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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SAO PAULO
RADIOIMUNOENSAIO DO HORMÔNIO TRIIODOTIRONINA (T3) NO SORO.
DESENVOLVIMENTO DE UMA TÉCNICA DE FASE SÓLIDA E
COMPARAÇÃO COM DUAS TÉCNICAS DE FASE LIQUIDA.
POL1ETILENO GLICOL (PEG) E DUPLO ANTICORPO
MARGARIDA MIZUE HAMADA
Db**rt*ç*o •prnr.itiHia como p*rt« dm
r*qunitot part obt«mção do Or»u d»
Mwtr* «m T*cnolo9M Nudtar.
Drttntador»: Dr>. Conitánci» P9p»no Qoffç«lvtf-d« Silv*
.'..fin CAULO
'.965
10 TRIIOTOTIfOm (T3) NQ SQRQ.
EESENVDLVIWEMfD EE LMft TÊCNICft EE FASE SOUEA E
COM DUftS TECNIGflS I E FflSE LIQUID:
POJETIlBi) GLICGL (PEG) E DUPID MICDRPO
MARGARIDA MIZUE W1ADA
R E S U M O
EstabeleoBU-se um sistema de radloimunoensaio de homônio t r i io
dotironina (T,) pela témica de "Fase Sólida", imobilizando»se anticorpo,
anti-T, em tubos de polipropileno pré reoobertos oom glutaraldeido polimeri
zado em meio alcalino. O reoobrlmento dos tubos foi realizado pela reação
dos grupos andno do anticorpo com resíduos de aldeido que reccbretn as pare-
des dos tubos» tendo sido estudadas as variáveis seguintes: concentração,
pH, tempo e temperatura de incubaçãb do glutaraldeido e anticorpo.
Avaliou-se a qualidade dos tubos reoobertos pelo seu desenpenho
metodológico no radioinwnoensaio (RZB), analisando os diversos parâmetros
do ensaio, a saber: a dose mínima detectável,a ligação inespccífica ("MC3"),
"X50%"' indtnaçio da curva ("Slope"), precisão íntra e inter ensaio, exatJL
dão do método e digito de mérito.
OoRpaxou-se esta técnica oom outras duos, a técnica de "Du lo An
tloorpo" e de "Solução PEG". Na apreciação dos resultados concluiu-se que
os parâmetros obtidos.foram semelhantes para as três técnica», indicando
que os tubos reoobertos soo n "tequados para serem utilizados no RTE nas con
diçõcs estabelecidas.
Os intervalos de valores da concentração d» T, no soco d» indi-
víduos hipotireoiâeos e hipertireoideos e a faixa de normalidade de T 3 fo-
ram cfeterstínados para a técnica da "Fase Sólida".
A qualidade e as características dos reagentes utilizados nos
RIEs foram avaliadas. O rendimento e perfil raâiocxonabogrõfico da marcação»125a atividade especifica e a estabilidade do I-T-j, resultados da análise
as Scatchard (a constante de afinidade "K" e concentração solar *qJ") e a
especificidaúe do anticorpo fora» ccsparáveis àqueles dtaúos uns biblioyra
fias pertipentes.
fflDIOffHMMSSfflf RK TffllttPItfflCNINE IN SEBft ffVEUIfBff CF
M SOUP PTOSE TECtftlC AND (HfWttSGH WITH TWO UOUID PHflSE
RIA SVSlfflS: THE KLYElHflBE GLYCDL (FES) AND DOfiLE
mac wmn
ABSTRACT
tie haw» established a solid phase radioiinnunoassay (RIA)
for triioabthyronim (Tj), fay imnobilizing triiodothyronine antibodies cit
the inner wall of reaction txdbes. The antibody-coated tubes were made >ia
reaction of antibody with glutaraldeyde residue pre coated on the inner all
of the tubes by alkaline self-polimerization. Reaction paranetexs sud. c«
aoncentxation, pH# Incubation temperature and inoi>ation time for the g l u ^
raldeyde and the antibody in the coating tubes were studied.
The quality of the coated tubes was tested through i t s
in RIA Methodology, by analysing the following RIA paraneters:minijmir!
table dose (MDD), nonspecific binding (NSB), "X^", slope of the star4-..-i
curve, intra and inter assay precision, accuracy of the method and figuro
of merit.
The experimental data ware ccnpared with two phase liquid racli-
oinraunoassay system, the PEG solution and the double antibody technics, j>ie
solid phase RIA results obtained were ocnpnrable to thono of t ie rcG
lution and the double antibody RIAs, indicatimj thnt üvs nntibocly o
tubes are adequate for use in solid phase T, RIA uncler the e^
ditions.
The serun levels of T, in hypothyroid and hyperthyiT>±d patients
and the nonral values range were determined for solid phase MA system.
'ike quality and characteristics of the reagents used in the RIA
vere analysed. The efficiency of the raciiodination procedures, the radi-
ochromatograKi analysis of the I-T-j, the affinity constar» of the nntigen-
-aatihody reaction "K", the antibody concentration "c^" (Scrtchard analysis,
and the speciricity of the antibody cire in good agreement with those found
in the l i tera ture .
PÁGINA
I . INTRODUCED B PROPÓSITO 0 1
II. EQUIPAMENTOS, FEAGENTES E PflOCEDDENIO EXPERDOTOVL 11
1. Equipamentos 11
2 . Feagentes. 12
3 . Procedimentos Experimentais 16
3 . 1 . Marcação de T 3 ocm 1 2 5 1 16
3.2. Purificação da Triiodotircnina Radioiertoda em Coluna
de Sephadex 17
3.3. Rendimento da Marcação de Hormônio 18
3.4. Determinação da Atividade Específica cb 1 2 5I-T3 19
3.5. Obtenção do Anti-soro, Anti-Tj. 20
3.5.1. Preparação do Conjugado TyfKUi 20
3.5.2. Preparação do Anti-soro. 21
3.6» Separação das Imunoglobulinas G (IgG) do Anti-soro ,
Anti-T3 21
3.7. Preparação dos Tubos de Fase Solida 23
3.8. Avaliação nas Características do Anticorpo 24
3.8.1. Determinação da Diluição Adequada do Anticorpo 24
3.8.2. Especificidade 25
3.8.3. Caracterização da Constante de Afinidade e Concontração Molar do Anti-soro 27
3.9. Preparação da Mistura da Soro Humano Isento efe T3. "SOK> STRIP" 28
3.10. Preparação dos Soros de iteferência (Padrões;) rfc 1'v.. 28
3.11. Protocolo da Radioimunocnsnio c3o T3 pr?l/i T*"-TIUVT &*
"Fasa &5lidi" ?9
PÁGINA
3.12. Outras Técnicas de Radioiinunoensaio de T, 29
3.12.1. Protocolo do RIE do T 3 pela Técnica do "Du-
plo Anticorpo" 31
3.12.2. Protocolo ào RIS pela Técnica de " Solução
~" 31
3.13. Curva Padrão 34
3.14. Avaliação dos Ensaios Realizados 34
3.14.1. Dose Mínima Detectãvel 34
3.14.2. Precisão do Ensaio.. 35
3.14.2.1. Perfil de Precisão Intra-ensaio.. . 35
3.14.2.2. Perfil de Precisão Inter-ensaio.. . 35
3.14.3. Exatidão 35
3.14.4. Digito de t-érito 35
3.15. Cálculos Utilizados na Avaliação dos Resultados.,. . . 36
3.16. Caracterização da Faixa de l\tormalidade 36
3.17. Determinação dos Níveis Séricos de T3 em PacientesIÜLpotireoideo e Hipertireoideo 38
III. RESULTADOS 39
1. Triiodotironina Marcada can 1 2 5 I - 1 2 5 I -T 3 39
1.1. Purificação do T3 RndioiodadO '. 39
1.2. Rondimento da Marcação do IJorziCnio con J I 39
1.3. Determinação da Atividade Esj«cífica 44
1.4. Estudo da Estabilidade do 1 2 5 I -T 3 , Conservado esn Tm
pileno Clicol 50^ 44
2. Obtcr/,vb Co finli-í>oro fA
ÍNDICE
PÁGINA
2.1. Quantidade ds T, Conjugado ao soro Albumina Bovina
(SAB) 44
2.2. Preparação do Anti-soro 47
2.3. Separação das Iinunoglõbulinas G (IgG) do Ar.ti-soro.Anti-T 3 47
2.4. Estudo das Condições Adequadas para o Kecobrimentodo*:
Tubos cem Anticorpo (Tubos de "Fase Sólida") 47
2.4 .1 . Efeito do pH na Poliroeriz^ção do Glutaxaldeído
nas Paredes dos Tubos 47
2.4.2. Efeito da Concentração do Glutaraldeído no Pe
cobrimento dos Tubos 50
2.4.3. Efeito da Tenperatura no FScobriinento dos Tu-
bos 50
2.4.4. Tenço de Incubação para Recobrimento dos Tubos 50
2.5. Avaliação das Características do Anti-soro 54
2.5.1 . Determinação da Diluição Adequada do Anticorpo
para Reoobrimento dos Tubos 54
2.5.2. Especificidade do Anti-soro, Aiiti-T-j Utilizado 54
2.5.3. Caracterização da Constante de Afinidade e Con
centração Molar do Anti-soro 54
3. Resultados das Características das Curvas Padrão 58
4. Caracterís ticas Metodológicas dos Ensaios 62
4.1. Dose Mínima Detectável 62
4.2. Precisão do Ensaio. f>7
4.2.1. Perfil d3 Precisão Intra-onsn.io 67
4.2.2. Perfil te rrccj.são Inter"cnsnio C7
4.3. Exatidão
J
PÁGINA
4.4. Dígito de Mérito 75
5. Caracterização da Faixa de Normalidade 76
6. Níveis S é r i o s de T, em Pacientes Hipoticeoidpo e Ili[X?rti
reoideo 79
IV. DISCUSSÃO 81
1. Marcação da Triiodotironina oan " 1 81
1.1. Análise do Perfil Crauabográfioo cto Substrato Marcado 81
1.2. Determinação da Atividade Espp'Ufica do JI-ri'3 81
1.3. Estabilidade do 1 2 5I-T3 Armazenado em Solução de Pro
pileno Gliool 50% 82
2. Características do x\nticorpo 83
2.1 . Diluição Apropriada do Anticorpo, Anti-T. 83
2.2. Especificidade do Anti-oorpo, Anti-T3 84
2.3. Constante de Afinidade "K" e Concentração í-tolar \\"
do Anticorpo 85
3. Características Físico-Qulüdcas 83
3.1 . Separação das Imunoglobulinas G(IgG) do Anti-soro, An
t i -T 3 83
3.2. O pH Apropriado da Solução na Polinerize^no do (íluta
raldeído na Parede do Tubo. E6
3.3. A Ligação Inenpecífica no Sistema de "Fase Sólida"... 88
3.4, Efeito da ConoRntraçíío e da Itecpemturn de
da Glutaraldcícb no Rccobrir>2r.to foa 'lV~<->:; 83
3.5. Efeito cb Tc:ipo c da TcnipC'raturci £:• Ina.jU:c,w na Ir.o
bilUMií,:ão d) ravLia>rpo C9
ÍNDICE
PÁGINA
Características Metodológicas do Ensaio 69
4.1. Características das Curvas Padrão 69
4.2. Estinaiiva da Dose Mínima Detectável - DMD 90
4.3. Análise da Precisão do Método (Perfis Intra-ensaio e
Inter-ensaio) 90
4.4. Avaliação dos Paranetros Metodológicos das Três Téc-
nicas 91
4.5. Resultados da Concentração das Amostras Dosados - Exa
tidHo âo Método 92
Caracterização da Faixa de Normalidade e Níveis séricos de
T 3 Encontrados em Pacientes com Hipotireoidismo e Hiperti
reoidismo 93
Vantagens e Desvantagens da Técnica de "Fase Sólida" 95
ZWSfiES 96
I.
A glândula tireoide exerce, fisiolocjicajrente, una inportan-
cia excepcional scbre o organisnD no ser humano. Dentre as suns atividades
destacam-se a produção e secreção dos hormônios triiodotircnina (T ) e tiro
xina (T J t cr> quais são considerados netabolicamente ativos dentre os nrodu
tos secretados pela glândula tireoidiana.
Estes hormônios tireoidianos são produzidos pelo estímulo do
eixo hipotálaircHilpofisário-tiraoiUiano. 0 hipotálamo secreta o hormônio
liberador de tireotrofina (TRH), fstiiiwla a pituitárla anterior para que
ocorra a síntese e liberação da tireotrof ina (TSi!) hipofisária. A tireotro-
fina (TSH) liberada atua sobre a glândula e faz com que a col'ila tireoidia-
na libere os hormônios (T, e T^). Por sua \-az, a síntese e secreção do TSÍI
são reguladas, de acordo com o mecanismo de retroalimentação negativa, pe
los níveis de hormônios tireoidioro's circulantes.
As células da tireóide capt4 m iode to do líquido oxtracelular
por um mecanismo ativo. 0 icdeto incorporado pela tireóide é organifie-lo
rapichrrente, fixando a aminoácidos contidos na tireoglciwlina (proteína ar-
rnazenada na substância coloidal do folículo tireoidiaivj} para sua utiliza
ção na síntese da T 3 e de 1'4.
Entre os aminoácidos encontram-se moléculas de tironina na
qual se fixa o ataco de iodo. Pela ação enzimãtica responsável pela oz.Ha
ção, a peroxidase, forma-se a nonoiodotirosina (MIT) c diiodotirosina (LÍL)
(Figura 1).
HOCOOH
- CM '
Manoiodotirosina Dlioctotirosina
L - Fórmulas estruturais do nonoldotirosiiia c dliodotirosiiia
A formação de T_ e T. se dá pelo acoplanento de dois resí
xs is , coro a perda de um radical alifâtico e formação de uni grupainen
lil-Õter iodado (Figura 2) <52 '68 '83>.
CHi-CHy
NHl
"COOH
.NMt
^ C O O M
Liodotironina Olroxina
: - Formulas químLcas dos homcnios triioüotiroíiina e tiroxbia
Estes hormônios são liberados mediante proteólise eiizimátlca
ortados por proteííias plasnátlcas {,'IHG, 1BPA e albuidna). o tra>B
stes hormônios se dá em sua quase totallUaiJe por i.elo da ligação
a fração albundna e TDPA tanbém ligam e transportam estes íiomCiii-
ro cxxn menor afinidade que 1BG. Estas proteínas estão liyíídas ao T,
r a£inidado do que ao T , e caio resultato o T3 apresenta uma iteia
lógica nvils curta boxn cono tuna ação liais rápida o i\yy%7. quo o,81,83)
3.
O T 3 5 netabolicaiaentc três a quatro vezes mais ntivo que o
T 4 e apesar da sua baixa concentração na circulação sangüínea, aproximada
mente 70 vezes menos que o T^, contribui substancialmente na atividade ;:eta
bõUca tireoidiana (15'52'83>.
A raior parte do T_ circulante (76%) é derivado da monodesio
dação do Tj era tecidos periféricos, sendo apcr.^s una pequena quantidade pro
duzida na tireóide. Cerca de 85% do T*4 netabolizodo diariamente c dcsiodaúo
ao T 3 e ao seu isônero, a 3,3',5* trüodotironina (T^ reverso, rTJ. O res
tante é perdido, aparentemente cono tixoxina e seus conjugados, ou netaboii
zado pela deseminação e descarboxilaçao ca cadeia lateral de alanina, a ácL
do tetraiodoacético (TETRfiC)15'12'67' .
Sinilarmante T e rT_ são desiodados a 3,3* diiodotironina
(3,3' T_), sendo o rT, tairbém desiodado a 3,5* diiodotironina (3,5* T ). Por
outro lado, pode ocorrer a formação de ácido triiodoncético (TRUVC) pela
descarboxilaçãb ou desaminação destas triiodotironinas
0 nétodo utilizado na determinação sérica do T 3 deve, portan
to ser especifico, pois a interferência destes conpostos que guardam certa
identidade cora a molécula de T^ pode superestimar o valor deste hormônio
presente no soro.
