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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
AUTARQUiA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE De SÃO PAULO
2STUDO DAS CONDIÇÕES DE MARCAÇÃO DA GENTAMICINA COM 23™Tc.
COMPLEXAÇÂO COM Re. ESTABELECIMENTO DOS PARÂMETROS
FARMACOCINÉTICOS COM O AUXILIO DA
ANALISE COMPARTiMENTAL
CLGA GONÇALVES DE CARVALHO
Tese iipresenU'csi coma pntlc rios rns^wútos
para obter ção tío Grnu de Doutor cm
Tecnologia Nucle-ir.
Of i'Ti!;i(lorír Dry. Ma.'i.i Appar>.-t:i<lii T. M. i((; Almekiii
SAO PAULO
1928
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Ao Dr. Cláudio Rodrigues, Superintendente do Insti
tuto de Pesquisas Energéticas e Nucleares-CNfcN/SP, e ao, Dr.
Roberto Fulfaro, Diretor da Diretoria de Aplicações de Técni_
cas Nucleares pela oportunidade concedida para a realização
desta tese.
A Dra. Constância P.G. da Silva, Chefe do Departa
mento de Processamento, pelas facilidades oferecidas para exe
cução deste trabalho.
A Dra. Maria Apparecida T.M. de Almeida, Chefe da
Divisão de Radiofarmâcia, pela orientação, apoio e dedicação
recebidos durante a elaboração desta tese.
Ao Prof.Dr. Massayoshi Yoshida e ã Dra. Emiko Mura
moto, pelas sugestões, esclarecimentos e contribuições trans
mitidos durante a realização deste trabalho.
Aos pesquisadores Antonio Soares Gouvea e Maria do
Carmo Costa Falcão, pelos trabalhos de computação.
Aos pesquisadores Elaine Bortoleti de Araújo,Marycel
F.Barbosa, Maria Tereza Cotulrato, Maria Helena Bellini e aos
técnicos Alfredo dos Santos, Marina Leonel da Silva e Tereza
de Marilaque S. Vasconcelos pela valiosa colaboração na execu
ção da parte biológica desta tese.
Aos meus amigos do Instituto de Pesquisas EnergéU
cas e Nucleares que acreditaram e colaboraram na elaboração
deste .rabalho e a todos aqueles que de uma forma ou de outra
pa. «.íciparam na sua realização.
ESTUDO DAS CONDIÇÕES DE MARCAÇÃO DA GENTAMICINA COM 99mTc.Q14-
PLEXAÇAO COM Re. ESTABELECIMENTO DE ALGUNS PARÂMETROS FARMA-
COCINÉTICOS COM O AUXÍLIO DA ANÁLISE COMPARTIMENTAL.
Olaa Gonçalveé de. Ca.tiva.lho
RESUMO
Sulfato de gentamicina ê um antibiótico do tipo and
noglicosídio usado especialmente contra as infecções causadas
por bactérias Gram-negativas, e que apresenta a ototoxidez co
mo efeito colateral mais grave.
99m A marcação da gentamicina com Tc, tem por finaH
dade propor um traçador para o estudo da distribuição biológi^
ca e compartimentalização do antibiótico.
As condições de marcação de sulfato de gentamicina
com Tc, a partir de peTtecnetato de sódio eluído de um ge
no QQm «•
rador Mo- Tc, foram estabelecidas quanto a massa de anti_
biótico, do redutor (SnCK» 2^0) , tempo de reação e pH final
de marcação.
0 mesmo procedimento de marcação foi realizado com
Re (perrenato de amônio), com a finalidade de se obter algu
mas aproximações de caracter semiquantitative, no estudo de
estrutura do complexo formado, dadas âs características quí
micas similares entTe Re e Tc; sendo dessa forma possível su
gerir o envolvimento do grupamento NH2 e da ligação C-0 da
flDnt Off í /*í n a r% a r*i%fn*« 1 A V «*• « A
Do estudo de captação biológica em ratos com sulfa
to de gentamicina """Tc definimos que os rins se constituem
nos órgãos que apresentam maior afinidade pelo antibiótico,com
um máximo de captação em torno de 180 a 240 minutos, declinan
do após esse tempo; para a dose e tempo estudados não houve
uma significativa captação pela cabeça (região auricular).
Foi determinada a curva de decaimento plasmático de
gentamicina mTc, calculando-se então as meias-vidas biológi.
cas das respectivas exponenciais obtidas. Calculou-se também
o volume de distribuição aparente e com as medidas de corpo
inteiro foram determinados os valores da meia-vida biológicae
da depuração total.
0 modelo de distribuição do sulfato de gentamicina
99m
Tc em ratos, se constitui num modelo compartimental com
um de retenção para intervalo de tempo de 24 horas em que foi
estudado.
STUDIES OF LABELLING CONDITIONS FOR GENTAMICIN KITH 9 9 w T r .
COMPLEXATION WITH RHENIUM. ESTABLISHMENT OF PHARMACOKINETICS
PARAMETERS THROUGH COMPARTMENTAL ANALYSIS
Olga Gonçatvtò de. Caivalho
ABSTRACT
Gentamicin sulphate is an aminoglycoside antibiotic
type specifically used for treatment of infections produced
by Gram-negative bactérias but at the other hand it presents
ototoxic reactions as a serious side effect.
99m The main purpose of labelling gentamicin with Tc
was to obtain a radioactive tracer to carry out biological
studies and compartmental analysis of this antibiotic.
The optimal labelling conditions of gentamicin sul
phate with Tc, using sodium pertechnetate solution eluted Q Q QQm
from a Mo- Tc generator, weTe stablished by testing differ
ents masses of antibiotic, and reduction agent (SnCl2.2H20) ,
and also different reaction time and final labelling pH.
The same labelling procedure was used with Re (amo-
nium perrenate) in order to obtain some semi-quantitative
approximations of the chemical structure of the complex formed,
since Ke and Tc present similar chemical characteristics. In
this way it is possible to suggest the role that the groups
NH2 and C-0 bonding of the gentamicin play in the complexation
process.
From the studies of the biological uptake of Tc-
gentamicin sulphate in rats, the kidneys showed the highest
affinity for the antibiotic. The maximum uptake was observed
in 180 to 240 minutes followed by a decrease of it afterwards.
For the dose and time used, no significative uptake by the
auricular region was detected.
99m
Curve of plasma decay of Tc-gentamicin was ob
tained, and from the exponentials of each beanch of this curve
respective half-lives were calculated. Furthermore the apparent
volume of distribution was determined, and with the residual
radioactivity in the body, the biological half-life and total
clearance were obtained.
The distribution of Tc-gentamicin in rats was
set in a bi-compartments in addition to a retention one for
the 24 hours time interval studied.
ÍNDICE
CAPÍTULO l - INTRODUÇÃO 01
1.2. Características de Tecnécio: *Tc ... 07
1.3. Estudos Farmacológicos com o Uso de Ra
dioisótopos 09
1.4. Faroacocinética 12
1.5. Objetivos do Trabalho 18
CAPÍTULO 12 - PARTE EXPERIMENTAL 20
Materiais e Métodos
II. 1. Materiais 20
II. 1.1. Reagentes 20
11.1.2. Material Biológico 21
11.1.3. Equipamentos 21
II. 2. Métodos 22
11.2.1. Técnica de Marcação e Otimização das
Condições de Marcação do Sulfato de Gen
tamicina com 99n,Tc 22
11.2.2. Otimização das Condições de Marcação . 23
11.2.3. Estudos Químicos 23
ÍMÇ£
EÁÊUJA
11.2.4. Estudos Biológicos 24
11.2.4.1. Distribuição Biologic.i 24
11.2.4.2. Medidas do Henatócrito Real, Voluwe San
guíneo e Volume Plasnático 26
11.2.4.3. Medidas de Corpo Inteiro 26
11.2.4.4. Coleta de Fezes e Urinas 27
11.2.5. Irogranas de Conputador Enpregados nos
Cálculos 27
CAPÍTULO III - RESULTADOS 29
111.1. Estudo das Condições de Marcação do Sul
fato de Gentamicina com 99mTc 29
111.2. Estudos Químicos 30
111.2.1. Espectros de Absorção na Região do In
fravermelho 30
111.2.2. Espectrometria de Ressonância Nuclear
Magnética Protônica 31
111.2.3. Análise Elementar 31
111.3. Estudos Biológicos 36
III.3.1. Distribuição Biclógica do Sulfato de
Gentamicina Marcado com 99mTc após Ad-
ÍNDICE
EAfclKA
I I 1 . 3 . 2 . Níveis Sangüíneos e Plasmáticos do Su2 99B fato de Gentamicina Marcado com TC
após Injeção Endovenosa 36
I I 1 . 3 . 3 . Níveis Plasmáticos de Sulfato de Genta
micina *Tc após uma Administração En
dovenosa 36
II 1 .3 .4 . Cálculo do T\/2 d e C a d a Exponencial da
Curva Plasmatic» do Sulfato de Gent ami
cina 99mTc .. 49
II 1 .3 .5 . Determinação do Volume Aparente de T>is
tr ibuição 49
111 .3 .6 . Determinação da Neia-Vida Biológica . . 49
111 .3 .7 . Determinação da Depuração Total 51
I I I . 4 . Modelo Compartimental do Sulfato de
Gentamicina Tc após uma Injeção En
dovenosa em Ratos Kistar 56
I I I . 4 . 1 . Modelo Bi-Compartimental 56
II 1 .4 .2 . Modelo Bi-Compartimental com um Compar
timento de Retenção 57
CAPÍTULO IV - DISCUSSÃO E CONCLUSÕES - . 69
ÍNDICE
Piscussão 69
IV. 1. Estudo das Condições de Marcação do
Sulfato de Gentaaicina com *Tc . . . . 69
IV. 2. Coaplexação co* Re 70
IV. 3 . Estudos de Parâmetros Famacocineticos
do Sulfato de Gentaaricina *Tc co» o
Auxíl io da Análise Coicpartinental . . . 73
IV .3 .1 . Distribuição Biológica do Sulfato de
Gentawicina "*Tc 73
IV.3 .2 . Estudo Famacocinético do Sulfato de
Gentawicina ^ " c por Via Endovenosa . 74
Conclusões 79
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 83
INTRODUÇÃO
O antibiótico denominado gentamicina foi estudado e
descrito pela primeira vez por Weinstein e colaboradores em
1963* , e isolada, purificada e caracterizada por Rosselot
e colaboradores em 1964 *->* . Ela é utilizada preferencialmen
te no tratamento das infecções graves produzidas por bacté
rias Gram-negativas.
Quimicamente constitui-se em um antibiótico do tipo
aminoglicosídio derivado de microorganismos actinomicetos do
gênero Micromonospora.
Os antibióticos aminoglicosídios são formados por
dois ou mais aminoaçúcares unidos por ligação glicosídica a
um aminociclitol. A gentamicina possui dois aminoaçúcares H
gados ao 2-desoxiestreptamina e possui a seguinte fórmula e^
trutural, Fig. 1.1.
As variações do aminoaçúcar na posição I, Tesultam
em três componentes diferentes da gentamicina, que segundo
Goodman, L.S. e Gilman A., essas diferenças parecem ter pouco
efeito sobre a atividade antibiótica'- •'.
