INTRODUÇÃO

______________________________________________

16

1 INTRODUÇÃO

Durante muitos séculos, a única fonte de agentes terapêuticos para a humanidade era a

biodiversidade. Com o advento da química farmacêutica, esse recurso natural foi sendo

explorado de forma intensa, de modo que atualmente, os produtos naturais estão envolvidos

no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas (HOSTETTMANN, QUEIROZ e

VIEIRA, 2003). Como estratégia para investigação do uso dessas substâncias naturais, é

necessário combinar informações sobre o uso popular das mesmas pelas comunidades com o

estudo laboratorial científico (PACKER e LUZ, 2007).

A megadiversidade da flora brasileira está entre os elementos favoráveis ao

desenvolvimento de medicamentos naturais. Por outro lado, muitas comunidades ainda

cultivam o hábito da utilização de plantas para fins terapêuticos, especialmente na região

Nordeste, notadamente marcada pela pobreza. Não apenas do ponto de vista da

bioprospecção, mas por serem as plantas um recurso de uso clínico convencional, e ainda pela

expectativa de estas apresentarem menos efeitos colaterais que os produtos sintéticos, existe

atualmente um maior reconhecimento do valor das pesquisas com produtos naturais

(OMENA, 2007).

A região do semi-árido brasileiro possui uma biodiversidade rica em espécies

aromáticas produtoras de óleos essenciais, utilizados pelas suas atividades biológicas

destacando-se como agentes antimicrobianos. Essa atividade pode ser atribuída à presença de

terpenos, que atuam sobre a parede da membrana celular, causando danos à célula

(SIKKEMA, BONT e POOLMAN, 1994).

Por apresentarem atividade metabólica especial, os vegetais superiores são capazes de

produzir substâncias antibióticas utilizadas como mecanismo de defesa contra

microorganismos, insetos e herbívoros (SILVA et al., 2004). Pesquisas envolvendo essas

substâncias vêm sendo direcionadas ao descobrimento de novos agentes antimicrobianos a

partir de extratos de plantas e de outros produtos naturais, para serem aplicados em produtos

farmacêuticos e cosméticos, a partir da observação de sua atividade antibacteriana e

antifúngica pelos métodos microbiológicos de avaliação conhecidos (OTROSKY et al.,

2008).

O metabolismo secundário, principalmente dos vegetais, é estudado pela química dos

produtos naturais, sendo essa uma área bastante abrangente, pois envolve determinação

estrutural dos metabólitos secundários, a sua formação no organismo, a sua ocorrência no

17

reino vegetal e a sua importância para a sobrevivência da planta, exigindo estudos

interdisciplinares. Os metabólitos secundários são importantes para o homem, pois muitos

apresentam propriedades farmacológicas enquanto outros podem ser utilizados como

aromatizantes, conservantes, corantes, entre outros. Em qualquer caso, o conhecimento da

estrutura da substância é fundamental e assim sendo, a identificação ou determinação

estrutural das substâncias presentes em uma dada espécie deve ser a primeira etapa em

qualquer estudo dentro da química dos produtos naturais (OMENA, 2007).

O surgimento de patógenos resistentes aos antibióticos disponíveis, o desenvolvimento

da biotecnologia, a demanda das indústrias farmacêuticas por produtos naturais e as

exigências do mercado consumidor justificam o número crescente de estudos relacionados à

composição, as atividades e a toxicidade dos óleos essenciais, na busca de produtos seguros,

cada vez menos agressivos e de origem natural (PACKER e LUZ, 2007).

Além da necessidade de descobrir novas substâncias com propriedades

antimicrobianas para serem utilizadas no combate às infecções causadas por microorganismos

resistentes, é interessante que essas apresentem requisitos como: baixa toxicidade, baixo custo

e fácil acesso pelas comunidades carentes (COSTA et al., 2005). No Nordeste brasileiro, a

descoberta das potencialidades biológicas de metabólitos secundários significa uma

alternativa para a economia da região. É reconhecida a atividade anti-inflamatória,

antimicrobiana e antioxidante de espécies pertencentes ao gênero Lippia (BOTELHO et al.,

2007a; COSTA et al., 2005). Dentre as espécies em potencial, a Lippia gracillis destaca-se

pela capacidade de acumular em seus pêlos glandulares, óleos essenciais com atividade

antimicrobiana (ALBUQUERQUE et al., 2006).

Esse trabalho mostra o estudo da composição química e a investigação da atividade

antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracillis (Figura 1, pág. 18), obtido a partir de

folhas frescas e secas, e avalia a sua interferência sobre a atividade de alguns antimicrobianos

de comprovada eficácia clínica, uma vez que as plantas ainda são os maiores reservatórios de

novos tipos químicos estruturais, os quais muitas vezes podem ser associados à utilização de

medicamentos convencionais (SOUSA et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2006). Foi realizado

também um estudo qualitativo e quantitativo de óleos essenciais da espécie, obtidos em

diferentes horários de coleta.

18

Figura 1: Folhas da espécie Lippia gracillis Schauer (Fonte: do autor)

OBJETIVOS

______________________________________________

20

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

-Avaliar a composição química e as propriedades microbiológicas dos óleos essenciais

das folhas frescas e secas de Lippia gracillis.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Analisar a composição química do óleo essencial extraído das folhas secas e das

folhas frescas de L. gracillis coletadas em diferentes horários do mesmo dia;

- Avaliar o espectro de ação e o grau de inibição dos óleos essenciais de L. gracillis

frente a linhagens de bactérias e fungos e verificar a concentração inibitória mínima (CIM)

dos óleos essenciais de L. gracillis frente a bactérias padrão e multi-resistentes;

- Avaliar o efeito modulador dos óleos essenciais de L. gracillis frente a antibióticos

aminoglicosídeos por contato direto e por contato a vapor, usando bactérias padrão.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

______________________________________________

22

3.1 Gênero Lippia

A Família Verbenaceae compreende aproximadamente 36 gêneros e cerca de 1000

espécies de distribuição pantropical, sendo que no Brasil ocorrem 17 gêneros e 250 espécies

com potencial econômico amplamente explorado (LORENZI e MATOS, 2002; SOUZA e

LORENZI, 2005).

O gênero Lippia foi descrito primariamente por Linnaeu em meados do século XVIII

sendo os primeiros trabalhos taxonômicos propostos por Schauer no século seguinte; suas

espécies, subespécies e variedades estão distribuídas nas Américas tropical e subtropical,

sendo raros na porção tropical do Velho Mundo (BRANDÃO, 2003). De acordo com Sanders

(2001), o gênero é principalmente distribuído em regiões semiáridas da América do Sul e

secundariamente na região noroeste dos Andes e planaltos mexicanos.

No semi-árido nordestino, várias espécies do gênero são conhecidas como alecrins,

distribuindo-se amplamente na caatinga e sendo endêmicas nessa região do país (MATOS,

1999).

A importância econômica do gênero está relacionada aos componentes químicos das

espécies, sendo amplamente utilizadas na terapêutica das desordens gastrointestinais,

respiratórias e cutâneas (SANTANA et al., 2008; PESSOA et al., 2005), havendo relatos do

seu uso como agente antioxidante, gastroprotetor, antisséptico, antifúngico, antibacteriano,

citotóxico, clareador dentário e inseticida (COSTA, AGUIAR e NASCIMENTO 2004;

COSTA et al., 2005; BOTELHO et al., 2007a). Omena (2007) relata ainda a atividade de uma

espécie sobre o sistema nervoso central, a Lippia mycrophyla.

Vários autores citam o preparo de espécies desse gênero sob a forma de infusões e

decocções; estas podem ainda ser administradas oralmente ou utilizadas para uso tópico

(PASCUAL et al., 2001).

A larga utilização de espécies do gênero Lippia pelas comunidades justifica-se pela

sua ação antimicrobiana, o que se deve à presença de monoterpenos fenólicos como timol e

carvacrol (MATOS, 1988), componentes químicos de eficácia comprovada em diversos

estudos (BLANK et al., 2004; BOTELHO et al., 2007b).

23

3.2 Espécie Lippia gracillis

A Lippia gracilis Schauer, Verbenaceae, é um arbusto caducifólio, muito ramificado,

cuja altura pode variar entre 1 e 2,5 metros de altura, ramos cinéreos, subcilíndricos, de glabros

a pubescentes. Suas folhas são pequenas, aromáticas, decussadas, membranáceas e discolores,

apresentando pecíolo cilíndrico, face superior escabra, face inferior pubescente a tomentosa,

com base acumeada à obtusa, margem crenada, ápice agudo, nervuras proeminentes com

grande quantidade de tricomas e não apresentam frutos. Assemelha-se à L. microphylla pelas

espigas curtas e brácteas côncavas, mas diferem pelo fato da L. gracillis apresentar brácteas

decussadas, ovais, velutinas, com carena bastante evidente, cálice pubescente, corola alva e

anteras ovais. Evidenciam floração entre os meses de janeiro e junho (SANTOS et al., 2009).

Essa espécie é encontrada em regiões semi-áridas do Nordeste brasileiro, sendo

conhecida popularmente como alecrim de tabuleiro ou alecrim da chapada (LORENZI e

MATOS, 2002). A parte medicinal da planta, de onde é extraído o óleo essencial, corresponde

às folhas e flores; sendo reconhecida a sua atividade antimicrobiana devido ao alto teor de

carvacrol (PESSOA et al., 2005; BLANK et al., 2004). Outros estudos citam a presença de

timol além do carvacol, sendo essas duas substâncias encontradas também nos óleos essenciais

de plantas como orégano, tomilho e alecrim pimenta (CARVALHO et al., 2003; MATOS,

1999; ULTEE, KETS e SMID, 1999).

