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IINNSSTTIITTUUTTOO PPOOLLIITTÉÉCCNNIICCOO NNAACCIIOONNAALL

EESSCCUUEELLAA NNAACCIIOONNAALL DDEE CCIIEENNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS

Diversidad genotípica de

Helicobacter pylori

en pacientes pediátricos

TT EE SS II SS

QQUUEE CCOOMMOO UUNNOO DDEE LLOOSS RREEQQUUIISSIITTOOSS PPAARRAA

OOBBTTEENNEERR EELL GGRRAADDOO DDEE::

MMAAEESSTTRROO EENN CCIIEENNCCIIAASS

QQ UU ÍÍ MM II CC OO BB II OO LL ÓÓ GG II CC AA SS

PP RR EE SS EE NN TT AA ::

SSAANNDDRRAA MMEENNDDOOZZAA EELLIIZZAALLDDEE

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DDRRAA.. SSIILLVVIIAA GGIIOONNOO CCEERREEZZOO

DDRRAA.. NNOORRMMAA VVEELLÁÁZZQQUUEEZZ GGUUAADDAARRRRAAMMAA

SSEECCCCIIÓÓNN DDEE EESSTTUUDDIIOOSS DDEE

PPOOSSGGRRAADDOO EE IINNVVEESSTTIIGGAACCIIÓÓNN

Este trabajo se realiz

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Bacteriología Médica de la

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN con la dirección de la Dra.

Silvia Giono Cerezo y en el Laboratorio de Investigación en Bacteriología

Intestinal. Departamento de Infectología. Hospital Infantil de México

Federico Gómez bajo la dirección de la Dra. Norma Velázquez

Guadarrama.

El trabajo forma parte de los proyectos registrados ante la Dirección de

Investigación con número:

CO/2006/31 “Prevalencia de la resistencia a Claritromicina de

Helicobacter pylori mediada por la detección de la mutación de la

subunidad 23S de rRNA”

HIM/2003/072. Ssa578 “Asociación genotípica de Helicobacter

pylori con estrés oxidativo inducido en pacientes pediátricos y su

correlación histopatológica”

Proyecto SIP: 20100738 “Helicobacter pylori iceA, hopZ, triple

positivas, zona de plasticidad, adherencia, sstIV tfs3e inflamación.

Biofilm en bacterias Gram positivas y negativas resistentes,

causantes de infecciones intrahospitalarias” y SIP-2009-RE/131

(JCYTDF255/09).

Durante la realización de este trabajo fueron otorgadas las becas

CONACyT y PIFI, agradeciendo su apoyo para la culminación del

mismo.

ÍNDICE GENERAL

ABREVIATURAS ii

ÍNDICE DE CUADROS iii

ÍNDICE DE FIGURAS iv

RESUMEN v

ABSTRACT vi

1. INTRODUCCIÓN 1

2. Justificación 27

3. Hipótesis 27

4. Objetivos 28

5. Estrategia de trabajo 29

6. Materiales y Métodos 29

7. Resultados 42

8. Discusión 56

9. Conclusiones 64

10. Apéndice 65

11. Referencias 69

ABREVIATURAS

Abreviatura Significado

ATCC American Type Culture Collection, USA

(Colección Americana de Cultivos Tipo).

BabA Gen que codifica para la adhesina BabA.

cag-PAI

CagA

cagA

cagE

cagT

Isla de patogenicidad de cag.

Proteína A asociada a citotoxicidad de H. pylori.

Gen que codifica la proteína asociada a citotoxina A.

Gen que codifica para el sistema de secreción tipo IV de H. pylori.

Gen que codifica para el sistema de secreción tipo IV de H. pylori.

CMI Concentración Mínima Inhibitoria.

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute (Comité de Estándares

de Laboratorios Clínicos).

DNA Ácido Desoxirribonucléico.

DAR Dolor Abdominal Recurrente.

glmM Gen que codifica para fosfoglucosamina mutasa de H. pylori.

IgA Inmunoglobulina humana A.

IL-8 Interleucina 8.

IS605 Secuencias de inserción.

ORFs Marcos de lectura abiertos.

PBPs Proteínas de unión a penicilinas.

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa.

PPI Bomba Inhibitoria de Protones.

rRNA Ácido ribonucléico ribosomal.

TLR5 Receptor Toll.

tRNA Ácido ribonucléico de transferencia.

VacA

vacA

Proteína A citotóxina vacuolizante de H. pylori.

Gen que codifica para la citotoxina vacuolizante A.

ÍNDICE DE CUADROS

No. de Cuadro TITULO Página

1 Condiciones de PCR para amplificación de las cepas. 33

2 Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes cagA, cagE,

cagT, vacA alelos (s1,s2 y m2),babA2 por PCR individual.

34

3 Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes glmM y vacA

alelo (m1) por PCR individual.

35

4 Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes 23S y 16S por

PCR individual.

39

5 Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes rdxA y frxA por

PCR individual.

39

6 Condiciones de reacción de secuenciación. 40

7 Condiciones de PCR para reacción de secuenciación de los diferentes genes. 40

8 Resistencia y sensibilidad por CMI a cuatro antibióticos empleados en cepas de

Helicobacter pylori.

42

9 Frecuencia de genes, glmM, vacA, cagA, cagE, cagT, babA2 en cepas de

Helicobacter pylori

44

10 Frecuencia de combinaciones alélicas para los genes vacA, cagA y cagE en

cepas de Helicobacter pylori.

45

11 Resistencia vs. genotipo. 45

12 Clasificación de cepas de Helicobacter pylori. 46

13 Genotipos colonizantes vs. pacientes. 48

14 Dos casos reincidentes de infección por Helicobacter pylori. 49

15 Cepas que presentaron resistencia a claritromicina y tuvieron un valor de corte

cercano a la resistencia.

50

16 Cepas que presentaron resistencia a tetraciclina o valor de corte cercano a la

resistencia.

52

17 Cepas de Helicobacter pylori que fueron resistentes, intermedias y sensibles a

metronidazol.

53

18 Cepas de Helicobacter pylori que presentaron los genes rdxA y frxA. 54

19 Mecanismo de resistencia involucrados en cepas de Helicobacter pylori

resistentes a metronidazol.

54

ÍNDICE DE FIGURAS

No. de Figura TITULO Página

1 Prevalencia de Helicobacter pylori en el mundo. 2

2 Modelo generalizado de las alteraciones inducidas por la citotoxina VacA. 4

3 Polimorfismo de VacA. 5

4 Representacion esquemática de la región cag. 6

5 Sistema de secreción de Helicobacter pylori inyectando proteínas

bacterianas dentro del citosol de la célula húesped.

6

6 Interacción entre Helicobacter pylori cagA-positivos y células epiteliales

gástricas.

7

7 Liberación de la urea de Helicobacter pylori. 10

8 Rutas de transmisión sugeridas para Helicobacter pylori. 11

9 Modelo representativo del papel de Helicobacter pylori y otros factores en el

cáncer gástrico.

15

10 Progresión de cáncer gástrico intestinal. 17

11 Molécula 23S rRNA asa del dominio V. 21

12 Modelo especulativo de la evolución y transmisión de Helicobacter pylori. 26

13 Estrategia general de trabajo. 29

14 Distribución de la CMI de 180 cepas de Helicobacter pylori del HIMFG. 43

15 Resultados de cag-PAI en 180 cepas de Helicobacter pylori. 46

16 Red de genotipos. 47

17 Distribución de la CMI a claritromicina en 180 cepas de Helicobacter pylori. 50

18 Alineamiento de secuencias del gen 23s de Helicobacter pylori con cepas

de referencia 26695, J99. Localización de mutación puntual (2142 y 2143).

51

19 Distribución de la CMI a tetraciclina en 180 cepas de Helicobacter pylori . 52

20 Alineamiento de secuencias del gen 16s de Helicobacter pylori con cepas

de referencia 26695, J99. Localización de mutaciones (AGA926-928).

53

21 Electroferograma del corrimiento de gen rdxA de cepas de Helicobacter

pylori.

