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INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
Eficácia dos tratamentos estabelecidos pela Sociedade
Internacional de Transferência de Embriões, em oócitos
maturados in vitro, expostos experimentalmente à
Leptospira interrogans.
ANA CAROLINA GOES
Dissertação apresentada ao Instituto Biológico, da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, para obtenção do título de Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio. Área de Concentração: Sanidade Animal Orientador(a): Profª Drª Magali D’Angelo
São Paulo
2010
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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Goes, Ana Carolina Eficácia dos tratamentos estabelecidos pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões, com oócitos maturados in vitro, expostos experimentalmente à Leptospira interrogans / Ana Carolina Goes. -- São Paulo, 2010. Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação. Área de concentração: Sanidade Animal. Linha de pesquisa: Biologia Celular. Orientador: Magali D´Angelo. Versão do título para o inglês: Effectiveness of treatment defined to Internacional Embryo Transfer Society, in in vitro maturated oocytes, exposed to Leptospira interrogans. 1. Saúde animal 2. Oócitos in vitro, maturação 3. Embriões in vitro, produção 4. Leptospira interrogans . 5. Sociedade Internacional de Transferência de Embriões I. D´Angelo, Magali II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação III. Título
IB/Bibl./2010/002
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252 CEP 04014-002 - São Paulo – SP
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do candidato: Ana Carolina Goes
Título: Eficácia dos tratamentos estabelecidos pela Sociedade Internacional
de Transferência de Embriões, em oócitos maturados in vitro, expostos
experimentalmente à Leptospira interrogans.
Orientador(a): Profª Drª Magali D’Angelo
Dissertação apresentada ao Instituto Biológico da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios para obtenção do título de Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Animal
Aprovada em: 26 de março de 2010.
Banca Examinadora Assinatura: Prof. (a) Dr.(a): Magali D’Angelo Instituição: Instituto Biológico Assinatura: Prof. (a) Dr.(a): Adriana Cortez Instituição: Univesidade UNISA Assinatura: Prof. (a) Dr.(a): Edviges Maristela Pituco Instituição:InstitutoBiológico
iii
DEDICATÓRIA
Dedico esta pesquisa aos meus pais Ennio e Doroti, e meus irmãos Kenia e
Carlos, pelo apoio, encorajamento, amor e pelos ensinamentos que formaram os
alicerces do meu caráter.
Ao meu marido Mauricio, por acreditar, compreender e apoiar minhas decisões
ao longo da trajetória que me levou a concretizar este meu sonho.
À Drª Josete Garcia Bersano, minha segunda mãe, por sempre acreditar em
mim, em meu potencial e em minha perseverança durante meu crescimento
profissional.
E por fim, ao meu filho Miguel, que mesmo sem entender o que sua mãe
estava fazendo, por estar mergulhado em líquido amniótico, fez parte deste sonho
realizado.
iv
AGRADECIMENTOS
À Dra. Magali D’Angelo, orientadora da pós-graduação, pesquisadora do
Laboratório de Biologia Celular – Instituto Biológico, meus agradecimentos por aceitar
orientar uma aluna rebelde e nunca ter duvidado de meu potencial.
Aos meus pais, Ennio Goes e Doroti de Lurdes Coelho Goes pela paciência,
conselhos, acolhimento e credibilidade que me deram durante toda minha jornada.
Sem eles não seria possível.
Ao meu marido, Mauricio Nunes Pedro, pela paciência e apoio interminável e
incontestável.
Aos meus irmãos, Kenia e Carlos, e meu cunhado, Marco Antonio, também
pelo apoio e credibilidade em minha profissão e meus objetivos.
À Dra. Josete Garcia Bersano, veterinária, pesquisadora e diretora do Centro
Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal – Instituto Biológico, meus
agradecimentos por ser minha fada madrinha, conselheira que sempre me guiou por
caminhos certeiros e objetivados.
À Mariana Moraes Piccolomini, Bióloga e Mestre em Sanidade Animal, por
ser minha melhor amiga e estar presente durante todos os experimentos, me ajudar
nos momentos de desespero, me alegrar nos momentos de tristeza, e, indiretamente,
me orientar durante toda minha trajetória.
Ao meu grande amigo, Andre Soliva Ribeiro, Biólogo, pela amizade,
consideração e carinho, nestes 10 anos de convívio.
À Vanessa Castro, Bióloga e pesquisadora do Laboratório de Doença de
Bovinos – Instituto Biológico, pelo fundamental auxílio nesta dissertação, assim como
toda a equipe do laboratório, como Aline, Rosana, Igor, Lilia Paulin, Rosa Piatti e
Eliana Scarcelli.
À Dra. Margareth Genovez, veterinária e pesquisadora do Instituto Biológico,
que mesmo sendo uma pessoa muito ocupada, sempre esteve disponível para
debates sobre o tema desta pesquisa.
À Dra. Vera Letticie de Azevedo Ruiz, veterinária e pesquisadora do
Laboratório de Doenças de Suínos - Instituto Biológico, pela grande e sincera
v
amizade, pelos inumeros conselhos e pelas tardes de discussão sobre oócitos e
Leptospiras.
À equipe do Laboratório de Biologia Celular, Danielle, Leandro, Mayra e
Eduardo, agradeço sinceramente a enorme contribuição nas idas intermináveis ao
abatedouro, na seleção de oócitos, nas lavagens e tratamentos, e na análise
estatísticas dos dados.
Ao Luis Macedo Correzola, veterinário e Mestre em Sanidade Animal, pela
sincera amizade, carisma, compreensão, presença e alegria que sempre me passou,
tornando mais fácil o caminho até aqui.
Aos amigos Ana Claudia Cardoso e Silvio Rogério, Biólogos
Microbiologistas, que estarão para sempre em minha vida, com apoio e alegria.
Aos amigos Renato e Glaucy Concórdia, pelo grande apoio, credibilidade,
torcida, amizade e companheirismo, principalmente ao final desta caminhada.
Aos muitos e amados amigos do colégio Anchieta, Claudia, Larissa, Cris,
Elaine, Luiz, Assésio e Fernando Portugal, professores e queridos pelo apoio e
muitas risadas.
Ao Marcelo Furuguem e Adriana agradeço pela amizade, carinho e
descontração nos momentos de pura tensão.
À Livia Migliacci, Biomédica, pela amizade, risadas, conversas e caronas
descontraídas.
À Dra. Adriana Cortez, veterinária que fez parte da bancas de qualificação e
defesa, pela experiência e atenção a mim atribuída, sou grata pelos milhares de
conselhos e sugestões para que esta pesquisa mantivesse seu rumo correto.
À Dra. Claudia Del Fava, veterinária e pesquisadora do laboratório de
patologia, por fazer parte da minha banca de qualificação, pela atenção a mim
atribuída.
À Dra. Edviges Maristela Pituco, veterinária e pesquisadora do Laboratório de
Doenças de Bovídeos, sou grata por aceitar com tanto carinho, fazer parte de minha
banca de defesa.
vi
Ao Profº Drº Leonardo José Richtzenhain, do Departamento de Saúde
Preventiva e Saúde Animal, pela honra de aceitar fazer parte de minha banca de
defesa, me guiando com suas inúmeras sugestões.
À empresa Vitrocell / Embriocare, e seus representantes, em especial ao
Cláudio, por ter acreditado na presente pesquisa e colaboraram com o material aqui
utilizado.
À Márcia H.B. Catroxo, Bióloga e pesquisadora do Laboratório de Microscopia
Eletrônica – Instituto Biológico, pela ajuda na demonstração dos resultados dessa
dissertação.
Aos docentes do programa de Pós – graduação do Instituto Biológico de
São Paulo, pelos ensinamentos a mim passados com tanta competência.
Aos alunos companheiros da Pós-graduação, pelas conversas, apoio, festas,
diversões e aconselhamentos que trocamos durante este período de dois anos.
Ao abatedouro Mantiqueira e todos os seus funcionários, pelo imenso
auxílio na colheita de materiais para a presente pesquisa.
A todos que contribuíram, de forma direta ou indireta, para o sucesso dessa
cansativa jornada.
E finalmente, a Deus, por estar sempre presente durante todo meu percurso
nesta jornada, me guiando e me amparando, até o fim.
MUITO OBRIGADA!
vii
Não deixe seu passado impor quem você é, mas o
deixe fazer parte da pessoa que você será.
Nia Vardalos
viii
GOES, A.C. EFICÁCIA DOS TRATAMENTOS ESTABELECIDOS PELA
SOCIEDADE INTERNACIONAL DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES, EM
OÓCITOS MATURADOS IN VITRO, EXPOSTOS À Leptospira interrogans. São
Paulo. 2010. Dissertação (Mestrado em Sanidade Animal, Segurança Alimentar e
Ambiental) – Instituto Biológico.
RESUMO
Pesquisas sobre a qualidade e controle sanitário de embriões bovinos produzidos in
vitro, estão sendo realizadas mundialmente, devido a contaminações que podem
ocorrer durante as fases de produção e transferência de embriões. O patógeno pode
associar-se ao oócito durante a colheita, maturação, fertilização e/ou armazenamento.