Desde a identificação do T 3 em 1952 , diversos nétodos fo
ram desenvolvidos para a determinação da sua concentração no soro. O método
inicialmente desenvolvido envolvia, seqüencialmente, a extração <Tas tirorii
nas (T-j e T j) do soro, separação do V^ do T4 \x>t cromotorjrafia eni papel e(G6)
quantificação do iodo ligado ao Tj (T^I) pelo método químico. Pind r.n\
1957 estimou a média da concentração do 'í\i nos indivítluos normais *:.i
150 ng/dl, e co.-no o iodo constitui 57% do poso molecular tte T3, n mália da
concentração de T, no soro foi de 257 ng/dl. Por um rrcto-lo similar, liacla(5r0fi'--v. om 1957 avallcu a conocntitiçao desyo horr*-nio • • 500 ny/ui. 1'iitio
tr-nto, esta tcaúc.i vcstrcvrce pouco síinaívcl o jT.:pr+/'!ML.tvr>l, além rV: r/.r
t e d i o s a c dexorada não sen to , j jo r tan to , ap l icáve l ã í o t i a i d« t>)?.Tjpin
(Cl) ini)
Kausiann e col cn 19G7 o Stcrl.Lrt'; o col cm 190!> n'lo
r e n o n í t o d o do ensa io por l i gação tia coupe tir-ao p r o t í i c i d i Murphy - r
(CPBA) pa ra quant i f i cação do T-, G cnccntrar.i::», it?r.|**el.lv.:ut.onfce, 33;)220 ng/dl de T-, no soro de indivíduos normais. Esto netmto iratém iT»jm«ria
o processo do e;±raçãb das xodotironijias do r-nm o crponçõo «Io T *l<> T.
jx)r croiratografia era pcpcl para posterior nervsur.iç;*;) tio T,. Ks^ l^núoi
fornecia rccnccntraçõcs do T^ suíjriores àquelas existent.*» no noco, \>rova -
vclirente, por causa da separação inconpleta do T do T- •> «> procedo U(Í
desiodação do T., a qual conduz a formação cia T- duronlo «i fran de
. Por outro lado esta técnica requeria teüix> e \T>Uotc tio soro
grande.
Em vista destes resultados Dussalt e col * '* cs:i 1971, desen
a técnica de cronatografia cm dupla coluna para õeloi-nnn.-\>po <1Q
T v Elos observaram qtc, quesndo corrigidos por artifícios i«r*tc»V>l*xjia/3, o
inten/alo do ccnccritrcição de T_ RO coro em indivltluos noruiln v-irtnvn entre
25 a 203 ng/dt, asa vrra ncdla da 98 ± 38 ncj/dl. ILIS, além d«> ser ÍOIVT lécrü.
ca corcplexa e c^tteradít, a larya cotreçno por a r t i í l c k « j!c-.ixV/J.õyi.co:í cvtuaa
vn scrxos prcbleinas
Ho inicio da década de 70, Mitsucn e col*53 'C '1) ricwnvolwram
a croiratografia líquida-gacorja para dotermlnnção <To T o oncnntr^ríim wwvt
çâo de 137 ng/dl, enquanto qua Ilaçjcn o inl '"*' p"lo ÍIRÍXKÍO de
d.E>lo isõt&po estiraran XCT valor ncdLo d" 226 ivjAll. FJitrotnnto,
tos com estnc tecnicar; Ucm penranecidos liiritíKVr,, yr.i.:', .-Aim rir? trol.-nllio
nus, rcs5uorc:n iJistrunciitos espccinlizatJ^-; .
O iraior í?*\'?onvulv.lnw.L':> f-1"1 líotc>iT»^I->'|f.i d i (lírr.Tf/f! t%- 'J' foi
(i',)c r . c o r i l x a J o r « r Uvcrv/n e c o l ç;u 1 0 . " . j ; l c r , rírV•.!.••.;•-.;« ( J £••; " - c ' l " :-I:-.T<'—.-.•» !.^
'svio (To ;u
5.
posto maior, o succinilato de polisina. Apesar deste anticorpo não ser ade-
quado, por apresentar una reação cruzada de cerca de 5% cem T. , recen"!t«.in-
do, portanto das fases de e x t r a i o e cromatografia similar àquela üsnda por
Sterling , esta descoberta representou ura contribuição iiqportante, pois
as iodotireninas não são antigênicas na sua fonna natural.
Desde então, naiitos progressos foram alconçctdo3 utilizando-se
uma variedade de processos químicos para ligar covalentemente o T ã outras
moléculas maiores, para a imunização, a saber: alburaina, tireoglobulina, po
l is ina , cbtendo-se assim anticorpo, anti-T- altamente específica ' " ' '"^49,53)
Estes resultados conduziram ao desenvolvimento do radianunoen
saio (KD3) ' para dosagem de T total no soro. Os priireiros resultados
obtidos na sua determinação apresentaram valores notadanente diferentes.
Oiopra e ool estimaram a concentração de T^ no soro de indivíduos: no£
mais no intervalo entre 100 a 170 ng/dl, enquanto Gharib e col * ' encon
traram uma média de 218 ± 55 ng/dl. Essas diferenças ocorreram por causa da
interferência da proteína ligadora do T no soro que poete limitar a ef iciên
cia do T, na reação cora o anticorpo.
No entanto, adiedrnando-ce na mistura de incubnção do R[F. ,
substÜicias como tetraclorotironina , salicilato de sódio , inertioL}
te e ácido aniliro naftaleno sulfônico (ANSA) para bloquear -.s pro
tsínas ligadoras da T. do soro, encentraram-se variações pequenas rv>r.
rrativas do valor reclio da concentração de T. no soro de indivíduos nomair;.
Assim, o valor médio variou entre 110 a 145 ng/dl com intervalo de 50 a
210 ng/d l ( 1 3 ) .
Alguns investigadores não convencidos da exati<?.7-j On tun sim
pies HIE de T- total , desenvolveram nctodoG nialo tríibiilhonos tio PJK qun rn
cpsrom extração do sc"o ' , n~s os rccult.V.os ]c\<", ò.>ir. i^tclcr; ivío fo
r-a sirnificjttivr.ncrsce diforenter, ' ,
íto presente, o nótodo mais utilizado ra sua dosíiyem ó o radio
inamoensaio , q»« se caracteriza por ser altamente preciso, eupcciCico e
sensível e ainda oferece a praticabilidade exigida, tornando-o exequl
O principio do radioixunoensaio baseia-se na ccqpetição entre
antígeno marcado isotopicaiisnte (Ag*) e não marcado (Ag) pelo anticorpo (to),
formando ccnplexo antlçeno-anticorpò. Essa reação de corpetição otxxfeco a
loi de ação das irassas e pode ser representada pela equação:
Ccrrplexo
Antígeno I-brcado-Antioorpo
Ag* - Ac
Antígeno^«urcado +
Ag*
AnticorpoEspecifico
Ac
Antlçenonão marcado
Ag
CorplexoAntlçeno não narcado-Anticorpo
Ag - Ac
ís2sta reação a quantidade de produto antígeno irarcado-onticorpo (Ag* - Ac)
é dependente da quantidade adicional do antígeno não m:trrrcf!o. /issiin, quanto
r i ior a cjuantidatle de antígeno n5o irarcado no meio da reação, nenor a rjviin-
tidade de anticorpo que estará disponível para a ligação com o inarcadu. Man
tendo constante a quantidade de anticorpo e de antígeno rareado corrt?spon
dcnt"r. a adiçHo de padrões da ontIçjGr.o não norcado e:n conccntrnçõcn croGcrrn
tes , ocasionará ur.i dcislocnincnUo proporcional díwiuele norcri-Jo a p.rrtlr do
co.Tple:ío antlgcno-íir.ticcsT0, obectecondo a lei úo 09ÍI0 das nossas, fcnri.i for
ira, por2G-se c!cfccmLr.ar a.qmntidado do r.n'igcno do u.-« ;o.r;trj do;;oonljcx:l.iv
fa':cr.Co-se o iro Co v.-.t enur/a rloso :•: rcrjxrjtn (tj'r.jiiii.b'.!-- ' • Aj vrr.t):s ra
7.
dioatividadc da fração Agí_
Cs resultados esnenciaiu jxira o Pis:, coa'iLr.tein, {«cctarsi.o, 1)
no preparo do sntígcao mrendo e dos soluções: pa-lnles {.-iu'ly-i» não pm eodo
usado cato referência cm concentração crescente), 2) iv» r.íítnjçrio Co c:».ti';or
po especifico G 3) na e~oolha da técnicas aitequuti:; qus i<?nt;itn:;i a no;\ir.i
ção do ccirple:» antlqcno-anticcrpo do nntígeno livre ÍIJ»!G ntiiKjimui «j
líbrio da reação*.
CS critérios para a seleção Jc uso técnlcn (Tn n^wr.Trã') cn
tre as frações "ligadas" e "livres" devera olanüci: os ar;i>ccl.<iR FP»aün{.<»f;:
a) eficiência da ceparação ccnduzimlo n jry\iriKa v.nlor*r; Co
erro de classificação,
b) praticabilidode (siirplicidade operacion'il, r™>'ulcz, ct/j)
c) economia c
d) confiabilidade (precisão, exatidão, espoclCicidatte o nonr.L
bilidade).
Os diversos mü todos de separação ciT^n.Kbo b.:w?innr-»» IMS di
de configuração nolecular cntxo o nntííj^no llq-Tlo r» o li.vr»? .iiá
técnicas baseadas nas afinidades oilTOrtiv.TS derc njitti|ern-« livmn ' ' '' ,
na r.dgração difomncial do coirplexo formado e <Sn ít^õo J Lvre ' ' o».i
nas precipitações sel*?Livns dos caiple-T^" cntítr-ri-j-ontlcruix-» \nr inn
nnl ' , por um colvrntr ; o rqônico ' ou po r inn r'?rpnnTi> nut -norno *' ' '
88) -. Existem a inda a s t é c n i c a s quo adsorvem OJI cvT^rir?::nii o nni i i r r f o r;u i-n
torial de fase sólida, cemo por e:x?irç>lo, a aiLiowfto cin tiJftr; p lantÍCT OU
' ' 'com
dosaycn tio T é utilizada cin ÍÚ^O-I erxviln i« rr/in;*» di cu
íí i; r:c;c I t rn q-.io o :mr.c.nln t-.,0;-:1
crinologia, no diagnóstico do liipertiroidisiro ÍÍ liipotiroidisno.
A iiqx3rtSncii\ econômica c social tin dosagem do T sCiico, jx>
do SOT aquilatada pelo ceguinto ejxsrplo: KDS sccgões tie HIE tion Liijor.-ito
rios clínicos modernos o T^ abrarcjs nproxiinadainente 15% tie l>«l» a sm ro'.i
na. .Anosar dessa incontestável importância, lniifíntaveliwmt-o, om rrr^no rr-io
a noior parcela do CGRSHÍPO de ren^wites utilizados rei siui dosof m é aiiyla de
procedência isçortacia. A necessidade da liiportação tlrrs rfwjpntrs to:n sitio
justificada pelas dificuldades tecnológicas de sais preparações.
Dentre as tCcnicas de IUE mais utilizados atiialJtonte fxira
qinntificação de T, destacwr-se a denominada de "Solução VYX1" ' «To "Dirplo
Anticorpo"(88) e de "Fase Sólida" ( 9 ) . Estas três tócntcos diferan entro üi
no processo d3 soparação da fração do antlgeno 1 :.vro do cci.pl«>vx) antT-jono-
anticorpo.
íta técnica «a "Solução PEC" utili&.i-se n ptí^ri^lnde do polis
tileno glicol d*? precipitar, mediante centrifugoçÊío, noléejlos do
das çarrviglcljuliiias, ccnsequenteniente, o corplexo antlycncr-nnt Lcorfx».
Na tõcnica do "Duplo Anticorpo", um sefjurvJo anticorpo, íui
raglobulina c u^ado para pr^-ipitar o conplcxo pri«5r?o. A H'RCTO <-w re o
princiro e o segundo anticorpo forma corp.ls;-» uv,- prcporçõerj colecularcs
permite a sua precipitação. Este recurso tom a caractcarlstica dt? apreso
alta afinidade pois, o segundo anticorpo reconhece e"j-""i f icui^nU: .ir;
globiilinas do primeiro anticorpo dor.tre as denais protoíis.'is <'.o intuo n'-ri
da íwostra. No entanto, esto irõtodo necessita tanJjéin do c:oritriiijtf.i>;~o o c<?
um período adicional do inciiTação, na quai ca procesaa o 1 iq.^-ão do r, M'i:' 'o
anticorro com o prinrciro.
autores coirbiriarn catar, duas LricnLc s uí.ili/.ir/io <•"».••»->
Ç ü o .:•. m . í 5 [ ; i u ' . i d o r i > G c o m o .".•'•.;•;;•, >,•> t?.,i L i • : ; - r < >' ' ' . \ ' - . ; ' n
- i e a : ' r r ; ! : r > n.-. b ' r . r » r a r n r r t c r I r ; ' ;/•;-• f i - ;•-•!.-•:•,, r\< • • • • • ) \ r .-•'
9.
ta afinidade, baixo nível da reação cruzada e praticwrntn ivio neomwitn di
sccjuida fase de incubaçõo, en-bora ainda requeira fnnc laborai.'niú «fc con
trifuejaçõo.
Na técnica cia "Fase Sólida", o anticorpo c fbii'lo em i^llrrc.
res insoluveis, por cxcsnplo, na paredo do tubo «te reaçrw . A
fixação «3os anticx>rpos ã superfícies sólidas poete .'ser feita pr?r sii^>lfís <~K.1_ _ . (8,10) , . _ , 145,65,71,76)
sorçao fxsica ou por ligação ciuinaca coval^nte . f-v.ty
restxi caso a reação antlgcno-anticorpo se realiza .u» fase sólida, a separa
cio da fração livre do caipicxo é feita por siirples decontnçãb õn fase lí^
quida. Ê considerado o método de separação mais prático o efienz da fração
livro da ligada . As vantagens desta técnica são inúmera*;, a saber: •'• Laboratorialmanto mais sinples, não necessita de ccntrifuy-içíío ocro ar. tlorrviirv
cxiç3 o mínimo de operações e grande rapidez de trabalho, i^roiHrvTo anslm
qvK infireras determinações sejam realizadas rapldanente. Pode ser utiliznda
por qualquer laboratório que possua un nedidor cte rndloatividoue e c*«rnlm. n
t s ajTrosenta roelhor perfil de precisão nos resultados.
Cbserva-se na literatura uma preocupação crescente q>jonto aos
as[x;ctos netGdolõgicos que conduzem â slr»7lif icaçõo da dosnqíün d»? homô
nios i ' ' ' ft razão desta tendência é que pLirrola poivter'-.Til das
scxriedades inodernas fazem hoje ic?o da metodologia dos rndioennaicr:. prlnci-
pnlmcnte os de "Fa'je Sólida". Edunldt e <rA WW i > Ta tom qiir? na tX>púljlU%i F's
doral da Aleitvmha aproxírrv^TTPnte -50 milhfes (GO't) dr? r.otis ínbltant^s •nio
sulxctidos anualífcnte ã prova desses radiorursaiou.
de todos ess u» evidências, n5xirf?t\toi!rtitr» imiito jT>ucn
atenção tem sido disj-cnsada a certos fases expariürrntni". «.V» p
•- (2)do "Fa.se Solida" e suns prupritxTades , pcirüicuJnninniXí «ri
• r i o .
10.
PROPÓSITO DO 7R/\PAU«
O objetivo desta trabalha é estabnlocer asfxxrtos teori 'xy, e
práticoG da netodologia da preparação dos tiáxs <7e "Fa'jo SôlixW pí».rn a do
sagGtn de triiocotironina (T,), avaliando o seu íV oenppnlíO mtcli l t / i ico IVJ
radi.oiiumoensaio, quanto nos critõrics de cxínfiaíjiliil,!'^ >V> pt«oio n*1.:»t n
do-se a precisão do ensaio (j-ierf is in»ra e in^^r^-cn-jíxío), o;<ntic!.To, t?sp.«ci-
ficidarfe, a doe» t,ínLma ctetecaivel (DMD) o a ^VI1Í<J.T'<? Q corocterístrens cks
rcacentes básicos utilizaiIOG.
1 1 .
ii. ewfyrerms, mum \. \vmw.\w mm
1 . R
1 . 1 . Balança í»mlíh.i'"-» m*-'-> ' " ' t t l o r , «rxT'?lo M?OT, "m i-j---- - .'T«iú
.1 .2 . A g i t a d o r ragnético niõ^ca F i s c h e r í ^ : ° n t . i f i c C o . , r . / i e l o I ' , I
1 . 3 . Goluna c r a : a t o g r á f i c a cfe d i n e n s õ o 0 , 6 x 3'1 cm '-'; " -
itvirca Ói
1 . 4 . C o l e t o r de f r a ç õ e s n u t o n á t i o o marca LKB, TTO.AÍIO Uitr.---— 7f?of>. Pi>*
c i a .
1 . 5 . IV^ilx» p e r i s t á l t i c a nnrcn IK», ntxl^lo -IO]? A, S C I V - K I .