55

RESUMEN

Helicobacter pylori se adquiere en los primeros años de vida colonizando el

estómago y ocasionando dolor agudo recurrente (DAR) en niños. El tratamiento

involucra antibióticos que son usados en otro tipo de infecciones como claritromicina,

amoxicilina, metronidazol y tetraciclina. Las diferencias genéticas de H. pylori,

desempeñan un papel importante en la infección, principalmente los genes asociados

a la virulencia (cagA, vacA y babA) que determinan el genotipo presente en cada

individuo. Se analizó la diversidad genotípica y mutaciones asociadas a la resistencia

antimicrobiana en aislamientos pediátricos de H. pylori. 180 cepas aisladas por

cultivo de biopsia gástrica de 32 pacientes pediátricos con DAR, se identificaron por

pruebas convencionales, Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y por PCR se

identificaron los genes glmM, cagA, cagE, cagT, vacA (s1, s2, m1, m2) y babA2. Se

obtuvo 93.3% (168/180) resistentes a metronidazol, 1% (2/180) resistentes a

claritromicina y 100% sensibles a amoxicilina y tetraciclina. Ninguna cepa

seleccionada presentó mutación en la posición 2142 y 2143 del gen 23S rRNA de

resistencia a claritromicina y en la posición 926-928 del gen 16S rRNA de resistencia

a tetraciclina. Los genes rdxA y frxA, que participan en la activación del metronidazol

a su forma activa hidroxilamina para matar a H. pylori, estuvieron presentes en

88.3% (158/180) para el gen rdxA, 65.5% (118/180) para el gen frxA y 62.7%

(113/180) con ambos genes. Por lo que la resistencia a Metronidazol se sugiere que

se debió en 16 cepas a la no presencia de los genes rdxA y frxA, 22 a deleciones en

el gen rdxA y 130 a inactivación de uno o de dos genes. Se presento el genotipo

virulento vacAs1m1 cagA+/cagE+ 57.7% (104/180); genotipo vacAs1m1

cagA+/cagE- 10% (18/180); genotipo vacAs2m1 cagA+/cagE+ 4.4% (8/180) el cual

no es común; genotipo vacAs2m2 cagA+/cagE+ 11.6% (21/180); 10.2% presentaron

otros genotipos y 6.1% no fueron tipificables. Dos pacientes presentaron reincidencia

de infección a diferentes tiempos y se confirmó que un mismo paciente puede estar

infectado con más de un genotipo, razón por la cual se hace difícil la erradicación del

microorganismo.

ABSTRACT

Helicobacter pylori is acquired in first years of life to colonize the stomach and

causing recurrent acute pain in children. Treatment involves antibiotics that are used

in other infections such as clarithromycin, amoxicillin, metronidazole and tetracycline.

Genetic differences H. pylori, play an important role in the infection, mainly associated

with virulence genes (cagA, vacA y babA) that determine the genotype present in

each individual. We analyzed the genotypic diversity and mutations associated with

antimicrobial resistance in pediatric isolates of H. pylori. 180 strains isolated by

culture of gastric biopsies of 32 pediatric patients were identified by conventional

tests, Minimum Inhibitory Concentration and by PCR were identified genes glmM,

cagA, cagE, cagT, vacA (s1, s2, m1, m2) and babA2. 93.3% (168/180) were resistant

to metronidazole, 1% (2/180) resistant to clarithromycin and 100% susceptible to

amoxicillin and tetracycline. No selected strain showed no mutation at position 2142

and 2143 of 23S rRNA gene of clarithromycin resistance and the position 926-928 of

the 16S rRNA gene of resistance to tetracycline. Genes rdxA and frxA, that

participate in the activation of metronidazole to its hydroxylamine active form to kill H.

pylori, were present in 88.3% (158/180) for the rdxA gene, 65.5% (118/180) for the

gene frxA and 62.7% (113/180) with both genes. As resistance to metronidazole is

suggested that 16 strains due to non presence of the genes rdxA and frxA, 22 with

deletions in the rdxA gene and 130 to inactivation of one or two genes. The virulent

genotype vacAs1m1 cagA+/cagE+ was present in 57.7% (104/180); genotype

vacAs1m1 cagA+/cagE- 10% (18/180); genotype vacAs2m1 cagA+/cagE+ 4.4%

(8/180) which is not common genotype; vacAs2m2 cagA+/cagE+ 11.6% (21/180);

10.2% had other genotypes and 6.1% were not typeable. Two patients had

recurrence of infection at different times and confirmed that a patient may be infected

with more than one genotype, which is why it is difficult to eradicate the organism.

Diversidad genotípica de Helicobacter pylori en pacientes pediátricos

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades

Helicobacter pylori es un bacilo Gram negativo pleomórfico, clasificado como una

bacteria no invasiva porqué no atraviesa la barrera epitelial, es móvil por la

presencia de cuatro a seis flagelos polares envainados; crece en condiciones

microaerofílicas entre los 3 y 5 días a 37C en primoaislamiento; sus colonias son

translúcidas y miden de 1 a 2 mm de diámetro (Scott et al., 2006).

Su genoma tiene en promedio 1.7 Mbp. con un contenido G+C de 35 a 40%, que

codifica para 1500 proteínas (Suerbaum et al., 2002). Aproximadamente el 40%

de los aislados de H. pylori contienen plásmidos de 23.3 Kb, pero estos no

contienen factores de virulencia reconocidos; además, posee por lo menos dos

operones de cada ácido ribonucléico ribosomal (rRNA) 16S, 23S y 5S (Kuster et

al., 2006).

El humano es el huésped definitivo de H. pylori, más de la mitad de la población

del mundo está infectada con este microorganismo. La infección se adquiere

dentro de los primeros años de vida y se relaciona con la localización geográfica

(Kusters et al., 2006; Cover et al., 2009). La evolución de la infección es muy

variable, la mayoría de los individuos infectados permanecen asintomáticos y solo

del 10 al 20% progresa a gastritis atrófica; de ellos, menos de 3% desarrolla

cáncer gástrico (Fuentes-Panana et al., 2009; Costa et al., 2009).

En países desarrollados, las tasas de prevalencia de infección varían de 1.2% a

12.2%, se considera baja en niños, adolescentes y mayor en adultos y personas

de edad avanzada y en países en vías de desarrollo las tasas son mucho más

altas (80%) (Rajindrajith et al., 2009). El factor principal que predispone a esta

infección es el estado socioeconómico, se ha observado que es mayor entre

aquellos que viven en viviendas hacinadas y pobres (Weyermann et al., 2009). La

prevalencia de H. pylori en el mundo (fig. 1) varía entre 20% a 80%. La menor

prevalencia de la infección se reporta en el Norte de América (Estados Unidos y

Canadá) y Oeste de Europa. Asimismo, la mayor prevalencia se reporta en el


Este de Europa, Asia y en muchos países en vías de desarrollo como México,

donde se reporta del 60 al 80%, en edades que van de 5 a 9 años (Forman et al.,

2004; Frenck et al., 2003; Scott et al., 2006; Azevedo et al., 2007).

Fig. 1. Prevalencia de Helicobacter pylori en el mundo. Tomado de Azevedo et al., 2007.

La Organización Mundial de la Salud clasificó a H. pylori como carcinógeno para

humanos tipo I en 1994 (Logan 1994). En este mismo año el Instituto Nacional de

Salud de Estados Unidos declaró que hay una asociación entre H. pylori y la

enfermedad úlcero péptica (Rajindrajith et al., 2009); además la agencia

internacional de búsqueda de cáncer (IAC), consideró que el 43% de la carga

global de cáncer gástrico pudiera estar relacionado con H. pylori (Forman et al.,

2004).


1.2 Factores de virulencia.

Helicobacter pylori posee factores de virulencia que ayudan a atravesar la mucosa

gástrica, colonizar y permanecer en el estómago humano (Costa et al., 2009).

Citotoxina vacuolizante (VacA)

El gen vacA presenta una copia en todas las cepas de H. pylori,

aproximadamente 50% de las cepas la producen (Sugimoto et al., 2009;

Rajindrajith et al., 2009). La citotoxina VacA de 95 kDa se secreta al espacio

extracelular por un mecanismo de autotransporte tipo V; la toxina tiene una fuerte

tendencia a oligomerizarse en forma de rosetas. Esta se une a la porción apical

de las células epiteliales gástricas y se inserta en la membrana plasmática,

formando un canal selectivo de aniones hexaméricos; que funciona como un tubo

dependiente de voltaje, a través del cual se liberan del citosol de la célula aniones

orgánicos y bicarbonato para obtener el abastecimiento de nutrientes bacterianos

(Montecucco et al., 2001; Suerbauma et al., 2002; Hatakeyama et al., 2006;

Rajindrajith et al., 2009).

La toxina VacA es lentamente endocitada, alcanzando los compartimentos

endosomales, los cuales incrementan su permeabilidad a aniones con un

aumento de la ATPasa vacuolar y el amonio generado de la ureasa, que va a

permitir que el agua fluya y la vesícula se hinche (paso esencial en la formación

de la vacuola). Así mismo, por un mecanismo todavía desconocido la toxina VacA

altera las uniones celulares, incrementa la permeabilidad para adquirir hierro,

níquel y otros nutrientes esenciales para el desarrollo de la bacteria en la mucosa

(fig.2) (Montecucco et al., 2001). La vacuolización celular con formación de poros

permite la entrada de aniones y urea, hay formación de canales de membrana

que causan la liberación del citocromo “C”, mediante la cual se induce apoptosis y

alteración de endosomas y de la función lisosomal (Blaser et al., 2004; Costa et

al., 2009).


Fig. 2. Modelo generalizado de las alteraciones inducidas en la célula epitelial gástrica

por la citotoxina VacA. Tomado de Montecucco et al., 2001.