Dessa forma, estudos sobre a interação de patógenos com oócitos tornaram-se
essenciais na produção in vitro de embriões. Sendo assim, a técnica de produção e
transferência de embriões torna-se segura desde que seguida as normas de controle
definidas pelo manual International Embryo Transfer Society (IETS), através do
tratamento de oócitos com tripsina, lavagem sequencial ou antibióticos. Os objetivos
da pesquisa foram avaliar a eficácia dos tratamentos, estabelecidos pela IETS, em
oócitos bovinos expostos experimentalmente a Leptospira interrogans sorovar
Grippotyphosa e subsidiar a implantação de normativas de controle de qualidade na
produção de embriões in vitro. Os oócitos foram obtidos através de punção folicular de
ovários provenientes de abatedouro, selecionados e divididos em quatro grupos, todos
expostos ao patógeno e submetidos aos diferentes tipos de tratamentos. O controle
negativo não foi exposto ao patógeno, porém dividido em quatro grupos e submetidos
aos mesmos tratamentos. A exposição ao patógeno foi realizada no volume de 30µL
da estirpe da L. interrogans sorovar Grippotyphosa, na concentração de 4,7.105/µL,
virulenta e não adaptada ao meio de manutenção EMJH, e 6,3.105/µL, avirulenta e
adaptada ao meio EMJH; cada gota de meio de maturação contendo 20 oócitos,
ix
levados à estufa de CO2 5% em ar, umidade relativa de 90% e à temperatura de 37°C,
por 18 a 24 horas. A análise quanto a presença do patógeno e alterações morfológicas
através de microscopia óptica de campo escuro, mostrou retração no ooplasma e, o
mesmo, apresentou-se granuloso com coloração castanho escuro, havendo ainda a
formação de vacúolos, para os grupos contaminados tanto para a estirpe virulenta
quanto para a avirulenta, o que não foi observado nos controles. Os tratamentos
apresentaram, para os grupos tratados com tripsina ou antibióticos, 21,7% de eficácia,
porém para o grupo lavado sequencialmente, apresentou 33,4% de eficácia. Nenhum
dos tratamentos foram eficazes para os grupos contaminados com estirpe avirulenta.
Em análise estatística dos dados, através do χ2 (teste qui-quadrado) constatou-se
significância nos resultados obtidos, no valor p<0,05. Os oócitos também foram
avaliados, através de microscopia óptica de corte semi-fino, quanto a interação do
patógeno e o oócito, onde verificou-se presença de estrutura semelhante as leptospira
no ooplasma. Com tais resultados, concluímos que as normas de controle de
qualidade estabelecidas pela IETS na produção in vitro de embriões, poderiam ser
revisadas e, possivelmente redefinidas, uma vez que a eficácia dos tratamentos,
provavelmente não depende somente da espécie do patógeno, havendo interferência
de sua virulência e ação dos tratamentos sobre o tipo de patógeno.
Palavras-chave: IETS, oócitos, Leptospira interrogans, Grippotyphosa, produção in
vitro
x
GOES, A.C. EFFECTIVENESS OF TREATMENT DEFINED TO INTERNACIONAL
EMBRYO TRANSFER SOCIETY, IN IN VITRO MATURATED OOCYTES, EXPOSED
TO Leptospira interrogans. Sao Paulo. 2010. Dissertation (Animal Health, Food
Safety and Environmental) – Biological Institute.
ABSTRACT
Researches about the sanitary quality and control of bovine embryo produced in vitro,
are being carried worldwide, because of the contamination that may occur during all
stages of production and transfer of embryos. The pathogen can be associated with
the oocyte during collection, maturation, fertilization and / or storage. Studies on the
interaction of pathogens with oocytes have become essential in vitro embryos
production. On that account, the technique of production and embryos is safe as long
as it follows the control regulations defined by the manual of the International Embryo
Transfer Society (IETS) treating oocytes with trypsin, washing sequential or
antibiotics. The research objectives were to evaluate the effectiveness of treatments
established by IETS, in bovine oocytes exposed experimentally to Leptospira
interrogans serovar Grippotyphosa, and support the implementation of norms of
quality control in in vitro embryos production. Oocytes were obtained through follicular
puncture of ovaries derived from slaughterhouse, selected and divided into four
groups, all exposed to the pathogen, under different types of treatments. The negative
control was not exposed to the pathogen, but divided into four groups and subjected to
the same treatments. The exposure to the pathogen was performed in 30µL of the
strain of L. interrogans serovar Grippotyphosa, the concentration of 4,7.105/µL,
virulent and not adapted to the EMJH maintaining of medium; and 6,3.105/µL,
avirulent and adapted to EMJH medium, every drop to the medium of
maturation containing 20 oocytes, taken to the incubator at 37°C, 5% CO2 and 95%
humidity for 24 hours. The analysis about presence of the pathogen and morphological
xi
changes through optical microscopic dark field, showed reduction in the ooplasm and
the same, presented granular colored dark brown, and there are vacuoles to
contaminated groups for both the strain virulent and avirulent for, which was not
observed in controls. The treatments presented for the groups with trypsin or
antibiotics, 21.7% efficiency, but for the group washed sequentially presented 33.4%
efficiency. None of the treatments has been effective for the groups infected with
avirulent strain. In statistical analysis, using the χ2 (chi-square test) was found
significance in the results obtained at p <0.05. The oocytes were also evaluated by
light microscopy cut semi-thin, as the interaction of the pathogen and the oocyte, where
it was found presence of similar structure to leptospira in the ooplasm. With
such results, we conclude that the standards of quality control established by IETS in
vitro embryo production could be reviewed and possibly redefined, since the
effectiveness of treatments, probably depends not only on the species of pathogen no
interference in its virulence and action of the treatments on the type of pathogen.
Keywords: IETS, oocytes, Leptospira interrogans, Grippotyphosa, in vitro production
xii
LISTAS DE TABELAS E FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 Representação das divisões e subdivisões dos grupos experimentais de oócitos maturados, para cada estirpe................................................. 14
Fluxograma 2 Detalhes dos tratamentos utilizados nos diferentes grupos
experimentais......................................................................................... 15
Fluxograma 3 Sequencia experimental para avaliação da eficácia dos tratamentos
estabelecidos pelo Manual da IETS........................................................ 17
Tabela 1
Relação das espécies de Leptospira, sorogrupos e sorovares que
serão empregados como antígenos na reação de Soroaglutinação
Microscópica realizada sob a forma de microtécnica.............................. 21
Tabela 2 Grupos de oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar
Grippotyphosa 4,7x105/µL........................................................................ 22
Tabela 3 Grupos de oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar
Grippotyphosa 6,3x105/µL........................................................................ 22
xiii
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Oócitos do grupo controle após período de maturação, em MCE (400X)...................................................................................................... 24
Figura 2 Oócitos do grupo infectados com 30µL de L. interrogans, em MCE (400X)...................................................................................................... 24
Figura 3 Oócitos do grupo controle após período de maturação, em MCE
(400X) ..................................................................................................... 24
Figura 4 Oócitos do grupo contaminado com 30µL de L. interrogans, em MCE
(400X) ..................................................................................................... 24
Figura 5 Corte semi-fino de oócito contendo estruturas semelhantes à L.
Interrogans (100X) .................................................................................. 25
Figura 6 Corte de oócitos, em microscopia eletrônica de transmissão, contendo estruturas semelhantes à L. interrogans (4.800X)................................... 26
Figura 7 Corte de oócitos, em microscopia eletrônica de transmissão, contendo estruturas semelhantes à L. interrogans (7.560X)................................... 26
xiv
LISTAS DE ANEXOS
Anexo 1 Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal – CETEA-IB 38
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µL Microlitros
BoHV-4 Herpesvírus bovino tipo 4
BSA Albumina Sérica Bovina
BTV Vírus da línga azul
BVDV Vírus da diarréia viral bovina
CETEA Comissão de ética na experimentação animal
COC Complexo cumulus-oócito
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
EMJH Ellinghausen McCullough Johnson Harris
FIV Fertilização in vitro
hCG Gonadotrofina Coriônica Humana
IA Inseminação artificial
IBRV Vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina
IETS Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
LH Hormônio luteinizante
LPS Lipopolissacarídeo
M Molar
M2 Metáfase dois
MCE Microscópio de campo escuro
MDKB Linhagem Madin Darby ded células de rim bovino
Mg Miligrama
MIV Meio de maturação
mL Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
MPF Fator da fase meiótica
n-PCR Nested Reação em Cadeia pela Polimerase
OIE Organização Mundial de Saúde Animal
OMS Organização Mundial de Saúde
xvi
pb Pares de base
PBS Phosfate buffer Solution
PCR Reação em Cadeia pela Polimerase
pH Pontencial hidrogênico
PIV Produção in vitro
rpm Rotações por minuto
RPV Vírus da peste bovina
SAM Soroaglutinação microscópica
SFB Soro Fetal Bovino
TCM Meio para cultura de tecidos
TE Transferência de embriões
Vero Célula de rim de macaco verde africano
VG Vesícula germinativa
VSV Vírus da estomatite vesicular
ZP Zona Pelúcida
OBS: Visto terem seu uso consagrado na literatura técnica, algumas abreviaturas e siglas seguem as iniciais de sua grafia no idioma inglês.
