instituto nacional de pesquisas da amazÔnia ......citogenética clássica e molecular em peixes da...
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE ÁGUA DOCE E
PESCA INTERIOR - BADPI
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla BLOCH &
SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM ÊNFASE NOS HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS
JANICE MACHADO DE QUADROS
MANAUS-AM
2019
JANICE MACHADO DE QUADROS
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla BLOCH &
SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM ÊNFASE NOS HÍBRIDOS
INTERESPECÍFICOS
ORIENTADORA: Eliana Feldberg, Dra.
COORIENTADOR: Efrem Jorge Gondim Ferreira, Dr.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS, área de concentração Biologia de
Água Doce e Pesca Interior.
MANAUS-AM
2019
ii
Ficha Catalográfica
Sinopse: A fim de investigar a existência de híbridos entre espécies de Cichla,
nós analisamos, por meio de técnicas de citogenética clássica e molecular indivíduos
de C. monoculus, C. temensis, C. pinima, C. kelberi, C. piquiti, C. vazzoleri de
diferentes locais da bacia amazônica e entre eles, três indivíduos foram
considerados, morfologicamente, híbridos. Todos os indivíduos apresentaram 2n=48
cromossomos acrocêntricos. A heterocromatina foi encontrada preferencialmente em
regiões centroméricas e terminais, com variações entre indivíduos de C. monoculus,
de diferentes locais. Os resultados mostraram que os sítios de DNAr e sequências
repetitivas estão envolvidas na evolução da macroestrutura cariotípica do gênero. A
localização dos genes DNAr 5S permitiu sugerir os possíveis parentais dos híbridos
analisados no presente estudo.
Palavras-chave: Hibridação, tucunaré, Heterocromatina, FISH, DNAr 5S.
Q1c Quadros, Janice Machado de
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla
BLOCH & SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM
ÊNFASE NOS HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS / Janice Machado de
Quadros; orientadora Eliana Feldberg; coorientadora Efrem Ferreira. --
Manaus:[s.l], 2019.
56 f.
Dissertação (Mestrado - Programa de Pós Graduação em Biologia de
Água Doce e Pesca Interior) -- Coordenação do Programa de Pós-
Graduação, INPA, 2019.
1. Hibridação. 2. Tucunaré. 3. Heterocromatina. 4. FISH. 5. DNAr. I.
Feldberg, Eliana, orient. II. Ferreira, Efrem, coorient. III. Título.
CDD: 639.2
iii
Ata de Defesa Pública
iv
A realização deste estudo foi possível devido:
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), à Divisão de curso de Pós-
graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior - BADPI e ao laboratório de Genética
Animal (LGA).
Aos financiamentos fornecidos pelos projetos: NCT – Centro de Estudo das
Adaptações da Biota Aquática - ADAPTA-AMAZÔNIA-Fase II, para CHAMADA
PÚBLICA MCTI/CNPQ/FAPS No. 16/2014, Edital Nº 047/2012.
Estudos citogenéticos e citogenômicos da biodiversidade da Amazônia, com
implementação de avanços técnicos (AUXPE – Pró-Amazônia, CAPES 3297/2013/Processo
nº 23038.009446/2013-09).
Citogenética clássica e molecular em peixes da bacia amazônica frente a diferentes
desafios ambientais. Taxa da bolsa de produtividade de Eliana Feldberg, CNPq - Processo Nº
302421/2014-9.
v
Agradecimentos
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), pelo suporte para o
desenvolvimento do presente trabalho.
À coordenação do programa de pós-graduação em Biologia de Água Doce e Pesca
Inteior, corpo docente e colegas do curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)
pelo financiamento do projeto.
À Profª. Drª. Eliana pelo apoio, incentivo, orientação e por sempre estar disposta a
partilhar seus valiosos conhecimentos. Agradeço especialmente pela amizade, paciência, pela
confiança em mim depositada e por ter me apresentado a citogenética.
Ao Prof. Dr. Efrem pela orientação e valiosa colaboração nesse trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Genética Animal, em especial: Ramon, Léo,
Milena e Francy.
Aos meus queridos amigos Alex e Luana e ao meu namorado Luciano pela amizade e
por todo o apoio prestado nesse processo.
A minha aluna Ketlen e aos meus colegas Patrik, Marajó, Erika e Ezequiel por todo o
suporte prestado durante as coletas.
Aos meus pais, por serem o meu alicerce e sempre me apoiarem nesse caminho. Às
minhas irmãs e ao Pietro pelo incentivo e amizade, os quais foram fundamentais para que a
minha jornada fosse concluída.
Obrigada!
vi
“... Sirvam nossas façanhas de modelo a toda Terra...”
(Francisco Pinto da Fontoura)
vii
Resumo
O gênero Cichla compreende 15 espécies válidas, conhecidas como tucunaré, que se
distribuem por toda Amazônia. Algumas espécies foram introduzidas em diferentes bacias
hidrográficas brasileiras, onde tiveram uma boa adaptação. Alguns estudos têm apontado a
existência de híbridos interespecíficos, em ambientes onde ocorrem mais de uma espécie
deste gênero. Ainda, pode ocorrer o retrocruzamento com os parentais, fenômeno que pode
levar à introgressão de genes. Este processo também é comum entre diferentes linhagens,
particularmente quando espécies alopátricas são introduzidas em novos habitats. A fim de
investigar a existência de híbridos entre as espécies deste gênero, nós coletamos indivíduos de
diferentes espécies de tucunaré (C. monoculus, C. temensis, C. pinima, C. kelberi, C. piquiti,
C. vazzoleri) em diferentes locais da bacia amazônica. Estes foram analisados
citogeneticamente, e todos os indivíduos apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos. A
heterocromatina foi encontrada preferencialmente em regiões centroméricas e terminais, com
variações entre indivíduos de Cichla monoculus, de diferentes locais. Essa variabilidade
intraespecífica no padrão heterocromático pode ser o resultado de adaptação e/ou respostas
epigenômicas da cromatina a mudanças no ambiente, devido a sua ampla distribuição pela
Amazônia. A região organizadora do nucléolo (RON) foi localizada no par 2, coincidente com
DNAr 18S, em todos os indivíduos analisados. O DNAr 5S, entretanto, apresentou dois
padrões: no 4º e no 6º par. Entre todos os indivíduos, três foram considerados híbridos,
morfologicamente, coletados na UHE de Balbina, junto com C. temensis, C. monoculus e C.
vazzoleri. Do ponto de vista citogenético, estes indivíduos se diferenciaram em relação ao
padrão de banda C, que mostrou-se similar entre híbridos e a C. monoculus coletado em
Anavilhanas e em relação à localização do DNAr 5S, que em um indivíduo esteve em posição
intersticial no primeiro cromossomo do par 4 e no segundo cromossomo do par 6 (C. temensis
ou C. monoculus X C. vazzoleri), em outro indivíduo, a marcação do DNAr 5S se fez presente
em ambos os cromossomos do par 4 (C. temensis X C. monoculus) e num terceiro indivíduo,
a marcação evidenciou o segundo cromossomo dos pares 4 e 6 (C. temensis ou C. monoculus
X C. vazzoleri), o que nos permite sugerir os possíveis parentais dos híbridos. Os sítios
teloméricos foram restritos às regiões terminais dos cromossomos e os retrotransposons Rex3
e Rex6 apresentaram um padrão de distribuição disperso em porções de heterocromatina e
eucromatina.
Palavras-chave: Hibridação, tucunaré, Heterocromatina, FISH, DNAr 5S.
viii
Abstract
The genus Cichla comprises 15 valid species, known as tucunare, that are distributed
throughout the Amazon. Some species were introduced in different Brazilian river basins,
where they had a good adaptation. Studies show the existence of interspecific hybrids in
environments where more than one species of this genus occurs. Hybridization is a common
process among fish species and backcrossing with the parental is a phenomenon that, when it
occurs, can lead to introgression of genes. This process is also common among different
strains, particularly when allopatric species are introduced into new habitats. In order to
investigate the existence of hybrids among species of this genus, we collected individuals of
different species (C. kelberi, C. monoculus, C. pinima, C. piquiti, C. temensis, C. vazzoleri) at
different sites in the Amazon basin. We analyzed cytogenetically and all individuals presented
2n = 48 acrocentric chromosomes. The constitutive heterochromatin was found preferentially
in centromeric and terminal regions, with variations among individuals of C. monoculus from
different locations. This intraspecific variability in the heterochromatic pattern may be the
result of adaptation and / or epigenomic responses of the chromatin to changes in the
environment due to its wide distribution in the Amazon. The nucleolus organizer region (Ag-
NOR) was found in pair 2, coincident with 18S rDNA, in all individuals analyzed, however,
the 5S rDNA presented two patterns: in the 4th and 6th pair. Among all individuals, three
were considered hybrids, morphologically, collected at the Balbina UHE, together with C.
temensis, C. monoculus and C. vazzoleri. For cytogenetics, these individuals differed in
relation to the C-band pattern, that was like C. monoculos from Anavilhanas, and the rDNA
5s, that was found in one individual at the first chromosome of 4th pair and in the second
chromosome of 6th pair (C. temensis ou C. monoculus X C. vazzoleri),. Another individual
presented rDNA 5s at 4th chromosomal pair (C. temensis X C. monoculus), and the last hybrid
presented the rDNA 5s at the second chromosome of 4th and 6th pair (C. temensis ou
C.monoculos X C. vazzoleri), allowing us to suggest the possible parenting of hybrids. The
telomeric sites were restricted to the terminal regions of the chromosomes and the Rex3 and
Rex6 retrotransposons showed a dispersed distribution pattern in heterochromatin and
eucromatin portions.
Key words: Hybridization, tucunaré, Heterochromatin, FISH, 5S rDNA.
ix
Sumário
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
Hibridação interespecífica em peixes .......................................................................... 1
O gênero Cichla ........................................................................................................... 4
A Citogenética ............................................................................................................. 7
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 11
Objetivo Geral ............................................................................................................ 11
Objetivos Específicos ................................................................................................ 11
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 12
Material ...................................................................................................................... 12
Métodos - Citogenética Clássica ................................................................................ 16
Obtenção dos Cromossomos Mitóticos .............................................................. 16
Análise Cromossômica ....................................................................................... 16
Detecção da Heterocromatina Constitutiva ........................................................ 17
Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo ............................................ 17
Métodos - Citogenética Molecular ............................................................................ 17
Extração de DNA................................................................................................ 17
Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 18
Marcação das sondas .......................................................................................... 19
FISH - Hibridização in situ fluorescente ............................................................ 19
Análise Cariotípica .................................................................................................... 20
RESULTADOS ................................................................................................................ 21
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 29
CONCLUSÕES ................................................................................................................ 34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 35
1
INTRODUÇÃO
Hibridação interespecífica em peixes
Hibridação é o cruzamento genético entre duas espécies diferentes, animal ou vegetal.
Os indivíduos gerados por hibridação são chamados híbridos. Estes podem ser estéreis, com
baixa fertilidade ou férteis. A hibridação é uma questão amplamente discutida em vários
estudos com espécies de peixes. Para alguns autores, hibridações podem estar relacionadas a
diversificação e especiação de muitos grupos, ou a extinção de populações ou espécies. A
dificuldade para diferenciar espécies e híbridos pode ser um problema para o manejo correto
de espécies selvagens, porque linhagens híbridas, especialmente as mais avançadas, podem
assemelhar-se aos parentais (Mourão et al. 2017).
A produção de híbridos no Brasil tornou-se, nas últimas décadas, a forma mais usual
de se obter material genético mais produtivo. A presença de híbridos na estatística de
produção comprova o bom resultado zootécnico do processo de hibridação entre espécies
nativas. Entretanto, a grande dificuldade de manter estes híbridos sob controle (em cativeiro)
e sua fertilidade constituem uma grande ameaça, a longo prazo, à integridade genética das
populações selvagens, fonte de variabilidade para os programas de melhoramento (Hilsdorf e
Orfão 2011). Independentemente do ponto de vista adotado, os estudos de hibridação são
cruciais para a compreensão da base do isolamento reprodutivo e da origem da biodiversidade
(Arnold e Meyer 2006). As alterações dos ambientes e a introdução de espécies têm grande
influência no processo evolutivo dos organismos. Este fenômeno ocorre devido à pressão
seletiva exercida sobre os indivíduos sujeitos à nova condição ambiental (Futuyma 2003).
Presença de híbridos tem sido notada entre espécies introduzidas e espécies locais,
geneticamente compatíveis (Arthington 1991; Alves-Brinn et al. 2004).
A hibridação é uma maneira eficaz de prevenir a degeneração das variedades e
produzir uma variedade melhorada e pode ser interespecífica ou intraespecífica. A
interespecífica combina os genomas de diferentes espécies e pode resultar em mudanças
significativas nos fenótipos e genótipos dos descendentes. A intraespecífica, que é definida
como um cruzamento entre diferentes subespécies (linhagens), pertencentes à mesma espécie,
também pode levar a alterações fenotípicas e genotípicas nos descendentes, porém,
aparentemente, a hibridação interespecífica pode levar a mudanças maiores nas progênies
resultantes, do que as da intraespecífica (Wang et al. 2019).
