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Instituto Politécnico Nacional CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN

PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

DEPARTAMENTO AGROPECUARIO

Detección y Caracterización Molecular de Xanth das

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA: FATIMA DEL ROSARIO RIVERA SOTO

Guasave, Sinaloa, México

UNIDAD SINALOA

omonas campestris pv. vesicatoria Asociacon Mancha Bacteriana de Cultivos de Tomate en

Sinaloa

2007

El presente trabajo se realizó en el Departamento Agropecuario en el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Interdisciplinario de Investigación para el desarrollo Integral Regional CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN) bajo la dirección de la Dra. Norma Elena Leyva López. El autor agradece al Instituto Politécnico Nacional por el apoyo en Infraestructura y económico brindado a través de su sistema de becas, así como al CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa por el apoyo durante la realización de este proyecto.

i

CONTENIDO

Número de página CONTENIDO------------------------------------------------------------------------ i

ÍNDICE DE FIGURAS-------------------------------------------------------------- v ÍNDICE DE CUADROS----------------------------------------------------------- vii

GLOSARIO-------------------------------------------------------------------------- viii

ABREVIATURAS------------------------------------------------------------------ xii

RESUMEN--------------------------------------------------------------------------- xiv

ABSTRACT------------------------------------------------------------------------- xv

I. INTRODUCCIÓN----------------------------------------------------------------- 1

II. REVISION DE LITERATURA------------------------------------------------ 3

A. Bacterias-------------------------------------------------------------- 3

1. Morfología y estructura bacteriana --------------------- 3

2. Bacterias fitopatógenas----------------------------------- 5

3. Bacterias que causan enfermedad en el tomate---- 5

4. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

4.1. Origen ----------------------------------------------- 7

4.2. Clasificación actual de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria ------------------- 8

4.3. Morfología específica de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria.--------------------- 9

4.4. Sintomatología de la mancha bacteriana -- 9

4.5. Estructura y organización del genoma ------ 11

4.6. Importancia del gen hrp ------------------------- 12

4.7. Importancia del cultivo de tomate en Sinaloa-- 13

4.8. Importancia de la mancha bacteriana en

tomate ------------------------------------------------ 14

4.9. Ciclo de la enfermedad ------------------------- 15

4.10. Control de la enfermedad --------------------- 15

B. Caracterización fisiológica de Xanthomonas campestris

pv. vesicatoria -------------------------------------------------------- 16 1. Caracterización a nivel género---------------------------- 16

1.1. Fluorescencia ------------------------------------- 17

ii

1.2. Tinción Gram ------------------------------------ 18

1.3. Catalasa ------------------------------------------- 20

1.4. Oxidasa-------------------------------------------- 20

1.5. Crecimiento en YDC---------------------------- 21

2. Caracterización a nivel especie ------------------------ 21

2.1. Crecimiento en YS ----------------------------- 22

2.2. Hidrólisis de almidón -------------------------- 22

2.3. Licuefacción de gelatina ---------------------- 23

2.4. Hidrolasa de arginina -------------------------- 23

2.5. Fuentes de carbono --------------------------- 24

3. Caracterización a nivel patovar------------------------ 24

3.1. Crecimiento en Agar Tween y SX----------- 24

4. Prueba de patogenicidad -------------------------------- 25

C. Caracterización genotípica de Xanthomonas spp.--------- 26

1. Detección de Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria por la PCR---------------------------------- 29

III. HIPÓTESIS ----------------------------------------------------------------- 29

IV. OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------- 29

A. Objetivo general ---------------------------------------------------- 29

B. Objetivos específicos -------------------------------------------- 29

V. MATERIALES Y MÉTODOS ------------------------------------------- 30

A. Material vegetal --------------------------------------------------- 30

B. Metodología -------------------------------------------------------- 31

1. Pruebas simples para la identificación de

Xanthomonas -------------------------------------------- 31

1.1. Aislamiento y condiciones de

crecimiento para Xanthomonas------------ 31

1.2. Tinción Gram ---------------------------------- 31

1.3. Prueba de fluorescencia ------------------- 32

C. Caracterización molecular-------------------------------------- 32

1. Extracción de DNA de cepa bacteriana- 32

2. Electroforesis ----------------------------------- 33

3. Determinación de la concentración de DNA 34

4. Detección del patógeno por PCR -------------------- 34

iii

5. Purificación de bandas --------------------------------- 35

6. Ligación de productos de PCR ---------------------- 36

7. Transformación de células competentes 36

8. Extracción de DNA plasmídico ----------------------- 37

9. Análisis de restricción de los productos amplificados

por PCR ------------------------------------------------------- 37

10. Secuenciación, análisis y comparación

de secuencias-------------------------------------------- 38

D. Caracterización fisiológica ------------------------------------- 39

1. Caracterización fisiológica del género

Xanthomonas -------------------------------------------- 39

1.1. Catalasa --------------------------------------- 39

1.2. Oxidasa ---------------------------------------- 40

1.3. Crecimiento en YDC ------------------------ 40

2. Caracterización a nivel especie---------------------- 40

2.1. Crecimiento en YS -------------------------- 40

2.2. Hidrólisis de almidón ----------------------- 41

2.3. Licuefacción de gelatina ------------------- 41

2.4. Dihidrolasa de arginina --------------------- 42

2.5. Fuentes de carbono ------------------------- 42

3. Caracterización a nivel patovar ---------------------- 43

3.1. Crecimiento en medio Tween ---- 43

3.2. Crecimiento en medio SX -------- 43

4. Pruebas de patogenicidad -------------------- 43

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN --------------------------------------- 45

A. Sintomatología --------------------------------------------------- 45

B. Pruebas simples de identificación de Xanthomonas

spp. ------------------------------------------------------------------ 46

1. Tinción Gram ---------------------------------------------- 47

2. Fluorescencia --------------------------------------------- 48

C. Caracterización molecular ------------------------------------- 48

1. Extracción de DNA ------------------------------ 48

2. Detección del patógeno por PCR ----------- 49

3. Identificación de Xanthomonas spp. por

iv

RFLP-PCR ---------------------------------------- 51

5. Análisis de secuencias ------------------------ 52

6. Análisis de restricciones ----------------------- 56

7. Análisis filogenético ---------------------------- 59

D. Caracterización fisiológica ------------------------------------- 61

1. Caracterización a nivel genero ----------------------- 61

1.1. Catalasa ---------------------------------------- 61

1.2. Oxidasa ----------------------------------------- 61

1.3. Crecimiento en YDC ------------------------- 61

2. Caracterización a nivel especie ---------------------- 62

2.1. Crecimiento en YS --------------------------- 62

2.2. Hidrólisis de almidón ------------------------ 63

2.3. Licuefacción de gelatina -------------------- 64

2.4. Hidrolasa de arginina ------------------------ 65

2.5. Fuentes de carbono ------------------------- 65

3. Caracterización a nivel patovar--------------------- 67

3.1. Crecimiento en medio Tween y SX ------ 67

D. Pruebas de patogenicidad ------------------------------------- 69

VII. CONCLUSIONES ------------------------------------------------------- 70

IX. BIBLIOGRAFÍA ----------------------------------------------------------- 71

v

ÍNDICE DE FIGURAS 1. Estructura bacteriana mostrando los principales organelos -- 4 2. Algunos síntomas causados por bacterias en el cultivo del tomate ----------------------------------------------------------------------- 7 3. Micrográfica de Xanthomonas campestris ------------------------ 9 4. Síntomas causados por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria en cultivos de tomate------------------------------------- 10 5. Estructura de una bacteria Gram positiva------------------------ 18 6. Estructura de una bacteria Gram negativa------------------------ 19 7. Localización de los municipios de Sinaloa donde se realizó la colecta de muestras de tomate con síntomas de mancha bacteriana ------------------------------------------------------------------- 30 8. Restricción de fragmentos de 420 pb del gen hrp de

Xanthomonas spp. con la enzima HaeIII con los primer RST65/69----------------------------------------------------------------- 39

9. Síntomas de mancha bacteriana observados en cultivos de

tomate en Sinaloa ------------------------------------------------------ 45 10. Síntomas observados en cultivos de tomate--------------------- 46 11. Aislados bacteriológicos obtenidos de tejido foliar

sintomático de planas de tomate con mancha bacteriana --- 47 12. Fotografía con microscopio de la bacteria Gram negativa y

forma bacilar de aislados bacteriológicos de plantas de tomate --------------------------------------------------------------------- 47

13. Prueba de fluorescencia en medio B de King, con

exposición a luz ultravioleta (260 nm) ---------------------------- 48 14. DNA de aislados bacteriológicos de tejido de tomate--------- 49 15. Productos amplificados por PCR del gen hrp de

Xanthomonas spp. con los primers RST65/RST69------------ 50 16. Análisis de restricción de los fragmentos amplificados por PCR con los primers RST65/RST69----------------------------- 51

vi

17. Análisis de los sitios de restricción de las secuencias del gen hrp de Xanthomonas campestris pv vesicatoria--------- 58

18. Árbol filogenético construido mediante el método de alineamiento (CLUSTAR Method) de secuencias del gen hrp amplificado con el par de primers RST65/RST69 de Xanthomonas campestris pv vesicatoria de la cepa 75-3 reportada en el banco de genes---------------------------------- 60 19. Colonias de consistencia mucoide, de color amarillo, desarrolla en YDC, correspondiente a la cepa del Estado de Sinaloa a las 48 hr de incubación -------------------------------------------------------- 62 20 Crecimiento de un aislado del Estado de Sinaloa de

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria después de 48 hr de incubación en medio YS a 35°C-------------------------------- 63

21. Pruebas de hidrólisis de almidón ----------------------------------- 64 22. Prueba de licuefacción de gelatina a aislados de tomate---- 67 23. Prueba de arginina en medio Thornley´s 2A -------------------- 64 24. Producción de ácido a partir de fructuosa como fuente de carbono--------------------------------------------------------------------- 66 25. Producción de ácido a partir de glucosa como fuente de carbono -------------------------------------------------------------------- 66 26. Producción de ácido a partir de celobiosa como fuentes de carbono -------------------------------------------------------------------- 67 27. Crecimiento en medio selectivo para patovares

“vesicatoria” de tomate------------------------------------------------ 67 28. Pruebas de patogenicidad en cultivo de tomate---------------- 69

vii

ÍNDICE DE CUADROS

1 Clasificación de bacterias fitopatógenas-------------------------- 6

2 Características usadas para diferenciar géneros de bacterias

patógenas en platnas capaces de crecen en medio estándar--------------------------------------------------------------------- 17

3 Pruebas bioquímicas para la diferenciación de Xanthomonas

spp..--------------------------------------------------------------------------- 22 4 Crecimiento de algunos patovares de Xanthomons

campestris pv. vesicatoria en medios semiselctivos------------- 24 5 Pruebas rápidas de patogenicidad--------------------------------- 27 6 Secuencias de los oligonucleótidos usados en la PCR para

detectar aislados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria------------------------------------------------------------------- 34

7 Secuencias de Xanthomonas campestris pv vesicatoria

obtenidas de los cultivos de tomate de los diferentes municipios de Sinaloa--------------------------------------------------- 54

8 Porcentaje de similitud entre secuencias del gen hrp de

Xanthomonas campestris pv vesicatoria clasificadas en el grupo A (X. axonopodis pv. vesicatoria)---------------------------- 55

9 Características culturales, morfológicas y fisiológicas de los aislamientos de la bacteria en estudio --------------------------------- 68

viii

GLOSARIO

Ácidos nucleicos. Moléculas formadas por macropolímeros de nucleótidos, o

polinucleótidos. Esta presente con todas las células y constituye la base

material de la herencia que se transmite de una a otra generación. Existen dos

tipos, el ácido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA).

Ácido Ribonucléico. Ácido nucleico formado por nucleótidos en los que el

azúcar es ribosa y las bases nitrogenadas son adenina, uracilo, citosina y

guanina. Actúa como intermediario y complemento de las instrucciones

genéticas codificadas en el DNA. Existen varios tipos de ARN, relacionados

con la síntesis de proteínas; RNA mensajero (RNAm), RNA ribosómico (RNAr)

y el RNA de transferencia (RNAt).

ADNt. Ácido desoxirribonucleico de transferencia.

Ampicilina. Antibiótico derivado de la penicilina que interfiere con la síntesis de

la pared celular, impidiendo el crecimiento bacteriano. El gen asociado con la

resistencia a la ampicilina es muy usado en ingeniería genética como marcador

de selección.

Clonación molecular: Inserción de un segmento de DNA ajeno, de una,

dentro de un vector que se replica en un huésped específico.

Clones. Grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética

entre si y con el antepasado común del que se producen por división binaria o

por reproducción sexual.

DNA. Ácido desoxirribonucleico de doble cadena formado por nucleótidos en el

que el azúcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina,

citosina y guanina. El DNA codifica la información para la reproducción y

funcionamiento de las células y para la replicación de la propia molécula de

DNA.

ix

DNA Ligasa (Polinucleotido ligasa). Es una enzima que une covalentemente

a los extremos 3´ con extremos 5´ de cadenas polinucleotídicas, para formar

una cadena continua. Participa en replicación y reparación de DNA.

Electroforesis. Técnica utilizada para la separación de moléculas (Proteínas o

ácidos nucleicos) a través de un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño

molecular y carga eléctrica.

Enfermedad. Cualquier mal funcionamiento de las células y tejido del

hospedante, que resulta de la irritación continua por un agente patogénico o

factor ambiental y que lleva al desarrollo del síntoma.

Enzimas de restricción. Endonucleasas que reconocen una secuencia entre

4-8 pb en DNAs. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la

enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba y otro enlace

fosfodiester en la hebra complementaria. Son las tijeras de la ingeniería

genética que abrieron las puertas a la manipulación genética.

Fitopatógeno. Microorganismos que producen enfermedades en las plantas.

Inóculo: Patógeno o partes de él que hacen contacto con el hospedero.

In vitro. Literalmente significa “en el vidrio”. Se refiere a las acciones o

condiciones en el tubo de ensayo del laboratorio, investigado y manipulado fuera del organismo vivo.

Kilobase (Kb). Unidad empleada para medir la longitud de los fragmentos de

DNA, constituidos por una serie de bases. 1kb = 1000 bases.

Nucleótido. Monómero de los ácidos nucleicos integrado por la combinación

de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa o

desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrólisis de

ácidos nucleicos por acción de nucleasas.

x

Oligonucleótidos. Secuencia lineal de nucleótidos (hasta 20).

Organismo. Entidad biológica capaz de producirse o de transferir material

genético, incluyéndose dentro de este concepto a las entidades

microbiológicas, sean o no celulares. Casi todo organismo está formado por

células, que pueden agruparse en órganos, y estos a su vez en sistemas, cada

uno de los cuales realizan funciones específicas.

Pared celular. Capa externa y rígida de las células de las plantas superiores,

algunos protistas y la mayoría de las bacterias. La pared celular vegetal está

constituida principalmente de celulosa, aunque también se presenta

emicelulosa, pectinas y puede tener lignina.

Pares de bases. Dos bases nitrogenadas (timina y adenina o citosina y

guanina) que se unen por puentes de hidrógeno en la molécula de DNA.

Patógeno. Microorganismo que tiene la propiedad de producir enfermedad en

los seres humanos, animales o plantas.

Patovar. En las bacterias, subespecie o grupo de razas que sólo puede infectar

a plantas de un cierto género o especie.

Plásmido. Fragmento circular de DNA bicatenario que contiene unos cuantos

genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias. Actúan y se replican

de forma independiente al DNA bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a

otras. Se utilizan como vectores en manipulación genética.

Primers (Iniciador). Cadena corta de polinucleótido preexistente a la cual

pueden agregársele nuevos desoxirribonucleótidos por la acción de la enzima

DNA polimerasa.

Procariote. Célula u organismos carentes de una membrana definida, núcleo

estructural discreto con un solo cromosoma así como de otros compartimentos

xi

celulares. Las bacterias son procariotes.

(PCR) Reacción en Cadena de la Polimerasa. Técnica de análisis del

genoma mediante la amplificación limitada de porciones específicas del DNA,

aunque sean minúsculas. Es un método revolucionario de amplificación

exponencial del DNA por la intervención de una enzima termoestable.

Secuencia conservada. Una secuencia de bases de una molécula de DNA (ó

una secuencia de aminoácidos en una proteína) que ha permanecido

esencialmente sin cambios a través de la evolución.