Os antibióticos aminoglicosídios agem interferindo
nas síntese das proteínas nos ribossomas das bactérias Gram-
-negativas sensíveis, têm a capacidade de induzir a uma lei
tura errônea quanto ao código genético do modelo do RNA mensfi
geiro, incorporando aminoãcidos incorretos nas cadeias poH
HC NHR9 NH0
FORMULA ESTRUTURAL DA 8ENTAMICINA
•ENTAMICINA C, > R,t Rt • CM,
C„ . R, . R f . N
AC—» ACf TILAM «»—A0IMLAK
Figura 1 . 1 . - Fórirula Es t ru tu ra l da Gentair icjna.
3
peptídicas em crescimento. Especificamente a gentamicina age
ao interferir com a síntese das proteínas nos micToorganis
mos.
As bactérias podem resistir à atividade antimicro
biana dos aminoglicosídios de «rido aos seguintes fatores:
a) incapacidade de penetração celular do aminoglicosídio.
b) baixa afinidade da droga pelo ribossoma bacteriano.
c) inativação da droga por enzimas microbianas, sendo que
isso explica a resistência microbiana aos aminoglicosi
dios, observada na prática clínica.
Podemos observar na figura 1.1, que os grupamentos
amino e hidroxila da gentamicina têm a capacidade de sofrer
ação das enzimas acetilase (AC) e adenilase (AD).
No tratamento das infecções microbianas graves cau
sadas por bactérias Gram-negativas tais como: Pseudomonas ae
ruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Entero
bacter (vária-» espécies), utilizam-se geralmente os antibiõti
cos aminoglicosídios. Dentre as infecções a considerar, temos
aquelas do trato urinario, a bacteremia, a meningite, a pneu
monia, a otite e a peritonite.
Embora os antibióticos aminoglicosídios não sejam
indicados para o tratamento das infecções sem complicações
nas vias urinãrias, existem dados de Ronald e colaboradores1 9J
e de Varese e colaboradores^64^, indicando que uma única dose
4
de administração intra-muscular de gentamicina, (5 mg/kg) se
ria e f i c a z , produzindo cura em 901 dos casos.
A Tabela 1.1 fornece a concentração in ib i tõr ia mini
ma (C1V) , e a porcentagem de microorganismos isolados, consi^
derados sens íve i s pela gentamicina.
Concentração Pseudomo- Enterobac- Klebsiella Serratia Plasmãtica nas aeru- ter(várias pneumoniae marcescens
ginosa espécies) (yg/ml) CIM % CIM \ CIM I CIM \
Gentamicina 4 - 8 8,0 87 1.3 90 4,0 97 4,0 95
Tabela 1.1 - Atividade Antibacteriana da Gentamicina (Atkin
son, 1980) (5 )
CIM - Concentração Inibitõria Média
% - Porcentagem de Microorganismos IsoLa
dos Sensíveis
Definimos microorganismos sensíveis,como sendo aque
l e s in ibidos por concentrações plasmáticas otimizadas obtidas
clinicamente, mas que não estejam associadas a incidência de
toxicidade.
Os antibiót icos aminoglicosídios são mal absorvidos
pelo trato i n t e s t i n a l , e no caso particular da gentamicina es
sa absorção pode aumentar na ocorrência de desinteria b ' c i -
lar*- K No caso de administração oral ou retal repetida,
poderá resultar em acúmulo de concentrações tóxicas em pacien
5
tes com disfunção renal. Da mesma forma quando os antibiôti^
cos aminoglicosídios são aplicados topicamente em grandes fe
Tidas ou queimaduras, poderá ocorrer intoxicação se existir
/-• •- • -.(29) insufíciência renal*•*"*J .
Quanto ã distribuição orgânica, observam-se concen
trações altas de antibióticos aminoglicosídios apenas no cor
tex renal, na endolinfa e na perilinfa do ouvido interno, o
que provavelmente estaria contribuindo para a nefrotoxicidade
e ototoxicidade dessas drogas. Temos ainda também, concentra
ções secundárias de aminoglicosídios nas secreções e nos te
cidos(29>.
Os antibióticos aminoglicosídios são excretados qua
se que exclusivamente por filtraçao glomerular* '.
Dado que, a incidência de nefrotoxicidade e ototoxi_
cidade está diretamente relacionada a concentração na qual se
acumula o aminoglicosídio, isto torna obrigatório a redução
da dose de manutenção em pacientes com disfunção renal e isto
deve ser acompanhado com precisão, visto que, a concentração
plasmatics associada ã toxicidade não é muito maior do que
aquela necessária para o tratamento de numerosas infecções
bacterianas.
0 efeito colateral da gentamicina mais importante e
muito grave é a ototoxicidade irreversível, sendo esta o r^
sultado da destruição progressiva das células sensoriais ves
tibulaTes do ouvido interno, extremamente sensíveis e do sis
f 12 681 tema acústico, estendendo-se às células coclearey ' .A dege
6
neração das células sensorials e do nervo auditivo resultam
na perda irreversível da audição* .
A gentamicina pode produzir também maior nefrotoxi
cidade do que os outros antibióticos aminoglicosídios utiliza
dos per vias sistêmicas.
A nefrotoxicidez resulta da alteração da estrutura
e da função das células tubulares proximais dos rins. A toxi
cidade está relacionada com a quantidade total da droga admi_
nistrada e o potencial nefrotoxico varia de acordo com an ti
biotico aminoglicosídio em questão. Há uma corrente de pesqui
sadores representados por Jackson, G.G., Black, Abramowicz,
M. e colaboradores*'*-'^, para os quais o potencial nefrotoxico
da gentamicina em uso clínico foi apresentado como raro e àes
prezível. Entretanto para animais, como por exemplo ratos, ne
cessita-se de uma dose de 12 a 60 vezes maior de que a dose
terapêutica humana para produzir nefrotoxicidez; a quantidade
exata depende entre outros fatoreo, da idade do animal, segun
do esses mesmos pesquisadores* ' ' •'.Falco, Smith « Arcieri,con
cluíran em seus estudos em humanos que a probabilidade de in
cadência de nefrotoxicidez a partir do emprego de gentamicina
situa-se em torno de 21* *.
A administração intratecal ou intraventricular pode
causar inflamação local e resultar no desenvolvimento de ou
Í2Ql trás compli caçoes * " ' .
A forma de sulfato de gentamicina é a mais comumen
te usada em terapêutica, sendo solúvel em água*29-'.
7
O sulfato de gentamicina, conhecido comercialmente
como "Garamicina", é* utilizado na forma farmacêutica para uso
parenteral, em dispositivos para injeção intratecal e produ
tos de aplicação local (pomadas, cremes e solução oftãlmi-
ca)' 2 9'.
Sabe-se que a concentração máxima de gentamicina al_
cançada no plasma é de 4 pg/ml após administração intramuscu
lar, em pacientes que receberam 1 mg/kg; contudo para alguns
estudiosos, as doses recomendadas quando emprega-se gentamiô
na, não proporcionam concentrações previsíveis, havendo um
grau elevado de variação individual, existindo portanto a ne_
cessidade de controles periódicos da concentração plasmatica
do antibiótico nos indivíduos em tratamento prolongado. Por
outro lado, embora não se conheça com precisão a concentração
plasmatica tóxica; sabe-se que tais concentrações máximas su
periores a 10 pg/ml e valores mínimos de cerca de 2 pg/ml man
tidos durante mais de 10 dias tem sido associados ã toxicide
QQlT\
1.2. Características do Tecnécio: Tc
0 tecnécio é um metal de transição de número atônú
co 43, ocupando na tabela periódica o grupo VII B do 59 perío
do. Do ponto de vista químico Tc e Re têm semelhanças quínú
c a s(21) # Dentre os seus radionuclídeos, o 99mTc e o isótopo
de maior interesse em Medicina Nuclear por suas característi
cas nucleares: *\n àe 6,02 horas, emissão Y de 140 keV, au
sêncía de emissão 8. Disso resulta que a exposição para ani
mais e homens é baixa.
8
99, O 99inTc é formado a partir do yyMo e decai por tran
99 sição isomérica ao Tc.
0 99mTc utilizado em Radiofarmácia é obtido a par
• „ J 99u« 99mTl. tir de geradores Mo- Tc.
Na figura 1.2 temos a curva de crescimento do siste
j 99- 99mT„ ma gerador Mo- ic.
Fig. I.2. Curva de Crescimento do 99mTc num Gerador
99Mo-99mTc <44>
Em sistema do tipo gerador de 99Mo-99n,Tc, somente
8o% do 99Mo decai para o 99mTc, portanto o crescimento do 99mTc
será inferior ao do pai, o 99Mo, como podemos observa,- na fi QQ -
gura 1.2. No tempo t - 0, temos somente o "Mo que esta geran
do o 99mTc, no tempo de equilíbrio, que no caso é de 23 horas;
a atividade do 99inTc é máxima, a partir da qual ele passa a
decair com a meia-vida do Mo (66 horas). Se eluimos o ^T"c
nesse instax.te, ele assume as suas características nucleares
99 99m -e novamente o Mo começa a produzir o Tc até um novo equi
líb^io ser instalado.
99 99m Na pratica, o gerador Mo- Tc utilizado no IPEN-
CNEN/SP é const- tuído por uma coluna de alumina onde íons mo
libdato e pertecnetato estão adsorvidos; obtem-se o pertecne
tato de sódio (Na Tc04), eluindo-se a coluna com solução fi
siolôgica (NaCl 0,91).
Existem compostos de tecnécio em todos os estados
de oxidação desde + 7 até -1; entretanto na preparação de ra
diofármacos marcados rom mTc, devemos inicialmente reduzir
o ânion TcO* (+VII), seguida da reação com o agente complexan
te adicionado.
Tecnécio e Rênio formam poucos compostos no estado
de oxidação +2 e apresentam vários no estado de oxidação+4* .
0 interesse na química dos complexos de Re esta no crescimen
- 99m
to da importância e utilização do Tc em Medicina Nuclear.
Estudos eletroquímicos de complexos de Re e Tc, realizados
por Seeber, Mazzochim e colaboradores^ ' ' ^ ' permitiram fazer
comparações entre os dois tipos complexos e com base na siini
laridade química foram preparados complexos de Re e Tc e que
analisados quimicamente apresentaram aproximadamente também
semelhanças de comportamento^8'.
1.3. Estudos Farmacológicos com o Uso ^e Radioisotopes
0 entendimento e a quantificação dos eventos que
10
ocorrem no sistema biológico são facilitados pelo uso de isó
topos radioativos ou estáveis* .
O sangue e a linfa são os tecidos orgânicos que con
duzem preferencialmente os farmacos após administrados, intro
duzindo-os no local de ação. 0 sangue é o compartimento cen
trai a partir do qual um produto é* distribuído aos tecidos,aos
órgãos excretoTes e Teceptores específicos* .
Os produtos, uma vez que atingem a corrente sanguí
nea vão estar dissolvidos na fase aquosa, ligados ãs proteí
nas ou então incorporados ãs células do sangue. No transporte
da droga pela corrente sangüínea, podemos considerar a seguin
te seqüência: fase celular do sangue - fase proteica - fase
aquosa. Durante a absorção da droga o deslocamento se dá* da
direita para esquerda (fase aquosa - fase proteica - fase ce
lular do sangue), e durante a difusão da esquerda para direi_
ta (fase celular do sangue - fase proteica - fase aquosa); se
a droga estiver ligada ãs proteínas na fase aquosa, antes da
difusão ela deverá ser liberada, o mesmo acontecendo se ela
estiver ligada ãs células do sangue. Após a difusão, a distri
buição acontecerá progressivamente para os espaços extracelu
lares, ãs reservas lipídicas, para os excretores, para as zo
nas de biotransformação e finalmente para os receptores espe
cíficos; em não havendo uma ordem preferencial para esta dis
tribuição,haverá a possibilidade dos eventos ocorrerem todos ( 19]
simultaneamentev '.