Segundo Hubbs (1955), hibridação interespecífica é um fenômeno comum entre vários
grupos de peixes de água doce, e, geralmente, está relacionada com fatores ambientais. Uma
2
mudança climática pode facilitar invasões biológicas e causar perda de biodiversidade, uma
vez que as espécies ocupam diferentes nichos climáticos (Walther et al. 2002; Root et al.
2003; Parmesan 2006; Rahel e Olden 2008; Sorte et al. 2013). Ainda, o retrocruzamento com
os parentais é um fenômeno que, quando ocorre, pode levar à introgressão de genes. Este
processo também é comum entre linhagens, particularmente quando populações alopátricas
são introduzidas em novos habitats (Hubbs 1955; Avise et al. 2002; Rubidge e Taylor 2004).
Assim, hibridação e introgressão genética entre espécies nativas e invasoras são
consequências evolutivas importantes de invasões biológicas, mediadas pelo homem
(Simberloff 2014). Mas, também podem ocorrer de forma natural, levando à transferência de
alelos adaptativos de uma espécie para outra e ao aumento da diversidade de espécies (Moy et
al. 2019).
Particularmente entre os ciclídeos, Smith et al. (2003) discutem as vantagens
adaptativas da hibridação e introgressão para o aumento da variabilidade genética, entretanto,
é necessário ressaltar que este processo pode levar à extinção de espécies locais (Perry et al.
2002), pois a existência de híbridos férteis deve conter uma maior variabilidade genética, e
deste modo, apresentar maior vigor e capacidade adaptativa, sendo mais competitivos e
agressivos que as espécies originais (Arthington 1991; Bernatchez et al. 1995).
Na Amazônia, um exemplo de híbrido natural foi descrito para os jaraquis, com base
em estudos morfológicos (Semaprochilodus insignis vs Semaprochilodus taeniurus) (Ribeiro
1985) e uma hipótese de hibridação natural entre Cichla monoculus (Agassiz 1831) vs Cichla
temensis (Humboldt 1821) foi levantada, com base em análises cariotípicas (Alves-Brinn et
al. 2004) e por sequenciamento de DNA mitocondrial (Andrade et al. 2001).
Alves-Brinn et al. (2004) analisaram as espécies C. monoculus e C. temensis,
provenientes da Usina Hidrelétrica de Balbina (bacia do rio Uatumã). Neste estudo, os autores
encontraram indivíduos que apresentaram características morfológicas e cariotípicas
intermediárias entre as duas espécies e sugeriram tratar-se de um possível híbrido ao que
denominaram Cichla sp. Embora todos os indivíduos analisados tenham apresentado 2n=48
cromossomos acrocêntricos, a região organizadora de nucléolo (RON) foi um marcador
espécie-específico, onde os exemplares de C. monoculus e cinco indivíduos Cichla sp.
apresentaram marcação no segundo par cromossômico e C. temensis e três Cichla sp.
apresentaram a RON no terceiro par. Como C. monoculus e C. temensis são encontrados em
simpatria na bacia amazônica, os autores sugerem que o ancestral de Cichla sp. teria sido o
resultado do cruzamento destas espécies. Um outro estudo, utilizando os mesmos indivíduos
3
do estudo de Alves-Brinn et al. (2004) e outros de áreas de comprovada simpatria entre
Cichla monoculus e Cichla temensis, por sequenciamento de DNA mitocondrial, confirmou a
hibridação entre as duas espécies nas bacias dos rios Uatumã, Tapajós, Moju, Tocantins e
Guamá (Andrade et al. 2001). Teixeira e Oliveira (2005), com base em padrões
eletroforéticos da esterase, confirmaram a presença de híbridos em áreas de simpatria de C.
monoculus e C. temensis.
Willis et al. (2010), usando dados multilocus, estudaram a possível hibridação
interespecífica entre espécies de Cichla em seu habitat natural, bacia do Tocantins-Araguaia,
e nesta investigação não foram encontradas evidências de hibridação e/ou introgressão de
genes entre C. kelberi (Kullander e Ferreira 2006) e C. piquiti (Kullander e Ferreira 2006) e
na genealogia mitocondrial, as duas espécies encontram-se em clados diferentes. Por outro
lado, quando estas espécies, coletadas na região Sul-Sudeste, onde foram introduzidas, foram
analisadas, híbridos foram encontrados. No entanto, Mourão et al. (2017), utilizando
marcadores nuclear (RAG1) e mitocondrial (COI), analisaram as espécies C. kelberi, C.
piquiti e indivíduos híbridos em potencial, denominado carijó, coletados nos rios Paraná e
Tietê (SP, Brasil), sugerem que o carijó não é um híbrido interespecífico, porque apresentou
padrão genético idêntico e morfologia próxima a C. piquiti. Assim, os autores propuzeram
que o carijó é um morfotipo de C. piquiti.
Híbridos artificiais são muito comuns na aquicultura. Interessante notar que as
principais espécies de peixes utilizadas para a formação de híbridos têm uma constituição
cariotípica muito semelhante tanto no número diploide como na fórmula cromossômica, como
é o caso do tambaqui (Colossoma macropomum) e pacu (Piaractus mesopotamicus). Desde a
década de oitenta vem sendo produzidos diversos híbridos com a finalidade de sua inserção na
piscicultura. Estudos citogenéticos foram conduzidos por Toledo-Filho et al. (1994) em
ambas as espécies para sua caracterização citogenética e monitoração dos resultados destes
cruzamentos. Com relação ao número diploide, as duas espécies parentais apresentam
cariótipos indistinguíveis com 2n=54 cromossomos, com 20 cromossomos metacêntricos e 34
submetacêntricos. Porém, analisando a heterocromatina constitutiva da geração F1, ficaram
evidentes cinco cromossomos com padrão de bandamento diferenciado, o que permitiu
identificar os genomas parentais. Ainda, resultados mais refinados, como o estudo por
microscopia eletrônica do complexo sinaptonêmico, sugeriram a existência de
espermatogênese anômala nos híbridos, o que poderia inviabilizar a formação de gametas
geneticamente funcionais (Toledo Filho et al. 1994).
4
Em relação ao tucunaré, na bacia do rio Paraná, Oliveira et al. (2006) investigaram a
diversidade genética de populações de C. monoculus e Cichla sp., depois confirmadas como
C. kelberi e C. piquiti, respectivamente (Kullander e Ferreira 2006), e demonstraram um
padrão de diferenciação, com indivíduos geneticamente intermediários entre as duas espécies,
indicando uma forte evidência da quebra do isolamento reprodutivo destas duas espécies, e
deste modo resultando no híbrido. Entretanto, Willis et al. (2010), usando dados multilocus,
estudaram a possível hibridação interespecífica entre espécies de Cichla da região norte da
América do Sul (Bacias do Amazonas, Tocantins-Araguaia e do Orinoco), onde as duas
espécies (C. kelberi e C. piquiti) são nativas e coexistem, não encontraram híbridos e nem
evidências de introgressão de genes entre elas e, na genealogia mitocondrial, as duas espécies
encontram-se em clados diferentes. Em referência à adaptação e à especiação em Cichla, sua
localização originária restrita à bacia amazônica permite inferir que o mecanismo de
especiação para este gênero tenha ocorrido em simpatria e parapatria (Aparício et al. 2002).
Redução da variação genética foi observada em todas as populações invasivas para C.
kelberi e C. piquiti. Por exemplo, a heterozigosidade foi menor na faixa invasiva, quando
comparada às populações nativas da bacia amazônica. Portanto, apesar da invasão bem
sucedida de Cichla no sudeste do Brasil, baixa diversidade genética foi observada nas
populações introduzidas. Isso, segundo Carvalho et al. (2014), pode ser devido a uma
combinação de fatores, como estratégias reprodutivas, de alimentação e a fraca resistência
biótica às modificações antrópicas do ecossistema.
O gênero Cichla
Cichla pertence à família Cichlidae e são conhecidos como tucunaré, no Brasil, pavón
na Venezuela, toekoenali no Suriname e lukanani na Guyana (Kullander 2003). Os tucunarés
são preferencialmente piscívoros e têm sido utilizados para peixamentos em barragens e
açudes. São animais de grande interesse econômico, por possuírem carne de excelente
qualidade e serem muito apreciados na pesca esportiva (Kullander e Ferreira 2006). De hábito
diurno, podem utilizar diferentes locais para alimentação (Winemiller 2001). Durante a noite,
repousam nas beiradas rasas de rios e lagos, embaixo ou ao lado de coberturas vegetais
(Taphorn e Barbarino 1993).
Espécies de Cichla, como os demais ciclídeos, têm desova parcelada e cuidado
parental. O local de desova escolhido é geralmente um substrato duro e resistente, onde
macho e fêmea limpam a superfície, com auxílio da boca protrátil e movimentação das
nadadeiras, retirando algas ou outros vegetais (Sawaya e Maranhão 1946; Fontenele 1950;
5
Zaret 1980; Taphorn e Barbarino 1993). Uma vez ocorrida a fecundação, os reprodutores se
revezam na tarefa de cuidar do ninho (Zaret 1980; Taphorn e Barbarino 1993). Ao nascerem,
as larvas são aspiradas pela boca e colocadas no ninho e, se perturbado, o casal pode mudar as
larvas de local ou mesmo abandonar o ninho (Sawaya e Maranhão 1946; Zaret 1980; Taphorn
e Barbarino 1993). O cuidado parental pode ser realizado por ambos os pais (Zaret 1980) ou
por apenas um deles (Fontenele 1950). Devido a este cuidado com ovos e larvas, as espécies
de tucunaré são classificadas como guardadores e o casal torna-se altamente territorialista no
período reprodutivo (Zaret 1977).
Representantes do gênero Cichla são facilmente distinguidos de todos os outros
ciclídeos sul-americanos pela forma da nadadeira dorsal, a boca larga, mandíbula e maxila
proeminentes, um ocelo na base da nadadeira caudal e barras verticais escuras, variando de 1
a 4 (Kullander e Ferreira 2006). Entretanto, sua coloração é extremamente variável, devido,
aparentemente, a alterações ontogenéticas e período reprodutivo, o que causa grande
dificuldade na identificação de suas espécies (Kullander e Ferreira 2006).
Segundo Kullander e Ferreira (2006), este gênero compreende 15 espécies (Tabela 1)
reconhecidas morfologicamente, sendo que sua distribuição é um tanto particular. Por
exemplo, C. monoculus e C. temensis são encontradas na bacia do rio Amazonas, mas C.
piquiti e C. kelberi são restritas ao rio Tocantins. Algumas espécies foram introduzidas em
diversas bacias hidrográficas brasileiras e encontram-se bem estabelecidas, como C.
monoculus, C. kelberi e C. piquiti (Nascimento et al. 2001).
Devido à abundância natural, à natureza esportiva e à qualidade de sua carne, as
espécies do gênero Cichla são um importante recurso natural em muitas regiões da América
do Sul (Jepsen et al. 1999). Um exemplo é a espécie Cichla ocellaris (Schneider 1801), que
foi introduzida no Sudeste e Pantanal, e por sua vez, teve seus estoques parentais originários
da Amazônia (Gomiero e Braga 2003). Outra espécie introduzida foi C. kelberi, no
reservatório de Juturnaíba, localizado no Rio de Janeiro e uma área a jusante do rio São João,
juntamente com C. monoculus restrito a áreas fluviais a jusante. Essa introdução se deu por
pescadores esportivos, devido ao valor econômico das espécies (Diamante et al. 2017). Já, C.
piquiti é naturalmente encontrada nas bacias dos rios Tocantins-Araguaia, mas as populações
não-nativas são registradas em muitos reservatórios do centro, sul e sudeste do Brasil (Dos
Santos et al. 2016).
6
Tabela 1. Espécies do gênero Cichla em ordem cronológica de descrição e sua distribuição,
de acordo com Kullander e Ferreira (2006), e números diploides conhecidos.
Espécie Distribuição Número
diploide Referência
C. ocellaris
Schneider 1801
Guianas, Suriname, alto rio Branco no Brasil
C. temensis
Humboldt 1821
Drenagens dos rios Negro e Orinoco no Brasil,
Colômbia e Venezuela; rios de águas negras ao
longo dos Rios Solimões-Tefé, Puraquequara,
Rio Uatumã e Silves
48
acrocêntricos
Alves- Brinn et al.
2004
C. orinocensis
Humboldt 1821
Rios Negro e Orinoco no Brasil, Colômbia e
Venezuela
C. monoculus
Agassiz 1831
Planícies de inundação da bacia Amazônica, na
Colômbia, Peru e Brasil, nos rios do Amapá e
no baixo rio Oyapock na fronteira entre o Brasil
e Guiana Francesa.
48
acrocêntricos
Alves- Brinn et al.
2004; Schneider et
al. 2012
C. nigromaculata
Jardine 1843
Alto Rio Orinoco na Venezuela e médio Rio
Negro no Brasil.
C. intermedia
Machado-Alisson
1971
Restrita às drenagens dos rios Casiquiare e
Orinoco na Venezuela
C. kelberi Kullander
e Ferreira 2006
Rio Tocantins, drenagens dos rios Paraná,
Paraíba do Sul e região Nordeste do Brasil.
48
acrocêntricos
Mourão 2013
C. pleiozona
Kullander e Ferreira
2006
Rios Madre de Dios, Beni e Guaporé na Bolívia
e no Rio Jamari no Brasil
C. mirianae
Kullander e Ferreira
2006
Alto rio Tapajós, rios Juruena, Teles Pires, alto
rio Xingu no Brasil.