Vários estudos utilizando óleo essencial de Lippia gracillis extraído de folhas secas

demonstraram que dos 36 componentes identificados na análise química, o componente

majoritário foi o timol (30,48%), enquanto o carvacol correspondeu a apenas 8,38%;

diferentemente dos resultados encontrados por outros autores que identificaram o carvacol

como componente com maior percentual (44 a 54%) (PESSOA et al., 2005; SILVA et al.,

2008). Essas diferenças podem ser atribuídas à influência da época e do horário de coleta,

mostrando que fatores não-genéticos alteram não só o rendimento do óleo essencial, mas

também a sua composição química (NEVES et al., 2007).

Na área de caatinga do agreste e sertão pernambucanos, L. gracillis recebe duas

denominações populares e suas composições químicas são diferentes. No município de

Ouricuri, no sertão pernambucano, a uma altitude de 450 metros, é denominada cidreira da

serra, tendo como componentes majoritários o carvracol e o p-cimeno, enquanto no município

24

de Buíque, agreste pernambucano, a uma altitude de 960 metros, é conhecida por alecrim,

caracterizado pela presença de timol e terpenos (NEVES et al., 2007).

A espécie L. gracillis é utilizada no combate de infecções da boca, garganta e pele,

apresentando ainda eficácia no tratamento de queimaduras, ferimentos, acnes e outras

patologias do sistema tegumentar (CAVALCANTI, 2007; CARRAZONI, 2000). É indicada

para o tratamento de micoses causadas por leveduras do gênero Candida, demonstrando

potencial anti-fúngico, e quando utilizada em aplicações externas, mostra-se eficaz no

tratamento de doenças cutâneas, queimaduras e feridas, bem como no tratamento de acnes,

panos brancos, caspa e impingem (DUARTE et al., 2005; PASCUAL et al., 2001;

CARRAZONI, 2000). Apresenta ainda, atividade tuberculostática frente a diferentes cepas de

Mycobacterium tuberculosis (CAVALCANTI, 2007).

Outros estudos demonstram a possibilidade de utilização de óleos essenciais de Lippia

gracillis como controle alternativo de contaminantes encontrados em laboratórios de cultura

de tecidos de plantas (OLIVEIRA et al., 2008), sendo a Klebsiella pneumoniae a menos

sensível e a Enterococcus hormaechei a que apresenta maior sensibilidade

(ALBUQUERQUE et al., 2006). Autores citam ainda atividades larvicida frente ao Aedes

aegypti e no controle do crescimento de fungos contaminantes de plantas (OLIVEIRA et

al.,2008; SILVA et al., 2008).

3.3 Óleos essenciais e seus constituintes químicos

Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos nos órgãos vegetais e são

assim denominadas devido à composição lipofílica que apresentam; encontram-se relacionados

a várias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em seu ecossistema, exercendo papel

fundamental na defesa contra microorganismos e insetos, e também na atração de insetos e

outros agentes fecundadores (NEVES et al., 2007).

Estima-se cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem

propriedades antifúngicas e 35% exibem atividades antibacterianas (BHAVANANI e

BALLOW, 1992), apresentando por isso, uma longa tradição de uso na prática médica

popular (SIANI et al.,2000).

Os óleos essenciais, devido às suas propriedades físico-químicas, são também

designados como óleos voláteis, aromáticos ou etéreos. Podem ser encontrados em várias

25

espécies vegetais e estarem distribuídos em vários órgãos vegetais da planta, tais como flores,

folhas, casca do caule, madeira, raízes, rizomas, frutos e sementes (SIANI et al., 2000;

SIMÕES e SPITZER, 2004). São instáveis à presença de luz, calor e umidade (KUNLE et al.,

2003).

Além do metabolismo primário, responsável pela produção de celulose, lignina,

proteínas, lipídios, açúcares e outras substâncias que realizam suas principais funções vitais,

as plantas também apresentam o chamado metabolismo secundário, do qual resultam

substâncias de baixo peso molecular, às vezes produzidas em pequenas quantidades: os

alcaloídes, esteróides, terpenóides, flavonóides, lignóides e derivados de fenilpropanóides.

Esses compostos são biossintetizados a partir de metabólitos primários, e apresentam

distribuição restrita a certas plantas ou microrganismos, sendo que muitas vezes a síntese

desses compostos é específica de um dado gênero ou espécie (ALVES et al., 2000).

Os metabólitos secundários não são necessariamente produzidos em todas as

condições. Na composição do óleo essencial de uma mesma espécie vegetal, pode haver a

influência de fatores não-genéticos determinando diferenças no teor dos constituintes e no

rendimento do óleo. Dentre os fatores podem ser citados: a época de coleta, condições

climáticas e de solo, localização geográfica; ciclo vegetativo da espécie, o processo de

obtenção do óleo e as condições de secagem e estocagem (NEVES et al., 2007; ANDRADE e

GOMES, 2003; AKROUT et al., 2003).

Portanto, sendo os constituintes dos óleos essenciais originados do metabolismo

secundário das plantas, possuem composição química mais complexa do que os metabólitos

primários, destacando-se a presença de terpenos (normalmente, monoterpenos e

sesquiterpenos) e fenilpropanóides (GONÇALVES et al., 2003; SILVA et al., 2003).

Os fenilpropanóides formam um grupo de compostos químicos derivados dos

aminoácidos fenilalanina e tirosina ou da via do xiquimato que basicamente apresentam 3

carbonos ligados a um anel benzóico (SIMAS et al., 2004.). Possuem reconhecida atividade

hepatoprotetora, antialérgica e antimicrobiana. Vários autores descrevem atividades

nematicida, antifúngica e antioxidante dessa classe de compostos. Estudos demonstram ainda

que modificações na estrutura dos fenilpropanóides podem formar derivados capazes de

ocasionar efeito sinérgico sobre a atividade citotóxica, inibindo o crescimento de células

neoplásicas (LEE et al., 2002; MATSUDA et al., 2003; ACERO-ORTEGA et al., 2005).

Os terpenóides presentes nos óleos essenciais atuam sobre as estruturas da membrana

celular, causando danos às células (SIKKEMA, BONT e POOLMAN, 1994), e são derivados

de unidades de isopreno (C-5), cuja origem biossintética é proveniente da rota do ácido

26

mevalônico e são classificados como hemiterpenóides (C5), monoterpenóides(C10),

sesquiterpenóides(C15), diterpenóides (C20), sesterpenóides (C-25), triterpenóides (C-30),

esteróides (C-18 a C-30) e tetraterpenóides, carotenóides (C-40) (DEWICK, 1997). São

numerosos os compostos terpênicos conhecidos, podendo apresentar estruturas variáveis,

como hidrocarbonetos insaturados, álcoois, aldeídos ou cetonas, lactonas e troplonas, sendo

ainda acíclicos, monocíclicos ou bicíclicos (SIMÕES e SPITZER, 2004).

A partir do isolamento de vários monoterpenos (α e β-pineno, 3-careno, limoneno,

mirceno, α-terpineno e canfeno) que foram avaliados quanto à toxicidade, foi demonstrada a

atividade frente a diferentes insetos, resultando no estabelecimento da importância dos

terpenos como defensivos de plantas (HARBONE, 1993). As plantas brasileiras ricas em

óleos essenciais contendo sesquiterpenos abundantes como nerolidol e farnesol,

monoterpenos como e α e β -pineno, carvona e geraniol e fenilpropanóides como safrol,

eugenol e aldeído cinâmico são alternativas interessantes para o controle de larvas de A.

aegypti e outros insetos, evidenciando ainda a importância da lipofilicidade de terpenos para a

atividade larvicida destes e relatando a menor atividade de fenilpropanóides contendo núcleos

benzênicos que possuem substituintes nucleofílicos, como hidroxila, metoxila e benzodioxila

(KAINULAINEN et al., 1998).

Carvalho et al. (2003) relacionaram a atividade larvicida do óleo essencial de Lippia

sidoides à presença de timol e carvacrol. O alto teor de timol no óleo essencial de Lippia

sidoides foi considerado por Fontenelle et al. (2007) como responsável pela propriedade

antifúngica da espécie.

Chagas et al. (2002) identificaram no óleo essencial de Eucalyptus staigeriana, 26

substâncias diferentes, reconhecendo a atividade inseticida de compostos como citral, α -

pineno e β-pineno, terpineno, terpineol e ainda o dl-limoneno.

A análise cromatográfica dos óleos essenciais de folhas frescas e secas do Oreganum

vulgare em diversos estudos, demonstra como componentes majoritários os terpenos: ρ-

cimeno, terpinoleno, γ-terpineno, α-terpineol, linalol, 4-terpineol, timol, carvacrol e

germacreno-D e α-pineno, dentre outros. Alguns autores atribuem ao timol, composto

fenólico, a alta atividade antibacteriana do óleo essencial dessa espécie, uma vez que os

principais componentes do óleo, 4-terpineol, α -terpineol e γ –terpineno, não apresentam

atividade antibacteriana reconhecida (ALIGIANNIS et al., 2001; OUSSALAH, CAILLET e

LACROIX, 2007).

Vários outros autores atribuem atividade antibacteriana e antifúngica a pequenos

terpenóides e compostos fenólicos como timol, carvona, carvacrol, mentol e muuroleno

27

(MENDES et al., 2010; SIKKEMA, BONT e POOLMAN, 1994; DIDRY, DUBREIL e

PINKAS, 1993). Apesar dos seus mecanismos de ação não estarem bem caracterizados, para

Sikkema, Bont e Poolman (1994) parece haver uma associação entre o caráter lipofílico dos

compostos, havendo seu acúmulo em membranas e perda de energia pelas células.