1-6. C e n t r í f u g a a u t o m á t i c a c&m unida<le úc r o f r i t / r r -v / ão D v . n -n ; i ; i . i fo
PR-6000 da I n t e r n a t i o n n l F/piipontüit Coi^viny, rievjdh.im H"í.«Tfite ,
M a s s a c h u s e t t s , E.U.A.
1 . 7 . S i s t < v a a u t o m á t i c o clc» d e t e c ç ã o d e r a d i a d o cenn f l i i ' J k / I o r t'/í
Uai (Ti) t i p o fjocp dr? 3 x 2 polHr;odrts nv-non *':•! ' : >t (i-i-:;>•:••>, •>.:;.;>..
1 . 8 . Ag i tndor Vorf-v:-Geni« uxxkrlo K - 5 ' í fi nv>r'-;i D'.-if-nLi r i ' : ín \>\-\ -r\rx
I n c . - Sp r ing f i e l d , í t » s s . , U.S.A.
1 . 9 . Corp.itru.lor nvirra Tí'"l/170 m x b l o 15r> <>' i v n - i ' - : - v . •'-•• ••'>
12.
1.11. Espcctrofotõcretro rcarca ZBISS PM - 11 da Carls Zeiss,
1.12. Bonfoa de vácuo da MiUiporo Fi l ter Corporation, Massachusetts ,
U.S.A.
1.13. Tubos do ensaio 12 x 75 ran, de polipropilcno, Vidrolabor, S-*"» Pau
Io.
2 . REGENTES
2.1 . Triioúotironina enpzegada na preparação de soro de referência (pa
drões) e na cbtençio do anticorpo, antt-T_
3,5,3' - L-trüodotirorúua da Sigma Cheiaical Corç>any, St . Louis ,
Mo., E.ü.A.
2.2. Diioctatironina erpregacla na marcação (T )
3,5 - Iy-diioãotironina da Signa Cher'^ol Carf«ar;y, St. Louis Ma,,
F..U.A.
2.3. Sübstâncins análogas a triiodotironina utilizacVis no estudo de esçe
cificicade
2.3.1. Triiodotironina rev?rso (rT,)
^ ,3 ' , 5 ' triiodotironina On Si ma ClifíndcíJl Gw\xav/, St. Lc>ulCy
Vo., E.U.A.
2.3.2. Diiodotirorlna (T2)
3,3' dj.ioc3ctironina da Sigma Chni;iicnl Coniwrr/, St. LOIÚÍ; ,
Vo., E.U.Íw
13.
2 .3 .3 . Tiroxina (T4)
3,5,3' ,5' tetroiodotironina dn Sigma Chnmical Gbapany, St.
Louis, Mo., E.Ü.A.
2.3.4 . fcido tetraiortoaogtioo fJETIWO
3,5,3' ,5' ácido tetraiottoaoétioo da Sigma Chemical
ny, St . Louis, Mo., E.UJV.
2.3.5. ftado triiodoacético (TRIiVC)
3,5,3* ácido triiodoacétioo da Si-ira Chemical Conpany,
St . Louis, Mo-, E.U.A.
2.3.6. Diiodotirosina (Drr)
3,5 - Diiodo-L-tirosina da Sigma Qiendcal Coqwny, St.Iouis,
tk>., E.Ü.A.
2.3.7. iixwiodotirosina (MTT)
3-Zodo-L-tizosina da Sigma Oiemical Ocrpony St. Louis Mo.,
E.Ü.A.
2.4. TaBpão Fosfato 0,2ii pü 7,4
Monchidroçpnofosfato cte sódio (Na^DP04l2H 0) , Merck S.A. . . 58,02 g
KLhidrogcnofcsfato de sódio (NaH2TO412»2O), tterck E.A r>,28 rj
Água destilada rj.s.p. 1 1
2.5. Tanpõo Rssfato 0,02M pll 7,4
Diluição do tcarpãb anterior 1:10
2.6. TnnpSo Fosfato 0#05M ill 11,9
r^nof-oTato cV; potássio (K^iio ) , ifcrci; S.A 8,3 rj
f/"T fj.n.p. I 1
14..
Acerto do pH foi feito com NaOK IN
2.7. Tecpãò Veronal 0,05M pH 8,6
ícido d ie t i l barfaitúrico (C^H^W^Oj), Mertí; S.A 1,884 g
Baxbital sódico (CgH^ryfaOj), Merck S.A 8,200 g
Água destilada q.s .p . 1 1
2.8. Tanpão \feronal 0.025M pH 8,6
Diluição do Raspão anterior 1:2
2.9. Soluça) saturada de sulfato cie amôaio
Sulfato de sncnio (r«4)S04, Merck S.A 796,50 g
ígua destilada q .s .p . 1 1
2.10. Bicarbonate de Sódio 0,lW
Bicazfconato cte Sódio (NaHOXj), Kerdt S.A 8,401 g
Água destilada q.3.p. . 1 1
2.U.. Clorasiina T ( C l - T)
ClarnmLna T [Cflj£V:?.l&^.3íl2O), l-fe*de S.A 5,25 g
Tanpão fosfato de sódio 0,2M pH 7,4 q.s .p. 1 1
2.12. Xfcítabtssulfito de Godio
f fetabissulfito de sódio (Ma^O-), tferck S.A 10,ü g
Tanpâo fosfato de sódio 0,ZM píí 7,4 q.n.p. 1 1
2.13. EOIUÇ-TO Fisiológica
Cloreto de sódio (ifeCl) , lfcrd< S.A 8,766 CJ
clontilada q.s.p. 1 l
2.14. Propileno Glicol, 50%
Propileno gliool 500 ml
destilada 500 ml
2.15. Iodo radioativo
Na125I, l ivre de carregador e redutor, adquirido da tfew Euglanl
Nuclear, U.S.A.
2.16. Sephadex G-25 fino (partícula tarmrho 20-S0u), c?a Pharmacia Fine
Chemicals AB Uppsala, 9ueàen.
2.1V. Azul <3e bronofenol da Merdc S.A. - Indústrias Químicas Rio de Ja
neiro.
2.18. "Plasma azul" - plasma coratlo cora azul de bromofenol
2.19. 1 Ciclchexil-3 (2-norJ.olinoetil) carbodiiMc!.-? meta-p-tolueno sul
fcnato K^JHJJÍJO.S) da Signa Chcnícal Conpcirr,-, St. Luuis, 5o. ,
E.U.A.
2.20. Diitetilíormamida (HCCN(ai3)2) da íferck A.G., Dannasfr.-rdt, Arranha.
2.21. Soro albumina bovira fração V da Sigma Chearlcal Cop\>nr\yf St.Louis»
^to., E.U.A.
2.22. Adjuvante coirpleto de Fround, da Difco Laboratories, Detroit, f-U.,
E.U.A.
2.23. Adjuvante incompleto úc Frciind, tia Difco I-füwratorLcv;, IXitroit,
Mi., E.U.A.
16.
2.24. Carvão ativado da Mi rck S.A. - Indústrias Químicas, Rio de Janel
ro .
2.25. Msrtiolate {Timsrosal) da Eli Lilly do Brasil, são Paulo.
2.26. Anticorpo antiganaglobulina de coelho, obtido eni carneiro no
IPEN-CMEN/SP, São Paulo.
2.27. Polietileno Glicol 6000 Í?^G), adquirido da Indústrias Acias, São
Paulo.
2.28. Acido anilino naf taleno sulfônipo (ANS) da Sigma Üieraical Coiipany,
St. Louis, Mo., E.U.A.
2.29. E.D.T.A. - sal disódico de SrVfc> etilenodiomintetracético dihidra-
tado da Tferck A.G., Darmastadt, Alermnha.
2.30. Glutaraldeído 25% da Merck A.G., Darnestadt, Alemanha.
3 . PROCEDIflEfITOS EXPERIf^EMTAIS
3.1. ffarcação do T, com 1?-5I
(42)A r.fítodolocín errpretjada haseou-r-x; na deacrita jx>r Hunter ,
utilizando cx)iro agente oxidante a Cloramtna T(Ct.-T) para slntene de 1251-T,
partljsdo de diiodotironina (1'2) c 1 2 S I . Para tanto, 1 ing ás T2 foi dissol
vido can 5 ml d^ propileno gliool 503, adicionandrr-wi 25 ui de NaOH 1M. Ali
quotas dessas solução foram pi^tadaíj em tiilxis c'o vidro e innntida? a ~A0°C
até a ocRsiõo da ra
A radi.oiodaç<~o foi ofütu^da adiei'>:;'.".• 3o-r-: CJ;I \:^ rx; d:> c;nr;io
Cn 12 x 75 mn CO.TI fundo cênico, 20 u.l d: tasii^o íc-.1" '.o 0,2"; .'; ;.;i 7, '., 1 ..
17.
3 ul (37 MBq; 1 n d ) as Na125I, 5 ul de solução 1'2 Escrita acima, oonten-
do 1 ug de Tj e, en seguida, 10 ul do solução tfc* Cl-T em tampão fosfato
0,025 M pH 7,4 (52,5 ug de Cl-T). Após 40 segundos a renção foi interronpi-
da com 10 ul de solução de nEtõbissulfito de sódio em tampão fosfato (105 ug
de metabissulfito de sódio), seguido de 50 ul de propileno gltrol 50%. Os
ieagentes foram adicionados em intervalos de tempo curtos, sob agitação su
ave e contínua com o auxílio de irn. pequeno fragmento de aço inoxidável man
tido no tubo de marcação ein rotação por agitaCor nvK[r5tico.
A seguir, a mistura da reação foi peroolada por uma coluna de
Sephadex G-25 fino com o auxílio de nácropipeta automática, para a purifica
<f.o.
3.2. Purificação da Triiodotironina Radioiodada em Coluna de Sephadex
Ito preparo da coluna, o gel de Sephadex G-25 fino foi previa-
nente entunecido ceia tampão fosfato de potássio 0,05 M pH 11,9, durante 24
horas. Foram feitas quatro trocas, cem aspiração do sobranadante, utilizan
do-se una barba de vácuo. A seguir preencheu-se WT coluna de vidro de 25cm
co altura por 0,6 cm de diâmetro cem o Sephadex.
0 substrato narcado foi purificatlo em uma coluna de Sephadex,
assim preparada, seguindo-se basicamente os procedimentos descritos por
Kjedal e c o l ( 4 6 ) .
Imediatamente após a adição da mistura da marcação, a eluição
foi feita com o tampão fr -fato n,05 M pH 11,9 o frações de 2 ml foram colhi
das con o auxílio de um coletor automático 1KB, mantendo fluxo <3e 40 ml/h
com uma bomba peristált ica. Locp após n coleta tie cada tubo, nclicionou-so u
na gota de HCL 6N cem uma pipeta de Pasteur, porn neutralizar a íjolução ,
pois oshoimã-losKarcados são instãvein em soluções alcalin.is. For^ü coleta
ciar. 50 frações e da cada u;ra dccsns írr-fien aliquot.ou-se 10 ul (vira
no contactor gama a fim da traçar o perfil de radiocrcraatograna e determinar
o pico correspondente ao T, marcado.
As frações correspondentes ao pico de T3 marcado foram mistu-
radas e armazenadas a -20°C COT soluções de propilenoglicol 50%.
Para verificar a estabilidade do 1?5I-T_ armazenado, foram re
tiradas alíquotas em intervalos de tempos variáveis, sendo recrcntttografatTcB
scnpre nas mesmas condições mencionadas para purificação e , paralelamente ,
elecuou-se a radiccronatoçjrafia por eletroforese. Para tonto, aplicou-se a
uma f i ta de papel Whatman 3 MM, colocada em sentido horizontal sobre um su
porta dentro de uma cuba de eletroforese, uma alíquota de *25I-'f, misturada
em 10 ui. de "plasma azul". A eletroforese foi desenvolvida cm tu..i>3o fos'^
to 0,02 M pH 8,6 empregando-se 2 mft por f i ta , interrorpenclo-se quando a man
dia azul se distanciar 5 cm de origem. As fitas foram secas ã tei:peratur-i ~JTI
biente e cortadas em intervalos de 1 an, iniciando-se 2 cm antns do ponto
de aplicação. A radioatividade de c .da segrrttnto foi 'Isterminada no contador
caíra, traçando-se assim o perfil de cronuLograma.
3.3. Rendimento da Marcarão do Hormônio
Cs componentes presentes na mistura da rr.-rcn^'o são adsorvl
dos ao Cephadex com diferentes afinidades, apresentando assim diferentes co
eficientes de partição ' . Estes foraia identificados ^GII posição dos pjl
cec cia atividade no croratograma e as áreas correspcr.ci;ntes ã cada
te foram avaliadas pela integral da área determinada por cálculos nuticri(30)
cos, particularmente utilizando o sistema conputacional TMACRDM , diq:onK'Gl no Departamento de PrcccsGsmsnto de P. /!os do IP»K^JTíJ/f5P.
Para os cálculos de rendirento da rarcação forain levados cm
ccr!3iâ?ração an árr>-!T corrtisponctentes a cada cerponente.
A rorcont-if^m do rcnclirrcnto da imrci^üo ó (-ida )nv:
r! r.-- •• . . . . . . . . . . . . . . - ,
19.
+ \ x 100
Am + AT. + Ay
onde:
A_ = área correspondente ao pico de T^3 "*
A_ = área correspondente ao pico de TXi 4
Aj = área correspondente ao iodo não reativo
A porcentagem de l25I-T_ fornado na marcação é dada por:
x 100
3.4. Determinação da Atividade Específica da I 2 5I-T3
A atividade específica íoí determinada pelo método de auto
deslocamento' ' , incubando-se quantidades crescentes do tiormônio marcado
com quantidades constantes do anticorpo e demais condições de ensaio simila
res aquelas entregadas para os padrões.
Para esta detenr inação, foi feita primriraniente umn curva pa
drao, e a seguir foram incubadas arostras radloattvns contendo 5, 10 e ?.n
v^zes a radioatividade utilizada ra ensaio, sem adição da rrassa fria, ou se
ja T3 não narcado. A leitura da nossa de T3 existente nas amostra*» radioati
vas foi feita utilizando a curva padrão. A re5?posta Y - B/r foi calculada
para cada quantidade (radioatividade) do lU jnorcacb, csri; D representa n
contagem relativa ao conplexo |T^ - la\ (T^ mnrcatlo ligndo ao anticorpo) c
T a contagem wv;cal prcscr.tG no s.tstenu de rençHo o cofrpnrcu-3'3 por interpo-
lação com os respetivos valores dos {x.Itõf?s. A r-cjiiir, tr.T;oii-r;o o çjróíico
20.
en papal milimetrado, tendo nas ordenadas os relações B/T c em abcissas as
concentrações de T~ da amostra radioativa. Efetviou-se a regirisão linear en
tre a radioatividade total utilizada na incuòação e a respectiva irassn es ti
nuda. A intarsecção da reta com o eixo das ordenadas corresponde a nossa
do hormônio radioativo que foi utilizado para dafinir a curva padrão.
A atividade especifica é calculada pelo vnlor do coeficiente
angular da reta, rnultiplicada por um fator adequado para conversão da uni
dade apropriada (Bq/g).
3.5. Obtenção do Anti-soro, Anti-T
3.5.1. Preparação do conjugado Tg - SM
Dsvido ao baixo peso molecular doT, e por não ser antigênico
na sua forma natural , o T, foi conjugado ao soro albundna bovina (SAB),
utilizando a técúca de carbodiimida antes da injeção, para que respostas
imunológicas consistentes fossem obtidas. Assim, 30 mg t1/? l ciclohexil-3
(2-morfoilnoetil) carbodiimida neta-p-tolueno sulfonato "MORPD-CDI" foram
adicionados a una solução de 50 rag de soro albumina bovina ein 25 ml de ã
cjua destilada. A seguir 20 mg de triicdotironina e 10.000 qín <-v» l 2 5I-T-
dissolvidos em 5 rei de diirstilüormandda foram adicionados yota a i;ota a os
sa solução, seb agitaçib suave e contínua, mantendo o yi\ da inlstura cons tan
te em 5,5comHCl 0,01 M ou NaCH 0,01 M. Após 10 minute-s CG inaibação em tern
pemtura airbiente, adicionou- ze 10 mj de "MORPO-aíl". A solução foi conser
vadi em temperatura anfoiente sob constante agitação, na ausência de luz, du
rente 18 horas. A rrdstura da reação foi dialisada em água destilada corren
te por 72 horas.
Paralelamente, unvn misturi da ronção contendo '1' , 1?5x-T, e
CDI", TRMÍ na avwêncin th PNl ftA preparada JK.-IO í..--;;ro
O r.v.rinro &t rerj.íuiKx; C.: 'l\ JjirrjririrjV' a c :'Vi v,r>V"?.\\\i\
21.