C. melaniae
Kullander e Ferreira
2006
Baixo rio Xingu, no Brasil
C. piquiti Kullander
e Ferreira 2006
Rios Tocantins, Paraná no Brasil e Paraguai. 48
acrocêntricos
Mourão 2013
C. thyrorus
Kullander e Ferreira
2006
Rio Trombetas no Brasil, à montante da
Cachoeira Porteira.
C. jarina Kullander e
Ferreira 2006
Rio Jari no Brasil, corredeiras de Santo
Antônio.
C. pinima Kullander
e Ferreira 2006
Afluentes do sul do Rio Amazonas no Brasil
(Tapajós, Curuá-Una, Xingu) e baixos rios
Tocantins e Capim. rios Amapá, Araguari e
Canumã no Brasil.
C. vazzoleri
Kullander e Ferreira
2006
Baixo rios Uatumã e Trombetas no Brasil
7
A Citogenética
O primeiro autor a propor a utilização de dados cariotípicos para identificar espécies e
para elaborar padrões de relacionamento ou filogenias foi Mathey (1949 apud Sczepanski
2008), no primeiro trabalho de revisão de dados cromossômicos de vertebrados.
As técnicas de bandeamento em cromossomos mitóticos de anfíbios, introduzidas na
década de 1970 (Schimid e Krone 1976; Schimid 1978; Schimid e Guttembach 1988) deram
início a uma nova fase nos estudos cromossômicos. Os padrões de bandas observados para
cada espécie passaram então a permitir relacionar alguns grupos, ampliando o entendimento
sobre a estrutura dos cromossomos eucariotos e fornecendo importantes dados para a
compreensão molecular da organização dos cromossomos de vertebrados. Entretanto, a
citogenética teve um grande avanço nos últimos anos com a aplicação da técnica de
Hibridização in situ Fluorescente (FISH), que faz uso de sondas obtidas a partir de segmentos
específicos de DNA, nos cromossomos (Martins et al. 2010).
Oliveira et al. (2009) destacam ainda que os estudos citogenéticos contribuem com
informações para o entendimento da divergência genética entre espécies coespecificas, bem
como da relação entre grupos, da ocorrência de espécies crípticas e de complexos de espécies.
Ainda, destacam a relevante contribuição que a citogenética tem acerca dos mecanismos e
evolução dos sistemas de cromossomos sexuais, da mesma forma com a descrição de
cromossomos B, ocorrência de poliploidia e suas relações com a evolução dos grupos. O
número de cromossomos, as fórmulas cromossômicas, a localização das regiões
organizadoras de nucléolos (RON) e o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva
são características cariotípicas que são consideradas caracteres importantes no entendimento
da história evolutiva de grupos relacionados e também são importantes na identificação de
espécies crípticas e/ou de taxonomia problemática (Garcia e Almeida-Toledo 2010).
Arai (2011) catalogou 3.425 espécies de peixes com cariótipos descritos. O número
diploide variou de 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis (Scheel 1973) a 2n=134
cromossomos em Corydoras aeneus (Turner et al. 1992). Outras especificidades já foram
observadas para os peixes neotropicais por análises cariotípicas, tais como: polimorfismos
estruturais (rearranjos), numéricos (euploidias e aneuploidias), cromossomos sexuais e
cromossomos supernumerários (Garcia e Almeida-Toledo 2010).
A visualização dos cromossomos pela coloração com Giemsa permite a determinação
do número diploide e da constituição cariotípica de uma espécie, abrindo assim um
importante caminho para a comparação interespecífica. Os cromossomos portadores das
8
regiões organizadoras de nucléolo (RONs) podem ser localizados de maneira rápida e fácil
pelo método de coloração com o nitrato de prata (AgNO3). Porém, a coloração com AgNO3
permite apenas a localização das RONs ativas antes da divisão celular. O nitrato de prata cora
apenas proteína não-histona ácida (nucleosina, também chamada de proteína C23), presente
nas RONs ativas durante a interfase, no momento da fixação das células. Essa técnica deve ser
considerada como um método indireto para a localização das RONs, uma vez que não há
associação direta com o DNA ribossômico, mas sim com proteínas a ele associadas (Guerra
1988; Nirchio e Oliveira 2006).
As regiões organizadoras de nucléolo (RON) são regiões cromossômicas que contém
os genes responsáveis pela codificação do RNA ribossomal. A variação dessa região em
peixes (RON simples e múltipla, RON heteromórfica, RON associada à heterocromatina
constitutiva e RON ativa em cromossomos sexuais) tem sido utilizada como um marcador
para tentar entender os processos que levaram à diferenciação de populações e espécies
estritamente relacionadas (Almeida-Toledo e Foresti 1985).
A observação das RONs, como um marcador cromossômico, permite detectar grupos
de organismos em que sua distribuição se dá em apenas um par de cromossomos e grupos
com múltiplos sítios desses elementos (RONs múltiplas). Schmid (1980) sugere que os
cariótipos com RONs simples sejam ancestrais em relação a cariótipos com RONs múltiplas.
Estes sítios são importantes marcadores cromossômicos, uma vez que seu número e
localização são característicos de espécies e de populações (Lourenço et al. 1998).
A heterocromatina constitutiva constitui as regiões dos cromossomos altamente
repetitivas, que se mantêm condensadas durante todo o ciclo celular e é tida por alguns
autores como um estado reprimido ou inativo da cromatina. Tal região é encontrada,
preferencialmente, em blocos centroméricos, teloméricos ou intersticiais. Heterocromatina
associada às RONs, braços cromossômicos ou cromossomos inteiros são algumas alterações
do padrão da heterocromatina constitutiva encontradas em peixes. Alguns autores sugerem
que essas alterações podem estar refletindo processos de diferenciação de populações ou a
origem e evolução de cromossomos sexuais (Guerra 1988; Andreata 1991). Sua detecção se
dá pela técnica de Bandeamento C, que consiste numa remoção diferencial de DNA da
cromatina após o tratamento com ácido, base e solução salina, enquanto que a região
heterocromática permanece aparentemente intacta (Sumner 1972). A eucromatina é composta
pela maioria dos genes estruturais e sequências de DNA de cópia única; enquanto que a
heterocromatina é caracterizada pela ausência de atividade gênica (Guerra 1988). As porções
9
de DNA repetitivo são essenciais para o comportamento cromossômico próprio (Wallrath
1998). Essas sequências repetitivas apresentam uma função estrutural e são de grande
importância para a evolução do genoma de diversos organismos (Bieé mont e Vieira 2006).
Isso deve-se ao fato de que vários tipos de cópias de DNA repetitivo estão intimamente
associados com regiões heterocromáticas, indicando que esse DNA não se distribui de
maneira aleatória no genoma e que tal associação pode estar relacionada com a manutenção
destas cópias no genoma (Mazzuchelli e Martins 2009).
Garcia e Almeida-Toledo (2010), por meio de análises citogenéticas realizadas em
cinco espécies de Pimelodella, coletadas nas principais sub-bacias do Alto Rio Paraná e Rio
Paraíba do Sul, verificaram que o número diploide variou de 2n=46 a 2n=58 cromossomos e
que todas as populações diferiram na constituição cariotípica. Observaram ainda, um
polimorfismo de heterocromatina envolvendo o primeiro par cromossômico do cariótipo, o
qual se mostrou restrito a alguns machos.
Um outro exemplo é o gênero Bunocephalus, Aspredinidae, que é considerado
monofilético com 13 espécies válidas. Ferreira et al. (2017), analisando indivíduos de quatro
populações amazônicas da espécie Bunocephalus coracoideus, por meio de análises
citogenéticas e moleculares, encontraram que cada população pode representar uma unidade
significativa evolutiva (ESU). Os marcadores citogenéticos número diploide e fórmula
cromossômica foram distintos, bem como o número e localização dos sítios de DNA
ribossomal entre as ESUs. Uma destas populações se destacou por apresentar vários citótipos,
indicando um polimorfismo, provavelmente devido a rearranjos cromossômicos e não-
disjunções meióticas. Sendo assim, a diversidade citogenética observada em grupos de peixes
até o momento justifica as pesquisas envolvendo estes animais.
Uma outra técnica que vem sendo muito utilizada na citogenética é a hibridização in
situ fluorescente (FISH), que consiste na incorporação de uma sonda, composta por
sequências específicas de nucleotídeos marcados com fluorescência, aos cromossomos
mitóticos em análise. Várias sondas são utilizadas, e as de uso mais comum em peixes são as
sondas de DNA repetitivo (Martins et al. 2010; Guerra 2012).
DNAs repetitivos são sequências de DNA de tamanhos variados, organizadas em
tandem, dispersas ou repetidas milhares de vezes no genoma, podendo ter ou não função
codificadora. Estudos acerca dessas sequências têm sido de grande relevância para a
compreensão da evolução genômica de determinadas espécies, pois elas nos remetem a dados
mais consistentes sobre a diversificação de cromossomos sexuais, origem de cromossomos
10
Bs, bem como na detecção de homeologias cromossômicas existentes entre espécies
relacionadas (Griffiths et al. 2008; Vicari et al. 2010; Blanco et al. 2013; Dulz et al. 2019).
As famílias multigênicas são sequências de DNA repetitivo que codificam moléculas
importantes como os RNAs ribossômicos (Martins et al. 2004). Os DNAs ribossômicos 18S e
5S, mapeados por hibridização in situ fluorescente, têm sido amplamente usados como
marcadores citogenéticos em peixes neotropicais, por contribuírem na elucidação de
problemáticas taxonômicas, biogeográficas e filogenéticas (Bellafronte et al. 2005; Teixeira et
al. 2009; Vicari et al. 2010; Ferreira et al. 2016).
Quanto aos elementos transponíveis, sua classificação baseia-se nas características
estruturais e moleculares de suas sequências, podendo ser agrupados em classes em que o
modo de transposição é o critério utilizado para o agrupamento. Os elementos da classe I
(retrotransposons) utilizam a transcriptase reversa para se transporem via um intermediário de
RNA, sempre originando uma nova cópia (mecanismo replicativo) e os elementos da classe II
(transposons) se transpõem diretamente de DNA a DNA usando a enzima transposase por eles
codificada (Finnegan 1985). Ainda, o mecanismo de replicação via DNA pode ser
conservativo ou replicativo. No primeiro, o elemento transponível é removido de um local e
inserido em outro, enquanto que no segundo o transposon é duplicado antes de ser
transportado para outro sítio (Burt e Trivers 2006).
Os retrotransposons podem ser classificados de acordo com a presença ou ausência de
longas repetições terminais (LTRs, do inglês long terminal repeats). As LTRs são necessárias
para a transcrição e integração do cDNA depois da transcrição reversa, sendo encontrados
nestas sequências, domínios para proteinase, integrase, transcriptase reversa e RNAse. Já, os
retrotransposons não-LTRs utilizam promotores internos para a sua transposição e codificam
uma transcriptase reversa e uma RNAse, sendo também conhecidos como LINES (long
interspersed elements) ou retrotransposons TP (target-primed). Além disso, dentro da
categoria dos não-LTRs, existem também os SINES (short interspersed nucleotide elements),
que não codificam a maquinaria enzimática necessária para a transposição, mas obtém esta
provavelmente por meio dos elementos LINES (Bohne et al. 2008). Os transposons também
podem ser subdivididos em duas subclasses. Na subclasse I estão agrupados os elementos que
possuem a tríade conservada DDE (D=ácido aspártico; E=ácido glutâmico) na transposase,
que é responsável pela excisão do elemento do seu sítio original e sua integração em um novo
sítio, mecanismo conhecido como “corta e cola”. Os da subclasse II não apresentam a
transposase DDE, sendo sequências alternativas utilizadas para este fim (Bohne et al. 2008).
11
A utilização de elementos transponíveis pode proporcionar uma melhor visão do
genoma das espécies e de como este genoma está organizado. Ainda, verificar se esta espécie
está sob estresse, uma vez que, como já se tem verificado estes elementos podem aumentar
em número de sequências frente a condições de estresses seja intrínseco, climático ou
ambiental (Ribeiro et al. 2017; Ferreira 2019).
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar alterações citogenéticas em espécies de Cichla, que possam sugerir a
presença de híbridos interespecíficos.
Objetivos Específicos
Caracterizar o cariótipo (número diploide, morfologia cromossômica, distribuição da
heterocromatina C-positiva e Ag-RONs) de espécies de Cichla;
Realizar o mapeamento cromossômico de sequências repetitivas de DNA (DNAr 5S e
18S, telômero), como marcadores cromossômicos;
Localizar os elementos transponíveis do tipo Rex em espécies de Cichla e nos
possíveis híbridos;
Investigar a ocorrência de indivíduos híbridos em Cichla, onde suas espécies ocorrem
em simpatria.
12
MATERIAL E MÉTODOS
Material
Neste estudo, 50 indivíduos de Cichla foram citogeneticamente analisados (Tabela 2).
Na Figura 1 é apresentada a distribuição das espécies estudadas no presente trabalho e, na
Figura 2, os locais de coleta: rio Negro (Lago Catalão e Anavilhanas), rio Uatumã (UHE de
Balbina), rio Tapajós e rio Araguaia. Na Figura 3 estão os representantes das espécies
analisadas.