Wilson T.W. e colaboradores* ', estudando a eliini
nação da gentamicina tritiada em pacientes normais e com fa
lhas renais severas, verificaram discrepancies entre as meia-
11
-vidas aparentes obtidas em pacientes normais (3,3h) e a média
das meia-vidas aparentes da gentamicina obtidas por outros pes
quisadores* * ' , justificaram esse fato da seguinte foTma:
em baixas concentrações plasmáticas existe uma grande parte de
gentaricina ligada as proteínas plasmáticas reduzindo portanto
a clarificação renal. Isto também explicaria a não adequação
do modelo de um só compartimento para explicar o comportamento
cinético da gentamicina tritiada. Outro fato de interesse, se
ria também a disparidade entre a velocidade de desaparecimento
do produto do plasma e a taxa de aparecimento na urina * .
K.üzker e colaboradores^ .estudando a contribuição
da gentamicina marcada com ^^c em estudos da imagem da função
renal em animais, verificaram que, embora a gentamicina seja
excretada rapidamente por filtração glomerular,a velocidade de
clarificação observada foi mais baixa do que 30 minutos apôs in
jeção endovenosa, demonstrando portanto a sua utilidade no diag
nóstico cintilográfico das falhas renais com respeito a filtra
ção glomerular e a reabsorção,sendo que a retenção razoavel_
mente longa nos rins facilitaria a imagem renal.
Existem vários trabalhos publicados que fazem o eí>
tudo da cinética da gentamicina em humanos, tendo como objeti
vo o estabelecimento do critério de dosagem da mesma entre pa
cientes normais e pacientes com função renal comprometida. Fo
ram obtidos valores para a meia-vida, volume de distribuiçãoe
a clarificação renal, estudando-se também a interferência da
idade, do peso das várias formas de administração da droga.Em
bora alguns autOTes admitam que a cinética da gentamicina tt
que caracterizada com o modelo de um só compartimento,existem
outros que admitem um decaimento bifasico na concentração pias íítf A7 1 7 XX XI ÂX ÍA CC CM
12
1.4. Farmacocinética
A Farmacocinética, segundo Wagner* tem como obje
tivo o estudo das velocidades de troca das concentrações das
drogas e de seus metabólitos nos fluídos biológicos, tecidos
e excretas, bem como também a resposta farmacolõgica e a cons
trução de modelos adequados para interpretação de tais dados.
0 estudo cinético de uma droga depende do tipo e da
forma como foi administradav '.
A construção de modelos em Farmacocinética supõe o
organismo dividido num sistema de compartimentos unidos entre
si no qual a droga vai ser distribuída após a sua administra
ção. 0 modelo construído deve representar o sistema eir> estru
tura e/ou comportamento de uma determinada droga baseado nos
dados disponíveis. Entende-se por : npartimento um grupo de
teci 'os com características fisiológicas e fisicoquímicas si.
milares.
A partir dos fundamentos dados em Farmacocinética
nos quais em qualquer momento deve haver relações de propor
cionalidade entre os componentes estudados, podemos definir
algumas constantes biológicas.
1. Volume de distribuição aparente* '
0 volume de distribuição aparente relaciona a. quan
tidade da droga no corpo com a concentração piasiática.
Em uma administração endovenosa, a droga devera dis>
13
tribuir-se en todos os tecidos, e quando er equilíbrio tere
mos a relação:
Vd • quantidade da droga no corpo
concentração plasmática
Esta relação se aplica àquelas drogas que são eliau
nadas do plasma lentamente.
Na prática, podemos calcular o volume de distribui
ção aparenta >tra uma droga administrada por via endovenosa,
por meio da seguinte relação:
Vd * Dose (administrada)
Co
onde Co é obtido através do gráfico logaTÍ ...nico da curva pias
mática em função do tempo; extrapolando-a para t = 0, nós te
remos Co.
0 volume de distribuição é uma constante ligada a
cada droga, é* dependente do fluxo sangüíneo nos diferentes te
cidos, do coeficiente de partição da droga nos sistemas orgâ
nicos (lipídeo/água) e da afinidade desta com as proteínas
plasmãticas.
2. Constante de velocidade (15)
As constantes de velocidade caracterizam as trocas
na concentração da droga num determinado compartimento; elas
representam a velocidade com que a mesma entra num comparH
mento, se distribui e ê eliminada resultando respectivamente
nas constantes de absorção, de distribuição e eliminação.
14
A constante K de velocidade de eliminação é* defini
da CORO :
K « ke • km • kp • ...
onde ke: constante de eliminaçio por excreção urinaria e bi
liar
kr.: constante de eliminação por biotransformação
kp: cnstante de eliminação por todos os processos de
remoção dos fármacos do organismo.
K tem unidades de tempo recíproco (h ou min" )
A propriedade aditiva das constantes de velocidade
permitem o cálculo das constantes desconhecidas e a fração to
tal da droga removida do organismo por uma via específica.
3. Meia-vida biológica1 '
A meia-vida biológica representa o tempo necessário
para que a quantidade da droga presente no organismo se redu
za a metade.
i/2 -J7~
4. Depuração total***'
A depuração total de uma droga é* o resultado da eli
minação desta por todos os mecanismos eliminatórios do orga
15
nismo: excreção renal, hepática e t c l J ' . Podemos relacioná-la
com a constante de depuração total (b) por meio da seguinte
expressão:
D* = b x Vd
D — depuração total da droga no organismo
b — constante de depuração tota l
Vd — volume de distribuição aparente
Análise compartimental^ ' '
A análise dos valores experimentais do estudo ciné
t i co de uma droga requer um modelo que é análogo a um sistema
de compartimentos no qual ocorre a distr ibuição àa droga.
Um sistema está no estado estacionãrio se a quanti
dade da droga num tempo permanece constante e i s to , impl ica ne
cessariamente na manutenção das velocidades de absorção e eli.
minação em valores constantes.
Muitos t ipos de modelos compartimentais para estu
dos dinâmicos da droga são descritos na l i t era tura , ut i l i zan
do-se sistemas representativos do tipo mamilar e quaternário
entre outros. Tanto o sistema quaternário como o mamilar, são
os mais ut i l izados para representar sistemas b io lóg icos .
No sistema quaternário os compartimentos estão aj»
sociados em cadeia, enquanto que no sistema mamilar todos os
compartimentos estão disponíveis para a troca com o comparti
mento central. A compartimentalização da droga pode ser re
presentada por uma ou mais exponenciais.
16
Na prática para se construir um modelo, teremos que
analisar primeiramente os dados experimentais, em seguida des
creveremos o sistema de equações diferenciais que se ajustam
aos dados, devendo haver tantas exponenciais quantos forem o
número de compartimentos. A resolução do sistema de equações
diferenciais deverá ser feita por computadores. Um dos progra
mas de grande utilização em análise compartimental é o progra
f Oi
ma SAAM de Mones e Bermanv . Resolvido o sistema de equa
ções diferenciais comparam-se os dados numéricos com os dados
obtidos experimentalmente: em havendo concordância, teremos o
modelo que simula o sistema em estudo.
Modelo aberto de dois compartimentos^ '
0 sistema aberto constando de dois compartimentos,
constitui-se no modelo mais comum, aplicado â maioria de estu
dos cinéticos de drogas; nesse modelo supõe-se o organismo
constituído por um compartimento central, e outro periférico.
Esquematicamente temos:
Q = compartimento central
P - compartimento periférico
E = eliminação
kio= constante de eliminação
ki2s constante de transferên
cia de Q para P
k2i" constante de transferên
cia de P para Q
A droga ao chegar no compartimento central Q se dis
administra ção endo^ ©-^0
*2lU
17
tribui para um compartimento periférico P de uma forma rever
sível com constantes de transferência ki? e ^21 resPectivame!!
te, e é eliminada do compartimento central para o exterior
com uma constante de eliminação kin*
Quando um medicamento é* administrado por via endo
venosa teremos em um primeiro estágio que supor a distribui
ção do produto de maneira uniforme no compartimento central,
entendendo-se este como sendo o sangue; e que a quantidade de
fármaco no compartimento periférico no momento da administra
ção é zero, sendo a eliminação também igual a zero.
Em um sistema de dois compartimentos teremos um de
caimento biexponencial representado pela seguinte equação:
C(t) = A e"at + B e"Bt (I)
Representando-se graficamente o logarítmo de C em
função do tempo (t), obteremos uma curva que será analisada
submetendo-a ao método de decomposição (peeling).
A e B são respectivamente os valores das duas compo
nentes da curva biexponencial, no tempo t • 0, obtidas experi
mentalmente.
o e 0 são respectivamente os coeficientes angulares
das duas componentes da curva biexponencial.
Temos então que A e B, o e g são valores que pode
rão ser calculados a partir da curva representativa do loga
ritmo da concentração plasmãtica em função do tempo (t).
As constantes de transferência ki? c k?!' e a c o nl
18
tante de eliminação k.Q podem ser definidas a partir das se
guintes relações:
a * B = k12 • k21 • k1Q (II)
o . $ = k n . k10 (III)
Integrando-se a equação (I), em função do tempo te
remes:
C dt = -A. • -L- « _Ç°_ = D o s e (IV) o a k10 vd
onde Co • concentração inicial do fãrmaco
Vd = volume de distribuição aparente da droga
Dose* quantidade do fãrmaco injetada
de onde teremos:
k = ° • B 1 0 V
K21
k 1 2 * a + e - k21 - k10
, = AB • Ba _ aB *21 " A + B k 1 0
1.5. Objetivo do Trabalho
Tendo em vista a importância da aplicação da genta
micina no combate às infecçoes provocadas por bactérias Gram-
19
-negativas, infecções essas, principalmente renais e os seus
efeitos colaterais, entre eles o mais grave a ototoxicidez,
nos propusemos a realização do seguinte projeto:
1. Preparação da gentamicina marcada com o isótopo de fácil
*• 99in obtenção no IPEN e de interesse em Radiofarmacia: Tc.
Otimização das condições de marcação do sulfato de
99m gentamicina marcada com Tc: estudo da variação da massa
do sulfato de gentamicina; estudo da variação do pH final de
marcação; estudo da massa de redutor e estudo da variação do
tempo de reação.
2. Estudos químicos.
Algumas contribuições no estudo da estrutura quími.
ca da complexaçao do sulfato de gentamicina com a utilização
do perrenato de amônio, dadas às características semelhantes
do Rênio com o Tecnécio.
3. Estudos biológicos.
a) Realização de estudos da distribuição biológica do QQTT)
sulfato de gentamicina marcado com Tc em ratos.
b) Proposição de um modelo cinético da atuação do sulfa
to de rentamicina marcado com Tc.
II. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAIS E MÉTODOS
II.1. Materiais
II.1.1. Reagentes
Sulfato de gentamicina: Signa Chemical Company, EUA
Perrenato de amônio p.a.: Merck, Alemanha
Cloreto estanoso bihidratado p.a.: Merck, Alemanha
Dimetilglioxima p.a.: Merck, Alemanha
Uretana p.a.: Merck, Alemanha
"Liquemine": 5000 UI/ml de heparina: Roche, Brasil
Álcool etílico p.a.: Merck, Alemanha
Ácido clorídrico d * 1,19 p.a.: Merck, Alemanha
Cloreto de sódio 0,91 - solução estéril e apirogenica: Droga
sil. Brasil
Éter etílico p.a.: Merck, Alemanha
Metiletilcetona p.a.: Cario Erba, Itália
Pertecnetato de sódio, Gerador 99Mo-99mTc: IPEN-CNEN/SP, Bra
sil
Papel cromatográfico Whatman n* 3 MM: W 6 R Balston Ltda, In
glaterra
21
"Sephadex" G.10-120, partícula 40-120 u: Sigma, EUA
Filtro millipore 0,2 ym: Gelman, EUA
11.1.2. Material Biológico
Animal utilizado: "Rattus norvegicus albinus" H
nhagem Wis tar, machos, pesando 275 +_ 25 g. Os animais recebe
ram durante todos os experimentos, ração comercial e água "ad
libitum".
11.1.3. Equipamentos
Contadores de radioatividade:
Contador gama de poço coin cristal de Nal(Tl) de 3 polegadas,
Nuclear Chicago, EUA
Curietest: Siemens, Alemanha
Contador com cristal Nal(Tl): Abbot, EUA
Aparelho contador de corpo inteiro comportando um cristal de
Nal(Tl), 8" x 4": Harshav Chemical Company, EUA
Aparelho para analise eletientar: Perkin Elmer-240, EUA; (Ins
tituto de Química - USP)
Centrífuga: "Sorval" GLC-1, EUA
Espectrômetro infravermelho: Infrared FouTier FT-1750 Perkin
Elmer, EUA; (Instituto de Química - USP)
Espectrômetro de ressonância nuclear magnética: Varian, mode
Io T-60-A, EUA; (Instituto de Química - USP)
22
Liofilizador: The Virtis Company Gardiner - N.Y. 12525, EUA
Separador de frações: LBK 2070 URTRORAC II - Suécia
Bomba: LBK Varioperpex II, Pump 2120, LBK Produkter AB
S-16125 Bromma 1, Suécia.
Gaiola metabólica para a coleta das fezes e urinas elimina
das, de acordo com o modelo idealizado por Lucas e colaborado
res(70>.
II.2. Métodos
II.2.1. Técnica de Marcação e Otimização das Condições de
— 99m Marcação do Sulfato de Gentamicina com Tc
A metodologia empregada na marcação do sulfato de
99m gentamicina com Tc baseou-se no trabalho de Kutlan e cola
boradores^ , tendo sido otimizado e padronizado por nós.
Uma solução de 1 ml de pertecnetato de sódio
(Na TcO,) , foi adicionada em um frasco tipo penicilina, con
tendo 10 mg de sulfato de gentamicina dissolvidos em 1 ml de
água destilada; em seguida adicionaram-se 0,5 ml de solução
de cloreto estanoso 0,5 mg/ml em HC1 0,5N. 0 conteúdo do fras
co foi agitado, durante um minuto e deixado reagir por 30 mi_
nutos ã temperatura ambiente, perfazendo-se um volume de rea
ção de 2,5 ml e um pH final de 1,7.
0 rendimento de marcação foi calculado por meio de
análise cromatográfica, sistema ascendente, em papel Khatman
n9 3 MM e con.o solventes, solução de NaCl 0,91 e metiletílce
23
tona. Em C8da fita de papel de 25 x 1,5 cm foi semeada a solu
ção do produto marcado. As fitas após a corrida nos solventes,
foram cortadas em segmentos de 1 cm num total de 15 e as suas
atividades avaliadas em contador gama tipo poço >:om cristal
Nal(Tl) , Abbot.
0 Rf do produto marcado em solução salina é zero e
em metiletilcetona o Rf é 1.
11.2.2. Otimização das Condições de Marcação
— Estudaram-se os seguintes parâmetros: a) variação
da massa de sulfato de gentamicina; b) variação do pH final
+ 2 de marcação; c) variação da massa de redutor (Sn ); d) va
riação do tempo de reação.
11.2.3. Estudos Químicos
Tendo em vista a impossibilidade de serem efetuados
estudos químicas com o elemento Tc, procedemos a complexaçao
do sulfato de gentamicina com Re, devido ã semelhança do com
portamento químico entre os dois elementos* '.
A metodologia empregada foi semelhante a descrita
no item II.2.1, sendo entretanto introduzida algumas modifier
ções:
- em tubos de reação foram colocados 1 ml de solu
ção de NH^ReOj (5,7 mg/ml em solução fisiológica), e 0,5ml de
solução de cloreto estanoso (0,5 mg/ml HC1). A mistura foi
aquecida até* 50°C e apôs o resfriamento foi acrescentado lOmg
24
de solução de sulfato de gentamicina dissovidos em 1 ml de
água destilada. Agitou-se o tubo e deixou-se reagir por 30 nu
nutos. A solução foi percolada numa coluna de Shephadex G-10
(1,5 >: 23 cm), sendo eluída com solução de cloreto de sódio
0,9». Foram recolhidas amostras de 2,5 ml em 35 tubos, manti^
do um fluxo de 0,5 ml por minuto. Todos os tubos com os elua
tos foram submetidos ã reação de toque para se detectar a pre
sença de Re: reagindo-se a solução eluída com solução satuTa
dc< de dimetilglioxima em etanol e com solução de cloreto esta
f 34") noso 251 em HC1 10NV ' , observou-se uma coloração vermelha
alaranjada característica da presença de Re. Em seguida os tu
bos contendo Re foram liofilizados; a solução foi refeita com
0,5 ml de água destilada e recromatografada em coluna de Sepha
dex G-10, Tecolhendo-se novamente amostras em 35 tubos e ana
lisando-se qualitativamente a presença de Re; os tubos com
reações positivas foram novamente liofilizados e destinados a
análises físico-químicas utilizando-se dos seguintes métodos:
espectroscooia no infravermelho e ressonância nuclear magnéti^
ca.
Foi realizada também a análise elementar.
II.2.4. Estudos Biológicos
II.2.4.1. Distribuição biológica
Utilizaram-se 14 grupos de 6 ratos machos para p es
tudo de captação de sulfato de gentamicina marcada com ""Tc
pelos órgãos, músculo e para avaliação dos níveis plasmáticos.
25
Inicialmente os animais foram pesados e anestesia
dos cor uretana (100 mg/100 g peso). Prepararam-se amostras
com pH ajustado para valor 6,5 com solução fisiológica, con
tendo cada uma 0,075 ml da solução de gentamicina maTcada com
Tc i.4 mg/ml), com atividades específicas entre 216 e 516
pCi/mg: as respectivas doses foram injetadas na artéria dor
sal do penis de cada animal. Tomaram-se amostras de 2 ml de
sangue por punção cardíaca nos seguintes tempos: 3, 10,15,20,
30, 45. 60, 90 minutos e 2; 3; 4; 6; 16,20 e 24 horas. 0 san
gue foi coletado em frascos heparinizados com Liquemine, par
te foi destinado a leitura do hematõcrito. O plasma foi obti
do por centrifugação (2500 rotações por minuto durante meia
hora), a radioatividade contada, e o volume medido.
Após a coleta de sangue, os animais foram sacrifica
dos para a retirada dos seguintes órgãos: baço, coração,rins,
estômago, fígado, pulmão, intestino delgado, intestino gros
so, amostra do músculo da pata traseira e parte da cabeça (re
gião auricular).
Os materiais biológicos foram pesados e em seguida
contados em contador gama.
Todas as contagens foram efetuadas e calculadas em
relação a um padrão contendo exatamente a mesma dose injetada
nos animais. Manteve-se a mesma geometria e o tempo de conta
gem para todas as medidas.
26
11.2.4.2. Medidas do hematócrito Teal, volume sangüíneoe vo
lume plasmático*4^5)
0 hematócrito rela foi medido por meio da seguinte
formula:
Hematócrito real • Hematócrito lido no tubo x 0,91 x
0,96<65>
0 volume plasmático foi calculado por meio da seguin
te fórmula:
Volume plasmatic©: volema(ml)x(100-hematócrito r e a l ) ( 6 5 )
100
A volemia de cada rato foi determinado usando-se a
seguinte fórmula:
Volemia = Peso do animal x 0,0528^ 4 ^
II.2.4.3. Medidas de corpo inteiro
As medidas de corpo inteiro foram efetuadas em um
lote de 5 ratos machos, injetados endovenosamente na artéria
dorsal do pênis com 0,075 ml de solução de sulfato de gentaini
cina 99mTc (4 mg/ml), com atividade específica de 216 a 316
pCi/mg. Os animais foram mantidos individualmente durante um
período de 24 horas em gaiolas metabolicas e contados em con
tador de corpo inteiTO para avaliação da atividade nos seguin
tes tempos: 1; 3; 4; 6,30 e 24 hs. A cada medida nos tempos
27
previstos foi efetuada também a contagem de um padrão, consis
tindo em uma simulação representada por um frasco de volume e
forma cilíndrica aproximadamente equivalente a um rato de 275g.
preenchido com água e contendo a mesma dose previamente inje
tada nos animais. Foi mantida também a mesma geometria entre
a gaiola do animal e o colimador do contador de corpo inteiro
para animais e padrão.
II.2.4.4. Coleta de fezes e urinas
Foram recolhidas urinas e fezes dos ratos mantidos
em gaiolas metabólicas e injetados endovenosamente com sulfa
to de gentamicina ""Tc como em II.2.4.3. Recolheram-se uri
nas após 3, 5, 24 e 48 horas da aplicação de sulfato de genta
mi eina mTc. Foram medidos os volumes de urina e contados em
um contador gama.
As fezes foram recolhidas das gaiolas metabólicas
nos seguintes tempos: 24 e 48 horas, levadas a uma estufa a
50°C para secar; tendo sido então trituradas pesadas e leva
das ao contador tipo poço para a medida de radioatividade. To
das essas medidas foram realizadas e calculadas em relação a
um padrão, que continha a mesma dose injetada nos animais.
As contagens obedeceram aos critérios de igualdade
de geometria para o padrão e amostras.
II.2.5. Programas de Computador Empregados nos Cálculos
0 estudo estatístico dos dados referentes â distri
28
buiçãe biológica foi realizado no computador IBM/4541 util_j
zando-se o programa SAS (Statistical Analysis System)* '.
A determinação do volume plasuático aparente de dis
tribuição foi realizada utilizando-se os dados experimentais
das concentrações plasmáticas expressos em porcentagem de ra
dioatividade por mililitro. Estes dados foram ajustados nume
ricamente, empregando-se o método iterative Gauss-Kevton de
mínimos quadrados não linear disponível no programa SAS (Sta
tistical Analysis System)* '.
A meia-vida biológica foi calculada utilizando-se
os dados obtidos nas medidas de corpo inteiro, expressos em
porcentagem de radioatividade. Estes dados foram ajustados nu
mericamente, empregando-se o método dos mínimos quadrados li_
near disponível no programa SAS (Statistical Analysis System/52!
Na análise compartimental, a determinação numérica
dos coeficientes de transferência foi realizada a partir dos
pontos experimentais da curva plasmatics era porcentagem de do
se utilizando-se o código SAAM2S, (Simulation Analysis and
Modeling), desenvolvido por M.Berman e M.F.Keiss1 ' '. Obtidos
os coeficientes de transferência foram substituídos no siste
ma de equações diferenciais e a solução foi obtida com o auxí
lio do sistema CSMP, (Continous System Modeling Prograir) * ' .
As curvas foram construídas com o SAS/GRAPH, e fo
ram traçadas numa unidade gráfica TK4662.
