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INTRODUÇÃO
Os vertebrados ectotérmicos mesmo tendo seu padrão de coloração
definido geneticamente apresentam mudança de coloração em resposta a
estímulos do ambiente, o que lhes permite adaptação a diversas situações.
Essas modificações geralmente ocorrem por meio da alteração na quantidade
e/ou na área das colorações melânicas (preto, marrom ou cinza), através da
dispersão ou agregação dos grânulos de pigmentos contidos dentro das células
pigmentares ou cromatóforos. Existem basicamente cinco tipos de
cromatóforos, nos vertebrados ectotérmicos (peixes, anfíbios e répteis). A
natureza química dos pigmentos e a cor que estes conferem às células
pigmentares foram utilizadas para classificá-los (Fujii, 2000). São cinco tipos:
melanóforos (marrom e preto: melanina), eritróforos (vermelha: carotenoides,
pteridinas) xantóforos (amarelo: carotenoides, pteridinas), leucóforos
(esbranquiçado: purinas citoplasmáticas que refletem) e iridóforos (prateado:
cristais de purinas arranjados em forma de placas que refletem a luz), alguns
deles representados na figura abaixo (Figura 01).
Fig. 01 – Melanóforos (m), eritróforos (e), xantóforos (x), observados na nadadeira do teleósteo
Devario malabaricus. Foto cedida por Tabata V. Caldeira (400x).
As mudanças de coloração podem ser divididas em dois tipos: as
x e
m
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mudanças fisiológicas ou rápidas, que resultam dos movimentos dos grânulos
de pigmento dentro das células pigmentares e as mudanças de coloração
morfológicas ou lentas que resultam de estímulos duradouros, pela alteração
da quantidade de pigmentos dentro das células pigmentares, e/ou do número
de células pigmentares.
O comportamento das células que contem pigmento é controlado pelo
sistema nervoso, pelo sistema endócrino (hormonal) ou por ambos, tanto nas
mudanças rápidas como nas mudanças mais lentas. Diversos
neurotransmissores e hormônios estão envolvidos na regulação das respostas
dos cromatóforos, induzindo a agregação dos grânulos de pigmento, ou a sua
dispersão, dentre eles o hormônio estimulador de melanócitos (MSH), o
hormônio concentrador de melanina (MCH), noradrenalina e outros.
Histórico
Aristóteles em 343 A.C. em seu livro Historia Animalium já relata a
mudança de coloração em camaleões, sendo a primeira observação escrita
descrita. A descrição de que a hipófise controlava a mudança de coloração em
anfíbios ocorreu em 1916 em trabalhos independentes de Smith & Allen. Em
1923 Smith & Smith mostraram a influencia de extratos de lobos intermediário
da hipófise na pigmentação de girinos hipofisectomisados, denominando o
principio ativo encontrado de hormônio estimulador de melanócito ou
intermedina.
A partir de observações feitas em anfíbios entre 1931 e 1936 Hogben &
Slome sugeriram um controle hormonal duplo na coloração de anfíbios e
conduziram pesquisas para identificar quais seriam as “substâncias” que
estariam envolvidas nessas modificações rápidas de colorações dos animais,
clareando-os ou escurecendo-os. A hipótese é que existiria um controle
hormonal duplo na mudança de cor em anfíbios. Evidenciaram que as
respostas ao fundo branco não dependiam do mesmo mecanismo de
coordenação das respostas ao fundo preto, que seria produzido pela liberação
de um hormônio que denominaram de substancia “B” da pars intermedia da
hipófise (α-MSH). Experimentos apontavam a existência de outra secreção
interna, além da substancia “B” (α-MSH), a qual chamaram de substância “W” e
descreveram que poderia estar conectada direta ou indiretamente com a
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atividade da pars tuberalis.
O α-MSH é um peptídeo de 13 aminoácidos, originário da clivagem de
um precursor de alto peso molecular, a proopiomelanocortina (POMC) (Eipper
& Mains, 1980). Teve a caracterização da sua sequencia em 1957 (Harris &
Lerner, 1957). Do ponto de vista fisiológico o α-MSH é o hormônio pigmentar
mais relevante, estimulando a translocação de grânulos de pigmento e síntese
de melanina, assim como a proliferação celular (Sherbrooke et al., 1988;
Takahashi & Kawauchi, 2006). Em teleósteos este peptídeo induz dispersão
pigmentar, ou seja, escurecimento, o que foi observado em todas as espécies
investigadas (Fujii, 2000; Takahashi & Kawauchi, 2006). Atualmente em
teleósteos e tetrápodes são descritos cinco subtipos de receptores (MC1R a
MC5R). Dos cinco subtipos, dois estão amplamente distribuídos no sistema
nervoso central (MC3R E MC4R), enquanto os demais (MC1R, MC2R e MC5R)
são encontrados predominantemente em células periféricas. Todos os
receptores são acoplados à adenilil ciclase e seus efeitos são mediados
primariamente por ativação da via dependente do AMP cíclico, sendo que cada
um apresenta localização e funções diferentes. (Mountjoy et al., 2003).
Enami (1955) foi o primeiro a propor a existência de um hormônio
clareador, neurohipofisário, através de suas observações no teleósteo
Parasilurus asotus (bagre japonês) utilizando extrato bruto ou frações de
extrato com etanol absoluto de hipotálamo e hipófise dessa espécie, os quais
induziam a concentração de pigmento nas melanóforos dérmicos do peixe,
tanto in vivo com em in vitro. Também mostrou que a fração insolúvel em álcool
apresentava um principio em maior concentração, que denominou de hormônio
concentrador de melanóforo (MCH).
Em 1957 Pickford & Atz apresentaram evidências da existência de um
hormônio clareador, mas não o separaram do α-MSH. A separação ocorreu um
ano mais tarde por Imai (1958) por absorção em óxido de alumínio, seguido por
eluição com concentrações decrescentes de acetona. A separação dos
hormônios também foi conseguida por Baker & Ball (1975) por métodos
eletroforéticos.
Westerfield e colaboradores (1980) realizaram experimentos tratando os
extratos de hipófise com vários agentes químicos e processos, a fim de definir
algumas características físico-químicas do MCH. Seus resultados não foram
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muito esclarecedores, no entanto revelaram que o MCH não seria uma amina e
sim um polipeptídio.
Baker & Rance (1983) utilizando gel de poliacrilamida, mostraram que
MCH é um pequeno peptídeo com menos de 2000 daltons. No mesmo ano
Kawauchi e colaboradores, conseguiram extrair, purificar e caracterizar
quimicamente o MCH através da purificação da hipófise de salmão
(Oncorhynchus keta). Neste momento já estavam bem elucidadas as funções
do α-MSH, que é responsável pela dispersão dos pigmentos nos melanóforos
dos tegumentos dos vertebrados ectotérmicos. A molécula de α-MSH é
derivada de uma proteína precursora, a proopiomelanocortina, por
processamento específico dentro do lobo intermédio da hipófise. Mas não havia
evidências da existência de um hormônio antagônico nos anfíbios, embora a
existência de uma molécula na hipófise de peixes teleósteos tivesse sido
reconhecida e foi denominado hormônio concentrador melanóforos (MCH) por
Enami (1955).