Os peixes coletados foram transportados vivos até o laboratório de campo ou ao de
Genética Animal do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA), Manaus, e mantidos
em aquários aerados até serem processados.
Após o processamento, os animais foram numerados, registrados, fixados em formol
10% durante 24h e acondicionados, posteriormente, em recipientes contendo álcool 70%.
Todas as espécies terão vouchers depositados na Coleção de Peixes do INPA.
Este trabalho seguiu os padrões éticos para pesquisa animal de acordo com o Comitê
de Ética para Uso Animal do INPA, sob o protocolo número 01280.000338/2018-62. A
autorização para a coleta dos indivíduos foi concedida pelo Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade (ICMBio), de acordo com a licença SISBIO número nº
28095-1.
A classificação dos peixes foi feita pelo Dr. Efrem Ferreira, que considera híbridos, os
indivíduos que apresentam características de mais de uma espécie e quando a linha lateral é
contínua de um lado. O híbrido C (Figura 3), por exemplo, apresentou manchas na região pós
occipital e barras verticais oceladas contornadas de amarelo se assemelhando mais a C.
vazzoleri. Os híbridos A e B (Figura 3) apresentaram manchas brancas de forma
“desorganizada” se assemelhando a C. monoculus e a C. temensis, respectivamente.
13
Tabela 2. Espécies analisadas, número de indivíduos e locais de coleta. Espécies Número de
Indivíduos
Local de Coleta Coordenadas Voucher
C. kelberi 4♂ 3♀ Rio Araguaia - São Félix –
MT
11°39'03.9"S50°52'59.4 "W MZUSP125273
C. monoculus 5♀ Anavilhanas (Médio Rio
Negro) - AM
2°33'28.4"S 60°46'29.7"W INPA-ICT059047
C. monoculus 3♀ UHE Balbina (Rio
Uatumã) - AM
1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059044
C. monoculus 1♀ Rio Tapajós – Santarém -
PR
2°24'53.0"S 54°46'48.3"W INPA-ICT059045
C. monoculus 4♂ 1♀ Lago Catalão (Rio Negro) -
AM
3°10'30.8"S 59°56'30.3"W INPA-ICT059046
C. pinima 7♂ 6♀ Rio Tapajós – Santarém -
PR
24°21'16.4"S54°70'23.16"W INPA-ICT059045
C. piquiti 2♂ 2♀ Rio Araguaia- São Félix-
MT
11°38'01.7"S50°40'11.3"W MZUSP125272
C. temensis 2♂ 2♀ UHE de Balbina (Rio
Uatumã) - AM
1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059043
C. vazzoleri 2♂ 3♀ UHE de Balbina (Lago
Uatumã) - AM
1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059048
Híbrido 3♂ UHE de Balbina (Lago
Uatumã) - AM
1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059047
14
Figura 1. Mapa da distribuição das espécies de Cichla, de acordo com Kullander e Ferreira
2006 estudadas no presente estudo.
Figura 2. Mapa evidenciando os pontos de coleta das espécies de Cichla analisadas no
presente estudo.
15
Figura 3. Espécies de Cichla e indivíduos considerados morfologicamente
híbridos (A, B e C), analisados no presente trabalho.
16
Métodos - Citogenética Clássica
Obtenção dos Cromossomos Mitóticos
Para se obter um maior número de células em metáfase, foi utilizada a técnica para
indução de mitoses, descrita por Oliveira et al. (1988), na qual uma solução de fermento
biológico foi aplicada nos espécimes. A solução de fermento biológico foi preparada com 0,3
g de fermento biológico comercial, 0,3 g de açúcar e 10 mL de água destilada, sendo esta
mantida em estufa (37 °C) por um período de 15-20 minutos, e posteriormente injetada na
região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1mL para cada 100 g de peso do animal. Os
peixes submetidos ao tratamento com solução de fermento biológico foram colocados em
aquários bem aerados por 24 horas.
Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizado o protocolo de Gold et al.
(1990).Após o período de estimulação, o animal foi eutanasiado com eugenol na proporção de
5mL para 12L de água. Foram retiradas porções do rim e transferidas para uma cubeta de
vidro contendo de 2 a 10 mL de meio RPMI. Em seguida, o rim foi dissociado com uma
seringa hipodérmica de vidro. Foram adicionadas de 3 a 4 gotas de colchicina 0,0125%,
ressuspendendo com movimentos leves de aspiração e expiração, para a obtenção de uma
solução celular homogênea e foi deixada em temperatura ambiente por 30 minutos. Em
seguida, a solução celular foi transferida para um tubo do tipo falcon, ressuspendida e
centrifugada por 10 minutos a 900 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e foram
adicionados à solução 10mL de solução hipotônica de KCl 0,075M, a qual foi incubada em
estufa a 37 ºC por 40 minutos. Terminado o período de hipotonização, foi adicionado 1mL de
fixador Carnoy (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético glacial), a solução foi
homogeneizada e centrifugada por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
pellet foi diluído em 8mL de fixador Carnoy, homogeneizado e centrifugado por 10 minutos a
900 rpm. Este passo se repetiu por mais 2 vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante
foi descartado e foram adicionados 1,5mL de fixador. A suspensão celular foi homogeneizada
e acondicionada em tubos do tipo Ependorff em freezer a -20 °C.
Análise Cromossômica
Para a análise cromossômica foram gotejadas de duas a três gotas da suspensão celular
sobre uma lâmina de vidro limpa e coberta por uma lâmina d’água a uma temperatura de 60
ºC. Logo em seguida a lâmina foi corada com Giemsa 10% em tampão fosfato (pH=6,8) por
10 minutos.
17
Detecção da Heterocromatina Constitutiva
Para determinar o padrão de heterocromatina constitutiva (banda C) foi utilizada a
metodologia descrita por Sumner (1972), que consistiu em tratar as lâminas, contendo a
suspensão celular, em ácido clorídrico (HCl) 0,2N, a 37 ºC, durante 2 minutos e depois lavada
com água destilada. Em seguida, a lâmina foi incubada em solução de hidróxido de Bário
(Ba(OH)2.8H2O) a 5%, recém preparada e filtrada, a 42 ºC, durante 50 segundos e para
interromper a ação do hidróxido de bário, a lâmina foi lavada brevemente em ácido clorídrico
0,2N e depois lavada com água destilada. Em seguida, a lâmina foi incubada em solução
salina 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,06M em pH 6,8), a 60 ºC, durante
40 minutos e foi lavada com água destilada. Depois de seca, a lâmina foi corada com Iodeto
de ® propídeo (1µL de iodeto + 20µL de Vectashield) e coberta com uma lamínula para
espalhar o iodeto (Lui et al. 2012).
Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo
Para determinar o padrão de distribuição das regiões organizadoras de nucléolo
(RONs) foi utilizado o protocolo de Howell e Black (1980), que consistiu em colocar sobre
uma lâmina, contendo a preparação cromossômica, três gotas de solução de gelatina a 2%
(acrescida de ácido fórmico na proporção de 1mL para cada 100mL de solução); sobre cada
gota de gelatina foram colocadas duas gotas de solução aquosa de nitrato de prata a 50%. As
soluções foram misturadas delicadamente e cobertas com uma lamínula. As lâminas foram
incubadas em câmara úmida a 60 °C por 5 a 7 minutos ou o tempo necessário para que a
lâmina adquirisse uma coloração amarelada ou marrom escura. A lamínula foi retirada com
um jato de água destilada e a lâmina lavada e deixada secar ao ar.
Métodos - Citogenética Molecular
Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular de Cichla kelberi,
monoculus, C. pinima, C. piquiti, C. temensis, C. vazzoleri e dos indivíduos híbridos,
utilizando o protocolo de extração de DNA – Wizard Genomic DNA Purification Kit
(Promega). Aproximadamente 20mg de tecido muscular foi macerado, com auxílio de
tesoura, dentro de um tubo estéril de 1,5mL do tipo Ependorff. Foram adicionados 300μL de
EDTA/Nuclei Lysis Solution (este mix foi preparado usando 60μL de EDTA. + 250μL de
Nuclei Lysis Solution e colocado em geladeira por 10 minutos, até ficar turvo) e 10μL de
Proteinase K (10ng/μL). O conteúdo do tubo foi homogeneizado e deixado a 55 ºC por cerca
18
de 2 horas ou até o tecido ser totalmente dissolvido. Em seguida, foram adicionados 5μL de
RNAse, misturado cuidadosamente, por inversão, por alguns minutos e deixado em estufa a
37 ºC durante 30 minutos (este passo é opcional). Em seguida, foram adicionados 100μL de
Protein Precipitation Solution, vortexado até a solução ficar espumante (aproximadamente 20
segundos) e colocado em freezer por 5 minutos. Posteriormente, o tubo foi colocado em
centrifuga a 13000 rpm durante 8 minutos, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e o
pellet descartado.
Então foram adicionados 300μL de isopropanol gelado, homogeneizado por inversão e
centrifugado a 13000 rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado, com o
auxílio de uma pipeta, e foram adicionados 300μL de etanol 70% gelado e novamente
centrifugado a 13000 rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado e o
pellet foi colocado para secar a 37 ºC por 15 minutos. Por fim, foram adicionados 50μL de
DNA Rehydrate Solution e armazenado em freezer.
Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi
quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese
padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de
agarose 0,8% e corado com GelRed Acid Gel Stain Biotium (1:500). A visualização e análise
do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency). As
quantificações foram feitas em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare).
Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction)
A amplificação do DNAr 18S e 5S dos indivíduos amostrados foi realizada a partir do
DNA celular total, previamente isolado, sendo a amplificação realizada através da técnica de
PCR (Polimerase Chain Reaction, Saiki et al. 1988), utilizando os primers 18S F (5’ -CCG
CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’) e R (5’ -CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross
et al. 2010) e os primers 5S F (5’ -TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’) e R (5’ -CAG
GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’) (Martins e Galetti Jr. 1999).
Elementos transponíveis já identificados e caracterizados como conservados em outras
espécies de peixes, tais como os retroelementos do tipo Rex foram estudados. Primers foram
testados para amplificar os elementos transponíveis Rex3 (RTX3-F3 5’CGG TGA YAA AGG
GCA GCC CTG e RTX3-R3 5’TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al. 1999;
2000; 2001a), Rex6 (Rex6-Medf1 5’TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCAC e Rex6-Medf2
5’AGG AAC ATG TGT GCA GAA TATG) (Volff et al. 2001b). Estes primers já foram
19
utilizados para isolamento destes elementos repetitivos em diversos grupos de peixes,
indicando serem boas ferramentas para o isolamento destas sequências.
Marcação das sondas
As Sondas foram marcadas seguindo o método de Nick Translation, utilizando o Kit
Dig-NickTM Translation Mix para a marcação das sondas em vermelho e o Kit Biotin-
NickTM Translation Mix para a marcação das sondas em verde.
Foram colocados em um tubo do tipo eppendorf de 0,2 ml: 5μL de DNA obtido na
PCR, 4μL de mix do kit e 11μL de água destilada (volumes para 8 lâminas com DNA a
300ng). Foi incubada em termociclador a 16 ºC por 45 minutos, 65 ºC por 10 minutos e
posteriormente a sonda marcada foi armazenada em freezer -20 °C.
FISH - Hibridização in situ fluorescente
Para a detecção das sondas foi realizada a técnica de hibridização in situ por
fluorescência (FISH) descrita por Pinkel et al. (1986), com estringência de 77%, com algumas
modificações.
Preparação das lâminas:
As lâminas contendo a suspensão celular foram lavadas durante 5 minutos em PBS 1x, em
temperatura ambiente e posteriormente desidratadas em série alcoólica de etanol gelado (70%,
85% e 100%) por 5 minutos cada.
Fixação:
As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1x/50nM de cloreto de magnésio
durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas durante 5 minutos
em PBS 1x em temperatura ambiente, novamente desidratada em série alcoólica de etanol
gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos cada e deixadas secar ao ar.
Pré-hibridização:
O material contido na lâmina foi desnaturado em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5
minutos, desidratado em série alcoólica de etanol gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos
cada e deixadas secar ao ar.
Solução de hibridização:
Em um tubo do tipo eppendorf foram adicionados 50μL de formamida 100%, 20μL de sulfato
de dextrano 50%, 10μL de 20xSSC, 5μL de sonda 1 Roche, 5μL de sonda 2 Roche e 10μL de
20
água destilada (volume total para 2 lâminas). A sonda foi desnaturada em banho seco a 99 °C
por 10 minutos e transferida imediatamente ao gelo.
Hibridização:
Sobre uma lamínula limpa foram colocados 40μL da solução de hibridização e inverteu-se a
lâmina seca sobre a lamínula e deixadas com o material voltado para baixo em câmara úmida
a 37 ºC overnight (14 horas).
Lavagens:
Após o período de hibridização, as lâminas foram lavadas em formamida 15 % a 42ºC durante
10minutos e posteriormente lavadas em solução de Tween 0,5 % durante 5 minutos em
temperatura ambiente.
Detecção do Sinal:
Para a detecção do sinal as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos e
lavadas duas vezes (5 minutos cada) em solução de Tween 0,5 % em temperatura ambiente.
