Introdução à análise por marcadores moleculares
Prof. Vinicius Campos
Disciplina de Biotecnologia AnimalGraduação em Biotecnologia
UFPel
Genética
1900s - Descoberta dos princípios genéticos 1920-50 - Melhoramento genético científico
genética quantitativa e biometria (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)
1970-80 - Utilização de marcadores genéticos molecularesA
Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais
Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
marcadorescromossoma
Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações pontual ou inserção/deleção macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções
1. Mutações pontuais – SNPs A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI
B. ATCTCGTGATTATAGTCGTATAGAGCACTAATATCAGCAT
2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B. ATCTCGT---GTCGTATAGAGCA---CAGCAT
Origem do Origem do Polimorfismo MolecularPolimorfismo Molecular
Principais Marcadores na Indústria Animal
Polimorfismos Tipo RFPL Polimorfismos Tipo RAPD Marcadores Microssatélites
Classes de Marcadores
Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP
Polimorfismo de tamanho de fragmento RFLP examina diferença em tamanho de
fragmentos de restrição de DNA específicos Polimorfismo deriva de mutação pontual,
inserção, deleção Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular
Como funciona
Herança
Extração de DNA A amostra de DNA é amplificada por PCR Digestão enzimática dos produtos de PCR com enzima
de restrição adequada e à sua temperatura ótima Utilizam-se controles normais e se disponíveis
controlos homozigóticos e heterozigóticos para a mutação
Os produtos da digestão são colocados nos poços de um gel de agarose ou de poliacrilamida
RFLP - Procedimento
RFLP - Análise
RFLP
Eletroforese da digestão enzimática com MscIe FauI para pesquisa da mutação L858R
RFLP Eletroforese da digestão enzimática com Bcl I para pesquisa da mutação
H63D
Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários 10 bases com >50% G+C
PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade
RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
Interpretação de RAPDs
Marcadores RAPD são anônimos Dados binários (presença x ausência) RAPD são dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migração
mesma banda, mesmo fragmento? uma banda, um fragmento?
Questionamento para filogenia banda homólogas?
PCR com primers arbitrários: acúmulo de siglas!
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
DAF DNA Amplification Fingerprinting
AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir
todas as pequenas variações na técnica)
Diferenças entre ensaios com primers arbitrários
RAPD 10mers, gel de agarose corado com brometo
DAF 5mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P
AP-PCR 10mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P
GEL RAPD
RAPD - resumo
Rápido Simples Baixo custo Sem uso de radio-isótopos
Marcador dominante Problemas de reproducibilidade Problemas de interpretação
Microssatélites
Sequence-Tagged Microsatélites (STMS) também conhecido como microssatélite ou Simple
Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-alélico Co-dominante Altamente reprodutível
Microssatélites
Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem
Presentes em procariotos e eucariotos Presentes em regiões codificantes e não
codificantes Maioria das repetições são dinucleotídeos
(AC) n (AG) n (AT)n
Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições Escorregamento da DNA polimerase durante a
replicação Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
Codominantes
Normalmente locos simples e multi-alélico
Microssatélites
Microssatélites
altamente informativo - vários alelos por locos detecção por PCR facilmente transferível entre labs distribuição homogênea no genoma
Microssatélites
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Microssatélites
Obtenção de seqüências: a partir de banco de dados de genoma ou cDNA hibridação com biblioteca genômica, identificação
de clones e seqüenciamento construção de biblioteca enriquecida por afinidade
com seqüência da matriz
Detecção do polimorfismo Géis de agarose Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb)
coloração direta: nitrato de prata (barato) Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente
Microssatélites
Análise Microssatélites
Problemas Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos primers
Construção de bibliotecas genômica sequenciamento Triagem dos melhores primers
Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados
EST (Expressed Sequence Tags) - SSR funcional x SSR genômico
Microssatélites
RFLP RAPD SSR
Polimorfismo Pontual ou InDel
Pontual ou InDel
Nº de Rep.
Nível do Polimorfismo
Médio Médio Alto
Abundância Alta Média MédiaAlta
Dominância Co-Dominante Dominante Co-Dominante
[DNA] 10 ug 25 ng 50 ng
Marcação Sim/Não Não Não
Repetibilidade Alta Baixa Alta
Comparação entre Marcadores