Originalmente Enami (1955) sugeriu que o MCH pudesse ter sua origem
no núcleo lateral tuberalis do hipotálamo de onde é transferido para a
neuroipófise. A origem hipotalâmica do MCH também pode ser confirmada por
Baker & Rance (1983) e Rance & Baker (1979).
MCH: Síntese e Características Estruturais
O MCH é um peptídeo neuroipofisário, sintetizado/produzido por
neurônios hipotalâmicos, cujas fibras projetam-se para a neuroipófise e se
irradiam para diversas regiões do sistema nervoso central em todos
vertebrados (Naito et al, 1985; Baker, 1991). É liberado por terminais axonais
no lobo neurointermédio da hipófise (Baker & Rance, 1983; Naito et al., 1985).
Naito e colaboradores (1985) chegaram a essas conclusões ao utilizar um
antissoro especifico para MCH sintético, mostrando que esse pode ser
sintetizado em neurônios e que eles podem se projetar para neuroipófise onde
o hormônio é secretado.
Alguns desses axônios projetam-se dorsalmente para diversas regiões
do sistema nervoso central, o que sugere que esse peptídeo tenha um papel
neuromodulador, talvez na regulação da ingestão de água (Zamir et al., 1986).
Barber et al. (1987) utilizando MCH de salmonídeos executaram
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radioimuno ensaio, afim de obter uma medição imunorreativa do MCH (irMCH)
no hipotálamo e hipófise em trutas (Salmo gairdneri) e enguias (Anguilla
anguilla). Os animais foram mantidos sob diferentes regimes de cor de fundo.
Os resultados mostraram que nas trutas 95% do irMCH estava localizado no
hipotálamo, sendo que a imunorreatividade aumentou quando animais
adaptados em fundo branco foram transferidos para fundo preto. As enguias
por outro lado apresentaram acúmulo apenas na hipófise. Esses achados
sugerem que MCH seja liberado da neuroipófise em associação a mudança de
cor fisiológica.
Utilizando MCH sintético baseado na sequencia de aminoácidos de MCH
de salmonídeos, Oshima e colaboradores (1986) observaram a agregação
pigmentar rápida em eritróforos de Xiphophorus maculatus e Xiphophorus
helleri, quando empregaram MCH. A fim de descartar a possibilidade que o
efeito do MCH estivesse sendo mediado através da liberação de
catecolaminas, e/ou através de adrenoceptores, os autores utilizaram um
bloqueador α-adrenérgico, fentolamina, e puderam assim observar que a ação
do MCH era direta na célula pigmentar através de receptor próprio.
Esse peptídeo liga-se as células pigmentares presentes na pele
induzindo a agregação dos grânulos de pigmentos, promovendo assim o
clareamento da pele, e exercendo assim ação antagonista ao hormônio
estimulador de melanócitos (α-MSH).
Em peixes o MCH é um heptadecapeptídeo cíclico altamente lipofílico,
que possui uma ponte dissulfeto entre cisteínas nas posições 5 e 14. Já em
mamíferos o MCH possui dois aminoácidos adicionais na extremidade N-
terminal e quatro substituições adicionais, com a seguinte distribuição primária:
Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-
Val (Vaughan et al. 1989). A identificação do MCH em mamíferos levou vários
anos, porém, descobriu-se que o MCH é idêntico em todos os mamíferos
analisados, camundongo, rato, coelho e humanos (Pissios & Maratos – Flier,
2003). Mesmo apresentando dois aminoácidos adicionais, o MCH de
mamíferos apresenta alta similaridade de sequencia ao MCH salmão
(teleósteos) sendo a estrutura em forma de laço entre as duas cisteínas
altamente conservada, ocorrendo no hipotálamo de todos os vertebrados
desde lampreias (Bird et al., 2001) a humanos. Além de ser expresso em
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melanócitos humanos, antagonizando a ação do α-MSH e também exerce um
papel na regulação melanogênica (Hoogduijn et al., 2002). Sua ampla
distribuição sugeriu, desde o inicio dos estudos, que esse peptídeo poderia
estar envolvido em diversas funções, como: regulação da resposta ao stress e
à ansiedade, comportamento, locomoção, reprodução e ingestão de alimentos
(Skofitsch et al.,1985; Bittencourt et al., 1992; Bluet-Pajot et al., 1995; Sanchez
et al., 1997; Gonzalez et al., 1998; Pissios & Maratos-Flier, 2003; Cardinaud et
al., 2004). A atividade agregativa do MCH pode ser comprovada em
cromatóforos de vários teleósteos (Wilkes et al., 1984a, b; Castrucci et al.,
1987; Hadley et al., 1987; Baker, 1988).
Em contraste com os teleósteos, em mamíferos a síntese de MCH no
sistema nervoso central é limitada a neurônios magnocelular no hipotálamo
lateral e zona incerta. Esses neurônios são atípicos, eles fazem conexões
monossinápticas, projetando para o córtex, amidala, núcleo accumbens,
tubérculo olfatório e vários núcleos do tronco cerebral (Pissios & Maratos –
Flier, 2003).
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Figura 02 - Representação esquemática da molécula de MCH de salmonídeos (a) e mamíferos
(b). Os aminoácidos diferentes entre as moléculas estão assinalados com a seta. Modificado
de Baker, 1991.
Nahon e colaboradores (1989) relataram a clonagem e sequenciamento
do cDNA do MCH isolado a partir de uma biblioteca de hipotálamo de roedores.
A análise do mRNA indicou que Pmch mostrando que a transcrição do mesmo
codifica um prepro-hormônio com dois outros potenciais produtos de
neuropeptídios. O prepro-hormônio codificado compreende 165 resíduos e o
MCH é gerado através de uma clivagem proteolítica nas argininas 145 e 146. O
prepro-hormônio também pode ser processado para dois produtos adicionais,
designados neuropeptídeo EI (CEL) e neuropeptídeo GE (ESL) (Pissios &
Maratos – Flier, 2003). A sequência de DNA encontrada em MCH purificado e
caracterizado de rato (rMCH) confirma a sequência deduzida a partir do
peptídeo purificado (Nahon et al., 1989).