Amplificação do Sinal:
Sobre uma lamínula foram colocados 100μL do mix de amplificação (20µL de anti-
digoxigenina e 100µL de estreptavidina/NFDM (2 μL de estreptavidina + 998 μL de NFDM).
Inverteu-se a lâmina sobre a lamínula e incubadas em câmara úmida e escura a 37 ºC durante
60 minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas 3 vezes (5 minutos cada) em solução de
Tween 0,5% em temperatura ambiente e desidratadas em série alcoólica de etanol gelado
(70%, 85% e 100%), por 5 minutos cada e deixadas secar ao ar.
Montagem das lâminas:
Sobre cada lâmina foi colocado 20μL de uma solução contendo 1μL de DAPI diluído em
20μL de Vectashield®, coberta com uma lamínula e mantida em recipiente escuro.
Análise Cariotípica
As preparações convencionais (Giemsa, banda C e Ag-RONs) foram analisadas em
microscópio óptico. As contagens cromossômicas e observações mais detalhadas foram feitas com
a objetiva de imersão, num aumento de 1.000 vezes. As lâminas de FISH e fluorocromos foram
analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência sob filtro apropriado. As melhores metáfases
foram capturadas, utilizando sistema de captura de imagens DPController e processadas pelo
programa DPManager. Posteriormente, os cariótipos foram montados, utilizando o programa
21
Adobe Photoshop CS6, onde os cromossomos metafásicos mitóticos foram recortados,
emparelhados, medidos no programa ImageJ e colocados em ordem decrescente de tamanho,
separados por grupos. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a
posição do centrômero segundo Levan et al. (1964) e classificados com base no índice de
relação de braços (RB= comprimento do braço maior/comprimento do braço menor), podendo
ser metacêntricos (RB= 1,0-1,7), submetacêntricos (RB= 1,71-3,0), subtelocêntricos (RB=
3,01-7,0) e acrocêntricos (RB= 7,00). Na determinação do número de braços (NF) foram
considerados os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo
dois braços e os acrocêntricos como tendo apenas um braço.
RESULTADOS
As seis espécies analisadas no presente trabalho: C. kelberi, C. monoculus, C. pinima,
C. piquiti, C. temensis e C. vazzoleri apresentaram número diploide igual a 48 cromossomos
acrocêntricos e número fundamental (NF) igual a 48. A região organizadora do nucléolo (Ag-
RON), bem como o DNAr 18S, esteve presente no segundo par em posição terminal no braço
longo de todas as espécies (Figuras 4 e 5). Já, a localização do sítio de DNAr 5S localizou-se,
intersticialmente em posição proximal no par 6 de quatro espécies (C. kelberi, C. pinima, C.
piquiti e C. vazzoleri) e quase terminal no par 4 em duas (C. monoculus e C. temensis) (Figura
5).
Quanto ao padrão de banda C, as seis espécies apresentaram blocos heterocromáticos
centroméricos em todos os cromossomos e a região organizadora do nucléolo foi banda C
positiva. Entretanto, alguns blocos foram espécie-específicos: blocos terminais foram
observados no braço longo dos pares 1, 3 e 4 de C. kelberi; par 3 de C. pinima e C. temensis;
pares 1 e 3 de C. piquiti; e nos pares 3 e 6 de C. vazzoleri (Figura 4). Já, C. monoculus, que
foi coletada em quatro locais apresentou uma variabilidade quanto ao padrão de banda C,
onde os indivíduos coletados na UHE de Balbina também apresentaram blocos terminais no
braço longo dos pares 1, 6, 9, 12, 15, 19; os indivíduos do Catalão parecem ter blocos
terminais em todos os pares, mas os mais conspícuos foram os dos pares 1, 3, 5, 6, 7, 8, 10 12;
o mesmo ocorreu nos indivíduos coletados em Anavilhanas, mas nestes os blocos foram mais
conspícuos em praticamente todos os cromossomos e ainda apresentaram marcações
intersticiais nos pares 1, 3 e 6. Os indivíduos do rio Tapajós tiveram os blocos terminais nos
pares 1, 3, 5, 11, 14,15 e intersticial nos pares 14 e 15 (Figura 6).
22
Dentre os 50 indivíduos analisados, 3 foram considerados morfologicamente híbridos.
Esses híbridos apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos e NF=48, RON e DNAr 18S
no segundo par em posição terminal no braço longo (Figuras 7 e 8). A banda C mostrou-se
presente na região centromérica de todos os cromossomos nos três indivíduos, região
organizadora do nucléolo foi banda C positiva e o primeiro par dos três indivíduos tem um
bloco intersticial. Ainda, o indivíduo A (Figura 7b) também apresentou blocos terminais nos
pares 1 e 5; o indivíduo B (Figura 7e) tem blocos terminais na maioria dos cromossomos e
intersticial nos pares 3 e 6; o indivíduo C (Figura 7h) terminal nos pares 3, 10 e 11.
A localização do DNAr 5S foi detectada intersticialmente em um homólogo do par 4 e
em um homólogo do par 6 em dois indivíduos híbridos (A e C). O indivíduo B teve a
marcação do DNAr 5S em ambos homólogos do par 4 (Figura 8).
A hibridização com sondas teloméricas mostrou, como esperado, marcações nas
porções terminais de ambos os braços de todos os indivíduos analisados (Figura 9).
Com relação à localização cromossômica dos retrotransposons Rex3 e Rex6, estes
apresentaram um padrão de distribuição predominantemente disperso, tanto em regiões de
heterocromatina como de eucromatina, sendo que alguns pares cromossômicos apresentaram
um maior acúmulo dessas sequências nas regiões heterocromáticas (Figura 10). Entretanto,
não visualizamos qualquer diferença mais evidente entre as duas espécies (C. temensis e C.
vazzoleri) e o indivíduo considerado híbrido.
23
Figura 4. Cariótipo das espécies analisadas em coloração convencional com Giemsa,
bandeamento C e Ag-RON: Cichla kelberi (a, b, c); C. pinima (d, e, f); C. piquiti (g, h, i);
C. temensis (j, k, l); C. vazzoleri (m, n, o).
24
Figura 5. Cariótipos das espécies analisadas com marcadores cromossômicos moleculares.
“Double” FISH com sondas de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Cichla monoculus (a);
Cichla kelberi (b); C. pinima (c); C. piquiti (d); C. temensis (e); C. vazzoleri (f).
Figura 6. Cariótipo da espécie Cichla monoculus de diferentes localidades em coloração
convencional com Giemsa, bandeamento C. (a) UHE Balbina (Rio Uatumã); (b) Lago Catalão
(Rio Negro); (c) Anavilhanas (Médio Rio Negro); (d) Santarém (Rio Tapajós).
25
Figura 7. Cariótipo dos indivíduos híbridos A, B e C (conforme Figura 3) respectivamente,
em coloração convencional com Giemsa (a, d, g); bandeamento C (b, e, h) e Ag-RON (c, f, i).
26
Figura 8. Cariótipos dos indivíduos híbridos A, B e C (conforme Figura 3)
respectivamente com marcadores cromossômicos moleculares. “Double” FISH com
sondas de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde).
27
Figura 9. Metáfases evidenciando o padrão de hibridização
com sondas teloméricas (vermelho). Cichla monoculus (a);
Cichla kelberi (b); C. pinima (c); C. piquiti (d); C. temensis
(e); C. vazzoleri (f); indivíduo híbrido C (conforme Figura 3)
(g).
28
Figura 10. Cariótipos mostrando a distribuição dos elementos retrotransponíveis Rex3 e
Rex6. (a e b) Cichla temensis; (c e d) Cichla vazzoleri; (e e f) Indivíduo híbrido C
(conforme Figura 3).
29
DISCUSSÃO
Para Cichlidae, o número diploide igual a 48 cromossomos acrocêntricos é
considerado um caráter ancestral (Thompson 1979). A evolução cromossômica dessa família
é considerada conservada, do ponto de vista da macroestrutura cromossômica (Feldberg et al.
2003).
Cichla, ocupa uma posição basal para os ciclídeos neotropicais (Smith et al. 2008), e
tem todas as espécies, até agora cariotipadas, com 2n=48 cromossomos acrocêntricos (Alves-
Brinn et al. 2004; Schneider et al. 2012; Mourão et al. 2013), sendo que, C. pinima e C.
vazzoleri tiveram seus cariótipos descritos pela primeira vez neste trabalho. O mapeamento
das sequências teloméricas apresentou-se em porções terminais de ambos os braços para todas
as espécies e híbridos analisados e nenhuma sequência telomérica insterticial (ITS) foi
encontrada. Entretanto, a medida que mais espécies da família são estudadas e técnicas mais
acuradas são aplicadas, encontramos fórmulas cariotípicas diversas e mudanças na
posição/localização de vários marcadores (Schneider et al. 2013; Poletto et al. 2010; Gross et
al. 2009), sugerindo, que nesse grupo, os principais rearranjos cromossômicos ocorridos
foram os não robertsonianos. Interessante que em várias espécies dos clados derivados de
Cichlinae foram observadas ITSs, como em Astronotus ocellatus e Hypselecara temporalis
(Schneider et al. 2013) e os autores sugerem que inversões devem ter ocorrido, envolvendo a
região telomérica.
Alves-Brinn et al. (2004), com base em dados cariotípicos, Andrade et al. (2001), com
base em dados mitocondriais e Teixeira e Oliveira (2005), com base em padrões
eletroforéticos da esterase, sugeriram a presença de híbridos entre as espécies C. monoculus e
C. temensis, em ambientes onde estas espécies co-existiam, como nas bacias dos rios Uatumã,
Tapajós, Moju, Tocantins e Guamá. Entretanto, nesta época apenas quatro espécies de Cichla
eram descritas (C. monoculus, C. ocellaris, C. orinocensis e C. temensis). Em um trabalho
inédito de Kullander e Ferreira (2006), foram descritas novas espécies para este gênero, que
hoje compreende 15 espécies.
Nos indivíduos de Cichla analisados por Alves-Brinn et al. (2004), os autores
encontraram a RON em pares diferentes, ou seja em C. monoculus no 2º par do complemento
e em C. temensis no 3º par, enquanto em alguns indivíduos “intermediários”
morfologicamente, a RON foi observada no 2º e 3º par do complemento, que foram
considerados híbridos. Entretanto, Kullander e Ferreira (2006) verificaram que alguns destes
indivíduos seriam C. vazzoleri. Por outro lado, no presente estudo tal diferença não foi
30
detectada, e a RON foi considerada estar no 2º par, terminal, no braço longo para todos os
indivíduos de todas as espécies e dos híbridos, sendo esta região confirmada pelo
mapeamento do gene DNAr 18S.
Em um trabalho inédito, Schneider et al. (2012) analisaram 13 espécies de ciclíneos e
encontraram RON simples para 12 e múltipla para uma espécie, sendo que todas foram
confirmadas pela sonda DNAr 18S, exceto Pterophyllum leopoldi que além de confirmar a
RON, marcou todos os outros pares.
Quanto ao DNAr 5S, Schneider et al. (op. cit.) encontraram para 12 da 13 espécies
analisadas apenas um par com sítios 5S e uma com dois pares. Porém, em Cichla o mapeamento
do DNAr 5S vaiou estre as espécies e encontramos dois padrões: no 4º par (C. monoculus e C.
temensis) e no 6º par (C. kelberi, C. pinima, C. piquiti e C. vazzoleri) e em três indivíduos,
considerados híbridos morfologicamente, dois tiveram a marcação em um homólogo do 4º par
e e em um homólogo do 6º par. O outro teve a marcação em ambos homólogos do par 4 Visto
que estes híbridos foram capturados na UHE de Balbina, onde ocorrem C. monoculus, C.
temensis e C. vazzoleri (Kullander e Ferreira 2006), acreditamos que o híbrido A (figura 3)
possa ser o resultado do cruzamento entre C. monoculus X C. vazzoleri ou C. temensis X C.
vazzoleri. O híbrido B (figura 3) pode ser do cruzamento entre C. monoculus X C. temensis e
o híbrido C (figura 3) do cruzamento de C. monoculus X C. vazzoleri ou C. temensis X C.
vazzoleri. Ainda, não podemos descartar a introgressão (que pode ser definida como o
movimento do DNA de uma espécie para o pool genético de outra espécie, por
retrocruzamentos repetidos de indivíduos híbridos com uma ou ambas as espécies parentais)
entre os indivíduos híbridos e os parentais, pelo fato de que nos três indivíduos híbridos foi
observada gônada (masculina). Introgressão já foi verificada em cruzamentos intergenéricos e
intragenéricos na família Cichlidae, como por exemplo em Tilapia x Oreochromis e
Cichlasoma nigrofascatum x C. cyanoguttatum e os híbridos de alguns cruzamentos
assemelham-se mais a um dos parentais e outros são intermediários (Kornfield 1984).
Willis et al. (2012), utilizando dados multilocus, verificaram que a introgressão é um
fenômeno comum em espécies de Cichla. Geralmente, a hibridização introgressiva é esperada
ocorrer em habitats modificados, mas os autores verificaram que a maioria dos casos foi
encontrada em habitats naturais não perturbados, sugerindo que a introgressão é uma parte
natural da evolução de muitas espécies tropicais e esta pode aumentar a diversidade genética.
Um ponto importante a ser considerado no estudo de híbridos é a presença de
marcadores específicos. Um exemplo disto pode ser verificado no trabalho de Ribeiro et al.