SUMÁRIO Página
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 3
2.1. A produção in vitro de embriões ...................................................................... 3
2.2. Riscos sanitários da produção in vitro ............................................................. 6
2.3. Aspectos da Leptospira spp na produção in vitro de bovinos .......................... 7
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 11
3.1. Bactéria ............................................................................................................ 11
3.2. Obtenção dos oócitos ..................................................................................... 11
3.3. Seleção dos oócitos ......................................................................................... 12
3.4. Maturação in vitro dos oócitos ......................................................................... 12
3.5. Exposição dos oócitos a L. interrogans sorovar Grippotyphosa, durante o período de maturação in vitro ................................................................................. 13
3.6. Tratamentos dos oócitos com tripsina, antibióticos e lavagem sequencial, após o período de maturação in vitro ...................................................................... 13
3.7. Avaliação da eficácia dos tratamentos ............................................................. 15
3.8. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ..................................................... 16
3.9. Análise dos oócitos após tratamentos, através de microscopia óptica de corte semi-fino .................................................................................................................. 18
3.10. Análise dos oócitos, após os tratamentos, através de microscopia eletrônica de transmissão ......................................................................................................... 19
3.11. Teste de toxicidade do meio de manutenção da Leptospira spp – EMJH ..... 19
3.12. Controle dos oócitos à prévia infecção por Leptospira spp, em hamsters, através de sorologia ................................................................................................ 20
3.13. Análise estatística .......................................................................................... 21
4. RESULTADOS ................................................................................................... 22
4.1. Avaliação da eficácia dos tratamentos com trispina, antibióticos e lavagem sequencial ............................................................................................................... 22
4.2. Avaliação da morfologia dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia
de campo escuro ..................................................................................................... 23
4.2.1.Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa virulenta ................................ 23
4.2.2.Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa avirulenta .............................. 24
4.3. Avaliação dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia óptica através
de corte semi-fino ..................................................................................................... 25
4.4. Avaliação dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia eletrônica de transmissão .............................................................................................................. 25
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 27
6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 33
1
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, uma das principais fontes de renda, é o Agronegócio voltado à
Pecuária, sendo o principal mercado de exportação o de carne bovina. Segundo
estimativas da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (Food
and Agriculture Organization – FAO), o Brasil detém o maior rebanho mundial de
bovinos, seguido da Índia, China, Estados Unidos e Argentina, tendo este cerca de
200 milhões de cabeças (IBGE, 2008). A utilização de biotecnologias na reprodução
dos rebanhos, como inseminação artificial (IA), produção in vitro de embriões bovinos
(PIV) e a transferência de embriões (TE), foram de grande contribuição para se
alcançar esse patamar.
A TE começou a ser utilizada mundialmente para introdução, melhoria e
preservação de animais geneticamente superiores. Clonagem, sexagem e
manipulação de DNA de embriões são procedimentos que propiciam oportunidades
para contaminação de agentes infecciosos devido a trocas de materiais celulares que
ocorrem durante o processo. Consequentemente, a investigação sobre esses agentes
infecciosos e de protocolos para certificação sanitária dos embriões no comércio
internacional, devem ser comprovados por meio de pesquisas científicas e realizados
por órgãos competentes (BIELANSKI et al., 1997).
A PIV é vista como mais uma alternativa nos programas de reprodução, pois,
além de sua relevância para estudos biotecnológicos, possui fundamento comercial,
sendo em bovinos uma valiosa ferramenta para difundir e acelerar a produção de
animais geneticamente superiores, e também impedir o descarte precoce de fêmeas
portadoras de alterações adquiridas que as impeçam de reproduzir por meio de monta
natural ou via TE. Também é um excelente recurso para pesquisa de fenômenos
biológicos que ocorrem durante a maturação, fecundação e cultivo in vitro de oócitos,
capacitação espermática e eventos relacionados ao início do desenvolvimento
embrionário na fase de pré-implantação. Devido à sua capacidade de produzir um
grande número de embriões, a PIV se tornou um indispensável instrumento para
outras biotécnicas como a clonagem, a manipulação de genes e a transferência de
núcleos (GONÇALVES et al., 2007).
Durante o período de maturação, as células da granulosa começam a se
expandir, conectando-se com a zona pelúcida (ZP) e afroxando-a para permitir a
2
entrada do espermatozóide. Deste modo, autores questionaram se haveria interação
entre o relaxamento das células da zona pelúcida e o agente infeccioso, podendo
assim levar o patógeno à receptora, ou tornar o embrião doente ou portador. Sendo
assim, respostas para os questionamentos sobre a possível penetração e aderência
de microrganismos no complexo cumulus-oocitos (CCO) e na zona pelúcida de oócitos
e embriões, em seus diferentes estágios, são de grande preocupação (BIELANSKI et al.,
1997).
Um dos procedimentos descritos pelo Manual da Sociedade Internacional de
Transferência de Embriões (International Embryo Transfer Society – IETS) para
qualidade sanitária na PIV, consta do tratamento de oócitos e/ou embriões com
tripsina ou antibióticos em lavagens alternadas com meio de cultura, com a finalidade
de inativar ou remover agentes infecciosos que podem interferir no produto final.
Diversos autores testaram esse procedimento, questionando sua eficácia como
Stringfellow et al. (1990) e Bielanski et al. (1998).
A utilização de ovários bovinos colhidos em abatedouros, procedentes de
animais cujo estado sanitário é desconhecido, é uma prática estabelecida e ainda
utilizada para a produção de embriões in vitro (FERREIRA et al., 2005).
O presente trabalho teve como objetivos, avaliar a eficácia dos tratamentos
com tripsina, antibióticos ou lavagem sequencial com meio de cultura, estabelecidos
pela IETS, em oócitos maturados in vitro e, expostos experimentalmente com
Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa, durante o período de maturação, pela
técnica de microscopia de campo escuro, subsidiando assim, a implantação de
normativas de controle de qualidade na produção de embriões in vitro; e avaliar
possíveis interações entre grupos de L. interrogans e o oócito bovino, por meio de
microscopia óptica e de corte semi-fino e microscopia eletrônica de transmissão.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A produção in vitro de embriões
A biotecnologia da reprodução representa um dos melhores exemplos de
história de sucesso na transferência tecnológica. A IA foi a primeira geração da
biotecnologia da reprodução assistida, utilizada atualmente, no mundo todo. Em
seguida encontram-se a TE, a fecundação in vitro (FIV), a sexagem de embriões e por
fim, a transferência nuclear e a transgênese (THIBIER, 2005).
No Brasil, destacam-se o uso dessas tecnologias, pela maior parte dos
embriões bovinos terem sido obtidos por meio de PIV, passando a ter alto valor
comercial. Devido a facilidade de envio de material genético em pequenas palhetas
congeladas que garantem prolongada viabilidade, as vantagens para o comércio
internacional de embriões, oócitos e espermatozóides, são consideráveis. Porém, a
criopreservação celular de material para PIV também facilitou a sobrevivência,
transmissão e transporte de qualquer patógeno que, por ventura, esteja presente no
material. Sendo assim, as autoridades especializadas passaram a ser desafiadas para
garantir a sanidade do rebanho nacional, sem restringir atividades ligadas à TE
(WRATHALL, 1995). As tecnologias de embriões são uma combinação de assistência
reprodutiva, biologia celular, molecular e técnicas genômicas (GALLI et al., 2003).
Magajesvski (2006) evindeciou que, técnicas de reprodução assistida
melhoram a qualidade e produtividade de rebanhos no mundo todo, e técnicas de FIV,
dada às qualidades zootécnicas dos animais envolvidos no sistema, PIV e TE, tem
sido cada vez mais utilizadas, porém, pesquisas de análise sanitária dos rebanhos e
condições dos oócitos e embriões são escassas no Brasil.
Magajevski, Gírio e Meirelles (2007) descrevem que, as técnicas de IA, PIV e
TE foram passos fundamentais para melhor rendimento e qualidade de rebanhos
bovinos em todos os continentes, favorecendo bons resultados econômicos para a
pecuária mundial.
4
Le Tallec et al. (2001) descrevem que embriões bovinos produzidos in vivo e in
vitro, podem ser contaminados durante as diferentes fases da PIV e TE. O agente
infeccioso pode ter origem no sêmen ou em oócitos, havendo contaminação desde a
colheita até a transferência, passando pelos processos de maturação e fecundação,
incluindo as condições de armazenamento.
Outra dificuldade da PIV está na baixa produção e qualidade de embriões,
devido a deficiência dos processos in vitro para uma adequada maturação
citoplasmática do oócito, o que pode dificultar os processos de preservação dos
oócitos e embriões e, por consequência, a implantação em sistemas de produção
animal (GONÇALVES et al., 2007). Porém, as vantagens e aplicações da PIV como
biotécnica, segundo Gonçalves, Figueiredo e Fretias (2002), estão relacionadas a
rápidas e melhores possibilidades para programas de cruzamentos, maximização do
potencial genético do macho e da fêmea, maior eficácia dos programas de núcleos de
produção, controle e determinação do sexo dos produtos, facilidade de exportação e
importação do sêmen congelado de alto valor genético, rápida multiplicação de raças e
estudo e desenvolvimento de novas biotécnicas reprodutivas a partir da
micromanipulação de embriões e gametas.
Tornaram-se essenciais na PIV, os estudos da interação entre agentes
infecciosos e óocitos/embriões, pelo fato de que, as diferenças no modo de ação
podem estar ligadas a sua capacidade de resistir à aderência e penetração pelos
patógenos, podendo causar alterações morfológicas, bloqueio da clivagem, aumento
do espaço periplasmático, retração ooplasmática e até rompimento da zona pelúcida
(D’ANGELO et al., 2005, 2006).