Secuenciación. Determinación del orden de nucleótidos (secuencias de

bases) en una molécula de DNA o RNA, o el orden de aminoácidos en una

proteína.

Sustrato. Molécula que sufre transformaciones durante una reacción

catalizada por una enzima.

Tejido. Grupo de células similares organizadas en una unidad estructural y

funcional.

Transformación bacteriana. Uno de los procesos naturales de transferencia

de material genético de una bacteria a otra. Experimentalmente consiste en

introducir un fragmento de DNA en una bacteria para provocar en ella una

recombinación genética.

Transformación. Modificación permanente y heredable de una célula como

resultado de la incorporación de un DNA foráneo.

Vector. Portador que transfiere un gen de un huésped a otro. Sistema que

permite la transferencia, la expresión y la replicación de un DNA extraño en

células huésped para una posterior clonación o transgénesis. Se trata de una

molécula de DNA (plasmido bacteriano, microsoma artificial de levadura o de

bacteria) o de un virus defectuoso.

xii

ABREVIATURAS

A = Adenina

AN= Agar Nutritivo µg = Microgramo µl= Microlitro

µm = Micrometro

Blast = Basic Local Alingment Search Tool C = citosina dNTPs = Desoxiribonucleótidos (Desoxiribonucleótidos trisfosfato)

G = Guanina

hr = Hora

IPTG = (isopropil- β D- tiogalactopiranosida) KCl = Cloruro de potasio LB = Medio de cultivo Luria- Bertani M = Molar

mg = Miligramo

MgCl2 = Cloruro de magnesio

min = Minuto

ml = Mililitro mM = milimolar

N = Normal

NaCl = Cloruro de sodio

NaOH = Hidróxido de sodio

ng = Nanogramo nm = Nanómetro

°C = Grados centígrados pb = Pares de bases

PCR = Polymerase Chain Reaction (Reacción en caena de la polimerasa)

pmol = Picomol

RH= Reacción de hipersensibilidad

RFLP = Restricción fragments Length Polimorphism (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción)

xiii

RNA = Ácido ribonucleico RNasa = Ribonucleasa

rpm = Revoluciones por minuto rRNA = Ácido ribonucleico ribosómico seg = segundos T = Timina

Taq polimerasa = DNA polimerasa, obtenido de la bacteria Thermus aquaticus

TE = Tris- EDTA

Tris = Tris [hidroximetil] aminometano

Tris- HCl = Tris [hidroximetil] aminometano – ácido clorhídrico tRNA = RNA de transferencia U = Unidad enzimática

X-Gal = (5-bromo-4cloro-3i-ndoli-β-D galactopiranosa)

YDC = Extracto de levadura dextrosa

YS = Caldo de levadura

xiv

RESUMEN

El tomate es la hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico. En México se obtuvo una producción de 2, 148,130 ton en el 2005. En Sinaloa en el ciclo otoño-invierno 2005-2006 se obtuvo una producción de 537,177 ton con un rendimiento de 32.735 ton/ha. Las enfermedades constituyen un factor limitante en la producción de tomate en muchas partes del mundo. La mancha bacteriana es una enfermedad del tomate que causa considerables pérdidas en la producción, es causada por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria y es clasificada dentro de cuatro especies, Xanthomonas euvesicatoria (Grupo A), X. vesicatoria (Grupo B), X. perforans (Grupo C) y X. gardneri (Grupo D). El objetivo del presente trabajo es detectar y caracterizar molecularmente aislados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria asociadas con cultivos de tomate de Sinaloa. Para el desarrollo de este trabajo de tesis se realizaron muestreos en los municipios de Guasave, Ahome, Mocorito, Sinaloa de Leyva, Salvador Alvarado, El Fuerte, Culiacán y Elota, obteniéndose un total de 174 muestras, de las cuales 15 aislados fueron detectados por PCR y de acuerdo al análisis de RFLP-PCR y secuenciación son miembros del grupo A (Xanthomonas euvesicatoria) de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. La caracterización fisiológica y bioquímica confirma que estos 15 aislados pertenecen a Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Mediante la prueba de patogenicidad se demostró que los 15 asilados fueron patógenos a plantas de tomate.

xv

ABSTRACT Tomato is one of the most important vegetable crops around the world and one

of the greater economic value. In México a production of 2, 148.130 ton was

obtained in the 2005. In Sinaloa in 2005-2006 a production of 537,177 ton with

a yield of 32,735 ton/ha was obtained. Many diseases and disorders can affect

tomatoes during the growing season. The bacterial spot is one of the most

common foliar diseases of the tomato in Mexico. This disease is caused by the

bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria and recently it was

classified in four different species, Xanthomonas euvesicatoria (Group A), X.

vesicatoria (Group B), X. perforans (Group C) and X. gardneri (Group D). The

objective of the present work was to detect and to molecular characterization of

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria associated to tomato crops at Sinaloa.

174 Samples were collected in the counties of Guasave, Ahome, Mocorito,

Sinaloa de Leyva, Salvador Alvarado, El Fuerte, Culiacán and Elota. A total of

15 isolates yielded the expected product in PCR assays and according to the

RFLP-PCR analysis and sequencing of the PCR products allowed their

classification as members of group A (Xanthomonas euvesicatoria) of

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. The physiological and biochemical

characterization confirms that these 15 isolated belong to Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria. By means of the pathogenicity assays was

demonstrated that the 15 isolates were pathogenic to tomato plants.

Rivera Soto Fatima del Rosario

I. Introducción. Dentro de la agricultura mexicana, la actividad hortícola es una de las más

dinámicas y con mayor capacidad exportadora. En el 2004, México obtuvo una

producción de alrededor de 2.1 millones de toneladas de tomate, 1.6 de papa, 1.8

de chile y 1.2 millones de toneladas de tomatillo (SAGARPA, 2004). Entre los

principales productos hortícola sobresale el cultivo del tomate (Licopersicum

esculentum Mill). Tradicionalmente la producción de esta hortaliza en el Estado de

Sinaloa ha sido un componente importante de la producción nacional y su

comportamiento ha sido muy similar. Por ello para este estado es un cultivo

económicamente importante y cubre una superficie de 26,530 has (SAGARPA, 2004). La enfermedad mancha bacteriana ocasionada por la bacteria

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, es una de las enfermedades más

importantes en los cultivos de tomate y chile en el Estado de Sinaloa, donde se

localiza con una distribución general y en forma epidémica, ocasionando pérididas

en la producción (Cruz et al., 1998). Al cultivo del tomate lo afectan diversos agentes patógenos, pero la

bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria está considerada como una de

las más peligrosa (Gitaitis, et al., 1992). La mancha bacteriana se caracteriza por

presentar lesiones necróticas en hojas, tallos y frutos. En verano y climas cálidos,

la mancha bacteriana podría causar severas defoliaciones de plantas ocasionando

pérdidas en la producción (Pohronezny et al., 1986). El uso de técnicas moleculares han contribuidao a una rápida y eficiente

detección de patógenos las cuales estan enfocadas en la manipulación del DNA.

El gen hrp que determina la hipersensibilidad y patogenicidad es necesario

para las bacterias patógenas, en la planta induce síntomas en hospederos

susceptibles y reacción de hipersensibilidad en hospederos resistentes o no

hospederos (Willis et al., 1990), y puede ser encontrado en algunas bacterias

fitopatogénas tales como Erwinia amylovora (Beer et al., 1991), Pseudomona

solanacearum (Boucher et al., 1987), P. syringae pv. phaseolicola (Lindgren et

al., 1986), y Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Bonas, 1991). En una

región altamente conservada del genoma de bacterias fitopatógenas es más fácil

1


la selección de DNA específicos para la detección e identificación de un gran

número de especies o patovares de Xanthomonas.

Dada la importancia el cultivo del tomate en Sinaloa y el riesgo que

representa la presencia de cepas patogénicas de esta bacteria en cultivos de

tomate, se requiere de métodos de detección e identificación eficientes que

permitan detectar a tiempo la enfermedad. La identificación y clasificación de

bacterias se basó historicamente en las características fenotípicas, lo que ha sido

de base para diferenciarlas; sin embargo, las características moleculares son

esenciales para diferenciar las distintas especies bacterianas. La biología

molecular es una herramienta de gran impacto ante la problemática que

representa el poder caracterizar esta bacteria por métodos convencionales. Por lo

anterior, el objetivo del presente estudio es detectar y caracterizar diferentes

cepas de la bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria teniendo como

principal herramienta las técnicas moleculares.

2


II. REVISION DE LITERATURA. A. Bacterias.

Dos clases de procariotes causan enfermedades en las plantas: las

bacterias y los mollicutes (Agrios, 2004). Las bacterias son células pequeñas

(0.5-3.0 µ), que carecen de una membrana alrededor de un núcleo; no poseen

organelos claramente definidos y delimitados por membranas, tales como

mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi y lisosomas. En el medio ambiente

global, los procariotas son absolutamente esenciales en los ciclos de los

elementos, como Carbono, Oxígeno, Nitrógeno, Azufre (Montealegre, 2002). Las

bacterias se definen como seres generalmente unicelulares, sus dimensiones

medias ascilan entre 0.5 y 1 µm. Se conocen alrededor de 1600 especies de

bacterias (Goto, 1990). La inmensa mayoría de bacterias son organismos

estrictamente saprófitos y como tales benefician al hombre, ya que ayudan a

descomponer cantidades enormes de materia orgánica, que produce anualmente,

en forma de productos de desecho o que son resultado de la muerte de las

plantas y los animales. Varias especies producen enfermedades en el hombre,

entre ellas la tuberculosis, la neumonía y la fiebre tifoidea, y otras que causan

enfermedades tanto en el hombre como en los animales donde resaltan por su

importancia la brucelosis y el ántrax (Agrios, 1986). En la actualidad se reconocen

alrededor de 60 especies de bacterias causantes de enfermedades en plantas,

que incluyen aproximadamente 300 subespecies y patovares (Blancard, 1990).

1. Morfología.

La mayoría de las bacterias fotopatógenas tienen forma de bastón. Los

bastones son, más o menos cortos y cilíndricos y, en los cultivos jóvenes, tienen

una longitud que va de 0.6 a 3.5 µm. Las paredes celuares de la mayoría de las

especies de bacterias están cubiertas por un material vizcoso y gomoso que

puede ser delgado (“capa mucilaginosa”) o denso, formando una masa

relativamente amplia en torno a la célula (“cápsula”). La mayoría de las bacterias

poseen delicados flagelos en forma de filamentos que a menudo son

3


considerablemente más largos que las células que los formaron. En algunas

especies bacterianas, cada especie presenta un solo flagelo (Figura 1), mientras

que otras poseen un ramillete de ellos en uno de sus extremos y todavía otras

poseen un flagelo perítrico, es decir, distribuidos sobre toda su superficie. Las

celulas bacterianas presentan paredes celulares delgadas, relativamente firmes y

un poco rígidas que al parecer son bastanes distintas a la menbrana citoplásmica

interna pero que en ocasiones parece intergradas y fusionarse con la capa

mucilaginosa externa o la cápsula. La pared celular in cluye el contenido de la

célula y permite la entrada al flujo de nutrientes y la salida de desechos, enzimas

digestivas y otros productos emitidos por la célula bacteriana. La membrana

citoplásmica determina el grado de permeabilidad selectiva de las distintas

sustancias que fluyen hacia el interior y desde el exterior de la célula; por el

citoplasma, que es una mezcla compleja de proteínas, lípidos, carbohidratos,

muchos otros compuestos orgánicos y por el material nuclear, que consiste en un

gran cromosoma circular de DNA que constituye el rpincipal armazón de material

genético de las bacterias y aparece como un corpúsculo esférico, elipsoidal o en

forma de pesas localizado dentro del citoplasma. Con frecuencia, las bacterias

tambien tienen copias individuales o multiples de otros cromosomas circulares

más pequeños denominados plásmidos (Agrios, 2004).

Figura 1. Estructura bacteriana mostrando los principales organelos.

http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.html)

4


2. Bacterias fitopatógenas.

Las bacterias fitopatógenas se conocen desde 1882; son, con mucho, el

grupo más grande de procariotes fitopatógenos que mejor se conocen (Agrios, 2004). Este grupo de patógenos constituye el segundo en importancia, después

de los hongos, si tenemos en cuenta el número y gravedad de las enfermedades

que produce (Goto, 1990). La clasificación de las bacterias, al igual que la de

otros organismos, nunca es estática y continuamente se proponen cambios.

Actualmente, la clasificación de las bacterias se puede plantear, según se indica

en el Cuadro 1.

3. Bacterias que causan enfermedad en el tomate.

Existe una gran variedad de enfermedades causadas por bacterias que

dañan tallo, fruto y hojas en el cultivo de tomate; entre ellas se encuentran, la

mancha bacteriana (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), cancro bacteriano

(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), la peca bacteriana

(Pseudomonas syringae pv. tomato), tizón foliar bacteriano (Pseudomona syringae

pv. syringae), la pudrición blanda (Erwinia carotovora subs. carotovora), la

marchités bacteriana del tomate (Ralstonia solanacearum) y la necrosis medular

(Pseudomonas corrugata) (Agrios, 2004) (Figura 2).

5


Cuadro 1. Clasificación de bacterias fitopatógenas.

Reino División Clase Familia Género

Enterobacteriaceae

Erwinia

Pseudomonaceae

Acidovorax

Burkholderia

Pseudomonas

Rhizobacter

Rhizomonas

Xanthomonas

Xylophilus

Gracillicutes (Gram -) Proteobacteria

Rhizobiaceae Agrobacterium

No definida Xylella

Firmibacteria (Gram +,

Bacterias simples)

Bacillus

Clostridium

Firmicutes

Thallobacteria (Gram +, bacterias

ramificadas)

Streptomyces

Arthrobacter

Clavibacter

Corynebacterium

Rhoddococcus

Spiroplasmataceae

Spiroplasmas

Tenericutes Mollicutes (procariotas sin pared celular)

Fitoplasmas

Bacterias

Procaryotae

Mendosicutes Archaeobacteria

6


A

A B C

FD

D

E

Figura 2. Algunos síntomas causados por bacterias en el cultivo del tomate. (A) Mancha

bacteriana, (B) Peca bacteriana, (C) Marchités y cancro bacteriano, (D) Tizón foliar

bacteriano (E) Pudrición blanda y (F) Marchités bacteriana del tomate.

Figura 2. Algunos síntomas causados por bacterias en el cultivo del tomate. (A) Mancha

bacteriana, (B) Peca bacteriana, (C) Marchités y cancro bacteriano, (D) Tizón foliar

bacteriano (E) Pudrición blanda y (F) Marchités bacteriana del tomate.

4. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. 4. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

4.1. Origen. 4.1. Origen. La mancha bacteriana del tomate fue observada primeramente en

Sudáfrica y descrita por Doidge en 1920 (Jones et al., 1998). La mancha bacteriana del tomate fue observada primeramente en

Sudáfrica y descrita por Doidge en 1920 (Jones et al., 1998). Los agentes causales de los síntomas cancro bacteriano y mancha

bacteriana fueron identificados en 1921 como, Bacterium vesicatorium n. sp., por

Doidge y como Bacterium exitiosum n. sp., por Gardner & kendrick (Bradbury, 1984). Ambos estudios cloncluyerón que se trataba de una única especie

bacteriana que era capaz de infectar principalmente plantas de tomate y chile y

fue denominada por Doidge Bacterium vesicatorium. Posteriormente el agente

causal se denominó Pseudomonas vesicatoria en 1925 y Phytomonas vesicatoia

en 1930 y finalmente en 1939 recibió el nombre de Xanthomonas vesicatoria (Jones et al., 1998). El agente causal de la mancha bacteriana en plantas de

Los agentes causales de los síntomas cancro bacteriano y mancha

bacteriana fueron identificados en 1921 como, Bacterium vesicatorium n. sp., por

Doidge y como Bacterium exitiosum n. sp., por Gardner & kendrick (Bradbury, 1984). Ambos estudios cloncluyerón que se trataba de una única especie

bacteriana que era capaz de infectar principalmente plantas de tomate y chile y

fue denominada por Doidge Bacterium vesicatorium. Posteriormente el agente

causal se denominó Pseudomonas vesicatoria en 1925 y Phytomonas vesicatoia

en 1930 y finalmente en 1939 recibió el nombre de Xanthomonas vesicatoria (Jones et al., 1998). El agente causal de la mancha bacteriana en plantas de

7


tomate y chile fue reclasificada en 1978 como un pathovar de la espécie X.

campestris, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Sahin, 1997). Inicialmente, se creía que todos los aislados de Xanthomonas campestris

pv. vesicatoria, podían infectar plantas de tomate y chile, pero algunos aislados

son patógenos al tomate, otros solo a chile y otros a ambas especies (Canteros et

al., 1991). Se han reclasificado varias especies de Xanthomonas y entre ellas

subdividido Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, que se dividió en dos

especies, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria y Xanthomonas vesicatoria,

aunque esta propuesta ha sido controversial (Schaad et al., 2000; Young et al., 2001).