SAB foi estijnado pela radioatividade não dialisãvel da mistura de conju-
gação, faaendo-ító primeiramente uma correção entre esta radioatividade pre
sente nesta mistura e aquela encontrada na diálise da mistura livre de
SA3.
3.5.2. Preparação do anti-soro
Os anti-soros foram obtidos em coelhos, utilizando-se a técni
ca de imunização baseada em múltiplas injeções intradérmicas dorsais ' .
Selecionaram-se 3 coelhos para imunização e estes tiveram ini
cialitente seu dorso cuidadosamente raspado. Apôs 24 horas, inoculou-se 2 *&•
de una emulsío de partes iguais de adjuvants completo de Freund e 150 ug do
conjugado T.-SAB em solução fisiológica, A eroulsão foi distribuída aproxi-
madamente em 50 "botões" intradérmicos, conforme esquema da figura 3. Este
procediroento foi repetido em intervalos de 15 dias, aproximadamente, substi
tuindo-se a partir da segunda dose de reforço, o adjuvante completo de
Freund por adjuvante inconpleto.
Após a terceira dose de reforço, retirou-se / no máximo, 10 ml
de sangue de cada coelho. 0 sangue foi irantido por duas horas em banho ma
ria a 37°C e a seguir centrifugado a 1000 g. O sobrenadante (soro) foi sepa
rado para o estudo de título. As amostragens foram repetidas após 8 a 10
dias de <-fvfo nova dose de reforço. Selecionou-se, para posteriores expert
rier.tos, o anti-soro quj apresentou as malhores características.
3.6. Separação das Imunoglobulinas G (IgG) do Anti-soro, Anti-T3
A fim de purificar o anti-soro selecionado, • isolaram-se as(82)
tmunoglebulinas pela técnica de precipitação pelo sulfato cta amcnio . U
rra solução saturada de sulfato de amônio foi adicionada gota a gota, sob n
çitaçSo contínun, ate que se completasse ura proporção &>. 33>, an 10 ml de
ti-r^ro. A solução foi r^ntidn ndí> SU.T^? ngít/ir-no durante íin
22.
Figura 3 - Esquema da distribuição em múltiplos sít ios da einulpão IK) cbrso
raspado do coelho. Cs pontos pratos na área raspada rr>prr>r;ent:!n
"botões" da injeções intradérmica.'; do 40 ul
23.
20 horas, sendo estes procedimentos realizados a 20°C. A seguir, a solução
foi centrifugada por 15 minutos a 2.500 g e o sobrem-jflante decantado. O pro
capitado foi então solubilizado era 10 irl do bicarbonato do sódio 0,1 II e
dialisado contra 2 litros do nssrto tanpão bicarbcnato por 24 horas a 4°C.
A concentração de proteína do extrato foi determinada, medin
do-se a absorvância em 280 nm.
3.7. Preparação dos Tubos de Fase Sólida
O anti-soro, anti-T, purificado foi aderido ãs paredes de tu
bos de polipropileno de 12 x 75 mm, utilizando glutaraldeldo para pré-reco-
brimsnto dos tubos, e assim efetivar a reação dos resíduos do glutaraldjldo
das paredes dos tubos com o anticorpo.
Micionou-se 1 ml de solução de glutaraldeído 2% em ãcjun des
tilada e acertou-se o pH da solução para 9,5 com NaCtl IN. Após repouso du
rante 4 horas em temperatura airbiente, decantou-se essa solução, lav^ndo-se
3 vazes com tanpão veronal 0,025 M pH 8,6 para retirar o excesso de gluta
raldeido. Secaram-se os tubos a 4°C. A seguir aJicionou—r» 1 ml de f-mfcicnr
po diluido em tartpao veronal 0,05 M pH 8,6, cem título capaz de corplexar a
proxinadamente 251 do traçador radioativo. Os tubos foram deizcidr- em repou
so em terrperatura de 4Pc durante 24 horas para efetivar a reação der resí
duos de aldeido, nos tubos plásticos, com grupo amiro do anticorpo. Então, a
solução foi decantada c os tubos lavados com toirvio veronnl 0,025 M pff 8,6
por três vezes, seguindo-se de incubação por 30 minutos com solução de SA3
0,5% neste mesmo tanpão, repete-se o processo de lavagnm e leva-se ã secura
a 4°C. A figura 4 ilustra as fase.-; experimentais:
7A.
í {
->
! :
v e L U T A R * D : i t > 3 t Ait r i o
L J LCOMJU<;ACA9 DO
TIPO MICHAEL I t: ilfl»"' 'HO C/
DOS 9ITI09 NÃO
Figura 4 - Esqiema de preparação dos tubos do frtso sólida, iiLili/on-o ., glu
ueIUo para [>xõ rcccijiiircnto tics Uáj»«.
Estixtos foram realizados, utiliza/pTo-oc ylutaral»telili-» «an tlife
rentes conoentiüções e pll e varianclo-se a tcnjnor.iturn e te«|*> do incn!xi',-Ho
no reccbriitíínto dos t d x s .
Paralelamente, utilizou-ce outro j>coccdlisrnto 110 q«nl o o
corpo foi aderido ãs paredes Oe tulx« de poliprq.»ileno \x>r sinpl.es oilsur^i
Para i s to , adicionou-se 1 nü. da ncsnía solidão <!» nntioDrjx) cm liir.r, ÍV? f>r;li
prepileno nem tratamento CT*n cjlutaraldeldo o rrj r?Ll rcuir-rw or; procv.Uitrnit.os
já nencionados, conforne a figura 5.
u ü—;
> t- • -
ÜOÍCOUKI» CO» l *V*H CCK tf** IMCltH» Cf» | iHH ri'« í f C <« » t n o « o f » « j i 1 » » r i o sono » i l>v»i»« T o u r ^ r i
V í f i n H A L iH/V1r#4 I t Alt) y f » f V I L
• A D S O R C Ã O 1 :• A P S O f l C A U
Fiqura 5 - licqucra da preparação dor» túxn por r
no1; n i i a s HÃO
HE C"l»F II I O
3.8. Aynlio'gHp iwn CarncLottr»t:Lcysr. «Ij fnf:ic)!j_<>
,";:i!.:.cf >v\
Pr,.
25.
aderidos aos tvibos de poliprqpileno: anticorpo, anti-T, nas diluições cfe
1/10, V 5 0 , 1/100, 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000 e 1/10000 seguindo CG nes
nos procedinentos utilizados na preparação dos txix» de fase sólida. A se
guir, foram incubados com 40.000 cpm do traçador, nas condições similnrcs
do ensaio.
A diluição do anticorpo, que proporcionou irna ligação cm tor
no de 25% com o fcraçador, foi escolhida para a prepot—ção dos tubos cie fase
sólida.
3.8.2. Especificidade
A especificidade do anti-soro, anti-T foi avaliada pelo grau
da reação cruzada can os possíveis interferenbes. Realizaram-se ensaios ,
nos quais substituiram-se os padrões de T por padrões de substâncias com
estruturas moleculares que guardara certa identidade com os moléculas de T ,
a saber:
3,3f, 5*T3 (rT3)
3,5,3',5'T4
3,3'T2
3,5,3',51 ácido tetraiodoacético (lETRAC)
3,5,3' ecido triicdoaoético (TRWC)
3 ironoiedotirosina (MIT)
3,5 diiodotirosina (DIT),
cujas fórmulas estruturais encontram-se na figura 6.
Utilizaram-se quantidades variando da 1 ng a 1000 ug ( l u g a
1000 mg/dl) na preparação dos padrões destes corrpostos e determinou-se a
concentração necessária de cada oonposto para deslocar 50fc do corrp;\_-;<D
12 5j_T-anticorpo.
O índice do r^nçao cruzada do cada coitpooto foi adotndo ccrr>
sendo a relação entm a concentração da T rcqurridi r'-iri cí^locnr rP,'>. r'o
26.
OH-C *>~ O "V *>-CH t -CH
I * ' I •v * COO»
3 , 5 , 3 ' , 5 ' Tlroxipxi (T4)
I I
HO ,—CM
,NHt
COON
3,3',5» Triioaotironina (Tj reverso)
OH f\ - CM
NHZ
COOH
3,3' Diioãotironina (T2)
OH CH — COOH
HO — CHOOH
I
I
HO
3,5,3' í-sáãa tiiicdcacético (TKTAC)
C H 2 - CH
3,5 DLioãotirosina (DIT)
noCOOJJ
3 yor.oic "ocirosina (M3.T)
Figura 6- FÓrr.u'.:::.". oo
27.
corrplejfo *2 5I-T3-antioorpo e a concentração do ccrposto análogo que dp-; loca
50% do corrposto do oonplexo ^I-T^-anticorpo, descontando-se o nível <k>
não especifico (NSB) *.
3.8.3. Caracterização da constante da afinidade e concsntração r>o-
lar do antl-soro
Caracterizou-se a constante de afinidade ou equilíbrio (K) e
concentração nolar (q) do anti-soro pelo método de Scatchard * .
3.9. Preparação da Mistura de Soro Humano Isento rte T3."Soro Strip"
Na preparação dos soros padrões utilizou-se una mistura de so
ros humanos, especialmente selecionados de pessoas consideradas normais. Ex
traiu-se o T_ ciüõgeno presente nessa mistura utilizando-se carvão ativado
em excesso ' , onde o T, presente no soro é adsorvido pelo carvão.
Em um l i t ro do soro humano adidonou-se 0,37 (4Uq (10 uCL) de
125I-T3 e 100 g de carvão ativado. Deixou-se sob ccr^tante agitação em tenr-
peratura anbiente durante duas horas, e mantido em rotação ooro agitador ma<j
nétioo mediante a introdução de uma barra magnética no recipiente. Qitão. >
carvão foi. separado do soro por centrifugaçHo a 5000 rpm durante 1 hora. te
operações de centrifugação e decantação foi.ain repetidas por m i s três rts
zes.
A eficiência da extração foi determinada, inedintio-se •"> a t iv i -
dade de 1 2 5I-T3 presente JÁJ soro após o txatamento e este deve ser nrror do
qie IS da atividade inicialmente adicionada na mistura.
• KSil é O "branco" tín reação, ÍGÍ-O d, a resposta di r*?.:ç"ío rm .UP*!/.-! •.
anticorpo.
28.
3.10. PrBy-rcação rios Sores cie Referência (Padrões) de T
Os padrões forem preparados a part ir do 3, 5, 3'-Ij-ti.iitxk>ti
ronina na concentração de 100 ug/ml (solução estoque ) mnforne o seyuinte
protocolo:
Pesar 1 mg <IG T,
Dissolver con 50 uL da solução NaOH IN
/idicionar 5 r i dj propileno glicx)l
Conpletar volune para 10 ml com soro "SiI-JP"
No preparo da solução 3 Uxnou-se 10 ul desta solução e di
lvaiu-se era 10 ml de soro "STRIP", que corresponde a una concentração final
d= 100 ng/ml.
Os soros de referência para definir a curva {xxlrão foram pre
parados nediante o seguinte* esquena:
SORO IEFEI&1CIA1000 nq/õl
Solução P ; 1000 ul
Soro STKIP q . s . p . 10 ml
SOFO REFTOÊNCIA 500 nçf/dl
Solução 3 500 ul
Soro SWIP q-s-p. 10 ml
SORO K^UnfííCIA 250 nq/dl
Solução g 250 ul
Soro STRIP . . . ; q-s.p. 10 r.J.
SOFÍ) PEFEfàiCIK 100 nç//dl
Solução fl 10O ul
Ceio FflVlV <].':.]>. 10 nl.
KÕ:~ "i \
29.
SOIO KSTERÊTJCIA 50 ng/dl
Solução B 50 ul
Soro STREP q.s.p. 10 ml
SORO FEFERÊNCIA 20 ng/dl
Solução 0 20 ul
Soro STREP q.s .p. 10 ml
SOFD EEFEPÊNCIA 0 no/til
Utilizou-se o próprio Soro SiRIP
3.11. Protocolo do Radiolmuroansaio do T-, pala 'J^cnica da "Fase Sólida"
Para verificar a qualidade dos t i ixs recobertos coir nntlcorpc,
realizou-se o ra&Loimuncensaio utilizando estes tubos.
Iteagentes Errpregados:
a) tubos de fase sólida preparaJos scjunilo o ítnm 3.7.
b) soro de referência de Tj (p.-"lrt3es)
c) 125I-T3 diluido can tanpio veroral 0,05 M píl 8,6 cem 0,035*
de WS e 0,01? de tiirerosol de rrxlo a se obter a concentra
ção radioativa de 40.^00 cpnv/rnl, Lqjjcoxiinadfimente.
ProcedinEnto:
0 protocolo do rnCioiminoesosaio do T_ pela técnica fV> "Fase
Sólida", adotado reste traballio encontra-se es<"iucnwtizado na figura 7.
3.12. Outras T&cnícos de Radioiiminoensaio çV? T_
pnra fins conparativos *eali .:ou-se KIJ2 do T,, utiliznnrlo tóc
nicas já tradicionalmente utili/adon iv» nosno lalxuvitorto, n r^\x-r: "iíi::>lo
K'\\ vcorpo" c "noluç^
Aliquotar 100 ul dos soros padrões ou amostras
nos tubos previamente reccbertos com anti-soro
1 ml do T3-125I
Agitar
Incubar por 4 horas a tenparatura anbiento
Decantar sobrenadante
Ifedir radioatividade do carplexo
30.
Figura 7 - Protocolo operímental do RIE de T pala técnica de "Fase Sólida"
31.
3.12.1. Protocolo do RIE do T3 pola tõaiica do "Dipto Anticorpo'
Reagentes Bspregadcs:
a) Soro ds referência de T
b) 125I-T3 diluida COT tatipão veronnl 0,05 M pll 8,6 com 0,35%
de WS e 0,02% de tircrosal, para se obter urra ativi.riv3e
correspondente a 40.000 cpm por 100 ul
c) Anticorpo, anti-T^ diluida 1/10000 em tampão voronal 0,05 M
pH 8,6 com 3% de EOTft e 0,02* de türerosal.
d) Anticorpo antigamaglcbulina de cnelho {29 anticorpo prove
niente do carneiro) e usado na diluição 1/1G0 em tairpão ve
ronal 0,025 M pH 8,6 com 3% de EDIA e 0,02% de timercsal.
Prccedinento:
Na figura 8 encontra-se esquenatizado o procedimento do RIE
de T3 pela técnica de "Duplo Anticorpo".
3.12.2. Prolocoloi do RIE pela técnica de "Solução PEG".
Rsagentes Btpregados:
a) Soro de referência de T
b) 125I-T descrito do item 3.12.1
c) Anticorpo, anti-T, diluido 1/iOOOO em tarpão veronal
0,05 M pH 8,6 com 0,01% de timercsal.
d) Sol.^ão PEG-6000 16% em tanpão veronal 0,025 fl pll 8,6 com
0,02% de t-inerosal
ProcediiTEnto:
Encontra-se escjuematizodo nn figura 9 o protocolo Co RIF. de
T3 pela tecnica de "Solução PEG".
32.
Aliquotar 100 ul dos soros padrões ou amostras
1100 ul (to anticorpo diluido
I1Q0 ul do 125I-T,
iAgitar
Incubar por 4 horas a tenperatura aribiente
Adicionar 1 ml de solução de Duplo Anticorpo
Agitar
Incubar por 1 hora a tenperatura aniúente
Centrifugar a 1000 g durante 20 minutos
Aspirar sobrer.adante
Medir a radioativicV^o do complexo
Figura 8 - Protocolo cxpcTinrnt.il úo RLE j e
In Lt'or..r:a tin "DriM
33.
ALiquotar 100 ul dos soros padrões ou amostras
100 ul do anticorpo diluído
I100 ul do T3-125I
imitar
Incubar por 4 horas a tenperatura anbiente
1MLcionar 1 ml de solução P£G
Agitar
iCentrifugar a 1O00 g durante 20 minutos
IAspirar sdbrenadante
M?dir a radioatividade do complexo
Figura 9 - Protocolo experimental cio IHE do
T3 pela téaüca efe "Solução VEG"
34.
3.13. Curvas Padrão
Inicialmente, foram calculadas ns razões entro ar> contagens
obtidas para as diversas concentrações On padrões (II) e as contagens obti
das para o padrão 0 (B ) , descontando-so as ligações inespecT ficas (NGB) de
cada ponto. lis curvns padrão foram traçadas em papel semi-logarlrjoLco, ten
do em ordenadas as relações x 100 e em cbeissas a-5 coucp-ít-raBo - NSB ~
ções conhecidas de horn£nio.