Receptores e Vias de Sinalização
A principio, a caracterização de um receptor especifico para este
hormônio foi difícil, devido à composição altamente lipofílica da molécula de
MCH, com alta capacidade de ligação inespecífica e de fácil degradação
enzimática (Schlumberger et al., 2002; Griffond & Baker, 2002). Outro
empecilho seria o de não haver, um radioligante adequado que fosse capaz de
responder satisfatoriamente aos procedimentos experimentais (Kokkotou et al.,
2000). Utilizando uma molécula análoga ao MCH denominada [Phe13, Tyr19]
(b) (a)
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permitiu a descoberta de sítios de ligação em melanoma e varias linhagens
celulares de mamíferos (Drozdz & Eberle, 1995), e em queratinócitos humano
SVK-14 (Burgaud et al.,1997). No entanto, estes resultados são questionáveis,
devido à baixa confiabilidade das propriedades de ligação quando uso deste
análogo. Mais tarde grupos de pesquisadores independentes demonstraram
que os dados obtidos com o análogo [Phe13, Tyr19] eram inconsistentes
(Chambers et al., 1999; Hawes et al., 2000; Sone et al.,2000; Audinot et al.,
2001; Griffond & Baker, 2002).
Dois subtipos de receptores para MCH foram encontrados: MCH-R1,
que foi relatado no SNC e tecidos periféricos em todas as espécies estudadas,
e MCH-R2, presente principalmente no sistema nervoso central em alguns
mamíferos.
O primeiro receptor para MCH (MCHR-1) foi identificado quase que
simultaneamente por três grupos diferentes (Chambers et al., 1999; Lembo et
al., 1999 e Saito et al., 1999), em pesquisas realizadas utilizando extratos ou
biblioteca de hipotálamo, a fim de encontrar um ligante natural para o receptor
órfão SLC-1 (GPR24 -Somatostatin Like receptor 1), pertencente à grande
família de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), caracterizam-se por
apresentarem sete -hélices bastante conservadas, que atravessam a
membrana plasmática, e estão orientadas de forma que o lado aminoterminal
se apresenta extracelular e o lado carboxiterminal, intracelular.
A determinação da sequência de nucleotídeos para o receptor SLC-1
para humanos ocorreu em 1996 por Kolakowski e colaboradores, para rato
ocorreu dois anos mais tarde (Lakaye et al., 1998) enquanto que para
camundongo ocorreu em 2001 (Kokkotou et al., 2001), as três sequencias
mostraram ser altamente semelhantes, com 98% de identidade entre as
sequências para rato e camundongo e 91% entra as sequências de rato e
humano. Sendo as sequências de humanos e rato praticamente idênticas, com
350 pares de bases, cada, diferindo apenas em três aminoácidos. A proteína é
codificada por dois éxons, sendo que o éxon 1 é pequeno e parece ser
essencial para ligação e bioatividade. Possui um importante resíduo (Asp172),
presente na terceira alça da região transmembrânica, que foi identificado em
outros GPCRs como sendo o responsável pela interação do receptor com o
seu ligante. Este receptor possui uma porção aminoterminal grande e uma
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porção carboxiterminal pequena (Kolakowski et al., 1996; Saito et al., 2001;
Griffond & Baker, 2002).
O receptor MCHR1 sofre um processo de dessensibilização, ou seja,
perda da resposta a despeito da presença do agonista (Hausdorff et al., 1990;
Gether, 2000; Griffond & Baker, 2002; Kawauchi & Baker, 2004). Esse processo
é decorrente do desacoplamento entre receptor e a proteína G, e também de
um processo de internalização do receptor em sua forma ativada pelo agonista.
A fosforilação de receptores acoplados proteínas G pode ser causada por duas
diferentes famílias de quinases: as quinases ativadas por segundos
mensageiros, como as proteínas quinase A e C (PKA,PKC), e quinases da
família das quinases de receptores acoplados a proteínas G (GRKs) (Hausdorff
et al., 1990). A fosforilação promove a interação do receptor com uma arrestina,
e isso leva ao desacoplamento entre receptor e proteína G. Além disso, a
interação com arrestina é importante também, para direcionar os receptores
ativados para a internalização via vesículas cobertas com clatrina (Goodman et
al., 1996).
Nos últimos anos tem sido postulado que o mecanismo de internalização
é a chave que permite que o receptor acoplado à proteína G ative outras
cascatas de sinalização, como as normalmente usadas por receptores para
fatores de crescimento (Lefkowitz & Whalen, 2004; Luttrell et al., 1999). Evans
e colaboradores (2001) observaram que o complexo receptor para
MCH/arrestina ao internalizar permanece próximo ou mesmo ligado na face
interna da membrana plasmática. Mais recentemente, Saito e colaboradores
(2004) verificaram que a internalização do receptor MCH1R é dependente de
PKC, -arrestina-2 e dinamina I, e que a porção da cauda C-terminal é
fundamental para o processo de internalização.
Este receptor está amplamente distribuído em áreas do SNC, como
córtex, hipocampo, tálamo, mesencéfalo e ponte, e especialmente em núcleos
hipotalâmicos. Esta distribuição anatômica, anteriormente também identificada
por imunocitoquímica (Griffond & Baker, 2002, Kawauchi & Baker, 2004), é
consistente com as funções neuromoduladoras atribuídas ao MCH,
notadamente as relativas ao balanço energético (Qu et al., 1996; Ludwig et al.,
1998; Shimada et al, 1998; Tritos et al., 1998).
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A glicosilação é uma característica pós-translacional comum aos
GPCRs, e sua importância para expressão e função foi determinada para
vários destes receptores. A glicosilação de ao menos um sítio é necessária
para uma expressão eficiente do receptor na superfície celular e para a
transdução de sinal, enquanto em outro a glicosilação de resíduos específicos
é crucial para a transdução de sinal ou para que o receptor seja encaminhado
corretamente para a superfície celular. O MCHR1 possui três potenciais sítios
para a N-glicosilação, Asn13, Asn16 e Asn23 em sua porção aminoterminal. Foi
constatado que todos sofrem glicosilação, mas o seu papel é variável.
Particularmente, o sítio Asn23 é fundamental na expressão do receptor na
superfície celular, ligação e transdução de sinal (Saito et al., 2003).
Estudos mostram que o SLC-1, na presença do MCH é capaz de ativar
diversas vias de sinalização, o que é um indicativo de que este receptor tem a
capacidade de estar acoplado a mais de um tipo de proteína G. (Kawauchi et
al., 1983; Nahon, 1994; Isoldi et al., 2004; Kawauchi & Baker, 2004). Por
exemplo, a inibição do aumento dos níveis de AMPc induzido por forscolina, é
um indício de que estes receptores podem atuar acoplados às proteínas Gi e
Go, ou a ligação pode levar a ativação da via da fosfolipase C e à produção de
IP3, o que pode indicar o acoplamento com as proteínas Go e Gq. Ainda, outras
vias de sinalização podem estar envolvidas, indicando a ativação destes
subtipos de proteína G, como a de canais de K+ (proteína Gi), um aumento
transiente de Ca2+ intracelular (proteínas Gi, Go e Gq) e a estimulação de MAP
quinase (proteínas Gi, Go e Gq) (Hawes et al., 2000; Griffond & Baker, 2002,
Cotta-Grand, 2009).