El patógeno es bastante variable en sus características fenotípicas y

genéticas siendo posible la distinción de hasta cuatro grupos (“A”, “B”, “C” y “D”),

en virtud de sus diferencias (Vauterin et al., 1995). X. gardneri también esta asociada a la mancha bacteriana de tomate y

chile (Jones et al., 1998). En 1957, esta bacteria fue identificada por primera vez

en Yugoslavia como P. gardneri (Sutic, 1957). La especie no fue considerada

sinónimo de X. vesicatoria, ya que mostraba diferencias en pruebas fisiológicas y

de patogenicidad. Por pruebas de hibridización de DNA, verificó que X. gardneri

estaba más relacionada con especies como X. campestris pv. carotae, X.

campestris pv. pelargonii y X. campestris pv. taraxaci y que Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria representa otro grupo. A pesar de que ha sido validada

como especie, estudios recientes de aislados de Xanthomonas spp. patógenos a

hospederos de tomate y chile confirman que Xanthomonas gardneri (=grupo “D”),

es una entidad taxonómica distinta de Xanthomonas vesicatoria (=grupo “B”) y

Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (=grupos “A” y “C”) (Jones et al., 2000).

4.2. Clasificación actual de Xanthomonas spp. De acuerdo con la actual clasificación filogenética de las bacterias, basadas

principalmente en comparaciones de secuencias nucleotídicas, principalmente de

rRNA 16S, el género Xanthomonas pertenece al phylum Proteobacteria, clase

8


“Gammaproteobacteria” (Clase III), orden “Xanthomonadales” (Orden II) y familia

“Xanthomonadaceae” (Garrity & Holt., 2000). Estudios recientes ha propuesto la siguiente clasificación: Xanthomonas

euvesicatoria (Grupo A), X. vesicatoria (Grupo B), X. perforans (Grupo C) y X.

gardneri (Grupo D) (Jones et al., 2004).

4.3. Morfología específica de Xanthomonas spp. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria es una bacteria baciliforme, con

dimensiones entre 0,7-1,0 x 2,0-2,4 µm, Gram-negativa, aerobica estricta, móvil y

con un flagelo polar (Jones, 1997). Se caracteriza por presentar colonias amarillas

en medio agar nutritivo (AN), mucoides y/o de producir pigmentos

(xanthomonadinas) (Stall, 1993). La mayoría de ellas crecen muy lentas en

medios de cultivo (Agrios, 2004) (Figura 3).

Figura 3. A. Micrografía de Xanthomonas campestris. B. Colonias de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria aisladas en AN (agar nutritivo).

4.4. Sintomatología de la mancha bacteriana en tomate. Los síntomas de la mancha bacteriana ocurren en toda la parte aérea de la

planta y se manifiestan en cualquier etapa fenológica del cultivo (Gitaitis et al., 1992). Se caracteriza por presentar lesiones necróticas en hojas, tallos y frutos.

9


En verano y climas cálidos la mancha bacteriana causa severas defoliaciones de

plantas ocasionando pérdidas en la producción (Pohronezny et al., 1986). En

hojas los primeros síntomas se presentan como ampollas irregulares, con bordes

definidos de un color amarillo o verde claro a marrón oscuro o necrótico (Goode & Passer, 1980). En los frutos verdes aparecen pequeñas manchas acuosas

que sobresalen ligeramente, tienen halos blancos verduscos y se extienden hasta

alcanzar un diámetro aproximado de 3 a 6 mm (Agrios, 2004). Poco después los

halos desaparecen y las manchas se van tornando de color marrón y de textura

áspera (Jones, 1997). Estas lesiones tienden a ser hundidas en el centro y

elevadas por los márgenes (Gonder & Passer, 1980). Una enfermedad conocida

como peca bacteriana del tomate se parece a la mancha bacteriana pero es

ocasionado por la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las lesiones que

causa en hojas, tallos y el fruto son similares (pero más pequeñas) que las que

causa Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Agrios, 2004), (Figura 4).

A B

Figura 4. Síntomas causados por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria en cultivos de

tomate. A) manchas necróticas en tejido foliar. B) heridas necróticas en fruto.

10


4.5. Estructura y organización del genoma. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria también designado Xanthomonas

axonopodis pv. vesicatoria (Bonas, 1993) o Xanthomonas euvesicatoria (Jones, 2004) tiene un alto contenido genómico de G + C (Leyns, 1984). Xanthomonas

campetris pv vesicatoria contiene un simple cromosoma circular de 5, 178,466 pb

y cuatro elementos extracromosomales. Contiene dos operones rRNA

organizados en el orden 16S-23S-5S y localizados en una región de

aproximadamente 500 kb (entre 4,600,000 pb y 5,100,000 pb) (Thieme et al., 2005).

El alto número de elementos móviles y desviaciones en contenidos de G +

C proporcionan la flexibilidad del genoma en Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria. Esto es una ventaja para la evolución de los patógenos por la

necesidad de adaptación contínua para suprimir los mecanismos de defensa del

hospedero (Thieme et al., 2005). Xanthomonas campestris pv. vesicatoria posee DSF (factor de difusión de

señal), constituidos por ácidos grasos alfa, β-insaturados los cuales están

involucrados en la regulación de síntesis de enzimas extracelulares y

exopolisacáridos. Ocho genes (rpfA a H) involucrados en la producción y

percepción de DSF, se están dentro del genoma de X. campestris pv. vesicatoria.

Posee también el factor difusible (DF), el cual es una butirolactona y está

involucrada en la regulación de pigmentos (xanthomonadinas) y en la síntesis de

exopolisacaridos.

El DF es encontrado en el genoma de X. campestris pv. campestris y se

cree que está dentro del genoma de X. campestris pv. vesicatoria por la presencia

de un pigB locus que está implicado en la síntesis de DF en Xanthomonas

campestris pv. campestris (Poplawsky et al., 1997). Tiene una región de 147-kb en el cromosoma (116 genes, XCV1929 a

XCV2044) el cual es únicamente desarrollado para la biosíntesis flagelar (Thieme et al., 2005).

En X. campestris pv. vesicatoria algunos operones codifican componentes

de tipo 4 pili, que le permite a la bacteria la retracción y la adhesión al tejido de la

11


planta (Van Doorn et al., 1994). Algúnas bacterias Gram-negativas tienen polisacáridos fijos a su superficie,

las cuales contribuyen a su patogenicidad y a su interacción con las células de

plantas y animales (D,Haeze et al., 2004). El típico exopolisacárido del género

Xanthomonas es el xanthano (Becker et al., 1998). El gen gum controla la

biosíntesis de xhantano en X. campestris pv. campestris y es conservado en X.

campestris pv. vesicatoria. Estudios en X. campestris pv. campestris demuestran

que xhantano gum no es esencial para la patogenicidad pero contribuye en la

agresividad contra el hospedero (Katzen et al., 1998). El sistema de secreción bacterial es importante para la interacción del

patógeno con el hospedero (Buttner et al., 2002). X. campestris pv. vesicatoria

contiene genes para todos los sistemas de transporte de proteinas conocidos en

bacterias gram-negativa. Se conoce el “Sec pathway” el cual es importante para el

transporte de muchas proteínas en el espacio periplasmico. El sistema TAT (tatA-

tatC) manda una ruta alternativa de proteinas al periplasma (Robinson et al., 2001). El sistema de secreción tipo II de patogenicidad de la baceria consiste en

un gran número de proteínas incluyendo posibles determinantes de avirulencia, al

espacio intercelular de la planta (Sandkvist et al., 2001). El principal determinante de la virulencia dentro de X. campestris pv.

vesicatoria es el sistema de secreción tipo III (TTSS), que es codificado por el

grupo de genes de la patogenicidad hrp. Localizado a 35.3-kb del cromosoma

genómico (459,555 pb – 494, 868 pb) (Thieme et al., 2005). 4.6. Importancia del gen hrp.

El gen hrp está altamente conservado entre un gran número de bacterias

fitopatógenas. El gen hrp (reacción de hipersensibilidad y patogenicidad, es

esencial para una evidente interacción con la planta, para la patogenicidad en

plantas susceptibles y la inducción de la Reacción de hipersensibilidad (HR) en

plantas resistentes (Fenselau et al., 1992). El gen hrp determina la patogenicidad, muchos genes hrp son organizados

en grandes grupos que contienen dos o más genes y se pueden aislar de muchas

12


bacterias fitopatógenas gram negativas, tales como: patovares de Pseudomona

syringe, Ralstonia solanacearum, Erwinia amylovora y patovares de Xanthomonas

campetris (Bonas, 1994). Los genes hrp de las bacterias fitopatógenas son también muy similares a

los genes que están involucrados en la secreción de factores de patogenicidad

para bacterias patógenas de mamíferos (Fenselau et al., 1992). Bacterias no-

patógenas no pueden producir síntomas en hospederos susceptibles y reacción

de hipersensibilidad en no-hospederos y se cree que no poseen secuencias del

DNA similar al gen hrp (Stall et al., 1990). Muchos genes hrp están involucrados

en una región cromosomal 23 kb y están organizados en seis operones que van

de hrpA a hrpF (Bonas et al., 1991). El gen hrp que determina la hipersensibilidad

y patogenicidad es apropiado para los análisis de detección e identificación de

bacterias fitopatógenas (Willis et al., 1990). Los oligonucleotidos diseñados en el

gen hrp pueden ser usados para determinar la patogenicidad desconocida de

Xanthomonas. La presencia de cepas fitopatógenas en muestras puede ser

determinada por la amplificación de fragmentos hrp sin la necesidad de métodos

de aislamiento del organismo e inoculación en plantas hospederas (Leite et al., 1994). 4.7. Importancia del Cultivo de tomate en Sinaloa.

Sinaloa es considerado en México y en el mundo como una entidad

eminentemente agrícola, donde se concentra gran parte de la producción de

hortalizas del país. A lo largo del último siglo se ha dado un desarrollo de la

horticultura como consecuencia principalmente de la variación que ha

experimentado la demanda, tanto en el mercado nacional como en el mercado

externo (Gonzáles, 1998). Sinaloa obtuvo una producción total de 537,177 ton.

con un rendimiento promedio de 32.735 ton/ha en el ciclo otoño-invierno 2005-

2006. Los municipios con mayor superficie sembrada de tomate en Sinaloa son:

Culiacán (7399 has), Los Mochis (7210), Guasave (7093 has), Mazatlán (1697

has), La Cruz (1567) y Guamúchil (802). Alcanzando una superficie de 26, 530

has en el ciclo 2005-2006, con un valor comercial de 412.6 millones de dólares,

13


representando el 37 % del valor total de las exportaciones de legumbres y

hortalizas, siendo una fuente importante de mano de obra ya que se requieren

hasta 254 jornales por hectárea (SAGARPA, 2004). Esta situación favorable de la

horticultura Sinaloense se debe, entre otros factores a la posición geográfica

estratégica, un clima favorable, sus notables avances tecnológicos y gran

capacidad de innovación, además sobre salen la organización eficiente de los

productores, la disposición de tierra cultivable, una enorme infraestructura

hidráulica, disponibilidad de mano de obra, tradición en sus relaciones con las

distribuidoras estadounidenses, facilidades en telecomunicaciones y transporte y

la calidad de sus productos hortícolas (Gonzáles, 1998) . 4.8. Importancia de la mancha bacteriana en tomate.

El género Xanthomonas comprende un grupo de bacterias fitopatógenas de

gran importancia económica, ya que sus especies tienen como hospedero a más

de 124 especies de plantas monocotiledóneas y 268 dicotiledóneas son

hospedantes de Xanthomonas (Leyns et al., 1984). Entre las especies de

Xanthomonas campestris es una de las más importantes pues consta de al menos

125 diferentes patovares que son diferenciados por el hospedante al que afectan

(Bradbury, 1984). La mancha bacteriana es una de las enfermedades más importantes del

tomate y chile en el Estado de Sinaloa, por su amplia distribución y severidad esta

considerada como una de las enfermedades más importantes en la actualidad. El

clima caluroso y alta humedad de esta región costera de México, combinado con

lluvias en invierno y neblinas, constituyen un ambiente ideal para la infección de

hojas pecíolos, tallos y frutos (Cruz et al., 1998). La enfermedad causa la caída de flores, reflejandose en la producción y su

rápida diseminación en favorecida por altas temperaturas (24-30°C). Las pérdidas

causadas por la mancha bacteriana también repercuten en el costo de los

productos químicos utilizados como estrategias de control, como lo es el uso de

fungicidas cúpricos (Lopes & Quezado-Soares, 1997; Goode & Passer, 1980; Jones, 1997).

14


Algunos factores que explican el desarrollo de fuertes epidémias por la

mancha bacteriana en el cultivo de tomate son: variabilidad en el control químico y

la ausencia de fuentes de resistencia adecuada (Goode & Passer, 1980; Jones, 1997).

4.9. Ciclo de la enfermedad. La bacteria penetra dentro de las hojas a través de los estómas. En los

frutos, se introduce mediante heridas provocadas por insectos picadores como la

chinche verde (Nezara viridula) por la acción del granizo, o bien por el granizo y

por partículas de arena muy finas arrastradas por vientos muy fuertes (Jones, et

al., 1991). Una vez dentro de la cavidad estomatal la bacteria provoca una

hinchazón y rompimiento de la epidermis. Después se extiende hacia otros

espacios intercelulares adyacentes, y destruye el tejido. Posteriormente la mancha

se seca y el tejido se colapsa (Jaime, 1976). En tejidos jóvenes de hojas y frutos estimulan la división celular; la

hipertrofia es ocasionada por cantidades muy pequeñas de amonio, que es

producido por la bacteria.

Las bacterias se diseminan a través de la semilla infestada, por la lluvia y

durante las labores de cultivos. Sobrevive en residuos de plantas muertas durante

dos años, en semillas secas de tomate durante 16 meses, en plantas de tomate y

en la rizósfera de algúnos cereales de invierno; la bacteria no sobrevive en el

suelo como células individuales (Peterson, 1965; Jones et al., 1991). Las temperaturas de 24 a 30°C, así como la humedad relativa

especialmente gotitas de agua son necesarias para el desarrollo de la enfermedad

(Jones et al., 1991). 4.10. Control de la enfermedad. La desinfección de la semilla es importante para un buen inicio de la

producción de plántulas libres de las bacterias. Se recomienda la desinfección de

la semilla con agua caliente a 50°C durante 30 minutos o tratar la semilla con

productos químicos como el Arasan 75, en una relación 1:2000 durante 5 minutos

15


seguido de un lavado de la semilla (León, 1982; Haward y Waterson, 1964). En plántulas que se producen en invernaderos con cubierta de plástico, se

debe de regar solamente cuando sea necesario. Tratamientos al agua con

bactericidas/algicidas resultan de gran utilidad y a muy bajo costo si se

implementan en forma contínua. Tambien conviene aplicar cualquier metodo que

ayude a reducir la temperatura dentro del invernadero, sobre todo durante los

meses más calurosos. Lo anterior no favorece el desarrollo de la enfermedad

(Sánchez, 1986). Las aspersiones con productos químicos a base de cobre mezclados con

antibióticos completan el manejo de la enfermedad.

En el campo, la alternativa de control es el uso de fungicidas a base de

cobre mezclados con ditiocarbamatos de manganeso, así como la aspersión de

antibióticos como el sulfato de estreptomicina.

La rotación de cultivos es recomendable para eliminar las fuentes de

inóculo (residuos de cosecha y plantas muertas) en el campo (Jones et al., 1991). B. Caracterización fisiológica de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

Por más de 70 años se creía que la mancha bacteriana era causada por

una sola especie, identificada como Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

(Jones et al.,1998). Varios estudios se han realizado con el objeto de esclarecer

la etiología de la enfermedad, a través de características fenotípicas y genotípicas.

Las pruebas bioquímicas, son pruebas simples que se han desarrollado

para demostrar la presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática,

grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada

temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, entre otros. No significan de

ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano (Montealegre, 2002). 1. Caracterización a nivel género.