31
(2017), onde os autores diferenciaram os híbridos resultantes do cruzamento de Colossoma
macropomum e Piaractus mesopotamicus dos híbridos resultantes do cruzamento entre C.
macropomum e P. brachypomus pelo mapeamento dos sítios de DNAr 18S. Já, no presente
estudo, o mapeamento dos sítios de DNAr 18S não foi considerado um bom marcador para
identificar os peixes estudados, pois o padrão de localização observado foi o mesmo para
todos indivíduos. Por outro lado, o mapeamento dos sítios de DNAr 5S foi útil para sugerir
que as três espécies que ocorrem em Balbina podem estar envolvidas na formação dos
híbridos.
O gene ribossômico 5S é um importante marcador citotaxonômico e evolutivo, pois
auxilia na compreensão da diversidade cromossômica dos organismos (Bellafronte et al.
2005; Teixeira et al. 2009; Vicari et al. 2010). Em estudo realizado por Ferreira et al. (2016),
dados cromossômicos com mapeamento de DNAr 5S revelaram um sistema de cromossomos
sexuais múltiplo em uma população de Bunocephalus coracoideus e inédito em Silurifores
(X1X1X2X2/X1Y1X2Y2). As sequências repetitivas de DNA ribossomal 5S e 18S são as mais
estudadas, e vêm ganhando destaque principalmente em estudos sobre as relações evolutivas entre
as espécies, na caracterização de populações e na estrutura do genoma (Martins et al. 2004,
Schneider et al. 2012; Terencio et al. 2012).
Quanto à heterocromatina constitutiva, o padrão de distribuição, muitas vezes, pode
ser utilizado como um marcador espécie-específico ou populacional (Feldberg et al. 2003;
Vicari et al. 2006; Benzaquem et al. 2008; Perazzo et al. 2011). No caso de Cichla, o padrão
da heterocromatina é muito similar entre cinco espécies. Entretanto, C. monoculus, da qual
analisamos indivíduos de quatro localidades, encontramos quatro padrões de heterocromatina
constitutiva (Figura 5).
C. monoculus é uma das espécies com a mais ampla distribuição pela Amazônia
(Kullander e Ferreira 2006) e também a mais utilizada para introduções em represas de todo o
Brasil (Johnson et al. 2011; Santos et al. 2016; Diamante et al. 2017). Essa variabilidade
intraespecífica no padrão heterocromático desta espécie pode ser o resultado de adaptação
e/ou respostas epigenômicas da cromatina a mudanças no ambiente. A heterocromatina é
reconhecida por desempenhar atividades importantes, como auxiliar na segregação
cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão gênica, associada a respostas às
mudanças no ambiente, podendo afetar também o processo de recombinação gênica (Grewal e
Jia 2007; Varriale et al. 2008; Bühler 2009).
32
Interessante foi que o padrão heterocromático dos três indivíduos híbridos foi muito
similar entre si e muito mais próximo do padrão descrito para C. monoculus do rio Negro
(Anavilhanas), com alguns blocos intersticiais. Poderia ser uma heterocromatinização? Tal
variabilidade na heterocromatina também pode ser explicada pela presença de fatores
estressantes, como mudanças ambientais ou processos de hibridação (Richards et al. 2010), o
que explicaria as diferenças na distribuição da heterocromatina, encontradas em C. monoculus
e nos indivíduos híbridos.
Willis et al. (2012) inferem também, que vários exemplos de hibridização são
descritos a partir de habitats modificados por influência humana, o que normalmente altera o
comportamento dos organismos que ali vivem. Considerando o represamento do Rio Uatumã
para formação da UHE de Balbina, que alterou o ambiente natural de pelo menos três espécies
de Cichla, e a variabilidade no padrão de cores entre suas espécies, talvez associada a algum
comportamento, a escolha de parceiros para esses predadores visuais pode ter sido dificultada,
levando assim a uma facilitação para formação de híbridos. Não só as espécies de Cichla, mas
todos os peixes, que permaneceram na área após os impactos da instalação da UHE de
Balbina, devem apresentar diferenças significativas nas suas características, relacionadas à
ocupação de dois ambientes com características ecológicas e dinâmicas muito diferentes
(reservatório e rio) (Willis et al. 2012).
Em se tratando dos peixes, uma característica importante do seu genoma é a
diversidade de classes de elementos transponíveis (ETs), tanto transposons como
retrotransposons (Volff et al. 2003). Diferentes classes de ETs foram mapeadas no genoma
dos ciclídeos neotropicais, tais como transposon Tc1 que foi mapeado em Cichla kelberi,
evidenciando blocos conspícuos em regiões centroméricas e marcações dispersas nos
cromossomos (Teixeira et al. 2009). Três novas classes de retroelementos foram descritas:
RCk que apresenta marcações dispersas nos cromossomos de C. kelberi; AoRex3 e AoLINE
que são agrupados na heterocromatina centromérica de todos os cromossomos de Astronotus
ocellatus (Mazzuchelli e Martins 2009), por exemplo. O mapeamento dos retroelementos Rex
também tem sido realizado neste grupo, visando compreender a organização genômica e os
resultados têm mostrado um padrão de distribuição compartimentalizado na heterocromatina
pericentromérica, entretanto, sinais dispersos e agrupados em regiões eucromáticas também já
foram observados (Gross et al. 2009; Mazzuchelli e Martins 2009; Teixeira et al. 2009;
Valente et al. 2011).
33
De forma geral, os elementos transponíveis acumulam-se principalmente em regiões
heterocromáticas do genoma em diversos grupos, incluindo peixes (Fischer et al. 2004;
Mazzuchelli e Martins 2009; Gross et al. 2009; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2013). O
acúmulo dessas sequências, preferencialmente em regiões heterocromáticas, tem sido relatada
para muitos organismos (Dimitri e Junakovic 1999; Bartolomé et al. 2002; Da Silva et al.
2002), sugerindo que a heterocromatina pode atuar também como um refúgio de ETs
funcionais ou degenerados. A distribuição de Rex no genoma dos ciclídeos sugere que estes
retroelementos estão sob ação de mecanismos evolutivos que tendem a acumulá-los em
regiões cromossômicas específicas (principalmente em heterocromatinas) (Schneider et al.
2013).
No entanto, nossos dados mostram que os ETs do tipo Rex (Rex3 e Rex6) se
apresentam dispersos nos cromossomos de C. temensis, C. vazzoleri e em um dos híbridos,
diferente dos dados encontrados por Schneider et al. (2013) para C. monoculus do lago
Catalão, onde estes elementos se apresentaram em blocos mais compartimentalizados. Esse
acúmulo de ETs em regiões específicas do genoma de ciclídeos foi evidenciada e associada a
possíveis eventos de alterações cromossômicas (Teixeira et al. 2009; Mazzucheli e Martins
2009; Gross et al. 2009; Ferreira et al. 2010; Valente et al. 2011). Por outro lado, o padrão de
distribuição disperso, como encontrado no presente estudo, pode ser devido ao fato desses
elementos transponíveis possuírem funções estruturais e regulatórias, que justifiquem sua
dispersão em ambos os tipos de cromatina. A ação dessas sequências tem grande importância
em funções regulatórias do genoma, no que diz respeito ao direcionamento da expressão
gênica, além de terem papel importante na adaptação do hospedeiro a mudanças ambientais
(Brookfield 2005; Slotkin e Martienssen 2007; Carareto et al. 2015; Rey et al. 2016). Esta
hipótese foi corroborada no trabalho realizado por Ribeiro et al. (2017), no qual observaram
um aumento na quantidade desses retrotransposons no híbrido tambacu, provavelmente
devido à necessidade de ajustes nos processos de divisão celular. Junto a isso, um dos
quesitos aceitos para explicar a origem e dispersão de elementos móveis está na hibridação
introgressiva, envolvendo espécies aparentadas (Capy 1998; Rouzic e Capy 2005), o que
explicaria o fato dos elementos do tipo Rex estarem dispersos no híbrido analisado no
presente trabalho.
Em uma revisão, Cioffi e Bertollo (2012) afirmam que essas sequências vêm sendo
encontradas, preferencialmente em regiões heterocromáticas, em diversos grupos de peixes,
nos quais, essas sequências teriam um papel estrutural. No entanto, no presente trabalho, essas
34
sequências foram encontradas tanto em regiões heterocromáticas quanto em regiões
eucromáticas, o que nos leva a crer, que por estarem também em regiões de eucromatina, as
sequências do tipo Rex encontram-se ativas no genoma das espécies de Cichla aqui estudadas.
Sendo assim, a atividade dessas sequências pode contribuir para a evolução do genoma deste
gênero, servindo como fonte de variabilidade genética, ou ainda podem estar relacionadas
com processos de adaptação a agentes estressores, gerando diferentes padrões de expressão
gênica. Junto a isso, não é possível afirmar que essas sequências estejam relacionadas a
ajustes de expressão gênica, ou ainda processos de disgenesia hibrida, uma vez que o padrão
encontrado nos indivíduos analisados foi muito similar. Para elucidar essa questão, estudos
aprofundados se fazem necessários, afim de gerar mais informações a respeito do
comportamente desses ETs no genoma, assim como suas possíveis contribuições ao genoma
das espécies de Cichla.
CONCLUSÕES
As espécies de Cichla e os híbridos aqui analisados mantêm a macroestrutura
cariotípica conservada. Entretanto, a localização das regiões heterocromáticas e do gene
DNAr 5S mostraram-se como marcadores resolutivos para evidenciar processos diferenciais
de evolução cromossômica entre as espécies.
O processo de heterocromatização encontrado em Cichla monoculus pode estar
relacionado a condições ambientais, tratando-se de uma resposta epigenética relacionada a
adaptações locais.
Espécies do gênero Cichla apresentam tendência à formação de híbridos, quando
ocorrem em simpatria e em ambientes modificados.
Dos três indivíduos híbridos encontrados, com base no marcador DNAr 5S, dois
devem ter C. vazzoleri envolvido, sendo que o outro parental pode ser C. monoculus ou
C.temensis e um indivíduo deve ser resultado do cruzamento entre C. monoculus X
C.temensis.
O padrão de distribuição dos retroelementos Rex3 e Rex6 encontrado nas espécies
analisadas evidencia que estas sequências estão ativas no genoma, não apresentando apenas
função estrutural. No entanto, não estão relacionadas com ajustes nos indivíduos híbridos.
35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F. 1985. As regiões organizadoras do nucléolo em peixes.
Ciência e Cultura, 37(3): 448-453.
Almeida-Toledo, L.F. 1998. Cytogenetic markers in Neotropical freshwater fishes. In:
Malabarba, L.R; Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena, Z.M. S.; Lucena, C.A (eds).
Phylogeny and classification of Neotropical fishes. EDIPUCRS. Porto Alegre, RS,
BR. p. 583-588.
Alves-Brinn, M.N.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2004. Karyological evidence for interspecific
hybridization between Cichla monoculus and Cichla temensis (Perciformes, Cichlidae)
in the Amazon. Hereditas, 141: 252-257.
Andrade, F.; Schneider, H.; Farias I.; Feldberg, E.; Sampaio, I. 2001. Análise filogenética de
duas espécies de Tucunaré (Cichla, Perciformes), com o registro de hibridação em
diferentes pontos da bacia amazônica. Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da
UFPA, 1:1, 1-11.
Andreata, A.A. 1991. Estudos citogenéticos na subfamília Hemipsilichthiinae (Ostariophysis,
Siluriformes, Loricariidae) com base em caracteres cromossômicos e de DNA
mitocondrial. Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo, São Paulo, São
Paulo. 122pp.
Aparício, S.; Chapman, J.; Stupka, E.; Putnam, N. 2002. Whole-genome shotgun assembly
and analysis of the genome of Fugu rubripes. Science, 297: 1301-1310.
Arai, R. 2011. Fish karyotypes. Springer. Japan: Tokyo. 347p.
Arnold, M.L.; Meyer, A. 2006. Natural hybridization: One evolutionary mechanism. Zoology,
109: 261–276.
Arthington, A.H. 1991. Ecological and genetic impacts of introduced and translocated
freshwater fishes in Australia. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,
48(1): 33-43.
Avise, J.C.; Jones, A.G.; Walker, D.; Dewood, J.A. 2002. Genetic mating systems and
reproductive natural histories of fishes: lessons for ecology and evolution. Annual
Review of Genetics, 36: 19-45.
Bartolomé, C.; Maside, X.; Charlesworth, B. 2002. On the abundance and distribution of
transposable elements in the genome of Drosophila melanogaster. Genetics and
Molecular Biology, 19(6): 926- 937.
36
Bellafronte, E.; Margarido, V.P.; Moreira Filho, O. 2005. Cytotaxonomy of Parodon nasus
and Parodon tortuosus (Pisces: Characiformes). A case of synonymy confirmed by
cytogenetics analyses. Genetics and Molecular Biology, 28(4): 710-716.
Benzaquem, D.C.; Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Gross, M.C.; Zuanon, J.A.S. 2008.
Cytotaxonomy and karyoevolution of the genus Crenicichla (Perciformes, Cichlidae).
Genetics and Molecular Biology, 31: 250-255.