Em teleósteos, Abrão e colaboradores (1991) demonstraram, em
melanóforos do teleósteo Synbranchus marmoratus, que a fosfolipase C é
estimulada após ativação do receptor de MCH, seguindo-se a estimulação de
uma proteína quinase C (PKC) pelo diacilglicerol (DG), e que uma fosfatase é
ativada em etapas finais da via de transdução, tanto do MCH como de
catecolaminas ao estimularem adrenoceptores 1 ou 2. Entretanto, Svensson
e colaboradores (1991), verificaram que forscolina (que ativa a adenilil ciclase)
bloqueava a agregação induzida pelo MCH em melanóforos de teleósteos,
sugerindo que este hormônio induza uma diminuição dos níveis intracelulares
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de AMPc, ao se ligar a seu receptor transmembrânico, analogamente ao que
ocorre com a ativação de adrenoceptores 2 (Nery & Castrucci, 1997;
deOliveira et al., 1996). Oshima & Wannitikul (1996) investigaram a
participação da via do DG/IP3 na agregação mediada pelo MCH em
melanóforos de Oreochromis niloticus, com o emprego de bloqueadores
específicos. Apesar de alguns dos bloqueadores serem os mesmos
empregados por Abrão e colaboradores (1991) os resultados obtidos foram
opostos, ou seja, não demonstraram a ativação desta via pelo MCH em O.
niloticus. Isoldi e colaboradores (2004) analisaram as vias de sinalização em
células de eritroforoma do teleósteo C. auratus e neste modelo observaram
estimulação da proliferação celular, mobilização de cálcio pela via do IP3/DAG
e indução do aumento dos níveis de AMPc, dose-independente, provavelmente
desencadeado pela ativação, nas doses de MCH utilizadas, do receptor para -
MSH. A atividade mitogênica induzida pelo hormônio é inibida na presença de
bloqueadores específicos para a isoforma 1 da PKC, que é a isoforma
expressa nessa linhagem celular (Isoldi et al., 2003).
Inicialmente o segundo receptor para MCH (MCHR2), foi identificado no
genoma humano (Hill et al., 2001) e seu cDNA foi clonado e caracterizado a
partir de uma biblioteca de cDNA de cérebro, por grupos de pesquisas isolados.
Em contraste ao MCHR1, o tratamento de células com toxina de pertussis não
influencia a mobilização de Ca2+, sugerindo que o MCHR2 atua através do
acoplamento com a proteína Gαq. Outra característica contrastante é a de que o
MCH-R2 é predominantemente expresso no SNC, enquanto o MCH-R1, além
do SNC é expresso em tecidos periféricos (An et al., 2001; Hill et al., 2001; Mori
et al., 2001; Rodriguez et al., 2001; Sailer et al., 2001; Wang et al., 2001; Tan et
al., 2002; Griffond & Baker, 2002; Kawauchi & Baker, 2004). Takahashi e
colaboradores (2007) em Verasper moseri mostraram que, neste teleósteo, a
distribuição dos subtipos de receptor é inversa à de mamíferos, ou seja, o
subtipo MCH-R1 tem sua distribuição restrita ao SNC e o MCH-R2 ocorre no
SNC e em vários tecidos periféricos.
As análises iniciais da sequência de aminoácidos de MCHR2 obtida a
partir da biblioteca de cDNA indicaram homologia com outros GPCRs já
conhecidos, inclusive MCHR1 e receptores para somatostatina subtipos 1, 2, 3
12
e 5. Porém uma análise mais detalhada desta sequência revelou que a mesma
possuía homologia maior com o MCHR1 (35%), levando à conclusão de que
havia sido descoberto um novo receptor para MCH. Porém, ao contrário do
MCHR1, que é extremamente conservado em diversas espécies, o MCHR2
parece ter uma função definida apenas em humano, pois, apesar de outras
espécies possuírem este receptor e suas sequências serem altamente
homólogas entre si, a expressão funcional não foi conservada durante a
evolução.
Embora ainda haja muito que se investigar a respeito deste subtipo de
receptor, a sua identificação pode ser a explicação para observações
anteriores, como, por exemplo, a de que o MCH antagoniza efeitos induzidos
por AMPc em algumas células ou potencializa este efeito em outras (Griffond &
Baker, 2002).
Em peixes, foram identificadas três sequências para MCHRs em Danio
rerio e duas sequências em Fugu rubripes, porém estas foram identificadas por
mapeamento genético em bancos de dados, e apenas parcialmente
sequenciadas. A análise filogenética destes fragmentos sugere que a
duplicação inicial dos genes codificando para os MCHRs teria ocorrido cedo na
evolução. Estas duas espécies possuem sequências ortólogas para os genes
mchr-1 e mchr-2 (Logan et al., 2003a, b). Os autores também sugerem que o
terceiro gene para o receptor de Danio rerio poderia ser resultante de um
evento de duplicação tardia na evolução dos teleósteos.
Funções na coloração
Os animais ectotérmicos podem apresentar adaptações cromáticas a
diferentes situações: níveis de iluminação, cor de fundo, estágio reprodutivo,
interação presa-predador, entre outras. Os animais de maneira geral utilizam
sua coloração para diversas funções. Peixes, por exemplo, a usam para
proteção e sobrevivência em seu habitat, como meio de comunicação visual,
informação do estado de saúde do animal, pois a perda da cor de algumas
espécies indica uma dieta falha, uma vez que alguns pigmentos, ou seus
precursores, não podem ser sintetizados e devem ser obtidos através da dieta
13
(Rodrigues et al., 2009). Em outros casos, a coloração indica o estágio de
maturação sexual.
A resposta mais comumente observada nos cromatóforos de peixes, de
adaptação ao substrato, é também conhecida como “coloração protecionista”,
sendo uma importante estratégia de sobrevivência a fim de evitar possíveis
predadores. Por exemplo, quando expostos a um fundo escuro, os
cromatóforos que absorvem luz, dispersam os pigmentos neles contidos ( ver
Fig.1 a).
Dois hormônios, entre vários outros hormônios e neurotransmissores,
estão envolvidos na mudança de cor fisiológica: α- MSH e MCH (este apenas
em teleósteos e holósteos). O hormônio concentrador de melanina (MCH)
regula as respostas dos cromatóforos, induzindo a agregação dos grânulos de
pigmento perinuclearmente, e o α- MSH sua dispersão para as projeções
dendríticas (Figura 3).
Figura 03 – Representação esquemática da correlação entre grânulos de pigmento e cor. Quando
os grânulos estão dispersos (a) o animal escurece (1), e a medida que se agregam (b,c) o
animal clareia (2). Fig. 03 ( II) - Corte transversal de uma célula pigmentar em diferentes
estágios de agregação/dispersão pigmentar. (A) máxima agregação e máxima dispersão (B).
