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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais
ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE IRAPUCA (Podocnemis
erythrocephala, PODOCNEMIDIDAE) DA AMAZÔNIA BRASILEIRA:
IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO
RAFAELA CARDOSO DOS SANTOS
Manaus, Amazonas
Maio, 2008
Livros Grátis
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II
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais
ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE IRAPUCA (Podocnemis
erythrocephala, PODOCNEMIDIDAE) DA AMAZÔNIA BRASILEIRA:
IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO
RAFAELA CARDOSO DOS SANTOS
ORIENTADORA: DRA. IZENI PIRES FARIAS
Co-orientadora: Dra. Maria das Neves Silva Viana
Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-
Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do
convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas,
área de concentração em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
Maio, 2008
III
FICHA CATALOGRÁFICA
Sinopse:
No intuito de determinar a diferenciação genética de Podocnemis
erythrocephala como um efeito da atuação de cachoeiras e/ou corredeiras e de
rios como barreiras geográficas, dez localidades distribuídas ao longo da
bacia Amazônica brasileira foram estudadas com o auxílio de um marcador de
linhagem materna. Duzentos e quarenta e seis espécimens foram seqüenciados
para a região controle mitocondrial e analisados quanto à diversidade gênica e
nucleotídica, análise de variância molecular, estimativas de diferenciação
genética e fluxo gênico, testes de neutralidade, teste de Mantel e análise do
agrupamento de clados. As análises indicaram que algumas localidades
mantêm elevado fluxo gênico e compõem uma grande população panmítica.
Contudo, foi detectada forte influência da estrutura da geomorfológica
(cachoeiras, corredeiras e rios como barreira ao fluxo gênico) da bacia do rio
Negro e do rio Amazonas sobre a diferenciação genética de três localidades
estudadas. Tais estruturas atuam como barreiras efetivas ao fluxo gênico e
corroboram a existência de estoques geneticamente distintos dentro da bacia
Amazônica. Estes resultados fornecem suporte para projetos que visem à
definição de planos de conservação e manejo para a espécie na Amazônia
brasileira.
Palavras-chave: Podocnemis erythrocephala, Genética de Populações, DNA
Mitocondrial, Região Controle, Amazônia brasileira.
S237 Santos, Rafaela Cardoso dos Estrutura genética das populações de irapuca (Podocnemis erythrocephala, Podocnemididae) da Amazônia brasileira: implicações para a conservação/ Rafaela Cardoso dos Santos.--- Manaus : [s.n.], 2008. xiv, 64f. : il. Dissertação (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador : Izeni Pires Farias Co-orientador : Maria das Neves Silva Viana Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Podocnemis erythrocephala. 2. Irapuca – Amazônia. 3. Genética de populações. 4. DNA mitocondrial. I. Título. CDD 19. ed. 597.920415
IV
Dedico este trabalho a minha família: minha
mãe Anabia, meu padrasto Ronaldo e minha
irmã Marla, pelo amor e incentivo.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me abençoado, amparado e sempre ter me mostrado a saída
nos momentos adversos.
À Dra. Izeni Pires Farias e à Dra. Maria das Neves Silva Viana, pela amizade,
orientação, incentivo e confiança.
Ao Curso de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia e à Universidade Federal do Amazonas, pelo
auxílio e infra-estrutura para a realização deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas, pela concessão da bolsa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo auxílio
financeiro para o projeto.
Ao Dr. Richard Carl Vogt, por sua contribuição literária e imensurável ajuda no
trabalho de campo. Soledad Novelle, Camila Ferrara, Rafael Bernhard, Ladislau Brito, Melina
Rizzato, Ellis Perrone, Virgínia, pela ajuda no trabalho de campo.
Ao Projeto Pé-de-Pincha (UFAM), pela coleta de material. Ao Paulo Andrade, Paulo
Henrique Guimarães, Pedro Macedo, Hugo, Hellen, Elma, Carlos, Andison, Thiago, Midiam
e todos que colaboraram para a obtenção das amostras.
Ao Juarez Pezzuti e Danielly Félix, pela colaboração na coleta das amostras referentes
ao Parque Nacional do Jaú.
Ao Dr. Tomas Hrbek, por disponibilizar um de seus primers ainda não publicados e
que foi utilizado no presente trabalho, pelo apoio e sugestões para as análises genéticas.
Ao Dr. Jack Sites, pelo auxílio financeiro para a realização da excursão para a coleta
de material em São Gabriel da Cachoeira, e ao Jackson Pantoja pela coleta do material nesta
localidade.
Aos colegas do Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL) e do
Laboratório de Bioquímica, pela ajuda durante as atividades laboratoriais e pela amizade,
Luciana Viana, Cleiton Fantin, Adam Leão, William Rangel, Andréa Cantanhede, Hellen
Medeiros, Mário Nunes, Edvaldo Pereira, Waleska Gravena, Eduardo Souza, Natasha
Verdasca, Daniel Toffoli, Conceição Freitas, Themis Silva.
Aos meus amigos Paula Sant’Anna, Liene Rocha, José Vital, Loretta Ennes, Quézia
Ribeiro, Michel Martins e Elma Chips, pelo apoio, amizade e momentos de descontração.
Agradeço de forma especial ao Fabrizio Fernandes Cardoso pelo amor, carinho,
VI
compreensão e por estar sempre me animando e apoiando nos momentos difíceis.
Aos meus pais, Anabia Cardoso e Afonso Sá, ao meu padrasto, Ronaldo Horta, a
minha irmã, Marla, e a toda a minha família paraense, pelo apoio, confiança, alegria e
maravilhosos momentos compartilhados.
A todas as pessoas e aos colegas, que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
VII
RESUMO
Os quelônios do gênero Podocnemis são endêmicos das bacias do Orinoco,
Amazônica e do Araguaia, e historicamente ligados aos hábitos culturais das populações
humanas locais, que utilizam a carne, a gordura e os ovos como fontes de alimento.
Podocnemis erythrocephala, também conhecida como irapuca, apresenta distribuição restrita,
vivendo apenas em água preta e água clara. Esta espécie é classificada pela IUCN (União
Internacional para Conservação da Natureza) dentro da categoria vulnerável. Isso ocorre
devido à pressão de coleta de ovos e caça dos indivíduos adultos pelos ribeirinhos, atividade
comum em praticamente toda a bacia do rio Negro. O objetivo deste trabalho foi determinar a
estrutura genética de P. erythrocephala a partir de um marcador de linhagem materna (região
controle mitocondrial) para que os resultados provenientes deste estudo possam dar suporte a
futuros programas de manejo e conservação da espécie. Amostras de sangue foram coletadas
de cada indivíduo através da punção da veia femoral, sem que houvesse a necessidade de
sacrificar os animais. Os locais de coleta compreenderam o Parque Nacional Viruá, no estado
de Roraima, São Gabriel da Cachoeira, Santa Isabel do Rio Negro, Barcelos, Parque Nacional
do Jaú, Barreirinha e Nhamundá, no estado do Amazonas, e Oriximiná e Terra Santa, no
estado do Pará. Foram analisados 550 pares de bases de 246 indivíduos, onde foi possível
encontrar 49 haplótipos, e destes, 36 foram únicos, e apenas um haplótipo estava presente em
todas as localidades. A diversidade gênica média (H) e a diversidade nucleotídica média ( )
apresentaram valores consideráveis, 0,608 e 0,0021, respectivamente. As análises de variância
molecular revelaram alto grau de subdivisão populacional ( ST = 0,27931, P < 0,001). Os
resultados mostraram que 27,93% da variância total ocorrem entre as populações, entretanto a
maior variação genética foi atribuída à variância dentro das amostras populacionais (72,07%).
Os valores do índice de fixação ST foram significativos para as localidades do Parque
Nacional do Jaú, São Gabriel da Cachoeira e Barreirinha, que evidenciaram também limitado
fluxo gênico (Nm) em comparação com as outras localidades. Isto demonstra que estas
populações são distintas entre si, ou seja, estão diferenciadas geneticamente. No entanto, o
isolamento por distância não é o fator responsável para explicar este padrão, uma vez que não
houve correlação entre a variação genética e a distância geográfica segundo o teste de Mantel.
Neste caso, a diferenciação genética encontrada pode ser explicada pela presença de
cachoeiras e corredeiras no entorno das localidades do Parque Nacional do Jaú e São Gabriel
da Cachoeira. No caso da localidade de Barreirinha, a diferenciação genética fornece
VIII
considerável suporte para a hipótese do rio Amazonas como barreira. Estas estruturas
geomorfológicas (cachoeiras e/ou corredeiras da bacia do rio Negro e o rio Amazonas)
parecem constituir barreiras físicas eficientes limitando o fluxo gênico de indivíduos de P.
erythrocephala entre estas e as demais localidades. Para as comparações entre as outras
localidades os valores do ST não foram significantes contrastando com os altos valores de
Nm (número de migrantes por geração). Este resultado indica que não existe estrutura
genética entre as demais localidades e que o número de migrantes estabelece elevado fluxo
gênico entre as amostras. Tais localidades compõem uma grande população panmítica e
fazem parte de um mesmo estoque que ocorre ao longo da Amazônia brasileira. Entretanto,
entre as amostras populacionais de irapuca analisadas na região Amazônica existem
subpopulações demograficamente distintas (Parque Nacional do Jaú, São Gabriel da
Cachoeira e Barreirinha) e que devem ser tratadas como unidades de manejo separadas no
intuito de monitorar as populações e designar políticas de conservação que mantenham a
viabilidade das populações e da espécie.
IX
ABSTRACT
The chelonians of the genus Podocnemis are endemics of the Orinoco, Amazon and
Araguaia basins, and historically form an important part of the cultural habitats of the local
human populations who utilize meat, fat and eggs as sources of food. Podocnemis
erythrocephala, also known as irapuca, has a restricted distribution, and occupies only black
and clear waters. This species is classified by IUCN (International Union for the Conservation
of Nature) as vulnerable. This classification is due to hunting of adult individuals and egg
collection by the riberinhos (riverine inhabitants), a common activity practiced in practically
the whole Rio Negro basin. The objective of this study was to determine the genetic structure
of P. erythrocephala using maternal lineage markers (the mitochondrial control region) so
that the results of this study could be used for future management and conservation of this
species. Samples of blood were collected from each individual by puncturing the femoral vein
without the need to sacrifice the animal. Sampled localities included the Viruá National Park,
Roraima state, São Gabriel da Cachoeira, Santa Isabel do Rio Negro, Barcelos, Jaú National
Park, Barreirinha and Nhamundá, Amazonas state, and Oriximiná and Terra Santa, Pará state.
By analyzing 550 base pairs in 246 individuals it was possible to encounter 49 haplotypes of
which 36 were unique and only one haplotype was present in all localities. Gene diversity (H)
and nucleotide diversity ( ) showed considerable values, 0.608 and 0.0021, respectively. An
analysis of molecular variance revealed high levels of population subdivision ( ST = 0.27931,
P < 0.001). The results showed that 27.93% of total variance was observed between
populations, although majority of the genetic variance was attributable to variance within
populations (72.07%). Values of fixation indexes ST were significant for the localities of Jaú
National Park, São Gabriel da Cachoeira and Barreirinha, that also showed limited gene flow
(Nm) in comparison with other localities. This demonstrates that these populations are distinct
from each other, that is, they are genetically differentiated. However, isolation by distance
does not explain this pattern, because there is no association between geographic and genetic
distance using the Mantel test. In this case, the genetic differentiation is explained by the
presence of water falls and rapids that separate the Jaú National Park and São Gabriel da
Cachoeira localities from other areas. In the case of Barreirinha, genetic differentiation gives
credence to the hypothesis that the Amazon River is a barrier. These geomorphological
structures (water falls and/or rapids in the Negro River and the Amazon River) appear to be
physical barriers that efficiently limit gene flow of individuals of P. erythocephala between
X
these and remaining localities. Comparisons between other localities showed low non-
significant ST values and contrasted with high Nm values. These results indicate lack of
genetic structure between these localities, and the number of migrants reveals elevated gene
flow between the localities. These localities represent one large panmictic population and
form part of a large stock that occurs in the Brazilian Amazon. However, among populations
of irapuca analyzed in the Amazonian region exist demographically distinct subpopulations
(Jaú National Park, São Gabriel da Cachoeira and Barreirinha), and these should be treated as
separate management units in the sense of monitoring of these populations and the
implementation of conservation measures that maintain the viability of these populations and
of the species.
XI
ÍNDICE
FICHA CATALOGRÁFICA................................................................................................III
DEDICATÓRIA....................................................................................................................IV
AGRADECIMENTOS...........................................................................................................V
RESUMO............................................................................................................................IIV
ABSTRACT.........................................................................................................................IX
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................XIII
LISTA DE TABELAS......................................................................................................XIV
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................1
1.1. Considerações gerais.............................................................................................1
1.2. Quelônios aquáticos da Amazônia.......................................................................2
1.3. Biologia de Podocnemis erythrocephala (SPIX, 1824)........................................4
1.4. Parâmetros genéticos como estimadores populacionais....................................6
1.5. O uso de DNA mitocondrial em estudos populacionais.....................................8
1.6. Justificativa..........................................................................................................11
1.7. Hipóteses..............................................................................................................12
2. OBJETIVOS....................................................................................................................13
2.1. Objetivo geral......................................................................................................13
2.2. Objetivos específicos...........................................................................................13
3. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................13
3.1. Local de coleta e material amostrado................................................................13
3.2. Métodos laboratoriais.........................................................................................15
3.2.1. Extração de DNA......................................................................................15
3.2.2. Quantificação do DNA.............................................................................16
3.2.3. Amplificação da região controle...............................................................16
3.2.4. Purificação do produto amplificado..........................................................17
3.2.5. Reação de seqüenciamento.......................................................................18
3.2.6. Análise dos dados.....................................................................................18
3.2.6.1. Edição e alinhamento das seqüências..............................................18
3.2.6.2. Análises de diversidade...................................................................18.
3.2.6.3. A análise de clados agrupados hierarquisados.................................19
3.2.6.4. Análises de estrutura populacional.................................................20
XII
3.2.6.5. Análise de distância genética...........................................................21
3.2.6.6 Testes de neutralidade e equilíbrio genético.....................................22
4. RESULTADOS................................................................................................................23
5. DISCUSSÃO....................................................................................................................35
5.1. Diversidade genética............................................................................................35
5.2. Estrutura populacional.......................................................................................37
5.3. Filogeografia........................................................................................................38
5.3.1. Barreiras geográficas ao fluxo gênico......................................................38
5.3.1.1. Rios como barreiras.........................................................................39
5.3.1.2. Cachoeiras e corredeiras como barreiras.........................................41
5.3.1.3. Outras barreiras geomorfológicas...................................................43
5.3.2. Controvérsias da NCA nas análises filogeográficas................................45
5.4. Unidades para a conservação e o manejo..........................................................47
6. CONCLUSÕES................................................................................................................51
REFERÊNCIAS..................................................................................................................52
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Exemplar de P. erythrocephala.............................................................................5
Figura 2. Genoma mitocondrial completo de Pelomedusa subrufa......................................9
Figura 3. Mapa com as localidades amostradas. ................................................................14
Figura 4. Cladograma dos 49 haplótipos identificados em P. erythrocephala...................27
Figura 5. Árvore filogenética com base no método Neighbor Joining sem raiz utilizando o
índice de diferenciação genética ( ST) das comparações múltiplas entre os pares de
populações de P. erythrocephala........................................................................................33
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lista das amostras populacionais analisadas. .....................................................15
Tabela 2. Seqüência nucleotídica dos iniciadores utilizados na amplificação da região
controle........................................................... ...................................................................16
Tabela 3. Relação dos sítios polimórficos correspondentes aos 49 haplótipos de P.
erythrocephala definidos pelas localidades amostradas na Amazônia
brasileira..............................................................................................................................24
Tabela 4. Distribuição dos haplótipos de P. erythrocephala em função das
localidades...........................................................................................................................25
Tabela 5. Análises de agrupamento de clados (NCA) para P. erythrocephala, mostrando
os valores das distâncias de clados (Dc), distâncias dos clados agrupados (Dn) e distâncias
dos clados interiores versus os de ponta (IT)......................................................................28
Tabela 6. Parâmetros genéticos estimados para Podocnemis erythrocephala....................30
Tabela 7. Estimativa indireta de fluxo gênico (Nm) (acima da diagonal e à direita) e
diferenciação genética ( ST) (abaixo da diagonal e à esquerda) entre os pares de
populações de P. erythrocephala........................................................................................32
Tabela 8. Distâncias genéticas entre as populações de P. erythrocephala com base no
modelo de Kimura 2-parâmetros........................................................................................34
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações gerais
Os quelônios descobriram um modo de vida bem sucedido no Triássico e, desde então,
modificaram-se muito pouco. No mundo todo, existem cerca de 313 espécies, que habitam a
terra firme, os rios, os lagos e os mares. O casco, a chave de seu sucesso, também limitou a
diversidade do grupo, e sua morfologia reflete a ecologia da espécie: as formas mais
terrestres, os jabutis da família Testudinidae, possuem casco em forma de altas cúpulas e pés
semelhantes aos dos elefantes. As espécies menores de jabutis podem apresentar adaptações à
escavação. Outros quelônios terrestres apresentam carapaça (porção superior do casco)
moderadamente convexa. Vários tipos de quelônios desenvolveram regiões flexíveis no
plastrão (porção inferior) que permite que os lobos anterior e posterior sejam puxados para
cima, fechando as aberturas do casco. Os quelônios aquáticos possuem carapaças baixas, que
oferecem pequena resistência ao deslocamento na água (Pough et al., 2003).