A curva padrão foi ajustada ã função <le cjuatro parân«trcs de
f inidas por :
a - dy = + d (l)
1 -
onde:
a = valor assintótico superior, isto é, a = 3 A'(B calculado por regres
são)
d = valor assintótico inferior, is to é, d = 1SB (ligação não específico)
c = parâmetro asseciudo 5 posição da cuiva era rcflnção no eixo das abeisnas,
i s to é, c = XKrtít (a concentração do T que desloca efetivamente 50% do
corplexo 3
b = parâmetro associado ã inclinação da enrva, ou seja, a inclinação da re
ta quando traçado em escala log x logito
3.14. Avaliação dos Sisaios Realizados
3.14.1. Dçpe mínlina detectávol
A dose r.IniiTQ dotectãvel dofinirà coní nondo rx nenor (iinntidi
à?. cntatisticaní?ntc difercnciávtjl do nível do concentração iguil n :'.:to ao
nível d-; limite dr? confLTTÇ^ df» P - 0,0r>, ío:. cnUirtr.ili r.-gv.n'lo o.; <T-.rr-i
tor, Ha Htir» {2?) a rrxBwrcJ c c-1 (7<1).
35.
3.14.2. Precisão do Ensaio
A avaliação da precisão do ensaio foi feita pela análise de
reprodutibilidads intra-ensaio e inter-cnsaio.
3.14.2.1. Perfil de precisão intra-ensaio
A reprodutibilidade intra-ensaio foi avaliada pela
dispersão (coeficiente de variação) dos resultados encontrados nas duplica
tas, de todas as amostras e padrões, em um roesito ensaio.
3.14.2.2. Perfil de precisão inter-ensaio
Três amostras contendo nívois de concentração de T
baixo, irêdio e alto foram dosadas em rftplicata, em ensaios consecutivos e
assim avaliou-se a reprodutibilidacie inter-ensaio calculando-se o coeficien
te de variação dos valores encontrados.
3.14.3. Exatidão
Para o estudo de exatiião, C3 valores da concentr^-ío sérica
de T^ das amostras dosadas cela técnica de "Fase Solida" foram tabelados e
cortparados com os resultados obtidos pelas técnicas de "Duplo Anticorpo" e
"Solução PEG", técnicas estas consensialr^nte aceitas e ut i l izada na l i t e -
ratura pertinente. Lançou-se, em gráfico linear com projeção tridinensio
nal os resultados obtidos de "Fase Sólida", "Diiplo /í;Licorpo" e "Soluç~o
PEG" do iresmo conjunto de amostra. D2terminaram-f>e CG coeficientes de • ro
gressHo entre os resultados destas três técnicas, comparados entre s i .
3.14.4. Dígito de Márito (P.M.)
Para análise conjunta dos diferenten p^.rhwlror, cnvolviAx? na
CíiracteriznçHo cio IViHoirnvnK^nonio, r.io'cou-r-o com jvuvi^'Lro rt? cfJi^nmcZo
un dígito de J.írito, qu-: roflotinrjr! n rumlidult; «"V» ors-nso nri c?ntc:<to a:u
pio.
36.
Considerando qua a técnica irais eficiente é aquela que
senta maior precisão nos resultados e detecta a nnnor (jpnntiâade do horiiõ
nio, a análise conjunta desses dois parâmetros 5 indicada, conforme exep?,io
gráfico da figura 10.
O digito de mérito foi calculado utilizando a seguinte expres
são:
FDMD x Perf i l
D.M. = J " " (2)
(F - DM))2
onde: DMD = valor de dose mlniita debectãvel
F = valor do último ponto da concentração do hormônio da curva pa
drio
fPI Perfil = area do perfil de precisão do ensaio do i onto LMD atéJDMD
F. A área foi calculada por cálculos numéricos.
3.15. Cálculos utilizados na avaliação dos resultados
Os cálculos para a caracterização dos parâmetros da curva
padrão, da dose mínima siqnificativa, do perfil de precisão do ensaio, (In
constante de afinidade, da concentração do anti-soro no trJbo de reação (Aná
(56)Ee da Scatchaxu) foram efetuados pelo sisteira conpubncional GAPIA
disponível no rYTertareoto cie Processamanto da todos do WE
3.1G. Caracterização da faixa de nornalidaue
Seguindo-se o protocolo e;-x*?rincnfc.-il descrito no it/L-rn 3.11, rio
saram-se 153 soros Co indivíduos considerados clínicarronto nomiai-, r/?ri/b
80 do sexo fcrvnino o 73 do SO;ÍO irasciiLlno, com idade entre 20 e GO anor ' ?
dia c!s 35 rx,os) . nr/.r:3 rr:nult?.(la', fomn .TJT. VT.T':•.-. a tr.^-vio o !ii"*•'.• jr.?.,-r.-i. A
dctrjifio-ce (p.12 ... v^loror; cbc>^"n ?\ '1i-.tribin.ç.!.j r.'.;n:-'«l, d'to/sun.' :••;•/.•. :\
37.
OMD
i ; . • • •
!i I
100 200 300 400 500 600 700 000 000 1000
Figura 10: Elementos para o cálculo do dígito de mérito para a compararão áa
qualidade entre técnicas de ens;'!o: área do por^il Ce pi^cisão cte
limitada prla dose nilnima clctectãvel (rtv) o o fin (F) cio
da cur</a padrão.
38.
itédia aritnética do seus resultados c o seu desvio padrão, permitindo os
sim estabelecer a faixa de normalidade.
3.17. Determinação dos níveis séricos ós T «n ?-•-«cientes Iiipotireoideo e
hipertlreoideo
Selecionaraní-se anrr.txas séricas, tie pacientes cem h?»iotiroi
disn» e hipertiroi&Lsmo. Determinou-se a concentmção tic T. can r.^ro «Testas
anostras a agrtipou-se os resviltados dos diversos níveis dv enaceotração em
tomo da respectiva média.
' . '••:•:.;. '•:• í-.;;t;:c:A Ú ; • < . ; . Í : A R , - S P ]
39.
I I I . RESUMES
1 . TmiODOTIRONINA MARCADA CQH 1 2 5I
1 .1 . Purificação do T- radioiodarlo
Na figura 11 encontra-se o cromatogrnira t ip ioo da separar-ão
em coluna de Sephadex G-25 fino do 1 2 5 I - T , logo opôs a radioioctupão, de una
das 12 marcações real izadas.
Apresentam-se t r ê s picos onde:
a) o primeiro corresporf10 ao 1 2 5 I que não reagiu . Como pode
se r v i s t o , na figura 12, apresentou eletroforetograrca idên
t i c o ao do I3a125I, qvnndo sitometido à cletrofores» de pa
p e l .
b) o segundo correspondo ao T marc^Jo, o que W corprovado
pelo seu a l t o nível de ligação (~90$) com excesso de oi.ti
corpo, anti-T , quando es tes fornm incuíxidos e
c) o t e rce i ro ao T marcado, pela sua a l ta l igação (~90%) cem
excesso de anticorj-o, an t i -T . .
A figura 13 (A) mestra o p e r f i l resultante da anál ise elefcro
foré t ica da fração correspondente ao pico do I 2 5 I -T_, ir,--» após a purif ica
yZio, enquanto a figura 13 (3) apresenta o eT^troforetoyrv-uivj da incsma ir;os
t r a , apôs decorridos 105 dias da sua purificação.
1.2. Randimento da Marcação do Hormônio con
Na tabela I enccntranrse os valores das Sroas dor, picr« 1, 2
c 3, provenientes das 12 marcaç^s. A sena dos vnlores ir-rt-cntuois dis 5
rooG corrcspcnícntcs cos picer, 2 c 3, fornece n ..f.Miivit.iv.i <!> rtrir." —.•.ío C.\
irnrcação, crruv-nto o valor p~rcontur.1. r'-i í\r^-\ c.-orroqrr/'.-'n'--: rr> vjyy •"•".*) pU?>,
AO.
123I-T3
4 O 12 10 20 24 20 32 33 40 44 40 G2 63 CO e4 60 72 7 ' 00
mi cio eluído
Figura 11 - iudlocrcr.'a lograra r"-. purificação cia Ho^iaclox r -25 f ino do T-j rvir
caJo cc.n J Z 5 I , cca fl;i;o 'T- 40 r.il/iiov.i cm oi b.i !/•.,-;•"; fosfato
0,0"» i. p:: 11,^
IPI
c
orr
O
contagens/ min x 100004
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3 2r
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I-
I2S
I-T* ©Alíquota do sagundo pioo da figura n? 10tatente r.pôs a separação em Sepharfex G-25 fino.
1 2 5
- * - -X—X-
I 2 3 4 $ 7 I 8 9Azul
cm
10 II 12 13 H 15
ooo
cÊ
(0ca>D>O
- • - -
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3-
7
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5-
4-
3'
2
I-
0
125I-T3 0
Alíquota do segundo pioo da figura n9 10 npós
105 dias da radioivircação.
125-
-í( *—« N >T \ ( K X- -*—
I 2 3 4 9 6 7 I 8 0 10 II 12 13 14 15Azul
cmFigura 13 - Eletroforcttvgrnma do m I - T 3 (Alíqix>tíi fio p ico nV 2 ) ,
logo opôs a pv.riüic^çvj cm Ucfíi-"1-'o:? G-2r! f i ro (A) <"• 10r> ^i.i.s
cpõo n p u r i f i c a d o (ri)
43.
Tabela I - Resultados dos cálculos (te áreas (%) do perfil dr> r.Tl.ocronatoqrarra
e da atividade csrocífica do 125I-T .
» rto ' " t » ii» "*I-T » <»• " ' l -T i * l " ' i ^ i / • Ivl lv l" I ••<i~-iti-a I ir
1?7 '
>J
31
24
40
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?•»
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7/
0»
«? 18 51 23
«fV
5> » 21 71ir»
ft? - ' 29 « 26 71->•>
25 40 2» 7 ' j
IW
8? 21 2f, 77
10?
2* 50
4(4
21
27
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IS
ill
1 » JO 49 W111
12Í 19 S3 III"7
1 M
X i * 25,0 1 4,1 43,í t 4,9 20,1 » 3,4 7 ' , , f ) i 4 , J ||>>,H « ; i , f .
valores rfS[»*ctlvDi« i>> |>rlnrlm c W
fornece c cstirrativa do 1 2 5 I -T , forrado ni rmrca
!."*•. Dctcrrrlnação da Atividade Especifica
A figura 14 mostra a relação linear entre os níveis de radio-»
tividade e respectivas ccncentrações do Tj irarcado determinadas pelo nétcio
io autodeslocaniento para o cálculo da atividade especifica.
A tabela I apresenta os resultados da atividade especifica do
125j_'p d,, 24 ensaios. O valor rnédio daqueles resultados foi df»
(110 ± 23,6) TBq/g (2994 ± 638 C i / g ) . Es te v a l o r permite es t imar que a i n c i
dência de átomos de 1 2 5 I por moléculas de T fo i da ordem de (0,9 * 0,2)
1 2 5 I / i iDlécula .
Es t e s dados permitem i n f e r i r que a a t iv idade adicionada nos
tubos doi radioimuncensaio (40.0^0 cpm ou -50.000 dpm) reprt isenta aproxima-
damente 60 pg de T-j marcado.
1.4. Estudo ch Es t ab i l i dade do 1 2 5 I - ' f 3 , cor\servrido em p r o p i l e i o g l i c o l
50%
A f igura 15 mostra o conportaicento c i n é t i c o da deconposição
do 1 2 5 I - T , conservado em p ropi leno g l i c o l 50^ em t e r p e r a t u r a de ~20eC, ao
longo de 105 d ias . R>ste estudo foi ut i l izada a craratceletroforesee a colu
na da Sophadex G-25. On to e cinco dias após a i.vircação 90% da radiou t i vida
de presente representava l ? s I - T indene.
2- OBTENÇÃO DO MT I-SORO
2.1 . Ouantidadf* án Tn coniuqado no «oro alLvi-iiai :/>vii-:'. {S/ J)
O resultado da rnçdi.cia do T., roilloatlvo não dia lidado (In idr-.tu
ra de cor.jugaç.ío indicou q;a íiprcj-d:...; livnmlr' 1~} r-.v;t.T. :; <*.* 'í\ r^r.üi i;v-.-..;
45.
is
140
120
, - 100
•D
O»8 0
GO
4 0
2 0
A-20
100 200 300 400 BOO COO 700 000 900 IO0<?
RADIOATIVIDADE DA AMOSTRA {cpm x 1000)
Figura 14 - ralação lir.ear cntxe a xndLrxitLvjUtHlp »U.li-
zadi jara o cálculo da ativldn<>» orjioclfica
o as respectivas ooiíC3ontra,'jc3 cfc T rarciOo
2 5,% DA RADIOATIVIDADE DE I-Ts NA AMOSTRA
o OO o o
o
I
l
V 8*
1 I
3
3 SL
O)
o
o
oo
o
o
«5 -
Q* _ jw o r
47.
porados ã cada molécula de SAB, o que está de acordo cem a Hterutu(16,24)
ra .
2.2. Preparação do Anti-Soro
Apôs quatro reses da primeira aplicação do imunógeno cbtevo —
se o anti-soro com ti tulo compatível aos ensaios. Dos três coelhos iinuniza-
dos, somente um, mostrou-se satisfatório para fins de recobrimento dos tu
bcs. Todos cs dados relatados a seguir referem-se a esse anticorpo.
A evolução da ligação do anticorpo, anti-T nas diluições
1/50, 1/500, 1/3000 e 1/10000 cesa o traçador encontram-se na figura 16. Nes
ses estudos utilizou-se a técnica da "Solução PEG" descrita no capitulo I I ,
figura 9.
2.3. Separação das Imunoglobulinas G (IgG) do anti-soro, anti-T
A concentração de proteína da solução final, obtida após pre
cipitação cem sulfato de amônio e diálise, foi de 1,3 ng/rnl.
2.4. Estudo das Condições Adequadas para o Jteocbriirento dos Tubos oom
Anticorpo (tubos de "Fase Sólida")
2.4.1. Efeito do pH na polimerizãção do glutaraldeído nas paredes
dos tubos
Na figura 17 nostra-se o efeito do pH da nolução do gluLural
deído no pré-reccbriirento dos tubos.
Os tiibos «ccebertos oan glutaraldeíd^ em pJI 7,0 o 2,Z riío
mostraram diferenças significativas cetn aqueles encontrados nos tubos Í;;/.1JÍ.
lizados por sinples adsorção. Por outro lado, os tubos tratados ortr» yluta
raldcído em pi! 9,5 apresentou mior capnci(1>.lo <\* ii.qiv;~\o cr»-n o (T,IÇ,VVT.
48.
58h-
03
100-
9 0 -
B0-
7 0 -
6 0
50
4 0 -
3 0 -
20-
10-
O Diluição '/BO
x Diluição ' / 3 0 0
• Diluição ' / 3000
A Diluição '/ »0000
10 12 IG
I I I I I I I I 1IS 20
Ficjui:a 16: Evolução da l i 1 2 5
uii a
Co anticorj» anti-T3 txm 1 2 5 I - T . . /r, f l e -
ctis injeções art «IMIÍIHO cnntcncb o a--ijn'.-;<i
49.
24
21
18
15
12-
CD
x pH O,5A pH 7,0o pH 3,5
• simple* odaorcõo
100 200 300 «00 SOO COO 700
T* (ng.df)
9OO !000
Fiçj\ira 17: Curva padião do RIB da T^ ulilLzanáy-iie gluU«rakV.-ícTo cr»
rcr.txis pil G curva padrão do RIE de T, dos tulx« prep.-itM'V";
siiiplf-G ndcorção.
2.4.2. Efeito da concentração do glutaraldeldo no recobriirer.'-o ^y-
tubos
0 efeito da ccr.ccntração do glutoraldoido ?v»ra prê-recobrii7ç*i
to dos tubos na curve, padrão do RIE de 1* , encontra-so na fiqura 18. A capa
cidade de ligação mais alta do traçador foi obtida nos tubos tratados com
glutaraldeido diluido a 10%. No entanto a diluição de 2% apresentou curva
padrão com qualidade superior para a quantificação do nível sérico do T .
2.4.3. Efeito da teirperatuxa no recooriirento dot; Lubos
No pré-receforimento dos tubos, a tenperatura cie polimerlza
cão de glutaraldeldo que mostrou ser a mais eficiente foi a de 20°C. Confer
me ilustra a figura 19 esta temperatura foi a que apresentou a ligação nvús
alta, sem conpraneter a sensibilidade da curva padrão.