El gen vacA (fig.3), contiene una secuencia señal de 33 aminoácidos con tres

alelos diferentes (s1a, s1b, y s2), un fragmento COOH-T de aproximadamente 50

kDa que exhibe una similitud al fragmento COOH-T de la inmunoglobulina

humana A (IgA) de Neisseria gonorrhoeae y un segmento llamado región media,

el cual está dividido en m1 y m2 (Sugimoto et al., 2009).

Se ha observado que los genotipos vacAs1/m1 secretan altos niveles de proteína

VacA y son altamente toxigénicos; en genotipos vacAs1/m2 se considera

intermedia y en genotipos vacAs2/m2 está ausente la capacidad citotóxica

(Kusters et al., 2006). Así, el daño a la célula epitelial gástrica es causado por la

vacuolización de la citotoxina (Dundon et al., 2001; Sugimoto et al., 2009).

Urea

Endosoma

Vacuola

Núcleo


Fig. 3. Polimorfismo de VacA. Tomado de Blaser et al., 2004.

Las mutantes VacA- que pueden colonizar en modelos animales al compararlas

con cepas que tienen el gen vacA inactivo; también colonizan y son aisladas de

pacientes, indicando que la proteína VacA, no es esencial para la colonización

(Suerbaum et al., 2002). Además, pacientes con cepas productoras de esta

citotoxina desarrollan úlcera péptica y adenocarcinoma gástrico en forma

frecuente, a diferencia de individuos infectados con cepas que no la producen

(Díaz-Regañon et al., 2006).

Isla de patogenicidad (cag-PAI)

cag-PAI está constituida por un locus adquirido de 40 Kb, el cual está presente

en 50 a 70% de las cepas de H. pylori y se asocia con la expresión de la actividad

citotóxica (Díaz-Regañon et al., 2006; Kusters et al., 2006). La presencia de

secuencias de inserción IS605 pueden interrumpir en dos regiones a la isla en cag

I y cag II (fig.4), que consiste en por lo menos 14 y 16 ORFs (marcos de lectura

abiertos) (Ikenoue et al., 2001; Kauser et al., 2004). Algunas cepas contienen una

isla incompleta cag-PAI (menos de 40 kb en tamaño) y en otras cepas cag-PAI

está completamente ausente (Scott et al., 2006).

gen Región señal

Región media


Fig. 4. Representacion esquemática de la región cag. Tomado de Censini et al., 1996.

Esta isla de patogenicidad está constituida de 31 genes, como el gen cagA de

120-135 KDa que es un marcador de la presencia de cag-PAI (Kusters et al.,

2006; Hatakeyama et al., 2009); este gen codifica para la proteína CagA de

140 kDa. Es altamente inmunogénica y se considera como un marcador de

patogenicidad, ya que su presencia se relaciona con el desarrollo de úlcera

péptica y cáncer gástrico (Tomasini et al., 2003; Giono-Cerezo et al., 2006). La

mayoría de los genes cag-PAI codifican para componentes de un sistema de

secreción tipo IV que funciona como una jeringa molecular que inyecta

lipoproteínas y otros productos bacterianos a la célula epitelial; dicho sistema

cruza la membrana interna y externa de la bacteria y se inserta en la membrana

enterocítica de la célula huésped para inyectar a CagA y posiblemente otras

proteínas de la bacteria en el citosol (fig.5) (Montecucco et al., 2001; Fuentes-

Panana et al., 2009).

Fig. 5. Sistema de secreción de Helicobacter pylori inyectando proteínas bacterianas dentro del citosol de la célula huésped. Imagen modificada de Montecucco et al., 2001.

Célula

huésped

Célula

huésped Membrana

externa

Periplasma

Membrana

interna

Citoplasma


En respuesta a un decremento extracelular de pH, CagA interrumpe el

funcionamiento normal del citoesqueleto y modifica la configuración del epitelio, al

afectar sobre todo las uniones apicales se cree que se podría utilizar por la

bacteria para liberar nutrientes dentro de la célula (Hatakeyama et al., 2006;

Fuentes-Panana et al., 2009).

CagA se transloca a la región intracelular de la célula huésped (fig. 6), se somete

a una fosforilación de tirosina en los sitios EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala), los cuales

están presentes en múltiples copias en la región polimórfica de la porción COOH-

T de la proteína; esta fosforilación es mediada por la cascada de la familia de

tirosin-cinasas SRC (Suerbaum et al., 2002; Hatakeyama et al., 2004;

Hatakeyama et al., 2009).

Fig. 6. Interacción entre Helicobacter pylori cagA-positivos y células epiteliales gástricas. Tomado de Hatakeyama et al., 2004.

Las alteraciones y movimientos que se producen en el citoesqueleto in vitro por

acción de cag-PAI producen cambios en la forma celular, dando lugar a una forma

alargada conocida como fenotipo colibrí (Blaser et al., 2004; Fuentes-Panana et

al., 2009). La perturbación de la vía de señalización inducida por las moléculas

codificadas por cag-PAI ha sido considerada como la causa principal de la

disfunción celular que dirige a la transformación celular (Hatakeyama et al., 2006;

Scott Algood et al., 2006).

H. pylori se agrupa según presente el gen que codifica para la proteína CagA en

cepas: cagA positivas y cagA negativas. Diversos estudios han observado que las

cepas cagA positivas crecen mejor que las cepas cagA negativas; además las

Fosa gástrica

Extracelular

Membrana

celular

Intracelular


cepas que contienen el gen cagA se asocian con una respuesta inflamatoria

exacerbada (Sugimoto et al., 2009; Hatakeyama et al., 2009). El crecimiento

rápido y la respuesta inflamatoria es resultado de la infección y produce desarrollo

de gastritis grave, atrofia de la mucosa, úlcera o cáncer gástrico; se ha observado

que las cepas procedentes de úlcera son 90% cagA positivas. (Díaz-Regañon et

al., 2006; Hatakeyama et al., 2006; Hatakeyama et al., 2009; Sugimoto et al.,

2009).

Los genes cagA, cagE y cagL, tienen la capacidad de inducir la producción de

interleucina 8 (IL-8); la cual es un quimioatrayente de leucocitos que infiltra el

tejido infectado de manera persistente (Fuentes-Panana et al., 2009; Sugimoto et

al., 2009); por otro lado se ha observado que cuando hay deleción del gen cagE,

resulta en una considerable reducción de la producción de IL-8 (Kauser et al.,

2004).

Adhesina BabA

Las proteínas Hop de H. pylori son una familia de proteínas de membrana externa

altamente conservadas y constituidas por 33 miembros que han sido identificadas

como adhesinas, la más estudiada es BabA 78 kDa, que se unen al antígeno del

grupo sanguíneo Lewisb (α-1,3/4 difucosilado) de células epiteliales gástricas de

antro y de células de mucosas superficiales (Ilver et al,. 1998; Gerhard et al.,

1999; Mizushima et al., 2001; Peek et al., 2002; Colbeck et al., 2006). Esta

adherencia protege a la bacteria de la acidificación del lumen gástrico extrema y

del desplazamiento del estómago por fuerzas, tales como el peristaltismo y el

vacío gástrico (Ilver et al., 1998).

Los genes bab pertenecen a una familia de aproximadamente 30 genes cuyos

productos muestran una secuencia de aminoácidos homóloga amplia en los

dominios NH2-T y COOH-T; lo que sugiere que hay una posibilidad de

recombinación y cambios subsecuentes en las posiciones de los genes

individuales (Ilver et al., 1998).

BabA esta codificada por dos genes, babA1 y babA2; pero debido a que hay una

inserción de 10 bp en el gen babA1, únicamente babA2 es considerada


funcionalmente activa (Ilver et al., 1998; Kusters et al., 2006); además, cepas con

el gen babA2 están asociadas con una mayor incidencia de adenocarcinoma

gástrico (Peek et al., 2002). En un estudio realizado por Aspholm-Hurting et al.,

2004, observaron que BabA puede presentar diferencias al momento de unión,

tales como especificidad y fuerza de unión, lo que conlleva a cambios sutiles en la

secuencia de aminoácidos que contribuyen a la divergencia de babA y a su

adaptación con el medioambiente del huésped (Aspholm-Hurting et al., 2004).

Ureasa

La ureasa de H. pylori es una enzima de aproximadamente 540 kDa que contiene

níquel y está formada por un hexámero de 12 subunidades de UreA [27kDa] y 12

de UreB [62kDA] que están codificadas en un operón y arregladas en un anillo

doble de 13 nm de diámetro (Kusters et al., 2006).

La ureasa está asociada con la membrana externa de H. pylori, además la enzima

está localizada casi exclusivamente dentro del citoplasma en cultivos frescos

(fase logarítmica); la cantidad de ureasa producida por la bacteria varía, en

condiciones de cultivo y puede alcanzar mucho más del 10% de la proteína total

de la bacteria (Montecucco et al., 2001; Rajindrajith et al., 2009).