As duas linhagens de quelônios atuais podem ser rastreadas por meio de fósseis até o
Mesozóico (Gaffney et al., 1987; Gaffney & Kitching, 1994). Os Cryptodira (cripto =
escondido, dire = pescoço) retraem a cabeça para dentro do casco curvando o pescoço na
forma de S vertical. Já os Pleurodira (pleuro = lado) retraem a cabeça curvando o pescoço
horizontalmente (Pough et al., 2003).
Os quelônios são animais de vida longa. Muitas espécies apresentam baixas taxas de
crescimento e requerem longos períodos para atingir a maturidade. Espécies de pequeno
porte, como a tartaruga-pintada (Chrysemys picta), não atingem a maturidade antes dos sete a
oito anos de idade e podem viver mais de 25 anos. Espécies de maior porte como jabutis e
tartarugas marinhas podem viver tanto quanto os seres humanos, e mesmo os jabutis-caixa
podem viver mais do que 50 anos (Pough et al., 2003).
Essa longevidade dificulta o estudo de sua história de vida. Um longo período de vida
geralmente está associado a uma baixa substituição de indivíduos na população, e espécies
com esta característica correm riscos de extinção quando condições variáveis como caça
(Pough et al., 2003) indiscriminada que não leva em conta estimativas de densidade ou época
de desova, e destruição do habitat, aumentam a mortalidade dos adultos ou reduzem
drasticamente a entrada de jovens na população.
Todos os quelônios são ovíparos e nenhum exibe cuidados parentais aos filhotes. Os
2
filhotes, ao nascerem, sofrem séria taxa de mortalidade ao atravessar os poucos metros de
areia até a água. Os predadores se concentram nas praias de reprodução de tartarugas na época
da eclosão e aguardam seu aparecimento. Uma estratégia natural que lhes permite escapar
temporariamente dos predadores é a saída simultânea do ninho.
O sexo de algumas tartarugas não é definido na concepção, como nos mamíferos. A
temperatura, a umidade e as concentrações de oxigênio e dióxido de carbono podem exercer
efeitos profundos sobre o desenvolvimento embrionário dos quelônios (Packard & Packard,
1988). De maneira geral, temperaturas elevadas induzem a formação de fêmeas e
temperaturas mais baixas apenas a geração de machos (Bull, 1985). Cobertura vegetal (Vogt
& Bull, 1984; Janzen, 1994), profundidade da cova (Thompson, 1988) e a data de ovoposição
(Vogt & Bull, 1984) são outros elementos que também influenciam a determinação sexual.
Souza & Vogt (1994) e Milton et al. (1997) mostraram que a composição mineralógica e
granulométrica do substrato pode ser responsável por diferenças significativas de temperatura.
Mesmo pequena, a alteração do ambiente hídrico e termal traz conseqüências marcantes, pois
de acordo com Yntema & Mrosovsky (1980) e Alho et al. (1985) apenas 1°C de diferença na
temperatura de incubação é suficiente para alterar bruscamente a razão sexual.
O uso de informações a respeito dos aspectos básicos da biologia dos quelônios é uma
parte crucial dos esforços de manutenção das populações existentes e do restabelecimento de
populações em declínio (Pough et al., 2003).
1.2. Quelônios aquáticos da Amazônia
Os sete milhões de Km2 de Floresta Amazônica com seus numerosos igarapés, rios e
lagos, escoando uma grande variedade de formações geológicas, solos e tipos de vegetação,
oferecem muitos nichos para a vida aquática (Smith, 1979). Pelo menos 15 espécies de
quelônios de água doce têm servido o homem amazônico há muito tempo, como um
importante recurso alimentar (Vogt, 2001). Os Podocnemididae são as mais exploradas no
comércio e subsistência com cinco espécies vivendo na região.
Segundo Noonan (2000), a família Podocnemididae compreende um grupo
monofilético que reúne três gêneros de quelônios de água doce: Erymnochelis Baur, 1888;
Peltocephalus Duméril & Bibron, 1835 e Podocnemis Wagler, 1830. O gênero Erymnochelis
está representado por apenas uma espécie vivente, E. madagascariensis (Grandidier, 1867),
restrita a Madagascar (Pritchard & Trebbau, 1984). Peltocephalus, grupo-irmão de
3
Podocnemis, é monoespecífico, estando Peltocephalus dumerilianus (Schweigger, 1812)
distribuída pelo leste da Colômbia, sudoeste da Venezuela e noroeste do Brasil (Pritchard &
Trebbau, 1984). O gênero Podocnemis, distribuído pela região setentrional cisandina da
América do Sul, é o mais representativo, com seis espécies viventes: P. erythrocephala (Spix,
1824), P. expansa (Schweigger, 1812), P. lewyana A. Duméril, 1852, P. sextuberculata
Cornalia, 1849, P. unifilis Troschel, 1848 e P. vogli L. Muller, 1935 (Pritchard, 1964;
Mittermeier & Wilson, 1974; Mittermeier, 1977; Pritchard & Trebbau, 1984; Moretti, 2004).
A Amazônia brasileira é o centro da diversidade do gênero Podocnemis, sendo que
quatro espécies ocorrem na região: P. expansa, P. sextuberculata e P. unifilis, amplamente
distribuídas pela bacia do rio Amazonas, e P. erythrocephala, que ocorre na bacia do rio
Negro (Mittermeier & Wilson, 1974) e tributários dos rios Nhamundá, Trombetas, Branco,
Amazonas (obs. pessoal) e Tapajós (Hoogmed & Ávila-Pires, 1990; Rebêlo, 1991). As duas
outras espécies, P. lewiana e P. vogli, ocorrem respectivamente no rio Magdalena e bacia do
rio Sinu (Colômbia) e na bacia do rio Orinoco (Colômbia e Venezuela) (Mittermeier &
Wilson, 1974; Mittermeier, 1975; Vanzolini, 2001; Moretti, 2004).
Atualmente, P. erythrocephala é popularmente conhecida como “calalumã”, “irapuca”
e “tracajá-piranga”; P. expansa é denominada “tartaruga” e “tartaruga-da-Amazônia” ou
“capitão” e “capitari” no caso dos machos; P. sextuberculata é chamada “iaçá” e “pitiú”; e P.
unifilis recebe o nome popular de “tracajá”, nome este também utilizado em algumas
localidades para designar os demais representantes do gênero, com exceção de P. expansa
(Rodrigues Ferreira, 1903; Ferreira, 1922; Luederwalt, 1926; Pereira, 1958; Medem, 1969;
Alfinito, 1980; Mittermeier et al., 1980; Rebêlo, 1991; Moretti, 2004).
Segundo Pritchard & Trebbau (1984), nenhuma espécie do gênero Podocnemis é
obrigatoriamente herbívora e todas apresentam pelo menos um mínimo de quantidade de
alimento de origem animal. Fachín-Terán (1999), estudando indivíduos de P. sextuberculata
da Reserva de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, verificou que o item predominante na
alimentação desta espécie foi matéria vegetal, tendo como principal componente sementes.
Também foram encontradas quantidades mínimas de insetos e peixes.
A dieta pode variar em função do sexo e da idade do indivíduo. Fachín-Terán et al.,
(1995) comentam que, após analisar conteúdos estomacais de P. unifilis na natureza,
encontraram diferenças na dieta entre machos e fêmeas. Sementes e frutas eram mais
consumidas por fêmeas e talos e brotos pelos machos.
Diversos autores citam que a reprodução dos Podocnemididae está relacionada com o
ciclo anual de vazante e enchente, sendo que a desova e a incubação são realizadas na época
4
seca, e o nascimento dos filhotes coincide com o início da enchente (Alho & Pádua, 1982a;
Fachín-Terán, 1992; Thorbjarnarson et al., 1993; Soini, 1996, 1997; Fachín-Terán & von
Müllen, 2003). Alho & Pádua (1982b) comentam que o regime de vazante com a estabilidade
do nível da água, em seu nível mais baixo, parece ser a causa que desencadeia o ritual de
comportamento de nidificação de P. expansa.
Com relação à biologia reprodutiva, P. expansa é a espécie que mais se diferencia
dentro da família. As fêmeas sobem à praia em grupos, e deixam de ser ariscas ao iniciarem a
ovipostura. Seus ovos são esféricos, os ninhos são relativamente profundos e estão
concentrados em determinada região da praia (Mittermeier, 1975; Alho & Pádua, 1982a). A
iaçá costuma nidificar nos pontos mais altos das praias que surgem na estação seca pondo, em
média, 15,8 ovos por ninho na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá (RDSM)
(Pezzuti & Vogt, 1999). Os autores relatam que o período médio de incubação para esta
espécie é de 64 dias. Nesta mesma reserva, Fachín-Terán & von Müllen (2003) comentam que
a nidificação de P. unifilis ocorre quando a diminuição do nível da água expõe praias e
barrancos. As fêmeas utilizam argila, areia e folhiço como substratos na construção dos
ninhos. Os ninhos estavam concentrados na parte alta da praia e em terreno inclinado.
1.3. Biologia de Podocnemis erythrocephala (SPIX, 1824)
Das quatro espécies do gênero Podocnemis encontradas na Amazônia brasileira, a
espécie que apresenta distribuição mais restrita é a irapuca, que vive preferencialmente em
água preta (Mittermeier & Wilson 1974) e em água clara (Hoogmed & Ávila-Pires, 1990;
Rebêlo, 1991, obs. pessoal).
Podocnemis erythrocephala (Figura 1) é a menor espécie do gênero e facilmente
distinguida de suas congêneres devido ao seu pequeno tamanho (medindo menos que 32 cm,
geralmente as fêmeas medem em torno de 27 cm e os machos são menores ainda). Sua
coloração vai de marrom-escuro a preto; a carapaça é expandida na porção posterior;
apresenta um par de barbelos embaixo do queixo; e uma faixa vermelha brilhante se estende
da parte de trás da cabeça até os tímpanos (nos machos adultos este padrão persiste enquanto
que nas fêmeas torna-se marrom escuro) (Pritchard & Trebbau, 1984).
5
Figura 1 - Exemplar de P. erythrocephala.
Informações sobre a dieta natural desta espécie foram descritas por Mittermeier &
Wilson (1974), que analisando o conteúdo estomacal, revelaram que os adultos são
principalmente herbívoros, se alimentando de plantas aquáticas e frutos que caem no igapó.
Contudo, eles são freqüentemente capturados com linhas de pescar, o que indubitavelmente
inclui peixe em sua dieta, ocasionalmente.
As fêmeas de P. erythrocephala utilizam substratos arenosos para depositar seus ovos
(Ernst & Barbour, 1989). Os sítios de desova estão normalmente localizados nas áreas de
Campina (Mittermeier & Wilson, 1974). A campina é uma das fitofisionomias florestais que
ocorrem nas areias brancas da bacia do rio Negro, consistindo de uma vegetação mais
arbustiva e campestre. Uma vez que não ocorre a justaposição das copas das árvores, não há a
formação de um teto ou dossel (Oliveira et al., 2001). Vogt (2001) menciona que na bacia do
rio Negro as fêmeas desta espécie desovam freqüentemente dentro da floresta, até 200 m de
distância da água.
Esta espécie coloca seus ovos no período que vai do final do mês de agosto até início
de novembro, sendo que o pico da estação de postura aparentemente ocorre entre setembro e
outubro. Em Santa Isabel do Rio Negro (Batistella, 2003) e em Barcelos (Rebelo, 1991) a
desova se estende até dezembro. Na Colômbia a postura ocorre de novembro até janeiro
(Castaño-Mora, 1997). A estação de desova está sincronizada com o regime de vazante dos
rios, e quando as primeiras praias começam a despontar, as fêmeas de irapuca começam sua
estação de ovipostura. Uma vez que o regime de vazante é dinâmico e a exposição dos sítios
de desova ocorre em épocas distintas, o início da estação de desova varia entre as bacias
hidrográficas (Pezzuti, 1998).
Mittermeier & Wilson (1974) encontraram uma variação de 5 a 14 ovos por ninho de
6
P. erythrocephala, com base em dados coletados na calha do rio Negro. Batistella (2003)
encontrou uma variação de 2 a 16 ovos por ninho, na região de Santa Isabel do Rio Negro. Já
Moretti (2004) encontrou uma variação de 7 a 11 ovos por ninho, os dados foram coletados na
bacia do rio Trombetas. Os ovos são alongados podendo apresentar a casca dura ou levemente
flexível (Mittermeier & Wilson, 1974).
Vogt (2001) demonstrou que nesta espécie, assim como na maioria das espécies de
Podocnemis, a determinação sexual dá-se por meio da temperatura média à qual os ovos estão
submetidos durante o período de desenvolvimento embrionário, sendo a diferença entre a
temperatura que define machos e fêmeas da ordem de um ou dois graus.
Os ribeirinhos consomem uma grande quantidade de ovos de irapuca em praticamente
toda a bacia do rio Negro (Vogt, 2001; Novelle, 2006), apesar de ainda não existir um
programa específico para a proteção de seus locais de desova como ocorre com a tartaruga-
da-Amazônia. Como observado por Batistela (2003), na região de Santa Isabel do Rio Negro
é muito comum famílias inteiras de ribeirinhos visitarem as campinas durante o período de
desova. A coleta de ovos nestas ocasiões chega a 100% do número de posturas da noite.
Vários autores descrevem a mesma situação em diferentes regiões e para outras espécies
(Hildebrand et al., 1988; Mitchel & Quinõnes, 1994; Pezzuti, 1998).
As fêmeas de P. erythrocephala são capturadas nas campinas durante a estação
reprodutiva. Como todas as Podocnemis da América do Sul, a irapuca é altamente explorada e
nas cidades pequenas existe pouco ou nenhum controle sobre esta exploração (Mittermeier &
Wilson, 1974). Esta espécie é classificada pela IUCN (União Internacional para Conservação
da Natureza) dentro da categoria vulnerável (Hilton, 2000), devido a pressão de coleta de seus
ovos e da caça dos indivíduos adultos pelos ribeirinhos (Vogt, 2001; Novelle, 2006).
1.4. Parâmetros genéticos como estimadores populacionais
O enfoque genético pode ser usado como importante ferramenta auxiliar para
pesquisas em diferentes campos. Parâmetros ecológicos como, por exemplo, estudos
comportamentais e de ecologia populacional, têm sido estimados a partir da escolha judiciosa
de marcadores moleculares, levando-se em consideração as diferentes taxas de
substituição/evolução. Baseado nesta característica pode-se estudar desde problemas de
avaliação de parentesco genético e sistemas de acasalamento a investigações de caráter
filogeográfico e história demográfica (Hoelzel & Dover, 1991; Avise, 1994, 2000; Carvalho,
7
1998; Pearse et al., 2001). Revisões recentes detalham a miríade de técnicas de análises
genéticas agora disponíveis e as questões ecológicas que podem solucionar (ver Selkoe &
Toonen, 2006 para maiores detalhes).