III. RESULTADOS
1II.1. Estudo das Condições de Marcação do Sulfato de Genta-
99m micina com Tc
Tabela III.1.1. - Variação da Massa de Sulfato de Gentamic^
na
Massa de Sulfato
de Gentamicina
(mg)
vol. SnCl2 (ml)
(0,5 mg/ml)
Atividade 99mTc04 (mCi)
(lmCi=3,7xl07Bq)
pH final % Marcação
x 6
OS 0,5 1 1,7 96,0 2,5
10 0,5 1 1,7 95,5 2,4
15 0,5 1 1,7 95,4 2,3
20 0,5 1 1,7 96,8 1,0
25 0,5 1 1,7 95,5 1,9
Tabela III.1.2. - Variação do pH Final de Marcação
Massa de Sulfato
de Gentamicina
(mg)
10
10
10
10
10
10
vol.
(0,5
SnCl2
mg/ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
(ml) Atividade 99mTc04 cmCi)
(lmCi=3,7xl07Bq)
pH final
1,3
1,7
2,1
4,0
4,3
4,5
1 Marcação
x 6
80,2 5,2
96,4 3,8
48,5 4,8
32,5 1,0
39,1 2,9
25,0 1,2
30
Tabela III.1.3. Variação da Massa do Redutor Sn 2-
Massa de Sulfato
de Gentamicina
T.g)
10
10
10
10
pH Final
1.7
1,7
1,7
1,7
Atividade 99nTcC4 (mCi)
(lmCi=3,7xlO/Bq)
1
1
1
1
Massa de Redu
tor SnCl-, (mg)
(0,5 mg/ml)
0 ,063
0,125
0,250
0,375
i Marcação
y í
"5,6 5,5
61,9 0,4
95,9 2,5
63,1 5,5
Tabela II1.1.4. - Variação do Tempo de Reação
Massa de Sulfato de Genta -iicina (mg)
10
10
10
10
pH Final
Atividade 99mTc04 (mCi)
(lmCi=3,7xl07Bq)
vol. SnCl, (ml) L
(0,5 mg/ml)
1,7 1 0 ,5
1,7 1 0 ,5
1,7 1 0 ,5
1,7 1 0 ,5
Tempo de
Reação
(min.)
15
30
60
90
% Marcação
X 6
90,5 7,8
9",6 1,9
96,6 0,6
99,0 0,3
III.2. Estudos Químicos
III.2.1. Espectros de absorção na Tegião do infraverrelho
Os espectros de absorção no infravermelho do sulfj»
to de gentamicina não complexado e complexado com Re, foram
obtidos nos limites de comprimento de onda entre 500 e 4.000
31
cm . As amostras foram preparadas na foTma de pastilhas de
brometo de potássio, na concentração de 0,011.
As figuras III.2.1 e III.2.2 apresentam os espe£
tros infravermelho do sulfato de gentamicina antes e após a
complexação com Re, respectivamente.
III.2.2. Espectrometria de ressonância nuclear magnética pro-
tônica
Os espectros de ressonância nuclear magnética do
sulfato Je gentamicina não complexado e do complexado com Re
foram obtidos em aparelho com freqüência de 60 MHz, sendo uti_
lizado como solvente a D2O.
As figuras III.2.3 e III.2.4 apresentam os espec
tros de ressonância nuclear magnética protònica do sulfato de
gentamicina não complexado e do complexado com Re respectiva
mente.
III.2.5. Análise elementar
Determinou-se a porcentagem de C, H e N do sulfato
de gentamicina complexado com Re, sendo que os valores expedi
mentais obtidos e calculados para estes elementos foram:
C 16,74* H 3,75* N 7,16%
Os valores teóricos para este composto são:
m 3598
Figura III.2.1. - Espectro de Absorção no Infravermelho do Sulfato de Gentatnicina o*
teoe.ee T
niN.ee i 4808 3588 3000 2500 1500 OH w9
Figura III.2.2. - Espectro de Absorção no Infravermelho do Sulfato de Gentamicina
Comnlexado com Re.
U ^ A J J C ^ ^ < t I J. I I I
* ll I ll -ta-*i * U- + Figura III.2.3. - Espectro de Ressonância Nuclear Magnética Protônica do Sulfato de Genta-
micina.
w
~w Si "SB «B -, w ; vr
Figura III.2.4. - Espectro de Ressonância Nuclear Magnética Protonica do Sulfato de Genta-
micina Comnlexado com Re.
36
C 15,641 H 3,711 N 8,211
III.3. Estudos Biológicos
III.3.1. Distribuição biológica do sulfato de gentamicina
marcado com Tc após administração por via endo-
venosa
A captação de sulfato de gentamicina mTc por gr£
ma de órgãos e tecido é* apresentada na tabela II 1.3.5.
III.3.2. Níveis sangüíneos e plasmáticos do sulfato de gen-
tamicina marcado com Tc após injeção endovenosa
Nas tabelas III.3.16 e III.3.17 são apresentadas as
porcentagens de radioatividade no sangue e plasma por miliH
tro, eir ratos Kistar respectivamente, em relação a um padrão.
Para o cálculo da porcentagem de radioatividade no
sangue e no plasma total foi necessário a determinação da vo
lemia e do volume plasmãtico de cada animal respectivamente.
III.3.3. Níveis plasmáticos de sulfato de gentamicina 99inTc
após uma administração endovenosa
Os dados experimentais do plasma expressos en por
centagen de dose por mililitro, que foram ajustados numérica
Í521 mente pelo programa SASV \ correspondem a uma expressão
Tabela III.3.S. - Porcentagea de Radioatividade por g de Órgãos e Tecidos de Ratos Nistar: Via Endovenosa-Sulfato de Gentaiaicina 9 t aTc: Volutt Injetado: 0,075 «d. Atividade Especifica: 216-316 uCi/»l
Teapo (aòn)
OS
10
IS
20
30
45
60
90
120
180
240
360
980
1440
BAÇO
X
0.31
0.24
0.3S
0.36
0.24
0 .23
0.26
0.36
0.23
0.36
0.47
o.ss 0.13
0.05
4
0.01
0 .03
0.01
0 .03
0.03
0.01
0 .03
0.04
0.02
0.04
0.02
0 ,03
0 ,03
0.01
CORAÇÃO
X
0.27
0.22
0.37
0,28
0,29
0 ,23
0,24
0.26
0.16
0.18
0.17
0,23
0.04
0.02
i
0.03
0.01
0,02
0,01
0,02
0,03
0,03
0,02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.00
0.01
RINS
X
0,48
0.36
2.S4
1.7S
2,03
2.50
4.00
4.S5
4.9S
6.96
6,S3
4,66
2.34
1,65
s
0,02
0.02
0.27
0.13
0.61
0.34
0.41
0.22
0.80
0,48
0,62
0,52
0,16
0,14
ESTÔMAGO
X
0.33
0.42
0.32
0.33
0,62
0.61
1.05
1.09
1.30
0,38
0,35
0,29
0,24
0.24
S
0.03
0.02
0,02
0.02
0.62
0,03
0.16
0.01
0.02
0,02
0,05
0,03
0,04
0,01
PUUtfO
X
0.50
0,44
0.50
0,46
0.43
0,38
0.45
0.38
0,34
0,43
0,44
0,36
0.10
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0,02
0,03
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0,01
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INTESTINO GROSSO
Ml
0,35
0,46
0,28
0,11
0,23
0,29
0,36
0,42
0,28
0,31
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0,00
INTESTINO DELGADO
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0,30
0,56
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MOSCULO
X
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0,11
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CABEÇA
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0,10
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0,37
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Tabela 111 .5 .8 . - RIM - Porcentagem de Dose/Grama
Tempo
(min)
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60
90
120
180
240
360
9 80
1440
Média
0,48
0,36
2,54
1,75
2,03
2,50
4,00
4,55
4,95
6,96
6,53
4,66
2,34
1,65
Desvio
Padrão
0,02
0,02
0,27
0,13
0,61
0,34
0,41
0,22
0,80
0,48
0,62
0,52
0,16
0,14
Valor
Máximo
0,49
0,38
2,73
1,88
2,53
2,87
4,48
4,79
5,83
7,44
6,97
5,03
2,46
1,75
Valor
Mínimo
0,45
0,34
2,23
1,62
1,35
2,20
3,75
4,36
4,26
6,49
6,09
4,29
2,23
1,55
Variância
5.55E-04
4,53E-04
7.45E-02
1.69E-02
3,71E-01
1.16E-01
1.71E-01
4.81E-02
6,43E-01
2.26E-01
3.87E-01
2.74E-01
2.65E-02
2.00E-02
Tabela I I 1 . 3 . 9 . - ESTÔMAGO - Porcentagem de Dose/Grama
Tempo
(min)
5
10
15
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30
45
60
90
120
180
240
360
9 80
1440
Média
0,33
0,42
0,32
0,33
0,62
0,61
1,05
1,09
1,30
0,38
0,35
0,29
0,24
0,24
Desvio
Padrão
0,03
0,02
0,02
0,02
0,05
0,03
0,16
0,01
0,02
0,02
0,05
0,03
0,04
0,01
Valor
Máximo
0,36
0,44
0,35
0,35
0,66
0,63
1,23
1,10
1,32
0,40
0,40
0,31
0,28
0,24
Valor
Mínimo
0,31
0,40
0,31
0,32
0,56
0,58
0,96
1,09
1,28
0,37
0,31
0,25
0,20
0,23
Variância
7,00E-04
4.00E-04
5,33E-04
3.00E-04
2.63E-03
6.33E-04
2.43E-02
3.33E-05
4.00E-04
2.35E-04
2,03E-03
1.03E-03
1.63E-03
3.33E-05
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60
90
120
180
240
360
980
1440
i d u c i d l j i > J > I ' r W & ^ ^ J f t ^ W ^ w a " w ^ «* v — _.w — _.
por ml Obtida Experimentalmente de Ratos
Kistar: Injeção Endovenosa de Sulfato de
Gentamicina 99mTc
Tempo (Minuto) % Radioatividade
ml
03
10
15
20
30
45
60
90
120
180
240
360
980
1440
9,55
3 ,63
1,40
0 ,98
0,82
0 ,73
0 ,63
0 ,61
0,56
0,46
0,42
0,30
0 ,07
0,02
+
+
+
+
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0,90
0 ,33
0,20
0 ,13
0 ,05
0,04
0,06
0,06
0,04
0,05
0,09
0,07
5 x IO"3
7 x IO"3
Tabela III.3.18. - Volemia
Volemia (ml) = Peso do Rato x 0,0528 ( 4)
Tempo (Minuto) Volemia (ml)
x 6(média de 6 ratos)
03
05
10
15
20
30
45
60
90
120
180
240
360
980
1440
14,50
14,50
14,47
14,27
15,00
15,03
14,71
13,59
14,37
14,34
14,22
14,29
14,34
13,74
14,80
+
+
+
+
+
+
+
•
+
+
+
+
+
+
+
0,50
0 ,60
0 ,74
0 ,81
0,77
0 ,88
0 ,60
0,27
0,24
0 ,18
0,54
0 ,80
0,85
0,22
0 ,67
f .CMi^M, K*,t.f.N»i tjt tNtRGIA NUCL£Afl/.Sf» - rftrt
Tabela lll.ó.iv. volume rjasjiittL.n.u
Volume Plasma-ticoünl) = Volemia x (100-H r) 100
(65)
Tempo (Minuto) Volume Plasmatico (ml)
x 6 (média de 6 ratos)
03
05
10
15
20
30
45
60
90
120
180
240
360
980
1440
6,80
6,44
6,73
7,26
7,93
7,39
7,06
6,48
6,36
7,29
6,80
6,92
7,46
6,75
6 ,86
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0,18
0 ,60
0 ,30
0 ,59
0 ,79
0,36
0 ,29
0 ,16
0,22
0,69
0 ,37
0 ,63
0,65
0,26
0,32
laDela l l l . ò . i v . - rur«.enid^cm uc nouiva^. *.~..~~ ..__ _.