La capacidad de hidrolizar almidón (actividad amilolítica) fue una de las

primeras características fenotípicas que mostró diferencias entre los aislados de

16


Xanthomonas spp. asociados con la mancha bacteriana en tomate y chile. Actualmente se han caracterizado los grupos “A”, “B”, “C” y “D” de Xanthomonas

campetris pv. vesicatoria como agentes causales de la mancha bacteriana. (Jones et al., 1998). Se han reconocido cerca de 100 especies de Xanthomonas como

patógenos de distintas plantas. En el Cuadro 2, se definen algunas de las pruebas

bioquímicas empleadas para la caracterización de 13 generos de bacterias, dentro

de los cuales se ubica Xanthomonas.

Cuadro 2. Características usadas para diferenciar géneros de bacterias

patógenas en plantas capaces de crecer en medio estándar.

Caracter

Erw

inia

Pan

toea

Aci

divo

rax

Pse

udom

onas

Ral

ston

ia

Bur

khol

deria

Xant

hom

onas

Xyl

ophi

lus

Agr

obac

teriu

m

Cla

viba

cter

Clo

strid

ium

Bac

illus

Stre

ptom

yces

Gram - - - - - - - - - + + + +

Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - - + + -

Crecimiento aerobio + + + + + + + + + + - + +

Colonias amarillas o

naranjas en YDC o NBY - + - - - - + + -

+ - - -

Colonias mucoides en YDC - - + - + - + - + + ND ND -

Fluorescencia en B de K - - - + - - - - - - - - -

Ureasa - - + - + v - + ND - ND ND ND

Oxidasa - - + - + + - - + - - V +

(Schaad, 2000)

1.1. Fluorescencia. La fluorescencia es la capacidad que tienen ciertos cuerpos de

transformar la luz que reciben en radiaciones de mayor longitud de onda. El medio

B de King, especialmente pobre en hierro, pone de manifiesto la presencia de un

pigmento fluosrescente con luz ultravioleta de 260 nm. La bacteria Xanthomonas

17


campestris pv. vesicatoria es una bacteria que no emite luz al crecer en dicho

medio de cultivo y ser expuesta a luz UV (Lehninger, 1995).

1.2. Tinción de Gram La tinción de Gram fue diseñada empíricamente en 1884 por el médico

danes Cristian Gram, quien dividió a las bacterias en organismos Gram-positivos

(Figura 5) y Gram-negativos según su reacción frente al teñido con cristal violeta y

yodo y después de ser decoloradas y tratadas con safranina (Lehninger, 1995). La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales (http://edicion-

micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html).

Características de las bacterias Gram positivas y Gram negativas:

a) Gram positivas

Ácido Teicoico Peptidoglicano

Pared celular

Membrana Citoplasmática

Ácido Lipoteicoico

Figura 5. Estructura de una bacteria Gram positiva.

En el interior de la célula se encuentra el citoplasma que está constituido

por ribosomas y centralmente se ubica el nucleoide bacteriano que semeja una

madeja de hebras y cuyo principal componente es el DNA.

El perfil de la envoltura externa de la pared celular de la bacteria Gram

positiva, posee como base química fundamental el péptidoglucano y que

corresponde a un polímero de N-acetil glucosamina, unido en posición B-1-4 con

N-acetil murámico, a éste se agregan por el grupo lactilo 4 ó más aminoácidos.

18

http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html



Esta molécula se polimeriza gran cantidad de veces, de modo que se forma una

malla especial, llamada sáculo de mureína. Dicho compuesto es de vital

importancia para conservar la forma y darle rigidez a la célula bacteriana; si este

compuesto no existiera, la célula reventaría debido a su gran presión interna.

b) Gram negativas

Las células presentan una doble capa denominada membrana externa,

(Figura 6), luego se observa una capa más densa que corresponde al

peptidoglucano, estructura que conforma la pared celular de la bacteria Gram

positiva y que también es responsable de la rigidez y resistancia de la célula Gram

negativa.

Lipopolisacárido Poro

Membrana externa

Lipoproteína Espacio Periplásmico

Peptidoglicano Membrana citoplásmica

Figura 6. Estructura interna de una bacteria gram negativa.

Luego se encuentra el espacio periplasmático y la membrana

citoplasmática que posee similar característica a la de la bacteria Gram positiva.

En el interior se encuentran el citoplasma y nucleoide, que aparecen menos

compactos que las bacterias Gram positivas, pero que son estructuralmente

semejantes.

En las bacterias Gram negativas, como es el caso de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria, existe una membrana externa que no poseen las

bacterias Gram positivas y cuya estructura es semejante a la membrana

citoplasmática. La membrana externa se presenta como un triple perfil en el que

19


las líneas densas a los electrones corresponden a proteínas que fijan los

compuestos de metales pesados (para la microscopía electrónica). El perfil

transparente a los electrones tiene una composición química compleja; al exterior

de la bacteria se encuentran polímeros de heterosacáridos o azúcares que están

unidos a un complejo de glúcidos fosfolípidos que se han denominado

lipopolisacáridos (Montealegre, 2002).

1.3. Catalasa. La porción no aminoácido de una proteína conjugada se denomina grupo

prostético. La catalasa es una hemo-enzima que posee un espectro de absorción

característico debido a su grupo prostético hemo (ferroprotoporfirina) y muestra

cambios transitorios en su espectro cuando se muestra con su sustrato, el

peróxido de hidrógeno, lo cual es el reflejo de la descomposición de su complejo

enzima-sustrato. El peróxido de hidrógeno formado por la superóxido dismutasa,

hemoenzima que cataliza la reacción.

H2O2→ H2O + ½ O2

La detección de la catalaza se realiza mediante la identificación de burbujas

de oxígeno formadas, dicha reacción se observa en el caso de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria debido a la acción de dicha enzima cuando se pone en

contacto con su sustrato el peroxido de hidrógeno (Lehninger, 1995).

1.4. Oxidasa. Los citocromos son proteínas transferidoras de electrones que contienen

grupos ferro-porfirina; se encuentran únicamente en las células aeróbicas.

Algunas se hallan localizadas en la membrana mitocondrial interna, donde actúan

secuencialmente para transportar los electrones originados en varios sistemas

deshidrogenasas, hasta el oxigeno molecular. Otros citocromos se encuentran en

el retículo endoplasmático en el que desempeñan un papel en las reacciones de

hidroxilación especializadas. Todos ellos experimentan cambios reversibles de

valencia Fe (II) Fe (III) durante sus ciclos catalíticos. Sus formas reducidas no

20


pueden ser oxidadas por el oxígeno molecular, con excepción del citocromo

terminal de la respiración mitocondrial, es decir, el citocromo, a3 o citocromo c

oxidasa, que también contiene cobre íntimamente unido a él.

Los citocromos oxidasas tienen una gran afinidad por el oxígeno, mientras

que las oxidasas negativas no. La reacción se efectúa cuando la proteína actúa

sobre el dihidrocloril tetrametil fenilamina que al combinarse con el naftol se

produce un color azúl y agua, esta reacción no sucede con la bacteria

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, dicha reacción se muestra a

continuación:

N (CH3)2 NH2 + Naftol + O2 → N (CH3)2 Azul + H2O

1.5. Crecimiento en YDC (extracto de levadura dextrosa). Este medio de cultivo es rico en calcio y se utiliza para observar el

crecimiento, elevación, consistencia y color de la bacteria Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria. Son colonias de Xanthomonas spp. presenta una

consistencia pegajosa y una coloración amarilla o naranja, esto permite diferenciar

entre otros géneros como de Pseudomonas spp. que no presenta estas

caracteristicas en YDC.

2. Caracterización de especies de Xanthomonas. Pocas especies han sido fácilmente distinguidas del tipo de especies de

Xanthomonas y/o cualquier otra, mediante el uso de pruebas bioquímicas usadas

en el manual de determinación bacteriológica de la octava edición de Bergey´s

(Skerman, 1980). Aun no es posible diferenciar las cuatro especies de Xanthomonas

asociadas con la mancha bacteriana en tomate (X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X.

perforans y X. gardneri) empleando pruebas bioquímicas. El último “Índice de

bacterias y cambios en la nomenclatura” publicados en la International Journal of

Systemic Bacteriology entre 1980 y 1992 (Moore, 1992), incluyen X. albilineans,

X. axonopodis, X. campestris, X. citri, X. fragaria, X. malthophilia, X. orizae,

21


X.phaseoli y X. populi (Williems, 1987). A continuación (Cuadro 3) se indican algunas de las pruebas bioquímicas

empleadas para la caracterización de cinco especies del genero Xanthomonas

(Schaad, 1998).

Cuadro 3. Pruebas bioquímicas para la diferenciación de Xanthomonas spp.

Pruebas

X.

campestris

X.

fragariae X. albilineans

X.

axonopodis

X.

ampelina

Crecimiento a 35°C + - + + -

Hidrólisis de almidón + + - + +

Licuefacción de gelatina v + v - -

Digestión de proteínas + - - - -

Producción de ureasa - - - - +

Ácido a partir de fructuosa + - - - +

Ácido a partir de glucosa + + + + -

Ácido a partir de celobiosa + + + - -

V = variable

2.1. Crecimiento en YS (Caldo de levadura). Este medio es un medio rico en levadura. Especies de Xanthomonas

campestris crecen en condiciones de temperatura de 35°C, observandose turbidez

en el medio de cultivo al haber crecimiento bacteriano. Este se utiliza para

diferenciar otras especies tales como, X. fragariae, X. axonopodis y X. ampelina

(Schaad, 1988). 2.2. Hidrólisis de almidón.

Dentro de los polisacáridos de reserva, el almidón es el más importante en

las plantas, y el glucógeno en los animales, los cuales se depositan

habitualmente, en forma de gránulos en el citoplasma celular. Los gránulos de

glucógeno o de almidón pueden aislarse de los extractos celulares por

centrifugación diferencial. En ocasiones en que hay exceso de glucosa, unidades

de ésta se unen enzimáticamente a los extremos de las cadenas de glucógeno o

22


almidón; si existe necesidad metabólica, entonces se liberan de nuevo, también

por acción enzimática y son empleadas como combustible (Lehninger, 1995). El almidón se encuentra en dos formas, la alfa-amilosa y la amilopeptina.

Ciertas bacterias fitopatógenas (Xanthomonas en su gran mayoría), son capaces

de transportar el almidón por medio de enzimas extracelulares conocidas como

alfa y β amilasas, las cuales hidrolizan el almidón a maltosa, de tal forma que esta

ya puede penetrar al interior de la célula y ser atacadas por enzimas

intracelulares para la obtención de energía (Rodríguez, 2001). 2.3. Licuefacción de gelatina.

La gelatina es una proteína simple obtenida de la hidrólisis del colágeno, la

cual puede ser despolimerizada por todas aquellas bacterias que sintetizan la

exoenzima gelatinasa. En el caso de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

produce dicha enzima. Sin embargo, es importante señalar que el medio donde se

va a probar la acción de dicha enzima debe estar exento de carbohidratos, ya que

al fermentarse inhiben la síntesis de la gelatinasa (Rodríguez, 2001).

2.4. Dihidrolasa de arginina. Los aminoácidos básicos en los que los grupos R tienen carga positiva neta

a pH 7, poseen todos seis átomos de carbono. La arginina tiene un grupo

guanídico cargado positivamente.

La detección del sistema enzimático dihidrolasa de arginina, el cual permite a las

bacterias crecer bajo condiciones anaeróbicas, consiste de dos enzimas: la

arginina desmidasa que degrada la arginina a citrulina y NH3 y la citrulina ureidasa

que convierte a la citrulina a ornitina, bióxido de carbono y NH3. (Rodríguez, 2001). 2.5. Utilización de fuentes de carbono (Fructuosa, glucosa y celobiosa). Las fuentes de carbono son tradicionalmente utilizadas para determinar la

actividad de la vía metabólica de muchas bacterias a partir de sustratos (fructousa,

glucosa y celobiosa) que se incorporan en el medio de cultivo y que la bacteria al

23


crecer transforma o no. Existen muchas fuentes de carbono para llegar a la

caracterización de Xanthomonas campestris, enlistadas en el manual de Schaad

1988 y 2001. Así, la utilización de fructuosa, glucosa y celobiosa con fuentes de

carbono, permite la diferenciación de X. fragariae, X. albilineans y X. axonopodis,

al utilizar glucosa es diferenciada de X. ampelina y al utilizar celobiosa es

diferenciada de X. axonopodis y X. ampelina de acuerdo al manual de Schaad

1988.

3. Caracterización a nivel patovar. El término patovar no ha sido taxonómicamente estandarizado en el Código

Internacional de Nomenclatura de Bacterias (Sneath, 1992). Desde 1980, se han

propuestos algunos cambios relacionados con la nomenclatura y taxonomía de

Xanthomonas.

El término patovar fue propuesto en 1978 (Young, 1978), como una medida

para preservar el nombre de la planta hospedera, pero los datos fenotípicos no

fueron capaces de diferenciarlas de otras especies.

Muchos patovares de X. campestris pueden ser diferenciados por su

crecimiento y morfología de la colonia en medios semiselectivos (Cuadro 4) (Schaad, 1988).

Cuadro 4. Crecimiento de algunos patovares de Xanthomonas campestris en

medios semiselectivos.

Medio vesicatoria carotae translucens phaseoli pruni campestirs

SX - - - v- v-+

SM - - - - v +

BSCAA v v- + v- + +

MXP + (+) v + v- v+

XPSa v - - v- + -

XCS + + + + v +

MD-5 v + v + (+) v-

Tween + v + (+) + +

V = Variable

24


3.1. Crecimiento en agar Tween y SX. El medio SX es usado para la caracterización de Xanthomonas spp., en

tejido de plantas y suelo, tambien es usada para semilla. Los medios Tween y SX

son dos de los medios utilizados por Jones et al en 1980 para la caracterización

de pathovares “vesicatoria”, ya que son dos los principales para difrenciar entre el

resto de pathovares de acuerdo al manual de Schaad, 1988.

4. Prueba de patogenicidad. Cuando un organismo se encuentra asociado en forma convincente a una

planta enferma es fundamental determinar un papel como agente causal de la

enfermedad. Para demostrar lo anterior se realizan los postulados de Koch, los

cuales consisten en lo siguiente:

1. El patógeno debe encontrarse asociado con la enfermedad en todas las

plantas enfermas que se examinen.

2. El patógeno debe aislarse y desarrollarse en cultivo (parásitos no

obligados) puro y se deben describir sus características o desarrollarse en

una planta hospedante susceptible (parásito obligado) y registrar su

presencia por los efectos que en ella produzca.

3. El patógeno que se desarrolle en un cultivo puro debe ser inoculado en

plantas sanas de la misma especie y variedad en que apareció la

enfermedad y debe producir la misma enfermedad en la planta inoculada.

4. El patógeno debe registrarse una vez más en cultivo puro y sus

características deben corresponder a las anotadas en el segundo punto

(Agrios, 2004).

Es importante considerar que la infección por bacterias fitopatógenas

ocurre a través de heridas o aberturas naturales, por ello se debe de ayudar a la

bacteria en el proceso de penetración. Con base en lo anterior se han ideado

métodos de inoculación artificial tales como: Aspersión, el cual se usa para inducir

manchas foliares o tizones en los que las bacterias penetran a través de los

25


estomas, nectarios o estigmas; inyección ó punción, este método se utiliza en

caso de bacterias que causan marchités o pudrición blanda para ello se realizan

heridas en los cotiledónes y en la axila de la primera hoja verdadera; finalmente, la

inmersión en suspensión bacteriana que es recomendada para R. fascinas, planta

de tabaco, margaritón o semillas de chíncharo y la siembra en suelo esterilizado,

también se recomienda este último método para bacterias que invaden el xilema

(Rodríguez, 2001). Debido al tiempo consumido en la consecución de las pruebas

normales se han ideado pruebas rápidas de patogenicidad (Rodríguez, 2001) (Cuadro 5). C. Caracterización genotípica de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. La detección e identificación de bacterias fitopatógenas dependen del éxito

en el aislamiento de la bacteria en cultivo puro, la realización de pruebas

bioquímicas, serológicas y pruebas de patogencidad (Saettler 1989; Schaad 1989). Algunas veces se requieren medios selectivos para incrementar la

sensibilidad del aislamiento, de las bacterias, lo que inhibe el crecimiento de

bacterias contaminantes asociadas al tejido de la planta (Saettler 1989). Los

antisueros se han usado para la detección e identificación de bacterias, pero los

resultados son variables. Los antisueros policlonales pueden reaccionar con otras

bacterias y pueden ser ineficientes para detectar cepas específicas o patovares de

Xanthomonas campestris. Por lo que el diagnóstico de la mancha bacteriana ha

sido complicado debido a la heterogeneidad del agente causal de la enfermedad

(Bouzar et al., 1994). Actualmente se utilizan técnicas basadas en ácidos

nucleicos para la detección y caracterización de bacterias fitopatógenas

(Bereswill, 1992), por lo tanto, el diagnóstico de enfermedades bacterianas es

más sensible y específico a través de estos métodos (DeBoer, 1996). Para la

caracterización genotípica de Xanthomonas spp. que causan la mancha

bacteriana en plantas de tomate y/o chile se han empleando métodos

dependientes de amplificaciones por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

(Lows et al., 1999). Se considera que los métodos basados en análisis de ácidos

nucléicos son más confiables y precisos que las características fenotípicas,

26


serología, bioquímicas, fisiológicas, composición de ácidos grasos y utilización de

diversas fuentes de carbono, al comparar relaciones genéticas entre

microorganismos.