Em espécies cujas populações são pequenas ou experimentaram recente redução
populacional, marcadores com baixa taxa mutacional, como aloenzimas, podem ser
invariáveis e apenas loci com alta taxa de mutação podem ser informativos (Hedrick, 1999).
Um lento processo mutacional permite a suposição de eventos no passado distante que
persistem muito tempo, o que torna a seleção de loci com alta ou baixa diversidade alélica da
questão de interesse um parâmetro extremamente importante. Questões de paternidade ou
estrutura clonal são mais bem avaliados usando microssatélites com alta diversidade alélica,
que podem fornecer todos os indivíduos com um único genótipo (identification tag) usando
poucos loci (Queller et al., 1993). Em estudos de estrutura populacional e migração, que
empregam estimativas da freqüência de alelos na população, a alta diversidade alélica dos
marcadores microssatélites atua como uma réplica estatística para emprestar maior poder para
distinguir populações (Kalinowski, 2002; Wilson & Rannala, 2003; Selkoe & Toonen, 2006).
Um outro importante marcador tem se mostrado poderoso para resolver questões sobre
a possibilidade de viés sexual. Devido a seu predominante modo de herança materna
(Huntchison et al., 1974; Avise, 1986), o número efetivo de genes do genoma mitocondrial
corresponde a um quarto do nuclear, levando a mais rápida taxa de diferenciação genética
através da deriva (Birky et al., 1983). A divergência genética é também aumentada pela maior
taxa de evolução de seqüências (pelo menos em vertebrados), particularmente dentro de uma
porção hipervariável do genoma mitocondrial, a região controle, em comparação aos genes
condificantes do DNA nuclear (Brown et al., 1979; Brown, 1983; Moritz et al., 1987). Estas
propriedades também facilitam a reconstrução de relações filogenéticas entre os haplótipos do
DNA mitocondrial, que podem ser comparadas a sua atual distribuição geográfica para
identificar os processos que definem a estrutura genética entre populações (Avise et al., 1987;
O’Corry-Crowe et al., 1997).
Estas informações demonstram que a ferramenta genética pode ser usada como um
importante componente na conservação de espécies ameaçadas, pois permite a identificação
das quebras genéticas, a fronteira entre as unidades evolutivas significantes (UES) e as
unidades de manejo (UM), o problema central da genética de populações (Waples, 1995;
Crandall et al., 2000; Fraser & Bernatchez, 2001; Pearman, 2001; Moritz, 2002; Pearse et al.,
2006).
8
As unidades evolutivas significantes são entendidas como uma categoria acima das
unidades de manejo, descrevendo uma população ou grupos de populações que podem
apresentar uma nova trajetória evolutiva, decorrente de um isolamento a longo prazo ou
divergência ecológica, morfológica ou genética (Waples, 1991). O conceito de UES é valioso,
pois permite aos conservacionistas uma abertura nas difíceis questões sobre conceitos
taxonômicos e de espécies, e foca na preservação de maiores subdivisões evolutivas (Bowen,
1998).
As populações isoladas ou unidades de manejo são tipicamente caracterizadas por
diferenças na freqüência genotípica, sem levar em conta a natureza filogenética dos alelos
(Moritz, 1994). Este conceito está bem inserido na biologia populacional e é importante para a
conservação, pois descreve as unidades de manejo fundamentais: as populações isoladas
reprodutivamente (Bowen, 1998).
Como as estimativas de parâmetros populacionais contêm componentes independentes
de outras espécies ou da diversidade de ecossistemas, a diversidade genética pode fornecer
uma medida pela qual se pode estimar o valor das regiões para a conservação. Em geral, o
método e o programa estatístico utilizado para responder questões sobre genética de
populações e sobre filogenética são aplicáveis para a conservação genética (Bert et al., 2002).
1.5. O uso de DNA mitocondrial em estudos populacionais
Entre os fragmentos de DNA mais usados para estudar os níveis e padrões de
distribuição da variabilidade genética entre populações de espécies animais, o DNA
mitocondrial (DNAmt) tem recebido atenção especial (Avise, 1994). O genoma mitocondrial
dos animais é uma molécula de DNA circular, fita dupla, pequena e contida em múltiplas
cópias na mitocôndria (Figura 2). Seu tamanho é relativamente estável para animais, em torno
de 16 - 21 kilobases (kb) (Ray & Densmore, 2002). Sua organização inclui 13 genes
codificadores de proteína, que representam 90% deste genoma, 22 RNAs de transferência
(tRNAs), 2 de RNAs ribossômicos (12S e 16S rRNA) e uma região não codificadora chamada
de região controle ou alça D (D-loop) (Brown et al., 1979; Anderson et al., 1981; Avise,
1986; Meyer, 1993).
9
Figura 2 - Genoma mitocondrial completo de Pelomedusa subrufa [13974] gi|5835582|ref|NC_001947.1|.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/framik.cgi?db=genome&gi=13974, acessado em 03/03/2006.
Uma das vantagens em usar o DNAmt em estudos populacionais é que ele possui uma
taxa de evolução (mutação) de 5 a 10 vezes maior (5,7 X 10-8 substituição por sítio por
geração) do que os genes codificadores de proteínas do DNA nuclear (Brown, 1980; Perler et
al., 1980; Brown et al., 1982). Várias razões possíveis explicam o porquê dessa taxa de
mutação tão alta: 1) a exposição do DNA ao alto fluxo de radicais livres de oxigênio na cadeia
respiratória, que têm efeito mutagênico, o que não acontece com o DNA nuclear por ser
protegido pelas histonas (Cann et al., 1984; Strachan & Read, 1996; Li, 1997); 2) a falta de
um mecanismo de reparo, como o encontrado no DNA nuclear; 3) o número de replicações é
muito maior no DNA mitocondrial em relação ao nuclear, durante a vida da célula (Li, 1997).
O DNAmt é também muito utilizado devido à facilidade em isolá-lo, ao grande
número de cópias por célula, seu tamanho pequeno, sua organização simples, por não ser
recombinante (Avise et al., 1984; Hayashi et al., 1985) e por sua suposta herança materna (a
mitocôndria paternal parece ser ativamente degradada durante a fertilização) e uniclonal
(Hutchinson et al., 1974; Giles et al., 1980; Waughn et al., 1980; Avise, 1986, 1994). A
herança materna gera hipóteses que refletem a filogenia das fêmeas de uma população, sendo
útil, por exemplo, no estudo da movimentação de fêmeas em populações naturais de uma
D-Loop
10
espécie (Lasman et al., 1981; Avise et al., 1984). A alta taxa de mutação ainda permite que o
DNA mitocondrial seja utilizado para inferir relações filogenéticas entre populações ou
espécies com tempos de divergência relativamente recentes entre milhares e alguns milhões
de anos (Brown et al., 1979).
A região controle é a região não codificadora do genoma mitocondrial. Apresenta em
torno de 1100 pares de bases e localiza-se entre as regiões codificadoras de dois RNAs
transportadores (tRNA), o tRNA da prolina, e o tRNA da fenilalanina. Esta região inclui um
segmento chamado D-loop (displacement loop structure) ou alça-D onde estão localizados os
sítios de iniciação da replicação da fita pesada (H) e os promotores de transcrição das fitas
leve e pesada (Brown et al., 1986; Honeycutt & Wheeler, 1990; Strachan & Read, 1996).
A extrema variabilidade encontrada na região controle, em termos de substituição de
bases, quando comparada a outras regiões do DNAmt e do DNA nuclear (Aquadro &
Greenberg, 1983; Honeycutt & Wheeler, 1990), foi descoberta há mais de duas décadas
(Fauron & Wolstenholme, 1976; Upholt & Dawid, 1977) e tem sido amplamente utilizada em
estudos populacionais. Sua taxa de evolução está entre duas a cinco vezes maior do que a de
genes mitocondriais codificadores de proteínas (Aquadro & Greenberg, 1983) e esta região é
também responsável pela variação de tamanho observada no genoma mitocondrial dos
vertebrados (Densmore et al., 1985; Harrison et al., 1985).
Alguns trabalhos já têm utilizado com sucesso a região controle para estudos
populacionais em quelônios da Amazônia. Sites et al. (1999), trabalhando com P. expansa de
duas bacias hidrográficas (Tapajós e Araguaia) da Amazônia brasileira, obtiveram seqüências
de DNA mitocondrial da extremidade 5’ da região controle (354 pb) de uma amostra de 73
tartarugas, e a estratégia amostral permitiu uma comparação entre a estrutura populacional
inter e intrabacias fluviais. Todas as amostras foram fixadas em um único haplótipo dentro do
rio Araguaia, enquanto que as amostras do rio Tapajós incluíram três haplótipos exclusivos
desta bacia fluvial e um quarto haplótipo contendo amostras do rio Araguaia. Este resultado
sugere limitado fluxo gênico interbacias fluviais, mas muito extenso intrabacia. Em um outro
estudo concentrado em praticamente toda a área de distribuição desta espécie e com suficiente
capacidade de amostragem, Pearse et al. (2006) mostraram que as populações de P. expansa
não apresentam uma longa história de diferenciação genética, mas que cada grande tributário
do rio Amazonas atualmente forma uma população parcialmente isolada reprodutivamente,
parâmetro que deve ser considerado durante as tomadas de decisões e assim conservar seu
patrimônio genético.
11
1.6. Justificativa
Após mais de 36 anos de promulgada a Lei nº 5.197/67, que dispõe sobre a Proteção
da Fauna, proibindo a livre captura de animais silvestres, as comunidades ribeirinhas mantêm
o hábito cultural de alimentar-se e de comercializar quelônios (Rebelo & Lugli, 1996; Fachín-
Terán et al., 2000; Soares, 2000; Fachín-Terán & Von Mülhen, 2003; Fachín-Terán & Vogt,
2004), ocasionando, muitas vezes, repreensões pelos órgãos de fiscalização do governo.
Apesar de a irapuca não ser a mais importante na economia, ela está entre as espécies
mais consumidas nos tributários da bacia do rio Negro, devido a reduções locais nas
populações de P. expansa e P. unifilis, mais apreciadas (Vogt, 2001). Contudo, a carência de
dados populacionais sobre P. erythrocephala dificulta a determinação de sua situação e a
implantação de práticas de manejo e conservação dessa espécie na região Amazônica. Neste
sentido, as instituições de fiscalização e de pesquisa devem dar respostas para que as
populações dessa espécie sejam manejadas sustentavelmente pelas populações ribeirinhas que
participam do programa de preservação (Fachín-Terán & Vogt, 2004).
Atualmente, em relação aos quelônios da Amazônia, uma questão genética, de
conservação e manejo muito relevante a ser abordada diz respeito ao conhecimento dos níveis
e padrões de distribuição espacial da variabilidade genética, para se entender padrões
evolutivos inter e intrapopulacionais que possam fornecer subsídios na busca de melhores
estratégias para o uso racional deste recurso.
Na última década, várias classes de marcadores moleculares têm sido empregadas para
investigar os padrões de fluxo gênico e estrutura populacional, devido ao desenvolvimento de
técnicas que permitem avaliar múltiplos loci evoluindo em diferentes taxas de mutação
(Avise, 1994; Sites et al., 1999). O uso combinado de marcadores de DNA nuclear e
citoplasmático é bastante útil na determinação de fluxo gênico baseado no sexo,
particularmente em espécies que exibem um alto grau de estrutura em linhagens maternas
(Karl et al., 1992; Melnick & Hoelzer, 1992; Palumbi & Baker, 1994). O DNA mitocondrial
gera hipóteses que refletem a filogenia das fêmeas e unidades demográficas de uma população
(Moritz, 1994; Avise, 1995), enquanto o DNA microssatélite, devido a sua alta taxa de
mutação e alta diversidade alélica, é ideal para resolver muitas questões populacionais
(Ashley & Dow, 1994; Schlotterer & Pemberton, 1994), principalmente, para espécies
definidas como prioritárias para a conservação e das quais pouca informação ecológica pode
estar disponível (Sites et al., 1999).
12
Baseado nas informações expostas anteriormente, este trabalho utilizará dados da
região controle mitocondrial e analisará os padrões de variabilidade desta classe de marcador
molecular em diferentes bacias fluviais na região Amazônica. Este estudo intenciona
contribuir para trabalhos que investigam questões relativas à conservação de espécies
ameaçadas de extinção, numa escala em que o fluxo gênico define populações. Os resultados
obtidos também poderão colaborar para elucidar a estrutura de metapopulação e o
comportamento migratório de P. erythrocephala, permitindo identificar unidades
demográficas independentes necessárias para a conservação e o manejo, garantindo a
sobrevida da espécie.
1.7. Hipóteses
H0= As populações de irapucas pertencentes à bacia Amazônica apresentam-se em
uma única e grande população panmítica;
H1= Existem populações na região do rio Negro e do Médio e Baixo rio Amazonas
que não são geneticamente homogêneas como um efeito da estrutura geomorfológica (isto é,
cachoeiras e corredeiras) da drenagem do rio Negro e da provável atuação do rio Amazonas
como barreiras geográficas, que contribuem para a diferenciação genética das populações
separadas por estes acidentes geográficos;
H0= Não existe correlação significativa entre divergência genética e distância
geográfica nas populações amostradas, as quais se encontram em panmixia;
H2= Existe correlação entre geografia e distribuição da variação genética e esta
correlação é devido a eventos demográficos, tais como: isolamento por distância,
fragmentação no passado, fluxo gênico restrito e colonização.
13
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
- Determinar a estrutura genética de P. erythrocephala a partir de um marcador
de linhagem materna (região controle mitocondrial) para que os resultados provenientes deste
estudo possam dar suporte a futuros programas de manejo e conservação da espécie.
2.2. Objetivos específicos
- Caracterizar e analisar os níveis de variabilidade genética intra e
interpopulacional de P. erythrocephala ao longo dos pontos de distribuição amostrados na
bacia Amazônica;
- Determinar possíveis unidades de manejo a partir do nível de diferenciação
genética encontrado com base na freqüência dos haplótipos da região controle mitocondrial;
- Verificar se cachoeiras (ou corredeiras) localizadas na drenagem do rio Negro
e o rio Amazonas funcionam como barreiras ao fluxo gênico para as populações de irapucas;
- Inferir se há eventos históricos (colonização, fragmentação, expansão,
isolamento por distância) envolvidos no padrão de distribuição geográfica dos haplótipos do
DNA mitocondrial.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Local de coleta e material amostrado
Os locais de coleta compreenderam o Parque Nacional Viruá, no estado de Roraima,
São Gabriel da Cachoeira, Santa Isabel do Rio Negro, Barcelos, Parque Nacional do Jaú
(PNJ), Barreirinha e Nhamundá, no estado do Amazonas, e Oriximiná e Terra Santa, no
estado do Pará, como mostrado na Figura 3. As amostras foram obtidas com a autorização de
coleta fornecida pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA), licença n° 113/2006. Desta forma, neste estudo foram amostradas dez
populações de irapuca, perfazendo um total de 246 espécimens analisados (indivíduos jovens
ou recém-eclodidos) (Tabela 1). Foram retiradas amostras de sangue (aproximadamente
14
50µL) de cada indivíduo através da punção da veia femoral, com seringas contendo NE (NaCl
100mM e EDTA 10mM, pH 8) como anticoagulante e, em seguida, foram preservadas em
tubos com álcool etílico absoluto, rotulados com registro de campo e armazenados na
geladeira até o processamento.
Figura 3. Mapa com as localidades amostradas. 1- Parque Nacional Viruá (RR), 2- São Gabriel da Cachoeira (AM), 3- Santa Isabel do Rio Negro (AM), 4 e 5- Barcelos (AM), 6- Parque Nacional do Jaú (AM), 7- Barreirinha (AM), 8- Nhamundá (AM), 9- Oriximiná (PA) e 10- Terra Santa (PA).
Nota: Representam cachoeiras e corredeiras.