Ovários e ovidutos bovinos colhidos em abatedouros, procedentes de animais
cujo estado sanitário é desconhecido, ainda é uma prática utilizada e estabelecida
para a PIV (FERREIRA et al., 2005). Segundo normas descritas pelo manual da IETS
por Stringfellow (1998), para oócitos colhidos de ovários de abatedouro, devem ser
aplicadas medidas como: fêmeas descartadas em programas nacionais de
erradicação e controle de doenças não devem ser utilizadas como doadoras; o
abatedouro deve participar de programa de inspeção oficial que inclua inspeções ante
e pós-mortem; a equipe de colheita dos ovários deve seguir regras higiênicas e de
segurança aplicadas às atividades do abatedouro; os ovários e outros tecidos devem
ser transportados sob condições higiênicas.
Os complexos cumulus-oócitos (COCs), são reconhecidas fontes importantes
de material biológico para análise morfológica quantitativa rigorosa (estereologia), da
5
maturação e da FIV, onde a PIV atinge normalmente, as taxas de 5 a 60%
(GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2002). Esse limítrofe de resultados para a PIV a
partir de COCs imaturos, pode ser atribuído aos métodos de seleção dos complexos,
baseando-se em parâmetros de avaliação morfológica através de estereomicroscópio,
assim como o estado morfológico do cumulus e ooplasma. Apresentam maior
capacidade de desenvolvimento, os COCs com camadas de cumulus compacta e
constituídas por numerosas células foliculares, e o oócito com ooplasma homogêneo
(DE LOOS; KASTROP; VAN MAURIK, 1991).
Para que os oócitos sejam fecundados e, posteriormente desenvolverem-se até
o estágio de blastocisto, é necessário que sejam maturados, tanto in vitro como in
vivo. Durante essa fase, sofrem diversas transformações, tanto em seu citoplasma
quanto em seu núcleo. No desenvolvimento, o oócito encontra-se no estágio da
prófase 1 ou, também conhecido como estágio de vesícula germinativa (VG). In vivo, a
meiose ou maturação reinicia-se após o estágio de pré-ovulação (hormônio
luteinizante – LH), durante o estro e, in vitro, a retirada do oócito do contato com as
células foliculares, inicia o processo de maturação do núcleo. A maturação do oócito
envolve a progressão do estágio diplóteno da primeira prófase meiótica, até a fase de
metáfase 2 (M2). O período de maturação bovina in vitro, dá-se entre 18 a 24 horas,
em atmosfera de 5% de CO2, umidade relativa de 90% e temperatura de 37°C. A
habilidade para o reinício da maturação é obtida quando a concentração e a atividade
do pré fator da fase meiótica (MPF) atingem elevados níveis no oócito (GONÇALVES et
al., 2007; KOBAYASHI et al., 1991).
Os oócitos e embriões de mamíferos possuem um envoltório extracelular e
glicoprotéico, conhecido como zona pelúcida (ZP). Tem como função assegurar a
especificidade das espécies no momento da fecundação, bloquear a poliespermia e
proteger o embrião durante os primeiros estágios de desenvolvimento (DUNBAR, 1983).
As proteínas que constituem a ZP são secretadas pelas células foliculares associadas
ao oócito em desenvolvimento, pelo próprio oócito e, por vezes, pelas células epiteliais
que formam o oviduto (OIKAWA et al., 1988; WASSARMAN, 1988). Sendo assim, tais
afirmações deixam evidente que o bom estado biológico e sanitário do oócito é
fundamental para a formação de uma ZP apropriada, desempenhando assim suas
funções primordiais (MAGAJEVSKI; GÍRIO; MEIRELLES, 2007).
A ZP é uma membrana com microporos, permeável a macromoléculas
(SELLENS; JENKINS, 1975), torna-se essencial para a troca de substâncias entre os
meios internos e externos durante a maturação, permitindo também a fixação ou
6
entrada de patógenos. Também estão presentes na ZP, canais deixados por células
foliculares remanescentes que desprendem-se de sua superfície, ocorrendo
principalmente após a ovulação (GWATKIN, 1967), novamente sendo caracterizada
como via de acesso celular aos agentes infecciosos.
2.2. Riscos sanitários da produção in vitro
O modo de ação e funcionabilidade da ZP é questionável, no processo de
interação dos patógenos com oócitos e embriões. Acredita-se que a ação dos
patógenos sobre embriões ocorra somente após a penetração do agente na célula,
através da ruptura da zona pelúcida ou após o hatching, porém, patógenos com
tamanho extremamente reduzido, como os vírus, ou ativamente invasivos, como
algumas bactérias, a zona pelúcida, mesmo intacta, passa a não ser uma barreira
intransponível (D’ANGELO et al., 2005).
Stringfellow, Lauerman e Thomson, (1998) citaram a capacidade de alguns
patógenos conseguirem penetrar no oócito ou embrião através da ZP, como, por
exemplo o herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4), vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina
(IBRV), vírus da peste bovina (RPV), vírus da estomatite vesicular (VSV), Haemophilus
somnus, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma
paratuberculosis e Ureplasma diversum. Concluindo que, a lavagem e tratamento de
oócitos e embriões bovinos fertilizados in vitro, com tripsina, deve reduzir o nível de
contaminação, mesmo, a eficácia desses tratamentos não sendo totalmente
comprovada.
Bielanski e Surujballi (1996) isolaram leptospiras de amostras de cultura de
zigotos de sete dias e embriões submetidos à FIV, com oócitos expostos à Leptospira
borgpetersenii sorovar Hardjo, tratados por dez vezes com lavagem seqüencial e
tripsina, segundo recomendações da IETS.
Não há vantagens em investir em biotecnologias da reprodução em rebanhos
ou animais atingidos por problemas sanitários, com enfermidades que podem ser
transmitidas através do sêmen, oócitos e embriões, que provocam entre outros males,
7
infertilidade, abortamento, repetição de cio e até mesmo esterilidade (MAGAJEVSKI;
GÍRIO; MEIRELLES, 2007). A leptospirose encontra-se no hall dessas enfermidades
ligadas à reprodução, sendo considerada uma das principais, causando abortamentos,
infertilidade, ocorrência de natimortos e retenção placentária, sendo responsável pela
baixa produtividade da pecuária mundial (GIVENS, 2006) e tida como uma das
zoonoses mais difundidas no mundo (JOUGLARD, 2005).
2.3. Aspectos da Leptospira spp na produção in vitro de bovinos
As leptospiras são bactérias espiroquetas, gram-negativas, aeróbias
obrigatórias, helicoidais flexíveis e móveis, fortemente espiraladas. Possuem de 0,1 a
0,3 µm de diâmetro por 6 a 30 µm de comprimento, dois filamentos axiais (flagelo
periplasmático) com inserções polares localizadas no espaço periplasmático, o que
facilita seu movimento de rotação e flexão rápida em seu próprio eixo (FAINE,1994;
ELLINGHAUSEN; THIERMAN; SULZER, 1981). Possuem membrana dupla, comum também
em outras espiroquetas, em que a membrana citoplasmática e a parede celular são
constituídas por peptidoglicano, estando associadas e envolvidas pela membrana
externa. Sua parede de lipopolissacarídeo (LPS) possui composição similar a outras
bactérias gram-negativas, porém, com baixa atividade endotóxica (LEVETT, 2001).
Crescem em meios enriquecidos com vitaminas, principalmente B2 e B12, sais de
amômia e com ácidos graxos de cadeia longa, utilizadas como fonte de carbono e
metabolizados por β-oxidação (FAINE et al., 1999).
O gênero Leptospira pertence à família Leptospiraceae e ordem
Spirochaetales, e sua classificação pode ser baseada em critérios moleculares ou
antigênicos. Ambos os métodos reconhecem espécies patogênicas e saprófitas
(FERESU et al., 1999). Sua transmissão em bovinos pode ocorrer de maneira direta,
principalmente através de via venérea e, de modo indireto, pelo contato com solos e
água contaminados (AMATREDJO; CAMPBELL; PATHR, 1975). A via de transmissão
transplacentária também é comum entre os animais (BRASIL, 1995). Segundo Hanson
(1982) e Thiermann (1984), uma vez infectados, os bovinos podem eliminar o agente
através da urina por um período de tempo viável, podendo se estender a mais de um
8
ano. A leptospiúra em bovinos, segundo Rebhun (1995), pode persistir entre quatro e
dez meses, tendo caráter intermitente.
Segundo Ellis et al., (1985) perdas causadas pela leptospirose são
ocasionadas devido à localização da bactéria no hospedeiro durante o período de
leptospiremia, estando completamente difundidas pelo organismo do hospedeiro,
incluindo o trato genital. Por toda esta fase, a leptospira pode ser encontrada no
fígado, pulmões, globo ocular e, por vezes no sistema nervoso central.
Magajevski, Gírio e Meirelles (2007) citam que Jones (1958) verificou que a
leptospirose poderia ser disseminada nos rebanhos por meio de sêmen contaminado,
durante a monta natural e a IA, sendo confirmada por Roberts (1958) e Sleight e
Willians (1961).