e Fezes de Ratos Wistar, Obtida Experimen
talmente, Apôs Injeção Endovenosa de Sul
fato de Gentamicina 99m Tc
Teirpo
(horas)
3 , CO
5,00
24,00
48,00
Urina To
tal
x 5
6,66 + 2,20
0,31 + 0,14
22,13+ 6,78
2,23 + 0,99
Cumula
tivo
6,66
6,97
29,10
31,33
Urina/ml
x 6
3,25 • 1,40
7,88 • 5,44
4,23 + 2,74
0,61 + 0,20
Fezes To
tais
X 6
-
-
26,67 +4,33
5,29 + 1,92
Cumula
tivo
-
-
26,67
31,96
Fezes/g
x «
-
-
6,91 • 1,35
1,86 • 0,90
Tabela III.3.21 Porcentagem de Radioatividade no Corpo In
teiro de Ratos Wistar Obtida Experimenta^
mente Após Injeção Endovenosa de Sulfato QQtn
de Gentamicina Tc
Tempo (Horas) % de Radioatividade
x 6
1,00
3,00
4,00
6,30
22,50
24,00
75,87 70,36
54,95
50,20
29,39
25,93
+
+
+
•
•
+
5,16 1,27
0 ,93
2,27
2,35
1,63
WKTM* fcv « * v » v r «k ^ v n
P (t) = Aj e ' V • A2 e-h2l ( I )
Análise de Variância
Fonte de Variação
Modelo
Resíduo
Total (não corrigido)
Total (corrigido)
G.L
4
10
14
13
Soma de Quadrados Quadrado Médio
107,8780 26,9695
0,2930 0,0293
108,1710
79,3705
Estimativa dos Parâmetros
Parâmetro
Al
A 2
bl
°?
Valor
Estimado
14,7821
0,6866
0,1725
0,0021
Desvio
Padrão
0,5044
0,1109
0,0095
0,0011
Intervalo de
Lim.Inferior
13,6583
0,4395
0,1514
- 0,0004
Confiança(95t)
Lim.Superior
15,9059
0,9337
0,1936
0,0046
Teiros então a seguinte curva ajustada pelos pontos experimen
tais:
P(t) = 14,7821 e"°*1725t + 0,6866 e"°'0021t (II)
No tempo t=0, a concentração inicial Co, apresenta os seguin
tes valores:
Co Aj • A2 * 14,7821 + 0,6866 = 15,4687*/ml
Cü!*.r,„í,o I»MI„W\M-«. b t tfthRülA NliCLtAH/ljC - -1
—-.,-.— •—•— •*->»• * «• f A « a ^ ~
mática do sulfato de gentamicina mTc
A partir da expressão (II), podemos calcular o T,,»
de cada exponencial da curva do plasma:
Temos então:
°'693 = 0,07 horas Tl/2
Tl/2
=
=
In^
b i
tn2
b2
0,1725
• ^ ^ - = 5,5 horas 0,01
111.5.5. Determinação do volume aparente de distribuição
De acordo com a definição, descrita em 1.4.1,temos:
Vd = D o s e
Co
Portanto, substituindo pelos valores encontrados:
Vd = - ü ^ = 6,4647 ml 15,4687
Vd = 6,4647 ml
111.5.6. Determinação da meia-vida biológica
Os dados experimentais do corpo inteiro expressos
•
em porcentagem oe aose iuram «ju>uuus uuncin.ant,uiv p«lv ,„«
todo dos mínimos quadrados linear de Gauss - Markov disponí
r 521 vel no SASV ' , com o seguinte modelo para o ajuste: ín A-bt
Análise de Variância
Fonte de
Variação
Modelo
Resíduo
Total(corr.)
G.L.
1
2
3
Soma dos
Quadrados
0,5849
0,0241
0,6090
Quadra
Médio
0,5849
0,0120
Quadrado Valor Prob>F
F.
48,580 0,200
2 Quadrado do coeficiente de correlação R = 0,9605
2 R e definido como o quociente entre a soma dos quadrados do
modelo e a do resíduo.
Estimativa dos Parâmetros
Parâmetro Valor Desvio
Estimado Padrão
t para HO Prob > |t|
Parâmetro * 0
znA
b
4,2560
0,0007
0,0773
0,0001
55,075
- 6,970
0,0003
0,0200
Na estimativa dos parâmetros foi aplicado o teste
t (Student); temos então que t para HO, parâmetro » 0, signji
fica o valor de t para o teste da hipótese nulidade do para
metro. Os valores apresentados na coluna Prob > |t| , signifi
dade que os parâmetros sejam diferentes de zero e portanto
são significativos para o modelo escolhido.
Temos então: T 1 / 2 = °'693
Tl/2 = ° > 6 9 5 - 990 min = 16,5 h 0,007
III.3.7. Determinação da depuração total
A depuração total é expressa considerando-se como
sendo o produto da constante de depuração total (b), pelo vo
lume de distribuição aparente Vd.
Dessa foram temos:
D1 = b x Vd
D1 = 0,0007 x 6,4647
D1 « 0,0045 ml/min.
n<
i 0
« i t 0
0 00 •0 0 0 0
100 M O roe 009 1000 1100 1190 1100 1400 10
TEMPO
NOTA» 10 OBS COMCIDENTCS
Figura I I I . 3 . 3 . - Medidas de r a d i o a t i vi dadc r>or m i l i l i t r o de plasma - Anál ise E s t a t í s t i
Valores p r e v i s t o s x Tempo (o —*• v a l o r e s s imulados: * —* v a l o r e s obs vados ) .
• • « T
O.S"
0 - t
0 . 1
o-o
A AA
-A- -AAA A
- o . i
• • . a
Ü - 0 . »
- © . « '
- • • • « I I I » I
o-o 04 IO «•» to mo n i i i • i • * • • > -
10.0
VALOR PREDITO
Figura III.3.6» - Medidas de radioatividade ror mililitro de plasma - Analise Estatística
Resíduos x Valores preditos
i 3 «J .>
4 V
4.1
4.1
4.0
9.0
0.0
».»
0.0
0.0
0.4
9 »
».r
100
Pigura I I I . 3 . 7 . -
«
o
100 100 400 000 000 V00 000 000 1000 1100 1100 1S00 1400 I K
TEMPO (mio.)
Medidas de radioatividade de corpo inteiro (\ de dose) - Análise Esta
tística
Valores preditos x Tempo
o
2
©.It» t
e.iee
0.0?»
OOIO
ooa»
o.ooo
-o.oa»
•o.oto
- •o?»
•« .«00
V I » 4 1.4 ».» 14 ».? M I.» 4.0
VALOR MIOITO
4.1 i > i
4.1 4 1 4.4
Figura II1.3.8. - Medidas de radioatividade no corro inteiro
Resíduos x Valores preditos
Análise Estatística
n v w i v *.«••»#• • v».
Apôs uma Injeçio Endovenosa e». Ratos Wistar
III.4.1. Modelo bi-coapartimental
Os dados da concentração plasmática em função do
tempo ajustaram-se a uma soma de duas exponenciais. Temos por
(30) tanto, um modelo aberto de dois coapartimentos
zados na figura II1.4.9.
esquema ti.
*o compartimento in
travascular
compartimento ex
travascular
saída
Figura III.4.9. - Esquema de Modelo Aberto de Dois Coirparti
mentos.
A determinação das constantes de transferência kj?'
k21 e da constante de eliminação k,Q, foi realizada empregan
do-se o código SAAM2S (9)
Temos então:
-1, k12 - 0,1225 • 0,0068 (min *)
21 » 0,0113 • 0,0007 (min"1)
k1Q - 0,0382 • 0,0010 (min-1)
Na tabela III.4.22 é apresentada a simulação de um
moaeio Di-coniparunen iai uuiaiuc xntu m m u w ^ , ,_»,••• «,.£,.»«, v«%.
de valores a cada 10 minutos.
Na figura III.4.10 temos o gráfico onde estão regis
tradas as seguintes curvas:
P,(t) versus t
P2(t) versus t
curva atividade plasmãtica versus tempo
curva atividade extravascular versus tempo
S(t) versus t - curva de excreção versus tempo
CI(t) versus t curva de corpo inteiro versus tempo
III.4.2. Modelo bi-compartimental com um compartimento de
retenção
0 modelo com dois compartimentos intravascular e ex
travascular (1 e 2) e um compartimento de retenção 3 está e£>
quematizado na figura III.4.11.
dministração osa an i s t r a
mdoven
10
1
2
3
1 3
K 1 0 '
compartimento in t r avascu la r
compartimento ex t ravascular
compartimento de retenção
constante de t rans fe rênc ia da droga para um compartl mento de re tenção(durante a observação do experimen to) constante de eliminação para o e x t e r i o r
Figura I I I . 4 . 1 1 . - Modelo de 2 Compartimentos e Um de Retenção
sentada na figura III.4.9 do compartimento intravascular foi
sub-dividida em duas componentes:
k10 K10 13
Para ca lcu lar a cons tante k , 0 foram u t i l i z a d o s os
dados experimentais do plasma e os das excreções t o t a i s .
Os dados r e fe ren te s às excreções t o t a i s foTam calcu
lados a p a r t i r dos dados do corpo i n t e i r o , ou sejam:
Excreção t o t a l = 100 - corpo i n t e i r o
Supondo-se o compartimento 1, como precusor d i r e t o
das excreções , tem-se o seguin te modelo:
(Pi)
ou s e i a :
(S)
d S d t
" k10 P l ( t ) c o m sCt:=0) - 0 (D
Integrando-se a equação anterior (I) dos instantes
t»0 ao instante t * tj, tem-se:
;(tl> = kÍo Jo P l ( ° dt (II)
sabe-se que: Pj(t) = A^ e~ 1* + A2 e 2*
segue-se que
1 A, e-^l A7 e ' ^ l p (t) dt = - ^ • -i (III)
bl b2
substituindo-se em (II), tem-se:
S(tx) k10 (t=tl^ =
M i l A.M-A-^tl' A^l-e - 0! 1!) A2(l
bl b2
Substituindo-se para os valores numéricos conheci
dos, obtem-se um £j 0 - 0,0307 + 0,0026 (min-1).
Utilizando-se o "Continous System Modeling Pro
gram" * • , foram feitas diversas simulações e verificou-se,
comparando-as com a curva de corpo inteiro e de excreções,que
* -1
o melhor valor para o k,« seria igual a 0,0285 min , valor
este que se encontra dentro do intervalo do desvio padrão re
gistrado.
Chegando-se por tanto aos no ros c o e f i c i e n t e s de trans
ferência temos:
60
k12 - 0,1225 (min-1)
k21 * 0,0113 (mir."1)
k10 - 0,0285 (min-1)
k13 = (0,0582-0,0285) = 0,0097 (min"1)
Na tabela 111.4.23 é" apresentada a simulação do mo
delo compartimental com um compartimento de retenção durante
1440 n.inutos, com dados registrados a cada 10 minutos.