5
6
1
2
3
4
7
8
10
9
80°W 75°W 70°W 65°W 60°W 55°W 50°W 45°W 40°W
80°W 75°W 70°W 65°W 60°W 55°W 50°W 45°W 40°W
10°N
5°N
0°
5°S
10°N
5°N
0°
5°S
15
Tabela 1. Lista das amostras populacionais analisadas.
Localidades
Amostradas
Estado Rio/Lago/
Igarapé
Bacia Ponto no
Mapa
Tamanho
Amostral
Parque Nacional Viruá RR Igarapé Iruá Rio Branco 1 10
São Gabriel da Cachoeira AM Rio Negro Rio Negro 2 18
Santa Isabel do Rio Negro AM Rio Ayuanã Rio Negro 3 34
Barcelos AM Rio Itu Rio Negro 4 29
Barcelos AM Rio Cumicuri Rio Negro 5 29
Parque Nacional do Jaú AM Rio Jaú Rio Negro 6 34
Barreirinha AM Rio Andirá Rio Amazonas
7 33
Nhamundá AM Rio Paracatu Rio Nhamundá
8 23
Oriximiná PA Lago Sapucuá Rio Trombetas
9 17
Terra Santa PA Igarapé Alema
Rio Nhamundá
10 19
Total 246
3.2. Métodos laboratoriais
3.2.1. Extração de DNA
O DNA genômico foi isolado das amostras de sangue pelo método fenol/clorofórmio
(Sambrook et al., 1989), mediante modificações, envolvendo os seguintes procedimentos
gerais: (1) rompimento da célula, (2) separação dos ácidos nucléicos pela remoção das
proteínas e de outros restos celulares, e (3) purificação final (Kreuzer & Massey, 2002). As
amostras foram submetidas a um processo de digestão por uma solução de lise – STE (EDTA
(0,5M), Tris-KCl (1M), NaCl (3M), e SDS (5%)), Proteinase K, RNAse e SDS 10%.
Visando remover as proteínas contaminantes, o DNA foi purificado por meio de
sucessivas lavagens em fenol, fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e clorofórmio hidratado e
então submetido a uma purificação adicional compreendendo NaCl (3M) e álcool etílico a
70%. Posteriormente, o sedimento foi deixado à temperatura ambiente para secar e então
dissolvido em ddH2O.
16
3.2.2. Quantificação do DNA
O DNA em solução teve sua concentração determinada por meio da visualização e
comparação de bandas através da técnica de eletroforese em gel de agarose a 0,8%. No gel,
2µL do DNA extraído de cada amostra foi misturado com 2µL de corante Bromofenol. Como
parâmetro a concentração das amostras, foram utilizados 2µL de marcadores de peso
molecular conhecido (100, 50 e 30ng). Quando necessário, as amostras foram diluídas, e
então mantidas a concentração de 10-30ng/µL.
Aproximadamente após 60 minutos de corrida eletroforética, a 100 volts, o gel foi
corado com brometo de etídio por 15 minutos e em seguida observado em um transluminador
de luz UV Image Master (Pharmacia Biotech).
3.2.3. Amplificação in vitro do DNA via reação em cadeia da polimerase
Uma das ferramentas mais poderosas em biologia molecular é a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction), concebida por Kary Mullis em meados da
década de 80 (Mullis & Fallona, 1987). Esta técnica permite essencialmente que um número
ilimitado de cópias de um fragmento específico de DNA seja gerado. No presente estudo foi
utilizado, para amplificação de cada amostra, 0,8µL de DNA, 2µL de cada iniciador (primer)
(PRO e 12SR5 2mM), 2,5µL de tampão (Tris-KCl 200mM, pH 8,5), 1,5µL de MgCl (25mM),
2,5µL de dNTP (10mM), 0,2µL de enzima Taq polimerase (5U/µL) e 13,5µL de ddH2O
completando um volume final de 25µL de reação em cada tubo eppendorf de 0,2mL.
Os iniciadores utilizados para a amplificação da região controle conferem à seqüência
de bases nucleotídicas visualizadas na Tabela 2.
Tabela 2. Seqüência nucleotídica dos iniciadores utilizados na amplificação da região controle.
Iniciadores Seqüência Nucleotídica Referência
PRO 5’ - CCCATCACCCACTCCCAAAGC - 3’ Pearse et al., 2006
12SR5 5’ - GTCAGGACCATGCCTTTGTG - 3’ Tomas Hrbek com. pessoal
As reações de PCR foram realizadas em um termociclador (PCR Express – Thermo
Hybaid), programado para as seguintes condições de amplificação: o primeiro ciclo constitui-
se de dois minutos a 92°C para desnaturação das fitas complementares do DNA. Os demais 35
17
ciclos foram constituídos de um minuto a 92°C (desnaturação), trinta e cinco segundos a 55°C
(anelamento dos primers) e um minuto a 72°C (extensão dos seguimentos amplificados de
DNA) e a extensão final a 72°C por cinco minutos.
O produto amplificado foi submetido a uma corrida eletroforética em gel de agarose a
1% para que a eficiência da reação seja constatada. Neste procedimento, foi utilizado 3µL do
produto de PCR juntamente com 2µL de Bromofenol e um marcador padrão (Ladder 1Kb)
para posterior comparação e estimativa do tamanho do fragmento amplificado em pares de
bases. O gel foi corado com brometo de etídio e então visualizado em transluminador sob luz
ultravioleta.
3.2.4. Purificação do produto amplificado
As amostras de DNA amplificadas foram submetidas à purificação por meio de
precipitação com acetato de sódio e etanol 95%. Este procedimento visa eliminar dos
produtos de PCR resíduos de baixo peso molecular, tais como sais, iniciadores e dNTPs. O
protocolo de purificação constou das seguintes etapas:
- Verificar o volume total do produto de PCR;
- Adicionar 10% deste volume com NaOAc (3M, pH 4,8);
- Multiplicar este novo volume por dois, e o valor resultante constituir a
quantidade de álcool etílico 95%;
- Vortexar as amostras para homegeneizar;
- Incubar a -20°C por 30-40 minutos;
- Centrifugar (12.000rpm) por 30 minutos;
- Descartar o sobrenadante;
- Acrescentar 250µL de etanol 70%;
- Descartar o sobrenadante;
- Deixar secar;
- Ressuspender com 20µL de água autoclavada deionizada.
A eficiência do produto purificado foi verificada em gel de agarose a 1%.
18
3.2.5. Reação de seqüenciamento
As reações de seqüenciamento foram feitas em uma placa para um volume final de
10µL utilizando o kit de reação “DYEnamic™ ET dye terminator kit” (GE-Healthcare).
A mistura teve a seguinte composição: 4µL de DNA amplificado, 2 L de um dos
oligonucleotídeos (mesma concentração utilizada na reação de PCR), 2 L do ET-terminator
e 2µL de água autoclavada deionizada, para cada amostra. Em seguida as amostras foram
submetidas ao termociclador programado para 35 ciclos com o seguinte perfil de temperatura:
20 segundos a 95ºC a fim de desnaturar as fitas complementares, 15 segundos a 55ºC, para o
pareamento do iniciador e 1 minuto a 60ºC para a extensão da região a ser seqüenciada.
Ao término da reação, as amostras de DNA resultantes deste PCR foram submetidas
ao protocolo de precipitação de acordo com instruções do fabricante (GE-Helthcare).
Em seguida, a placa contendo o DNA foi submetida a eletro-injeção e as seqüências
nucleotídicas foram determinadas pelo seqüenciador automático MegaBACE 1000 DNA
Analysis System (GE-Helthcare) seguindo instruções do fabricante.
3.2.6. Análise dos dados
3.2.6.1. Edição e alinhamento das seqüências
As seqüências nucleotídicas convertidas pelo seqüenciador automático foram
conferidas no programa BIOEDIT (Hall, 1999), com auxílio da ferramenta ClustalW
(Thompson et al., 1994) que realiza o alinhamento automático. A edição final das seqüências
foi feita manualmente para minimizar o número de gaps causados pela inserção e/ou deleção
de nucleotídeos e maximizar o caráter de homologia inerente às regiões conservadas
flanqueando as àquelas mais variáveis e que estão sujeitas a inserção e/ou deleção de
nucleotídeos.
3.2.6.2. Análises de diversidade
A diversidade genética foi estimada a partir da diversidade gênica (H), que é a
probabilidade de duas seqüências, escolhidas aleatoriamente de uma população, serem
diferentes (Nei, 1987). Esta medida de polimorfismo é equivalente ao nível de heterozigose
19
esperada, quando se trata de marcador com herança co-dominante (dados diplóides); da
diversidade nucleotídica ( ), que corresponde ao número de nucleotídeos diferentes por sítio
entre seqüências escolhidas ao acaso em uma população (Nei & Li, 1979); do número de
haplótipos do DNAmt; e do número de sítios segregantes (S). Estas medidas de variabilidade
genética foram estimadas no programa ARLEQUIN versão 3.1 (Schneider et al., 2006) e no
programa DNASP versão 4.0 (Rozas et al., 2003).
3.2.6.3. A análise de clados agrupados hierarquisados
Análises referentes às amostras populacionais de Podocnemis erythrocephala
produziram uma matriz de dados utilizada para estimar cladogramas intra-específicos não
enraizados de haplótipos, com base no critério da máxima parcimônia (Templeton et al.,
1992). As topologias, que representam os agrupamentos dos haplótipos foram realizadas com
o auxílio do programa TCS versão 1.18 (Clement et al., 2000). Este software agrupa
seqüências de pares de bases que diferem entre si em passos mutacionais dentro de haplótipos
e calcula a freqüência desses haplótipos na matriz, estimando relações genealógicas entre eles,
usando um algoritmo descrito por Templeton et al. (1992).
A partir das mutações ocorrentes em uma ou mais bases nucleotídicas, este programa
pode gerar haplótipos raros ou únicos além de elipses menores, que ligam os haplótipos
identificados. Estas elipses menores podem corresponder aos haplótipos não amostrados
(missing haplotypes) ou que simplesmente não foram encontrados nas amostras populacionais
examinadas e, dessa maneira, este programa os assume como haplótipos intermediários.
Para verificar se alguma significante associação entre os níveis do cladograma dos
haplótipos e sua localização geográfica resulta de algum nível de fluxo gênico restrito foi
utilizada a análise de clados agrupados (NCA) proposta por Templeton et al. (1995). A NCA
leva em consideração genealogias de DNA, a freqüência dos haplótipos e dados geográficos
para distinguir eventos históricos (tais como fragmentação ou expansão populacional) ou
atuais (como o fluxo gênico). Para utilizar a NCA, a árvore dos haplótipos foi convertida em
um agrupamento hierárquico de conexões agrupadas, ou clados, usando as regras descritas por
Templeton et al. (1987) e Templeton & Sing (1993). Para cada clado inserido em um nível
hierárquico específico, desvios da hipótese nula de não associação geográfica foram
determinados a partir de duas distâncias: (i) a distância dos clados, (Dc), que corresponde à
distância de um clado X em relação ao centro geográfico de todos os haplótipos que são
20
incluídos neste clado, e (ii) a distância dos clados agrupados, (Dn), que equivale à distância de
um clado agrupado X em relação a outro. Esta análise inclui ainda outro parâmetro, o índice I-
T, que correlaciona os haplótipos do interior (mais antigos) e os de ponta (mais recentes). A
significância das distâncias (Dc e Dn) e a correlação interior-ponta foi testada usando uma
análise de contingência (Templeton & Sing, 1993) no programa GeoDis versão 2.0 (Posada et
al., 2000). A interpretação dos resultados seguiu a edição mais recente da chave de inferência
de Templeton, publicada em Novembro de 2005 (disponível em
http://darwin.uvigo.es/download/geodisKey_11Nov05.pdf).
3.2.6.4. Análises de estrutura populacional
Corroborando a importância da análise de clados agrupados para estudos de fundo
filogeográfico, os resultados deste método foram utilizados para inferir a estrutura genética
das populações de irapucas e deduzir quais clados são conectados por fluxo gênico. Os níveis
de diferenciação entre as populações foram calculados usando a análise de variância
molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992), o ST que é análogo ao FST (Weir &
Cockerham, 1984), e o teste de Mantel (Mantel, 1967) a partir de ferramentas disponíveis no
software ARLEQUIN versão 3.1 (Schneider et al., 2006).
A análise de variância molecular é baseada sobre análises de variação de freqüência
gênica, mas levando em conta o número de mutações entre os haplótipos como uma medida
de divergência evolutiva, sendo que as informações contidas na freqüência destes haplótipos
apresentam panmixia como ponto de partida da análise. Após a definição dos grupos de
populações, o usuário define uma estrutura genética que será testada. Uma análise hierárquica
de variação divide a variação total em componentes covariantes devido a diferenças intra-
individuais, inter-individuais e/ou diferenças interpopulacionais (Excoffier et al., 1992).
A estimativa do fluxo gênico das fêmeas foi calculada dos valores par a par do ST
(Slatkin, 1985), que produz valores equivalentes ao FST (Hudson et al., 1992) e têm sido
usados igualmente em estudos populacionais. O ST leva em consideração a distância genética
entre haplótipos, neste caso baseada no modelo Kimura 2-parâmetros (Kimura, 1980) sem a
correção gama, assim como a frequência dos haplótipos em cada população. Já o FST
considera apenas as diferenças na freqüência dos haplótipos. Outra diferença entre os dois
métodos é que o ST pode ser usado com um número grande de tipos de marcadores
moleculares (ao contrário do FST que se aplica mais a dados de marcadores co-dominantes).
21
Os valores de ST foram usados para estimar o número efetivo de fêmeas migrantes através da
equação Nemf ˜ 0,5 [(mtFST)-1-1] (Weir & Cockerham, 1984) para marcadores mitocondriais
(mt), onde Ne é o tamanho efetivo de fêmeas na população, e mf é a taxa individual de
migração de fêmeas. O fluxo gênico, dado pelo equivalente ao número de migrantes por
geração Nm, é uma força contrária e impõe um limite à diferenciação genética. Valores de Nm
maior do que 1 são indicativos de que a divergência genética está sendo refreada (Hartl &
Clark, 1989). Valores para o ST são inversamente proporcionais aos valores de Nm, ou seja,
quanto maior o número de migrantes, os valores de ST são menores indicando intenso fluxo
gênico entre populações e ausência de estruturação populacional. Ao passo que, quando
observado pequeno número de migrantes conclui-se estar ocorrendo pouco fluxo gênico. De
um modo geral, para estimativas de ST ou FST significativamente diferentes de zero, valores
superiores a 0,05 são considerados indicadores de alta estruturação populacional, enquanto
que valores abaixo de 0,05 indicam baixa estruturação (Wright, 1978). Baseada nos valores
do índice de diferenciação genética ST das comparações múltiplas entre os pares de
populações de P. erythrocephala foi construída uma árvore de distância de Neighbor Joining
sem raiz para as dez amostras populacionais usando-se o programa Mega versão 4 (Tamura,
Dudley, Nei & Kumar, 2007) para uma melhor visualização da relação entre as localidades.
Na área de genética de populações o teste de Mantel (Mantel, 1967) é usado para
estimar a significância da correlação entre a divergência genética (no caso deste estudo, o
índice ST) e uma distância espacial (neste caso uma matriz de distâncias geográficas
aproximadas, seguindo o curso dos rios). Neste trabalho a hipótese de isolamento por
distância foi testada via teste de Mantel e os valores de [ ST /(1 - ST )] foram adequados a
uma distância em quilômetros referente ao mais curto caminho percorrido pelos rios entre
cada par de populações (Fetzner & Crandall, 2003) e a correlação de Spearman (Spearman,
1904) com 10.000 permutações será usada para avaliar a significância no software
ARLEQUIN versão 3.1 (Schneider et al., 2006).
3.2.6.5. Análise de distância genética
A distância genética entre as populações de P. erythrocephala foi estimada segundo o
modelo de Kimura 2-parâmetros (Kimura, 1980). Este modelo assume igual freqüência de
bases (Adenina, Timina, Guanina e Citosina) e as transições e transversões tem diferentes
taxas de substituições.