Segundo Thiermann (1984), medidas para o controle da leptospirose foram
prejudicadas, pois estirpes virulentas tem a capacidade para sobrevivência a longo
prazo no ambiente, bem como infecção persistente e sendo disseminada por animais
selvagens e animais de corte, é altamente prejudicial à pecuária por causar
abortamentos, natimortos e diminuição da produção de leite.
Muitos são os trabalhos que se referem a perdas econômicas ligadas à
reprodução, causadas pela leptospirose. Na pecuária, Kolev et al., (1983) testaram
231 amostras de sangue de vacas que sofreram abortamentos, dado à luz a
natimortos ou que apresentaram falhas na concepção e demonstraram que 15,58%
dos casos foram causados por vírus e 6,06% por leptospiras. Também neste trabalho,
os autores evidenciaram os distúrbios reprodutivos que podem ser causados pela
baixa qualidade sanitária do rebanho, chamando a atenção à leptospirose.
Ellis et al. (1982), examinando fetos bovinos abortados, constataram que em
41,6% havia a presença do sorovar Hebdomadis e que 68% desses fetos eram
provenientes de propriedades com problemas reprodutivos.
Guimarães (1982) descreve que, os danos causados pela L. interrogans em
bovinos, em fases agudas e crônicas, caracterizam-se por abortamentos, retenção
placentária, queda na produção de leite, mastite, infertilidade, e infecção renal
permanente.
Elder et al. (1985) investigaram a relação entre abortamento e títulos de
anticorpos anti-leptospira em rebanhos bovinos de corte e leiteiro. Os títulos
9
sorológicos encontrados foram relacionados à alteração reprodutiva, sendo o sorovar
Pomona o mais frequente seguido pelo sorovar Hardjo.
Em 773 soros fetais bovinos testados, Kirkbride e Johnson (1989) verificaram
que 52 soros eram positivos à prova da soroaglutinação microscópica (SAM) para pelo
menos um dos cinco sorovares utilizados. O teste com anticorpos fluorescentes, não
detectou a presença do agente nos fetos que apresentaram título para anticorpos,
porém, pela mesma técnica, foi detectada a presença da Leptospira spp em 15
bezerros abortados, negativos na SAM.
Em surto de leptospirose bovina em Minas Gerais – Brasil, Moreira et al. (1993)
verificaram que a ocorrência de abortamento, infertilidade, morte fetal e mastite, foi
mais frequente em animais que apresentaram aglutininas contra sorovares Hardjo e
Wolffi.
Genovez et al. (1993) analisaram bacteriologicamente, no período de 1985 a
1992, no Instituto Biológico de São Paulo, 544 amostras de órgãos e anexos fetais de
282 fetos bovinos abortados, de diversos Estados brasileiros, demonstrando que
12,4% dos casos estavam relacionados à leptospirose e a brucelose.
Ellis et al. (1986) detectaram a presença do sorovar Hardjo no útero, ovidutos,
ovários e vagina de vacas não prenhes, infectadas experimentalmente com Leptospira
interrogans. Das vacas examinadas, 65% apresentaram o patógeno no trato genital e
62% nas vias urinárias.
Magajevski, Gírio e Meirelles (2007) relatam que de 212 vacas avaliadas,
abatidas no Estado de São Paulo – Brasil, 1,7% apresentou reação sorológica para o
sorovar Grippotyphosa. Na mesma pesquisa, os autores relatam que em muitos casos,
mesmo com a mãe soro reagente, o feto pode não desenvolver anticorpos para
leptospirose, mas albergar as leptospiras em seus órgãos.
Magajevski (2006) encontrou indícios de isolamento em meio Fletcher, de
Leptospira spp, em ovários, contendo pools de líquido folicular. Porém detectou,
através da técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR), a presença do DNA
de leptospiras em vacas negativas na soroaglutinação microscópica (SAM).
Langoni et al. (2000) destacaram que, 25,91% dos animais para corte,
apresentam sorovar Canicola, o que demonstra presença da leptospira em animais
abatidos, sendo que oócitos provenientes de ovários desses animais, se submetidos
ao processo de FIV, podem levar à contaminação aos embriões.
10
Bielanski et al. (1998) realizaram pesquisa verificando o estado sanitário de
oócitos e embriões coletados de vacas experimentalmente infectadas com Leptospira
borgpetersenii, e verificaram que em 21 amostras de embriões recuperadas, todas se
mostraram negativas à infecção por leptospira. No entanto, na mesma pesquisa, foi
demonstrado que 29% dos embriões em estágio de mórula e blastocistos,
apresentaram-se positivos, através da técnica de PCR, e de 29 oócitos recolhidos, um
foi positivo quanto a presença de DNA de leptospira.
11
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Bactéria:
Foram utilizadas estirpes de Leptospira interrogans, sorovar Grippotyphosa,
uma virulenta e outra avirulenta, sendo que para a reativação de sua virulência,
utilizou-se a metodologia clássica de passagens sucessivas em hamsters, de acordo
com procedimentos descritos por Gonzales, Dias e Matos (1999).
O procedimento foi realizado no Laboratório de Doenças Bacterianas da
Reprodução do Instituto Biológico.
3.2. Obtenção dos oócitos
Os ovários foram obtidos de vacas abatidas no frigorífico Mantiqueira,
localizado na cidade de São José dos Campos – SP. Aproximadamente 30 minutos
pós-mortem do animal, na fase de evisceração, foi realizada a retirada dos ovários,
mantidos em solução fisiológica acrescida de 1% antibióticos
(penicilina/estreptomicina) e transportados ao laboratório à 38°C, não excedendo o
período de quatro horas entre a obtenção do mesmo e as aspirações foliculares.
Para a aspiração folicular dos ovários, utilizou-se seringas de 10 mL e agulha
calibre 18G, estéreis e descartáveis. Foram aspirados folículos com diâmetro entre 2 e
8mm, o conteúdo transferido para tubos Falcon® e levados à estufa a 37°C por 20
minutos, para decantação dos oócitos. Após esse procedimento, os oócitos foram
coletados com pipetas Pasteur e depositados em placas de Petri para devida
12
recuperação e seleção dos complexos cumulus-oócitos (COCs), com auxilio de
solução Holding plus à 37°C, utilizando-se micropipetas e ponteiras descartáveis.
3.3. Seleção dos oócitos
A seleção dos oócitos foi realizada em fluxo laminar, com materiais, meios e
vidrarias estéreis, com a luz incandescente do fluxo apagada, para que não houvesse
a oxidação dos oócitos durante o procedimento. Para a recuperação e seleção
oocitária, utilizou-se o estereomicroscópio, em aumento de 20X, sendo selecionados
oócitos classificados como grau 1, os com COCs compactos, com mais de três
camadas de células do cumulus e citoplasma homogêneo e, os classificados como
grau 2, com COCs compactos com três ou menos camadas de células do cumulus ou
com citoplasma levemente heterogêneo, segundo os critérios descritos por De Loos,
Van Vliet e Van Maurik (1989). Os oócitos foram selecionados, classificados e lavados
por três vezes, em gotas de 100 µL de solução Holding plus a 37ºC, trocando-se a
ponteira a cada seleção.
3.4. Maturação in vitro dos oócitos.
No início de cada experimento, amostras de líquido folicular e oócitos foram
testadas quanto à presença do patógeno, por meio da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR). Em todos os testes, os resultados foram negativos.
Os oócitos selecionados foram transferidos para gotas de meio de maturação
(TCM199, 10% de Soro Fetal Bovino, 0,5 µl de FSH, 50 UI/mL de hCG, 1 µL de 17-
βestradiol/mL) de 50 µL cada, colocadas em placas de Petri descartáveis e sob óleo
mineral filtrado, evitando assim, contaminações externas e ressecamento das gotas de
13
meio de maturação. Foram divididos em quatro grupos, todos expostos ao patógeno
para serem submetidos aos diferentes tipos de tratamentos, ou seja, lavados com
antibióticos, tripsina, lavados sequencialmente e, um grupo sem tratamento, sendo o
controle positivo. O controle negativo não foi exposto ao patógeno, porém, também foi
dividido em quatro grupos para que fossem submetidos aos mesmos tratamentos,
respectivamente. Esse procedimento foi realizado para cada estirpe, separadamente.
3.5. Exposição dos oócitos a L. interrogans sorovar Grippotyphosa, durante o período de maturação in vitro.
A exposição ao patógeno foi realizada no volume de 30 µL da estirpe da L.
interrogans sorovar Grippotyphosa, na concentração de 4,7.105/ µL, virulenta e não
adaptada ao meio de manutenção EMJH; e outro grupo foi contaminado com a mesmo
volume, de outra estirpe da L. interrogans sorovar Grippotyphosa, na concentração de
6,3.105/ µL, avirulenta e adaptada ao meio EMJH; cada gota de meio de maturação
contendo 20 oócitos. Foram então, levados à estufa de CO2 5% em ar, umidade
relativa de 90% e à temperatura de 37°C, por 18 a 24 horas.