Óxido Nítrico
Em 1980, Furchgott & Zawadzki demonstraram em aortas isoladas de
coelhos que a acetilcolina promovia a vasodilatação, desde que o endotélio
estivesse intacto, devido à liberação de um fator de relaxamento derivado do
endotélio, inicialmente denominado de EDRF (endothelium-derived relaxing
I II
14
factor), e posteriormente caracterizado como óxido nítrico (NO) (Palmer et al.,
1987). Ainda na década de 80 evidenciou se uma via bioquímica dependente
de L- arginina que sintetizava L-citrulina e nitrato (Hibbs et al., 1987) e que o
oxido nítrico era um produto da reação de oxirredução da L-arginina, sendo a
produção de oxido nítrico intermediária para a síntese de nitrito e nitrato
(Marletta et al., 1988).
O NO é uma molécula gasosa simples que pode ser encontrado no ar
atmosférico, além de ser um radical livre produzido por diversas células. Pode
ser ou não tóxico, dependendo de sua concentração, sendo produzido
principalmente nas células endoteliais e macrófagos, exercendo um papel
importante na função cardiovascular (Schmidt & Walter, 1994; Bouallegue et
al.,2007) e nas células musculares lisas, podendo levar à modulação dessas
células por mecanismos dependentes de GMPc (Mollace et al., 1991). Participa
de diversos processos fisiológicos e patofisiológicos como: vasodilatação,
broncodilatação, inflamação, cicatrização e resposta imune não especifica as
infecções e citotoxicidade (Garcia & Stein, 2006). A meia vida do NO quando
diluído é de apenas 10 segundos devido a sua rápida oxidação a nitrito e
nitrato, assim estando presente apenas em células muito próximas a sua
produção (Robbins & Cotran, 1999, McMullin et al., 2005). A produção biológica
de NO já foi registrada em diversos organismos tais como hidras, insetos,
caranguejo ferradura, estrela-do-mar, lampreia e peixes. (Colasanti et al.,1995;
D’Alessio et al.,1982; Radomski et al., 1991; Martinez et al, 1994; Schober et
al., 1994; Schober et al., 1993).
A síntese de NO a partir de L-arginina ocorre devido a ação de
enzimas chamdas oxido nítrico sintases (NOS) que foram inicialmente descritas
em 1989 por vários grupos simultaneamente (Knowles et al.,1989; Mayer et al.,
1989; Müsch et al., 1989), sendo purificadas (Bredt & Synder,1990) e clonadas
(Bredt et al., 1991).
A reação química clássica de síntese de oxido nítrico ocorre a partir do
aminoácido semiessencial L-arginina que é transformado em um intermediário,
a N-hidroxi-L-arginina na presença de Ca2+ e NADPH e O2 para formação de L-
citrulina e NO (Flora Filho & Zilberstein, 2000).
15
Figura 04 – Representação da síntese do óxido nítrico a partir da L-arginina.
A presença de NOS em vários organismos sugere que a via da L-
arginina/NO foi selecionada nos primórdios da escala filogenética e mostra a
importância biológica da produção de NO em animais (Campos-Perez et
al.,1999).
Várias células são capazes de produzir o NO através de hemeproteínas
da família do citocromo P-450, que são chamadas de NO sintases. As NOS são
dependentes de O2, NADPH, biopterinas e flavinas para exercer sua atividade
(Flora Filho & Zilberstein, 2000).
Até o momento foram isoladas e clonadas três isoformas de óxido nítrico
sintase:1) endotelial (eNOS), 2) induzida (iNOS) e 3) neuronal (nNOS) (Garcia
& Stein, 2006).
As isoformas eNOS e nNOS são chamadas de NOS constitutivas
(cNOS), expressas em baixos níveis e ativadas pelo aumento de Ca 2+ no
citoplasma em presença de cálcio-calmodulina (Ca 2+ - CAM), o que leva a uma
rápida produção de NO. As cNOS também são estimuladas por processos de
estresse ou ativação do receptor de endotélio vascular, por bradicinina ou
acetilcolina, pois induzem influxo de Ca 2+. O NO formado por esta enzima
difunde-se pela musculatura lisa vizinha, que aumenta os níveis de GMPc e
consequentemente ativa a proteína quinase dependente de GMPc,(PKG) e que
promove o relaxamento destas células (Barnes & Belvisi, 1993; Mayer et al.,
1998; Garcia & Stein, 2006; Bouallegue et al., 2007).
Já a iNOS é induzida quando os macrófagos são ativados por citocinas
ou outros agentes, mas não há aumento de Ca 2+ ou ativação de PKG, além do
NO poder reagir com o ânion superóxido para formar o radical peroxinítrico
(Kelm et al., 1997; Garcia & Stein, 2006).
O primeiro estudo a demostrar óxido nítrico sintases em teleósteos foi
realizado por Schober e colaboradores em 1993, utilizando diencéfalo de
Orcorhynchus mykiss.
L- arginina
NADPH
Ca 2+
N- hidroxi-L-arginina L-citrulina + NADPH
O2
NO
16
Em peixes já foi demostrada a produção de NO em resposta a
lipopolissacarídeos em várias espécies (Laing et al., 1999; Mulero & Meseguer,
1998; Schoor & Plumb, 1994; Yin et al.,1997), e a presença de NOS no sistema
nervoso de Ictalurus punctatus, Carassius carassius, Salmo gairdneri. Salmo
salar, Oncorhynchus mykiss e Hoplerythrinus unitaeniatus (Huque &
Brand,1994; Hylland & Nilsson,1995; Li & Furness,1993; Ostholm et al.,1994;
Söderström et al.,1995; Staples et al.,1995).
OBJETIVOS
Investigar o papel do Hormônio Concentrador de melanina (MCH na
ativação das vias de sinalização do óxido nítrico nas células de eritroforoma do
teleósteo Carassius auratus - GEM-81, uma vez que as vias clássicas de
sinalização nestas células parecem não serem as únicas a atuar neste sistema.
E assim poder vir a estabelecer a presença dessa via de sinalização na
modulação hormonal em células pigmentares de teleósteos.
17
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Cultura de células de eritroforoma de Carassius auratus (GEM-81)
As células da linhagem GEM-81 foram mantidas em meio F-10 de Ham
(Cultilab), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Nutricell), 14,3mM de
NaHCO3 e 15mM de Hepes, pH 7,4, na presença de 1% de
penicilina/estreptomicina/anfoterecina B (Sigma Chem. Co.), a 25 oC. O meio
de cultura foi trocado sob fluxo laminar (Trox modelo FLV) a cada 72 horas e as
células subcultivadas quando atingiam 80 a 90% de confluência. Para tanto
foram removidas com solução de Tripsina/EDTA e transferidas para novos
frascos.
Alíquotas celulares foram mantidas congeladas em meio de cultura
suplementada com 10% de soro fetal bovino e 10% de DMSO, em reservatório
de nitrogênio líquido. Todas as soluções aquosas foram preparadas com água
Milli-Q com condutividade abaixo de 15mΩ. Os meios de cultura e soluções
foram esterilizados por passagem em membrana Nunc de 0,22µm de
porosidade, e conservados em geladeira até o momento do uso.