22
3.2.6.6. Testes de neutralidade e equilíbrio genético
Os testes D (Tajima, 1989) e Fs (Fu, 1997) foram utilizados para verificar se amostras
de diferentes localidades estão em equilíbrio com relação ao DNAmt. Valores significantes
para estes testes poderiam indicar que as seqüências nucleotídicas mitocondriais não estão
evoluindo segundo a hipótese de neutralidade seletiva (isto é, não estão em equilíbrio com
respeito à mutação e à deriva genética), ou que as populações foram anteriormente
subdivididas e/ou experimentaram flutuações no passado (ou seja, não estão em equilíbrio
quanto à migração e à deriva genética) (Hartl & Clark, 1989). A neutralidade é uma suposição
empregada em estudos moleculares de história e estrutura populacionais, logo testes
estatísticos concernentes a esta suposição são necessários (Rand, 1996; Ballard & Whitlock,
2004). O teste D se baseia no modelo dos sítios infinitos sem recombinação (Kimura, 1969),
apropriado para seqüências de DNA e leva em consideração a razão do número de sítios
segregantes e o número médio de diferenças nucleotídicas, estimado pela comparação em
pares de bases (Tajima, 1989). O teste Fs baseia-se na probabilidade de observar em uma
amostragem ao acaso um número de alelos similar ou menor do que o número observado de
diferenças par-a-par, tirados da estimativa de theta. Este teste é mais sensível para detectar
expansão populacional (Fu, 1997), e a sua significância foi testada por comparações da
estatística de Fs contra uma distribuição gerada a partir de 1000 amostras aleatórias sobre as
hipóteses de neutralidade seletiva e equilíbrio populacional (Hartl & Clark, 1989). As análises
foram implementadas com o programa ARLEQUIN versão 3.1 (Schneider et al., 2006).
23
4. RESULTADOS
O banco de dados para análises de populações foi composto de 246 seqüências
nucleotídicas com um total de 550 pares de bases cada. A composição média de bases
nucleotídicas deste fragmento parcial foi de: 27,08% para Adenina, 31,83% para Timina,
27,64% para Citosina e 13,45% para Guanina. A partir de todas as seqüências analisadas
verificou-se que 510 sítios foram monomórficos e 40 foram polimórficos. Dentre os sítios
variáveis, 27 corresponderam a mutações do tipo transição e 14 do tipo transversão (Tabela
3). Nos sítios 210, 433 e 490 ocorreram duas ou mais transversões. Já o sítio 162 mostrou dois
tipos de substituição de bases: duas transições (C T) e uma transversão (C A), com a
predominância de citosina nesta posição em todos os outros haplótipos.
Considerando os 246 indivíduos obtidos de dez amostras populacionais situadas ao
longo da Amazônia brasileira, foram definidos 49 haplótipos, e destes, 36 foram únicos, e
apenas um haplótipo (H3) está presente em todas as localidades (Tabela 4). Este haplótipo
equivale a aproximadamente 62% do total de haplótipos identificados e constitui o haplótipo
de maior distribuição geográfica. Tais características estão de acordo com o critério de origem
baseado na freqüência descrito por Templeton (1998) e segundo o qual este seria o haplótipo
ancestral dos indivíduos de irapuca estudados.
24
Tabela 3. Relação dos sítios polimórficos correspondentes aos 49 haplótipos de P.
erythrocephala definidos pelas localidades amostradas na Amazônia brasileira. Os polimorfismos incluem 27 transições e 14 transversões. As transversões ocorreram nos sítios 62, 162, 205, 210, 222, 244, 279, 290, 313, 342, 420, 426, 433 e 490. O sítio 162 mostrou duas transições (C T) e uma transversão (C A). N indica o número de indivíduos que compartilham o referido haplótipo.
H Posição das bases N
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
2
2
3
3
3
3
3 3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4 4
5
3
4
5
6
8
4
5
6
6
6
0
1
1
2
4
5
5
6
6 7
7
9
0
1
4
4
7 8
2
2
3
4
4
7
8
9
9
9 9
0
3
3
9
2
5
4
6
2
4
9
5
0
8
2
4
1
5
1
2 5
9
0
0
3
1
2
9 9
0
6
3
6
8
8
5
0
4
6 8
2
H1 C
A
G
C
G
A
C
C
A
T
C
A
A
C
C
C
C
C
C C
A
A
C
G
A
G
T T
A
T
A
G
G
T
A
A
A
G G
G
2 H2 . G
A
. . . . . . C
. . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H3 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 H4 . . . . A
. . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H5 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . C
. . . . . . . . . . . . 1 H6 . . A
. . . . . . C
. . . . . . . T
T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 H7 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . 1 H8 . . . . . . . . . . . . . . . . T
T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A
A
1 H9 . . . . . G
. . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H10 . . A
. . . . T
. C
. . . . . . . T
T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H11 . . . . . . . A
. . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H12 T
. . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H13 . . . . . . . . . . . . . . . . T
T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H14 . . . . . . . . . C
. . . . . . . T
. . . . . . G
. . . . . . . . . . . . . . . 3 H15 . . . . . . . . G
. . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 H16 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . T
. . . . . . . C
. . . . . . . . . 1 H17 . . . . . . . . G
. . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . C
. . A
. 1 H18 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . T
. . . . . . . C
. . . . C
. . . . 1 H19 . . . . . . . . G
. . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . 2 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . 8 H21 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . C
. . . . 1 H22 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . C
. . . . . . 1 H23 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A
2 H24 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . A
. . . . . . . . 1 H25 . . . . . . T
. . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . A
1 H26 . . . . . . . . . . . . . . A
. . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 H27 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . C
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H28 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . G
. . . 2 H29 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . A
1 H30 . . . . . . . . . . . . . . . T
. T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 H31 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A
. 2 H32 . . . . . . . . . . A
. . . . . . T
. . . C
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H33 . . . . . . . . . . . . . . . T
. T
. . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . 1 H34 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . C
. . . . . . . . G
. . . . . 1 H35 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . 1 H36 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . 1 H37 . . . . . . . . . C
. . . . . . . T
T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 H38 . . . G
. . . . . C
. . . . . . . T
T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H39 . . A
. . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H40 . . A
. . . . . . C
. . . . . . . T
T T
. . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . 1 H41 . . . . . . . . . C
. . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H42 . . A
. . . . . . C
. . . . . . . T
T . . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . 1 H43 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . A
. . . . . . . . . . 1 H44 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . C
. . . . . . . . . . . 1 H45 . . . . . . . . . . . . G
. . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H46 . . . . . . . . . . . C
. . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H47 . . . . . . . . . . . C
. A
. . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H48 . . . . . . . T
. . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 H49 . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. . . . . . . . . . . . . . A
. . . . . . . 1
Nota: H = Haplótipos.
25
Tabela 4. Distribuição dos 49 haplótipos de P. erythrocephala em função das localidades.
Haplótipos ITU JAÚ ALE SAP AND PAR NEG AYU CUM IRU Total H1 2 - - - - - - - - - 2 H2 1 - - - - - - - - - 1 H3 15 11 14 14 17 17 1 32 23 9 153 H4 1 - - - - - - - - - 1 H5 1 - - - - - - - - - 1 H6 2 - - - - - 7 - 1 - 10 H7 1 - - - - - - - - - 1 H8 1 - - - - - - - - - 1 H9 1 - - - - - - - - - 1 H10 1 - - - - - - - - - 1 H11 1 - - - - - - - - - 1 H12 1 - - - - - - - - - 1 H13 1 - - - - - - - - - 1 H14 - 3 - - - - - - - - 3 H15 - 9 - - - - - - - - 9 H16 - 1 - - - - - - - - 1 H17 - 1 - - - - - - - - 1 H18 - 1 - - - - - - - - 1 H19 - 2 - - - - - - - - 2 H20 - 5 - - 1 2 - - - - 8 H21 - 1 - - - - - - - - 1 H22 - - 1 - - - - - - - 1 H23 - - 1 - - 1 - - - - 2 H24 - - 1 - - - - - - - 1 H25 - - 1 - - - - - - - 1 H26 - - 1 - 1 - - - - - 2 H27 - - - 1 - - - - - - 1 H28 - - - 2 - - - - - - 2 H29 - - - - 1 - - - - - 1 H30 - - - - 10 - - - - - 10 H31 - - - - 1 - - - - 1 2 H32 - - - - 1 - - - - - 1 H33 - - - - 1 - - - - - 1 H34 - - - - - 1 - - - - 1 H35 - - - - - 1 - - - - 1 H36 - - - - - 1 - - - - 1 H37 - - - - - - 5 - - - 5 H38 - - - - - - 1 - - - 1 H39 - - - - - - 1 - - - 1 H40 - - - - - - 1 - - - 1 H41 - - - - - - 1 - - - 1 H42 - - - - - - 1 - - - 1 H43 - - - - - - - 1 - - 1 H44 - - - - - - - 1 - - 1 H45 - - - - - - - - 1 - 1 H46 - - - - - - - - 1 - 1 H47 - - - - - - - - 1 - 1 H48 - - - - - - - - 1 - 1 H49 - - - - - - - - 1 - 1 Total 29 34 19 17 33 23 18 34 29 10 246
26
As análises de NCA definiram cinco níveis nos quais há a rejeição da hipótese nula da
não associação entre distância geográfica e divergência genética, foram os clados 2-3, 2-5, 3-
1, 3-3 e 4-1, mostrados na Figura 4. Os resultados da interpretação pela chave de inferência de
Templeton, indicaram, para os níveis 2-3 e 2-5, fluxo gênico restrito, mas com alguma
dispersão a longa distância. Um padrão de dispersão sobre áreas geográficas intermediárias
não ocupadas pela espécie também foi encontrado para o nível 2-3. Para os níveis 3-1 e 3-3
foi apontado fluxo gênico restrito com isolamento por distância. No nível mais elevado do
cladograma, o 4-1, a chave indicou colonização a longa distância com subseqüente
fragmentação, como mostra a Tabela 5.
27
Figura 4. Cladograma dos 49 haplótipos identificados em P. erythrocephala. Cada linha corresponde a um passo mutacional. As elipses menores representam os haplótipos não detectados. * Indica correlação significativa entre distância geográfica e divergência genética identificada nas análises de NCA.
28
Tabela 5. Análises de agrupamento de clados (NCA) para P. erythrocephala, mostrando os
valores das distâncias de clados (Dc), distâncias dos clados agrupados (Dn) e distâncias dos clados interiores versus os de ponta (IT). Apenas clados com permutações significantes (X2) para estrutura geográfica constam nesta tabela.
Nível
agrupado
Clados
inclusos
Localização
Dc Dn Valores
X2-P
Conclusão da chave de
inferência
118 Interior 0,0000*< 376,6667*<
1-3 Ponta 667,3333*> 605,9333*>
2-3
I-T -667,3333*<
-229,2667*<
0,0010
Fluxo gênico restrito, mas
com alguma dispersão a
longa distância sobre
áreas geográficas
intermediárias não
ocupadas pela espécie
1-7 Interior 556,6667 607,2727*>
1-6 Ponta 0,0000*< 385,3846*< 2-5
I-T 556,6667*> 221,8881*> 0,0270
Fluxo gênico restrito, mas
com alguma dispersão a
longa distância
2-1 Interior 782,3395 778,5344
2-2 Ponta 0,0000 647,7810
2-3 Ponta 534,8679*< 733,3815
2-6 Ponta 301,8182 781,6015 3-1
I-T 327,5489*> 44,2857 0,0000
Fluxo gênico restrito com
isolamento por distância
2-5 Interior 531,3636*> 398,9903
2-4 Ponta 349,4857 343,0357 3-3
I-T 181,8779 55,9546 0,0310
Fluxo gênico restrito com
isolamento por distância
3-1 Interior 782,0380 785,0721
3-2 Ponta 0,0000*< 611,6555*<
3-3 Ponta 421,3759*< 854,3398*> 4-1
I-T 522,7997 24,0725*>
0,0000
Colonização a longa
distância com
subseqüente fragmentação
Nota: Os valores significativamente menores ou maiores para Dc, Dn e I-T (Dc e Dn) estão indicados respectivamente por < (Pequeno) e > (Grande) e * indica o nível de significância P < 0,05. Os resultados foram interpretados utilizando a chave de inferências de Templeton (Templeton, 2005).
29
Os níveis de variabilidade genética estimados com base nos parâmetros genéticos e na
análise de polimorfismo de DNA estão sumariados na Tabela 6. A diversidade gênica (H)
total foi estimada em 0,608. Este valor é elevado quando comparado ao valor individual
encontrado para as localidades analisadas, que variou de 0,116 no rio Ayuanã, em Santa
Isabel do Rio Negro, a 0,813 no rio Jaú, no Parque Nacional do Jaú. A diversidade
nucleotídica ( ) observada quando reunidas todas as localidades amostradas foi de 0,0021
(0,21%) e variou de 0,0002 no rio Ayuanã a 0,0030 no rio Itu, em Barcelos. Estas estimativas
de polimorfismo genético indicam diferentes níveis de variabilidade genética ao longo da área
de distribuição desta espécie.
Os valores resultantes dos testes de neutralidade seletiva de mutações indicam que
algumas localidades não estão em equilíbrio genético com relação aos haplótipos do DNA
mitocondrial (Tabela 6). O Teste D de Tajima foi significativo (P < 0,05) para a localidade do
rio Cumicuri, município de Barcelos. Enquanto que Fs de Fu mostrou desvio significativo da
expectativa neutra das mutações em cinco localidades investigadas. Contudo, quando as
localidades são consideradas conjuntamente, os dois testes estatísticos indicam um
significante desequilíbrio genético. Ambos os testes são negativos quando há um excesso de
mutações recentes e valores negativos são interpretados como evidência de crescimento
populacional e/ou seleção (Tajima, 1989; Fu, 1997). Este padrão é frequentemente observado
em populações sofrendo rápida expansão demográfica.
30
Tabela 6. Parâmetros genéticos estimados para Podocnemis erythrocephala.
Populações
N S NH
H
D de
Tajima
Fs de Fu
NEG 18 6 8 0,797 ± 0,074 0,00265
-0,54150 -3,704
AYU 34 2 3 0,116 ± 0,074 0,00021
-1,49966 -2,516
CUM 29 8 7 0,377 ± 0,115 0,00112
-2,13647* -4,719*
ITU 29 14 13 0,736 ± 0,089 0,00307
-1,76555 -8,339*
IRU 10 1 2 0,200 ± 0,154 0,00036
-1,11173 -0,339
JAU 34 7 9 0,813 ± 0,041 0,00289
-0,20147 -2,824
PAR 23 6 6 0,458 ± 0,126 0,00109
-1,92926 -3,700*
AND 33 7 8 0,657 ± 0,066 0,00169
-1,32833 -4,076*
SAP 17 2 3 0,324 ± 0,136 0,00061
-1,06916 -1,038
ALE 19 6 6 0,468 ± 0,140 0,00131
-1,86971 -3,389*
Total 246
40 49 0,608 ± 0,037 0,00217
-2,34487* -28,964*
NOTA: * Nível de significância P < 0,005; N = Número de Indivíduos; S = Número de Sítios Polimórficos; NH = Número de Haplótipos; H = Diversidade Gênica; = Diversidade Nucleotídica (por sítio); ITU = Rio Itu, Barcelos; NEG = Rio Negro, São Gabriel da Cachoeira; JAU = Rio Jaú, Parque Nacional do Jaú; ALE = Igarapé Alema, Terra Santa; SAP = Lago Sapucuá, Oriximiná; AND = Rio Andirá, Barreirinha; PAR = Rio Paracatu, Nhamundá; AYU = Rio Ayuanã, Santa Isabel do Rio Negro; CUM = Rio Cumicuri, Barcelos e IRU = Igarapé Iruá, Parque Nacional do Viruá.
As análises de variância molecular revelaram alto grau de subdivisão populacional
( ST = 0,27931, P < 0,001). Os resultados mostraram que 27,93% da variância total ocorrem
entre as populações, entretanto a maior variação genética foi atribuída à variância dentro das
amostras populacionais (72,07%).