Estudos de Novacosk e Torres (2006) demonstram que óleos essenciais eficazes

apresentam um teor relativamente importante em álcoois, fenóis e aldeídos (eugenol, timol,

carvavrol, geraniol), poderosos agentes anti-sépticos, bem como de terpenos (α e β-pinenos e

limoneno), assim comprovando a existência das propriedades antimicrobianas conhecidas

nestes grupamentos químicos.

3.4 Atualização sobre as propriedades e constituintes químicos de espécies do gênero

Lippia

Inúmeros são os estudos que publicam a composição química e as propriedades

antimicrobianas e farmacológicas das várias espécies vegetais, dentre os quais se destaca o de

Pascual et al.(2001) que listaram comparativamente esses aspectos e o uso tradicional de

espécies de Lippia.

A presente pesquisa permitiu uma atualização do gênero Lippia abordando os

metabólitos secundários identificados ou isolados e as atividades relatadas desde 2001 até os

dias atuais. A revisão foi realizada entre os periódicos disponíveis no banco de dados da

CAPES, utilizando o portal Google Schollar.

Na busca, utilizando a palavra chave ―Lippia‖ apareceram aproximadamente 8.410

artigos, refinada pelo termo ―chemical composition and biological activities‖ esse número

decresceu para 1.140 referências. Dentre esses, foram selecionados os artigos publicados após

2001, que contivessem as espécies estudadas, as partes utilizadas da planta, os produtos

naturais obtidos, os componentes majoritários isolados ou identificados nos óleos essenciais e

as suas quantificações, resultando em 62 referências ao gênero. Essa coleta de dados permitiu

a elaboração dos quadros 1 e 2, nas pags 28 e 33 respectivamente

28

QUADRO 1: Dados sobre espécies de Lippia abordando constituição química e atividades nos últimos

dez anos

Espécie Parte da

planta

Fontes Atividades Principais

componentes

identificados ou

isolados(%)

Referências

L. adoensis Folhas Extratos Antimicrobina - Tadeg et al.,

2005

L. alba

Partes aéreas Óleo

essencial

Virucida carvona(39,7)

limoneno(30,6)

Ocazionez et

al., 2010

Partes aéreas e

raiz

Extrato Antimicrobiana - Aguiar et

al., 2008

Raízes Extrato Antimicrobiana terpenóides

fenilpropanóides

Sena Filho

et al., 2006

- Óleo

essencial

Anifúngica elemeno

α- pineno,

cis-cariofileno,

carvacrol, timol e

terpineol

Souza et al.,

2005

Folhas, caule e

raiz Extratos

Atividade

citotóxica -

Costa,

Aguiar e

Nascimento,

2004

Folhas frescas Óleo

essencial

Atividade

antioxidante

carvona(51)

limoneno(32.6)

bibiclosesquifelan-

dreno(7.3)

Stashenko,

Jaramillo e

Martinez,

2004

Folhas Extrato Inibição do

ritmo cardíaco -

Gazola et

al., 2004

- Extratos

Antimutagênico

via atividade

antioxidante

- Ramos et

al., 2003

Folhas frescas Óleo

essencial

No sistema

nervoso central

citral

mirceno

limoneno

Do Vale et

al., 2002

- Óleo

essencial

No sistema

nervoso central -

Zétola et al.,

2002

L. berlandieri -

Óleo

essencial Conservante -

Sosa et al.,

2010

(Cont.)

29

Folhas Óleo

essencial Antioxidante

carvacrol

timol

Rocha-

Guzmán et

al., 2007

L. dulcis

Partes aéreas Óleo

essencial

Anti-

espasmódica

cânfora(32.62)

hernandulcina(10.1)

Görnemann

et al., 2008

Partes aéreas Extratos Anti-

inflamatória -

Pérez et al.,

2005

L. chevalieri

Moldenke

Folhas Óleo

essencial

Atividade

antimicrobiana

timol(27.4)

p-cimeno(21.1)

2-fenil etil(12.6)

Bassole et

al., 2003

Flores Óleo

essencial Antimicrobiana

b-cariofileno(27.3)

elemol(22)

germacreno D(6)

Mevy et al.,

2007

L. citriodora Parte aéreas Óleo

essencial Virucida

geranial(18.9)

neral(15.6)

limoneno(10.7)

Ocazionez et

al., 2010

L. gracillis

Folhas secas Óleo

essencial

Analgésica,anti-

inflamatória e

antifúngica

timol(32.68)

p-cimeno(17.82)

metil timol(10.83)

carvacrol(7.53)

Mendes et

al., 2010

- Óleo

essencial Antifúngica -

Oliveira et

al., 2008

Folhas Óleo

essencial

Larvicida

carvacrol(44.43)

o-cimeno(9.42)

γ-terpineno(9.16)

b-cariofileno(8.83)

Silva et al.,

2008

Folhas Óleo

essencial

Antimicrobiana

carvacrol(54.4)

p-cimeno(10.7)

α-terpinene(8.0)

Lima et al.,

2008

Folhas Óleo

essencial Antimicrobiana

carvacrol(41.77)

timol(10.13)

Albuquerque

et al., 2006

Folhas frescas Óleo

essencial Antimicrobiana

carvacrol(54.4)

p-cimeno(10.7)

trans-

ariofileno(6.1)

Pessoa et

al., 2005

L. graveollens

- Óleo

essencial

Antimicrobiana

e antioxidante

Sanchéz et

al., 2010

Partes aéreas Óleo

essencial Antimicrobiana

carvacrol(37.84)

m-cimeno(20.42)

Hernández

et al., 2009

(Cont.)

30

timol(6.72)

isocariofileno(2.18)

Partes aéreas Óleo

essencial Antimicrobiana -

Salgueiro et

al., 2003

L. javanica

Folhas, flores

e caules

Óleo

essencial Antimicrobiana

3-metil-6-(1-

metiletiliden)-

ciclohex-2-en-1-

ona (74.4)

Manenzhe,

Potgieter e

Van Ree,

2004

Partes aéreas Óleo

essencial Antimicrobiana

mircenona

piperitenona

ipsenona

carvona

linalol

Viljoen et

al., 2005

L. lacunosa

Planta Extrato Antimicrobiana -

Leitão et al.,

2006

L.

mycrophylla

Cham.

Planta Extrato Psicoléptica,

neuroléptica -

Omena,

2007

- Óleo

essencial Antifúngica -

Souza et al.,

2005

L. multiflora

Moldenke Planta Extrato Antimalárica -

Ajaiyeoba et

al., 2006

Folhas Óleo

essencial Escabicida

linalol(26.7)

geraniol(20.4)

limoneno(15.4)

Oladimeji et

al., 2005

Folhas Óleo

essencial Antimicrobiana

linalol(26.7)

geraniol(20.4)

limoneno(15.4)

Oladimeji,

Orafidiya e

Okeke, 2004

- Óleo

essencial

Analgésica

Antipirética

Anti-

inflamatória

- Abena et al.,

2003

Folhas Extrato e

carvacrol Antimicrobiana -

Kunle et al.,

2003

Folhas Óleo

essencial

Atividade

antimicrobiana

timol(29.9)

p-cimeno(26.2)

timil- acetato(11.7)

Bassole et

al., 2003

L. nodiflora

Mich. - Extrato Antioxidante -

Ashokkumar

et al., 2010

(Cont.)

31

L. rugosa

Folhas frescas Óleo

essencial Anti-fúngica

geraniol(51.5)

nerol(18.6)

geranial(10.4)

Tatsadjieu et

al., 2009

L. scaberrima Partes aéreas

Óleo

essencial

Antifúngica limoneno

carvona

Regnier et

al., 2008

L. sidoides

Cham.

- Óleo

essencial Antifúngica -

Oliveira et

al., 2008

Folhas Óleo

essencial Antifúngica

timol(59.65)

E-cariofileno(10.6)

p-cimeno(9.08)

Fontenelle et

al., 2007

Folhas Óleo

essencial

Antibacteriana

e inflamação na

cavidade bocal

carvacrol

timol

Botelho et

al., 2007a

Folhas Óleo

essencial

Antimicrobiana

e anti-

inflamatória

carvacrol

timol

Botelho et

al., 2007b

Folhas secas Gel

Prevenção da

reabsorção do

osso alveolar

carvacrol

timol

Botelho et

al., 2007c

Folhas Óleo

essencial

Anti-

inflamatória,

antioxidante e

gastroprotetora

timol(66.67)

E-

cariofileno(11.73)

Monteiro et

al., 2007

Partes aéreas

Óleo

essencial

Anti-helmíntica timol(59.65)

E-cariofileno(10.6)

Camurça-

Vasconcelos

et al., 2007

- Óleo

essencial Antimicrobiana -

Lemos et

al.,2006

Folhas

Óleo

essencial

Sinergismo

para cefalotina -

Oliveira et

al.,2006

Partes aéreas Extrato

Coadjuvante no

controle do

biofilme

dentário

-

Nunes et al.,

2006

(Cont.)

32

Folhas

Óleo

essencial

Inibição do

crescimento de

S. aureus

-

Oliveira et

al., 2006

Folhas Óleo

essencial Larvicida -

Costa et al.,

2005

Folhas e

inflorescências Extrato Antimicrobiana -

Nunes et al.,

2005

Folhas Óleo

essencial

Larvicida frente

ao Aedes

aegypti

carvacrol

timol

Carvalho et

al., 2003

Folhas Óleo

essencial

Redução da

gengivite,placa

bacteriana e

cálculos

dentários

timol(66.67) Girão et al.,

2003

(-) dados que não constam no artigo

(Cont.)