La urea se libera al periplasma a través de un canal evidente y largo y su hidrólisis

genera amonio suficiente que regula el pH del citosol; lo que crea una capa neutra

alrededor de la superficie de la bacteria (fig.7), esta actividad le permite sobrevivir

a corto plazo al microorganismo en el lumen gástrico; además, la producción de

ureasa requiere de un microambiente neutro, el cual se produce por la bacteria

misma (Montecucco et al., 2001; Kusters et al., 2006; Cover et al., 2009;

Hatakeyama et al., 2009; Rajindrajith et al., 2009; Scott et al., 2009).


Fig. 7. Liberación de la urea de Helicobacter pylori. a. micrografía electrónica, b.

representación esquemática. Tomado de Montecucco et al., 2001.

Movilidad

La movilidad de H. pylori es un factor esencial para la colonización, que permite a

la bacteria moverse a través del moco gástrico y alcanzar un pH más neutro; esta

propiedad también le permite a la bacteria resistir las contracciones musculares

que regularmente vacían el estómago (Aguilar et al., 2001).

La bacteria posee de cuatro a seis flagelos polares envainados que son

pobremente reconocidos por TLR5 (receptor que está presente en la superficie de

las células epiteliales gástricas y que reconoce a patrones moleculares asociados

a patógenos PAMPs). Estos flagelos polares consisten de dos tipos, y están

codificados por los genes flaA y flaB. (Scott et al., 2006; Cover et al., 2009).En un

estudio demostraron que ambos genes son esenciales para la completa movilidad

de H. pylori (Yoshiyama et al., 2000).


1.3 Rutas de infección

Se ha observado que el estatus socioeconómico es el determinante más

importante en el desarrollo de la infección de H. pylori en el humano. Este factor

abarca varias condiciones tales como: niveles de higiene, densidad de vivienda,

saneamiento y oportunidad educacional, las cuales han sido identificadas

individualmente como marcadores de la presencia de la bacteria (Azevedo et al.,

2007).

La evidencia epidemiológica y microbiológica señala en gran medida que hay

varias rutas de transmisión aunque algunas solo han sido conjeturadas (fig.8). Sin

embargo, la transmisión de persona a persona se reporta como la más probable

ruta de infección, principalmente debido a la falta de aislamiento de H. pylori en

otros lugares diferentes al tracto gastrointestinal humano. Además, existe la

percepción de que el tránsito lento de la bacteria entre diferentes huéspedes sin

duda es favorable para la bacteria. En una revisión realizada por Azevedo et al.,

2007 identificaron que el hacinamiento doméstico e infección entre miembros de

la misma familia son un factor de riesgo para la transmisión de H. pylori.

Fig. 8. Rutas de transmisión sugeridas para Helicobacter pylori. Tomado de Azevedo et al., 2007.

Lactancia

materna

Iatrogénica

Zoonotica

Ingestión de

carne y leche

Ingestión de

vegetales crudos

Fecal

Transmisión

por agua

Contaminación

animal

Contaminación

de agua

Contaminación

de vegetales


La vía de transmisión de persona a persona abarca las rutas gastro-oral, oral-oral

y fecal oral. La transmisión por leche materna y la ruta iatrogénica también son

incluidas como otras vías alternativas para la diseminación del patógeno. De

acuerdo a los datos anteriores se ha observado que hay por lo menos tres

posibles vectores que mantienen a la bacteria en forma viable: agua, comida y

animales (Azevedo et al., 2007).

Transmisión Gastro-Oral

Se sugiere que la exposición a gotas microscópicas de jugo gástrico durante la

manipulación endoscópica podría explicar porque hay una alta prevalencia de

infección con el microorganismo; la transmisión gastro-oral ha sido postulada

principalmente para niños, entre quienes es común el vómito y el reflujo

gastroesofágico es común (Azevedo et al., 2007).

Transmisión Oral-Oral

La cavidad oral se considera como el reservorio óptimo para la subsistencia de H.

pylori y la transmisión se produce con besos o con contacto de saliva infectada, el

uso de palillos o como sucede en algunos grupos étnicos en donde las madres a

sus bebes les dan la comida pre-masticada (Azevedo et al., 2007). En un estudio

realizado por Dowsett et al., 2003 se detecto a H. pylori en la cavidad oral por la

técnica de PCR; no obstante, estudios llevados a cabo después usando técnicas

similares indican que la cavidad oral no es favorable para la colonización

prolongada de H. pylori; y que esta colonización es solamente transitoria.

Transmisión Fecal-Oral

La ruta fecal-oral para la transmisión es poco probable debido al contacto con la

bilis del humano, durante el paso a través del intestino. Estudios epidemiológicos

parecen apoyar el punto de vista de que esta transmisión es poco común. Sin

embargo H. pylori es capaz de colonizar el duodeno (parte superior del intestino

delgado) en áreas en donde se presenta metaplasia gástrica (Azevedo et al.,

2007).


Lactancia materna

La detección por PCR de H. pylori en leche materna apoya la posibilidad de

transmisión por esta vía, siempre y cuando la bacteria sobreviva en los pezones o

los dedos de la madre; sin embargo, en una revisión realizada por Azevedo et al.,

2007 no encontraron que hubiera una correlación entre la lactancia materna y la

adquisición de H. pylori (Azevedo et al., 2007).

Transmisión Iatrogénica

H. pylori ha sido detectado constantemente por cultivo en endoscopios, después

de su uso en pacientes infectados; pero con los procesos adecuados de

desinfección, se reduce el riesgo o se elimina como mecanismo de transmisión de

este microorganismo (Aguilar et al., 2001; Azevedo et al., 2007).

Transmisión Zoonótica

Estudios epidemiológicos parecen apoyar el papel de los animales en la

adquisición o transmisión de H. pylori, aunque depende del animal en estudio.

Entre los animales más estudiados se encuentran: vacas, ovejas y moscas. En el

caso de las vacas, la ruta de transmisión sospechosa es principalmente por la

ingestión de leche cruda contaminada, la leche podría llegar a contaminarse

cuando la ubre de la vaca está en contacto con las heces en el suelo. Datos

epidemiológicos demuestran que hay una prevalencia frecuente de infección por

H. pylori en pastores y sus familiares que en la población en general. En el caso

de las moscas, la bacteria ha sido recuperada de la superficie externa hasta 12 h

y por más de 30 h en el intestino y en excremento (Aguilar et al., 2001; Azevedo

et al., 2007).

Ingestión de agua

La presencia de la bacteria en agua, biopelículas, ríos y redes de distribución de

agua ha generado que se implementen métodos moleculares de detección tales

como PCR y ensayos inmunológicos. Sin embargo, cuando se suspende en agua,

H. pylori tiene muy poco tiempo de viabilidad comparada con otros patógenos

(Aguilar et al., 2001). En una revisión realizada por Azevedo et al., 2007

reportaron que los tiempos de viabilidad son menores de 10 h para H. pylori a

temperaturas por arriba de 20° C comparada Escherichia coli y Salmonella


typhimurium cuyos tiempos de viabilidad son de más de 40 días a la misma

temperatura.

Ingestión de comida

Por lo menos hay dos estudios epidemiológicos en donde encontraron que hay

una relación entre el consumo de vegetales crudos y la transmisión de H. pylori; lo

anterior es debido a que los vegetales crudos son lavados o irrigados con agua

contaminada. Es importante tener en cuenta que en esta ruta se asume que H.

pylori es capaz también de sobrevivir en agua y, por lo tanto; los problemas de

infección pueden estar asociados con esta ruta de transmisión como posible

(Aguilar et al., 2001; Azevedo et al., 2007).

La leche es otro tipo de comida que ha sido implicada como vehículo para

estudios de transmisión de H. pylori. Contanza et al., 2004, correlaciono que la

infección con la ingesta de productos de leche en México. A la inversa un estudio

epidemiológico realizado en Italia reporto que hay una correlación inversa entre

consumo de leche y la prevalencia de infección por H. pylori; la diferencia

obtenida entre ambos estudios puede ser debida a la calidad microbiológica de la

leche entre estos dos países (Azevedo et al., 2007)


1.4 Patologías

H. pylori posee características que le permiten colonizar la mucosa gástrica, por lo

cual la historia natural de la infección puede evolucionar de una mucosa normal

hasta la generación de cáncer gástrico (Fig. 9).

Fig. 9. Modelo representativo del papel de Helicobacter pylori y otros factores en el cáncer gástrico. Tomado de Kusters et al., 2006.

Dolor Abdominal Recurrente (DAR).

El dolor abdominal recurrente es un síndrome de etiología multicausal, que se

puede asociar a patología orgánica o trastornos funcionales. El DAR constituye un

motivo relativamente frecuente de consulta pediátrica de primer contacto y es

particularmente importante en la consulta del gastroenterólogo pediatra (Larrosa-

Haro et al., 2004).

La presencia de H. pylori en la mayor parte de los niños infectados, no se asocia a

enfermedad clínica aparente, a pesar de la presencia de gastritis crónica activa,

aunque a la fecha es controversial la participación de H. pylori como agente

causal de DAR en niños. En un consenso de la North American Society for

Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, se recomendó el

tratamiento de erradicación siempre y cuando se demuestre que hay infección

activa por H. pylori asociada a enfermedad gastrointestinal sintomática (Larrosa-

Haro et al., 2004).