Alguns trechos da bacia do rio Negro compreendem regiões rochosas, caracterizadas
por um grande número de cachoeiras e corredeiras. Dentre as áreas analisadas as localidades
do rio Negro, município de São Gabriel da Cachoeira, e do rio Jaú, no Parque Nacional do
Jaú, estão situadas em regiões que incluem as condições ambientais descritas acima. Desta
maneira, a hipótese de isolamento por distância testada via teste de Mantel seguiu obedecendo
tal circunstância. Na primeira análise foram inseridas todas as populações amostradas. Os
valores não indicaram nenhuma correlação entre a divergência genética e a distância
geográfica das amostras populacionais (r = 0,1651, P = 0,261). Retirando as populações do rio
Negro e do rio do Jaú não foi observado um valor significativo para o coeficiente de
correlação (r = 0,0837, P = 0,325), e mesmo retirando a população do rio Andirá, município
31
de Barreirinha, única amostra localizada na margem direita do rio Amazonas, os valores do
coeficiente de correlação indicaram que não existe relação entre a variação genética e a
distribuição geográfica entre as localidades estudadas (r = 0,0736, P = 0,425).
Os valores obtidos das comparações múltiplas entre os pares de populações através do
índice ST foram utilizados para se construir uma árvore não enraizada com o objetivo de
ilustrar a distância genética entre as localidades (Figura 5) e estimar o fluxo gênico das
fêmeas. Os resultados foram usados para estimar o número efetivo de fêmeas migrantes por
geração entre as localidades de irapuca (Tabela 7). Todas as comparações foram significantes
quando envolveram a localidade do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira. A população do
rio Jaú, no Parque Nacional do Jaú, também se encontra geneticamente estruturada em relação
às outras localidades analisadas, exceto em relação ao lago Sapucuá, município de Oriximiná.
A localidade de Barreirinha não apresentou estrutura genética apenas em relação à do Igarapé
Alema, em Terra Santa, e do Igarapé Iruá, no Parque Nacional do Viruá.
Os valores do ST para as outras comparações de populações não foram significantes
após a correção de Bonferroni (P > 0,001) contrastando com os altos valores de Nm (número
de migrantes por geração). Este resultado indica que não existe estrutura genética entre as
populações e que o número de migrantes estabelece elevado fluxo gênico entre as amostras
populacionais estudadas.
32
Tabela 7. Estimativa indireta de fluxo gênico (Nm) (acima da diagonal e à direita) e diferenciação genética ( ST) (abaixo da diagonal e à esquerda) entre os pares de populações de P. erythrocephala.
NOTA: * Nível de significância P < 0,001 (após a correção de Bonferroni); ITU = Rio. Itu, Barcelos; NEG = Rio Negro, São Gabriel da Cachoeira; JAU = Rio Jaú, Parque Nacional do Jaú; ALE = Igarapé Alema, Terra Santa; SAP = Lago Sapucuá, Oriximiná; AND = Rio Andirá, Barreirinha; PAR = Rio Paracatu, Nhamundá; AYU = Rio Ayuanã, Santa Isabel do Rio Negro; CUM = Rio Cumicuri, Barcelos e IRU = Igarapé Iruá, Parque Nacional do Viruá.
Populações NEG AYU CUM ITU IRU JAÚ PAR AND SAP ALE
NEG – 0.1601 0.2871 0.6732 0.2933 0.4357 0.2765 0.2982 0.2574 0.3059
AYU 0.7573*
– 46.2123
7.7026 22.7325
1.8301 20.9718
2.3520 8.8940 12.7330
CUM 0.6351*
0.0107 – 27.6710
8 2.5152 47.9897
3.5127 40.4649
35.3111
ITU 0.4261*
0.0609*
0.0177 – 8 3.1754 13.0483
4.0773 14.6338
16.3744
IRU 0.6302*
0.0215 -0.0229 -0.0049 – 3.6471 8 4.9648 32.8323
8
JAÚ 0.5343*
0.2145*
0.1658*
0.1360*
0.1205*
– 3.4330 2.2426 2.6625 3.2964
PAR 0.6438*
0.0232 0.0103 0.0369 -0.0162 0.1271*
– 4.2785 26.5339
8
AND 0.6263*
0.1753*
0.1246*
0.1092*
0.0914 0.1823*
0.1046*
– 3.3804 4.5508
SAP 0.6601*
0.0532 0.0122 0.0330 0.0150 0.1581 0.0185 0.1288*
– 22.6888
ALE 0.6204*
0.0377 0.0139 0.0296 -0.0129 0.1317*
-0.0122 0.0989 0.0215 –
33
Figura 5. Árvore filogenética com base no método Neighbor Joining sem raiz utilizando o índice de diferenciação genética ( ST) das comparações múltiplas entre os pares de populações de P. erythrocephala.
NOTA: ITU = Rio Itu, Barcelos; NEG = Rio Negro, São Gabriel da Cachoeira; JAU = Rio Jaú, Parque Nacional do Jaú; ALE = Igarapé Alema, Terra Santa; SAP = Lago Sapucuá, Oriximiná; AND = Rio Andirá, Barreirinha; PAR = Rio Paracatu, Nhamundá; AYU = Rio Ayuanã, Santa Isabel do Rio Negro; CUM = Rio Cumicuri, Barcelos e IRU = Igarapé Iruá, Parque Nacional do Viruá.
34
As estimativas das distâncias genéticas entre os pares de populações analisados são
mostrados na Tabela 8. Os valores resultantes da análise de distância genética concordam com
a diferenciação genética da população do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira, devido à
atuação de cachoeiras e corredeiras como fatores limitantes ao fluxo gênico.
Tabela 8. Distâncias genéticas entre as populações de P. erythrocephala com base no modelo de Kimura 2-parâmetros.
Populações
NEG AYU CUM
ITU IRU JAU PAR AND SAP ALE
NEG –
AYU 0,005
–
CUM 0,005
0,001
–
ITU 0,005
0,002
0,002
–
IRU 0,005
0,000
0,001
0,002
–
JAU 0,006
0,002
0,002
0,003
0,002
–
PAR 0,005
0,001
0,001
0,002
0,001
0,002
–
AND 0,006
0,001
0,002
0,003
0,002
0,003
0,002
–
SAP 0,005
0,000
0,001
0,002
0,001
0,002
0,001
0,002
–
ALE 0,005
0,001
0,001
0,002
0,001
0,002
0,001
0,002
0,001
–
NOTA: ITU = Rio Itu, Barcelos; NEG = Rio Negro, São Gabriel da Cachoeira; JAU = Rio Jaú, Parque Nacional do Jaú; ALE = Igarapé Alema, Terra Santa; SAP = Lago Sapucuá, Oriximiná; AND = Rio Andirá, Barreirinha; PAR = Rio Paracatu, Nhamundá; AYU = Rio Ayuanã, Santa Isabel do Rio Negro; CUM = Rio Cumicuri, Barcelos e IRU = Igarapé Iruá, Parque Nacional do Viruá.
35
5. DISCUSSÃO
5.1 Diversidade genética
Para responder questões ecológicas o enfoque genético tornou-se, na última década,
uma das ferramentas mais eficiente, poderosa e flexível, o que permitiu que fosse amplamente
empregado. Marcadores genéticos, tais como as aloenzimas, o DNA microssatélite e o
mitocondrial podem ser utilizados para estimar diversos parâmetros ecológicos como, por
exemplo, taxa de migração, tamanho populacional, parentesco, redução populacional, e etc.
(Selkoe & Toonen, 2006). Segmentos mitocondriais têm emergido como uma importante
escolha para estes estudos por que podem medir o atual nível de fluxo gênico entre
populações e espécies, distinguir taxas de migração através de panmixia e estimar a
variabilidade genética intra e interpopulacionais, característica de extrema importância para o
manejo e a conservação de espécies ameaçadas.
Sites et al. (1999) e Pearse et al. (2006) utilizaram o marcador microssatélite e o
mitocondrial para caracterizar geneticamente populações de P. expansa. Os resultados
indicaram elevados índices de diversidade genética com semelhantes níveis de
heterozigosidade esperada (HE) (variando de 0,65 a 0,85 e 0,62 a 0,84, respectivamente), além
de um número considerável de alelos encontrados para cada microssatélite por população (3 a
29 e 4,4 a 8,7, respectivamente). Estes níveis de variabilidade genética foram corroborados
pelos valores resultantes da análise da região controle mitocondrial. Pearse et al. (2006)
observaram diversidade haplotípica (H) média de 0,65 e diversidade nucleotídica ( ) de
0,0025 entre as populações com valores semelhantes ao encontrado por Sites et al. (1999) em
uma das duas populações investigadas ( = 0,0032).
Bock et al. (2001) utilizaram loci aloenzimáticos para estudar a variabilidade genética
das espécies P. unifilis e P. expansa em diferentes áreas de desova localizadas no Peru, na
Colômbia e no Brasil. Verificaram que as amostras populacionais de tracajá apresentam
índices mais elevados de polimorfismo genético que as amostras populacionais de tartaruga-
da-Amazônia. A alta variabilidade genética encontrada para o tracajá neste estudo, por meio
de análises eletroforéticas é congruente com os resultados encontrados por Viana (2005)
analisando seqüências da região controle do DNA mitocondrial também de P. unifilis. Viana
(2005) amostrou cinco localidades da bacia Amazônica, duas das quais foram amostradas no
presente estudo. Outros estudos em genética de populações com base em DNA mitocondrial
36
mostraram baixos níveis de variabilidade genética em P. sextuberculata utilizando a região
controle (Viana, 2005) e um gene codificador de proteína (ND1) (Silva, 2002). O resultado
encontrado por Silva (2002) pode ser devido à pressão de seleção a que as regiões
codificantes estão sujeitas.
No presente trabalho, os consideráveis índices de diversidade genética encontrados em
populações de irapuca são semelhantes aos resultados de Viana (2005). Comparado ao estudo
anteriormente realizado para P. erythrocephala o padrão de polimorfismo encontrado nas
populações foi de elevada diversidade gênica e de baixa diversidade nucleotídica.
Os índices de diversidade genética e os valores significativamente negativos dos testes
estatísticos D de Tajima e Fs de Fu (P < 0,05) encontrados nas localidades dos rios Cumicuri
e Itu, em Barcelos, rio Paracatu, em Nhamundá, e no lago Sapucuá, em Oriximiná, indicam
que estas populações podem estar passando ou passaram por um recente crescimento
populacional.
A elevada diversidade gênica e baixa diversidade nucleotídica destas localidades
constituem um padrão esperado em uma população em crescimento, após um período de
pequeno tamanho efetivo populacional (Grant & Bowen, 1998). O considerável número de
haplótipos raros encontrados nestas localidades (Tabela 4) apóia esta hipótese, uma vez que
um rápido crescimento populacional aumenta a retenção de novas mutações (Avise et al.,
1984; Rogers & Harpending, 1987). Outro exemplo, segundo Grant & Bowen (1998), seria a
predominância de um haplótipo central encontrado em todas as localidades e a partir do qual
um ou mais passos mutacionais originam novos haplótipos (arranjo em estrela do cladograma
dos haplótipos) (Figura 4). Segundo Ramos-Onsins & Rosas (2002) o Teste Fs de Fu é
bastante sensível na detecção de processos históricos de expansão populacional e testa a
influência do tamanho amostral na análise. Diferenças no grau de sensibilidade destes testes
estatísticos podem ser observadas na Tabela 6. As populações que não tiveram valores
significativos para o Teste D de Tajima, tiveram sua expansão detectada pelo Fs de Fu (rio
Itu, rio Paracatu, rio Andirá e Igarapé Alema).
Uma outra explicação para estes valores significativos seria atribuir estes desvios ao
efeito da seleção. Ao analisar o conteúdo e mesmo o arranjo em termos de genes do genoma
mitocondrial, a região controle aparece fisicamente ligada a regiões codificadoras sujeitas aos
efeitos da seleção. Este fator poderia, portanto, justificar os valores significativos detectados a
partir dos Testes D de Tajima e Fs de Fu. Contudo, o fato da região controle não ser uma
região codificante atua de modo contrário e diminui consideravelmente a possibilidade destes
desvios serem atribuídos aos efeitos da seleção.
37
A detecção de expansão observada em algumas populações de irapuca deve ser vista
com cautela e confirmadas através de marcadores mais sensíveis como os de microssatélites.
5.2 Estrutura populacional
Os resultados da análise de variância molecular mostraram que grande parte da
variação genética ocorre dentro das localidades amostradas. Contudo, os significantes valores
de ST de algumas comparações entre localidades e o alto grau de estrutura observada pelos
resultados de AMOVA sugerem que algumas localidades encontram-se geneticamente
diferenciadas. O valor referente ao índice de diferenciação genética entre as dez amostras
populacionais estudadas ( ST = 0,27931) pode ser comparado com outras espécies do gênero
e discutido como segue: (i) é menor que o observado entre subpopulações geograficamente
distintas de Podocnemis expansa amostradas numa ampla área ao longo de sua distribuição na
região amazônica ( ST = 0,34; Pearse et al., 2006); (ii) é similar ao encontrado entre
populações de P. unifilis por Viana (2005). Este estudo incluiu duas localidades (lago
Sapucuá, em Oriximiná, e Igarapé Alema, em Terra Santa) para as quais as análises
populacionais de irapuca também foram conduzidas ( ST variou de 0,0149 a 0,4403); (iii) é
muito maior que o obtido por Silva (2002) entre populações de P. sextuberculata provenientes
da Reserva Biológica Abufari, Reserva de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá e Igarapé
Alema, município de Terra Santa ( ST = 0,023).
Em situações onde há estrutura filogeográfica e cada haplótipo difere muito de todos
os outros haplótipos, caso das comparações significantes envolvendo as localidades do rio
Negro, em São Gabriel da Cachoeira, do rio Jaú, no Parque Nacional do Jaú, e do rio Andirá,
em Barreirinha, a diferença média entre os haplótipos dentro das localidades difere da
diferença média entre localidades, mesmo se não existem diferenças na freqüência haplotípica
entre localidades. Sob esta circunstância a escolha de uma análise baseada na distância pode
ajudar a resolver a estrutura genética (O’Corry-Crowe et al., 1997).
Os resultados das comparações múltiplas entre os pares de populações mostraram altos
níveis de fluxo gênico, indicando um elevado número de fêmeas migrantes por geração entre
as populações de irapuca (Tabela 7). Segundo Slatkin (1987) o número de migrantes por
geração maior do que 1 indica que o fluxo gênico é suficiente para manter as freqüências
gênicas relativamente homogêneas e minimizaria a diferenciação causada pela deriva
genética. De acordo com nossas análises, algumas populações de P. erythrocephala compõem
38
uma grande população panmítica e fazem parte de um mesmo estoque que ocorre ao longo da
Amazônia brasileira (Figura 5). Entretanto, nossos dados também corroboram a existência de
estoques geneticamente distintos dentro da bacia Amazônica baseado no alto grau de estrutura
genética observado nas populações do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira, do rio Jaú, no
Parque Nacional do Jaú, e do rio Andirá, em Barreirinha.
5.3. Filogeografia
5.3.1. Barreiras geográficas ao fluxo gênico
Os padrões biogeográficos atuais são fenômenos biológicos históricos importantes
para suporte à construção de narrativas sobre cenários evolutivos que originaram a fauna e a
flora amazônica (Vieira et al., 2007). Várias hipóteses têm sido propostas para explicar a
diversificação na Amazônia, incluindo especiação alopátrica via barreiras fluviais (Wallace,
1852 apud Funk et al., 2007), refúgios de florestas (Haffer, 1969, 1997), incursões marinhas
(Nores, 1999; Webb, 1995), formação de cadeias de montanhas (Räsänan et al., 1990), ou
mudanças climáticas (Bush, 1994; Colinvaux et al., 1996; Colinvaux, 1998), assim como
especiação parapátrica causada por seleção divergente ao longo de gradientes ecológicos
(Endler, 1977).
O presente estudo testou a hipótese de que existem populações de P. erythrocephala
geneticamente estruturadas como um efeito da estrutura geomorfológica (isto é, cachoeiras e
corredeiras) da drenagem do rio Negro e da provável atuação do rio Amazonas como barreiras
geográficas.