33

Quadro 2: Estruturas químicas de metabólitos secundários de espécies do gênero Lippia.

OH

Timol

p-cimeno

O

Timol metil éter

OH

Carvacrol

OH

Geraniol

OH

Nerol

OH

Geranial

Limoneno

(Cont.)

34

(Cont.)

O-cimeno

O

Carvona

OH

Linalol

γ -terpineno

Germacreno D

CHO

Citral

COH

Neral

α-pineno

35

(Cont.)

OH

Mirceno

OH

Cânfora

O

Piperitona

OH

α- terpineol

m- cimeno

O

Mircenona

OHH

Elemol

Elemeno

36

(Cont.)

E- cariofileno

HH

Isocariofileno

HH

Trans-cariofileno

ß-cariofileno

HH

Cis-cariofileno

Ipsenona

OCH2CH3

Timol-acetato

Biciclosesquifelandreno

MATERIAL E MÉTODOS

______________________________________________

38

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta do material vegetal

Folhas de L. gracillis foram coletadas (Figura 2, pag. 38) no mês de janeiro/2009, em

quatro diferentes horários do dia (8:00, 11:00, 14:00 e 17:00 horas), no Horto da Universidade

Regional do Cariri, em Crato (CE), sendo parte das folhas submetida à desidratação. Uma

amostra representativa da espécie foi classificada e depositada no Herbário Prisco Bezerra da

Universidade Federal do Ceará, sob o número 44.456.

Figura 2: Coleta das folhas de Lippia gracillis no Horto de Plantas Medicinais e Aromáticas

– LPPN/ URCA (Fonte: do autor)

39

4.2 Obtenção do óleo essencial

Os óleos essenciais extraídos das folhas frescas (OEFF) e secas (OEFS) foram obtidos,

separadamente, por hidrodestilação em um balão de vidro de 5 L contendo 2,5 L de água

destilada, utilizando aparelho tipo Clevenger modificado por Gottlieb (Figura 3, pag. 39) da

marca Quimís, durante um período de 2 horas. Em seguida as misturas óleo/água foram

coletadas, secas com sulfato de sódio anidro (Na2SO4), filtradas e armazenadas sob

refrigeração a menos 4ºC até a realização das análises químicas e dos ensaios

antimicrobianos.

Figura 3: Aparelho tipo Clevenger modificado por Gottlieb (Fonte: do autor)

40

4.3 Análise da composição química dos óleos essenciais

As análises das composições químicas foram realizadas usando um espectrômetro

Shimadzu CG-17A / EM QP5050A (sistema de CG/EM): DB-5HT coluna de capilaridade (30

m x 0,251 mm); gás de portador: hélio 1,7 mL/min; pressão da coluna 107,8 kPa; velocidade

linear = 47,3 cm/seg; fluxo total 24 mL/min; fluxo de portador 24 mL/min; temperatura do

injetor 270 ºC; temperatura de detector 290 ºC; temperatura da coluna 60 (2 min) - 180 ºC (1

min) a 4 ºC/min, então 180 - 260 ºC a 10 ºC/min (10 min), operando sob energia de ionização

de 70 eV.

A identificação dos componentes foi baseada na fragmentação espectral, usando

padrões da biblioteca de computador Wiley 229, além de dois outros argumentos: os índices

de retenção e a comparação com dados da literatura (ADAMS, 2001; ALENCAR et al.,1990).

4.4 Screening antimicrobiano por difusão em cavidades

A ação antimicrobiana dos óleos essenciais de L. gracillis (OELG) obtidos de folhas

frescas (OEFF) e secas (OEFS), foram determinadas pelo método de difusão cavidade em

agar (modificado a partir de NAIR, VASUDEVAN e VENKITANARAYANAN, 2005;

SAHIN et al., 2004).

Os inóculos bacterianos e fúngicos foram obtidos a partir de colônias frescas crescidas

em placas de ágar Mueller-Hinton para bactérias e Potato Dextrose Agar (PDA) para fungos, a

fim de obter uma concentração de 1.0 x 108 UFC/mL (0.5 na escala MacFarland).

Na avaliação da atividade antibacteriana foram utilizadas seis culturas padrão cedidas

pela Fundação Oswaldo Cruz- FIOCRUZ, sendo quatro Gram- negativas Escherichia coli

ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Shigella flexneri ATCC 12022,

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 e duas Gram-positivas Sthaphylococcus aureus ATCC

12692 e Bacilus cereus ATCC 33018, reavivadas em meio ágar Brain Heart Infusion (BHI),

sendo incubadas por 24 horas a 37 ºC.

Na avaliação da atividade antifúngica foram utilizadas quatro culturas padrão cedidas

pela Universidade Federal da Paraíba, Candida albicans ATCC 40006, Candida albicans

41

ATCC 40277, Candida krusei ATCC 6438, Candida tropicalis ATCC 40042, reavivadas em

meio PDA, sendo incubadas por 24 horas à temperatura ambiente.

As placas de Petri utilizadas apresentavam 80 centímetros de diâmetro e em suas

superfícies já contendo os respectivos meios de cultura foram realizados perifericamente,

orifícios de aproximadamente 6 mm de diâmetro, equidistantes do centro da placa e entre si

(Figura 4, pag. 41). Os microorganismos foram semeados com o auxílio de um swab

estéril,nas placas de Petri previamente perfuradas. Cada orifício da placa recebeu 30 μL da

solução do óleo testado, em concentrações de 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6% e 0,3%.

Todos os testes foram executados em triplicata para o cálculo dos valores médios e

desvio-padrão. Como controle negativo foi usado o Dimetilsulfóxido (DMSO, Merck,

Darmstadt, Alemanha) a 2%. Discos de clorafenicol (30 μg/mL) e tetraciclina (30 μg/mL), e

ainda o cetoconazol (100 μg/mL) foram usados como compostos antimicrobianos de

referência a fim de comparar a sensibilidade das bactérias e dos fungos, respectivamente.

Após período de incubação de 24 h a 35ºC + 2º C, todas as placas foram examinadas

para verificar as zonas de inibição do crescimento, indicativo da atividade antimicrobiana. Os

diâmetros das zonas de inibição foram medidos através de uma régua milimetrada. Os

diâmetros de zona de inibição foram expressos em milímetros, considerando os seguintes

parâmetros: < 9 mm, inativo; 9-12 mm, parcialmente ativo; 13-18 mm, ativo; >18 mm, muito

ativo (ALVES et al., 2000; RIOS, RECIO e VILLAR, 1998).

Figura 4: (A) Perfuração dos orifícios nas placas com meio de cultura; (B) Semeadura dos

microorganismos nas placas. (Fonte: do autor)

A

B

42

4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A concentração inibitória mínima (CIM) do OEFF e do OEFS de L. gracillis foram

avaliadas pelo método de microdiluição em caldo, com base no documento M7-A6 para

bactérias (NCCLS, 2003).

Foram testadas bactérias Gram-negativas (E. coli e P. aeruginosa) e Gram-positiva

(S. aureus); sendo três linhagens padrão, E. coli ATCC 10536, S.aureus ATCC 12692 e

P.aeruginosa ATCC 15442 e dois isolados clínicos, S. aureus 358 e E. coli 27.

Previamente aos testes, as cepas bacterianas foram reavivadas em caldo BHI 3,8%

durante 24 horas a 35ºC + 2º C. Após esse sulbcultivo, procedeu-se a padronização do

inóculo, que consistiu na preparação de uma suspensão bacteriana em BHI, apresentando

turvação similar ao tubo 0,5 da Escala Mac Farland (1 x 108 UFC/ mL) em caldo BHI a 10%.

As amostras dos óleos a serem testados foram previamente preparados para obtenção

de uma concentração inicial de 10 mg / mL, sendo observada a seguinte proporção: 10 mg da

amostra solubilizada em 1 mL de DMSO. A partir desta concentração, foi efetuada uma

diluição de 1: 10 em água destilada estéril (10 mg / mL), e em seguida, esta foi diluída da

mesma forma formando uma solução estoque de 1024 µg/ mL. Após esse processo, diluições

seriadas foram realizadas na proporção 1:1 em água destilada, obtendo-se as concentrações de

512, 256, 128, 64, 32, 16, 8 µg/ mL.

Foram utilizados 100 µL de meios e de amostras, distribuídos em cavidades de

microplacas estéreis. As amostras estavam preparadas em concentração dobrada (1.024 µg/

mL) em relação à concentração inicial definida em volumes de 100 µL e posteriormente

foram diluídas seriadamente 1:2 em caldo BHI 10%. Em cada cavidade com 100 µL do meio

de cultura foi colocada uma amostra da suspensão bacteriana diluída na proporção de 1: 10

Figura 5 (pag. 43) resultando no inóculo final de 1 x 105 UFC/mL.

O controle negativo foi realizado com o caldo BHI, enquanto o controle positivo foi o

caldo mais o inóculo. A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor

concentração capaz de inibir completamente o crescimento microbiano Os ensaios foram

realizados em triplicata e as placas incubadas por 24 h à 37 + 2º C (JAVADPOUR et al.,

1996).

43

Como revelador foi utilizado 20 μL/ poço de resazurina sódica (SIGMA) preparada

em água destilada estéril na concentração de 0,01% (p/v), por um período de 1 hora em

temperatura ambiente. A leitura dos resultados para determinação da CIM foi considerada

como positiva para os poços que permaneceram com a coloração azul e negativa os que

obtiveram coloração vermelha (COUTINHO, 2008).