3.6. Tratamentos dos oócitos com tripsina, antibióticos ou lavagem sequencial, após o período de maturação in vitro.
Após 18 a 24 horas de incubação e maturação in vitro dos oócitos, os grupos,
foram submetidos a lavagens sequenciais, ao tratamento com tripsina 0,25%, ou ao
tratamento com antibióticos (Penicilina 10.000 U.I/mL e Estreptomicina 10 mg/mL),
estabelecidos e padronizados pela Sociedade Internacional de Transferência de
14
Embriões (IETS), como métodos de remoção e/ou inativação de microrganismos em
oócitos e embriões (STRINGFELLOW, 1998).
A cada 40 oócitos maturados e contaminados com a L. interrogans, quatro
grupos foram então subdivididos, para serem submetidos aos tipos de tratamentos,
sendo:
- expostos à 30µL do patógeno: 10 oócitos tratados com antibióticos (G1A); 10 oócitos
tratados com tripsina (G1T); 10 oócitos tratados com lavagem sequencial (G1M); 10
oócitos não tratados, sendo controle positivo (G1P);
- controles negativos: 10 oócitos tratados com antibióticos (G2A); 10 oócitos tratados
com tripsina (G2T); 10 oócitos tratados com lavagem sequencial (G2M); 10 oócitos não
tratados (G2P);
Fluxograma 1: representação das divisões e subdivisões dos grupos experimentais de oócitos maturados, para cada
estirpe.
Os tratamentos envolvem 10 gotas de 200 µL cada, sendo 1-4 meio TCM199,
5-6 com Antibiótico (Penicilina 10.000 UI/mL e Estreptomicina 10mg/mL) e 7-10 meio
TCM199. Para as lavagens com tripsina 0,25%, as gotas 5-6 foram substituídas, e
para lavagem sequencial, as 10 gotas continham meio TCM199, trocando a ponteira a
cada etapa do tratamento. Os oócitos foram expostos à tripsina ou antibióticos por 120
segundos, segundo fluxograma 2:
30µL (G1)
G1A
G1T
G1M
G1P
Neg. (G2)
G2A
G2T
G2M
G2P
15
Fluxograma 2: detalhes dos tratamentos utilizados nos diferentes grupos experimentais
3.7. Avaliação da eficácia dos tratamentos
Após as lavagens, os grupos foram transferidos para microtubos devidamente
identificados e observados ao microscópio óptico Jena Zeiss® , com condensador de
campo escuro (MCE) em aumento de 400X, onde foram avaliados quanto à presença
e/ou ausência da L. interrogans. (Fluxograma 3).
16
3.8. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Foram armazenadas as amostras de líquido folicular e oócitos em microtubos,
à temperatura de -20ºC para pesquisa de DNA de leptospira.
Para a extração do DNA das leptospiras dos materiais, foi adicionado 150 µL
de TE (50 mM Tris-HCl e 12,5 mM de EDTA) a 50 µL da amostra, previamente
homogeneizada. Os tubos foram centrifugados a 13000G por 5 minutos, desprezado o
sobrenadante e ressuspendido em 300 µL de tampão de lise (195 µL de água mQ, 60
µL TNE, 30 µL SDS e 15 µLpK a 20 mg/ml). As amostras foram incubadas em banho-
maria a 56°C sob agitação de 350 rpm, por uma hora. Após este período, foi
adicionado 150 µL de fenol tamponado, homogeneizado e centrifugado a 13000G por
5 minutos. 300 µL da fase aquosa foi então transferida para um novo microtubo e
adicionado 100 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), agitado e
centrifugado a 13000G por 5 minutos. Para um novo microtubo, foi então transferido
200 µL da fase aquosa e adicionado 40 µL de acetato de sódio 2 M (1/5 do volume),
480 µL de etanol puro, homogeneizado e mantido a -20°C por 4 horas. Novamente
centrifugado a 13000G por 15 minutos, e descartado o sobrenadante. O pellet
resultante, foi seco em estufa a 45°C por 15 minutos e adicionado 30 µL de TE,
incubado em banho-maria a 56°C sob agitação de 350 rpm por 15 minutos. O produto
final da extração foi então estocado à -20°C (CORTEZ et al., 2001).
A reação foi procedida utilizando-se o DNA extraído com os primers Lep1 e
Lep2 amplificando fragmentos de 330 pares de base (pb). O protocolo de amplificação
de DNA foi empregado em volume total de 50 µL, com 200 µM de cada dNTP, 5 µL de
tampão 10x (500 mM de KCl, 15 mM de MgCl2, 100 mM de Tris – HCl, pH 9,0), 1,5 µL
de MgCl2 a 1,5 mM, 10 pmol de cada primer (Lep1- 5´ GGCGGCGCGTCTTAAACATG
3´; Lep2 – 5´ TTCCCCCCATTGAGCAAGATT 3´), 0,5 U de Taq DNA Polimerase e 10
µL de DNA extraído (MÉRIEN et al, 1992)
As amostras foram submetidas a uma desnaturação inicial de 5 minutos a
95°C, 35 ciclos de 95ºC por 40 segundos, 55ºC por 40 segundos, 72ºC por 40
segundos e extensão final 72ºC por 5 minutos, realizada em termociclador (DIAS et al.,
2006).
17
A análise do produto amplificado foi realizada por eletroforese em gel de
agarose 2%, com tampão de corrida TBE 0,5X (0,045 M Tris-Borato e 1 mM de EDTA
pH 8,0) e o gel submetido à voltagem constante de 6-7 V/cm. O gel foi corado com
brometo de etídeo a 0,5 µg/mL e posteriormente fotografado sob luz ultravioleta
através de transiluminador (320 nm) pelo sistema de foto-documentação e analisado
com software 1D ImageAnalysis (Kodak Digital Science).
Fluxograma 3: Sequencia experimental para avaliação da eficácia dos tratamentos estabelecidos pelo Manual da IETS.
18
3.9. Análise dos oócitos, após os tratamentos, através de microscopia óptica de corte semi-fino.
Tanto os grupos de oócitos expostos à L. interrogans virulenta quanto à
avirulenta, submetidos a todos os tratamentos, foram encaminhados para análise por
microscopia óptica em corte semi-fino.
Após serem submetidos às lavagens com tripsina, antibióticos ou lavagem
sequencial, os oócitos foram envolvidos em agarose 2%, cortados em blocos de
aproximadamente 2 mm3, com auxílio do estereomicroscópio e levados a microtubos
contendo 200 µL de glutaraldeído 2,5% a 4ºC, para sua conservação. Os cortes e
análise foram realizados pelo laboratório de Microscopia Eletrônica – Instituto
Biológico, seguindo o seguinte protocolo:
Três lavagens de 15 minutos em tampão PBS, seguida por pós-fixação em
tetróxido de ósmio 1% em PBS durante 1 hora e três lavagens de 15 minutos em água
destilada. Imersão de 1 hora em uranila a 0,5 em água destilada e novamente três
lavagens de 15 minutos em água. Em seguida, para desidratação, 15 minutos de
lavagem em acetona 50%, depois 15 minutos em acetona 70%, mais 15 minutos em
acetona 90% e finalmente dois banhos de 10 minutos, seguidos por um último de 15
minutos em acetona 100%. Os oócitos foram colocados na resina Spurr e após 72
horas foram cortados com ultramicrótomo em corte semi-fino (2 µm). Essas secções
semi-finas, foram coradas com azul de toluidina a 2% em solução de borato de sódio
1% em água destilada e analisada quanto à morfologia ao microscópio óptico invertido
em aumento de 1000X (PADRÓN, 1998).
19
3.10. Análise dos oócitos, após os tratamentos, através de microscopia eletrônica de transmissão.
Para análise ultra-estrutural os blocos foram seccionados e os cortes ultra-finos
recolhidos em telas de níquel. As telas foram lavadas em BSA com tween 20 em PBS,
pH 7,0, incubadas em cloreto de amônio 5Mm (bloqueando e evitando a ligação
específica de anticorpos em grupamento aldeídico livre presente nas células fixadas) e
lavadas em BSA com tween 20 em PBS, pH 7,0. A seguir as telas foram incubadas
com anticirpo primário 1:80 em PBS/BSA 1 % por 4 horas, lavadas em BSA com
tween 20 em PBS, pH 7,0, incubadas com anticorpo secundário (proteína A-ouro) 1:10
em PBS/BSA 1 %, lavadas em PBS, pH 7,0 e fixadas com glutaraldeído 2,5% em
água. Após lavagem em água as telas foram contrastadas com acetato de uranila e
citrato de chumbo. No início e final do processamento as telas foram tratadas com
metaperiodato de sódio (solução saturada) (KNUTTON, 1995; PADRÓN et al., 1998).
As telas foram examinadas em microscópio eletrônico de transmissão Philips EM208.
3.11. Teste de toxicidade do meio de manutenção da Leptospira spp - EMJH.
O meio de manutenção do patógeno (EMJH) foi testado quanto à alteração no
período de maturação oocitária, devido a possíveis ações dos diversos sais minerais
que compõem a cultura. Durante o período de maturação, acrescentou-se diferentes
volumes de meio EMJH (5 µL, 10 µL e 30 µL) aos oócitos, e levados à estufa de CO2
5% em ar, umidade relativa de 90% e à temperatura de 37°C, por 18 a 24 horas.