Os valores do índice de diferenciação genética ST das comparações múltiplas entre as
populações do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira, do rio Jaú, no Parque Nacional do
Jaú, e do rio Andirá, em Barreirinha, e os demais pares de populações, foram significativos (P
< 0,001). Isto demonstra que estas populações são distintas entre si, ou seja, estão
diferenciadas geneticamente. No entanto, o isolamento por distância não é o fator responsável
para explicar este padrão, uma vez que não houve correlação entre a variação genética e a
distância geográfica nas três situações propostas anteriormente. Neste caso, a diferenciação
genética encontrada pode ser explicada pelas características ambientais dos locais amostrados
e fornece considerável suporte para a hipótese das barreiras ao fluxo gênico.
39
5.3.1.1. Rios como barreiras
A hipótese de rios como barreira sugere que os grandes rios amazônicos isolam
populações das áreas de terra firme e, desse modo, limitam o fluxo gênico e permitem que as
populações evoluam via seleção divergente/ ou deriva (Wallace, 1852; Sick, 1967;
Capparella, 1988). Quatro suposições derivadas desta hipótese podem ser testadas usando o
enfoque filogenético ou de genética de populações: (i) populações reciprocamente
monofiléticas para os haplótipos do DNA mitocondrial ocorrerão em margens opostas dos
grandes rios amazônicos após ter decorrido tempo suficiente para a separação das linhagens;
(ii) a divergência genética entre populações será positivamente correlacionada com a presença
de rios separando-as mesmo depois de removidos os efeitos da distância geográfica; (iii) a
divergência genética entre populações separadas por um rio será maior na região de
desembocadura do que na cabeceira; e (iv) os rios atuarão como áreas de diferenciação
primária ao invés de contato secundário das linhagens (Funk et al., 2007).
Evidências para a hipótese de rios como barreira são variáveis. Funk et al. (2007)
relacionam alguns estudos realizados com pássaros e borboletas cujos resultados indicam que
alguns rios da região amazônica atuam como importantes barreiras.
Os resultados encontrados no presente estudo também fornecem algum suporte à
hipótese de rios como barreiras na diferenciação genética de uma das dez amostras
populacionais de P. erythrocephala investigadas na região Amazônica. A população do rio
Andirá, município de Barreirinha, se mostrou geneticamente estruturada em relação às
amostras populacionais analisadas, exceto quando as comparações envolveram as populações
do Igarapé Alema, município de Terra Santa, e do Igarapé Iruá, no Parque Nacional do Viruá.
Esta população constitui o único local amostrado em um afluente da margem direita do rio
Amazonas e a diferenciação genética pode ser resultado da atuação do grande rio Amazonas
como barreira geográfica limitando o intercâmbio genético desta com as outras amostras
populacionais.
Funk et al. (2007) testaram duas hipóteses para explicar a distribuição biogeográfica
de uma espécie de anfíbio Physalaemus petersi em florestas de terra firme da região
Amazônica: a hipótese de rio e de gradiente altitudinal como barreiras. Pouca evidência foi
encontrada para a segunda hipótese, mas moderado suporte foi obtido para a hipótese de rio
como barreira em um dos três sistemas fluviais investigados (rio Napo, no Equador; rio Juruá,
no Brasil; e rio Madre de Dios, entre o Peru e a Bolívia). O rio Madre de Dios definiu dois
40
clados divergentes: o primeiro clado consistia em uma população do Peru e outra do Brasil, e
o segundo clado incluía quatro localidades do Peru e uma da Bolívia. As análises filogenéticas
indicaram uma divergência entre as populações do Peru e da Bolívia sugerindo que o rio
Madre de Dios atua como uma barreira ao fluxo gênico entre as populações inseridas neste
clado. Segundo Lampert et al. (2003), o rio Chagres, no Panamá, também atua como barreira
ao fluxo gênico entre populações de P. pustulosus, espécie irmã de P. petersi (Ron et al.,
2006).
Em uma espécie de macaco, Saguinus niger, foi observada uma alta divergência entre
as populações situadas nas margens opostas do rio Tocantins (Valinoto et al., 2006). As
análises filogenéticas sugerem que estas populações estão isoladas há muito tempo e,
conseqüentemente, estão em processo de diferenciação devido ao isolamento geográfico
também favorecido pela atuação do rio Tocantins como barreira física.
Outros autores também observaram uma relação positiva quanto à filogeografia de
borboletas e outros mamíferos e a presença de rios entre as populações analisadas (ver Funk et
al., 2007 para maiores detalhes).
A ausência de correlação entre ST e a distância geográfica pode ser característica para
as populações de irapuca baseada nos resultados encontrados neste estudo. Isolamento por
distância também não tem sido relatado em análises populacionais para as outras espécies de
quelônios do gênero Podocnemis (Viana, 2005; Pearse et al., 2006; Vargas-Ramírez et al.,
2007). Alguns estudos sugerem uma provável influência da distância geográfica sobre o
padrão de variabilidade genética em populações de P. expansa e P. unifilis (Sites et al., 1999;
Bock et al., 2001). Contudo, este resultado pode ser devido à ausência de pontos de coleta
abrangendo uma ampla área geográfica bem como entre as principais bacias fluviais
adjacentes. Desta forma, os resultados encontrados no presente estudo são congruentes com
outros trabalhos envolvendo as demais espécies do gênero.
Esta ausência de correlação entre a divergência genética e a distância geográfica pode
ser destacada também pela diferenciação genética observada entre a população do rio Andirá,
em Barreirinha, em relação à população do rio Paracatu, em Nhamundá, e do lago Sapucuá,
em Oriximiná. Estas localidades são relativamente próximas geograficamente. O resultado
apóia a hipótese do rio Amazonas como barreira geográfica, uma vez que os resultados do
teste de Mantel não mostraram valores significativos associados à distância geográfica nestas
localidades (r = 0,0736, P = 0,425).
41
5.3.1.2. Cachoeiras e corredeiras como barreiras
A Amazônia representa uma região com índice considerável de quelônios de água
doce, onde ocorrem, por exemplo, 14 das 61 espécies encontradas na América do Sul (Vogt,
2001). Diversos estudos moleculares investigando o padrão de distribuição geográfica das
espécies ao longo dos sistemas de rios têm sido desenvolvidos, principalmente para os
quelônios do gênero Podocnemis (Sites et al., 1999; Bock et al., 2001; Silva, 2002; Viana,
2005; Pearse et al., 2006; Vargas-Ramírez, 2007).
O rio Negro nasce com o nome de rio Guaínia na Serra de Tunaí, no Planalto da
Colômbia em altitudes de cerca de 1.660 metros. A maior parte do rio Negro possui areia de
sílice nas orlas e águas negras, mas mostram uma boa qualidade de nutrientes nos lagos de
floresta, com a presença abundante de algas filamentosas (Vogt, 2001). Na região do alto e
médio rio Negro encontramos numerosas cachoeiras, corredeiras e lagos com afloramentos
rochosos. Existem cachoeiras que são permanentes, com declives mais íngremes que
impedem a passagem de algumas espécies animais (Best & Da Silva, 1989a,b; Banguera-
Hinestroza et al., 2002). Outras apresentam menores declives e permanecem submersas em
épocas de cheia.
O nível das águas dos rios depende da estação do ano. Segundo Vogt (2001) entre o
ponto mais baixo da seca e o mais alto da cheia, os níveis variam de seis a oito metros.
Durante o período de águas baixas as cachoeiras e corredeiras emergem dificultando e/ou
impedindo o deslocamento da fauna aquática da região. Estas condições ambientais estão
presentes no entorno das amostras populacionais do rio Negro, município de São Gabriel da
Cachoeira, e do rio Jaú, no Parque Nacional do Jaú, e parecem constituir barreiras físicas
eficientes limitando o fluxo gênico de indivíduos de P. erythrocephala entre estas e as demais
localidades.
Diversos estudos comparativos de organismos aquáticos e terrestres têm investigado
os princípios e processos que determinam as distribuições geográficas sobre as linhagens de
genes, incluindo aquelas em nível intra-específico, o mesmo desenvolvido neste trabalho.
Recentemente foi demonstrado que a atual distribuição geográfica de alguns grupos de
organismos aquáticos na bacia Amazônica estava condicionada a paleoeventos que moldaram
a atual geomorfologia da bacia (Magalhães & Collart, 1997). Para a espécie Mylesinus
paraschomburgkii, um peixe serrasalmídeo habitante de áreas de corredeiras, foi demonstrado
que as populações dos rios Uatumã, Trombetas, Jari e Araguari estão isoladas considerando o
42
conjunto de informações morfológicas (Jégu et al., 1992), parasitológicas (Belmont-Jégu,
1992; Thatcher & Jégu, 1996) e filogeográficas (Porto et al., 1997). Porém, se por um lado
detectaram-se importantes diferenças interdrenagens, pouca ou nenhuma diferença foi
encontrada entre amostras de uma mesma drenagem demonstrando que essa espécie possui
reduzido fluxo gênico apesar da sua especificidade de habitat (Porto et al., 1997).
Da Silva (1994) comenta que a distribuição de botos contrasta com uma série de
barreiras geográficas. Populações dos rios Amazonas e Beni-Mamoré (Brasil e Bolívia) são
separadas por corredeiras no alto rio Madeira entre Porto Velho e Guajará-Mirim. A conexão
entre populações do rio Amazonas e do Orinoco é facilitada durante o período de águas altas
(cheia) quando é estabelecida comunicação entre os rios Inírida e Uapues e pelo Canal do
Casiquiari, que alcança o rio Negro, um tributário do Amazonas. Contudo, o Canal do
Casiquiari é considerado uma barreira para Inia geoffrensis devido ao pH ácido da água e a
baixa produtividade de biomassa. Outras potenciais barreiras são as cachoeiras e corredeiras
do rio Negro e do rio Orinoco entre Sumariapo e Puerto Ayacucho (Best e Da Silva, 1989a,b).
Banguera-Hinestroza et al. (2002) utilizaram dados da região controle mitocondrial
para caracterizar o nível de diferenciação genética de botos da Amazônia brasileira e
boliviana e da bacia do rio Orinoco, entre a Colômbia e a Venezuela. Os resultados
suportaram a monofilia do gênero Inia na Bolívia e agruparam os haplótipos da bacia
Amazônia brasileira e do rio Orinoco. Isto indica que o trecho de 200 quilômetros de
corredeiras do rio Madeira-Mamoré forma uma barreira ao movimento de Inia da Bolívia.
Segundo os autores, especiação alopátrica seria uma explicação razoável que suporta os
resultados obtidos neste estudo e aqueles encontrados por Da Silva (1994).
O padrão encontrado nas populações de Inia foi semelhante ao observado em
populações de P. expansa por Pearse et al. (2006). Neste estudo duas amostras populacionais
do rio Madeira-Guaporé estão agrupadas com relação aos loci microssatélites e compartilham
um haplótipo que não foi encontrado fora desta bacia. As duas populações também estão
localizadas no alto rio Madeira na porção anterior às corredeiras que parecem atuar como uma
substancial barreira ao fluxo gênico para P. expansa. Todavia, estas localidades também
compartilham com outras populações amostradas na região amazônica dois haplótipos mais
freqüentes, sugerindo uma estruturação relativamente recente destas duas populações.
No presente trabalho, os resultados de NCA indicaram que uma significante
associação em quatro níveis do cladograma dos haplótipos e sua localização geográfica
resulta de fluxo gênico restrito em algum nível (níveis 2-3, 2-5, 3-1 e 3-3). Viana (2005)
também encontrou rejeição da hipótese nula da não associação entre a distância geográfica e a
43
divergência genética em uma população de P. erythrocephala (rio Jaú, no Parque Nacional do
Jaú) amostrada na bacia Amazônica.
Os dados provenientes da análise de Neighbor Joining baseada nos valores do índice
de diferenciação genética ST indicam que há barreiras impedindo o fluxo gênico entre as
populações do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira, e do rio Jaú, no Parque Nacional do
Jaú, e as demais amostras populacionais. A distância genética entre os pares de populações,
baseada no comprimento dos ramos da árvore, é bastante elevada, principalmente para a
população do rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira. Os valores de distância genética das
comparações múltiplas envolvendo esta população também corroboram este resultado pelo
fato de apresentar maiores diferenciações genéticas, de 0,5 a 0,6 % (Tabela 8).
Esta subdivisão genética detectada por três diferentes métodos de análises, AMOVA,
ST e NCA, reforçam a importância das cachoeiras e corredeiras da bacia do rio Negro para a
estrutura genética encontrada nas duas populações citadas.
5.3.1.3. Outras barreiras geomorfológicas
Os efeitos que outras estruturas geomorfológicas exercem sobre a variabilidade
genética intrapopulacional e o fluxo gênico entre populações também têm sido relatados em
estudos envolvendo a filogeografia de inúmeras espécies animais.
Carlsson et al. (2001) investigaram a influência da estrutura geomorfológica do rio
Indalsälven, que drena para o mar Báltico, sobre a diversidade genética das populações de
Salmo trutta, a truta marrom. Os resultados indicaram que o entroncamento de vários lagos, a
presença de corredeiras e de muitos afluentes ao longo do rio têm forte influência na estrutura
genética das populações desta espécie. Contudo, as cachoeiras parecem desempenhar maior
impacto na diferenciação das populações, reduzindo o fluxo gênico intrabacia fluvial. Este
resultado é semelhante ao encontrado por Carlsson et al. (1999), onde o aparente isolamento
por distância identificado entre populações de Salmo trutta do rio Norwegian provavelmente
refletiu a presença de um tributário na porção inferior e de cachoeiras na região de cabeceira
deste rio ao invés da distância geográfica por si. Observações de Carlsson et al. (1999)
suportam estes argumentos demonstrando a importância da estrutura geomorfológica para o
fluxo gênico entre populações.
Spinks & Shaffer (2005) ao caracterizar a estrutura populacional de Emys marmorata
do sul da Califórnia, também tiveram a oportunidade de testar a hipótese de que a paisagem
44
topográfica pode desempenhar um papel tão importante quanto à história de vida na
diferenciação das populações desta tartaruga. Os resultados foram congruentes ao padrão
encontrado em estudos recentes envolvendo outros grupos de organismos aquáticos e
terrestres. Os valores resultantes das comparações múltiplas entre os pares de populações
indicaram que as Montanhas Tehachapi/Transverse Range funcionam como uma importante
barreira biogeográfica ao longo da costa do Pacífico na América do Norte (Calsbeek et al.,
2003).
Na região Amazônica, Pearse et al. (2006) verificaram que cinco amostras
populacionais de P. expansa do rio Araguaia formaram um grupo diferenciado em relação às
outras populações baseado em análises do DNA microssatélite, e apresentaram um haplótipo
mitocondrial quase fixado, raramente encontrado em outro lugar. Segundo os autores a
posição do rio Araguaia próximo à foz do rio Amazonas sugere que a divergência destas
populações pode ter originado no Mioceno a partir da separação entre a pequena drenagem
proto-Amazônia, e a drenagem Amazônia-Orinoco do centro-oeste que drenava em direção ao
norte para o Caribe (Hamilton et al., submetido apud Pearse et al., 2006). A metade separando
a drenagem paleo-Amazônia do Atlântico da paleo-Caribenha centro-oeste pode ter estado
presente entre 20 a 10 milhões de anos, e ter sido quebrada há cerca de 10 a 9 milhões de anos
quando a atual drenagem transcontinental da bacia Amazônica foi estabelecida (Hamilton et
al., submetido apud Pearse et al., 2006). Por esta época, P. expansa pode ter colonizado esta
bacia e então diferenciado e isolado devido às subseqüentes incursões marinhas do Plioceno-
Pleistoceno (Nores, 2004), durante as quais o alto nível da água do mar pode ter separado o
rio Araguaia do rio Amazonas.
A origem e manutenção das sucessivas paisagens da Amazônia ao longo do tempo
geológico resultaram dos principais processos ecológicos e fatores históricos que culminaram
com o padrão atual de diversidade biológica da região (Vieira et al., 2007).
Segundo Junk (1983) e Vieira et al. (2007) sob o domínio de um sistema climático
preponderantemente tropical, desenvolveram-se sucessivas transformações de ecossistemas,
principalmente influenciadas por câmbios climáticos e, secundariamente, por eventos
geológicos; estes últimos responsáveis por rearranjos sucessivos de leitos de rios e
deslocamentos de blocos continentais.