Figura 5: (A) Inoculação da suspensão bacteriana nos poços de microdiluição; (B) Placa de

microdiluição. (Fonte: do autor)

4.6 Avaliação da atividade moduladora por contato direto

Para a verificação do produto natural como modulador da atividade antibiótica

somente foi testado o OEFF de L. gracillis. A sua concentração inibitória minima (CIM) e a

dos antibióticos aminoglicosídeos utilizados (neomicina, canamicina, amicacina e

gentamicina) foram determinados de acordo com o método da microdiluição descrito no

documento CLSI M7-A6, utilizando concentrações subinibitórias em BHI a 10%.

Foram utilizadas duas culturas padrão cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz-

FIOCRUZ, sendo uma gram- negativa Escherichia coli ATCC 10536 e uma gram-positiva

Sthaphylococcus aureus ATCC 12692 e ainda, um isolado clínico, Escherichia coli 27.

As amostras a serem testadas foram preparadas em concentração dobrada (1024 µg/

mL ) em relação à concentração inicial (Javadpour et al.,1996). Para avaliação do óleo

essencial como modulador da resistência dos antibióticos, foram adicionados nos poços das

placas de microdiluição, as bactérias a serem testadas, juntamente com os aminoglicosídeos:

canamicina, amicacina, neomicina e gentamicina (Sigma Chemical Co.) e também, o óleo

A

B

44

essencial de Lippia gracillis, em concentrações subinibitórias (CIM/8). O teste foi

acompanhado de um controle negativo que consistia na solução de microrganismos e dos

antibióticos supracitados. As placas foram incubadas por 24 h a 37º C. A leitura foi realizada

pela adição da resazurina sódica, conforme descrita anteriormente.

4.7 Avaliação da atividade moduladora por contato a vapor

A modificação da atividade dos antibióticos pelos componentes voláteis do OEFF e do

OEFS foi determinada pelo método do contato a vapor (modificado por INOUYE,

TAKIZAWA e YAMAGUCHI, 2001). A avaliação foi realizada em triplicata, utilizando as

soluções contendo 50, 25, 12.5, 6.25 e 3.12 % dos óleos essenciais diluído em DMSO.

Foram utilizadas duas culturas padrão, sendo uma Gram- negativa, P. aeruginosa

ATCC 15442 e outra Gram-positiva, S. aureus ATCC 12692, reavivadas em meio BHI, sendo

incubadas por 24 horas a 37 ºC.

A partir das placas de BHI, as bactérias foram colocadas em suspensão no tubo de

ensaio alcançando uma turvação equivalente a 0,5 na escala de McFarland (1x 108 UFC/mL).

Em seguida, os microorganismos foram semeados com o auxílio de um swab estéril

em placas de Petri com Plate Count Agar (PCA, Difco). Na porção inferior e central das

placas, foram utilizados discos com os antibióticos amicacina (30 μg), gentamicina (10 μg) e

tetraciclina (10μg) da LABORCLIN (Figura 6, pag. 45) para verificar alterações no diâmetro

da zona de inibição do crescimento dos microorganismos. As placas foram invertidas e na

porção superior delas foi colocado 50 μL de cada concentração dos óleos essenciais, para que

os componentes voláteis interagissem com os antibióticos. Foram utilizadas como controle:

placas contendo DMSO sem o óleo essencial e placas contendo somente os antibióticos.

A leitura foi realizada após um período de incubação por 24 horas a 35 + 2º C, como

auxílio de uma régua milimetrada.

45

Figura 6: (A) Amicacina, Tobramicina e Gentamicina; (B) Utilização dos antibióticos

aminoglicosídeos. (Fonte: do autor)

4.8 Análise estatística

Os resultados foram expressos em média e ± desvio padrão da média, avaliados

estatisticamente usando-se o teste de Tukey e análise de variância (ANOVA), utilizando o

programa Microcal Origin 6,0 para Windows, onde as diferenças foram consideradas

significativas quando p< 0,05.

A B

RESULTADOS E DISCUSSÃO

47

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise da composição química dos óleos essenciais das folhas frescas e secas de

Lippia gracillis

As folhas de L. gracillis utilizadas para obtenção do óleo essencial de folhas frescas

(OEFF) e do óleo essencial de folhas secas (OEFS) utilizados nos ensaios antimicrobianos,

foram coletadas no mesmo dia e horário. O rendimento do óleo de L. gracillis extraído das

folhas secas foi consideravelmente superior àquele obtido a partir das folhas frescas, sendo

respectivamente de 2,64% e 0,56% (Tabela 1).

Tabela 1: Rendimento dos óleos essenciais de folhas frescas (OEFF) e secas (OEFS) de L.

gracillis

Óleo essencial Massa (g) Rendimento (%)

OEFF 77,0 0,56ª

OEFS 35,6 2,64b

* Rendimentos seguidos de letras diferentes, na coluna, diferem significativamente (p<0,05- teste de Tukey).

Nos estudos da composição química dos óleos essenciais, geralmente é identificado

um composto ativo majoritário, no entanto, por serem constituídos por complexas misturas de

substâncias voláteis, os óleos incluem na sua composição outros componentes químicos,

como uma série de hidrocarbonetos terpênicos, ésteres, ácidos orgânicos, aldeídos, cetonas,

fenóis entre outros, em diferentes concentrações (BURT, 2004).

A análise por CG/EM do óleo essencial das folhas frescas (OEFF) permitiu a

identificação de 17 constituintes químicos representando 96.26 % do óleo essencial, sendo 13

monoterpenos e 4 sesquiterpenos. Foi possível identificar ainda que dos monoterpenos, 5 são

oxigenados (4-terpineol, timol-metil éter, carvacrol-metil éter, timol e carvacrol), enquanto

que dos sesquiterpenos apenas 1 (óxido de cariofileno). Os constituintes presentes em maior

concentração no óleo foram: timol (44,42%), carvacrol (22,21 %), p-cimeno (6,23 %) e α-

pineno (5,65 %). A composição deste óleo essencial está demonstrada na Tabela 2.

48

Com relação à composição química do óleo essencial das folhas secas (OEFS),

fazendo uso do mesmo processo analítico, foi possível identificar 86,99 % da sua constituição

química, correspondendo a 15 compostos (Tabela 2). Deste total estão relatados: 7

monoterpenos não-oxigenados; 5 monoterpenos oxigenados e 3 sesquiterpenos não-

oxigenados. Neste óleo volátil foram encontrados em maior quantidade timol (21,30%),

carvacrol (20,85 %), α-pineno (19,42 %) e p-cimeno (8,58%).

Os estudos de GRIFFIN et al. (1999) chamam a atenção para o fato dos sesquiterpenos

oxigenados, como o óxido de cariofileno observado no OEFF, demonstrarem uma atividade

antimicrobiana maior do que os hidrocarbonetos sesquiterpênicos, devido à capacidade que

apresentam de formar pontes de hidrogênio desestabilizando a membrana celular. A lipofilia

dos hidrocarbonetos de estrutura terpênica pode ser a propriedade que facilita a penetração de

agentes antimicrobianos convencionais no interior da célula (BREHM-STECHER e

JOHNSON, 2003). Estudos de Pina-Vaz et al.(2004) demonstram ainda que após a lesão

primária na membrana, outro fator a ser considerado é a rápida descarga de potássio.

Mendonza, Wilkens e Urzua (1997) conseguiram demonstrar que aumentando a

hidrofobicidade do diterpeno ácido caurenóico, por adição de um grupo metila, sua atividade

antimicrobiana seria drasticamente reduzida. Murari et al.(2008) relatam que o efeito de

alguns terpenóides sobre a captação de oxigênio e a fosforilação oxidativa da célula

bacteriana são fatores que também contribuem para a atividade antimicrobiana dos óleos

essenciais.

Pode ser observado na Tabela 2, que os óleos essenciais estudados apresentam em suas

composições praticamente os mesmos componentes químicos, embora com quantificações

variáveis. Nos dois óleos as substâncias majoritárias são as mesmas, timol e carvacrol, sendo

que no OEFF a quantidade de timol (44,42 %) é o dobro em relação à de carvacrol (22,21 %),

enquanto no OEFS os dois componentes aparecem praticamente na mesma proporção (21,3 e

20,85, respectivamente). Timol e carvacrol apresentam estrutura semelhante, diferindo apenas

pela posição do grupo hidroxila no anel fenólico (ULTEE, KETS e SMID,1999). Esses

compostos agem contra os microorganismos através de uma ação lipofílica na membrana

celular, ocasionando a dispersão da cadeia de polipeptídeos da membrana celular e

desestabilizando a célula contra a qual estão desempenhando a sua atividade (NOSTRO et al.,

2004; COWAN, 1999).

Estudos utilizando o óleo essencial do orégano (Oreganum vulgare) permitiram a

observação de timol e carvacrol acumulados na membrana plasmática da P. aeruginosa e do

49

S. aureus, resultando em aumento de 90% na permeabilidade celular desses microorganismos.

Após ocorrerem modificações na permeabilidade membranar, ocorrem ainda alterações no

funcionamento dos canais de cálcio, perturbando o equilíbrio iônico e danificando a estrutura

morfofuncional da célula; sugere-se ainda que os componentes voláteis dos óleos essenciais

possam ocasionar a quebra dos ácidos nucléicos intracelulares e a inativação de enzimas

comprometidas com a produção da energia necessária à síntese de componentes estruturais

(KNOWLES et al., 2005; LAMBERT et al., 2001).