3.2 Ensaios hormonais
As células (1x 106) foram semeadas em garrafas de cultura (25 cm2)
e/ou placas com 24 poços. Ao atingirem a confluência de 80 a 90 % algumas
células passaram por um tratamento prévio overnight com o meio de cultura
suplementado com 0,5% SFB e as demais foram matidas em meio
suplementado com SFB 10%, assim as células foram incubadas em MCH
(SIGMA- ALDRICH) ou α- MSH (SIGMA- ALDRICH) na concentração de 10-6M,
por períodos de tempo 5, 15, 30, 60, 180 e 360 minutos, em solução fisiológica
para teleósteos (NaCl, 7,48g; KCl, 0,2g; CaCl2 (anidro, 0,2g; 2H2O, 0,26g);
NaHCO3, 0,2g; Glicose, 1,0g para 1L), a 25oC.
18
3.3 Determinação direta de nitrito
Para essa determinação, as células GEM-81 foram submetidas ao
ensaio hormonal descrito acima. Decorrido o tempo de exposição, a solução
fisiológica foi coletada e transferida para um eppendorff e devidamente
identificado e assim guardado a – 20 oC.. No momento da análise as amostras
foram descongeladas e aguardou-se até atingirem temperatura ambiente
(25oC), a mesma dos padrões utilizados na calibração do equipamento.
A concentração de Nitrito foi medida diretamente no sobrenadante das
amostras, previamente preparadas com a adição de 2% de solução ISA
(Mettler Toledo) com eletrodo específico para nitrito (NO2) (Mettler Toledo).
O eletrodo foi conectado a detector que analisa o íons e expressam sua
concentração em milivolts (mV) (JENCO – 6230 N ),os valores são anotados e
depois convertido em concentração mM após feita uma curva padrão de nitrito
com os padrões de concentrações conhecidas. As diluições dos padrões foram
feitas no dia da medição como indicado pelo fabricante, a partir de uma solução
estoque de 1 M de nitrito de sódio (NaNO2) (LABSYNTH).
As amostras (196 µl) foram transferidas para um eppendorff adicionou-
se 4 µl de ISA, sob agitação antes de aplicar na célula de fluxo do aparelho
para efetuar a leitura. Após a aplicação da amostra, o resultado em mV dado
pelo aparelho é anotado e convertido a mM .
3.4 Avaliação da expressão de Óxido Nitrico Sintase (NOS) por Western
Blot:
Para a realização do imunoblot, as células foram dissolvidas com
tampão RIPA (1% Triton X-100, 0,5% sódio deoxicolato, 0,1 % dodecil sulfato
de sódio (SDS), 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4). A concentração de
proteína foi dosada utilizando-se o método de Bradford e então ajustada para
30 µg/µl. As proteínas foram separadas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a
8% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Protran). A membrana
foi incubada em solução bloqueadora (1% BSA, 5% leite em pó) por 1 h e 30
min em temperatura ambiente. A membrana foi então novamente incubada por
18 h na mesma solução contendo os respectivos anticorpos primários: contra
19
iNOS (NOS II – H-174 – rabbit Santa Cruz Biotechnology) e contra α-tubulina
para normalização (T6199 - mouse polyclonal Sigma), sob agitação e
refrigeração. Após esta incubação, lavaram-se as membranas com TBS-T
(150mM NaCl, 10mM Tris, água Milliq, 0,05% Tween 20Q ) três vezes, por 10
min e procedeu-se à incubação com o anticorpos secundários contra iNOS
(IRDye 800nm – Licor 926-32211) e contra α-tubulina (Alexa-Fluor 680nm –
donkey – INVITROGEN Molecular Probes – A10038) por 1h. Após o tempo
com anticorpo secundário, as membranas foram lavadas três vezes, por 10 min
com TBS-T, em seguida fizemos a detecção das bandas por
quimiluminescência (Pierce, Rockford,IL,USA). A revelação dos filmes foi feita
com as membranas colocadas no cassete e o filme de tamanho adequado por
cerca de 1 minuto, Em seguida, o filme era colocado no liquido revelador por 5
minutos e depois transferido para o recipiente com água Mili-Q, agitando de
vez em quando. Após retirar o filme da água, este foi transferido para o
recipiente com o liquido fixador e aguardou-se 10 minutos, sob leve agitação,
seguindo-se lavagem em água corrente e secagem.
Os filmes com as bandas foram quantificados por densitometria optica
usando um sistema de análise de imagens (Imaging Research Inc., Brock
University, Canadá, modelo M4/SK/ALU). Os valores foram corrigidos através
da divisão do valor da densidade das bandas de proteína de estudo pelo valor
da banda obtida utilizando-se α- tubulina.
3.5 Análise Estatística
Os dados estão expressos como média +/- erro padrão da média (EPM)
e foram submetidos à análise estatística. Para comparações múltiplas foi
aplicada a análise de variância e, uma vez detectada diferença significativa, foi
aplicado o teste de Dunnett’s. Essas análises foram realizadas pelo programa
GraphPad prism 4 e o nível de significância para rejeição da hipótese de
nulidade foi fixado em 5% (p<0,05).
20
RESULTADOS
I- Identificação da expressão da proteína das isoformas de Óxido
Nítrico Sintase (NOS) expressa nas células de eritroforoma de
Carassius auratus – GEM -81.
Inicialmente, determinamos qual das três isoformas da NO sintases seriam
expressas nas células em estudo, eritroforoma de Carassius auratus – GEM-
81, utilizando os anticorpos adequados para cada isofoma (nNOS, iNOS e
eNOS). Conforme podemos observar na Figura 05, somente na forma induzível
de NOS (iNOS) ocorreu a marcação da expressão da enzima,nas outras
isoformas não ocorreu marcação. Um dado não apresentado é que em células
de melanoma humano (SK-MEL 23) também não há marcação de iNOS.
Figura 05 - Identificação da expressão proteica das isoformas de NO sintases em células GEM-
81. A marcação ocorreu proximo ao peso de aproximadamente 130 Kda, sugerindo assim a
expressao de iNOS em células de eritroforoma. A α- tubulina foi utilizada como normalizador e
teve sua marcação em aproximadamente 55 Kda .
21
II - Produção de Nitrito
1. Determinação da expressão do iNOS em resposta ao tratamento com
hormônio estimulador de melanócitos (α- MSH) na concentração de 10-6 M
por tempos crescentes (60, 180 e 360 min / 1,3 e 6h) .
Podemos observar na Figura 06 que, decorrido o tempo de tratamento, não
houve diferença significativa (p>0,05 ) na expressão de iNOS nas células
submetidas ao tratamento de α- MSH.
Figura 06 – Expressão do nível da proteína Óxido Nitrico Sintase induzivel i(NOS) em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM – 81 submetidas ao tratamento de com hormônio estimulador de melanócitos (α- MSH) na concentração de 10
-6 M por tempos crescentes (1,3 e
6h) em solução fisiólogica.
22
2. Determinação da expressão do iNOS em resposta ao tratamento com
hormônio concentrador de melanina (MCH) na concentração de 10-6 M
por tempos crescentes (60, 180 e 360 min/ 1, 3 e 6h).