2.4.4. 'IbiTpo de incubacão para rogcfaringnto dos tubos
Foi nRORSsárío um mínimo de três horas t>ara a poliineriza
ção do glutaraldeldo na superfície das paredes dos tubos. Incnibações no in
tervalo de 3 a ?> horas nao mostraram diferenças significativa:; no procosno
do prê-recobrimento.
0 efeito do taipo de incubacão a[xs adição do anticorpo nos
tubos pré-recebertos <~acn glutaraldeldo encentra-so na figura 20. O int-rsrva
Io dfí tesrpo de roccbriinento qrr- :ms\rxou-r>(i afleqnn'lo f^i entro 24 a 36 ho
ras.
Daseactos nesses rosultaJos, os tu^og ds "Fane Colida" u t i l i -
2ados cm todos or, ensaios descritos a seguir, foram pmryirnrios conforn»? o
protocolo descrito r . fiyura 3 do capitulo I I , itan 3.7, .LAo ó, pré-reco
brinmto dos tf^os ca;i glubnraldeido diluido ã 2'. em ii 9,5, duranto 4 ho
íwj ã 20°C e terjx? cl; incttoçHo Co anticorpo . :; tub'r; p-ó -xny *•."•*•"; »V;
2-1 iioraõ, n tcniforattira Cn 4°C.
51.
o Glutaraldifdo 10%x Gluiaraid»ído 5 7.A Gtutaraldoído 2%.O Gltttaraidsfdo 1%
-I 1 r 1 T 1 r
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Ts (ng
Figura 18: Kfei'o da concentração c!o glutaraldaído utilizado no reccbrirren
to doa tubos sobre a curva padrão do RJE c!e Ty Valores ds B/r
tiCin cV-soonfcar o valor <k> 2Cn (nível cia ligação não cspecífiCT,
i . e . , nível ús B/T ?, quando a concentração ca T^ tends a «>).
52.
CD
100 ZOO 300 400 SOO 600 7OO 800 900 IO00
Tsing.dl"1)
Figura 19: Efeito cia teiüporatura na polinerizaçno do cjUilaralcieíJo cobre
a curva pndcâo tio ÍU£ de T, . Viilores CG H/i' ST.I ctesoonb^r o
tíSü (vido te>:fco -1"! fiçjurn 17) .
53.
24
21
IB
15
12
CD
3-
\
\
\
36b»Z4ht
—o—14 ha—•— e h*
100 ZOO 300 400 500 600 700 800 900 1000
T* (ng.dl"1)
Figvira 20: Efeito do teiipo de incubação para recobriiiíento do;-, Lufog am ant i
Ojrpo ant i -T, na curva padrão do RIE cfe T , .
2 .5 .3 . Caracterização da constante de afinidade o cor.a^ntrayão f.q-
Lir do anti-goro
A figura 23 mestra o resultado grílfioo d i n;vili.r,e rio
CCcit.cíinrd na q in l cin-'vin a c^myiLnCTi C.n '{'., vrr-.r.-. V./V •• A . - - y^r,-<1 •- i'/ i
5'!.
2.5. Avaliação dis características do anti-soro
2.5.1. Determinação da diluição adequada do anticorpo porg reocfori.
npnto dos tubos
O resultado da determinação da diluição apropriada do anti
corpo para preparação dos tubos de fase sólida encontra-ne na figura 21.
A diluição do anticorpo que nostrou ser adequada pari proporI
cionar una ligação com o traçador em tomo de 253 f"oi 1/3Q90. O v=ilor cfc li
gação ao nível de 25% foi selecionado por desejarmos desenvolver ensaios (
con rrúor sensibilidade.
Os tubos de fase sólida preparados por sinples adsorção do j
antirorpo na parede dos tubos proporcionou uma ligação ráxina de 14%, ocno j
pode ser visto na figura 21. \i\
2.5.2. Especificiclad? do anti-joro, anti-T3 utilizado •
íA figura 22 mostra curvas de doses-res:fx>sta obtida pelo des ',
lccansnto do ccnplexo 125I-T -anticorpo (anti-T ) utilizantto os padrões de ]
T_ e padrões de diferentes svibstâncicis análogas ao T j
Na tabela II estão relacionados os resultados da a* nIlação ji
de especificidade dos ensaios, quanto ao Indies de reação cruzada de subs
tâncias análogas ao T-, utilizar-füo-^r: o «anticorpo, ontL-T^ ecríwj^^o r>osta
55.
I Glutaroldiido
o Adiorcoo Slmplai
5000 iõdor»
Diluição do Anticorpo
Figura 21: terminação da diluição adequou do anticorpo r,-a
ção dos tubos de "raso Sólida".
10 SO 00 100 850 300 1000 ISO O 5000 IQOOO 28.000 60.000 100.000 290.000 600.000 1000.000
- I(ng.dr1)igura. 22: Curvas ce òcse resposta de T, e a reatividade cruzada can ÕS diferentes substâncias análogas ao T-.
57.
Tabela I I - Porcentagem de reatividade cruzada rio ant icorpo, a n t i - l ' 3 com a s
substâncias análogas a T,
Conpostos Índice de reatividade cruzada
T3 100
T4 0,05
^ 0,0008
T 0,006L2
lEXRflC 0,004
TRIAC 0,02
DIT 0,0001
MIT 0,0001
58.
'it
3,0 12,7 19,7 26,8 33,0 41,0 48.P 03,1 C . l O,2 7<
L Igado (mol/l)
icpjra 23: Traçado da curva de Gcatchard do ensaio On T, j:»"- "Fose r-jli
da" para determinação da constante Co afinid"1^ (K) c cono^u
ça? ;roL:ir (q) cb
', • • IT o : ; i »\ • • ' • J 1
59.
tindo-se daí inferir a constante de afinidade "K" e a concentração irolnr
"q" do anti-soro.
0 comportamento não linear dn curva sugere que o anti-soro era
pregado deve conter nnis de um tipo de s í t io cte ligação.
Os dados experimentais contidos a i figura 23 se ajustaram ade
quadamente ao modelo analítico de dois tipos de s í t ios de ligação, expresso
pela função:
- = *q + K q1 - B/T 1 + K [Xj (1 - B/T) n n
representativo de duas populações de moléculas das quais uma é específica e
saturãvel e outra r ic pspecífica e insaturável. Ifesta equação "K" represen
ta a constante afinidade propriamente di ta , "q" a concentração molar das ino
léculas de anti-soro, K a o produto reprei> ntativo das l i^ções denomina
das de "não específica", [Xj a concentração do T e BA a razão do nível
de radioatividade do conple:<o anticorpo - 125I-T_ pala radioatividade total
adicionada
0 valor experimental da constante de afinidade (K) da reação
T, - anticorpo, o produto representative das ligações "não específica"
(Kq ) e a concentração molar aparente (q) fo anticorpo nos tubos de "Fase
Sólida" encontram-se na tabela I I I .
3 . RESULTADOS DAS CARACTERÍSTICAS DAS CURVAS PADRÃO
Na figura 24 mostram-se as curvas padrão, bem ecro a <Vrv» mí
nima detectãvel dos RIEs reaii2ados palas técnicas de "Fase íxJlida", "Duplo
Anticorpo" e "Solução de PEG"/ traçadas can escala .<^:mí-.lcxjarítinica.
Os valores dos coeficientes Bo/T, "Glqx?", "Xrf)>" o "fWR" cia
cc]inção número 2 ul-ili/'.a<li para o njur-tc <1\ eurvt ji;vlr~o r
Ia IV.
60.
Tabela I I I : Resultados da constante de afinidade "K" do s i t io específico ,
do pxoduto K j ^ das ligações não específicas e da concentração
nolar "q" calculadas do anti-soro aderido nos tubos de "Fase
Sólida"
N? do ensaio K (xlO10) l / ro l Kq (xl<T3) q (xlO"9) nul/1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
X ± S
1,1
1,0
0,9
0,6
1,2
0,9
0,7
1,0
0,8
0,7
1,0
1,0
0,92 ± 0,19
66
48
45
53
56
72
. 67
65
51
62
53
73
59,2 ± 9,5
0,35
0,41
0,53
0,39
0,48
0,66
0,29
0,40
0,50
0,32
0,34
0,41
0,<12 ± 0,10
61.
100
0 0
8 0
7O
6O
5 0
OGQ 4O
00
2O
10
10 20
PEGFoso SolidoDuplo Aniicorpo
30
i_
100 750 500 1000
T3 ng.dl"1
Fiyura 24: Curvas padrão dos RXEs de 1'3 realizados pelas três técnica."
separação da fração ligada da livro.
62.
TftDEIA IV - Rjsultadcs dos valores dos parâmetros a, b , c e d da função 2
descr i ta no Capitulo I I , item 3.13 calculados por regressão não
linear para c? Ia vera das t r ê s técnicas
(a) (d) (c) (b)
Ensaio B y r (%) NSB (%) X ( 5 Q % ) "slqie"
(ng/dl)
Fase Sólida 24 ± 5 i ± 2 256 ± 37 0,97 ± 0,22
Duplo 2\ntioorpo 25 ± 4 5 + 2 220 ± 46 0,93 ± 0,19
PEG 27 ± 4 10 ± 2 314 ± 43 1,20 ± 0,16
Nas figuras 25, 26 e 27 encontram-se as dispersões inter - en
saio peculiares a estes parâmetros.
L\, CARACTERÍSTICAS rETODOLPGtCAS DOS ENSAIOS
4.1. Dose Mínima Detoctável
Ka Tabela V encontra-se a estimativa calculada d,i dose míni-
ma dectíctável para cadn uma das técnicas , confome dados da fiqiira 20.
\ V - resultados da estimativa da dose nánira dutoctável
Easaio
Tnse Sólida
D.:->lo Anticoiyx)
Dose Mínima Dstectãvel
(ng/dl)
17 í 4
14 i 3
22 4 4
30
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M ^ 25,0
O 22,520,0
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20 22
VALOR MEDI0±DESVIO PADRÃO
- - 2 4 - 5
- - 0 ,97 £ C.22
- 256 - 37
— 7 * 2
Figura 25: Disce: -ão inter-ensaio dos parânetros ca cjrva padrão do PJE ce T3 pela têcrdca ás "Fase Sólida"
64 .
41.0
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15O H-
4.2. Precisão do Ensaio
4.2.1. Perfil de precisão intra-ensaio
A figura 29 mostra o perfil de precisão intra-ensaio para ca
da una fhs técnicas.
Dessa figura conclui-se qte a precisão intra-ensaio para a
técnica de "Fase Sólida" para os valores conpreendidos na fai>a de !>0 a
900 ng/dl foi inferior a 10%, sendo que a faixa de maior precisão encon
tra-se no intervalo de 200 a 400 ng/dl; enquanto a precisão intra-ensaio ,
no intervalo de 50 a 900 ng/dl, para as técnicas de "Duplo Anticorpo" e "So
lução PEG" variou de 8 a 13% e 7 a 16%, respectivamente.
4.2.2. Perfil de precisão inter*-ensaio
A figura 30 mostra o perfil de precisão inter-ensaio para ca
da uma das técnicas.
Nas figuras 31, 32 e 33 encontram-se as dispersões dos resul
tados de t rês amostras dosadas em diferentes ensaios.
A dispersão dos resultados encontrados na faixa de conoentra
ções de 50 a 900 ng/dl foi da ordem de 8 a 17? para a técnica de "Fase SóljL
da", 11 a 20% para a técnica de "Duplo Anticorpo" e 10 a 26% para técnica
de "Solução PEG".
. 4 .3. Exatidão
Na tabela VI encontram-se os rcsultacüos da concentração do T
da 39 amostras dosadas nos três ensaios (técnica do "Fase sólida", "Duplo
taticorpo" e "Solução PEG") simultaneamente, indicondo-sc os rr«;j/jctiver, in
tervnTrr; <!- confiança no nível de P = 0,05. 7* figtira 34 corror-rondo a corqvt
ração dosses resultados. Corno EG observa dessa figurei, o:; rnnyul.y'jor. d:n n
. . . : . . . w i; t l . o o : . •. r\i\ O i
j i. IJ. (-:. N .
68.
Duplo AnticorpoPEGFase Solida
100 200 300 400 500 COO 700 COO 900 IO00
T,(ng. ar)
Figura 29: Perfil cfc precisão intra-cnsaio para cada urna das três técníca-i.
COEFICIENTE DE VARIAÇÃO % (P= 0,05)
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73.
TABELA VI - Resultados da concentração cfe 39 íwostros dosadas pelas três
técnicas e os respectivos intervalos de confiança ao nível
c3e p = 0,05.
Tasn SõlltVi
Vostra
1
2
3
4
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7
8
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11
12
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15
16
17
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20
21
22
23
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32
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34
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136
149
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64
500
3t.
157
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164
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122
93
364
119
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75
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475
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Intervalo do Canílanç»
( 10 - 30)
(123 - 151)
(179 - 303)
(134 - 160)
(510 - 637)
(207 - 24B)
{ 10 - 48)
(121 - 150)
(137 - 161)
(178 - 202)
(001 - 980)
(650 - 780)
(220 - 250)
( 73 - 95)
(430 - 550)
( 22 - 50)
(141 - 172)
(257 - 315)
(IBS - 212)
(150 - 180)
(450 - 543)
( 33 - 70)
(107 - 130)
(165 - 1«>
(310 - 4qp>
( i o - y»
(130 - 170)
(110 - 133)
( 85 - 110)
(327 - 400)
(105 - 1J7)
(V,0 - 705)
( £2 - 88)
(C15 - 7f,0)
(420 - 531)
( 70 - J1)
(215 - J(.0)
(«K> - 500)
(«0 - Kl)
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265
205
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161
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Intervalo rtj Ccnfiarça
( » - 25)
1130 - 170)
(159 - 203)
1125 - 160)
(550 - 7»)
(220 - 200)
( 24 - 60)
(146 - 132)
(132 - )M>
(161 - 201)
(664 - 997)
(621 - 810)
(166 - 220)
( 77 - 103)
(36S - 475)
{ 30 - 70)
(143 - 179)
(230 - 300)
(182 - 22H)
(113 - 150)
(517 - 68*)
( 20 - 5 »
(172 - 216)
(141 - 100)
(235 - 305)
( 79 - 6))
(113 - 146)
(10S - 144»
( 97 - 13/)
(344 - 438)
( 76 - 101)
(559 - 711)
( 37 - 63)
(G37 - 873)
(454 - Mi)
( IS - 4',)
(185 - ir>)
(V,S - 470)
(573 - 7f,l)
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290
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142
119
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( 1» - 43)
(IJ4 - 155)
(1*0 - 196)
(151 - 189)
(520 - 720)
(112 - K0 |
( 32 - 68)
(13Í - 167)
(121 - 152)
(155 - 1C5)
(727 -1113>
(567 - 800)
(271 - 365»
( 64 - 93)
(41S - 5»3)
( 11 - 3»
(155 - 185)
( 2 » - 311)
(1(* - 202)
(líll - 167)
(4é> - 632)
( 31 - 55)
( 87 - 113)
(131 - 717)
(258 - V2)
( 0 - 4W
(17» - 1'JC)
(105 - 133)
1 93 - 172)
(310 - 3«>
| 8) - 109)
(r.u - oc4)
( 40 - 73)
(5»> - 831)
()•)! - V)7)
( Y, - 51»
(?;•/ - 2I'J)
\».\ - 451)
Cl) - 7«)
74.
DUPLO ANTICORPO
RELAÇÃO I D E A LFASE SOLIDA BDUPLO ANTICORPO
500 GOO 700 OOP SCFASE SOLI
PIO
Figura 34: Correlação ce resultados dos RLEs cb T 3 entre as três técnicas.
75.
mostras dosadas pelas três técnicas apresentaram entre si boa correlação,
pois a maioria de seus pontos enoontranrse espalhadas an torno di*; retas
bissetrizes.
Na tabela VII estão apresentados todos os parâmetros da re
grcssão linear das três técnicas, conforme a figura 34.
Tabela VII - Parâmetros de regressão linear dos resultados de concentração
de T3 das 39 amostras submetidas ao RIE nas três diferentes téç
nicas
Regressão Linear Intersecção Coeficiente Angular r
Fase Sólida x Duplo Anticorpo 5,9 0,95 0,97
Fase Sólida x PEG 8,1 . 0,96 0,96
Duplo Anticorpo x PEG 7,2 0,94 0,98
4.4. Dígito de Mérito
Na tabela VIII estão relacionados :
a) valores do dígito de trérito
b) valores da dose mínima detectável e
c) área do perfil de precisão.
calculados para cada vata das técnicas, conforme critérios definidos r.o dpi
tülo II, item 3.14.4.