Mucosa normal

Gastritis activa crónica

Gastritis atrófica

Metaplasia intestinal

Displasia

Cáncer gástrico

Respuesta

inmune, dieta,

gastrina, genética

del huésped

Carcinogénesis


Gastritis atrófica H. pylori induce gastritis, la cual es una inflamación activa dentro de la mucosa

gástrica e involucra la presencia de células polimorfonucleares, linfocitos (células

B y T), macrófagos y células plasmáticas (Peek et al., 2002).

H. pylori también induce gastritis atrófica, que es una lesión que se caracteriza por

la muerte de las células parietales, con pérdida del epitelio glandular que recubre

la mucosa del estómago. En este proceso participan tanto el agente infeccioso

dañando el tejido; como la reacción inmunitaria; de esta forma se reclutan a

células del sistema inmunitario en el sitio de infección que median la muerte

celular, de tal modo que se perpetúa el daño (Fuentes-Panana et al., 2009).

En una revisión se demostró que en el estómago de más del 50% de la población

adulta del mundo está infectado por H. pylori, que puede producir gastritis en

todos los sujetos infectados (Konturek et al., 2006).

Cáncer gástrico.

El cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en el mundo, con

aproximadamente 930,000 nuevos casos diagnosticados cada año y es la

segunda causa de cáncer relacionado a muertes, con aproximadamente 700,000

muertes (Hatakeyama et al., 2009). En México, en las últimas décadas se ha

informado que ha habido un incremento de 4.43 a 9 casos por cada 100,000

habitantes. En muchos casos el cáncer gástrico se diagnostica entre los 50 y 70

años, pero en personas jóvenes es frecuente verlo en familias con riesgo

hereditario (Fuentes-Panana et al., 2009).

La carcinogénesis resulta de la acumulación de cambios genéticos con disfunción

de los mecanismos celulares que mantienen la integridad normal del genoma.

Machado et al., 2009, observaron que cuando hay una desregulación en la

reparación del DNA con decremento de los componentes de reparación durante la

infección de H. pylori, esto permite la acumulación de inestabilidad genética en el

epitelio gástrico, así se produce la alteración en el balance entre la proliferación


celular y la apoptosis durante la infección que pueden promover la carcinogénesis

gástrica (Machado et al., 2009).

Estudios recientes han relacionado que la infección con H. pylori cagA-positivos,

juega un papel esencial en el desarrollo de cáncer gástrico intestinal y difuso y

sobre todo con el cáncer distal, además aislados clínicos con la variante

vacAs1m1 son lo que más se vinculan con esta patología (Fuentes-Panana et al.,

2009; Hatakeyama et al., 2009).

La cadena de eventos que ocurre durante el desarrollo del cáncer gástrico

intestinal (fig.10), involucra que hay una transición de una mucosa normal a una

gastritis superficial crónica, la cual conducirá a una gastritis atrófica, metaplasia

intestinal y finalmente a displasia y adenocarcinoma (Peek et al., 2002).

Fig. 10. Progresión de cáncer gástrico intestinal. Modificado de Peek et al., 2002.

Presencia de

la isla cag

Alta expresión

del alelo IL-1β

Mucosa no

colonizada Gastritis

superficial Gastritis

atrófica Metaplasia

intestinal Displasia Adenocarcinoma

gástrico


1.5 Tratamiento

Al igual que otras infecciones bacterianas el éxito del tratamiento a la infección

por H. pylori, dependerá del uso de antibióticos a los cuales el organismo sea

susceptible (Sugimoto et al., 2009). El tratamiento ideal para esta infección, es el

que consigue tasas de erradicación superiores a 90%, de corta duración para

asegurar el cumplimiento y con mínimos efectos secundarios (Martínez et al.,

2001; Perdomo et al., 2002).

La terapia triple es considerada el estándar para el tratamiento en niños y adultos

(Sun Wei-Hao et al., 2005; Rajindrajith et al., 2009). Metronidazol, subsalicilato de

bismuto o subcitrato de bismuto y amoxicilina durante 14 días, es capaz de

erradicar la infección por H. pylori en 70 a 95% de los pacientes (García-Campos

et al., 2003; Steven et al., 2005). La respuesta a esta terapia se ve influida por su

duración y en dos semanas se obtienen mejores resultados (Martínez et al., 2001;

Rajindrajith et al., 2009).

Durante la infección se ha observado hiperclorhidría, por lo que el empleo de la

bomba inhibitoria de protones (PPI), tales como omeprazol, polprazol,

lanzoprazol, pantoprazol, esoprazol y otros poderosos inhibidores de la secreción

de ácido gástrico (Konturek et al., 2006), resultan en un tratamiento de

erradicación efectivo y el esquema se completa con diferentes antibióticos como

la claritromicina, amoxicilina, metronidazol (Frenck et al., 2003; Steven et al.,

2005). Recientemente se planteó el uso de ciprofloxacina, moxifloxacina,

levofloxacina, rifabutina y furazolidona que parecen prometedores contra la

infección en pacientes que albergan cepas resistentes a metronidazol (Gerrits et

al., 2006; Kusters et al., 2006).


1.6 Resistencia antimicrobiana

H. pylori es susceptible a muchos antibióticos in vitro, aunque solo unos pocos

pueden ser usados in vivo para curar la infección. La falta de actividad in vivo, se

debe por la combinación de factores, como la incapacidad del antibiótico de lograr

niveles apropiados en el moco gástrico, inactivación del antibiótico por pH bajos y

el lento crecimiento del microorganismo (Gerrits et al., 2006). Además los

antibióticos empleados en la erradicación de la infección frecuentemente son

utilizados para otro tipo de infecciones, por lo que es muy común que la mayoría

de los pacientes que ya estuvieron en presencia de por lo menos alguno de estos

antibióticos; dan lugar a la presencia de cepas resistentes que pueden ser la

causa de fallas al tratamiento.

En H. pylori, el estudio de los mecanismos de resistencia a los antibióticos se

basa en mutaciones puntuales principalmente, localizadas en el cromosoma de la

bacteria. La resistencia a los antibióticos es desarrollada de novo fácilmente,

aunque la transferencia horizontal de genes por transformación natural no puede

ser excluida entre cepas susceptibles y resistentes (Gerrits et al., 2006).

Betalactámicos

Hasta el final del siglo 20 la resistencia a penicilinas (amoxicilina) era muy rara en

H. pylori; sin embargo, en una revisión observaron que la incidencia de

resistencia a amoxicilina parece incrementarse en regiones geográficas en donde

el antibiótico pueden obtenerse sin prescripción médica (eg, Italia, Brazil, El

Salvador, India, Lituania), pero en general la prevalencia de resistencia a

amoxicilina varía entre 1% y 2% (Gerrits et al., 2006).

La amoxicilina es un antibiótico betalactámico, semisintético, que pertenece al

subgrupo de las aminopenicilinas y el más usado para la erradicación de H. pylori,

ya que funciona bien en el jugo gástrico y muestra un incremento en su

estabilidad en condiciones ácidas comparada con otras penicilina (Calderon

2001; Gerrits et al., 2006).


Los antibióticos betalactámicos, son agentes bactericidas que inhiben la síntesis

de la pared celular bacteriana e inducen además un efecto autolítico, ya que se

unen a proteínas de unión a penicilinas (PBPs) (Gerrits et al., 2006). La

destrucción de la pared celular bacteriana se produce como consecuencia de la

inhibición de la última etapa de la síntesis del peptidoglucano; de este modo la

pared queda debilitada y puede romperse por la presión osmótica intracelular

(Martin 2003).

Al igual que todos los betalactámicos, la amoxicilina es susceptible de ser

inactivada por enzimas betalactamasas, que serán capaces de hidrolizar el anillo

betalactámico y transformarlo en un anillo penicilinoico sin actividad

antimicrobiana (Calderon 2001).

La resistencia antimicrobiana en H. pylori parece ser mediada principalmente por

cambios mutacionales o adyacentes a motivos secundarios y terciarios de

PBP1A, éstos cambios reducen la permeabilidad de la membrana o el flujo activo

de la amoxicilina, lo que contribuye que se generen altos niveles de resistencia

(Gerrits et al., 2006).

Macrólidos

La prevalencia de la resistencia a macrólidos es mucho más baja que la

resistencia a nitroimidazoles (Gerrits et al., 2006). La claritromicina es un

antibiótico bactericida que pertenece al grupo de los macrólidos, con un anillo de

beta lactona en los cuales la eritromicina es el macrólido más sencillo. La

claritromicina es capaz de entrar a las células eucariotas, y se emplea en el

tratamiento de la infección por H. pylori, se absorbe mejor en el moco gástrico y

es estable en condiciones ácidas (Gerrits et al., 2006). La claritromicina se da en

asociación con un segundo agente antimicrobiano, como amoxicilina o

componentes nitroimidazoles y una droga antisecretora (Megraud 1998; Lai et

al., 2006).