Bernatchez, L.; Glémet, H.; Wilson, C.C.; Danzmann, R.G. 1995. Introgression and fixation
of Arctic char (Salvelinus alpinus) mitochondrial genome in an allopatric population
of brook trout (Salvelinus fontinalis). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic
Sciences, 52(1): 179-185.
Bertollo, L.A.C.; Takahashi, C.S.; Moreira-Filho, O. 1978. Cytotaxonomic considerations on
Hoplias lacerdae (Pisces, Erytrinidae). Revista Brasileira de Genética, 1: 103-120.
Bieé-mont, C.; Vieira, C. 2006. Genetics: junk DNA as an evolutionary force. Nature, 443:
521–524.
Blanco, D.R.; Vicari, M.R.; Lui, R.L.; Traldi, J.B.; Bertollo, L.A.C.; Moreira-Filho, O. 2013.
The role of the Robertsonian rearrangements in the origin of the XX/XY1Y2 sex
chromosome system and in the chromosomal differentiation in Harttia species
(Siluriformes, Loricariidae). Rev Fish Biol Fish, 23: 127–134.
Bohne, A.; Brunet, F.; Galiana-Arnoux, D.; Schultheis, C.; Volff, J.N. 2008. Transposable
elements as drivers of genomic and biological diversity in vertebrates. Chromosome
Research, 16: 203-215.
Brookfield, J. 2005. The ecology of the genome-mobile DNA elements and their hosts.
Nature Reviews Genetics, 5: 128–136.
Bühler, M. 2009. RNA turnover and chromatin-dependent gene silencing. Chromosoma, 118:
141–151.
Burt, A.; Trivers, R. 2006. Genes in conflict: the biology of selfish genetic elements.
Cambridge: Harvard University Press, p. 228-300.
Capy, P. 1998. Dynamics and Evolution of Transposable Elements. France: Landes
Bioscience, 197p.
Carareto, C.M.A.; Monteiro-Vitorello, C.B.; Van Sluys, M.A. 2015. Elementos de
transposição: diversidade, evolução, aplicações e impacto nos genomas dos seres
vivos. SciELO-Editora FIOCRUZ.
37
Carvalho, D.C.; Oliveira, D.A.; Sampaio, I.; Beheregaray, L.B. 2014. Analysis of propagule
pressure and genetic diversity in the invasibility of a freshwater apex predator: the
peacock bass (genus Cichla). Neotropical Ichthyology, 12(1): 105-116.
Cioffi, M.D.B.; Bertollo, L.A.C. 2012. Chromosomal distribution and evolution of repetitive
DNAs in fish. Repetitive DNA, 7: 197-221.
CONCEA. 2013. Diretrizes da prática de eutanásia do CONCEA. Ministério da Ciência,
Tecnologia e Inovação. Brasília, DF, BR. 54p.
da Silva, C.; Hadji, H.; Ozouf-Costaz, C.; Nicaud, S.; Jaillon, O.; Weissenbach, J. et al. 2002.
Remarkable compartmentalization of transposable elements and pseudogenes in the
heterochromatin of the Tetraodon nigroviridis genome. Proc Natl Acad Sci USA, 99:
1636-41.
Diamante, N.A.; de Oliveira, A.V.; Petry, A.C.; Catelani, P.A.; Pelicice, F.M.; Prioli,
S.M.A.P.; Prioli, A.J. 2017. Molecular analysis of invasive Cichla (Perciformes:
Cichlidae) populations from neotropical ecosystems. Biochemical systematics and
ecology, 72: 15-22.
Dimitri, P.; Junakovic, N. 1999. Revising the selfish DNA hypothesis. New evidence on
accumulation of transposable elements in heterocromatin. Trends Genet.,15: 123-124.
dos Santos, L.N.; Salgueiro, F.; Sampaio Franco, A.C.; Marques, A.C.P.; Nóbrega, F. 2016.
First record of the invasive blue peacock cichlid Cichla piquiti Kullander and Ferreira
2006 (Cichliformes: Cichlidae) in the Paraíba do Sul River basin, Southeastern Brazil.
BioInvasions Record, 5(4).
Dulz, T.A.; Lorscheider, C.A.; Nascimento, V.D.; Noleto, R.B.; Moreira-Filho, O.; Nogaroto, V.;
Vicari, M.R. 2019. Comparative cytogenetics among Leporinus friderici and Leporellus
vittatus populations (Characiformes, Anostomidae): focus on repetitive DNA
elements. Comparative Cytogenetic, 13(2): 105–120.
Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Bertollo, L.A.C. 2003. Chromosomal changes and adaptation of
cichlid fishes during evolution. In: Val, A.L.; Kapoor, B.G. (eds): Fish adaptation. Ibh
and Oxford, New Dehli and New York. p. 285-308.
Ferreira, A.M.V. 2019. Localização cromossômica de retrotransposons do tipo rex em
tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos aos cenários propostos pelo painel
intergovernamental sobre mudanças climáticas – IPCC. Dissertação de Mestrado em
38
em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, Manaus, AM.
Ferreira, I.A.; Poletto, A.B.; Kocher, T.D.; Mota-Velasco, J.C.; Penman, D.J.; Martins, C.
2010. Chromosome Evolution in African Cichlid Fish: Contributions from the
Physical Mapping of Repeated DNAs. Cytogenetic and Genome Research, 129: 314–
322.
Ferreira, M.; Garcia, C.; Matoso, D.A.; Jesus, I.S.; Feldberg, E. 2016. A new multiple sex
chromosome system X1X1X2X2/X1Y1X2Y2 in Siluriformes: cytogenetic
characterization of Bunocephalus coracoideus (Aspredinidae). Genetica, DOI
10.1007/s10709-016-9927-9.
Ferreira, M.; Garcia, C.; Matoso, D.A.; de Jesus, I.S.; Cioffi, M.D.B.; Bertollo,
L.A.C.;Feldberg, E. 2017. The Bunocephalus coracoideus species complex
(Siluriformes, Aspredinidae). Signs of a speciation process through chromosomal,
genetic and ecological diversity. Frontiers in genetics, 8: 120.
Finnegam, D.J. 1985. Transposable elements in eukaryotes. International Review of Cytology, 93:
281-326.
Fischer, C.; Bouneau, L.; Coutanceau, J.P.; Weissenbach, J.; Volff, J.N.; Ozouf- Costaz, C.
2004. Global heterochromatic colocalization of transposable elements with
minisatellites in the compact genome of the pufferfish Tetraodon nigroviridis. Gene,
336: 175–183.
Fontenele, O. 1950. Contribuição para o conhecimento da biologia dos tucunarés
(Actinopterygii, Cichlidae) em cativeiro. Aparelho de reprodução, hábitos de desova e
incubação. Revista Brasileira de Biologia, 10(4): 503-519.
Futuyma, D.J. 2003. Biologia evolutiva. 2ed. FUNPEC. Ribeirão Preto. 631p.
Garcia, C.; Almeida-Toledo, L.F. 2010. Comparative chromosomal analyses in species of the
genus Pimelodella (Siluriformes, Heptapteridae): occurrence of structural and
numerical polymorphisms. Caryologia, 63(1): 32-40.
Gold, J.R.; Li, Y.C.; Shipley, N.S.; Powers, P.K. 1990. Improved methods for working with
fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish
Biology, 37: 563-575.
39
Gomiero, L.M.; Braga, F.M.S. 2003. Relação peso-comprimento e fator de condição para
Cichla cf. ocellaris e Cichla monoculus (Perciformes, Cichlidae) no reservatório de
Volta Grande, rio Grande-MG/SP. Acta Scientiarum: Biological Sciences, 79-86.
Grewal, S.I.; Jia, S. 2007. Heterochromatin revisited. Nature Reviews Genetics, 8(1): 35-46.
Griffiths, A.J.; Wessler, S.R.; Gelbart, W.M.; Suzuki, D.T.; Miller, J. H. 2008. Introdução à
Genética. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. 856pp.
Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Porto, J.I.R.; Martins, C.; Feldberg, E. 2009.
Comparative Cytogenetic Analysis of the Genus Symphysodon (Discus Fishes,
Cichlidae): Chromosomal Characteristics of Retrotransposons and Minor Ribosomal
DNA. Cytogenetic and Genome Research, 127: 43-53.
Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Martins, C.; Feldberg, E. 2010. Variability of 18S
rDNA locus among Symphysodon fishes: chromosomal rearrangements. Journal of Fish
Biology, 76: 1117-1127.
Guerra, M. 1988. Introdução a citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara. 142 p.
Guerra, M. 2012. Citogenética molecular: Protocolos comentados. Sociedade Brasileira de
Genética, Ribeirão Preto. 132p
Hilsdorf, A. W.S.; Orfão, L.H. 2011. Aspectos gerais do melhoramento genético em peixes no
Brasil. Revista Brasileira de Zootecnia, 40: 317-324.
Howell, W.M.; Black, D.A. 1980. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions
with a protective colloidal developer. In: A 1 step method. Experientia, 36: 1014-
1015.
Hubbs, C.L. 1955. Hibridization between fish species in nature. Systematic Zoology, 4: 1-20.
Jepsen, D.B.; Winemiller, K.O.; Taphorn, D.C.; Olarte, D.R. 1999. Age structure and growth
of peacock cichlids from rivers and reservoirs of Venezuela. Journal of Fish Biology,
55(2): 433-450.
Johnson, J.R.; Thompson, R.C.; Micheletti, S.J.; Shaffer, H.B. 2011. The origin of tiger
salamander (Ambystoma tigrinum) populations in California, Oregon and Nevada:
introductions or relicts. Conserv. Genet. 12: 355e370.
Kornfield, I.L. 1984. Descriptive Genetics of Cichlid fishes. In: Turner, B.J. (Ed).
Evolutionary Genetics of Fishes. Plenum Press, New York. p. 591-616.
40
Kullander, S.O. 2003. Family Cichlidae (Cichlids). In: Reis, R.E.; Kullander, S.O.; Ferraris,
C.L. (eds.) Check list of the freshwater fishes of the south and central America.
Edipucrs, Porto Alegre, RS. p. 605-654.
Kullander, S.O.; Ferreira, E.J.G. 2006. A review of the South American cichlid genus Cichla,
with descriptions of nine new species (Teleostei: Cichlidae). Ichthyol. Explor.
Freshwaters, 17(4): 289-398.
Levan, A.; Fregda, K.; Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric position on
chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
Lourenço, L.B.; Recco-Pimentel, S.M.; Cardoso, A.J. 1998. Polymorphism of the nucleolus
organizer regions (NORs) in Physalaemus petersi detected by silver straining and
fluorescent in situ hibridization. Chromosome Research, 6: 621-628.
Lui, R.L.; Blanco, DR ; Moreira-Filho, O ; Margarido, VP . Propidium iodide for making
heterochromatin more evident in the C-banding technique. Biotechnic &
Histochemistry, v. 87, p. 433-438, 2012.
Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 1999. Chromosomal localization of 5S rDNA genes in Leporinus
fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, 7: 363–367.
Martins, C.; Oliveira, C.; Wasko, A.P.; Wright, J.M. 2004. Physical mapping of the Nile
tilapia (Oreochromis niloticus) genome by fluorescent in situ hybridization of the
repetitive DNAs to metaphase chromosomes – a review. Aquaculture, 231: 37-39.
Martins, C.; Cabral-de-Mello, D.C.; Valente, G.T.; Mazzuchelli, J.; de Oliveira, S.G. 2010.
Cytogenetic mapping and contribution to the knowledge of animal genomes. In:
Urbano, K.V. (ed.) Advances in Genetics Research. 81 pp.
Mazzucheli, J., & Martins, C. (2009). Genomic organization of repetitive DNAs in the
cichlidae fish Astronotus ocellatus. Genetica. 136(3), 461-469.
Mourão, A.A.; Freitas-Souza. 2019. Caracterização citogenética e molecular das espécies
Cichla kelberi e Cichla piquiti e seu possível híbrido interespecífico coletados em
ambientes naturais. Dissertação de Mestrado em Ciências Biológicas, Zoologia.
Universidade estadual Paulista. Botucatu, SP.
Mourão, A.A.; Freitas-Souza, D.; Hashimoto, D.T.; Ferreira, D.C.; Prado, F.D.D.; Silveira,
R.; V.; Porto-Foresti, F. 2017. Molecular and morphological approaches for species
delimitation and hybridization investigations of two Cichla species. Iheringia. Série
Zoologia, 107.
41
Moy, K. G., Unmack, P. J., Lintermans, M., Duncan, R. P., & Brown, C. (2019). Barriers to
hybridisation and their conservation implications for a highly threatened Australian
fish species. Ethology, 125(3), 142-152.
Nascimento, F.L.; Catela, A.C.; Moraes, A.S. 2001. Distribuição espacial do tucunaré, Cichla
sp. (Pisces, Cichlidae), peixe amazônico introduzido no Pantanal, Brasil. Bol. Pesq.
Desen. EMBRAPA Pantanal, 24: 1-15.
Nirchio, M.; Oliveira, C. 2006. Citogenetica de Peces. Porlamar, Graficas Internacional.
172pp.
Oliveira, C.; Almeida-Toledo, L.F; Foresti, F.; Toledo-Filho, S.A. 1988. Supernumerary
chromosomes, Robertsonian rearrangement and multiple NORs in Corydoras aeneus
(Pisces, Siluriformes, Callichthyidae). Caryologia, 41: 227- 236.