Na figura 111.4.12 apresentamos um gráfico onde es
tão construídas as seguintes curvas:
P,(t) versus t: curva atividade plasmática versus tempo
P2(t) versus t: curva atividade extravascular versus tempo
S (t) versus t: curva excreção versus tempo
CI(t) versus t: curva corpo inteiro versus tempo
P,(t) versus t: curva compartimento retenção versus tempo.
'I ill O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
m ~<t> < o o o < • • o m B u m
i»"» • « n o < >r» 9 r» ^ « i
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Tabela I I I . 4 . 2 2 . - Simulação de um modelo bi-compartiirental
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85Z iiúúiiiiiii^iiiitttiiiii^iiziiiiii^^*^^^^^^fc
O t f l _ o o o o o o a a o o o e o e o o o o e o a e o o e o e o e o o o o o e o a o a a o o e o o o o o o « >
m o i » « O ^ I O I A E 2 ° I ^ - V o o r V i . V r : ; <*m«tOTa>a>«i>inr«i<iNf*^^^oooo»««»««a>aiaa)a)r'»(*f»f»i '»««) • w)
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M O O
i « u w e * g a u i n * e i u a u i < j a « i i e e e e a a < i » * u e u t d g t o o o o õ o o o o o o o Õ o o o Õ S o o o o o o o o o o o o o o o
« « • • % • « « at • •» •» tai «a •>«» w • t» «a 4>*<4iat<a«ta»^t» o «C»
SSSSSSSS S S l
s
MODELO BI-COMPARTIMENTAL
P O R C E N T A 6 E H
P E
D O S £
90-8 0 -
7a: 6 0 -
. ^ '
H 111 i i i u | n 1111 u 1111111 n 1111111 n 11111111111111 u i H n i i i i i i i | i i i • • • • • •
0 200 400 600 800 1000
TEMPO CMIN)
1200 1400 16
CURVA AT. P. SIMULADA EXCR. SIMULADA
B t t f l A T . P . OBSERVADA * * * EXCR. OBSERVADA
AT. EX. SIMULADA C. I . SIMULADO
• • • C. I . OBSERVADO
•« a» O O O O O O O O O O O © O O O O O O O O O O O O O O O O O O ^ O C O O O O O O O O O O O O O O i9 s
as 3 St 83S S333S8333383383£382g3333S?S2SS?332S32833?8 O » « » » o •» í<« «rt »• •» *»<«i • tf» tf» tf» irt tf» »»•» r» o» >• tf» «•» » - o *» r* o» * c « o » t f i « " ( « m o * o> o » * « » 9
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Tabela II1.4 .23. - Simulação de um modelo comp rtimental com
um de retenção - Programa CSMP
MODELO COMPARTIMENTAL COM UM DE RETENÇ4C
I | I I I II I I I I | I I II I I I I I I'll I I I I I I I | | II I I I I I I |'l I I'I II I I I'l'l II I II II I | II I I I I I I I |
0 200 400 600 000 1000
TEMPO CMIhD
I 1400
CURVA AT. P. SIMULADA RETEN. SIMULADA C . I . SIMULADO
• • • C. I . OBSERVADO
AT. EX. SIMULADA EXCR. SIMULADA
n B n AT. p. OBSERVADA * * * EXCR. OBSERVADA
1600
AT. P. ; ATIVIDADE PLASMATICA AT. EX.> ATIVIDADE EXTRA VASCULAR RETEN.: RETENÇÃO EXCR.* EXCREÇXO C. I .» CORPO INTEIRO
IV. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
DISCUSSÃO
IV. 1. Estudo das Condições de Marcação do Sulfato de Gentamici
na com "Tc.
Analisando-se os resultados obtidos após estudo das
99m condições de marcação do sulfato de gentamicina com Tc, ob
servou-se que:
- não houve variação apreciável na porcentagem de
marcação, para o aumento da massa do sulfato de
gentamicina (Tabela III.1.1)
para um pH final de valor 1,7 obtivemos a melhor
porcentagem de marcação (Tabela II1.1.2)
• para uma massa de redutor de 0,25 mg de cloreto
estanoso obtivemos a mais alta porcentagem de mar
cação (Tabela III.1.3)
- não há variação sensível na porcentagem de mar
cação com o aumento do tempo de reação, todas as
variações encontram-se dentro do erro estatísti
co (Tabela III.1.4).
As análises cromatogrãficas de sulfato de gentamio
na yymTc dentro das condições descritas com solventes utiliza
dos, apresentam Rf bem determinados o que nos permitiu reali
zar os cálculos de rendimentos do produto após cada marcação.
70
As melhores condições encontradas na marcação do
sulfato de gentamicina com *Tc foram:
massa de sulfato de gentamicina
pll final de marcação
massa de redutor SnCK^H^O
volume final de marcação
tempo de reação
10 mg
1.7
0.25 mg
2.5 ml
30 minutes
Dessa forma foi estabelecido um protocolo de marca
ção que foi aplicado a todas as marcações realizadas para o
estude biológico.
IV.2. Complexação com Re
A complexação de sulfato de gentamicina cor: Re, des
tinada à realização de estudos químicos, baseando-se na SÍBÚ
laridzds dos dois elementos, foi efetuada em pH mais ácido que
a complexação com o roTc; o pH esteve em torno do valor igual
a 0,5 e a complexação foi também auxiliada pelo aquecimento ã
50°C, condições essas observadas por Duatti e colaborado
res (24) em seus trabalhos de complexação com Re.
Caracterização do complexo gentamicina-Re
1. Análise Elementar
Pela análise elementaT de C, H, N, após cálculos
pertinentes conclui-se em uma primeira aproximação de carac
ter semi-quantitativo que, a composição química mais provável
71
para o complexo em estudo seria: para cada molécula de gentíi
micina teríamos o equivalente a quatro moléculas de perrenato
de amênio.
2. Espectros de Absorção no Infravermelho
Analisando-se os espectros de absorção no infraver
melho do composto não complexado e após a complexação com Re,
observa-se uma banda em 3400 cm" que indica vibrações de e^
tiramento O-H e N-H, que embora apresentando um pequeno deslo
camento no espectro do produto complexado com Re, elas estão
sobrepostas, dificultando portanto, uma proposição bem defini
da, mas que indicam alterações nessa região.
A banda de 1630 cm" que corresponde a vibração de d£
formação N-H do composto não complexado, sofre um deslocamen
to para 1617 cm" no complexado com Re, com fortes indícios de
que este deslocamento iria indicar o envolvimento do grupamen
to NH., na complexação.
A banda de 1057 cm" que corresponde ã vibração de
estíramento C-0 no composto não complexado sofre um desloca
mento para 1045 cm no complexado com Re, permitindo-nos di
zer que provavelmente esta ligação está envolvida também na
complexação.
3. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear
Analisando-se o espectro de ressonância magnética
nuclear protônica do composto não complexado e relacionando-o
72
com a fórmula estrutural da gentamicina podemos concluir que,
os pices em 6 2,95; 6 2,75; 6 1,35 e 6 1,25 coincidem com os
descritos nos trabalhos de Calam e colaboradores1 , desta
forma podemos afirmar que a amostra utilizada em nossos tra
balhos . consistiu em sulfato de gentamicina com grau de pure
za satisfatório.
Por outro lado, ao analisarmos o espectro de res
sonância nuclear magnética protônica do sulfato de gentamici^
na cor.rlexado com Re, notamos que o mesmo apresenta algumas
alterações com relação ao espectro da droga pura. Pelos deslo
camente* observados nos picos para a região de i 4,1 a 6 5,9
poder.os deduzir que muito provavelmente houve uma modificação
estrutural causada pela complexação do Re na molécula de gen
tamicina; entretanto considerando-se que os dois espectros te
nham sido obtidos em condições similares, ao analisarmos o es
pectro da droga complexadz com Re, verificamos nesse caso,que
os picos se concentram próximos ã região do solvente (D.,0 con
taminada com H20), e a técnica utilizada não permite resolu
ções r.ais aprofundadas. Contudo, tratando-se de estudos preH
minares , é perfeitamente aceitável uma primeira aproximação ,
isto é a hipótese de uma alteração estrutural devido a comple
xação de gentamicina com Re, baseados nos dados experimentais.
Finalizando, as análises apresentadas nos permitem
relatar que muito provavelmente esta complexação ocorreu com
o envolvimento dos grupamentos NH2 e a ligação C-0 da molécu
Ia de sulfato de gentamicina.
75
IV.5. Estudos de Parâmetros Farmacocinéticos do Sulfato de Gen
tamicina mTc com o Auxílio da Análise Compartir.ental
IV. 5.1. Distribuição biológica do sulfato de gentamicina
99mTc
Analisando-se os dados relativos à captação do sul
99m — -
fato de gentamicina Tc por grama de orgaos e de tecidos,
em rates da linhagem Kistar, no intervalo de tempo estudado
até Z-" horas, observa-se para uma dose de 0,3 mg de gentamici_
na- "rTc injetada, via endovenosa que os rins e o fígado são
os órgãos que captam em maior porcentagem a droga marcada; os
rins apresentam um máximo de captação 3 horas após a injeção,
decrescendo gradualmente, ou seja, o antibiótico se acumula
até* ur máximo e depois é eliminado lentamente; quanto ao figa
do, a captação máxima situa-se em torno de uma hora.
F.C. Luft e colaboradores^ ' em seus trabalhos a
nível celular, sobre o acúmulo de antibióticos aminoglicosí
dios no parênquima renal de ratos, verificaram que, a gentanú
cina após uma simples dose de 10 mg/kg, injetada via sub-cutâ
nea apresentou um máximo de captação até 6 horas, e depois
disso declinou gradualmente, apresentando uma meia-vida no te
cido renal de 109 horas; justificando estes dados foi consta
tado c acúmulo da gentamicina no córtex renal numa área cons
tituida de túbulos proximais, acarretando meias-vidas relati_
vãmente longas desse antibiótico; dessa forma em nossos traba
lhos com traçador isotópico e rdministração endovenosa pud£
mos observar a redução no tempo máximo de captação dos rins
para 3 horas.
74
(45) K. tJzker e colaboradores1 J após alguns estudos
prelir.inares de captação em ratos e coelhos utilizando genta
99m micina Tc, destinada a cintilografias renais, verificaram
pouca captação de fígado nas imagens obtidas; ?sso também coin
cide com nossos dados que oferecem índices de 9,38» de capta
ção na relação rins/fígado após 3 horas por grama de tec_i
do.
Quanto ao efeito colateral ototóxico da gentamicina
verificamos que a captação pela cabeça (região auricular) é*
desprezível no intervalo de tempo estudado e nas doses utili_
zadas. Isso nos leva a deduzir que o acúmulo de antibiótico,
na região do ouvido interno, deve ser relacionada com repeti_
das doses do antibiótico e níveis plasmáticos mais elevados.
Observa-se ainda uma captação relativamente um pou
co mais alta no estômago após 2 horas; isto provavelmente po
de ser devido ao Tc na forma iônica não complexada.
- 99m
A tabela de captação de gentamicina Tc mostram
que grande parte dos outros órgãos e tecidos apresentam uma
captação desprezível nos intervalos de tempo estudados.
IV.5. 2. Estudo farmacocinetico do sulfato de gentamicina QQm
Tc poT via endovenosa
A observação dos dados experimentais quanto ao de
caimento plasmático, no intervalo de 24 horas nos permite ob
servar a soma de duas exponenciais, o que a princípio permj,
te-nos relacioná-las com a presença dê dois compartimentos
que seriam: compartimento 1, o intravascular e o compartimen
to 2 extravascular* .