El mecanismo de acción de la claritromicina es bactericida porque interfiere en la

síntesis de proteínas, fijándose a la subunidad 50S ribosomal que resultando en

un decremento de la afinidad de los componentes del ribosoma (González-Piñera

et al., 1998; Vallejos et al., 2003; Gerrits et al., 2006; Ahmad et al., 2009).

La resistencia a claritromicina es causada por mutaciones puntuales en el gen 23s

del rRNA, por lo menos cinco distintas mutaciones puntuales han sido reportadas

(van Doorn et al., 1999). Versalovic et al., 1996, encontraron dos transiciones

A G (A2142G y A2143G) y una transversión A C (A2142C) (fig.11). Hulten et

al., 1997, describieron dos mutaciones en G2115 A y G2141 A. Se han

observado también otro tipo de mutaciones en H. pylori como: A2515G, T2717C,

A2116G, A2144T, T2182C, G2224, T2127C, C2245T y T2289C (van Doorn et al.,

2001; Fontana et al., 2002; Gerrits et al., 2006; Ahmad et al., 2009).

Fig. 11. Molécula 23S rRNA asa del dominio V. Tomado de Taylor et al., 1997.

Asa del dominio V

de 23S


Tetraciclinas

Hasta el final del siglo pasado solo había unos pocos reportes que fueron

publicados de resistencia a tetraciclina que es un antibiótico bacteriostático

derivado de la naftacenocarboxamida policíclica de amplio espectro; sin embargo,

en los últimos años se ha observado mayor incidencia de la resistencia aunque,

en general, la prevalencia de la resistencia a tetraciclina se estima que es inferior

de 1% (Gerrits et al., 2002; Gerrits et al., 2006).

Hay cuatro mecanismos principales por los cuales la bacteria llega a ser

resistente a tetraciclina. Las bombas de flujo de expulsión activa de tetraciclina

que están ampliamente diseminadas en la bacteria, se localizan en plásmidos

transmisibles y transposones. Estas bombas son solo subunidades que contienen

múltiples segmentos transmembranales y son específicos para el transporte

activo de tetraciclina (Trieber et al., 2002).

La resistencia a tetraciclina en muchas bacterias es debida al flujo de energía-

dependiente de un complejo de cationes de tetraciclina a través de la membrana

celular por un flujo de proteínas asociada a la membrana. La exportación de

tetraciclina de la célula reduce su concentración intracelularmente y protege a los

ribosomas de ella. El segundo mecanismo de resistencia a tetraciclina es mediada

a través de proteínas de protección ribosomal (Tet O), estas proteínas

citoplásmicas confieren resistencia por reducción de la afinidad de ribosomas a

ella o por la liberación del antibiótico del ribosoma (Gerrits et al., 2002; Trieber et

al., 2002).

Además, de los mecanismos de resistencia previamente mencionados; se han

descritos otros dos, uno basado en la inactivación enzimática de la tetraciclina por

el producto de TetX en presencia de oxígeno y NADPH, y el segundo que se

origina por mutaciones en el gen 16S rRNA, que bloquea el sitio de unión del

aminoacil-tRNA del sitio A del ribosoma; por lo tanto, se bloquea la síntesis de

proteínas y el crecimiento de la bacteria (Dailidiene et al., 2002; Gerrits et al.,

2002; Gerrits et al., 2003; Glocker et al., 2005); lo que ocasiona la resistencia a

tetraciclina por mutaciones individuales o de triple substitución de pares de bases

en AGA926-928 TTC (correspondiente a 965 a 967 bp. de E. coli 16S rRNA), en


ambas copias del gen 16S rRNA (Gerrits et al., 2002; Gerrits et al., 2003; Glocker

et al., 2005).

Nitroimidazoles

La resistencia a nitroimidazoles es la forma más común de resistencia

antimicrobiana en H. pylori. Metronidazol y tinidazol son los más usados

frecuentemente en el tratamiento. En países desarrollados, cerca del 10 al 50%

de las cepas son resistentes, mientras que en países en vías de desarrollo la

resistencia es mucho más alta (Marais et al., 2003). La diferencia en la

prevalencia podría ser causada por el uso común del metronidazol para el

tratamiento de enfermedades relacionadas a parásitos, mientras que en países

desarrollados estos son principalmente usados para tratamiento de infecciones

ginecológicas y dentales (Gerrits et al., 2006).

Los nitroimidazoles son liberados en el jugo gástrico activamente y su actividad

antimicrobiana es afectada por pH bajos únicamente; éstos se dan como una pro-

droga que necesita ser activada dentro de la célula blanco, por un proceso de

transferencia de 1 o 2 electrones, esta reducción permite la formación de

radicales nitro-anión e imidazoles intermediarios (Gerrits et al., 2006).

Metronidazol [1-2-hydroxietil-2-metil-5-nitroimidazol] es un agente sintético

antimicrobiano y antiparásitario, que fue inicialmente usado contra una gran

variedad de microorganismos anaerobios y para el tratamiento de infecciones

provocadas por Trichomonas vaginalis, pero más tarde se encontró que tenia

actividad contra ciertos organismos microaerofílicos tales como H. pylori

(Bendesky et al., 2001; Gerrits et al., 2004; Moore et al., 2005). El metronidazol

tiene su acción antibacteriana por modificaciones en el DNA, tras ingresar en la

célula mediante difusión pasiva y se reduce por proteínas del metabolismo

anaerobio; proteínas relacionadas con el transporte de electrones de bajo

potencial redox. El metronidazol reducido, altera la estructura helicoidal del DNA,

con ruptura de la cadena e inhibición de la síntesis de ácidos nucléicos con

muerte celular (Bendesky et al., 2001; Hermida 2001).


El desarrollo de resistencia a metronidazol en H. pylori está asociada con

mutaciones sin sentido (deleciones o inserciones) en el gen rdxA que codifica

para una nitroreductasa NADPH oxigeno-insensible y aumenta por mutaciones en

el gen frxA que codifica para una NAD(P)H flavino oxidoreductasa que activan al

metronidazol, haciéndolo un agente bactericida y mutagénico (probablemente

hidroxilamina) (Alarcón et al., 2001 ; Kalach et al., 2001; Wong et al., 2001; Marais

et al., 2003; Gerrits et al., 2004; Moore et al., 2005).

Las cepas de H. pylori pueden seleccionar la población resistente por tres vías:

(1) tipo I, inactivación del gen rdxA, (2) tipo II, inactivación de ambos genes rdxA y

frxA, (Jeong et al, 2001) (3) tipo III, inactivación de frxA solamente. La alteración

solamente del gen rdxA puede producir la resistencia a metronidazol; en todos los

niveles y las mutaciones en el gen frxA pueden aumentar los niveles de

resistencia de las cepas tipo I; estas alteraciones genéticas generan paros

prematuros en la síntesis de la proteína (Maggi et al., 2000; Marais et al., 2003).


1.7 Diversidad

La diversidad genética es la variación en la composición de la información

genética contenida en todas las especies vivientes. H. pylori se caracteriza por

tener un alto nivel de diversidad genética, que se atribuye a la deriva génica y a la

transferencia horizontal de genes, la cual es importante para la adaptación en el

estómago humano y para los resultados clínicos de la infección; por consiguiente

cada huésped se coloniza por más de una clona, con determinados genotipos

dominantes (Blaser et al., 2004; Giono-Cerezo et al., 2006).

La diversidad de H. pylori puede ser considerada como una evidencia de que hay

versatilidad poblacional, capaz de maximizar los recursos de utilización en una

variedad de nichos, que son colonizados por sub-poblaciones las cuales van a

maximizar el éxito reproductivo permitiendo la colonización y evitar problemas en

el huésped; tales problemas incluyen producción de inmunidad adaptativa, el

desarrollo de cambios en el epitelio gástrico, la acidificación y la disponibilidad de

nutrimentos (Blaser et al., 2004).

Las diferencias en el contenido de genes entre aislados de H. pylori en pacientes

mexicanos con varias patologías gástricas, incluyendo cáncer, muestran genes

asociados a la enfermedad; además la plasticidad de su genoma se da por

competencia natural, transformación por DNA exógeno, mutaciones y

recombinaciones que se han propuesto como mecanismos de adquisición y

pérdida de genes; todo esto da lugar al origen de una extensiva diversidad alélica

que se presenta en huésped único (Blaser et al., 2001; Salama et al., 2007;Costa

et al., 2009).

En infecciones mixtas, se ha observado que cepas de un mismo paciente son

diferentes entre sí y algunas son más parecidas a cepas aisladas de otros

pacientes; también durante estas infecciones mixtas, las cepas pueden

recombinar y reemerger con diferentes combinaciones de genotipos (Prouzet-

Mauleon et al., 2005).