Analisando-se a Figura 07, observa-se um aumento gradativo na
expressão da proteína de iNOS após feito o tratamento prévio das células com
meio de cultura HAM-F10 suplementado com 1% de antibiótico e 0,5% Soro
Fetal Bovino (SFB) overnight, as quais foram submetidas ao tratamento com
MCH [10-6 M]. Por outro nas células que foram mantidas em meio de cultura
suplementado com 10% SFB, antes do tratamento hormonal, esse aumento
não é evidenciado (Figura - 08).
Figura 07 - Expressão do nível da proteína Óxido Nitrico Sintase induzivel i(NOS) em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM – 81 submetidas ao tratamento de com hormônio concentrador de melanina (MCH) na concentração de 10
-6 M por tempos crescentes (1,3 e 6h )
em solução fisiólogica, após tratamento previo com meio de cultura contendo 0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB).
23
Figura - 08 - Expressão do nível da proteína Óxido Nitrico Sintase induzivel i(NOS) em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM – 81 submetidas ao tratamento com hormônio concentrador de melanina (MCH) na concentração de 10
-6 M por tempos crescentes (1,3 e 6h)
em solução fisiólogica, com meio de cultura contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB).
24
3. Determinação da concentração de nitrito produzido após tratamento com
hormônio estimulador de melanócitos (α-MSH) na concentração de 10-6 M
por tempos crescentes (60, 180 e 360 min) utilizando a técnica de medida
por eletrodo especifico para nitrito.
Utilizando a técnica de determinação indireta da concentrção de óxido
nitrico através de dosagem da produçao de nitrito por leitura em eletrodo
especifico para íon, podemos observar na Figura 09, que não há diferença
significativa na porcentagem de produção de nitrito após o tratamento com α-
MSH. Os dados são expressos como média da porcentagem de produçãode
nitrito +/- SEM (n=3).
Figura 09- Porcentagem da resposta e produção de nitrito ,em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM- 81, submetidas ao tratamento com hormônio estimulador de melanócito (α- MSH) por tempos crescentes (60, 180 e 360 min) em solução fisiológica.
4. Determinação da concentração de nitrito produzido após tratamento com
hormônio concentrador de melanina (MCH) na concentração de 10-6 M por
tempos crescentes (5,15 e 30 min) utilizando a técnica de medida por
eletrodo especifico.
Utilizando a técnica de determinação indireta da concentrção de óxido
nitrico através de dosagem da produçao de nitrito por leitura em eletrodo
25
especifico para íon, podemos observar nas Figura 10, 11 e 12, que não houve
diferença significativa na porcentagem de produção de nitrito após o tratamento
com o hormônio concentrafor de melanina (MCH), com 0,5% SFB ou 10% de
SFB. Os dados são expressos como média da porcentagem de produçãode
nitrito +/- SEM (n=3-18).
Figura 10- Porcentagem da resposta e produção de nitrito, em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM- 81, submetidas ao tratamento com hormônio concentrador de melanina (MCH) por tempos crescentes (5, 15 e 30 min) em solução fisiólogica, após tratamento prévio com meio de cultura contendo 0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB).
26
Figura 11- Porcentagem da resposta e produção de nitrito, em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM- 81, submetidas ao tratamento com hormônio concentrador de melanina (MCH) por tempos crescentes (60, 180 e 360 min) em solução fisiológica, após tratamento prévio com meio de cultura contendo 0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB).
Figura 12 - Porcentagem da resposta e produção de nitrito, em células de eritroforoma de Carassius auratus – GEM- 81, submetidas ao tratamento com hormônio concentrador de melanina (MCH) por tempos crescentes (60, 180 e 360 min) com meio de cultura contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB).
27
DISCUSSÃO
O oxido nítrico é uma molécula muito investigada tanto por seu papel
fisiológico nos organismos quanto pelas suas propriedades tóxicas como
poluente atmosférico. Nos últimos anos tem sido objeto de diversas pesquisas
e ainda assim algumas de suas funções continuam controversas.
Desde a década de 80, quando descoberto (Furchgott & Zawadzki,
1980), iniciaram-se as pesquisas das funções que poderia ter, e hoje sabe se
que para sua síntese é necessária a oxidação da L-arginina pelas enzimas
oxido nítrico-sintases (NOS) e que alguns animais expressam as 3 isoformas
existentes. Dessas enzimas temos duas constitutivas e dependentes de cálcio,
nNOS e eNOS, e uma forma induzível, iNOS, que não é dependente de cálcio
e sim induzida por citocinas e lipopolissacarídeos em diversos tecidos. O NO
pode ser produzido em grandes quantidades podendo atuar em parasitas e
células tumorais (Cerqueira & Yoshida, 2002).
Na literatura é descrito a ocorrência da expressão das três isoformas
conhecidas de NOS em mamíferos (Knowles & Moncada, 1994). No entanto,
no nosso estudo observamos somente a detecção da expressão proteica da
enzima iNOS em células de eritroforoma de Carassius auratus (GEM-81),
embora tenhamos analisados as três isoformas da enzima. A expressão de
iNOS já havia sido documentada em (Carassius auratus), mas somente em
macrófagos (Laing et al., 1996).
A expressão de NOS já havia sido descrita em leucócitos dos rins
cefálicos de Ictalurus punctatus, por injeção intraperitoneal com Edwardsiella
ictaluri (Schoor & Plumb, 1994). Mas a descrição de iNOS em teleósteos
ocorreu primeiro em Carassius auratus, com o sequenciamento parcial da
enzima em cultura de macrófagos (Laing et al., 1996). Os estudos com I.
punctatus e C. auratus confirmaram que no metabolismo de peixes a síntese
de NO é dependente de arginina, ao utilizarem seus análogos (Schoor &
Plumb, 1994; Neumann et al., 1995).
Sabe – se que a iNOS não é expressa naturalmente sendo induzida nos
macrófagos e outras células por lipopolissacarídeos bacterianos e/ou citocinas
(Stuehr et al, 1991) e muitas vezes a produção de NO por iNOS está envolvida
em processos patológicos (Flora Filho et al., 2000).
28
Vários autores consideram que qualquer célula do organismo tem a
capacidade de produzir iNOS sob estímulos apropriados (Flora Filho et al,
2000), talvez por esse motivo explica-se a expressão de somente essa
isoforma de NOS nessas células. No entanto alguns estudos demostraram a
atividade e expressão do gene de iNOS em fagócitos, incluindo granulócitos
heterofílicos, neutrófilos, além dos macrófagos (Barroso et al., 2000; Saeij et
al., 2000).
Pode-se notar que a síntese proteica foi aumentada nos tempos
maiores, após o tratamento hormonal com MCH. Resultados foram mais
evidentes quando as células de eritroforoma foram previamente incubadas em
meio de cultura, suplementado com uma menor porcentagem de soro fetal
bovino (SFB) - 0,5%, em comparação às células que permaneceram com o
meio de cultura com a porcentagem de SFB - 10% durante todo o experimento.