Observou-se que não há interferência na maturação, em diversas
concentrações do meio, comprovando que, as alterações observadas na presença da
L. interrogans, ocorreram pela interação patógeno/oócito.
20
3.12. Controle dos oócitos à prévia infecção por Leptospira spp, em hamsters, através de sorologia.
Os oócitos foram avaliados sorologicamente, quanto à presença prévia da
leptospira nas vacas utilizadas. Foram expostos à 30 µL de L. interrogans, sorovar
Grippotyphosa avirulenta, durante o período de maturação, oócitos provenientes de
abatedouro. Após 24 horas, os oócitos foram mantidos em 100 µL de meio de cultura
TCM199, em microtubo, sendo cinco oócitos por tubo.
A inoculação em sete hamsters (Mesocricetus auratus) com 10 dias, peso entre
60 e 80g, ocorreu via intraperitoneal, sendo o conteúdo do microtubo diluído em 100
µL de solução PBS estéril, utilizando-se seringa de 1 mL e agulha calibre 22G. Dois
hamsters foram utilizados como controles negativos, com inoculação de oócitos,
também diluídos, porém, sem contaminação do patógeno.
Após 10 dias de exposição ao patógeno através dos oócitos, coletou-se 1 mL
de soro do animal e foi realizada a prova de soroaglutinação microscópica (SAM), com
uma coleção de culturas vivas de Leptospira spp., sendo um representante de cada
sorogrupo, totalizando 22 variantes sorológicas, apresentadas na Tabela 1, sendo a
SAM uma técnica de referência pela OMS (FAINE et al., 1999).
Cada amostra de soro foi diluída a 1:50 em solução salina tamponada de
Sorënsen (pH 7,4). Desta diluição, 50 µL foram colocados em microplaca de
poliestireno de fundo chato com 96 poços, e acrescidos de 50 µL do antígeno,
obtendo-se diluição inicial 1:100. Cada amostra sorológica foi colocada frente à bateria
antigênica dos 22 sorovares. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica
a 28ºC por três horas. Após este período, as leituras foram realizadas em
microscópico óptico Jena Zeiss®, em aumento de 100X observando-se a formação de
aglutinações.
21
Tabela 1: Relação das espécies de Leptospira, sorogrupos e sorovares que serão empregados como antígenos na
reação de Soroaglutinação Microscópica realizada sob a forma de microtécnica
Observou-se que não houve contaminação prévia dos oócitos, por nenhuma
espécie de Leptospira spp., antes da realização do experimento.
3.13. Análise estatística
A frequência de alterações observadas nos oócitos contaminados com
diferentes estirpes de Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa, após os
tratamentos com tripsina, antibióticos ou lavagem sequencial, foi avaliada por meio de
teste de qui-quadrado (χ2), sendo o nível de significância de p<0,05.
Espécie Sorogrupo Sorovar L. borgpetersenii Ballum Castellonis L. borgpetersenii Javanica Javanica L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi L. borgpetersenii Celledoni Whitcombi
L. interrogans Australis Australis L. interrogans Autumnalis Autumnalis L. interrogans Bataviae Bataviae L. interrogans Australis Bratislava L. interrogans Canicola Canicola L. interrogans Icterohaemorrhagiae Copenhageni L. interrogans Grippotyphosa Grippotyphosa L. interrogans Sejroe Hardjoprajitno L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis L. interrogans Pomona Pomona L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae L. interrogans Djasiman Sentot L. interrogans Sejroe Wolffi L. interrogans Pyrogenes Pyrogenes L. kirschneri Autumnalis Butembo L. kirschneri Cynopteri Cynopteri L. noguchii Panama Panama
L. santarosai Shermani Shermani
22
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação da eficácia dos tratamentos com tripsina, antibióticos e lavagem sequencial
Para os oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar Grippotyphosa
virulenta, na concentração de 4,7x105/ µL, os tratamentos apresentaram, para os
grupos G1T e G1A, 21,7% de eficácia, porém para o grupo G1M apresentou 33,4% de
eficácia (Tabela 2).
Tripsina (T) Antibiótico (A) L. sequencial (M)
G1 21,7 % (39/180) 21,7 % (39/180) 33,4% (60/180)
G2 100 % (160/160) 100 % (160/160) 100 % (160/160)
Tabela 2. Grupos de oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar Grippotyphosa 4,7x105/µL.
Para os oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar Grippotyphosa na
concentração de 6,3x105/ µL, avirulenta, os tratamentos não foram eficazes para os
grupos contaminados (Tabela 3).
Tripsina (T) Antibiótico (A) L. sequencial (M)
G1 0 % (0/160) 0 % (0/160) 0 % (0/160)
G2 100 % (140/140) 100 % (140/140) 100 % (140/140)
Tabela 3. Grupos de oócitos expostos à cepa de L. interrogans sorovar Grippotyphosa 6,3x105/µL
23
Foi utilizado o teste estatístico qui-quadrado (χ2), e verificou-se o valor de
p<0,05 (p=0,0001), havendo significância de efetividade dos tratamentos, entre os
grupos controle e contaminado.
4.2. Avaliação da morfologia dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia de campo escuro
Após os tratamentos com antibiótico, com tripsina ou lavagem sequencial, os
oócitos foram avaliados morfologicamente em microscópio óptico Jena Zeiss ® com
condensador de campo escuro em aumento de 400X.
4.2.1. Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa virulenta
Foi observada uma retração no ooplasma e, o mesmo, apresentou-se
granuloso com coloração castanho escuro, havendo ainda a formação de vacúolos
(Fig. 2) Essas características não foram observadas no grupo controle (Fig. 1).
24
Figura 1: oócitos do grupo controle após
período de maturação, em MCE (400X). Figura 2: oócitos do grupo infectados com
30µL de L. interrogans, em MCE (400X).
4.2.2. Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa avirulenta
Foi observado ooplasma granuloso com formação de vacúolos, para o grupo
contaminado com 30 µL (Fig. 4) o que não foi observado no grupo controle (Fig.3).
Figura 3: oócitos do grupo controle após
período de maturação, em MCE (400X). Figura 4: oócitos do grupo contaminado
com 30µL de L. interrogans, em MCE
(400X)
25
4.3. Avaliação dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia óptica através de corte semi-fino
Após os tratamentos, os oócitos foram avaliados, através microscopia óptica de
corte semi-fino, quanto a presença do patógeno no interior da célula.
Na Figura 5, foram observadas estruturas semelhantes as da leptospira no
ooplasma de oócitos previamente tratados com antibióticos ou tripsina. A zona
pelúcida e as células do cumulus mostram-se sem alteração.
Figura 5: Corte semi-fino de oócito contendo estruturas semelhantes à L. Interrogans (100X), corado com azul de toluidina.
4.4. Avaliação dos oócitos, após os tratamentos, em microscopia eletrônica de transmissão.
A avaliação quanto à presença do patógeno no interior do oócito, foi realizado,
através microscopia eletrônica de transmissão.
26
Nas Figuras 6 e 7, foram observadas estruturas extremamente semelhantes as
da leptospira na zona pelúcida, e penetrando no ooplasma do oócito, previamente
tratado, sem alterações morfológicas nas células do cumulus e zona pelúcida.
Figura 6: Corte de oócitos, em microscopia eletrônica de transmissão, contendo estruturas semelhantes à L. interrogans (4800X). OO: ooplasma; ZP: zona pelúcida; CC: células do cumulus.
Figura 7: Corte de oócitos, em microscopia eletrônica de transmissão, contendo estruturas semelhantes à L. interrogans (7560X). OO: ooplasma; ZP: zona pelúcida; CC: células do cumulus.
27
5. DISCUSSÃO
A PIV, por ser uma importante ferramenta para acelerar e aumentar a produção
de animais geneticamente superiores e, gerar conhecimento nas áreas relacionadas à
oogênese, foliculogênese, fecundação, desenvolvimento embrionário precoce e outras
muitas técnicas aplicadas à reprodução animal, (GONÇALVES et al., 2007), tornou-se
alvo de inúmeras discussões e pesquisas no que diz respeito à qualidade do produto
final, principalmente nas interações e interferências que patógenos podem causar ao
longo do processo, gerando prejuízos no setor pecuário.
A pesquisa com embriões bovinos e, menos extensivamente, com embriões
suínos, ovinos e caprinos, mostra que a TE pode ser um meio seguro e efetivo de
prevenir a disseminação de muitos patógenos preocupantes, no transporte
internacional de material genético, se utilizadas técnicas adequadas e assépticas de
coleta, manipulação e transferência. Talvez, o maior oportunismo para eliminação da
disseminação de doenças, são encontradas em possibilidades de avaliação e
tecnologia que sejam compatíveis com os procedimentos adotados para a coleta e
transferência. Por isso, fatores de diluição, lavagens por meios mecânicos, agentes
antimicrobianos e tratamentos com enzimas podem ser aplicados aos embriões
obtidos in vivo ou in vitro, após a coleta e antes da transferência (STRINGFELLOW,
1998).
A Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) padronizou
procedimentos e inferiu informações gerais para uso da tecnologia de TE, enfatizando
produções sanitárias, por parte da Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), sobre
o manuseio asséptico de oócitos e embriões com os objetivos de descrever técnicas
necessárias para assegurar que a TE não resulte em transmissão de agentes
patogênicos (STRINGFELLOW, 1998).