Un modelo el cual podría explicar la evolución y transmisión de H. pylori asume

que cepas cagA+, vacA+, babA+ representan un “estado de bienestar máximo” y

la activación de algunas de estas funciones disminuyen el estado físico de la

bacteria (fig.12). Durante muchos años, la bacteria vive en el estómago de cada

individuo y constantemente genera cag o vacA o babA. Los múltiples derivados

defectuosos que en algunos casos pueden superar a la bacteria silvestre, pueden

hacer que cag+ y cag- pueden ser aisladas del mismo paciente. Sin embargo,

estos derivados defectuosos no pueden sobrevivir durante largo tiempo; y por lo

tanto, representan la desaparición de algunas ramas del árbol evolutivo. En

conclusión, solamente la cepa silvestre, si es eficiente en la colonización a largo

plazo y participa en la transmisión de persona a persona es la que perdurará y por

lo tanto, es la que dirige la evolución (Montecucco et al., 2001; Prouzet-Mauleon

et al., 2005).

Fig. 12. Modelo especulativo de la evolución y transmisión de Helicobacter pylori. Tomado

de Montecucco et al., 2001.

Infección

Siguiente generación infectada


2. JUSTIFICACIÓN

Enfermedades asociadas a la infección por Helicobacter pylori son un problema

de Salud Pública, sobre todo en países en vías de desarrollo. En México la

infección se presenta en más de 70% en niños de hasta 10 años. Asimismo,

frecuentemente existen recaídas frecuentes del tratamiento; razón por la cual, es

necesario hacer estudios epidemiológicos para evaluar el perfil de susceptibilidad

y analizar los factores de virulencia en dichos aislamientos, para establecer

opciones terapéuticas en la comunidad pediátrica, teniendo en cuenta que podría

existir alguna mutación aún en cepas sensibles; y es por ello necesario revisar los

puntos de corte de resistencia para pacientes pediátricos y considerar cual es el

genotipo que pudiera estar asociado a patologías gástricas, incluyendo las triples

positivas.

3. HIPÓTESIS Si las cepas de Helicobacter pylori de una población infectiva de pacientes

pediátricos presentan una resistencia al metronidazol mayor del 70%, entonces se

espera una mayor prevalencia de los genotipos virulentos como vacAs1m1

cagA+/cagE+ entre las cepas.


4. OBJETIVO GENERAL Analizar la diversidad genotípica y las mutaciones asociadas a la

resistencia antimicrobiana en aislamientos pediátricos de Helicobacter

pylori.

4.1 OBJETIVOS PARTICULARES Evaluar el perfil de susceptibilidad antimicrobiana a amoxicilina,

claritromicina, tetraciclina y metronidazol.

Analizar la diversidad genotípica de la población de cepas de H. pylori

aisladas de pacientes pediátricos.

Identificar mutaciones del gen 23S del rRNA de resistencia a

claritromicina, del gen 16S del rRNA de resistencia a tetraciclina.

Identificar la presencia de los genes rdxA y frxA asociados con la

resistencia a metronidazol.


5. ESTRATEGIA DE TRABAJO

Figura 13. Estrategia general de trabajo. 6. MATERIAL Y MÉTODOS

Treinta y dos cultivos primarios de Helicobacter pylori fueron obtenidos de

biopsias gástricas de pacientes pediátricos con dolor agudo recurrente (DAR), sin

tratamiento dos semanas antes de la toma de la biopsia y con el consentimiento

de sus padres, a partir de ellos se aislaron 180 cepas de H. pylori provenientes de

32 cultivos primarios. La cepa ATCC 43504 de Helicobacter pylori fue utilizada

como referencia en este estudio.

Identificación de mutaciones Claritromicina Tetraciclina Metronidazol

23S 16S rdxA y frxA

Obtención de cultivo primario de H. pylori a

partir de biopsia gástrica

Aislamiento de cepas puras de H. pylori

1

er Objetivo

2

do Objetivo

3er

y 4to

Objetivo

Caracterización genotípica de genes de virulencia por PCR de cagA, cagE, vacA, babA, cagT.

Perfil de susceptibilidad por Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI)


6.1 Cultivo bacteriano a partir de biopsias gástricas

Las muestras de biopsia gástrica se colectaron en caldo Brucella suplementado

con suero de caballo 10% y fueron transportadas al laboratorio del HIMFG en un

tiempo no mayor de 3 h (apéndice).

Las muestras se maceraron en un mortero de vidrio esmerilado, ocupando caldo

Brucella, el material macerado se inoculó en placas de gelosa base de Casman

suplementado con sangre de caballo 7.5% con y sin antibiótico (apéndice) para

disminuir el sobrecrecimiento de cualquier biota competitiva. Las placas se

incubaron a 37C por 3- 5 días en atmósfera parcial de CO2.

6.2 Identificación bacteriana

La identificación bacteriana se realizó por morfología colonial, a partir de placas

con gelosa base de Casman con sangre de caballo al 7.5% y suplemento

antimicrobiano. Las placas se incubaron en un ambiente microaerofílico de 3 a 5

días a 37C en atmósfera parcial de CO2; se seleccionaron colonias típicas

circulares, elevadas, borde entero, grisáceas como “gotas de rocío”.

A partir de las colonias seleccionadas se realizó la tinción de Gram, en donde se

pudo observar los morfotipos de H. pylori como bacilo Gram negativo cuya forma

característica es en “ala de gaviota” o en forma de “s”. Se realizó la prueba de

ureasa con medio de urea (apéndice), inoculando un tubo de cada cepa,

observando el cambio de color del indicador rojo de fenol de ácido (amarillo) a

alcalino (rosa mexicano) indicativo de la hidrólisis de la urea por la enzima ureasa

de H. pylori. También se utilizó la prueba de catalasa y oxidasa (apéndice).

6.3 Aislamiento de cepas por cultivo

Las cepas obtenidas se sembraron en gelosa base de Casman con sangre de

caballo 7.5%, para obtener colonias aisladas, se incubaron a 37ºC por 3 días en

atmósfera parcial de CO2. Después de la incubación con ayuda de una asa

bacteriológica se picaron 5 colonias aisladas de cada cepa, para posteriormente

sembrarlas en una caja de gelosa base de Casman con sangre de caballo 7.5%

que se incubo a 37ºC por 3 días en atmósfera parcial de CO2. La clasificación


numérica de las cepas se realizó dando un número progresivo del 1 al 5 por cada

niño a partir de la biopsia (por ejemplo cepa 24: 241, 242, 243, 244, 245).

6.4 Conservación de las cepas

De cada cepa aislada se sembró en forma masiva tres cajas de gelosa base de

Casman, posteriormente se cosecho la biomasa para ser conservada en criotubos

de 1.5 mL. Cada criotubo contenía 800 L de caldo Brucella con suero fetal

bovino al 10% y 25% de glicerol. Los criotubos se conservaron en congelación a

-70C (apéndice).

6.5 Ensayos de susceptibilidad a los antimicrobianos

6.5.1 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) por dilución

seriada en placa de agar con replicador de “Steers” (CLSI 2009)

Se determinó la CMI para amoxicilina, metronidazol, claritromicina y tetraciclina

empleando la dilución seriada en placas de agar con replicador de “Steers”, se

empleó la cepa de referencia ATCC 43504 de Helicobacter pylori.

Las cepas se descongelaron y se crecieron en cajas de gelosa base de Casman

con sangre de caballo 7.5% en atmósfera parcial de CO2 de 3 a 5 días a 37C. Se

cosechó el crecimiento en caldo Mueller Hinton y se ajusto la suspensión

bacteriana al tubo 2.0 del nefelómetro de MacFarland con una concentración de

bacterias 1x107 – 1x108 UFC/ mL.

Las diluciones del antimicrobiano seleccionado se adicionaron en las placas de

gelosa base de Mueller Hinton con 10% de sangre de caballo (apéndice) a las

diferentes concentraciones. Para la replicación se ocupo 1ml de la suspensión

bacteriana ajustada al 2.0 de MacFarland de cada cepa en los diferentes pozos

del replicador “Steers” colocando cuidadosamente la parte superior del replicador

(tapa) para poder llevar a cabo la replicación (por duplicado), se incubaron las

placas en atmósfera parcial de CO2 de 3 a 5 días a 37C.


6.5.2 Lectura de resultados y valores de corte

La CMI es la concentración más baja del antibiótico en donde se inhibe el

crecimiento aparente del 99% de las bacterias. En la dilución seriada en placa con

el replicador de “Steers”, la CMI está indicada por la placa con menor

concentración de antibiótico que no presentó crecimiento de la cepa.

Los valores de corte para considerar a las cepas sensibles o resistentes a los

antimicrobianos fueron los siguientes: Amoxicilina: resistente 4 g/mL (Torres et

al., 2001), Metronidazol: Resistente (baja resistencia >8 µg/mL, moderada

resistencia 32 a 64 µg/mL, alta resistencia 128 µg/mL (Kwon et al., 2000; Kwon et

al., 2001; Poon et al., 2009); Intermedia 2 a 4 µg/mL (Maggi et a., 2000);

Susceptible <2 µg/mL (Maggi et al., 2000), Claritromicina: resistente 1 g/Ml

(Kobayashi et al., 2001; CLSI 2009), Tetraciclina: resistente 4 g/ml (Gerrits et

al., 2003).