50

Tabela 2: Composição química dos óleos essenciais obtidos das folhas frescas (OEFF) e

secas (OEFS) da L. gracillis (Schauer)

Componentes

OEFF OEFS

RT* (%) RT* (%)

α-tujeno 7,66 0,47 -

-

α-pineno 10,96 5,65 10,64

19,42

β-pineno 12,43 0,33 12,42

0,83

Mirceno 12,69 1,63 12,68

2,00

α-terpineno 13,78 0,61 13,78

0,79

p-cimeno 13,88 6,23 13,87

8,58

Limoneno 14,25 0,39 14,24

0,83

γ-terpineno 16,45 2,83 15,25

3,51

4–terpineol 19,48 3,27 19,48

0,40

timol-metil éter 21,29 0,63 21,27

3,46

carvacrol-metil éter 21,67 0,74 21,66

0,64

timol 23,14 44,42 23,01

21,30

Carvacrol 23,45 22,21 23,36

20,85

β-cariofileno 28,43 5,61 28,40

3,57

α-humuleno 29,44 0,45 29,44

0,27

δ-cadineno 31,31 0,26 31,31

0,54

oxido de cariofileno 33,37 0,51 -

-

Total 96,26 86,99

RT* - tempo de retenção

51

Quadro 3: Estruturas químicas dos constituintes majoritários presentes nos óleos essenciais

de folhas frescas e secas de L. gracillis Schauer

OH

Timol

OH

Carvacrol

p-cimeno

α- pineno

Outros constituintes identificados nos óleos essenciais estudados foram o p-cimeno e o

α-pineno. A quantificação do α-pineno foi consideravelmente maior no OEFS (19,42) do que

no OEFF (5,65); no entanto, em relação ao p-cimeno não houve variação quantitativa

considerável (8,58 e 6,23 para o OEFS e OEFF, respectivamente). Estudos demonstram que

maiores quantidades de p-cimeno podem ser formadas a partir da oxidação do γ-terpineno e

do α-terpineno, causada pela luz e pelo ar (BROPHY e JOGIA, 2006). A literatura reconhece

as propriedades do p-cimeno e do α-pineno e quantifica-os na composição dos óleos

52

essenciais de várias espécies de Lippia, sugerindo que como componentes minoritários dos

óleos essenciais trabalhem sinergicamente para produzir atividades biológicas (MENDES et

al., 2010; LIMA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2007b).

5.2 Efeito do horário de coleta na composição química dos óleos essenciais de Lippia

gracillis

Os óleos essenciais obtidos a partir das folhas frescas de L. gracillis foram

coletadas em diferentes horários do mesmo dia e apresentaram rendimentos similares,

conforme está representado na Tabela 3. Segundo Morais (2009) o horário de coleta é um

ponto relevante, sendo necessário definir o melhor horário para fazê-lo, o que deve coincidir

com o momento de maior expressão do princípio ativo e maior rendimento da fitomassa.

Tabela 3: Rendimento dos óleos essenciais das folhas frescas de Lippia gracillis em

diferentes horários de coleta

* Rendimentos seguidos de letras iguais, na coluna, não diferem significativamente (p<0,05- teste de Tukey).

Diversos fatores influenciam a produção dos óleos essenciais, de modo que em relação

à espécie L. gracillis, alguns autores citaram o carvacrol como sendo o componente

majoritário nos óleos essenciais, demonstrando ser este composto mais efetivo do que os seus

derivados onde o grupo hidroxila é substituído por metila ou acetil (LIMA et al., 2008;

PESSOA et al., 2005; SILVA et al., 2008). Outros estudos que analisaram quimicamente o

óleo essencial das folhas de L. gracillis, observaram entre os constituintes químicos, o timol

como componente majoritário (MENDES et al., 2010).

Para Sorensen (2000), na obtenção de óleos essenciais fatores intrínsecos (genéticos)

podem ser influenciados por fatores extrínsecos como solo, métodos de extração, secagem da

Óleo essencial Massa (g) Rendimento(%)

7:00 77 0,56a

10:00 78 0,55b

14:00 77 0,53ª, b

17:00 76 0,57b, c

53

planta, temperatura, horários de coleta, sazonalidade, comprimento do dia, umidade,

intensidade e qualidade da luz.

A composição química dos óleos essenciais analisados está representada na Tabela 4,

possibilitando a observação das diferenças quantitativas e qualitativas relacionadas aos

diferentes horários de coleta.

A análise por CG/EM permitiu a identificação da composição química dos óleos

essenciais, sendo 17 (96,26 %), 20 (93,72 %), 20 (85,81 %) e 16 (89,26 %), os constituintes

identificados respectivamente nos óleos obtidos das folhas coletadas às 7:00, 10:00, 14:00 e

17:00 horas. Em todos os casos, foi observado o predomínio dos monoterpenos sob os

sesquiterpenos.

Os componentes majoritários observados nesses óleos essenciais foram: o timol

(44,42- 3,53 %), o carvacrol ( 35,27-17,10 %), o α-pineno ( 5,7- 5,65 %) , o p-cimeno (7,95-

4,22 %) e o β-cariofileno (6,0- 3,0 %), com uma grande variação nas proporções dos

constituintes químicos.

O timol, componente majoritário encontrado no óleo essencial obtido a partir da coleta

realizada às 7:00 horas ( 44,42%), foi encontrado apenas na concentração de 3,53% no óleo

proveniente da coleta realizada às 16:00 horas. A maior concentração de carvacrol foi

identificada no óleo essencial das 10:00 horas (35,27%), no entanto as concentrações desse

componente também foram significativas nos outros horários de coleta. O α-pineno foi

identificado somente nos óleos essenciais das 7:00 ( 5,65%) e 16:00 horas (5,70%).

Informações referentes à ação dos fatores abióticos no rendimento e na composição

química dos óleos essenciais são importantes para maximizar a produção de constituintes

ativos das espécies vegetais (MORAIS, 2009). Devido às proporções de timol e carvacrol

identificadas foram utilizados nos ensaios microbiológicos, os óleos essenciais extraídos das

folhas coletadas às 7:00.

54

Tabela 4: Composições químicas e percentuais dos componentes dos óleos essenciais de

Lippia gracillis em diferentes horários de coleta, em um mesmo dia.

Componentes

Composição

KI* 7:00h 10:00h 13:00h 16:00h

α-tujeno 927 0,47 0,60 - 0,31

α-pineno 931 5,63 - - 5,70

canfeno 948 - 0,27 - -

β-pineno 965 0,33 0,46 1,17 0,31

mirceno 992 1,63 0,79 2,51 0,79

α-terpineno 1012 0,61 1,44 0,87 0,51

p-cimeno 1028 6,23 7,95 7,78 4,22

Cis-ocimeno 1032 - 7,19 0,20 -

limoneno 1033 0,39 0,53 0,73 0,37

γ-terpineno 1060 2,83 4,27 3,68 3,30

linalol 1095 - 1,35 0,28 8,40

borneol 1168 - - 0,23 -

4–terpineol 1170 3,27 0,49 0,56 0,25

timol-metil éter 1231 0,63 4,40 6,28 -

carvacrol-metil éter 1239 0,74 0,52 0,88 -

timol 1285 44,42 4,14 17,17 3,53

carvacrol 1296 22,21 35,27 17,10 19,77

cinamato demetila 1374 - 16,68 20,95 38,15

α-copaeno 1369 - - 0,22 -

β-cariofileno 1405 5,65 6,00 4,19 3,00

Biciclogermacreno 1491 - - - 0,33

α-humuleno 1452 0,45 0,50 0,57 -

δ-cadineno 1501 0,26 0,24 0,26 -

óxido de cariofileno 1581 0,51 0,63 0,18 0,32

Total - 96,26% 93,72% 85,81% 89,26%

KI*- Índice Kovats

55

5.3 Resultados do screening antibacteriano

No teste de susceptibilidade para a avaliação da atividade antibacteriana, os óleos

essenciais de folhas frescas e secas de L. gracillis apresentaram atividade frente a quatro

bactérias testadas: P. aeruginosa ATCC 15442, S. aureus ATCC 12692, S. flexneri ATCC

12022 e B. cereus ATCC 33018 ( Tabelas 5 e 6). De acordo com parâmetros preconizados na

literatura (ALVES et al., 2000; RIOS, RECIO e VILAR, 1998), os óleos essenciais testados

na concentração de 10%, pelo diâmetro das zonas de inibição demonstradas nas Tabelas 5 e 6,

apresentam atividade parcial frente às bactérias supracitadas.

Há relatos na literatura da eficácia dos produtos naturais obtidos da L. gracillis, L.

chevalieri e L. multiflora, frente ao B.cereus (ALBUQUERQUE et al., 2006; BASSOLE et

al., 2003), enquanto outras espécies como L. triphylla apresentam-se ineficazes contra esses

microorganismos (OSKAY et al., 2005). Outros estudos demonstraram a atividade

antimicrobiana de espécies do gênero Lippia, inclusive L. gracillis, contra S. aureus (SENA

FILHO et al.,2006; PESSOA et al., 2005; OSKAY et al., 2005; AGUIAR et al., 2008).

Contudo, destaca-se nesse estudo, a atividade do OEFF e do OEFS frente à P.

aeruginosa ATCC 15442 quando comparados os halos de inibição produzidos por esses óleos

essenciais àqueles associados aos antibióticos utilizados como controle positivo,

principalmente o clorafenicol, conforme está demonstrado nas Tabelas 5 e 6.

