Introdução à análise por marcadores moleculares

Prof. Vinicius Campos

Disciplina de Biotecnologia AnimalGraduação em Biotecnologia

UFPel

Genética

1900s - Descoberta dos princípios genéticos 1920-50 - Melhoramento genético científico

genética quantitativa e biometria (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)

1970-80 - Utilização de marcadores genéticos molecularesA

Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais

Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples

marcadorescromossoma

Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações pontual ou inserção/deleção macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções

1. Mutações pontuais – SNPs A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA

TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI

B. ATCTCGTGATTATAGTCGTATAGAGCACTAATATCAGCAT

2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA

TAGAGCAGATCAGCAT

B. ATCTCGT---GTCGTATAGAGCA---CAGCAT

Origem do Origem do Polimorfismo MolecularPolimorfismo Molecular

Principais Marcadores na Indústria Animal

Polimorfismos Tipo RFPL Polimorfismos Tipo RAPD Marcadores Microssatélites

Classes de Marcadores

Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP

Polimorfismo de tamanho de fragmento RFLP examina diferença em tamanho de

fragmentos de restrição de DNA específicos Polimorfismo deriva de mutação pontual,

inserção, deleção Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

Como funciona

Herança

Extração de DNA A amostra de DNA é amplificada por PCR Digestão enzimática dos produtos de PCR com enzima

de restrição adequada e à sua temperatura ótima Utilizam-se controles normais e se disponíveis

controlos homozigóticos e heterozigóticos para a mutação

Os produtos da digestão são colocados nos poços de um gel de agarose ou de poliacrilamida

RFLP - Procedimento

RFLP - Análise

RFLP

Eletroforese da digestão enzimática com MscIe FauI para pesquisa da mutação L858R

RFLP Eletroforese da digestão enzimática com Bcl I para pesquisa da mutação

H63D

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD

Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários 10 bases com >50% G+C

PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade

RAPD

AA

Aa

aa

AA Aa aa

Interpretação de RAPDs

Marcadores RAPD são anônimos Dados binários (presença x ausência) RAPD são dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migração

mesma banda, mesmo fragmento? uma banda, um fragmento?

Questionamento para filogenia banda homólogas?

PCR com primers arbitrários: acúmulo de siglas!

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

DAF DNA Amplification Fingerprinting

AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction

MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir

todas as pequenas variações na técnica)

Diferenças entre ensaios com primers arbitrários

RAPD 10mers, gel de agarose corado com brometo

DAF 5mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P

AP-PCR 10mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P

GEL RAPD

RAPD - resumo

Rápido Simples Baixo custo Sem uso de radio-isótopos

Marcador dominante Problemas de reproducibilidade Problemas de interpretação

Microssatélites

Sequence-Tagged Microsatélites (STMS) também conhecido como microssatélite ou Simple

Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-alélico Co-dominante Altamente reprodutível

Microssatélites

Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem

Presentes em procariotos e eucariotos Presentes em regiões codificantes e não

codificantes Maioria das repetições são dinucleotídeos

(AC) n (AG) n (AT)n

Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições Escorregamento da DNA polimerase durante a

replicação Crossing-over desigual entre cromátides irmãs

Codominantes

Normalmente locos simples e multi-alélico

Microssatélites

Microssatélites

altamente informativo - vários alelos por locos detecção por PCR facilmente transferível entre labs distribuição homogênea no genoma

Microssatélites

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Primer REV

Primer FOR

Repetição CA

Microssatélites

Obtenção de seqüências: a partir de banco de dados de genoma ou cDNA hibridação com biblioteca genômica, identificação

de clones e seqüenciamento construção de biblioteca enriquecida por afinidade

com seqüência da matriz

Detecção do polimorfismo Géis de agarose Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb)

coloração direta: nitrato de prata (barato) Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente

Microssatélites

Análise Microssatélites

Problemas Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos primers

Construção de bibliotecas genômica sequenciamento Triagem dos melhores primers

Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados

EST (Expressed Sequence Tags) - SSR funcional x SSR genômico

Microssatélites

RFLP RAPD SSR

Polimorfismo Pontual ou InDel

Pontual ou InDel

Nº de Rep.

Nível do Polimorfismo

Médio Médio Alto

Abundância Alta Média MédiaAlta

Dominância Co-Dominante Dominante Co-Dominante

[DNA] 10 ug 25 ng 50 ng

Marcação Sim/Não Não Não

Repetibilidade Alta Baixa Alta

Comparação entre Marcadores