Cuadro 5. Pruebas rápidas de patogenicidad

Bacteria Parte vegetal

inoculada Método Síntoma esperado

Agrobacterium

rizogenes

Rebanadas de

zanahoria

Punción superficial Raíces adventicias

P. carotovorum Rebanadas de papa

P. fluorescentes Cebolla

X. c. pv. campestris Pepino

Cultivo bacteriano Pudrición suave

E. amylovora Frutos verdes del peral Lesiones necróticas

P. s.pv. syringae Vainas de chíncharo

P. s.pv. pisi Vainas de fríjol Punción con aguja

Lesiones húmedas

P. s.pv. phaseolicola

X. s. pv. phaseolicila

P. grupo syringae

E. amilovora

Hojas de tabaco Infiltración de hojas de

tabaco

Reacción de

hipersensibilidad

R. fascians Plántulas o semillas de

chíncharo dulce

Punción Fasciación

P. s. pv. syringae Frutos de limón Aspersión Necrosis hundida

P.s.pv. lachrymans Frutos de pepino

inmaduro

inyección Lesiones húmedas con

exudado

C. m. Subs.

michiganensis

Lesion levantada

X. vesicatoria Manchas y cancros

P. s. pv. tomato

Plántulas de tomate Inyección y corte de hoja

con navaja Manchas necróticas

pequeñas

C. m. Subs.

michiganensis

Hojas de maravilla Infiltración de

suspensión

Reacción de

hipersensibilidad

C. m. Subs.

sepedonicus

Plántulas de berenjena Inyección axilar Marchitez

A. tumefaciens Plántulas de tomate,

datura, girasol,

caléndula o crisantemo.

Aspersión en heridas en

el tallo

Agallas

27


1. Detección de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desarrollada

por Kary Mullis a mediados de los 80’s revolucionó el campo de la biotecnología

debido a la gran sensibilidad que posee en comparación con otras técnicas tanto

serológicas como convencionales. Básicamente el principio de esta técnica es la

síntesis “in vitro” de una molécula de DNA concreta a miles de moléculas

idénticas en cuestión de minutos. Además la sensibilidad de la técnica depende de

la especificidad de los “primers” u oligonucleótidos ante otros microorganismos

que podrían estar presentes en las muestras (Leite RP et al., 1994). El gen hrp

forma parte de una región altamente conservada del genoma de bacterias

fitopatógenas, por lo que es utilizado para la detección e identificación de un gran

número de especies de Xanthomonas o patovares. Teniendo en cuanta que

bacterias no-patógenas no pueden producir síntomas en hospederos susceptibles

y reacción de hipersensibilidad en no-hospederos y se cree que no poseen

secuencias del DNA similar al gen hrp. El estudio del gen hrp ha permitido la

rápida detección de Xanthomonas spp. mediante el PCR.

Los requerimientos para esta técnica son:

a) Un ADN de doble cadena que actúe como molde o templado.

b) Dos oligonucleótidos sintéticos como iniciadores de la síntesis que deben ser

complementarios a regiones en cadenas opuestas de ADN. La hibridación es

en regiones que flaquean al DNA de interés y con los extremos 3’ orientados

hacia el centro.

c) Una DNA polimerasa termoestable, que resista temperaturas mayores a 95°C,

como la Polimerasa Taq de Thermus aquaticus.

d) Los cuatro dNTPs en un buffer adecuado.

(Balbás, 2002).

28


III. HIPÓTESIS. La enfermedad de la mancha bacteriana ocasionada por Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria está asociada a cultivos de tomate en Sinaloa.

IV. OBJETIVO. A. Objetivo General.

Detectar y caracterizar aislados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

asociada con la mancha bacteriana en cultivos de tomate en Sinaloa.

B. Objetivos específicos.

Detectar por PCR la bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria en

tomate.

Caracterizar molecular y fisiológicamente aislados de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria asociadas con la mancha bacteriana en tomate.

Determinar la patogenicidad de aislados de Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria obtenidos de plantas de tomate.

29


V. MATERIALES Y MÉTODOS. 1. Material vegetal.

El muestreo se realizó en plantaciones de tomate del estado de Sinaloa (Ahome, Guasave, Mocorito, Sinaloa de Leyva, Culiacán, Elota, El Fuerte y

Salvador Alvarado), durante los ciclos agrícolas 2004-2006. Las muestras de

plantas sintomáticas se colectaron de lotes comerciales considerando los

síntomas inducidos por el genero de Xanthomonas en tomate. Las muestras se

colectaron en bolsas de polietileno y se trasladaron al laboratorio donde se

conservaron a 4°C paraanalizarse en un periodo no mayor a 48 hr después de su

colecta.

Durante el periodo muestreo se obtuvieron 174 muestras; de ellas 3, 25, 91,

30, 10, 3, 11 y 1 se colectaron en los municipios de Sinaloa de Leyva, Ahome,

Guasave, Culiacán, Mocorito, Salvador Alvarado, Elota y El Fuerte,

respectivamente (Figura 7).

Cabe resaltar que únicamente se colectaron muestras sintomáticas de tejido

foliar de tomate y de los municipios donde existe mayor superficie sembrada. El

número de muestras varió en los municipios debido a la eventualidad de los

síntomas mostrados en campo.

Salvador

Culiacán

Elota

Figura 7. Localización de

muestras de tomate con sínt

Alvarado Ahome

Sinaloa de Leyva

Mocorito

Guasave

los municipios de Sinaloa donde se realizó la colecta de

omas de mancha bacteriana (X. campestris pv. vesicatoria).

30


A. METODOLOGÍA. 1. Pruebas simple de identificación para Xanthomonas.

Previo a la caracterización molecular se realizaron pruebas sencillas y

rápidas para eliminar las colonias bacterianas que no presentaban características

morfológicas de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria; para ello se

consideraron las características de colonias en AN (agar nutritivo) y la prueba de

fluorescencia en medio B de King, tinción de Gram y forma de las bacterias. Todas

las colonias bacterianas que presentaron características similares al género

Xanthomonas se utilizarón en el desarrollo de este proyecto.

1.1. Aislamiento y condiciones de crecimiento bacterial en AN (agar nutritivo). Para el aislamiento de bacterias a partir de las plantas infectadas se

tomaron pequeños trozos de muestra del borde de la lesión con fin de restringir el

desarrollo posterior de contaminantes. Estos pequeños trozos de muestra se

sumergieron en alcohol al 96%, por un minuto, después se lavaron con agua

destilada estéril 1 minuto y se secaron en papel absorbente, para posteriormente

ser sumergidos en agua destilada estéril (2 ml) en un tubo por un minuto, de la

suspensión resultante se tomó una asada, para sembrar por estriado en cajas

petri con Agar Nutritivo (AN), las cuales se incubaron a 28º C, por 24 a 48 horas.

Las colonias amarillas fueron resembradas en cajas petri con agar nutritivo para

purificación, después de esto fueron preservadas en glicerol al 30% a -70°C.

Todas las cepas se transfirieron a medios de cultivo cada tercer dia ya que era

necesario mantener las colonias jóvenes (no mayores a 48 hr) para la realización

de las pruebas bioquímicas y fisiológicas.

1.2. Tinción Gram. La bacteria se cultivó en placa con AN por 24 horas. Se colocó una gota de

agua destilada estéril en un portaobjeto, y con el asa bacteriológica se tomó una

pequeña porción de una colonia (se recomienda colonias de 24 horas)

mezclandose con el agua para suspender la bacteria y así preparar un frotis, que

31


se fijó a la flama de un mechero de alcohol.

Se adicionó una o dos gotas de la solución de cristal violeta, se dejó actuar

un minuto y posteriormente se decantó; se adicionaron una o dos gotas de la

solución de lugol, se dejó actuar por un minuto y luego se decantó. Se decoloró

con etanol hasta quitar el excedente de colorante. Por último se adicionaron dos

gotas de safranina y se dejó actuar por 30 seg y finalmente se enjuagó con agua

corriente para posteriormente observarse al microscopio biológico compuesto

(Carl Zeizz, serie 470801-9097).

1.3. Prueba de Fluorescencia. Después de realizar los aislamientos bacteriológicos en AN (Agar

nutritivo), a las colonias amarillas mucoides se les realizó la prueba de

fluorescencia en medio B de King. Treinta y tres gr de medio B de king se

agregaron en 1000 ml de agua destilada e inmediatamente y se agitaron

vigorosamente, asegurándose de que estuviera completamente disuelto.

Posteriormente se sometió a esterilización en autoclave durante 15 min a 120°C y

15 Lb de presión. El medio de cultivo una vez estéril y a temperatura de 50° C se

dispensó en cajas petri para esperar su solidificación a temperatura ambiente.

Enseguida, en condiciones asépticas se procedió a sembrar la bacteria por estria

en medio AN y posteriormente cuando los cultivos tuvieron 48 horas se

transfirieron al medio B de King. Se utilizó como control positivo una cepa de

Pseudomonas (proporcionada por el Dr. Rubén Félix Gastelum, profesor

investigador de biología de la Universidad de Occidentes). Las cajas sembradas

se incubaron a 27° C de 24 a 48 hr.

B. Caracterización molecular. 1. Extracción de DNA de cepa bacteriana.

La bacteria se inoculó en medio LB y se incubó a 37° C de 16 a 18 horas;

posteriormente se transfirieron 1.5 mL de cultivo bacteriano a un tubo Eppendorf

de 1.5 mL; se centrifugó a 13 000 rpm por 3 min después se decantó el

sobrenadante, se transfirieron nuevamente 1.5 mL de cultivo bacteriano al igual

32


que en el primer paso, se centrifugaron y se dacantó. La pastilla se resuspendió

en 467 µL de solución amortiguadora con repetidos pipeteos, enseguida se

añadieron 30 µL de SDS al 10% y 3 µL de proteinasa K (20 mg/mL), se agitó por

inversión y se incubó 1 hora a 37 °C. Se adicionó un volumen igual (500 µL) de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) a -20°C, se mezcló por inversión varias

veces y se centrifugó por 8 min. a 13 000 rpm. Se transfirió la fase superior

acuosa a un tubo nuevo y se adicionaron 15 µL de RNA’sa. Se agitó por inversión

y se incubó a 37° C por 30 min. se adicionaron 500 µL de cloroformo:alcohol

isoamílico (24:1) a -20° C y se centrifugó a 13 000 rpm por 8 min. aquí se transfirió

nuevamente la fase superior acuosa a un tubo nuevo y se añadieron 50 µL de

acetato de sodio 3M pH 5.2 y se agitaron por inversión, se adicionaron 300 µL de

isopropanol a -20° C y se centrifugó por 8 min. a 13 000 rpm. se lavó el DNA con

etanol al 70% a -20°C por 3 min. Y se centrifugó a 13 000 rpm. y se decantó

cuidando de no perder la pastilla. Posteriormente se secó la pastilla y se

resuspendió el DNA en 20 µL de agua bidestilada. El DNA fue almacenado a -

20°C hasta su posterior utilización.

2. Electroforésis para visualizar el DNA genómico. La verificación de la extracción del DNA se llevó a cabo mediante su

visualización en un gel de agarosa por medio de la técnica de electroforesis. Se

utilizó un gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio a una concentración de 0.2

µL/ml. Primeramente se colocó en un matraz 0.24 gr de agarosa, se adicionaron

30 ml de buffer TAE 1X y se disolvió con temperatura por 1 minuto en horno de

microondas. Posteriormente, se dejó enfriar lo suficiente antes de gelificar, se

agregaron 0.8 µL de bromuro de etidio y por último, se vació en la cámara de

electroforesis hasta enfriarse y gelificar, aproximadamente 10 a 15 min despues.

Una vez gelificado se cargaron 2 µL de la muestra del DNA, junto con 6µL de

agua bidestilada estéril y 2µL de buffer de carga (colorante naranja G). La

electroforesis se corrió a 80 V durante 20-25 min, en una cámara de electroforesis

con el buffer TAE 1X. Finalmente, se visualizó el DNA en un transiluminador de

luz ultravioleta y se colocó en un fotodocumentador de imágenes para registrar los

33


resultados (Chemidoc, Biorad).

3. Determinación de la concentración de DNA. Antes de correr la PCR se determinó la concentración del ADN mediante la

lectura de absorbancia en un espectrofotómetro, con una longitud de onda de 260

nm. 5 µL del DNA obtenido fueron diluidos en 450 µL de agua destilada estéril.

Para conocer la concentración del DNA se aplicó la siguiente formula:

Concentración de DNA = (50 ng/µL) (Factor de dilución) (Absorbancia)

De todas las muestras se prepararon alícuotas a una concentración de 20

ng/µL y se utilizaron 2 µL de DNA templado en la reacción de PCR.

4. Detección del patógeno por PCR. La amplificación de la secuencia hrp mediante PCR es una herramienta útil

para la detección e identificación de Xanthomonas. La región hrp no está presente

en bacterias saprofitas y Xanthomonas spp. oportunistas, lo que reduce la

posibilidad de obtener falsos positivos.

El par de primer (Cuadro 6) RST65/RST69 amplifican un fragmento de 420

pb de cepas del patovar vesicatoria; estos primers están diseñados en la

secuencia conservada entre los cuatro grupos de Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria. (Obradovic et al., 2003). Cuadro 6. Secuencias de los oligonucleótidos usados en la PCR para detectar aislados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

Primer Secuencias 5´→ 3’ Referencia

RST65 GTCGTCGTTACGGCAAGGTGGTCG Obradovic et al., 2003

RST69 TCGCCCAGCGTCATCAGGCCATC Obradovic et al., 2003

La PCR se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 ml con un volumen total de

reacción de 25 µL el cual contenía 40 ng de DNA total, 1 X de buffer, 2 mM de

34


MgCl2, 0.4 pmol de cada primer, 0.2 mM de nucleótidos trifosfatados (dNTP´s) y

2.0 Unidades de taq polimerasa (Invitrogen Cat. 18038-018).

Para la amplificación de los ácidos nucléicos los tubos Eppendorf con la

mezcla de reacción se colocaron en un termociclador (Cycle-BioRad). El proceso

de la PCR se sujetó a las siguientes condiciones: 94°C por 2 min. (primera etapa

de desnaturalización), 94 °C por 30 seg. (segunda etapa de desnaturalización),

61°C por 45 seg. (etapa de alineamiento) y 72°C por 30 seg. (etapa de extensión).

Los últimos 3 pasos se repitieron por 30 ciclos y se dió una extensión de 72°C por

5 min para la polimerización final. Posteriormente los tubos permanecieron a 4°C

para enfriamiento y congelación de las moléculas sintetizadas.

5. Purificación de bandas (Kit Gen Clean III). Los fragmentos positivos para Xanthomonas campestris pv. vesicatoria se

cortaron del gel y se purificaron siguiendo el protocolo del kit comercial, Gen Clean

Kit III (Gibco-BRL Cat. 1001-200). Enseguida, se colocó la banda en tubos

Eppendorf y se adicionaron 500 µL de ioduro de sodio (NaI) y se incubaron a 55°

C, agitando constantemente hasta que se disolviera la banda con agarosa y liberar

el DNA. Una vez disuelta la agarosa, se agregaron 5 µL de perlas de vidrio (Glass

1000) y se incubó por 5 min a temperatura ambiente agitándose cada minuto por

inversión. Posterior a la incubación se centrifugó por 10 seg a 13 000 rpm y se

eliminó el sobre nadante. El presipitado se lavó tres veces con 500 µL de solución

“New Wash”. En cada lavado la suspension se agitó en un vortex y se centrifugó

por 10 seg a 13,000 rpm descartandose el sobrenadante. Posteriormente la

pastilla se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en 10 µL de agua ultra

pura y finalmente se incubó a 55° C por 5 min y se centrifugó a 13,000 rpm

durante 30 seg para liberar el DNA de las perlas de vidrio (Glass 1000) y que este

quedara disuelto en el sobrenadante, el cual se recupero con la pipeta cuidando

de no tocar la pastilla.