Oliveira, A.V.; Prioli, A.J.; Prioli, S.M.A.P.; Bignotto, T.S.; Júlio Jr., H.F.; Carrerk, H.;
Agostinho, C.S.; Prioli, L.M. 2006. Genetic diversity of invasive and native Cichla
(Pisces: Perciformes) populations in Brazil with evidence of interspecific
hybridization. Journal of Fish Biology, 69 (Supplement B): 260–277.
Oliveira, C.; Foresti, F.; Hilsdorf, A.W.S. 2009. Genetics of Neotropical Fish: From
Chromosomes to Populations. Fish Physiology and Biochemistry, 35: 81-100.
Parmesan, C. 2006. Ecological and evolutionary responses to recent climate change. Annual
Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 37: 637–669.
Perazzo, G.; Noleto, R.B.; Vicari, M.R.; Machado, P.C.; Gava, A.; Cestari, M.M. 2011.
Chromosomal studies in Crenicichla lepidota and Australoheros facetus (Cichlidae,
Perciformes) from extreme Southern Brazil. Reviews in Fish Biology and Fisheries,
21: 509–515.
Perry, W.L.; Lodge, D.M.; Feder, J.L. 2002. Importance of hybridization between indigenous
and nonindigenous freshwater species: an overlooked threat to North American
biodiversity. Systematic Biology, 51: 255-275.
Pinkel, D.; Straume, T.; Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high-
sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Nat. Acad. Sc., 83: 2934-2938.
Poletto, A. B., Ferreira, I. A., Cabral-de-Mello, D. C., Nakajima, R. T., Mazzuchelli, J.,
Ribeiro, H. B., ... & Martins, C. 2010. Chromosome differentiation patterns during
cichlid fish evolution. BMC genetics, 11(1), 50.
42
Rahel, F.J.; Olden, J.D. 2008. Assessing the effects of climate change on aquatic invasive
species. Conservation Biology, 22: 521–533.
Rey, O.; Danchin, E.; Mirouze, M.; Loot, C.; Blanchet, S. 2016. Adaptation to global change:
a transposable element–epigenetics perspective. Trends in ecology & evolution, 31(7):
514-526.
Ribeiro, M.C.L.B. 1985. A natural hybrid between two tropical fishes: Semaprochilodus
insignius vs Semaprochilodus taeniurus (Teleostei, Characoidei, Prochilodontidae).
Revista Brasileira de Zoologia, 2: 419-421.
Ribeiro, L.B.; Moraes-Neto, A.; Artoni, R.F.; Matoso, D.A.; Feldberg, E. 2017. Chromosomal
mapping of repetitive sequences (Rex3, Rex6, and rDNA genes) in hybrids between
Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) and Piaractus mesopotamicus (Holmberg,
1887). Zebrafish, DOI: 10.1089/zeb.2016.1378.
Richards, C.L.; Bossdorf, O.; Pigliucci, M. 2010. What role does heritable epigenetic
variation play in phenotypic evolution? BioScience, 60: 232-237.
Root, T.L.; Price, J.T.; Hall, K.R.; Schneider, S.H.; Rosenzweig, C.; Pounds, J.A. 2003.
Fingerprints of global warming on wild animals and plants. Nature, 421: 57–60.
Rouzic, A.L.; Capy, P. 2005. The First Steps of Transposable Elements Invasion: Parasitic
Strategy vs. Genetic Drift. Genetics Society of America. DOI:
10.1534/genetics.104.031211.
Rubidge, E.M.; Taylor, E.B. 2004. Hybridization zone structure and the potential role of
selection in hybridizing populations of native westlope cutthroat trout (Oncorhynchus
clarki lewisi) and introduced rainbow trout. Molecular Ecology, 13: 3725-3749.
Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.B.;
Erlich, H.A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491.
Santos, F.A.; Marques, D.F.; Terencio, M.L.; Feldberg, E.; Rodrigues, L.R.R. 2016.
Cytogenetic variation of repetitive DNA elements in Hoplias malabaricus
(Characiformes – Erythrinidae) from white, black and clear water rivers of the Amazon
Basin. Genetics and Molecular Biology, 39(1): 40-48.
Sawaya, P. e Maranhão, A. A. 1946. A construção dos ninhos e reprodução de alguns peixes
neotrópicos (Cichlidae_/gen. Cichla e Astronotus). Bol. Fac. Filos. Cient. USP 16: 357-
381.
43
Scheel, J.J. 1973. Fish chromosomes and their evolution. Internal Report of Danmarks
Akvarium, Charlottenlund, Denmark. O-50.
Schimid, M.; Krone, W. 1976. The relationship of the specific chromosomal region to the
develompment of the acrosome. Chromosoma (Berl), 56: 327-347.
Schimid, M. 1978. Chromosome banding in amphibia I. Constitutive heterochromatin and
nucleolus organizer regions in Bufo and Hyla. Chromosoma (Bed), 66: 361-388.
Schimid, M. 1980. Chromosome evolution in amphibia. In Miller H (ed) Cytogenetics of
vertebrates. Birkhfiuser, Basel, p 4-27.
Schimid, M.; Guttenbach, M. 1988. Evolutionary diversity of reverse (R) fluorescent
chromosomes bands in vertebrates. Chromosoma (Berl), 97: 101-114.
Schneider, C.H.; Gross, M.C.; Terencio, M.L.; Artoni, R.F.; Vicari, M.R.; Martins, C.;
Feldberg, E. 2012. Chromosomal evolution of Neotropical cichlids: the role of
repetitive DNA sequences in the organization and structure of karyotype. Reviews in
Fish Biology and Fisheries, doi:10.1007/s11160-012-9285-3.
Schneider, C.H; Gross, M.C.; Terencio, M.L.; Carmo, E.J. do; Martins, C.; Feldberg, E. 2013.
Evolutionary dynamics of retrotransposable elements Rex1, Rex3 and Rex6 in
Neotropical cichlid genomes. BMC Evolutionary Biology, 13: 152. doi:10.1186/1471-
2148-13-152.
Sczepanski, T.S. 2008. Caracterização cromossômica de espécies da família Ariidae
(Teleostei, Siluriformes) pertencentes ao litoral paranaense. Dissertação de
Mestrado. Programa de Pós-graduação em Genética. Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, Paraná. 96pp.
Simberloff, D. 2014. Biological invasions: What’s worth fighting and what can be won?
Ecological Engineering, 65: 112–121.
Slotkin, R.K.; Martienssen, R. 2007. Transposable elements and the epigenetic regulation of
the genome. Nature Reviews Genetics, 8: 272-285.
Smith, P.S.; Konings, A.D.; Kornifield, I. 2003. Hybrid origin of a cichid population in lake
Malawi: Implications for genetic variation and species diversity. Molecular Ecology,
12: 2497-2504.
Smith, W.L.; Chakrabarty, P.; Sparks, J.S. 2008. Phylogeny, taxonomy, and evolution of
Neotropical cichlids (Teleostei: Cichlidae: Cichlinae). Cladistics, 24: 625–641.
44
Sorte, C.J.B.; Ibanez, I.; Blumenthal, D.M.; Molinari, N.A.; Miller, L.P.; Grosholz, E.D.;
Dukes, J.S. 2013. Poised to prosper? A crosssystem comparison of climate change
effects on native and non native species performance. Ecology Letters, 16: 261–270.
Sumner, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin.
Experimental Cell Research, 75: 304-306.
Taphorn, D.C.; Barbarino, A. 1993. Evaluación de la situación actual de los pavones (Cichla
spp.) en el Parque Nacional Capanaparo-Cinaruco, Estado Apure, Venezuela. Natura,
96: 10-25.
Teixeira, A.S.; Oliveira, S.D.S. 2005. Evidence for a natural hybrid of peacock bass (Cichla
monoculus vs Cichla temensis) based on esterase electrophoretic patterns. Genetics
and Molecular Research, 4(1): 74-83.
Teixeira, W.G.; Ferreira, I.A.; Cabral-de-Mello, D.C.; Mazzuchelli, J.; Valente, G.T.; Pinhal,
D.; Poletto, A.B.; Venere, P.C.; Martins, C. 2009. Organization of repeated DNA
elements in the genome of the cichlid fish Cichla kelberi and its contributions to the
knowledge of fish genomes. Cytogenetic and Genome Research, 125: 224–234.
Terencio, M.L.; Schneider, C.H.; Gross, M.C.; Nogaroto, V.; Almeida, M.C.; Artoni, R.F.;
Vicari, M.R.; Feldberg, E. 2012a. Influence of repetitive sequences in the evolution of
the W chromosome in fish of the Family Prochilodontidae. Genetica, 140: 505-512.
Thompson, K.W. 1979. Cytotaxonomy of 41 species of Neotropical Cichlidae. Copeia, 4:
679-691.
Toledo-Filho, S.A.; Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F.; Bernardino, G.; Calcagnoto, D. 1994.
Monitoramento e conservação genética em projeto de hibridação entre pacu e
tambaqui. Cadernos de Ictiogenética 2: 25pp.
Turner, B.J.; Diffoot, N.; Rasch, E.M. 1992. The callichthyid catfifish Corydoras aeneus is an
unresolved diploid-tetraploid sibling species complex. Ichthyol. Explor. Freshwaters,
3: 17–23.
Valente, G.T.; Mazzuchelli, J.; Ferreira, I.A.; Poletto, A.B.; Fantinatti, B.E.A.; Martins, C.
2011. Cytogenetic mapping of the retroelements Rex1, Rex3 and Rex6 among cichlid
gish: new insights on the chromosomal distribution of transposable elements.
Cytogenetic and Genome Research, 133: 34-42.
Varriale, A.; Torelli, G.; Bernardi, G. 2008. Compositional properties and thermal adaptation
of 18S rRNA in vertebrates. RNA, 14: 1492–1500.
45
Vicari, M.R.; Moreira-Filho, O.; Artoni, R.F.; Bertollo, L.A.C. 2006. ZZ/ZW sex
chromosome system in an undescribed species of the genus Apareiodon
(Characiformes, Parodontidae). Cytogenetic and Genome Research, 114: 163-168.
Vicari, M.R.; Nogaroto, V.; Noleto, R.B.; Cestari, M.M.; Cioffi, M.B.; Almeida, M.C.;
Moreira-Filho, O.; Bertollo, L.A.C.; Artoni, R.F. 2010. Satellite DNA and
chromosomes in Neotropical fishes: Methods, applications and perspectives. J. Fish
Biol., 76: 1094-1116.
Volff, J.N.; Körting, C.; Sweeney, K.; Schartl, M. 1999. The nonLTR retrotransposon Rex3
from the fish Xiphophorus is widespread among teleosts. Mol Biol Evol, 16: 1427-38.
Volff, J.N.; Körting, C.; Schartl, M. 2000. Multiple lineages of the non-LTR retrotransposon
Rex1 with varying success in invading fish genomes. Mol Biol Evol, 17: 1673-84.
Volff, J.N.; Körting, C.; Meyer, A.; Schartl, M. 2001a. Evolution and discontinuous
distribution of Rex3 retrotransposons in fish. Mol Biol Evol, 18: 427-31.
Volff, J.N.; Körting, C.; Froschauer, A.; Sweeney, K.; Schartl, M. 2001b. Non-LTR
retrotransposons encoding a restriction enzyme-like endonuclease in vertebrates. J Mol
Evol, 52: 351-60.
Volff, J.F.; Bouneau, L.; Ozouf-Costaz, C.; Fischer, C. 2003. Diversity of retrotransposable
elements in compact pufferfish genomes. Trends in Genetics, 19: 674-678.
Wallrath, L.L. 1998. Unfolding the mysteries of heterochromatin. Current Opinion in
Genetics & Development, 8: 147-153.
Walther, G.R.; Post, E.; Convey, P.; Menzel, A.; Parmesan, C.; Beebee, T.J.C.; Bairlein, F.
2002. Ecological responses to recent climate change. Nature, 416: 389–395.
Wang, S.; Tang, C.; Tao, M.; Qin, Q.; Zhang, C.; Luo, K.; Hu, F. 2019. Establishment and
application of distant hybridization technology in fish. Science China Life Sciences,
62(1): 22-45.
Willis, S.C.; Nunes, M; Montaña, C. G.; Farias, I.P.; Ortí, G.; Lovejoy, N.R. 2010. The
Casiquiare River acts as a corridor between the Amazonas and Orinoco river basins:
biogeographic analysis of the genus Cichla. Molecular ecology, 19(5): 1014-30.
Willis, S.C.; Macrander, J.; Farias, I.P.; Ortí, G. 2012. Simultaneous delimitation of species
and quantification of interspecific hybridization in Amazonian peacock cichlids (genus
Cichla) using multi-locus data. BMC Evolutionary Biology, 12(1): 96.
46
Winemiller, K.O. 2001. Ecology of peacock cichlids (Cichla spp.) in Venezuela. J. Aquaric.
Aquat. Scien., 9: 93-112.
Zaret, T.M. 1977. Inhibition of Cannibalism in Cichla ocellaris and Hypothesis of Predator
Mimicry Among South American Fishes. Evolution, 31: 421-437.
Zaret, T.M. 1980. Life history and growth relationships of Cichla ocellaris, a predatory South
American Cichlid. Biotropica, 12(2): 144-157.