Os riscos associados com a possível transmissão de patógenos através de
embriões de animais domésticos estão, dessa forma, intimamente ligados com as
propriedades da ZP. Segue-se que, procedimentos para descontaminar a ZP são
importantes e valiosos pontos fortes nos protocolos sanitários de manipulação
propostos pela IETS (WRATHALL; STMOLLER, 1998). Tornou-se rotina lavar os
embriões, pelo menos 10 vezes, com substâncias antimicrobianas que, como enzimas
28
e antibióticos, eventualmente são adicionadas ao meio utilizado para as lavagens
(SINGH; THOMAS, 1987).
Existem evidências de que, oócitos e ovidutos colhidos em abatedouros
comerciais, para a PIV de embriões, podem estar contaminados por agentes
patogênicos (VAN SOON et al., 1992). Em relação à Leptospirose, o animal pode não
estar com sintomatologia clínica, porém seus ovidutos, ovários e oócitos podem
carrear a bactéria, prejudicando assim todos os processos da PIV (BIELANSKI;
SURUJBALLI, 1996).
A Leptospira spp. pode estar presente em sêmen de touros infectados e, já foi
demonstrada a possibilidade de transmissão da leptospirose bovina através da monta
natural ou inseminação artificial (MAGAJEVSKI et al., 2004).
Em nossos resultados, a avaliação da presença da bactéria, em movimento
e/ou interagindo com a célula, em oócitos expostos experimentalmente ao patógeno
no período de maturação in vitro e, posteriormente tratados com antibióticos, tripsina
ou à lavagens sequenciais, foi feita pela técnica de microscopia de campo escuro.
Nos resultados quanto à morfologia, nota-se a retração, granulação do
ooplasma e, por vezes, a formação de vacúolos, devido a presença do patógeno
durante sua maturação, evidenciando sua possível interação, uma vez que, a
formação de vacúolos pode ser um indício de defesa celular, não sendo observada no
grupo controle. Estudos posteriores devem ser realizados avaliando a viabilidade
destes oócitos contaminados e posteriormente tratados, quando submetidos à FIV.
Após a análise morfológica dos oócitos maturados e expostos ao agente
etiológico, verificou-se a eficácia parcial dos tratamentos validados pela IETS,
utilizando-se como parâmetro, a presença da bactéria ativa no campo do oócito. Os
resultados dos grupos, G1T e G1A apresentando 21,7% de eficácia, assim como G1M
com 33,4% de eficácia, para a estirpe virulenta, sugerem que, por se tratar de uma
bactéria não adaptada ao meio de manutenção, não houve tempo para sua
multiplicação e possível infecção ao oócito, o que explica a variação de efetividade dos
tratamentos. O patógeno pode não ter tido tempo hábil para se fixar ao oócito, sendo
então removido mecanicamente, ou mesmo diluído entre as gotas de lavagem.
Para a estirpe avirulenta, adaptada ao meio, os resultados se mostraram
constantes, ou seja, os tratamentos não foram efetivos, provavelmente por sua
adaptação em interagir com o oócito, com as células do cumulus, possibilitando sua
visualização ativa, após os tratamentos.
29
Diversos autores testaram os procedimentos estabelecidos pela IETS,
questionando sua eficácia como, Stringfellow et al. (1990) que, avaliaram a efetividade
dos tratamentos com tripsina para inativação dos vírus IBRV e BHV-4, em 24 e 29
embriões PIV, respectivamente, e verificou que 100% dos embriões foram positivos
para o patógeno, após o tratamento, através do isolamento do vírus por cultivo celular.
Singh e Thomas (1982) constataram que a lavagem sequencial foi eficaz em
64% das amostras e, com o tratamento com tripsina, foi de 57%, para embriões
infectados com IBRV, isolando o agente através de cultivo celular.
Lauerman et al. (1986) publicaram que, de 130 embriões bovinos infectados
experimentalmente com VSV, 36% apresentavam o vírus após a lavagem sequencial,
evidenciado pela ausência do mesmo no isolamento em células de rim de macaco
verde africano (Vero). Em 1987, o experimento de Singh e Thomas, confirmaram que
essa porcentagem é significativa para a lavagem sequencial. Também submeteram 46
embriões ao tratamento com tripsina, onde constatou sua eficácia em 63% das
amostras. Dois anos mais tarde, Stringfellow, Lauerman e Thomson (1989)
comprovam que a eficácia pode atingir 50% dos casos, em oócitos infectados, para
ambos os tratamentos.
Thomson, Stringfellow e Lauerman (1988) realizaram os testes de eficácia do
tratamento com antibióticos e com a lavagem sequencial, para Haemophilus somnus,
contaminando embriões com 1010 UFC/mL. De 38 embriões contaminados, e lavados
sequencialmente, isolou-se a bactéria em 26 deles. Porém, para 20 embriões
contaminados e submetidos ao tratamento com antibiótico, a eficácia atingiu 100% das
amostras.
Bielanski et al. (1989) mostraram que, de 71 embriões bovinos infectados
previamente com Mycoplasma bovis, após a lavagem sequencial, e de 40 embriões
tratados com antibióticos, foi isolado o agente em 100% das amostras, e mesmo após
o tratamento com tripsina, o microrganismo foi isolado em todas as amostras. Também
foi isolado por Riddell, Stringfellow e Panagala (1989) em 100% das amostras, o
Mycoplasma bovigenitalium, sendo os embriões bovinos lavados sequencialmente
(n=24), tratados com antibiótico (n=25) e com tripsina (n=22). Já Rohde et al. (1990)
isolaram Mycoplasma paratuberculosis em oócitos bovinos PIV, após a lavagem
sequencial, em 30% das amostras.
Trachte et al. (1998) apresentaram que, grupos expostos a amostras de BVDV
não citopático, tratados com tripsina e lavados sequencialmente, apresentaram 56%
30
de eficácia para embriões e 33% para oócitos, para o tratamento com tripsina. Porém,
com BVDV citopático, embriões e oócitos apresentaram 67% de eficácia para lavagem
sequencial, 78% de eficácia para o tratamento com tripsina em embriões e 56% em
oócitos. Bielanski e Surujballi (1996) testaram os procedimentos em oócitos coletados
in vivo de novilhas infectadas com BVDV, constatando que os tratamentos não
eliminam ou inativam o patógeno dos oócitos.
Edens et al. (2003) verificaram, através de co-cultivo de embriões expostos à
BoHV-1 em microgotas de TCM199 que, o tratamento com tripsina pode,
efetivamente, impedir a infecção das receptoras. D’Angelo et al. (2009) submeteram
embriões bovinos infectados experimentalmente ao BoHV-1, a tratamento com
tripsina, onde a última gota, inoculada em células de rim bovino (MDBK) foi submetida
à prova de N-PCR, tendo como resultado negativo para a presença do patógeno.
Porém, a detecção do patógeno, pelo mesmo teste, foi positiva para os embriões.
Esses resultados mostraram a ineficácia do tratamento, sendo relevantes a ausência
do patógeno na última gota do tratamento e presença do mesmo no embrião, dando
suporte à premissa de que enzimas proteolíticas diminuem a quantidade de
patógenos, ou, até mesmo, o inativam, desde que já não estejam no interior da
estrutura estudada.
Bielanski e Surulballi (1998) testaram a eficácia das lavagens sequenciais,
através de microscopia eletrônica, em embriões fertilizados in vitro, expostos à
Leptospira borgpeersenii sorovar Hardjo, e observaram que o patógeno encontrava-se
na superfície da ZP. Vale ressaltar que os autores utilizaram uma quantidade
sabidamente excessiva do patógeno, para realmente poder observar sua interação
com o embrião.
Goes et al. (2008) estudaram a eficácia dos tratamentos com tripsina e com
antibióticos na inativação/remoção de Leptospira interrogans sorovar Canicola, em
oócitos, avaliados quanto à presença da bactéria, através de microscopia de campo
escuro, demonstrando que os tratamentos não foram capazes de remover o
microrganismo, enfatizando a necessidade de se estabelecer normas de controle de
qualidade na PIV.
Com a utilização de microscopia óptica de corte semi-fino e microscopia
eletrônica de transmissão, foi constatado que, provavelmente há interação entre a
leptospira e o oócito. Os oócitos levados a tal procedimento, estiveram em exposição
por 24 horas ao patógeno, durante o período de maturação, tratados segundo normas
da IETS e, observou-se estruturas semelhantes às da leptospira no ooplasma dessas
31
células previamente tratadas com antibióticos e tripsina. Uma vez que, possivelmente
as estruturas observadas possam ser leptospiras, pode-se sugerir sua entrada na
células, e, consequentemente a eficácia de todos os tratamentos, torna-se
comprometida.
Sendo a leptospirose uma doença que acomete animais de corte, e a prática
da PIV está em crescimento acelerado mundialmente, a análise dos resultados obtidos
no presente estudo, mostra que a implantação de normativas de controle de qualidade
na produção de embriões in vitro, deve ser estabelecida e principalmente atualizada.
32
6. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que:
A lavagem sequencial mostrou-se mais eficaz, quando comparada aos
tratamentos com tripsina ou antibióticos, para estirpe virulenta de Leptospira
interrogans sorovar Grippotyphosa.
A detecção dos patógenos após os tratamentos, pelas técnicas de microscopia
óptica de corte semi-fino e de microscopia eletrônica de transmissão,
evidenciou a presença de estruturas semelhantes à Leptospira interrogans
sorovar Grippotyphosa, o que nos permite constatar que há interação do
patógeno com o mesmo..
33
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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