Para corroborar la recuperación del DNA purificado, se realizó una corrida

electroforética en un gel de agarosa al 1% con 2 µL del producto, 6 µL de agua

bidestilada estéril y 2 µL de buffer de carga (colorante G).

35


6 Ligación de productos de PCR en el vector de clonación. Una vez purificados los fragmentos de DNA de Xanthomonas campestris

pv. vesicatoria se ligaron en el vector de clonación pGEM-T Easy Vector System

(Promega Madison WI USA Cat. 157348). Este vector posee en los extremos una

base de timinas y el fragmento amplificado por PCR extremos con adeninas, que

por complementariedad y con la acción de la enzima ligasa permite el

recirculamiento del vector con el fragmento amplificado. Para la reacción de

ligación se mezclaron 4 µL de DNA purificado, 0.5 µL de vector (25 ng/ml), 5.0 µL

de buffer de clonación (2X), 1 µl de T4 DNA ligasa (3 U/µl) y 2.0 µl de agua

bidestilada estéril. Posteriormente la reacción se incubó a 4 °C durante 12 hr. El

producto de la ligación se utilizó en el proceso de transformación de E. coli.

Cuando no se realizó de inmediato la transformación, la reacción de ligación se

conservó a -20 °C hasta su utilización.

7. Transformación de células competentes. Para el proceso de transformación se utilizaron cajas petri (dos por cada

ligación) con LB sólido, ampicilina (100 mg/ml), IPTG (200ng/ml) (isopropil-β D-

tiogalactopiranosida) y X-Gal (20 ng/ml) (5-bromo-4cloro-3i-ndoli- β-D-

galactopiranosida). Las células competentes de E. coli (JIM 109, Cat. N.-L2001,

Promega) se descongelaron sobre hielo agitándose cuidadosamente por

inversión. En un tubo Eppendorf se colocan entre 2 y 5 µl de la reacción de

ligación (dependiendo de la intensidad de la banda purificada). Posteriormente, se

adicionaron 50 µl de células competentes. La reacción se mezcló golpeando

ligeramente los tubos con los dedos. Rápidamente los tubos fueron colocados en

hielo por 20 min. Posteriormente se procedió al choque térmico de las células por

aproximadamente 45-50 seg en baño maria a 42 °C (sin agitación).

Posteriormente los tubos se regresaron al hielo por dos min. Se agregaron 900 µl

de medio SOC (1% de tristona, 0.5 % de extracto de levadura, 8.5 mM de NaCl,

2.5 mM de KCl, 0.01 mM de MgCl2, 0.02 mM de glucosa 1000 ml de agua

bidestilada) a los tubos que contenían las células transformadas con las

reacciones de ligación y por último se incubó a 37° C con agitación a 160 rpm por

36


1.5 hrs.

En la cámara de flujo laminar se adicionaron 100 µl de la reacción de

transformación se distribuyéndose uniformemente a las cajas petri con

LB/ampicilina. El resto del transformado se centrifugó para obtener un

concentrado de las células. Se descartaron aproximadamente 800 µl de LB a otra

caja. Las cajas petri se incubaron por 16 horas a 37 °C. Las colonias

recombinantes con el fragmento de DNA insertado exhiben un color blanco, lo cual

se debe a que la inserción del DNA amplicado interrumpe el marco de lectura de

β-galactosidasa haciéndola no funcional y la hace incapaz de emplear extracto X-

gal para producir la coloración azul que muestra en células no transformadas.

8. Extracción de DNA plasmídico (minipreps). Para realizar la extracción del DNA plasmídico se crecieron las células

recombinantes (de color blanco) por 16 horas en LB líquido con ampicilina a 37°C

y agitación a 160 rpm. Posteriormente se procedió a la extracción del DNA

plasmídico, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante del kit Rapid

Plasmid Miniprep Purification Systems (Marlingen Bioscience 50 cat. No 11453-

016 Germany/USA).

Para verificar si se tenía el fragmento insertado en el vector se realizó

digestión con la enzima EcoRI, y en algunos casos el DNA plasmídico de cada

clona se amplificó por PCR con el par de oligonucleótidos RST65/RST69 y es

visualizó en un gel de agarosa al 0.8%.

9. Análisis de restricción del gen hrp amplificado por PCR (RFLP-PCR). Para determinar la presencia de los grupos (“A”, “B”, “C” y “D”)de

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, los productos de PCR fueron digeridos

con la enzima HaeIII que permite observar diferencias entre dichos grupos

(Obradovic et al., 2003). Los análisis de restricción de regiones amplificadas del

gen hrp pueden realizarse para cualquier grupo patógeno de Xanthomonas,

facilitandose la identificación y clasificación de cepas bacterianas (Leite et al., 1994). Todas las amplificaciones por PCR de las muestras fueron clonadas y

37


secuenciadas y mediante la técnica de RFLP-PCR se compararon los patrones

obtenidos.

Para el análisis de restricción de los fragmentos amplificados por PCR con

los primers RST65/RST69 que amplifican un fragmento de 420 pb, se utilizó la

enzima de restricción Hae III (Invitrogen). Para la digestión se mezclaron 10 µl del

producto de PCR 2.0 Unidades de enzima, buffer 1X y se sometió a un periodo de

incubación de 2 horas a 37°C. Los fragmentos obtenidos mediante restricción se

separaron en un gel de agarosa al 2%, separados por electroforesis con un voltaje

de 70 V durante 1 hr. El gel de agarosa fue teñido con una solución de bromuro de

etidio, los fragmentos de DNA se visualizaron con luz UV en un transluminador

digitalizado (Chemidoc, Biorad Cat. 170-8070 USA).

10. Secuenciación, análisis y comparación de secuencias.

La secuenciación de clonas y productos directos de PCR se realizó en el

laboratorio de Química de DNA del CINVESTAV-IPN Unidad Irapuato. Se utilizó el

kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction empleando un secuenciador

ABI PRISM 377 PERKIN-ELMER (CETUR, Norwalk, CT).

Las secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias reportadas

en el banco de genes (Gen Bank) del centro Nacional para la Información de

Biotecnología (NCBI- Nacional Center for Biotechnology Information

htt://www.ncbi.nibh.gov/), empleó el programa BLAST-N de dicho sitio para

conocer el nivel de identidad genética existente con secuencias ya reportadas y

depositadas en el banco.

La comparación de las secuencias del gen hrp y el árbol filogenético fueron

realizados con el programa MegAling y los mapas de restricción se realizaron con

el programa MapDraw mediante el software DNASTAR (versión 2.0 Madison,

Wisconsin, USA). Los mapas fueron comparados con los perfiles de referencia de

Serbia: 93-1 (raza de chile grupo A), 75-3 (raza de tomate 1 grupo A), XV56

(tomate raza 2, grupo B), 91118 (tomate raza 3, grupo C) y (X. gardneri, grupo D)

(Jones et al., 2000) (Figura 8).

38


Figura 8. Restricción de fragmentos de 420 pb del gen hrp de Xanthomonas spp.

con la enzima HaeIII con los primers RST65/69. Carriles: A) 93-1 (raza de chile

grupo A); A1) 75-3 (raza de tomate 1 grupo A); B) XV56 (tomate raza 2, grupo B);

C) 91118 (tomate raza 3, grupo C); D) X. gardneri, grupo D.

C. Caracterización fisiológica. Para determinar las características morfológicas de la bacteria asociada a

la mancha bacteriana del tomate se realizaron aislamientos en placas con AN; en

este caso se registraron la forma, color, elevación y superficie de las colonias. A

los diferentes aislamientos se le realizaron pruebas fisiológicas y bioquímicas para

su identificación. Durante esta investigación sólo se realizaron algunas de las

pruebas más comunes para la caracterización Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria.

1. Caracterización fisiológica del genero Xanthomonas.

1.1. Catalasa. La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peroxido de

hidrógeno y se determina mediante la producción de oxígeno al mezclar la

bacteria con peróxido de hidrógeno. Para realizar esta prueba, se tomó un poco

de colonia bacteriana, el cual se colocó en un portaobjetos; posteriormente se

39


añadió a la muestra una gota de peróxido de hidrógeno. La reacción se consideró

positiva a catalaza cuando se desprendieron burbujas de oxígeno.

1.2. Oxidasa. Con una asa de platino se tomó un poco de colonia bacteriana y se colocó

sobre una tira de papel filtro impregnado con la amina (dihidrocloride

phenylenediamine). Cuando el papel viraba del color blanco a purpura en

aproximádamente 10-60 seg, se consideró a la bacteria en estudio oxidasa

positiva.

1.3. Crecimiento en YDC (Extracto de levadura dextrosa). En un matraz se agregaron 500 ml de agua destilada y se añadieron en

orden de aparición 5 gr de extracto de levadura, 10 gr de dextrosa, 10 gr de

carbonato de calcio y 7.5 gr de agar. Se agitó el matraz vigorosamente.

Posteriormente se sometió a esterilización en autoclave durante 15 min a 120°C y

15 Lb de presión. El medio de cultivo una vez estéril y a temperatura de 50° C se

dispensó en cajas petri para esperar su solidificación a temperatura ambiente.

A partir de colonias bacterianas de 24-48 horas desarrolladas AN (agar

nutritivo), se tomaron bacteria con una asa y se colocaron en 5 puntos

equidistantes sobre el medio. Después de la siembra cajas se incubaron a 27° C

de 24 a 48 hr. Colonias amarillas o naranjas y mucoides en este medio de cultivo

son características de Xanthomonas.

2. Caracterización a nivel especie. Las cajas bacterianas que fueron identificadas como Xanthomonas, se

caracterizaron para diferenciar su especie. Se realizaron las siguientes pruebas:

2.1. Crecimiento en YS (Caldo de levadura). Esta prueba se realiza para determinar el crecimiento de la bacteria a 35

°C. Para ello se utilizó el medio líquido YS (Caldo de levadura), Se agregaron, en

1000 ml de agua destilada, 0.5 gr de NH4H2PO4, 0.5 gr de K2HPO4, 0.2 gr de

40


MgSO4.7H2O, 5.0 gr de NaCl y 0.5 gr de extracto de levadura. Posteriormente se

agitó vigorosamente y se vaciaron 9 ml en tubos de ensayo los cuales se taparon

perfectamente con un tapón de algodón y se esterilizaron por 15 min a 120 ° C y

a 15 Lb de presión. La inoculación del medio de cultivos se realizó cuando este se

igualó a la temperatura ambiente.

Las cepas en estudio se cultivaron previamente, en medio AN durante 24-

48 horas. A partir de estas colonias jovenes, se tomó una porción de bacterias

mediante el asa y se transfirieron en los tubos con medio líquido estéril. Por último

se colocaron en la incubadora a 35°C por 10-12 días.

2.2. Hidrólisis de almidón. En un matraz Erlenmeyer, se colocaron 500 ml de agua destilada

posteriormente se le adicionaron 10 gr de agar y 5 gr de almidón, se agitaron

vigorosamente asegurándose de que estuvieran disueltos. Posteriormente el

medio de cultivo se esterilizó y se dispensó en cajas de Petri.

Después se procedió a sembrar la bacteria colocando crecimiento

bacteriano en cinco puntos equidistantes equidistantes en cajas de petri

conteniendo el medio de cultivo. Después de la siembre los cultivos se incubaron

por cinco días a 27° C.

Finalmente, las cajas de Petri con la siembre se inundaron con lugol (yodo

1 gr; yoduro de potasio 2 gr; agua destilada 100 ml). La aparición de zonas claras

en los márgenes o debajo de las colonias indicó que el almidón fue hidrolizado

indirectamente por las enzimas alfa y β amilasas.

2.3. Licuefacción de gelatina. En un matraz que contenía 1000 ml de agua destilada se disolvieron 3 gr

de extracto de carne, 5 gr de peptona y 120 gr de gelatina; se agitaron hasta que

todos los componentes se mezclaran; enseguida se colocaron 10 ml de este

medio en tubos de cultivo y se esterilizaron, (como se describe en el apartado

2.1.). El medio de cultivo se conservó a 4°C y se inoculó por punción con colonias

jovenes (24-48 hr). Por ultimo, los tubos inoculados se incubaron a 28°C y se

41


determinó la licuefacción del medio por cambio del color a los 5 días.

2.4. Dihidrolasa de arginina. Se prepara el medio Thornley´2A (1000 ml de agua destilada, 1.0 gr de

peptona, 5.0 gr de NaCl, 3.0 gr de K2HPO4, 3.0 gr de agar; 0.01 gr de rojo fenol y

10.0 gr de monoclorhidrato de arginina y el pH se ajustó a 7.2), posteriormente se

vaciaron 9 ml de medio de cultivo a tubos de ensayo y se esterilizaron (como se

describe en el apartado 2.1.).

Una vez que la temperatura del medio de cultivo se igualó a la del

laboratorio la bacteria se inoculó. Para cada aislamiento bacteriano se utilizaron

tres tubos del medio antes señalado. La inoculación del medio se realizó mediante

punción y se utilizó un tubo con el mismo medio como testigo. Una vez inoculada

la bacteria, se adicionó a cada tubo una capa de 1 cm de aceite mineral y se

incubaron durante 72 hr a 28°C.

2.5. Fuentes de carbono (Fructuosa, glucosa y celobiosa). En esta prueba se utilizó medio C de Dye. En un matraz de 1000 ml, se

agregaron 500 ml de agua estéril se agregaron 0.5 gr de NH4H2PO4, 0.5 gr de

K2HPO4, 0.2 gr de MgSO4.7H2O, 5.0 gr de NaCl, 1.0 gr de extracto de levadura,

12.0 gr de agar y 0.7 ml de lila bromocrisol (1.5% en solución de alcohol),

después se agitó vigorosamente, se ajustó el pH a 6.8 por ultimo se esterilizó

(como se describió en el apartado 2.1.). Una vez que el medio se enfrió seagregó

la fuente de carbono filtrada y estéril al 0.5% v/v, se agitó y se vació en cajas

Petri. Cabe mencionar que se preparó un matraz con medio C de Dye para cada

fuente de carbono realizadas (celobiosa, glucosa y fructuosa), los cuales se

dispensaron en cajas de Petri y se inocularon en un periodo no mayor de 48 hr

después de su preparación. La bacteria fue inoculada por estria a partir de

colonias jovenes (24-48 hr) cultivadas en AN (agar nutritivo) y enseguida fueron

incubadas a 28 °C por 48 hr. La fuente de carbono es positiva si existe un cambio

de color en el medio que fue inoculado.

42


3. Caracterización a nivel patovar. 3.1. Crecimiento en medio Tween.

El medio Tween es un medio selectivo para X. campestris pv. vesicatoria.

Para esta prueba, en un matraz que contenía 1000 ml de agua destilada se

agregaron 10.0 gr de peptona, 10.0 gr de bromuro de potasio, 0.25 gr de CaCl2 y

15.0 gr de agar. Se agitó vigorosamente hasta que se homogenizó perfectamente,

posteriormente se esterilizó. A una temperatura de aproximadamente de 45°C,

cuidando de que no solidificara, se agregaron los siguientes reactivos: 10.0 ml de

tween, 75.0 mg de cyclohexamida, 25.0 mg de cephalexina, 6.0 mg de 5-

fluorouracil y 0.4 mg de tobramicina. Se agitó suavemente y se vació en cajas petri

(como se mencionó en el apartado 2.1.4.).

La inoclulación se llevó a cabo sembrando la bacteria por estría, partiendo

de colonias de las cepas crecidas en AN por 24-48 horas. Después de la siembra

las cajas se incubaron a 27° C de 24 a 48 hr.