Em comparação, a aferição da produção de nitritos pelas células em eletrodo
especifico mostra um aumento da produção de nitrito bem discreto com os
tempos de 180 e 360 minutos com o meio de cultura suplementado apenas
com 0,5% SFB..
O SFB é uma complexa mistura de diferentes substancias,
possivelmente contendo vários pequenos peptídeos, substratos energéticos e
vitaminas (Takahashi & First, 1992), presença de fatores de crescimento e
aminoácidos (Keskintepe et al., 1995), proteínas e citrato (Keskintepe et al.,
1995) e hormônios esteroides (Mingoti et al., 1995). Assim essas substâncias
do SFB podem, de alguma forma, alterar/mascarar os eventuais efeitos do
hormônio, podendo ou não ativar alguma via de sinalização. Assim, a retirada
completa do SFB antes do tratamento hormonal poderia mostrar respostas
mais robustas em relação aos dados obtidos com 0,5%.
Laing e colaboradores (1996) demostraram que a expressão de iNOS
era aumentada quando os macrófagos de Carassius auratus eram estimuladas
por lipopolissacarídeos sugerindo assim que essa enzima teria um papel
funcional pelo menos nessas células. Mas até o momento não havia registros
na literatura que o hormônio concentrador de melanócitos poderiam ativar as
vias de sinalização responsáveis pela produção de NO através da síntese
proteica de iNOS nessas células.
Os maiores picos de expressão de iNOS e concentração de nitrito foram
29
observadas nos tempos maiores 180 e 360 minutos. Na literatura há registros
que a indução de síntese de iNOS por endotoxinas bacterianas leva de duas a
quatro horas após a exposição ao agente e sua atividade persiste por mais de
24 horas (Cerqueira & Yoshida, 2002).
A detecção de iNOS em peixes por anticorpos específicos para ratos
evidencia uma alta conservação durante a evolução da estrutura molecular e
da produção do NO pelos organismos. Laing e colaboradores (1996) já haviam
descrito que a iNOS detectada em macrófagos de Carassius auratus
apresentava uma homologia com as sequências de aminoácidos da oxido
nítrico sintase de mamífero e uma grande similaridade na sequência de
nucleotídeos e aminoácidos da iNOS de humanos (65% / 75%), com truta (73
% / 85%), camundongo (62% / 75%) e rato (61% / 73%) respectivamente.
O óxido nítrico apresenta uma função importante no processo de
sinalização intracelular, pela ativação de guanilil ciclase solúvel, e essa enzima
promoveria a formação de monofosfato de guanosina cíclico (Moncada &
Higgs, 1991). Nilsson e colaboradores (2000) utilizando Xenopus laevis
demonstraram que a agregação de grânulos de pigmentos de melanossomos é
dependente de NO e que sua privação leva à dispersão. Hayashi & Fuji (2001)
utilizando cromatóforos dos teleósteos Zacco temminckii e Kryptopterus
bicirrhis, sugeriram um possível envolvimento do NO no controle de mobilidade
de pigmento em cromatóforos. Possivelmente em teleósteos o NO dispersaria
os pigmentos via ativação de guanilil ciclase solúvel levando a um aumento dos
níveis citosólicos de GMPc (Hayashi & Fujii ,2001).
Nossos dados não mostram a atuação α-MSH na produção de nitrito e
síntese proteica de iNOS nas células de eritrofoma.(GEM-81), Entretanto, na
literatura há alguns relatos da ação desse hormônio por essa via Em
macrófagos de murinos o α-MSH age inibindo a produção de NO que havia
sido induzida por LPS e Interferon gama. Nesse estudo o α-MSH aumentou os
níveis de AMPc nos macrófagos, como observado pela ativação de receptores
MCR1 de α-MSH em outros tipos celulares. A estimulação em MC1R pode
modular a inflamação inibindo a produção de NO, sugerindo assim que o α-
MSH seja um fator autócrino em macrófagos e que modularia a inflamação por
se contrapor aos efeitos de citocinas pro-inflamatórias .(Star et al., 1995).
O envolvimento de NO na melanogênese também foi investigado e
30
Romero-Graillet e colaboradores (1997) observaram que esta ação seria
decorrente do estímulo a sua síntese em queratinócitos irradiados. Tsamali e
colaboradores (2001) também observaram que o α-MSH aumenta a produção
de NO induzida pela radiação ultravioleta em células de melanoma B16 e
melanócitos humanos Entretanto, o mecanismo de ação do NO na síntese de
melanina não foi ainda elucidado. Entretanto, neste mesmo artigo, os autores
observaram que o α-MSH inibe a produção de NO induzida pela ação de LPS,
sendo portanto antagônicos.
O MCH em teleósteos media a agregação pigmentar em cromatóforos
de teleósteos em que foram identificados dois receptores: MCHR-1 e MCHR-2
(Logan et al., 2003; Takahashi et al., 2007), havendo a possibilidade de que
esses receptores ativem proteínas G diferentes,.
Evidências experimentais sugerem a existência de duas vias de
sinalização de MCH em cromatóforos de teleósteos. Na primeira, há redução
de AMPc, portanto o receptor seria ligado à proteína G1, observado em
Chrysiptera cyanea (Oshima et al., 1986), Labrus ossifagus (Svensson et al.,
1991), Anguilla anguilla (Cardinaud et al., 2004) e em Danio rerio (Logan et al.,
2006). Enquanto a segunda seria pelo ativação da proteína Gq, ativando
fosfolipase C, gerando IP3 e diacilglicerol, elevando os níveis intracelulares de
Ca2+ e ativando PKC dependente de Ca2+/calmodulina, observadas em
Synbranchus marmoratus (Abrão et al., 1991). Mas também é possível que
ambas as vias sejam ativadas em uma mesma célula pigmentar, como
sugeriram Nery e Castrucci (1997), o que ainda não foi investigado,
As vias de sinalização de MCH em GEM-81 foram estudas por Isoldi e
colaboradores (2004), e seus dados sugerem que PKC β1 e o cálcio estejam
envolvidos nas respostas de MCH em células GEM-81. E que MCH exerça
seus efeitos nessas células através da ativação de fosfolipase C, PKC β1e
Ca2+/calmodulina dependente de PKC. Anteriormente Isoldi e colaboradores
(2003) haviam mostrado que células de GEM-81 expressam as isoformas :β1, γ
e δ de PKC, sendo a β1 responsável pela ativação da cascata de MCH .
Embora na literatura não existam registros da participação do MCH na
produção de NO, nossos dados sugerem que o MCH, além das vias
conhecidas acima mencionadas, poderia atuar pela via do óxido nítrico. Em
contraste, não observamos a participação do α-MSH na indução à produção de
31
NO em nosso modelo experimental, em que pesem dados da literatura,
especialmente em células de melanoma e melanócitos que indicam a ativação
ou inibição dessa via pelo α-MSH.
32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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