76.
Tabela VIII - Análise conjunta de diferentes parâiiRtros do ensaio para ccnr-
paração da qualidade das três técnicas
Ensaio WDF
Perfil do Precisão
Fase Sólida 17 7806
Mérito
0,14
Duplo Anticorpo 14 13098
PEG 22 8826 0,20
5 . CARACTERIZAÇÃO DA FAIXA DE NORMALIDADE
Na tabe la IX encontra-se a d is t r ibu ição de freqüência de valo
re s de n íveis sé r i cos de T_ de 153 indivíduos cor-siderados norittiiy.
A figura 35 mostra o h i s tog ram re l a t i vo a esses indivíduos .
A nédia ar i tmét ica do seus resultados e o sou desvio padrão focam do
145 ± 27 ng /d l , respect!vaiicntc. Adotando-se a lúpõteno tie quo essa [
ção obedeça ã d i s t r ibu ição normal pode-CG então cr.tabelecer quo, ao
P = 0 ,05 , o in te rva lo de nonralidnde do T-j estej.i contido entro 90 a
200 n g / d l .
77.
Tabela IX - Distribuição do freqüência do valores ti? níveis sõricw tio T
nos indivíduos normais
Níveis scrijXG do T Frojuorcci a
ncr/dl W
menor qua 80
eo |— 90 3
90 f— 100 3
100 |— 110 4
110 |— 120 6
120 1—130 7
130 \— 140 12
140 f— 150 19
150 \— 160 14
160 \— 170 12
170 |— 180 9
180 \— 190 6
190 \— 200 4
. 200 I— 210 1
: .A ;>w'A ÍJÜCLL.M1. SP <
78.
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2 -
0 0 0 0 100 110 120 130 !40 150 IGO 170 I0O 190 ?00 ?\0
(ng.dr1)
Fiyura 35: Uistoyroma relatJLvo a valores cie níveis séríu^s d> 'i' nor, ir.di
vi duo:-, nomais.
79.
6 . NÍVEIS SÉRICOS DE T 3 EM PACIENTES HIPOTIREOIDUOG E HI PERT IREOIDEOS
OB valores de níveis sérioos de T em 5 pacientrs cem hipoti
reoidisno e 8 cxxn liipertireoidistto encontram-se agrupados na fiyur.i 36, ban
caio os resultados do dosa^ons de soros de 153 indivíduo:; o-jnni<lon'V.;i
utilizados na caracterização da faixa de
Os valores nêdio e respectivos denvio padrão obtidos foríun
4 6 - 2 4 , 145 - 27. e 500 - 197 ng/dl para indivíduos liipotireoideo, nonral e
hipertireoideo.
80.
IO00
000
eoo
7 0 0
600
| 500
J? 400-
3 00
2 0 0
100-
HIPOTIREOIDEO
*
•
NORMAL HIPERTIREOIDEO
•
*
•
Figura 36: Níveis so r i cos Ca T^ PJH indivíduos nounais o cm [jacicntra
liipotirroidiaro1 c hiix^rt
81.
IV. DISCUSSÃO
1. MARCAÇÃO DA TRIIODOTIRONINA COM
1.1. Análise do perfil crcmatngráfico do substrato marcado
A mistura da rrarcação purificada em ooluna de sephadex G-25 fi-
no, utilizando-se da propriedade das iodotironinas adsorverejn-se ao sepha
dex ocm diferentes afinidades ' , proporcionou purificação siirples, rá
pida e com boa resolução. Conforme a figura 11, observa-se diferenciação ní
tida entre os três picos, sendo o I eluido primeiramente, seguido de
1 2 5I-T 3 e 1 2 5I-T 4. O
i 2 5I-T 3 é eluido antes do 1 2 5I-T 4 devido ao seu coefi-
(4)ciente da par t ição (Kd) mais baixo. (Kd, = 2,35 e KcL - 5,20)
Em todas as marcações realizadas não se detectou a presença de
125I-T- (Kd-, = 1,13), sugerindo que a marcação parece não ocorrer no anel
2interno das moléculas das iodotironinas, coro j á òbservacb por outros autor e s ( 4 6 ' 4 7 ) .
Em 12 radioiodações realizadas sempre houve um rendimento eleva
do de hormônio marcado, cano mostra a tabela I . A média parcentu.il da scma
dos valores das áreas cbs picos correspondentes a T3 e T. foi de 74,0%. Es-
t e cálculo forneceu a estimativa do rendin^nto da marcação, dos cjuais 48,6*
corresponde ao I-T3 formado e 26,43 ao 5 I -T 4 . Esses valores estão cxtn
pat íve is con aqueles encontrados na l i t e ra tu ra
1.2. Determinação da atividade específica do JI- ' i ' ,
Os valores da atividade es tec t f ica calculixtoa polo iróí/V-o Cf. ;i-i
to deslocamento, c;i 2'1 cb lamínoç^s variou cV' 77 a 112 "iV'\/-\ (.:0'1 a
3B37 Ci/j) , era o n;>ro.rK>nta a UO/.-la !, "'-.l.-.ir iò . >l- ,vi»n'i r»»• '••.':••.-: -IM1 —
82.
res ' . A atividade espe *"ica rrédia daqueles valores foi ds (110,8 +
23,6) TBq/g (2994 _+ 638 '" j , permitindo esüjnar que a incidência de áto-
mos de 1 2 5 I por molój \ u de T3 foi de (0,9 + 0,2) 125l/molécula.
Esr Valores estHo próximos do valor de atividade específica má
o V/J T, produzido pela ac
que ê 0 '.30 TBq/9 (3500 Ci/g) ( 4 7 ) .
xima teóri o v/j T, produzido pela adição de 1 álano de I por molécula
Esta diferença entre o valor teórico e o encontrado pelo proces
so de autodeslocar.ie.nto, embora não significativa, deve-se provavelmente ã
propagação de erros experimentais preponderantemente ligada ã aliquotagem
da massa de T, e da atividade posta a reagir , e que conduzem ã disper-
são dos resultados da atividade específica encontradas entre diferentes en
saios.
A atividade específica das radioiodotironinas produzidas pela
— - 125 ~ 125
adição de um atono de I nao se al tera com o decaijnento do I,pois quan
do isso ocorre a molécula residual não é mais reconhecida pelo anti-soro.As
sim, a radioatividade e a quantidade de iodotironina decresoem aproximada
mente na iresma razão . De fato, em nossos estudos a atividade específica
mostrou-se constante ao longo de 105 dias, ocnprovando-se que I-T, foi
produzido cela adição de 1 Stano de I .
125 -1,3. Estabilidade do ^-^o armazenado em solução de propileno tjli-
col 50 rt
O I-T, permaneceu estável durante pelo menos 100 dias, qu^ido
foi devidaTients armazenado em soluções de propileno glicol 50% e mantido ã
temperatura de - 20°C. Cano rostra as figuras 13 e 15, IO1} díüs ap*5s a mar
125cação 9C6 da radioatividade presente representava o I-T, inebrio.
83.
2 . CARACTERÍSTICAS DO ANTICORPO
2 .1 . Diluição apropriada do anticorpo, anti-T7
A etapa experimental mais complexa da metodologia da fase sólida
é a da oomploxação do anticorpo ã estrutura plástica, necessitando utilizor
um anticorpo cujo t i tu lo seja previar.iente conhecido e alto. Assim, deternuL
r.ou-se o t í tu lo do anti-soro com a utilização da técnica de "Solução PEG",a
qual é mais simples nessa fase experimental. A figura 21 ircstra os resulta
dos da análise de t i tu lo do anti-soro obtido.
Segundo Parsons , os anticorpos dos antígenos de baixo peso
molecular (< 1000 daltons), devem apresentar t í tu lo da ordem de 1/10 000 em
sistemas de separação em "fase líquida" para serem adequados no uso de fase
sólida.
Dos três coelhos imunizados neste txcibalho, somente u:n, oproxi
mou-se dessas características (diluição 1/10 000).
Era nossos experimentos observance qu« Coi necossnrio ut i l izar o
anti-soro cerca de dez vezes irais concentrado em relação âs outras técnicas
(PEG, Duplo Anticorpo), o que está da acordo com ar, provisões fe Parsons
AsiiLm, enquanto a uma diluição €•• 1/30 000 obteve-sc uma capacidade do li<ja
ção cerca de 25% em "fase líquida", foi necessário recobrir os tuhos can es
te anticorpo diluído a 1/1000 para conseguir a irestiia li-jyção, «xnforire as
figuras 16 e 21.
A "ineficiência" do uso do anticorpo neste método é devida pro-
vavelmente ã incompleta adsorção do anticorpo e ã retenção da iüiunorrcvitivjL
dade de alguns s í t ios do anticorpo una vez aderido â superfície plástkrj
Aciira do liiiáto Ce saturação, a qufint.WT.lcs do nr.f .icorro iin/nor
reativo atlsorviclo na superfície não 6 prororciorvil ã quir.Lid-i:f: tii i>i\>\.c\;v\
84.
presente na solução de recobriroentxr ' .Na figura 21 observa-se que atin
giu ligação máxima na faixa cie diluições entre 1/100 a 1/300. Fora dosto in
tcrvalo verificou-se diminuição constante na capacidade de ligação, mssiio
aumentando a concentração do anticorpo na solução de inobiliznção. Foi ntTo
tada a diluição de 1/1000 conforme indicado na figura 21.
2.2. Especificidade do anti-corpo, ant-i-T-,
0 T, está presente em quantidade muito pey|wna na ei rculaçlo san
guinea, junto com substancias que possuem estruturas semelhantes à sua nolé
cuia, t a i s como T, e os produtos da desiodação ou da desaiuinação e descaebo
xilação das iodotironinas. Assim, é necessário obter anticorpo, anti-T^ a i
taroente espedfioD, para sua utilização do KSE.
A especificidac!^ do anticorpo, avaliada pela reativiclacte cruzai7"»
can aquelas substâncias nostrou-se satisfatória (Tabela II e figura 22). A
afinidade do T, pelo anticorpo foi muito p.iaior do que todos os outros com-
postos análogos estudados.
A reação cruzada com o rT, foi de apenas 0,008%, apesar de dife
r i r do T^ somente na posição de uni átano de uyio. Em diversos estados mata
bólicos cof.x) dcenças sistâivlcas, tixtreinos Ca idide e dor;nutrição [>rot.?ieo
Cíilôrica ocorre aumento nos níveis séricos de rT, e dhuinuição de
,p (1 , 4,b2, 9) ^ Mesno nestas condições, com aquele nível de reação crur:a
da, o RIE do T3 não sofrerá a interferência do rT-j. 0 1'4 que í;e encontra
em quantidade muito niaicr (cerca de 70 vezes) do que o l \ no sangue,a re£
ção ernzada foi de 0,053, valendo as mesmas observações.
Foram necessários 256 pg dfj T, (Xr0%) p^ira deslcx;ar 50?* cb T i.a_
díoativo do ccriplexo ""l-T-j-anticrirjo, enquanto que for.^i rcqi^rifVis rA2\Y}
cb T4, o 32 ug cb rT-, porá SG obter es?o rnnrmo clo:;1oc.-iirr>n'o.
85.
X50% entre * "9 a 30° U9# consequentemente can reação cruzada menor quo
0,01%. Estes resultados estão caipatíveis ocm aqueles descritos na litera-(16,48)
tura .
2.3. Constante de afinidade "K" e concentração molar "q" do anticorpo
A constante de afinidade "K", apresentada na tabela I I I , can o
valor médio c3e 0,92 x 10x litros/mol é aarparável cxxii aquele obtido por
Thorell e col e também dentro das expectativas c7e Ekins
Aplicando-se as expressões de Ekins no cálculo das concentra
ções ideais da concentração do T, traçador "p*" e da concentração nolar de
anti-soro "q" conduiu-se que a concentração do T, traçador seria de p* =
4/X = 0,43 x 10 mol/litro ou 44 pg. A concentração molar do anti-soro de
veria ser da ordem de q = 3/K = 0,33 x 10 mol/li tro.
O valor médio da concentração do anti-soro "q" obtido experimen••9talraente foi de (0,42 + 0,11)10 mol/litro, conforme os dados da tabela
—9I I I , enquanto a média da ccncentração do T3 traçador "p " foi de 0,58 x 10
mol/litro ou 60 pg.
Corparando-se esses valores irédios de "q" e "p " obtidos exper^
mentalmente e aqueles esperados teoricamente por cr i tér io de otimização de
Ekins , concluiu-*-* que as concentrações utilizadas estão razoavelmente
próxiiiias daqueles projetados pela expressão de Ekins.
3, CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS
3 . 1 . Sepeuraçcío das imunoglobulinas G (Infi) dp an t i - so ro , ant i -Tj
As proteinas do soro podem aderir â superf ície do ( ; lás t ia j a?n n
nx;s:na intensidade que o anticorpo especí í ico , por ir,r,o iíiolfirnin-"'"» ar;
imuiKxjlobulinas G (IcjG) do ant i -soro [GIC» técnica ei;; i»tcjii>il-'tçíío ftvi<-i'.»ti;i
86.
da de sulfato de aonônia. Ainda que este método não ofereça una preparação
pura de IgG, adotou-se este procecLunento, por ser a técnica mais simples no
isolamento da IgG e pelos resultados satisfatórios encontrados em nosso tra
balho e na li teratura . Obteve-se assim uma trelhoria no processo da reco
briinexito dos tubos.
3.2. O pH apropriado da solução na ppliroerizaçãq ft* fllutaraldetdo na
parede do tubo
A iinunoglobulina isolada foi aderida ã parede do tubo de reação
pela conjugação covalente da imunoglobulina na superfície plástica,utilizan
do o glutaraldeído. Este procedimento ncatrou-se r.iais eficiente, permitindo
una fixação mais firme do anticorpo na parede c una capacidade maior no re
cobrimento dos tubos do que squeles preparados por siirpies adsorçãb, confor
me os resultados da figura 17.
O pré recobrimento dos tubos foi efetuado com ylutoraldeído em
meio alcalino. Na figura 17, verifica-se que a eficiência no recobrüiento
dos tubos foi significativamente maior, para aqueles tratados can glutaral
deído em pH alcalino (9,5) , enquanto que em pH ácido e neutro a eficiência
foi praticamente igual ao obtido por sinples adsorção.
Estes resultados sugerem que o mecanismo de polimerizaçao do ylu
taraldeldo em meio básico, ocorre por condensação alüõ.lica, na
da parede do tubo, como propõem alguns autores J ' .
«7.
Vc-c-c-c'° _-i?_ °- « « « o
\,r
iII C it
I-
° V " " JJ « ? » Y I. H li .. C
» n H
0 glutaralüeído poliiierizaOo reage uai» o grufjo aiüna (!iH?) do on
, quanda csbes são colocados esn cxxitacto. Essa reação ocorre seyun-
cb o necanisno da ocndensoção de Michael* ' .
C „ «-'II I II I 11 ,
I + 2to-l«i2 ^-c - ç - c - c - c - c - c ^ :In>
v v- II II t » 1 » Ü^ c - c - c - c - c - c - c
II I II II II I IIM-ll . « - »I IMi «>
A ligação oovalente cnLre a nolécula cb ÍUÍLÍOVJ'» r» or» »nl/?r;
prc-UralaCbr. pro/n'.^ljicnLc ocorre i<>r c;;tn IXJ.T.V Í ' ' .
C G t u ! o r . , anni ia p ropa i a i l ' iK , Tuinsn i n a i K v l . v ; o n i .••;I>;~Í < f ;it. •:..]•»
KAB p m - i}toc:r.-;.cr or, t;ftlor. n ã o j . c a ! . ^ r t . o n cli |.l.1-';C O : :
P8.
3.3. A ligação ínespecífica no sistema de "Fase Sólida"
A ligação inespecífica no sistema de "Füse Sólida" pode ser de-
terminada por dois procedimentos. 0 mais siwples, para quem prepara estes
tubos, consiste em recobrir os tubos coin SAB em substituição ao anticorpo e
incuba-los cera traçactor na ausência do antígeno não marcado (branco tín rea
çio) . Outro procediitento reside na adição de quantidade em excesso do antí
geno não it;arcauo nos tubos recobertos can anticorpos, e reação cem o troça
dor. Este procediirento é mais indicarlo para quem recebe os tubos c!e "Fíise(65)
Sólida" ja preparados
Ifeste trabalho, os dois procedimentos apresentaram os mesmos re
sultacbs. A ligação inespecífica variou segundo as condições de pré recobri
nento des tubos can glutaraldeido (concentração, temperatura), interferindo
na qualidade da curva padrão, conforme se infere nas figuras 18 e 19.