3.2. Crecimiento en medio SX. Este es medio sólido selectivo para X. campestris pv. vesicatoria. Para esta

prueba en un matraz que contenía 500 ml de agua destilada estéril se agregaron

5.0 gr de almidón, 0.5 gr de extracto de carne, 2.5 gr de cloruro de amonio, 1.0 gr

de fosfato de potasio, 0.5 ml de violeta metil 2B (solución al 1% en etanol al 20%),

1.0 ml de verde metil (solución acuosa al 1%) y 6.0 gr de agar, el medio se

esterilizó como se mencionó anteriormente. Una vez que el medio se enfrío se

adicionaron 2.5 ml de una suspensión de cycloexamida. (se adicionaron 5.0 gr a

5.0 de metanol y se aforó con agua estéril), se homogenizó vigorosamente.

Después se vació en cajas petri.

4. Pruebas de patogenicidad. Para las pruebas de patogencidad se usaron tres plantas por aislamiento,

este se llevó a cabo en plantas de tomate con 2 meses de edad. Las plantas se

desarrollaron en vasos de poliestireno de 1.0 L conteniendo una mezcla de muzgo

y vermiculita (1:1) y se fertilizaron con triple 17 cada 10 días. La inculación con el

43


aislamiento de Xanthomonas, obtenidas de tomate, se efectuó en plantas en la

etapa de seis hojas verdaderas. El inóculo consistió en una suspensión bacteriana

(1 x 108 células/ml) de 48 hr, la cual se obtuvo a partir de crecimiento bacteriano

en AN. Previo a la inoculación, las plantas se frotaron con un agitador de vidrio

para provocar el rompimiento de tricomas y facilitar la penetración de la bacteria,

la cual se frotó en hojas, peciolos y tallos con algodón impregnado con la misma;

como testigo se utilizó algodón impregnado con agua destilada estéril. Después de

la inoculación, las plantas se colocaron en el invernadero y se cubrieron con una

bolsa de polietileno para mantener la humedad. Las plantas estuvieron en

observación diaria para mantener las condiciones de humedad y temperatura

óptimas para Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES.

44


A. Sintomatología. La bacteria Xanthomonas campestris. pv. vesicatoria se presenta en toda la

etapa de crecimiento del cultivo de tomate, afectando hojas, tallos y frutos. Se

pueden presentar síntomas más severos cuando el clima es cálido y con alta

humedad; sí este es el caso las lesiones pueden unirse y formar manchas grandes

necróticas irregulares en follaje, causando defoliacion. En algunos casos puede

afectar la floración y causar el aborto de flores. Durante este estudio las muestras

colectadas en las diferentes regiones del estado de Sinaloa (Ahome, Guasave,

Mocorito, Sinaloa de Leyva, Culiacán, Elota, El Fuerte y Salvador Alvarado)

presentaron sintomatología típica de la bacteria. Se observó únicamente manchas

necróticas en tejido foliar, también en las partes apicales de la planta, en la

mayoría de las plantas se observó la necrósis en el envés y por los bordes de las

hojas. También se encontraron síntomas más severos como manchas necróticas

extensivas e irregulares causando defoliación. Cabe mencionar que únicamente

se colectaron plantas sintomáticas (Figuras 9-10).

B

FS

A

igura 9. Síntomas de mancha bacteriana observados en cultivos de tomate en

inaloa. A) Manchas necróticas en toda el área foliar B) y bordes de un foliolo.

A B

45


Figura 10. Síntomas observados en cultivo de tomate. A) Defoliación. B) Manchas

necróticas severas e irregulares.

B. Pruebas simples de identificación de Xanthomonas.

Para efectuar la caracterización molecular se realizaron aislamientos de

bacterias asociados a 174 muestras sintomáticas del tomate, colectadas en los

diferentes municipios del estado de Sinaloa. Pruebas fisiologicas sensillas se

llevaron a cabo para determinar las características más importantes de la bacteria

de interes en el presente estudio. Se ignoraron 127 aislados que no presentaron

caracteristicas importantes para este proyecto quedando un total de 47

aislamientos correspondieron al genero de Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria, pues presentaron caracteristicas importantes (Figura 11) para estudio.

Una de las pruebas sencillas para la selección de aislados que posteriormente

serian analizados por técnicas moleculares fue la observación de la morfología

colonial en AN (agar nutritivo) y tinción Gram y la prueba de fluorescencia.

46


Figura 11. Aislados bacteriológicos obtenidos de tejido foliar sintomático de plantas de

tomate, con mancha bacteriana.

1. Tinción Gram. Anteriormente hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando

aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan

de color rojo-rosado. En este estudio los 15 aislados bacteriológicos fueron Gram

negativo y de forma bacilar, lo cual es característico del género Xanthomonas (Figura 12).

Figura 12. Fotografía con microscopio de la bacteria Gram negativa y forma bacilar de

aislados bacteriológicos de plantas de tomate.

De acuerdo a la bibliografía, las células Gram positivas retienen el cristal

violeta cuando se tratan con etanol mientras que las Gram negativas no lo tiñen y

se tiñen entonces del color rojo de la safranina

esto se debe a que las células Gram negativas tienen un contenido graso muy

47

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/tincion_grampos.html

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/tincion_gramneg.html


elevado en su pared celular y al ser decoloradas pierden el complejo formado por

cristal violeta y el iodo tornándose incoloras y posteriormente al ser tratadas con

safranina se tornan rojas y las Gram positivas de lo contrario retienen el complejo

debido a la poca cantidad de lípidos en su pared.

2. Fluorescencia. De los 47 aislados en estudio, sólo en dos se observó pigmento

fluorescente. Lo cual sugirió que estas cepas pertenecen al género Pseudomonas,

que son comúnmente confundidas con Xanthomonas spp. ya que presentan la

misma morfología colonial en AN, pero Pseudomonas spp. es fluorescente en

medio B de King (Figura 13). Se obtuvieron un total de 15 aislados con

características amarillas mucoides no fluorescentes sobre el medio B de King,

para seguir con la caracterización molecular y posteriormente correr la

caracterización fisiológica.

A B

Figura 13. Prueba de fluorescencia en medio B de King, con exposición a luz ultravioleta

(260 nm): A) aislado de tomate, B) Testigo positivo (Pseudomona syringae pv. tomato)

proporcionada por el Dr. Rubén Félix Gastelum.

C. Caracterización molecular 1. Extracción de DNA.

Se estandarizó una técnica de extracción de DNA de cepas bacterianas

(Figura 14) ya que es de gran importancia la obtención de DNA de buena calidad

para la detección de fitopatógenos (Chavez-Medina, 2006).

48


1 2 3 4 5 6 7

Figura 14. DNA de aislados bacteriológicos de tejido de tomate (carriles 1 – 7).

2. Detección de bacterias por PCR. A todas las extracciones de DNA de colonias amarillas mucoides, se les

realizó la detección por PCR. Se amplificaron fragmentos de 420 pb de la

secuencia hrp de Xanthomona campestris pv. vesicatoria con los primers

RST65/RST69 (Figura 15). El primer fragmento amplificado por PCR fue clonado

y secuenciado para ser usado como control positivo para todas las detecciones

posteriores.

Se detectó la presencia de Xanthomonas en 15 muestras de las 47

analizadas. La distribución de las muestras positivas fue la siguiente: se

detectaron 2 de 3 en Sinaloa de Leyva, 4 de 25 en Ahome, 2 de 91 en Guasave,

3 de 30 en Culiacán, 1 de 10 en Mocorito, 1 de 3 en salvador alvarado, 1 en El

Fuerte y 1 de 11 en Elota.

Se ha demostrado la presencia de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

en cultivos de tomate en el estado de Sinaloa (Carrillo-Fasio et al., 2001). Se han

hecho investigaciones en otras partes del mundo como El Caribe, América Central

(Bouzar et al., 1999), Norte América, Sur América, Europa, Australia, África y

Estados Unidos (Bouzar et al., 1994).

49


1 2 3 4 5 M (-) (+)

1 2 3 4 5 M (-) (+)

uliacan, (M) marcador de peso

olecular 1 kb, (-) control negativo, (+) control positivo.

A

420 pb

B

420 pb

Figura 15. Productos amplificados por PCR del gen hrp de Xanthomonas spp. con el par

de primers RST65/RST69. A) Carriles 1-5 tejido foliar de tomate del municipio de Ahome,

(M) marcador de peso molecular 1 Kb, (-) control negativo, y (+) control positivo. Panel B) carril 1-5 tejido foliar de tomate del municipio de C

m

50


3. Identificación de Xanthomonas spp. mediante el análisis por RFLP-PCR. El análisis de restricción de fragmentos amplificados es una herramienta

muy importante para la identificación de grupos de cepas fitopatógenas y

patovares de X. campestris (Leite et al., 1994). Se utilizó la enzima HaeIII para

digerir los fragmentos correspondientes al gen hrp de Xanthomonas spp.

amplificados a partir de muestras de tomate. El análisis de los patrones de

restricción muestra que las Xanthomonas spp. detectadas en esta investigación

pertenecen al grupo A (X. euvesicatoria) y C (X. perforans) ambas nombradas

de bandas,

aso que no sucede con los patrones de bandas de los grupos B y D.

iones de Sinaloa digeridos con la enzima HaeIII. M. Marcador de peso

anteriormente Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Jones et al., 2004). Los perfiles de restricción obtenidos con la enzima HaeIII de las 15

muestras de tomate de Sinaloa fueron idénticos a los patrones de bandas del

grupo A y C obtenidos por Obradovic et al (2003) (Figura 16). Con esta enzima es

difícil diferenciar los grupos A y C, ya que presentan el mismo patrón

c

M

123pb

51 pb

135pb

69 pb

1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12

Figura 16. RFLP-PCR. Análisis de restricción de los fragmentos amplificados por PCR

con los primers RST65/RST69 (420 pb). Carriles 1-12 Xanthomonas spp. de tomate de

los diferentes reg

molecular 50 pb.

51


4. Análisis de secuencias. Los productos amplificado por PCR de la región hrp de 420 pb con los

primers RST65/RST69 fueron clonados y secuenciados. Cabe señalar que se

clonaron todos los fragmentos amplificados por PCR para comparar las

secuencias en el programa Map Draw y observar diferencias en base a lo

publicado por Obradovic y colaboradores (2003). Durante este trabajo se lograron

encias 147-3 Ahome y 166-4

detectar, clonar y secuenciar 15 fragmentos de Xanthomonas spp (Cuadro 7-8)

El grupo de secuencias de las cepas 161-3 de Culiacán, 154-4 de Ahome,

125-5 Mocorito, 167-4 Ahome, 162-1 Culiacán, G5 Salvador Alvarado, 159-1

Guasave, SE59 Sinaloa de Leyva, 145-1 Elota y 143-C, presentaron una

homología del 100 % entre ellas. El grupo de secu

Ahome tienen una homología del 100 % entre ellas.

Las secuencias de las Xanthomonas spp. en estudio se compararon con

otras secuencias reportadas en el banco de datos (mediante el programa Blast

Search del Nacional Center for Biotechology Information (NCBI), http:// www.

ncbi.nlm.nij.gov/blast), obteniéndose los siguientes resultados: las 15 secuencias

de los diferentes aislados de los municipios de Sinaloa presentan una alta

homología con la secuencia del grupo A (AMO39952) de tomate reportada en el

banco de genes. Las secuencias de Xanthomonas campestrsi pv. vesicatoria de

tomate A154-4, A 167-4, A 147-3 y A166 del municipio de Ahome tienen una

homología del 99.5 al 100 % con la cepa 75-3 (Grupo A), siendo la cepa A166 y la

147-3 las únicas de todas las secuencias obtenidas que presentan una homología

del 100% con la reportada en el banco de genes, las secuencias 161-3, C162-1 y

163-3 del municipio de Culiacán, tienen una homología del 99.3 al 99.5 % con la

cepa 75-3 (Grupo A), del municipio de Mocorito sólo se obtúvo la secuencia M125-

5, la cual presenta una homología del 99.5 % con la secuencia de la cepa 75-3

(Grupo A), las dos secuencias obtenidas del municipio de Sinaloa de Leyva, SE59

y 143-C, ambas presentan una homología del 99.5 % con respecto a la secuencia

de la cepa 75-3 (Grupo A), las secuencias de las cepas del municipio de Guasave,

G158-3 y G159-1, ambas presentan una homología del 99.3 al 99.5% con

respecto a la cepa 75-3 (Grupo A), del municipio de Salvador Alvarado se obtuvo

52


53

cepa 75-3 (Grupo A).

una secuencia, G5, con una homología del 99.5 % con respecto a la cepa 75-3

(Grupo A) y por último la secuencia del municipio de Elota, E145-1 presenta una

homología del 99.5 % con la


Cuadro 7. Secuencias del gen hrp de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria obtenidas de los cultivos de tomate de

diferentes cultivos de Sinaloa.

Número Clona de Xanthomonas spp.

Origen Similitud con otras secuencias

1 A154 AhomeXanthomonas campestris pv. vesicatoria complete genome AMO39952 99%

2 167-4 AhomeXanthomonas campestris pv. vesicatoria complete genome AMO39952 99%

3 147-3 AhomeXanthomonas campestris pv. vesicatoria complete genome AMO39952 99%

4 166-4 Ahome

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria complete genome AMO39952 100% 5 G5 Guamúchil

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 6 C161-3 Culiacán

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 7 C162 Culiacán

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 8 C163 Culiacán

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 9 E145-1 Elota

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 10 SL143C Sinaloa de Leyva

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 11 SLSE59-2 Sinaloa de Leyva

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 12 G158-3 Guasave

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 13 G159-1 Guasave

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 14 F169 El Fuerte

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99% 15 M125 Mocorito

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria complete genome AMO39952 99%

54


55

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Secuencias del gen hrp de X.c.pv.v.

100 99.8 100 99.5 99.5 100 100 99.5 99.5 100 99.8 100 100 100 100 1 x.c.pv.v. Culiacan 161-3

99.8 100 99.5 99.5 100 100 99.5 99.5 100 99.8 100 100 100 100 2 x.c.pv.v. Ahome 154-4 99.8 99.3 99.3 99.8 99.8 99.3 99.3 99.8 99.5 99.8 99.8 99.8 99.8 3 x.c.pv.v. Culiacan 163-3 99.5 99.5 100 100 99.5 99.5 100 99.8 100 100 100 100 4 x.c.pv.v. Mocorito 125-5

100 99.5 99.5 99.9 100 99.5 99.3 99.5 99.5 99.5 99.5 5 x.c.pv.v. Ahome 147-3

99.5 99.5 99.1 100 99.5 99.3 99.5 99.5 99.5 99.5 6 x.c.pv.v. Ahome 166-4

100 99.5 99.5 100 99.8 100 100 100 100 7 x.c.pv.v. Ahome 167-4

99.5 99.5 100 99.8 100 100 100 100 8 x.c.pv.v. Culiacan 162-1

99.1 99.5 99.3 99.5 99.5 99.5 99.5 9 x.c.pv.v. El Fuerte 169-3

99.5 99.3 99.5 99.5 99.5 99.5 10 x.c.pv.v. Grupo A cepa 75-3

99.8 100 100 100 100 11 x.c.pv.v. Salvador AlvaradoG5

99.8 99.8 99.8 99.8 12 x.c.pv.v. Guasave 158-3

100 100 100 13 x.c.pv.v. Guasave 159-1

100 100 14 x.c.pv.v. Sin aloa de Leyva SE59

100 15 x.c.pv.v. Sinaloa de Leyva 143-C

16 x.c.pv.v. Elota 145-1

Cuadro 8. Porcentaje de similitud entre secuencias del gen hrp de Xanthomonas campestrsi pv. vesicatoria clasificadas

en el Grupo A (Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria.)