75
Na análise de variância, relacionada com o ajuste
numérico dos dados observados dos níveis plasmaticos, verifi_
ca-se que a soma dos quadrados do modelo e do resíduo são
dois valores bem diferentes, respectivamente: 107,8780 e
0,2950. o que significa que o ajuste do irodelo aos dados expe
Timentais foi satisfatório. Podemos observar na figura III.
3.5, que apresenta o gráfico dos valores preditos dos níveis
plasmaticos em função do tempo, a ocorrência de 10 valores
coincidentes entre a simulação e a observação experimental;
ainda na figura III.3.6, onde temos a distribuição dos resí
duos em relação aos valores preditos, verificamos uma distri
buição estatisticamente satisfatória dos valores apresentados.
Analisando-se as meias-vidas de cada componente ex
ponencial da curva Teferente aos níveis plasmaticos da genta
99JIW t •• • * i -* •
micina Tc, observa-se que no inicio os níveis plasmaticos
decaer. com uma meia-vida rápida, T/2 igual a 0,07 horas, pa^
sando em seguida para o compartimento extravascular e antes
da eliminação, decaindo mais lentamente apresentando um T/2
igual a 5,5 horas. Para explicarmos o fato, devemos conside_
rar a ligação da gentamicina a proteína do plasma, visto que
somente o material livre no plasma seria eliminado, sendo fil
trado pelo glomérulo. Gyselynck e colaboradores1 ' em seus
estudos sugerem que uma fração livre da droga é reversivelmen
te ligada ãs proteínas plasmáticas, sendo que estas ligações
vão refletir quantitativamente no mo io cinético adotado. Os
resultados decorrentes do modelo bi-compartimental encontrado
após injeção de gentamicina Tc em ratos Wistar se asseme
lham com os resultados dos trabalhos sobre o comportamento da . . - (55,56,69)
gentancina durante tratamento terapêutico em humanos* ',
76
utilirando-se de métodos de detecção microbiologicos e de Ra
dioiir.unoensaio.
Os trabalhos de Wilson e colaboradores ' , cue uti
lizarar a simulação de um modelo com um só compartimerito estu
dando a eliminação da gentamicina triciada em pacientes humia
nos normais e pacientes com a função renal comprometida, apre
sentar gráficos que relacionam a meia-vida aparente da droga
com vários parâmetros da função renal, mas sugerem a apresen
tação de um outro modelo de dois compartimentos, baseados na
disparidade encontrada pelos autores entre a velocidade de de
saparecimento da droga do plasma e a velocidade de aparecimen
to na urina.
A partir dos dados obtidos por nos, quanto a curva QQlfl
de níveis plasmáticos do sulfato de gentamicina Tc, pude
mos calcular o volume de distribuiçãv «parente, cujo valor é
6,4 7 r.l considerando-se que ele é ligeiramente inferior ao vo
lume plasmático de 7,11 ml, obtido experimentalmente, cor
respondente a um rato normal de 275 g; isto significa que a
droga logo após a aplicação se distribui uniformemente pelo
organismo do animal, num primeiro estágio.
Analisando-se as medidas de radioatividade observa
das nas excreções urinãrias e fecais apresentadas na tabela
II1.5.20 destacamos que nas 24 horas após a injeção, tanto a
eliminação pela urina, bem como pelas fezes apresentar o me£
mo nível de eliminação, havendo uma Tedução sensível nas vin
te e quatro horas subsequentes.
Í381 No trabalho de Luft e colaboradoresK ' foi obser
77
vado que a gentamicina é eliminada por via renal com filtra
ção glomerular, constituindo-se portanto os rins, os órgãos
de eiiirinação preferencial. Neste ponto podemos associar a
eliminarão pelas fezes com a radioatividade presente nos in
testincs às 24 horas e também a uma provável metabolização da
droga pelas enzimas relacionadas, como menciona também Gyse-
lynck e colaboradores^31' em seus estudos farmacocinéticos
da gentamicina em humanos. Alem disso, os trabalhos de Coxv '
se referem a uma mal absorção intestinal da gentamicina,o que
em parte pode explicar a eliminação fecal relacionada em nos
so trabalho.
Os dados experimentais do corpo inteiro foram ajuí>
tados a uma curva exponencial do tipo monoexponencial.
0 gráfico dos valores preditos em relação ao tempo
e os dos resíduos apresentados nas figuras III.3.7 e III.3.8
respectivamente, relacionam valores que foram submetidos a
análise de variância, (teste de Fischer ou teste F) ; observa-
-se que R , o quadrado do coeficiente de correlação e igual
a um valor 0,9605, valor este que indica que o modelo explica
í 231 quase que aproximadamente 1001 dos dadosv .
Temos então para valor da meia-vida biológica 16,5
horas, sendo este relativamente alto; todavia se considerar
mos que a gentamicina poderia permanecer acumulada er grande
parte no córtex renal dos ratos, antes de ser totalmente eli
minada, podemos justificar essa meia-vida biológica prolonga
da.
Foi calculada também a depuração total da droga do
78
organismo, cujo valor é 0,0045 ml/minuto, estando relacionada
significativamente com a depuração renal estabelecida.
Dentro do intervalo de tempo estudado, o plasma foi
o compsrtimento de entrada do sulfato de gentamicina mTc,
sendo conduzida a um segundo compartimento extravascular, on
de os rins se constituem nos órgãos que retiram-na da
circulação, havendo também uma pequena captação pelo fígado.
Nesse sentido foram calculadas as constantes de transferência
k,2»k->j do compartimento intravascular para o extravascular e
deste para o intravascular respectivamente e uma constante de
eliminação kin* P a T a a escolha deste modelo foram feitas duas
hipóteses:
1. no instante inicial toda a droga esta no compar
timento 1.
2. a eliminação da droga marcada obedece a um pro
cesso de primeira ordem, isto é, a quantidade
de substância que sai na unidade de tempo é pro
porcional ã quantidade de substância presente
nele.
Contudo ao analisarmos a simulação do modelo bi-com
partiirental e o gráfico que estão apresentados na tabela III.
4.22 e na figura III.4.10 respectivamente, verificou-se a ne
cessidade da inclusão de um compartimento de retenção que pu
desse explicar satisfatoriamente a discrepância entre a simu
lação das curvas de excreção e a do corpo inteiro com as cur
vas baseadas nos dados observados experimentalmente.
79
A partir desses dados, simulou-se então um modelo
de dois compartimentos com um de retenção, onde o coef ic iente
de eliminação k,Q do compartimento plasmatico foi dividido em
dois componentes: k,n = k!» • k,^, sendo que k,0 è" o coe f i
c iente de eliminação da droga marcada para o exterior do âmb_i
to b io lógico e k , , ê responsável pela transferência da genta
micina mTc para o compartimento de retenção.
A simulação deste modelo e o gráfico representativo
estão apresentados na tabela I I I . 4 .23 e nz figura III.4.12res^
pectivamente. Ao analisarmos es tes dados, observamos que a in
clusão de um compartimento de retenção explicou a concordân
cia verif icada entre as curvas simuladas e as observadas cor
respondentes.
A explicação para este compartimento de retenção es
tá provavelmente, na absorção pelo trato gastro- intest inal do 99m •» —
su l fa to de gentamicina marcado com Tc e também no acumulo Í38) do ant ib iót ico pelo córtex renalv J , e carcassa em geral ,pa
ra o intervalo de tempo observado. A simulação deste modelo
com a presença de um compartimento de retenção é um dado ligfí
do ao nosso modelo proposto para cinética do ant ib ió t i co , não
tendo sido descrito portanto na l i teratura.
CONCLUSÕES
QQfn
1. A ir.arcação do sulfate de gentamicina com Tc resultou
num complexo viável, para serem feitos estudos cinéticos
desse importante antibiótico aminoglicosídio.
80
2. A complexaçao do sulfato de gentamicina com Re, que è* o
elemento que tem características químicas mais similares
ao Tc, possibilitou alguns estudos preliminares estrutu
rais, permitindo-nos sugerir que os grupamentos NH? e a li
gação C-0 estão envolvidos na complexaçao com Re e port an
99m to do mesmo modo com o Tc.
3. A distribuição biológica do sulfato de gentamicina marcadc
com " '"Tc, por via endovenosa, em ratos Kistar.revelou uma
maior afinidade dos rins pela droga, sendo este, o órgão
excretor principal do produto.
4. A curva de decaimento plasmãtico traçada a partir dos da
dos experimentais do produto marcado com "'Tc, resultou
numa curva biexponencial, comportando dois compartimentos:
o intravascular e extravascular; num primeiro tempo a gen
tairicina abandona o plasma com uma meia-vida muito curta:
Tj/2 = 0,07 horas, para em seguida, decair com um l\/2 mais
longo de 5,5 horas.
5. 0 calculo do volume de distribuição aparente nos leva a
concluir que num primeiro instante, após a administração,
via endovenosa, a gentamicina se difunde pelo organismo to
do do animal, para depois ir sendo captada pelos órgãos
afins.
6. A eliminação da gentamicina por via urinaria bem como tam
bem pela fecal aparesentam níveis aproximadamente iguais
nas 24 horas, reduzindo-se sensivelmente nas 24 horas sub
sequentes. A eliminação pelas fezes nos leva a sugerir em
parte, uma provável metabolização da droga.
81
7. O coeficiente de depuração renal nos revela que a gentaini
cina no total é uma droga que é de eliminação relativamen
te lenta.
8. A meia-vida biológica da gcntamicir.a é de 36,5 horas, pa
ra uma dose única injetada de 0,3 r.g de gentaini cina em ra
tos de 27S gramas de peso.
9. 0 modelo compartimentai escolhido para o intervalo de tem
po de 24 horas estudado, resultou na difusão da droga .atra
vés da circulação por todo o organismo do animal num pri
meiro instante, sendo depois captada e eliminada preferen
cialmente pelos rins com uma meia vida de 16,5 horas e os
25* de resíduos que permaneceram no organismo do animal,
representaram a quantidade da droga que ficou acumulada
no cortex renal, além da que ficou depositada na carcaça
e do que foi absorvida pelo trato gastro-intestinal,sendo
estas duas últimas provavelmente er menor porporção em re
lação ã primeira.
10. 0 modelo matemático obtido pela análise compartimental
apresentou bom ajuste, havendo uma boa concordância entre
as curvas simuladas e as obtidas experimentalmente.
11. Os compartimentos intra e extravascular se constituem em
dois compartimentos de troca, sendo mais rápida no senti_
do da passagem do compartimento intravascular para o ex
travascular, pois kj2 ® maior do que k^l' e observa-se
também, que no intervalo de 24 horas estudado, para uma
dose de 0,3 mg de gentamicina aplicada existe um k,, rela
ti vãmente pequeno, mas presente no tempo de observação do
82
experimento, representando a transferência da gentamicina
roTc paTa um compaTtimento de retenção.
12. A cinêtica apresentada pela gentamicina "Tc em ratos
Kistar, poderá ser utilizada para explicaT nas condições
estudadas, um possível acúmulo relacionado com os efeitos
colaterais da droga.
15. Julgamos assim, com a técnica radioisotõpica utilizada
termos dados um passo adiante dentro do âmbito da moderna
Radiofarmacologia, especificamente no conhecimento de an
tibióticos importantes como no caso do sulfato de gentanri
cina.
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