Os dois óleos testados mostraram-se ineficazes contra E. coli e K. pneumoniae. Esses

resultados são condizentes com a literatura pertinente que demonstra menor susceptibilidade

dos microorganismos Gram-negativos aos agentes antimicrobianos (BURT, 2004; HOLLEY e

PATEL, 2005) o que pode ser explicado pela propriedade dos componentes voláteis dos óleos

essenciais atuarem primariamente sobre a membrana celular e os microorganismos

supracitados serem envolvidos por um envelope complexo (STAMMATI et al., 1999). Os

resultados do presente diferem em alguns aspectos daqueles obtidos por Pessoa et al. (2005)

utilizando essa mesma espécie vegetal, pois seus estudos demonstraram a eficácia do óleo

frente à E. coli e ineficácia contra P. aeruginosa.

Vários estudos associam a atividade antimicrobiana do óleo essencial de L. gracillis à

abundância de timol e carvacrol que inibem o crescimento de microorganismos, capacidade

considerada extensão do papel que esses compostos desempenham nos vegetais, protegendo-

os de microorganismos fitopatogênicos. Por esse motivo, o óleo é sugerido como matéria-

56

prima para a indústria farmacêutica e cosmética (ALBUQUERQUE et al.2006; BOTELHO et

al., 2007b).

Tabela 5: Atividade antibacteriana do óleo essencial de folhas frescas (OEFF) de Lippia

gracillis Schauer, determinada pelo método de contato direto.

Bactérias

Halos de inibição (mm de diâmetro)

OEFF

(10%)

OEFF

(5%)

Tetraciclina

(30 μg/mL)

Clorafenicol

(30 μg/mL)

DMSO

E. coli ATCC 25922 - - - 7+0,47 -

S. aureus ATCC12692 12,33+0,47

9+0,96 20+0,96 18+0,47 -

P.aeruginosa ATCC15442 11,33+0,96a

- 13+0,96 a 6+0,96

b -

S. flexneri ATCC12022 11,00+0,47 - 21+0,47 14+0,96 -

K.pneumoniae ATCC10031 - - 9+0,96 15+0,47 -

B. cereus ATCC33018 11,00+0,96 - 22+0,47 21+0,47 -

(-) Halo de inibição não-detectável. Médias seguidas de letras iguais na linha, não diferem significativamente

entre si (n=3, p<0,05- teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes na linha, diferem significativamente

quando comparado com o respectivo controle (n=3, p<0,05 ANOVA). Os resultados são expressos como média

+DP.

Tabela 6: Atividade antibacteriana do óleo essencial de folhas secas (OEFS) de Lippia

gracillis Schauer, determinada pelo método de contato direto.

Bactérias

Halos de inibição (mm de diâmetro)

OEFS

(10%)

OEFS

(5%)

Tetraciclina

(30 μg/mL)

Clorafenicol

(30 μg/mL)

DMSO

E. coli ATCC 25922 - - - 7+0,47 -

S. aureus ATCC 12692 12,33+0,47

- 20+0,96 18+0,47 -

P.aeruginosa ATCC 15442 11,33+0,47ª - 13+0,96 a 6+0,96

b -

S. flexneri ATCC 12022 12,00+0,96 - 21+0,47 14+0,96 -

K.pneumoniaeATCC10031 - - 9+0,96 15+0,96 -

B. cereus ATCC 33018 13,00+0,96 - 22+0,47 21+0,47 -

(-) Halo de inibição não-detectável. Médias seguidas de letras iguais na linha, não diferem significativamente

entre si (n=3, p<0,05- teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes na linha, diferem significativamente

quando comparado com o respectivo controle (n=3, p<0,05 ANOVA). Os resultados são expressos como média

+DP.

57

5.4 Resultado do screening antifúngico

Somente foi avaliada a atividade antifúngica do OEFF que demonstrou eficácia contra

quatro linhagens padrão de Candida: C. albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 6438, C.

tropicallis 40042 e C. albicans ATCC 40277, com halos de inibição maiores do que aqueles

produzidos pelo antimicrobiano padrão para estes microorganismos quando utilizadas as

maiores concentrações do óleo (Tabela 7). Destacam-se nesse estudo os resultados obtidos

frente às linhagens de C. albicans.

De acordo com parâmetros da literatura pertinente (ALVES et al., 2000; RIOS,

RECIO e VILAR, 1998), a atividade do OEFF na maior concentração do óleo frente aos

fungos testados é considerada muito ativa, pelo diâmetro dos halos de inibição obtidos.

Diversos estudos demonstram a propriedade antifúngica do gênero Lippia, associando-

a em parte ao timol e ao carvacrol por serem identificados como os componentes majoritários

na maioria dessas espécies (AGUIAR et al., 2008; BOTELHO et al., 2007b; PACKER e

LUZ, 2007; SOUZA et al., 2005; KUNLE et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2007b).

Alguns autores relatam redução na atividade antifúngica frente a C. albicans de

produtos naturais obtidos a partir de espécies de Thymus desprovidas de timol e carvacrol em

sua constituição, enquanto óleos extraídos de outras espécies do mesmo gênero, abundantes

em timol e carvacrol, demonstraram boa atividade antimicrobiana (PINA-VAZ et al., 2004;

RASSOLI e MIRMOSTAFA, 2003).

58

Tabela 7: Atividade antifúngica do óleo essencial da folha fresca (OEFF) de Lippia gracillis

Schauer, determinada pelo método de contato direto.

Fungos

Halos de inibição (mm de diâmetro)

OEFF

(10%)

OEFF

(5%)

OEFF

(2.5%)

OEFF

(1.25%)

OEFF

(0.6%)

OEFF

(0.3%)

C + C

-

Candida albicans

ATCC 40006

26.7+0.3a

18+0.3 b 14.4+0.5

c 9.7+0.5 9+0.00 9+0.3 12+0.3

c -

Candida. krusei

ATCC 6438

19.6+0.3b

11.6+0.6 c

9+0.0 9+0.6 8.0+0.0 8+0.0 9+0.0 c -

Candida tropicallis

ATCC 40042

23+0.6b

12.7+0.3 9.7+0.6 9.7+0.3 8.4+0.5 8+0.3 18+0.6 -

Candida. albicans

ATCC 40277

29.7+0.6a 12.7+0.5

c 12+0.6

c 10.7+0.3

c 9.7+0.6 9.5+0.5 9+0.3

c -

(-) Halo de inibição não-detectável. C+: Cetoconazol; C-: DMSO Médias seguidas de letras diferentes, na linha,

diferem significativamente quando comparado com o respectivo controle (n=3, p<0,05 ANOVA). Os resultados são

expressos como média +DP.

5.5 Resultado da concentração inibitória mínima (MIC) pelo método da microdiluição

A atividade antibacteriana dos óleos essenciais de L. gracillis foi evidenciada frente a

todas as cepas testadas, tanto Gram-positivas quanto Gram-negativas (Tabela 8). Destaca-se

nesse estudo o fato da menor CIM encontrada ser referente à E. coli de linhagem padrão (64

μg/mL) seguida pela E.coli resistente (128 μg/mL), representando as melhores atividades dos

dois óleos essenciais testados.

No entanto, é discordante em relação aos achados literários o fato de uma bactéria

Gram-negativa ser mais sensível ao óleo do que as Gram-positivas testadas, pois estudos

demonstram que de forma significativa aquelas demonstram maior resistência devido à

morfologia do seu envoltório externo, tornando a célula menos permeável ao óleo

(OLADIMEJI, ORAFIDIYA e OKEKE, 2004; HOLLEY e PATEL, 2005).

A maior susceptibilidade à ação dos óleos essenciais de folhas frescas e secas das

cepas de linhagem padrão (Ec 10536 e Sa 12692) em relação aos isolados clínicos (Ec 27 e Sa

358) está demonstrada na Tabela 8. Para Okeke, Fayinka e Lamikanra (2004) o aumento da

59

resistência nesses casos, pode ocorrer devido à exposição prévia dessas bactérias a condições

extremas como uso de anti-sépticos e antibióticos.

A P. aeruginosa e o isolado clínico de S. aureus apresentaram os maiores valores da

CIM, ou seja, foram menos sensíveis aos óleos testados quando comparados à sensibilidade

dos demais microorganismos. Em se tratando destas bactérias, houve similaridade entre a

CIM obtida pelo uso dos óleos extraídos das folhas frescas e secas. Há estudos que referem a

ineficácia ou a pouca eficácia do óleo essencial de espécies do gênero Lippia em relação à

P.aeruginosa (AGUIAR et al., 2008; PACKER e LUZ, 2007; OLADIMEJI, ORAFIDIYA e

OKEKE, 2004; KUNLE et al., 2003).

Os resultados observados frente às linhagens de E.coli e S. aureus corroboram com

estudos prévios de Lima et al. (2008), que reconheceram a propriedade antibacteriana do óleo

essencial de L. gracillis frente a esses microorganismos.

No presente estudo, os valores da CIM relacionados às cepas da linhagem padrão de

E.coli e de S. aureus e ao isolado clínico de E.coli demonstraram uma atividade mais eficaz

do OEFF quando comparado ao OEFS, fato que pode estar relacionado com a maior

quantidade de timol no óleo I (44,42%) do que no OEFS (21,30), uma vez que as proporções

dos outros componentes majoritários identificados são similares nos dois óleos, como o

carvacrol que aparece nas seguintes proporções respectivamente, 22,21% e 20,85%,

respectivamente. A melhor atividade do OEFF pode estar também relacionada à presença do

óxido de cariofileno, ausente no OEFS e citado por Griffin et al. (1999) pela sua capacidade

de desestabilizar a membrana celular bacteriana.

60

Tabela 8: Concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial das folhas frescas(OEFF)

e secas (OEFS) de Lippia gracillis.