5. Análisis de Restricción. Las 15 secuencias obtenidas del gen hrp de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria de tomate fueron analizadas con el programa Map

Draw del programa DNASTAR. Para la obtención de los mapas de restricción

de las secuencias, se utilizaron las enzimas HaeIII y CfoI. Ambas enzimas

fueron estudiadas por Obradovic et al (2003) además de la enzimas TaqI pero él

solo propone la enzima HaeIII para diferenciar entre los cuatro grupos de

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (A, B, C y D). En este estudio se

analizaron las secuencias en el programa MapDraw usando las enzimas HaeIII y

CfoI. Se tiene secuenciado el genoma completo de la cepa 75-3 de tomate que

corresponde al grupo A (X. euvesicatoria), pero no están aún reportadas las

secuencias del gen hrp de los grupos B (X. vesicatoria), grupo C (X. perforans) y

grupo D (X. gardneri), de acuerdo a su actual reclasificación (Jones et al., 2004). Las secuencias de Xantomonas campestris pv. vesicatoria de tomate del

municipio de Ahome (A 167-4, A 154-4 y A 166-4) presentaron el mismo patron de

restricción con el analisis RFLP-PCR con la enzima HaeIII. Las cepas de tomate

de C163-3, C161-1 (Culiacán ), A154-4, A167-4 (Ahome), M125-5 (Mocorito), G5

(Salvador Alvarado), SLSE59, SL143C (Sinaloa de Leyva) y E145-1 (Elota) tiene

una mismo patron de restricción con la enzima HaeIII y Cfol, pues presentaron

una homología del 100% entre ellas y del 99.5 % con el grupo A de

Xanthomonas campestris pv vesicatoria. Las secuencias C163-3 (Culiacan),

F169-3 (El Fuerte) y G158-3 (Guasave) tienen un mismo patron de restricción

que las secuencias mencionadas con las enzimas HaeIII y Cfol a pesar de las

diferencias en sus secuencias ya que tienen una homología del 99.3 al 99.5%

entre ellas y del 99.1 al 99.3% con el grupo A de Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria. El analisis de los sitios de restricción con enzima HaeIII para las

secuencias A 147-3 y A-166-4 (Ahome) presentan un patron de restricción

idéntico al patron del la cepa 75-3 perteneciente al grupo A de Xanthomonas ya

que tienen una homología del 100 % entre ellas y con la cepa del Grupo A. Las

secuencias A 147-3 y A-166-4 (Ahome), tienen un sitio de corte con la enzima

56


CfoI en la posición 279 que no presentan el resto de las secuencias, este sitio de

corte tambien lo presenta la secuencia de la cepa del Grupo A reportada en el

“GenBank”. Se puede observar que todas las secuencias presentan los mismos

sitios de corte con la enzima HaeIII estudiada por Obradovic et al (2003) para la

diferenciación entre grupos y comparada con la secuencia del grupo A, las

Xanthomonas spp. aisladas en el estado de Sinaloa pueden pertenecer a este

grupo (Figura 17).

Las diferencias entre secuencias puede ser por reconocimientos de las

enzimas de restricción por diferencias en la secuencia de nucleótidos; aunque la

clasificación de Xanthomonas spp. se puede realizar mediante enzimas de

restricción es importante conocer las secuencias de grupos de Xanthomonas

spp. para realizar una comparación completa.

Se tiene secuenciado el genoma completo de la cepa 75-3 de tomate que

corresponde al grupo A (X. euvesicatoria), pero no se conocen aún las

secuencias del gen hrp de los grupos B (X. vesicatoria), grupo C (X. perforans) y

grupo D (X. gardneri), de acuerdo a su actual reclasificación (Jones et al., 2004).

57


Grupo A de Xcv (cepa 75-3)

Xcv C162-1 Xcv C161-3 Xcv C163-3 Xcv A167-4 Xcv A154-4 Xcv G5 Xcv G158-3 Xcv G159-1 Xcv SLSE59 Xcv SL143-C Xcv E145-1 Xcv M125-5 Xcv F169-3

Xcv A147-3 Xcv A166-4

Figura 17. Análisis de sitios de restricción de las secuencias del gen hrp de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Los mapas fueron realizados utilizando la opción de MapDraw del programa DNASTAR. Grupo A de X.c. pv. v. (cepa 75-3 AMO39952 ), C 162-1, C 161-3 y C163-3 (tomate de Culiacán), A 167-4, y A 154-4 (tomate de Ahome), G5 (tomate de Salvador Alvarado), G 158-3 y G 159-1 (tomate de Guasave), SL SE59, SL 143-C (tomate de Sinaloa de Leyva), E145-1 (tomate de Elota), M 125-5 (tomate de Mocorito), F 169-3 (tomate de El Fuerte). La flecha indica la ausencia y los rectangulos la presencia de un sitio de restricción distinto.

100 bp 200 bp 300 bp 400 bp

100 bp 200 bp 300 bp 400 bp

Cfo

I H

ae II

I C

fo I

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Cfo

I

Hae

III

Cfo

I

Hae

III

Hae

III

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Hae

III

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

Cfo

I

58


6. Análisis Filogenético.

Con base en el análisis de la secuencia del gen hrp, se construyó un árbol

filogen

os aislamientos de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de tomate

C162-1

ético de las 15 secuencias de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

caracterizadas en este estudio. (Figura 18). En este proceso se consideró la

secuencia del Grupo A de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria del banco de

genes.

L

, C 161-3, C163-3, A 154-4, A 167-4, M 125-5, G5, G 159-1, G 158-3, F

169-3, SLSE59, SL 143C y E 145-1 se agrupan en una misma rama confirmando

su alta homología tal como se demostró en el análisis de restricción con las

enzimas HaeIII y CfoI donde presentaron patrones de restricción idénticos;

mientras que las secuencias de los aislamientos de las cepas A147-3, A 166-4

se agrupan en una misma rama confirmando su alta homología como se observa

en el analisis de restricción con las enzimas HaeIII y Cfol donde presentan

patrones de restricción idénticos al Grupo A (X. aeuvesicatoria). En base a lo

anterior podemos decir que las cepas aisladas de los municipios de Ahome,

Guasave, El Fuerte, Mocorito, Salvador Alvarado, Sinaloa de Leyva, Culiacán y

Elota estan dentro del grupo A (Xanthomonas euvesicatotia) (a pesar de que

existen pequeñas diferencias entre ellas).

59


Xcv Salvador AlvaradoG5

Xcv Guasave158 Xcv Mocorito125.5 Xcv Sinaloa de LeyvaSE592 Xcv Ahome 154-4

Xcv El Fuerte169-3 Xcv Guasave 159-1 Xcv Culiacán161-3 Xcv Culiacán163-3 Xcv Culiacán162-1 Xcv Elota145-1 Xcv Sinlaoa de Leyva143C

Xcv Ahome167-4 Xcv Ahome147-3 Xcv Grupo A cepa 75-3 Xcv Ahome166-4

11.

10 8 6 4 2 0 Figura 18. Árbol filogenético construido mediante el método de alineamiento

(CLUSTAR method) de secuencias del gen hrp amplificado con el par de primers

RST65/RST69 de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria obtenidos en este estudio y

de la secuencia del genoma completo de Xcv de la cepa 75-3 reportada en el banco de

genes(NCBI).

60


D.Caracterización fisiológica. Sin duda es importante el poder reafirmar este estudio mediante

metodos convencionales como lo son las pruebas bioquímicas, las cuales fueron

realizadas a los 15 aislados caracterizados molecularmente. Este estudio

tambien se realizó con el fin de conocer y observar el comportamiento del

patogeno, partiendo con su caracterización a nivel género, seguido por especie

y culminando con patovar.

1. Caracterización a nivel genero. 1.1. Catalasa. Esta reacción fue catalasa postivos para los 15 aislados. Por otra parte

la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que esta

degrada el peróxido de hidrógeno al presentar una formación de burbujas al

adicionarlo a la bacteria.

1.2. Oxidasa. Los 15 aislados fueron oxidasa negativos por no presentar coloración

azul al adicionar tetrametil. Según la literatura estos resultados se deben a que

en las células aeróbicas de la bacteria se encuentran los citocromos los cuales

son proteínas transferidoras de electrones, los citocromos oxidasa tienen una

gran afinidad por el oxígeno, mientras que las oxidasas negativas no, es por ello

que al combinarse la proteína (citocromo) con el tetrametil y el naftol se produce

un color azúl, lo cual no sucedió en este caso. Estos resultados demuestran que

la bacteria puede pertenecer al genero Xanthomonas que es una bacteria

aerobia y que no contiene citocromos en su celulas, pues no se presento una

reacción de color azul.

1.3. Crecimiento en YDC (Extracto de levadura dextrosa). A las 48 hrs de incubación en YDC, los 15 aislados presentaron una

coloración mucoide, en cinco una coloración naranja y en 10 una coloración

61


amarilla. De acuerdo al manual de Schaad de 2001, la reacción fue positiva

para todas las cepas analizadas en este trabajo (Figura 19).

Figura 19. Colonia de consistencia mucoide, de color amarillo, desarrollado en YDC,

correspondiente a la cepa del Estado de Sinaloa a las 48 horas de incubación.

Los resultados obtenidos de las cinco pruebas fisiológicas realizadas,

coinciden en que las cepas en estudio pertenecen al genero Xanthomonas.

Posteriormente se corrieron pruebas más específicas, para determinación

especies y patovar. 2. Caracterización a nivel especie. 2.1. Crecimiento en YS (Caldo de levadura). Después de 48 hrs de incubación de los aislamientos a 35°C en caldo

YDC se observó crecimiento bacteriano, al ser comparado con el control

negativo se corrobora turbidéz en los 15 aislados. Siendo este el resultado

esperado para especies de Xanthomonas campestris (Figura 20).

62


B A

Figura 20. A) Crecimiento de un aislado del Estado de Sinaloa de Xanthomonas

campestris pv. vesicatoria, después de 48 horas de incubación en YS a 35 °C. B) Testigo sin inocular.

2.2. Hidrólisis de almidón. Los 15 aislados de los diferentes municipios de Sinaloa fueron positivos

para la hidrólisis de almidón. Sin embargo, algunos aislados reaccionaron

débilmente por presentar halos poco definidos, sin embargo, se consideraron

positivos para dicha reacción (Figura 21). Esta reacción se debe a que ciertas

bacterias del genero Xanthomonas en su mayoría, son capaces de polimerizar el

almidón por medio de enzimas extracelulares, conocidas como amilasas

(Rodríguez, 2001). La capacidad de hidrolizar almidón (actividad amilolítica) fue

una de las primeras características fenotípicas que muestran diferencias entre

los aislados de la Xanthomonas spp. asociados con la mancha bacteriana en

tomate y chile (Jones et al., 1998). Los aislados asociados a la mancha

bacteriana en tomate son capaces de degradar almidón a diferencia de los

aislados de chile.

63


B A

Figura 21. Prueba de hidrólisis de almidón. A) Hidrólisis de almidón positiva el aislado

de Xanthomonas de tomate del municipio de Mocorito. B) Control negativo, aislado de

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de chile proporcionada por el Dr. Rubén Félix

Gastelum (Prof. Investigador de la Universidad de Occidente).

2.3. Licuefacción de gelatina. En esta prueba, ninguno de los 15 aislados en estudio causó

licuefacción de gelatina (Figura 22). La literatura reporta que las especies X.

campestris presenta resultados variables en cuanto a la producción de

gelatinasa. Esta reacción ayuda a la identificación de Serratia, Pseudomonas,

Flavobacterium y Clostridium, tambien ha sido usada por Obradovic et al, en el

2003 para la caracterización de Xanthomonas spp.

A B

Figura 22. Prueba de licuefacción de gelatina. A) Control negativo, sin inocular. B)

Reacción negativa para gelatinasa, de un aislado de Xanthomonas obtenido de tomate

del municipio de Mocorito.

64


2.4. Hidrolasa de arginina. En la prueba de dihidrolasa de arginina los 15 aislados dieron reacción

negativa, para la producción de esta enzima, ya que las bacterias no crecieron

bajo condiciones anaerobias, en ninguno de los tubos inoculados se presentó un

cambio de color del medio, lo que indica la carencia del sistema enzimático

dihidrolasa de arginina (Figura 23).

A B C

Figura 23. Prueba de arginina en medio de Thornley 2A. A) y B) Reacción negativa de

la hidrolasa de arginina del aisl do de la planta de tomate con mancha bacteriana

originada de Culiacán. C) Contro

2.5. Fuentes de carbono. En los 15 aislamientos

de incubar la bacteria sobre e

26). Estos resultados nos indic

ácido a partir de carbohidratos

establecido con especies de l

de Schaad 1988. Los 15 aisla

género, especie y se confi

resultados característicos de la

(Cuadro 9).

aA
l negativo, sin inocular.
se observó el cambio de color del medio después

l medio base Dye durante 48 hrs. (Figura 24, 25 y an que los 15 aislados fueron capaces de producir

. Los resultados obtenidos están de acuerdo a lo

a bacteria X. campestris establecido en el manual

dos bacteriológicos fueron caracterizados a nivel

rmó su patovar con medios selectivos dando

bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

65


Figura 24. Producción de ácido a partir fructuosa como fuente de carbono. A y B

Aislados del municipio de Sinaloa de Leyva mostraron cambios de color en el medio

Dye lo que indica que el azúcar fue utilizado.

B

A

A

B

FiguAisla

reac

A

ra 25. Producción de ácido a partir de la fuente de carbono Glucosa. A) y B).

dos del municipio de Sinaloa de Leyva cambiaron el color del medio lo que indica

ción positiva para la utilización de Glucosa.

66


B A

Figura 26. Producción de ácido a part de celobiosa como fuente de carbono. A) y B).

Aislados del municipio de Sinaloa de Leyva cambiaron el color del medio lo que indica la

utilización del azúcar.

3. Caracterización a nivel patovar. 3.1. Crecimiento en agar Tween y SX. Para determinar la identidad de los aislamientos a nivel patovar se

utilizaron los medios Tween y SX; en el primero crece Xanthomonas campestris

pv. vesicatoria pero en el medio SX no crece este patovar (Figura 27)

A

FAS

f

A
igura 27. Crecimiento en medios selectivos para patovares “vesicatoria” de tomate.
) Crecimiento positivo sobre medio Tween d

inaloa. B) Crecimiento negativo sobre medi

oliar de Sinaloa del municipio de Sinaloa de Le

B

B

irB

e un aislado de tomate de tejido foliar de

o SX de un aislado de tomate de tejido

yva.

67


Cuadro 9. Características culturales, morfológicas y fisiológicas de los

aislamientos de la bacteria en estudio (Schaad, 2001).

Características culturales: Características de Xanthomonas campetris

pv. vesicatoria

Borde

Entero

Elevación Convexa

Color Amarillo

Superficie Lisa

Características morfológicas:

Forma Bacilo

Tinción Gram -

Características fisiológicas:

Fluorescencia en medio B de King -

Catalasa +

Desarrollo de colonias amarillas en YDC +

Crecimiento a 35 ° C +

Hidrólisis de almidón +

Dihidrolasa de arginina -

Licuefacción de gelatina -

Oxidasa -

Crecimiento en medio Tween +

Crecimiento en medio SX -

Formación de ácidos a partir de:

Celobiosa +

Fructuosa +

Glucosa +

68


E. Pruebas de patogenicidad. Una vez que los 15 aislados fueron caracterizados molecularmente y

fisiológicamente, se les realizó la prueba de patogenicidad esto fue para

comprobar su relación patogénica con la mancha bacteriana del tomate en las

diferentes plantaciones en Sinaloa. En este estudio se demostró que los 15

aislados fueron patogénicos. Lo anterior pudo deberse a que todos los islados

en estudio se transfirieron constantemente, lo que pudo inducir a que se

debilitaran y que en consecuencia no ejercieran una fuerte actividad patogénica.

El método de inoculación fue el adecuado y las condiciones de incubación

fueron favorables al desarrollo de mancha bacteriana, lo cual se evidencio en

que las plantas (Figura 28) como controles positivos mostraron síntomas más

severos y característicos de la bacteria Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria. Esta cepa es un aislamiento reciente y poco manipulado de ahí que

afectó severamente al tomate. Para comprobar que los síntomas que en las

plantas de tomate eran ocasionados por la bacteria de interes, se pudo aislar el

patógeno y observar crecimiento de colonias amarillas mucoides; además dichas

colonias fueron bacilos Gram negativos. Con esto se cumplieron los postulados

de Koch.

A B

Figura 28. Pruebas de patogenicidad en cultivo de tomate. A) Planta de tomate

inoculada artifialmente con Xanthomonas campestris pv. vesicatoria aislada de

cultivo de tomate del municipio de Culiacán. B) Control positivo, planta inoculada

con un aislamiento de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria proporcionada por

el Dr, Rubén Félix.

69


CONCLUSIONES

♦ Las pruebas bioquímicas permitieron la caracterización a nivel genero, especie

y pathovar 15 aislados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de cultivos

de tomate de los municipios de Guasave, Ahome, Mocorito, Salvador Alvarado,

Elota, El Fuerte, Sinaloa de Leyva y Culiacán.

♦ Los aislamientos de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria obtenidas de las

15 muestras sintomáticas de tomate en Sinaloa correponden al grupo A

(Xanthomonas euvesicatoria).

♦ Los 15 aislamientos de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de tomate de

los municipios de Sinaloa de Leyva, Culiacán, Elota, Salvador Alvarado,

Guasave, Ahome, Mocorito y El Fuerte resultaron patogénicos en el mismo

cultivo, en condiciones de invernadero.

70


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