3.4, Efeito da concentração e da temperatura de incubação do glutaral-
deldo no recobrinento dos tubos
Conforne as figuras 18 e 19 alcançou-se ligação mais al ta Cu tra
çador quando a tesrperatura de polimerização foi elevada e cun glutaraldeido
Riais concentrado. Isto é òevido a formação de grande quantidade de glutaral
celdo polimerizado, na parede dos tubos, avsrentando-se assim, a ligação ires
pedf ica . Entretanto,a ligação maior obtida nessas condições, não reflete a
realidade de meJ.hor desençenho do ensaio. A má qualidade da curva dose res-
posta e a alta ligação inespecífica desestiinula qualquer propósito de aí i r
mar que estas sejam as condições adequadas de pró-tratsnento dos t'jr»s.
A concentração õn glutaraldeído qije nostrou ser indicada para o
recobriment:o dos tubos foi 24 à tenctfratvura de poliinerizaçÕo âe 20°C, ozn-
fomíí figiiras 18 e 19 o coní;J.ci?rD-yõcs y* mnndLcnvna-iri no C,vtáluh> i r r , ií -n
2.4.2. . Os tubos prú-tratnrtor, norsnr. v-MM'fJcv, r-Lnc:;fii' r.j -,m Cr; ;.<r\'Vi. v? <'•
89.
ligação (B /T) da ordem de 25% e não caipraneteretm a sensibilidade da curva
padrão. Por outro lado, utilizando-se glutaraldeído a 1% e tenperatura do
10°C, a curva i.ostrou oomporticnenta semelhante, no entanto, a cnpacviute do
ligação foi mais baixa e a ligação inespeclfica foi praticamente igual ãque
Ias encontradas para concentração de 21 a 20°C.
3.5. Efeito do tempo e da tonyeratura de incubação na iiiobilização do
anticorpo
O tempo de incubação na inobillzação do anticorpo que mostrou ser
apropriado para a preparação dos tubos foi entre 24 a 35 horas, conforme
mostra a figura 20. A temperatura de 4°C foi adotada para evitar a deterio
ração do anticorpo
4. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS DO EMSAIO
4.1. Características das curvas padrão
Para fins comparativos, RIEs de "Duplo Anticorpo" e "Solução PEG"
foram efetuados.Selecionaram-se estas duas técnicas por já serem utilizadas
tradicionalmente em nossos laboratórios, can as características metodolõgí^(36,57) (17,20,23,88)
cas definidas e consensualitente aceitas na literatura .
Para tanto, foram utilizados os rressnos reagentes básicos nos três ensaios,
125ou seja os padrões (soro referencias) do Ty anticorpo anti-T3 e
I ~ T 3 '
apenas diluído*; nas condições próprias para cada tiro de ensaio, cano des-
critos nos itens 3.11 e 3.12. Após a separação do complexo I-iy- anticor
po, da fração livre com seus respectivos sistemas de separação,avaJUiram-s®
todos os parâmetros pertinentes conparancfo os entre si.
A análise cbs valores dos parãnetros "n,/r", "MSU", "Zyyk" c
"SIÜÍC" &i curva paclrõo dos Prv",s Ca "Yo.se Sólida" cnconí-.rwn-y:' críiivUTv.-i'-.
90
can aqueles obtidos pelas outras duas técnicas conforme apresentados na ta
bela IV.
4.2. Estimativa da dose mínima detectável - EKP
As estimativas da dose mínima detectável (DM)) das t rês técnicos
encontram-se na tabela V e figura 28. O intervalo de confiança cia Cf'© ao ní
vel de P = 0,05 foi de 9 a 25 ng/dl, 8 a 20 ng/dl e 14 a 30 ng/dl para as
técnicas da "Fase Sólida", "IXtplo Anticorpo" e "Solução VBG", respecLLvoiien
t e . Estes valores estão muito distantes daqueles encontrados em indivíduos
normais, permitindo portanto caracterizar perfeitamente os hipotireoideos.
Os dados das CKDs da tabela V não sugerem diferenças significati
vas entre a técnica de "Fase Sólida" e as danais.
4.3. Análise da precisão do nétodo (Perfis intra-ensaio e inter-e»-
salo)
Na análise da precisão do método, a rrprodutibilidade intra-en
saio acusou variação da 6 a 10%, no intervalo de 50 a 900 ng/dl, enquanto
a precisão inter-ensaio foi de 8 a 17%, para a técnica de "Fase Solida",<xr_
forre figuras 29 e 30. Por outro lado, como se obsorva dessas figuras, as cte
tenrinações da concentração de T, nesti-» mesmo intervalo, para a tecn'ca de
"Duplo Anticorpo" são afetadas por erro de aproxk1.> Umente &h a 13% ' quando
a amostra é dosada no mesmo ensaio e erro do aproximadamente 11 a 205 quan
do dosadas em ensaios diferentes. Para a técnica de "Solução PEG", a preci^
são intra-ensaio variou da 7 a 16%, enquanto a precisão inter-ensaio Toi de
10 a 26%.
Ccmo podcsx>s observar, as três técnicos aprcBPntarojn prcclcob
intxa-cnsaio irenor do que a pK^cissão intGr-es\saJ.o, o (|UP \'\ era csjrsrflo
confe^nro obs?rv-.çu2í; Cn R&lbard o. fíísciuitd '
91
A reprodutibilidade intra-ensaio e inter-ensaio encontrada para
os t rês métodos está satisfatória, levando-se era conta que as a-nostras fo
rara dosadas em duplicata, cano são geralmente realizados na rotina <fe labo
ratórios clínicos. Esses valores de níveis de precisão são perfeitamente(56)
aceitáveis na rstocblogia do R3E
4.4. Avaliação dos parâmetros metodológicos das três
Avaliando-se isoladamente cada parâmetro, a técnica de "Duplo An
ticorpo", mostrou melhores resultados quanto 5 ligação imspecáf i m (NSB)
mais baixa, valor do DMD menor e por requerer menor quantidade de T, para
deslocar 50% do complexo I-T3 ^0%^ e n rè^aÇ^° a c u t r a s duas técnicas .
No entanto, na prática esses parâmetros estão tão próximos, que estas pequa
nas nuancias não são significativas.
Na análise da precisão do método, a técnica que mostre >u maior
reprodutibilidade nas determinações de concentrações do hormônio foi a téc:
nica de "Fase Sólida", tanto para precisão intra-ensaio cano para precisão
inter-ensaio. Provavelmente, is to se deve a extrema simplicidade do método,
exigindo o mínimo de operações do analista, ccno mostra o protocolo da fiyii
ra 7, minimizando-se, assim, as dispersões oriundas Cos erros experimentais.
Para ccnpararmos a qualidade dos ensaios pelas t rês técnicas no
contexto anplo, aplicou-se un algoritmo, o qual leva tan conta o jjtírfil dt»
precisão, a [MD e a extensão da curva padrão,
Ccno podamos verificar pela expressão n? 2 do Capitulo II itein
3.14.4. utilizada para calcular o dígito de mérito, a técnica mais adcrjuada
é aquela que apresentar nenor valor do dígito de nériLo, atendenclo-r-e as-
sim, o ccmprcmisso entre a sensibilidade e precisão do ensaio.
Os valores da dígito &• mérito foram: 0,14 p-.ir-u "Vr-,-2 fv^lid-i" ,
92.
0,19 para "Duplo Anticorpo" e 0,21 para "Solução PEG" cato roostra a tabela
VIII.
Alicerçados nessa avaliação conclui-se que o inelhor procediiien-
to corresponde a "Fase Sólida", seguido pelo "Duplo Anticoq»" e "Solução
PEG". Nossos resultados mostrara por outro lado, que o ensaio <To "Duplo Anti
corpo" pode satisfazer melhor os resultados na faixa de Mpotireoidisno, co
ro mostra e tabela VIII, na qual a técnica do "Duplo Anticorpo" acusa tuenor
END.
No entanto, os três sistemas de separação mostraram adequados pa
ra determinação dos níveis siri cos de T,.
4.5. Fe,sul,tados da concentração das amostras dosadas - Exatidão do
nêtodo
Os resultados da conosntração de T 3 de 39 amostras de soro,
das pelns três técnicas, com os respectivos intervalos de confiança onoon
tram-se na tabela VI.
A exatidão da técnica da "Fase Sólida" foi avaliada por chupara
ção entro esses resultados, que rjode ser nelhor observacki IVT figura 34, on
de todos os valores obtidos encontram-se espalhados cm torno das retos bis
setrizes. O coeficiente Ú3 correlação (r) entre os resultados destas três
técnicas comparados er.tre si, encontxanv-üe na tebela VIJ. A linearidatJe e a
alta correlação indicou que as três técnicas forneceram praticainente os ines_
mos resultados dos níveis séricos de T 3 presente nas anostras, caiprovantfo-
-se a validade da "F^se Sólida", uma vez que já se acredita nn exatidio das
outras duas técnicas.
93.
5. CARACTERIZAÇÃO DA FAIXA DE NORMALIDADE E NÍVEIS SÉRICOS DE Tj ENCONTRA-
DOS EM PACIENTES COM HIPOTIREOIDISHO E HIPERTIREOIDISHO
A distribuição de freqv£.-.cia ds valores das concentrações séri-
cas de T, obtidos ds 153 indivíduos normais encontram-se na tabela IX. Pelo
histograma apresentado na figura 351 adotou-se que os valor»*; obedecem a
distribuição normal. A média aritmética de seus resultados e desvio padrão
foi de 145 + 27 ng/dl, respectivamente, estabelecendo a faixa de normalida
da entre 90 a 200 ng/dl, ao nível de p = 0,05.
Da análise da figura 36, concluiu-se que a técnica de "Fase Sõli
da" discrimina os níveis séricos de T^ de indivíduos hipotireoideo, normal
e hipertireoideo.
Na tabela X encontram-se relacionados os valores de concentração
da T-. no soro de indivíduos nonrais, pacientes com hipotireoidisr© e hiper
tireoidismo descritos por outros autores, em comparação con resultados en
contrados neste trabalho. Eventuais variações no valor médio da concentra-
ção de T3, podem ser relacionadas com as variações de metodologia das carac
Í13 29) -terísticas dos cençonentes enpregados ' e de efeitos de distxibuiçaopopulacional.
94.
TABELA X - Estimativa da concentração âa T3 encontradas por diferentes
pesquisadores
Aufjor
Mitsuma (1971) ( 5 8 )
ULeblich e
ütiger (1971) ( 5 3 )
Larsen (1972) (52)
Sterling eMilch (1974) ( 8 5 )
Burger e
col (1975) K}
Lyunggren (1976) ( 5 4 )
Colli (1980) ( 1 9 )
Koizumi e
col (1980) m )
Este trabalho
Concentração ce
Hipotiroidismo
6 2 + 9
99 + 24
39 + 21
47 + 39
0 + 80
33 + 35
49 + 40
104 + 38
46 + 24
T3 n o £ ;oro ( ng/dl
Eurotiroidisno
138
145
110
169
90
us
132
159
145
+ 23
+ 25
+ 25
+ 30
Í 36
+ 22
+ 29
+ 21
+ 27
)
Hiperti roidisiro
491
429
546
838
220
411
420
522
500
+ 265
+ 146
+ 442
+ 30
+ 1040
± 142
+ 218
+ 404
+ 197
95.
6. VANTAGENS E DESVANTAGENS DA TÉCNICA DE "FASE SÓLIDA"
As desvantagens observadas para n Lécnim de "Fase Sôlich" era re
lação aos outros métodos foram: necessidade de maior quantidade de anticor
po, cerca de dez vezes mais, e anticorpo cem título mais alto. Os anLicor-
pos obtidos dos três coelhos mostraram-se satisfatórios para o sis Lema de
"Fase Liquida", enquanto que somente um apresentou título suficientanente
alto para ser utilizado na preparação dos tubos de "Fase Solida", além da
preparação geral da todas as etapas na técnica de "Fase SóliCa" ser mais
complexa do que outras técnicas.
No entanto, estas desvantagens são compensadas jela extrema sim-
plicidade do método, laboratorialmente, para quem o rccjdbe. A técnica pos
sibilita, assim ao analista grande rapidez no trabalho cem poucas operações
e equipamentos, ninimizaneb-se as dispersões nos reatados das dosagens cb
vido aos erros experimentais e conduzindo a ensaios com maior precisão. A
separação da fração ligada da livre se realiza por simples decantação ou as>
piração, não necessitando da fase de centrifugação.
Na análise conjunta levando-se em conta todos os parâmetros, a
técnica co "Fase Sólida" apresentou resultados ccíiiparáveis e algumas vezes
estes foram melhores.
96.
V. CONCLUSÕES
1. O T3 marcado possui aproximadamente (0,9 + 0,2) I por molécula do T .
A atividade específica do 1 2 5 I -T 3 foi de 110,8 + 23,6 T3q/g ( 29^4 +
638 Ci/g ) , a qual está próxima do valor da atividade especifica nváxi
ma teórica ã.
(130 TBq/g).
ma teórica do T3 produzido pela adição de 1 átono de I por molécula
2. O anticorpo, anti-T^ utilizado neste trabalho apresentou as seguintes
características: requereu diluição do anticorpo de 1/10 0GO em "Fase
Líquida" (PEG, Duplo Anticorpo) e 1/1000 em "Fase Solida" para propor
donar una ligação com o traçador ao redor de 25%; constante de af ini -
dade de reação T3-anticorpo de (0,92 + 0,19) x 10 1/mol e reativida
da cruzada de 0,05%com o T. e inferior a 0,01% com as demais substân-
cias análogas ao T-, estudadas.
3. Apôs o estudo das condições apropriadas para a preparação dos tubos
de "Fase Sólida", o procedimento definitivo adotado neste trabalho foi:
a) pré-recobrimento dos tubos com polimerização do glutaraldeldo diluí
do a 2% em pH 9,5 durante 4 hora» ã temperatura da 20°C; b) imobiliza
çâo do anticorpo nos tubos pré-recobertos can anticorpo diluído a
1/1000 en tampão veronal 0,05M pH 8,6 incubado a 4°C durante 24 horas
e c) preenchimento dos s í t ios não recobertoí; (te superfície plástica
com soro albumina bovina diluída a 0,5% em tampão veronal 0,025M pH
8,6 incubado a 20°C durante 30 minutos.
4. A dose mínirca detectável (DMD) pela técnic?. de "Fase GÓU&V foi de
17 +_ 4 ng/dl, não sugerindo diferenças significativas cem aquelas en-
contradas pelas técnicas de "Duplo Anticorpo" de H _+ 3 nj/dl c Co "C<n
lução PEG" de 22 + 4 nçj/dl.
97.
5. A precisão dos resultados da um mesmo ensaio (precisão intra-ensaio )
da técnica de "Fase Sólida" foi de 6 a 10%, no intervalo de 50 a 900
ng/dl# enquanto as técnicas de "Duplo Anticorpo" e "Solução PEG" apre-
sentara-a variação de 8 a 13% e 7 a 16% respectivamente.
6. A precisão dos resultados de dosagens efetuadas em diferentes dias
(precisão inter-ensaio) variou de 8 a 17% na faixa de concentrações de
50 a 900 r.g/dl para a técnica de "Fase Sólida" enquanto que a disper-
são dos resultados encontrada para a técnica de "IXiplo Anticorpo" foi
de 11 a 20% e para a técnica ús "Solução PEG" de 10 a 26%.
7. 0 menor valor do dígito de mérito (D.M.) encontrado para a técnica de
"Fase Sólida" (D.M. = 0,14) indicou que o procediicento mais eficiente
corresponde a esta técnica, atendendo melhor o conpromisso entre a seri
sibilidade e precisão do ensaio, seguido pelo "Duplo Anticorpo" (D.M. =
0,19) e "Solução PEG" (D.M. =0,21).
8. Os resultados das amostras séricas de T, dosadas pela técnica de "Fase
Sólida" apresentaram boa correlação can aqueles encontiaJo^ pelas téc
nicas de "Duplo Anticorpo" (r = 0,97) e "Solução PEG" (r - 0,96), ocm
provando-se a exatidão da "Fase S5lida", urna vez já conhecida a das ou
trás duas técnicas.
9. Os valores €a normalid-rip de ní"ol sérico de T, foi de 145 + 27 ny/dl,
estabelecendo a faixa de 90 a 200 ng/dl, ao nível de p - 0,05.
10 A técnica de "Fase Sólida" permitiu discriminação dos níveis séricos
de T, de indivíduos hipotireoideo, normal e hipertireoideo, nostrando-
-se adequada para a quantificação do T 3 na rotina dos dosagens do natu
reza clínica.
98.
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