Eventos demográficos históricos parecem ter desempenhado papel importante na
dinâmica populacional de P. erythrocephala. No complexo arranjo espacial de biomas no
domínio biogeográfico amazônico as estruturas geomorfológicas (cachoeiras e corredeiras)
dos sistemas fluviais investigados neste estudo foram inseridas. Os eventos geológicos que
45
culminaram na formação destes elementos geográficos resultaram numa possível
fragmentação das populações de irapuca na região segundo a análise de NCA. Estes
acontecimentos reforçam a hipótese de que tais estruturas geomorfológicas (cachoeiras e
corredeiras da bacia do rio Negro) e o rio Amazonas representam barreiras geográficas
históricas ao fluxo gênico entre as populações de P. erythrocephala.
5.3.2. Controvérsias da NCA nas análises filogeográficas
A análise de clados agrupados (NCA) tornou-se uma das mais poderosas ferramentas
utilizadas na área da filogeografia intra-específica (Petit, 2008; Templeton, 2008). Apenas em
Agosto de 2007, houve cerca de 1600 citações do artigo original de NCA, e aproximadamente
20% dos estudos em filogeografia fizeram uso deste método, demonstrando o seu amplo
emprego neste campo (Petit, 2008). Contudo, nos últimos anos, o uso da chave de inferência
da NCA para inferir história populacional tem recebido críticas.
Em recente artigo publicado na revista Molecular Ecology, Petit (2008) especula que
três trabalhos (Knowles & Maddison, 2002; Petit & Grivet, 2002; Panchal & Beaumont,
2007) corroboram de modo concludente a baixa robustez da análise de clados agrupados para
distinguir eventos históricos.
A NCA tenta distinguir entre diferentes processos históricos que podem ter
influenciado a distribuição dos haplótipos ou linhagens relativas aos clados de nível mais alto.
Isto inclui testes de permutação da distribuição espacial dessas linhagens e um protocolo para
a inferência dos processos históricos envolvidos no estabelecimento da estrutura
filogeográfica observada (baseada em uma chave de inferência) (Petit, 2008).
Templeton (2002a) menciona que as críticas de Petit & Grivet (2002) estão
fundamentadas em erros de compreensão e representação da NCA, e que os problemas
relativos à implementação prática dos testes de permutação usados para avaliar os dados, uma
situação reconhecida como criadora de erros já havia sido identificada por Templeton (1998).
Segundo Templeton (2002a), nesta situação a chave de inferência leva a falsos negativos
(Templeton, 1998), e não a falsos positivos como levantado por Petit (2008) (Templeton,
2008).
Falsos positivos têm sido avaliados na NCA a partir de controles positivos: análises de
dados reais com um evento conhecido. Templeton (2004b) habilitou a NCA com 150
expectativas prévias; provavelmente a mais completa série de controles positivos já usados
46
para validar um procedimento em genética evolutiva, e certamente em filogeografia intra-
específica (Templeton, 2008).
Os 150 controles positivos incluem elevado número de organismos, distribuição
espacial, e esquemas de amostragem, mas todos compartilham duas características: ambos são
eventos evolutivos e esquemas de amostragem reais. Para contestar a condição de análise
descrita acima, Petit (2008) cita dois trabalhos (Knowles & Maddison, 2002; Panchal &
Beaumont, 2007), que descrevem um único cenário evolutivo artificial com um esquema de
amostragem também artificial (Templeton, 2008). O primeiro cenário proposto foi de
microvicariância no qual cada deme local estaria isolada (Knowles & Maddison, 2002).
Segundo Templeton (2008) este tipo de evento foi excluído da NCA (p. 773, Templeton et al.,
1995), o que o torna irrelevante a NCA. Knowles & Maddison (2002) assumem amostragem
exaustiva de todas as populações. Contudo, nenhuma das séries de dados inseridas no robusto
estudo de validação de Templeton (2004b) requer tal amostragem exaustiva. Os resultados de
Knowles & Maddison (2002) foram novamente analisados sem a suposição desta amostragem
exaustiva. A porcentagem de falsos positivos caiu de 75-80% para 18% (Templeton, 2004b),
mostrando que a alta taxa de falsos positivos é um artefato de uma suposição irreal
(Templeton, 2008).
Panchal & Beaumont (2007) simularam uma população panmítica e encontraram 76%
de falsos positivos. A análise de clados agrupados não é aplicada a uma população panmítica,
uma vez que esta situação não é relevante para as análises de fundo filogeográfico relativas à
NCA (Templeton, dados não publicados). Templeton (2008) descrevem três potenciais fontes
da alta porcentagem de falsos positivos diagnosticada no estudo de Panchal & Beaumont
(2007): (i) suposição irreal em suas simulações (como aconteceu no trabalho de Knowles &
Maddison); (ii) falha na interpretação da NCA, e (iii) falha na versão original da NCA. O
desempenho da NCA com os 150 controles positivos envolvem apenas a terceira causa;
portanto, se a especulação feita por Petit está correta e a falha na versão original da NCA é o
único fator responsável pela alta taxa de falsos positivos observada, esta porcentagem seria
homogênea entre as duas análises (causas i e ii). Templeton (2008) demonstrou que a alta taxa
de falsos positivos identificada por Panchal & Beaumont (2007) é devido a erros durante os
procedimentos de simulação e/ ou implementação da NCA por estes autores.
Embora a taxa de falsos positivos da NCA (Templeton, 1998, 2004b) não seja tão alta
quanto àquela suposta por Petit (2008), ela ainda excede o nível nominal de 5% para pelo
menos alguns tipos de inferência, como, por exemplo, expansão geográfica (Templeton,
2004b).
47
Segundo Garrick et al. (2008) o procedimento de validação cruzada desenvolvido por
Templeton (2002b, 2004a,b) para múltiplos loci independentes, somado a avaliação de
análises complementares, e/ ou expectativas prévias, deve pelo menos em parte – talvez
consideravelmente – responder a alta taxa de falsos positivos mencionada nos estudos de
Knowles & Maddison (2002) e Panchal & Beaumont (2007). Contudo, Templeton (2008)
menciona que esta validação cruzada da inferência da NCA além de reduzir a porcentagem de
falsos positivos e de falsos negativos também fornece algum suporte para testar hipóteses
filogeográficas específicas.
A NCA é o único método de análise filogeográfica que tem sido validado por uma
sólida série de dados de controles positivos que envolvem um elevado número de espécies,
escala geográfica, e esquemas de amostragem. Petit & Grivet (2002) expôs uma situação
conhecida para gerar falsos negativos, e não falsos positivos como foi mencionado. O estudo
de Knowles & Maddison (2002) gerou uma alta taxa de falsos positivos como artefato de uma
suposição de amostragem irreal para uma situação irrelevante para a NCA. Análises
estatísticas mostram que a alta taxa de falsos positivos em Panchal & Beaumont (2007) é
devido a erros de simulação e/ ou implementação da NCA. Templeton (2008) comenta ainda
que as condições alternativas mencionadas por Petit (2008) podem gerar falsos positivos com
aparentemente forte suporte. Entretanto, talvez Petit (2008) esteja certo; os artefatos de
simulação usados por Knowles & Maddison (2002) e as discrepâncias com os dados reais nas
simulações de Panchal & Beaumont (2007) foram bastante danosas à técnica filogeográfica,
mas foram erroneamente remetidas à análise de clados agrupados (NCA) (Templeton, 2008).
5.4 Unidades para a conservação e o manejo
Vogt (2001) e Batistela (2003) relatam exaustivas ações de colheita predatória de ovos
de P. erythrocephala em praticamente toda a bacia do rio Negro. Do ponto de vista da
genética da conservação conhecer a escala geográfica em que populações são
demograficamente conectadas e/ ou independentes é um fator importante para a identificação,
o monitoramento e o manejo das populações de irapuca na região amazônica, que representam
as unidades fundamentais para a conservação da espécie (Moritz, 1994; Bowen & Avise,
1996; Dethmers et al., 2006). Os resultados do presente estudo identificaram três
subpopulações demograficamente distintas de P. erythrocephala na Amazônia brasileira. Este
padrão resulta da interferência de estruturas geomorfológicas presentes numa região
48
topograficamente complexa, a bacia do rio Negro, e do rio Amazonas para o fluxo gênico a
partir do regular intercâmbio de fêmeas entre as populações.
Uma vez que não existem informações sobre a dispersão de P. erythrocephala, a
inferência de migração e do fluxo gênico a partir de métodos indiretos como a análise
genética fornece algum suporte no entendimento do comportamento migratório desta espécie
numa escala interbacias fluviais (Berry et al., 2004), e nossos dados servem como base para
tais estudos futuros. A estimativa do número efetivo de fêmeas migrantes calculada a partir
dos valores par a par do ST (Slatkin, 1985) sugere que as localidades nas quais não foi
detectada influência da estrutura geomorfológica (cachoeiras, corredeiras e rios como
barreiras) sobre a distribuição da variabilidade genética devem ser tratadas como uma única e
grande população interagindo geneticamente. Esta conectividade genética é indicativo de
conectividade demográfica, e corrobora que elas sejam consideradas uma única população em
análises de viabilidade populacional (Deiner et al., (2007).
O elevado fluxo gênico de fêmeas somado aos consideráveis índices de diversidade
genética encontrados nestas populações sugere que planos de translocação de indivíduos de
irapuca interbacias fluviais na região Amazônica poderiam não resultar em incompatibilidade
genética entre as populações fonte e receptora. Esta resolução seria uma alternativa valiosa no
intuito de conservar as populações naturais desta espécie na região caso um severo declínio
populacional comprometesse a viabilidade destas populações. Contudo, esta decisão não pode
ser tomada apenas com base apenas em dados da região controle mitocondrial, pois outras
porções do genoma mitocondrial e nuclear de irapuca podem ser altamente diferenciadas
(Amato et al., 2007). Se este for o caso, o ato de misturar populações poderia causar uma
“contaminação genética”, possivelmente levando a depressão exogâmica (Meffe & Carroll,
1997). Portanto, a análise genética não pode ser o único fator a ser examinado durante as
tomadas de decisões sobre a conservação das populações. Outras considerações tais como o
valor local e o papel ecológico destas populações devem ser levados em conta (Hunter &
Hutchinson, 1994; Amato et al., 2007).
Outros resultados aqui apresentados expõem os efeitos que barreiras fluviais exercem
sobre o fluxo gênico e que desempenham um papel importante na diferenciação genética das
populações de P. erythrocephala. Tais barreiras fluviais são representadas por estruturas
geomorfológicas (cachoeiras, corredeiras e rio) que parecem limitar o intercâmbio genético
em três localidades, no rio Negro, em São Gabriel da Cachoeira, no rio Jaú, no Parque
Nacional do Jaú, e no rio Andirá, em Barreirinha, baseado no índice de diferenciação genética
( ST) e no alto grau de estrutura observada pelos resultados de AMOVA.
49
As diferenciações microgeográficas observadas na região conhecida como alto rio
Negro, caracterizada como uma região rochosa, com um grande número de cachoeiras e
corredeiras, elementos que a tornam relativamente complexa geograficamente, enfatizam a
importância da manutenção de populações em habitats diversos, especialmente em áreas com
mosaico de topografia como a bacia do rio Negro. Contudo, igual importância deve ser dada
ao aparente isolamento geográfico favorecido pela atuação do rio Amazonas como barreira
física.
Uma vez que três localidades demonstraram forte influência da estrutura
geomorfológica e altos níveis de diferenciação genética foram observados sugerimos que as
atuais medidas de conservação, tais como a proteção de um pequeno número de praias no
entorno das regiões avaliadas e a transferência de indivíduos pertencentes a drenagens
diferentes, são inapropriadas para esta espécie (Bock et al., 2001). Sob uma perspectiva
conservacionista, estas populações representam unidades de manejo diferenciadas (Moritz,
1994), que devem ser manejadas como entidades separadas já que compreendem estoques
geneticamente distintos.
Durante o desenvolvimento e as migrações entre os locais de reprodução e
alimentação, quelônios aquáticos podem percorrer consideráveis distâncias intrabacias
fluviais, mas raramente deslocam-se entre elas, logo, a maior parte da estrutura genética pode
resultar de diferenças interdrenagens (Sites et al., 1999). Considerando que a ampla extensão
geográfica e variedade de ecossistemas são características que permitiriam a Floresta
Amazônica comportar múltiplas unidades de manejo, a delimitação das regiões prioritárias
para a conservação de quelônios aquáticos nesta região deve tomar como parâmetro
importante a delimitação da área geográfica a ser considerada. Este estudo fornece um quadro
da escala em que o movimento das fêmeas de irapuca ocorre e deve ser usado como uma linha
guia para os planos de conservação desta espécie, uma vez que identificou três subpopulações
geneticamente estruturadas em diferentes sistemas fluviais.
Segundo Dethmers et al. (2006) a caça indiscriminada de fêmeas adultas e a coleta
predatória de ovos em uma praia de desova particular podem ter impactos profundos sobre o
conjunto de indivíduos que desovam nas praias adjacentes. Portanto, o delineamento das áreas
a serem manejadas em cada unidade deveria combinar dados de marcação e recaptura,
telemetria e análise genética de todas as subpopulações que estão sob pressão humana e que
devem ser avaliadas para esta região. Batistela (2003) comenta que planos de manejo e
conservação com a participação dos moradores locais reduzem os custos com fiscalização, e
asseguram a manutenção do modo de vida local a partir de estratégias de uso sustentável do
50
recurso (SCM, 1996), transformando os antigos predadores de ovos e carne em protetores da
espécie (Mo & Vargas, 1993).
De um modo geral, a partir dos resultados deste estudo podemos inferir que uma
avaliação da estrutura da geomorfológica (cachoeiras e corredeiras) em bacias fluviais e seus
impactos no fluxo gênico podem ser ferramentas poderosas, entre muitas disponíveis, para
acessar com cuidado a estrutura populacional e fornecer suporte para projetos que visem à
definição de planos de conservação (Deiner et al., 2007). Desta maneira, sugerimos que entre
as amostras populacionais de irapuca analisadas na região Amazônica existem subpopulações
demograficamente distintas e que devem ser tratadas como unidades de manejo separadas no
intuito de monitorar as populações e designar políticas de conservação que mantenham a
viabilidade das populações e da espécie (O’Corry-Crowe et al., 1997).
51
6. CONCLUSÕES
A variabilidade genética encontrada para as populações estudadas foi
considerável, comparada às populações de outras espécies do gênero Podocnemis.
Os testes de neutralidade, D de Tajima e Fs de Fu, sugerem que as localidades
dos rios Cumicuri e Itu, em Barcelos, do rio Paracatu, em Nhamundá, e do lago Sapucuá, em
Oriximiná, podem estar passando ou passaram por um recente crescimento populacional.
As análises de variância molecular indicaram alto grau de subdivisão
populacional.
Os valores do índice de fixação ST foram significativos para as localidades de
São Gabriel da Cachoeira, Parque Nacional do Jaú e Barreirinha, que evidenciaram também
limitado fluxo gênico em comparação com as outras localidades. Isto indica que estas
localidades são distintas entre si, ou seja, estão diferenciadas geneticamente.
Neste caso, a presença de estruturas geomorfológicas (cachoeiras e/ou
corredeiras da bacia do rio Negro e o rio Amazonas) parece constituir uma barreira física
eficiente limitando o fluxo gênico de indivíduos de P. erythrocephala entre estas e as demais
localidades.
Para as comparações das demais localidades analisadas os valores do ST não
foram significantes contrastando com os altos valores de Nm (número de migrantes por
geração). Este resultado indica que não existe estrutura genética entre as demais localidades e
que o número de migrantes estabelece elevado fluxo gênico entre as amostras.
Tais localidades compõem uma grande população panmítica e fazem parte de
um mesmo estoque que ocorre ao longo da Amazônia brasileira.
As subpopulações demograficamente distintas (Parque Nacional do Jaú, São
Gabriel da Cachoeira e Barreirinha) devem ser tratadas como unidades de manejo separadas
no intuito de monitorar as populações e designar políticas de conservação que mantenham a
viabilidade das populações e da espécie.
52
REFERÊNCIAS
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