Bactérias

CIM (µg/mL)

OEFF OEFS

Escherichia coli ATCC 10536 64 128

Escherichia coli Ec 27 128 256

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 512 512

Staphylococcus aureus ATCC 12692 128 256

Staphylococcus aureus Sa 358 512 512

5.6 Efeito modulador por contato direto

Segundo Barbosa et al. (2001), a ação bactericida dos aminoglicosídeos deve-se a dois

fatores: inibem a síntese protéica e provocam erros de leitura do RNAm, portanto agem no

interior da célula. No entanto, Tavares (1996, p.792) enaltece que o mecanismo de ação dos

aminoglicosídeos depende, fundamentalmente, da veiculação dos princípios ativos para o

interior dos microrganismos, proporcionando a atuação destas drogas no ribosssoma

bacteriano. Esse fato pode explicar o sinergismo que ocorre entre componentes presentes nos

óleos essenciais e os antibióticos aminoglicosídeos, uma vez que esses teriam a sua entrada

facilitada na célula após a alteração na permeabilidade da membrana ocasionada por

componentes dos óleos essenciais (KNOWLES et al., 2005).

A Tabela 9 demonstra a interferência do óleo essencial de L. gracillis obtido das

folhas frescas (OEFF) sobre a atividade dos antibióticos aminoglicosídeos (neomicina,

amicacina, canamiccina e gentamicina) em concentrações subinibitórias (CIM 1/8). O OEFS

não foi testado por esse método.

O OEFF ocasionou uma modificação sinérgica na atividade da amicacina frente à E.

coli (ATCC10536); não foram observadas pelo método do contato direto, interferências

significativas na atividade dos demais antibióticos testados.

61

Tabela 9: Valores de concentração inibitória mínima (CIM) de aminiglicosídeos na ausência

e presença do óleo essencial de L. gracillis obtido de folhas frescas (OEFF) por contato direto.

Antibióticos

E. coli

Ec 27

S. aureus

ATCC 12692

E. coli

ATCC 10536

CIM OEFF

(16 µg/mL)

CIM OEFF

(16 µg/mL)

CIM OEFF

(8 µg/mL)

Neomicina 32 32 128 128 128 64

Amicacina 64 64 256 256 64 16

Canamicina 16 8 128 64 64 64

Gentamicina 16 16 64 64 32 32

5.6 Efeito modulador por contato a vapor

A atividade moduladora dos OEFF e do OEFS sobre os antibióticos aminoglicosídeos

(amicacina, tobramicina e gentamicina) foi analisada pelo método do contato a vapor

conforme demonstrado nas Tabelas 10 e 11 (modificado a partir de INOUYE, TAKIZAWA e

YAMAGUCHI, 2001). Foram detectadas algumas interações significativas estatisticamente

(p<0,05) entre os óleos testados e a ação dos aminoglicosídeos.

A gentamicina foi o antibiótico que demonstrou a maior interferência dos óleos

essenciais contra a linhagem de S. aureus, havendo resposta sinérgica em todas as

concentrações testadas. Frente à linhagem de P. aeruginosa, foi observado o sinergismo nas

concentrações de 50%, 25% e 12%, havendo efeito antagônico entre a gentamicina e os dois

óleos na concentração de 6%.

A tobramicina somente apresentou modificação de sua atividade contra P.aeruginosa

quando os óleos essenciais foram testados na concentração de 50%. Frente ao S. aureus, foi

observada interferência dos óleos essenciais sobre a atividade da tobramicina da seguinte

forma: nas concentrações de 50% e 25% foi verificado sinergismo, e na de 6% o antagonismo.

62

Em relação à amicacina, foi demonstrada atividade sinérgica com os óleos essenciais

em todas as concentrações testadas contra P. aeruginosa. No entanto, contra S. aureus, o

sinergismo entre a amicacina e os óleos essenciais testados foi consideravelmente maior em

relação ao OEFF.

Tabela 10: Valores das médias dos halos de inibição do crescimento bacteriano do OEFF por

meio do contato a vapor

Linhagens

testadas Tratamento

Concentração/Diâmetro(mm)

50% 25% 12% 6% Amic. Tobr. Gent.

P. aeruginosa

(ATCC 15442)

Amic.+OEFF >80+0,0* 24+0,30 24+0,20 22+0,20

21.5+0,30 20.8+0,30 13.3+0,20 Tobr.+ OEFF >80+0,0* 20+0,20 20+0,40 19+0,30

Gent.+ OEFF >80+0,0* 15+0,20 14+0,00 12+0,30

S. aureus

(ATCC 12692)

Amic.+ EFF >80+0,0* 21+0,30 21+0,40 17+0,20

19.5+0,30 16+0,20 13.8+0,20 Tobr.+ OEFF >80+0,0* 31+0,50

* 16+0,20 13+0,20

Gent.+ OEFF >80+0,0* 65+0,50

* 35+0,30

* 15+0,30

(*) Médias dos tratamentos diferem significativamente entre si (n=3, p<0,05, teste de Tukey), quando comparados

com seu respectivo controle. Amic. – Amicacina 30 µg; Tobr. – Tobramicina 10µg; Gent. – Gentamicina 10µg

Tabela 11: Valores das médias dos halos de inibição do crescimento bacteriano do OEFS por

meio do contato a vapor

Linhagens

testadas Tratamento

Concentração/Diâmetro(mm)

50% 25% 12% 6% Amic. Tobr. Gent.

P. aeruginosa

(ATCC 15442)

Amic.+ OEFS

>80+0,0*

29+0,20*

24+0,20

24+0,20 21.5+0,3 20.8+0,2 13.3+0,2

Tobr.+ OEFS >80+0,0* 20+0,30 20+0,20 20+0,40

Gent.+ OEFS >80+0,0* 15+0,40 15+0,40 12+0,30

S.aureus

(ATCC 12692)

Amic.+ OEFS 65+0,00* 18+0,20 17+0,30 16+0,20

19.5+0,3 16+0,2 13.8+0,3 Tobr.+ OEFS 63+0,00* 20+0,30 16+0,30 14+020

Gent.+ OEFS >80+0,0* >80+0,0

* 43+0,20

* 34+0,40

*

(*) Médias dos tratamentos diferem significativamente entre si (n=3, p<0,05, ANOVA seguido pelo teste de Tukey),

quando comparados com seu respectivo controle. Amic. – Amicacina 30 µg; Tobr. – Tobramicina 10µg; Gent. –

Gentamicina 10µg.

CONCLUSÕES

______________________________________________

64

6 CONCLUSÕES

A maioria dos constituintes dos óleos essenciais de L. gracillis identificados por

CG/EM, são pertencentes à classe dos monoterpenos. Os óleos essenciais obtidos de folhas

frescas (OEFF) e secas (OEFS) utilizados nos ensaios microbiológicos, apresentaram

praticamente os mesmos constituintes químicos, embora a quantificação dos mesmos tenha

sido variável. Em ambos, os componentes majoritários foram o timol e o carvacrol, embora o

percentual de carvacrol no OEFF tenha sido o dobro em relação ao OEFS.

Essa pesquisa possibilitou ainda a obtenção de informações importantes para

maximizar a produção de constituintes ativos das espécies vegetais, pela observação das

diferenças quantitativas e qualitativas nos óleos essenciais das folhas frescas associadas aos

diferentes horários de coleta da planta (7:00 h, 10:00 h, 14:00 h e 16:00 h). O horário de

coleta em que houve a maior expressão de timol foi às 7:00 horas, enquanto a de carvacrol foi

às 10:00 horas. Os componentes majoritários observados nesses óleos essenciais foram: o

timol, o carvacrol, o α-pineno, o p-cimeno e o β-cariofileno, com uma grande variação nas

proporções desses constituintes químicos.

O screening antimicrobiano pelo método de difusão cavidade em agar permitiu a

observação da sensibilidade aos óleos testados de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas

na concentração de 10%, sendo mais significativos os resultados do OEFF e do OEFS frente à

P. aeruginosa quando comparados aos halos de inibição resultantes dos antibióticos padrão

utilizados nesse estudo. A atividade antifúngica do OEFF nas maiores concentrações testadas

foi considerada muito boa, com a formação de halos de inibição maiores do que aqueles

obtidos pelo antibiótico padrão, destacando-se os resultados frente às linhagens de C.

albicans.

Pelo método da microdiluição em caldo, foi observada a eficácia dos óleos testados

frente às bactérias Gram-negativas e Gram-positiva, tanto as de linhagem padrão quanto os

isolados clínicos, sendo obtidos valores de MIC inferiores ou iguais a 512 µg/mL. Destaca-se

a melhor atividade do OEFF quando comparado ao OEFS por esse método.

Os resultados desse estudo demonstram a interferência dos óleos essenciais de L.

gracillis sobre antibióticos aminoglicosídeos. Pelo método do contato direto, o OEFF

ocasionou uma modificação sinérgica na atividade da amicacina frente à E. coli ATCC 10536.

Pelo método do contato a vapor, a gentamicina foi o antibiótico que demonstrou o maior

65

sinergismo com os óleos essenciais (OEFF e OEFS) frente à linhagem de S. aureus, enquanto

em relação à P. aeruginosa, foi a amicacina, o aminoglicosídeo que apresentou maior

sinergismo com os óleos testados.

Esse estudo indica ser a espécie L. gracillis, uma alternativa viável para a indústria

farmacêutica em sua busca por produtos naturais, demonstrando ainda em quais horários do

dia os componentes ativos são mais predominantes. No entanto, é necessário que novos

estudos sejam realizados utilizando os componentes isolados presentes nesses óleos

essenciais, principalmente aqueles que são minoritários e trabalham sinergicamente na

produção de atividades biológicas.

REFERÊNCIAS

______________________________________

67

REFERÊNCIAS

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