6.6 Identificación de genes por técnicas moleculares en cepas de Helicobacter

pylori

6.6.1 Extracción de DNA genómico en cepas

La extracción de DNA de H. pylori se hizo a partir de un cultivo bacteriano

siguiendo la metodología descrita en el kit del Wizard Purification Genomic DNA

(Promega).

6.6.2 Caracterización genotípica en aislamientos de Helicobacter pylori

Se realizó la amplificación por PCR de los genes de virulencia de las 180 cepas

de H. pylori: glmM (Smith et al., 2004), cagA (Lage et al., 1995), cagE, vacA

(Atherton et al., 1995), cagT (Kauser et al., 2004), babA2 (Mizushima et al., 2001).

En los cuadros 1-3 se muestran los iniciadores que se utilizaron, las condiciones y

el producto esperado para la amplificación de los diferentes genes de virulencia.


Cuadro 1. Condiciones de PCR para amplificación de las cepas.

Gen Oligonucleótidos Condiciones Número de

ciclos

Producto

glmM

glmM-F

5-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3

glmM-R

5-AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC-3

(Smith et al, 2004)

93°C 45 seg

57°C 45 seg

72°C 45 seg

35 294 bp.

cagA cagA-s

5-AATACACCAACGCCTCCAAG-3

cagA-as

5-TTGTTGCCGCTTTTGCTCTC-3

(Lage et al, 1995)

94°C 1 min

55°C 1 min

72°C 1 min

35 400 bp.

cagE cagE-s

5-TGTGGCAAGCAAACAAGCT-3

cagE-as

5-TCAGGGAAACCAAACAACCT-3

94°C 45 seg

55°C 45 seg

72°C 45 seg

35 195 bp.

cagT cagT-R

5-CATCACCACACCCTTTTGAT-3

(Kauser et al, 2004)

cagT-F

5-CCATGTTTATACGCCTGTGT-3

94°C 1 min

55°C 1 min

72°C 1 min

30 301 bp.

vacA vac1-F

5-ATGGAAATACAACAAACACAC-3

vac1-R

5-CTGCTTGAATGCGCCAAA-3

vac3-F

5-GGTCAAAATGCGGTCATGG-3

Vac3-R

5-CCATTGGTACCTGTAGAAAC-3

vac4-F

5-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3

vac4-R

5-CATAACTAGCGCCTTGCAC-3

(Atherton et al, 1995)

94°C 45 seg

53°C 45 seg

72°C 45 seg

94°C 45 seg

53°C 45 seg

72°C 45 seg

94°C 45 seg

53°C 45 seg

72°C 45 seg

35

35

35

s1 259 bp.

s2 286 bp.

m1 290 bp.

m2 352 bp.

babA2 babA2F

5-AATCCAAAAAGGAGAAAAAGTATGAAA-3

babA2R

5-TGTTAGTGATTTCGGTGTAGGACA-3

(Mizushima et al, 2001)

92°C 1 min

55°C 1 min

72°C 1 min

35 812 bp.


Los componentes de reacción para cada gen se muestran en el siguiente cuadro:

Cuadro 2. Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes cagA, cagE, cagT, vacA alelos (s1,s2 y m2),babA2 por PCR individual:

Reactivo Concentración original de

patrón

Volumen por tubo

(µL)

Concentración final

Regulador PCR 10x 2.5 1x

MgCl2 25mM 1.5 1.5 Mm

dNTP´s (mezcla dATP, dTTP, dGTP,

dCTP)

10mM 0.5 200 µM

cagA-s cagA-as

20 pmoles/ µL 20 pmoles/ µL

2 2

0.8 pmoles/ µL 0.8 pmoles/ µL

cagE-s cagE-as

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

cagT-R cagT-F

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

vac1-F vac1-R

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

vac4-F vac4-R

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

babA2F babA2R

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

Taq DNA polimerasa

5 U/ µL 0.3 1.5 U

DNA genómico 200 ng/ µL 5 40 ng

H2O inyectable c.b.p 25 µL 11.2 -------------


Cuadro 3. Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes glmM y vacA

alelo (m1) por PCR individual:

Reactivo Concentración original del

patrón

Volumen por tubo

(µL)



MgCl2 25mM 1.5 1.5 mM

dNTP´s (mezcla dATP,

dTTP, Dgtp, dCTP)

10mM 0.5 200 µM

glmM-F glmM-R

10 pmoles/ µL 10 "

1 1

0.4 pmoles/ µL 0.4 "

vac3-F vac3-R

10 " 10 "

1 1

0.4 " 0.4 "

Taq DNA polimerasa

5 U/ µL 0.3 1.5 U



Posteriormente se realizó el corrimiento electroforético de los fragmentos de DNA

amplificados en un gel de agarosa al 1%, el cual se tiñó con bromuro de etidio

(apéndice) por 15 minutos en agitación constante.


6.7 Identificación de la mutación puntual causada por claritromicina en cepas de

Helicobacter pylori

La identificación de la mutación puntual en la posición 2142 y 2143 del gen 23S

del rRNA de las cepas; se empleó una PCR-anidada utilizando los siguientes

oligonucleótidos (Maeda et al., 1998).

Gen Oligonucleótidos Posición en

23S rRNA

23S

CRF-4

5-AGTGGAGGTGAAAATTCC-3

CRR-1

5-TAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3

CRR-3

5-ATTCCCATTAGCAGTGCT-3

2105-2123

2239-2221

2189-2172

(Maeda et al., 1998)

En la primera PCR se utilizó los oligonucleótidos CRF-4 /CRR-1 y en la segunda

los oligonucleótidos CRF-4 /CRR-3. Las siguientes condiciones de amplificación

fueron: 94ºC/ 30 seg desnaturalización, 50ºC/ 30 seg alineamiento y 72ºC/ 1 min

extensión, con 30 y 20 ciclos respectivamente.

La mutación de A por G en la posición 2142 y 2143 se detectó con los productos

de PCR que fueron digeridos con las enzimas de restricción, MboII (5 U) y BsaI (5

U) a 37ºC y 55ºC, respectivamente, por 2 h. Posteriormente, se realizó el

corrimiento electroforético de los amplificados con restricción en un gel de

agarosa al 1.2%, el cual se tiñó con bromuro de etidio por 15 minutos en agitación

constante.


6.8 Identificación de mutaciones en el gen 16S del rRNA en cepas de

Helicobacter pylori

Para la identificación de las mutaciones en el gen 16S del rRNA de las cepas, se

ocuparon los siguientes oligonucléotidos (Glocker et al., 2005).

Gen Oligonucleótidos AMPLIFICADO

16S

16S-880fw

5-ATAGACGGGGACCCGCACAAG-3

16S-999rv

5-TGGCAAGCCAGACACTCCA-3

120 bp.

(Glocker et al., 2005)

Las condiciones de la PCR fueron: 94ºC/ 15 min preincubación y 30 ciclos a

95ºC/ 10 seg desnaturalización, 56ºC/ 10 seg alineamiento, 72ºC/ 10 min

extensión. Posteriormente, se realizó el corrimiento electroforético de los

amplificados en un gel de agarosa al 1.2%, el cual se tiñó con bromuro de etidio

por 15 minutos en agitación constante.

Para la identificación de mutaciones se realizó la secuenciación de los productos

de PCR (véase apartado 6.10).


6.9 Identificación de la presencia de los genes rdxA y frxA en cepas de

Helicobacter pylori

Se identificaron los genes rdxA y frxA, que codifican para nitroreductasas que

reduce el metronidazol haciéndolo activo, para ello se ocuparon los siguientes

oligonucléotidos (Jeong et al., 2000; Jeong et al., 2001).

Gen Oligonucleótidos Amplificado

rdxA

rdxA-F

5-GCAGGAGCATCAGATAGTTCT-3

rdxA-R

5-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3

886 bp.

frxA frxA-F

5-GGATATGGCAGCCGTTTATCATT -3

frxA-R

5-GAATAGGCATCATTTAAGAGATTA-3

780 bp.

(Jeong et al., 2000; Jeong et al., 2001)

Las condiciones de la PCR fueron: 94ºC/ 2 min preincubación y 30 ciclos a 94ºC/

4 seg desnaturalización, 58ºC/ 40 seg alineamiento, 72ºC/ 1 min extensión y una

extensión final a 72ºC/ 10 min. Posteriormente, se realizó el corrimiento

electroforético de los amplificados en un gel de agarosa al 1.2%, el cual se tiñó

con bromuro de etidio por 15 minutos en agitación constante.

Para la identificación de los genes se considero: presencia del gen banda y

ausencia del gen no banda.


Los componentes de reacción para cada gen se muestran en el siguiente cuadro: Tabla 4. Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes 23S y 16S por

PCR individual.

Reactivo Concentración original del patrón

Volumen por tubo

(µL)



MgCl2 25mM 1.5 1.5 mM

dNTP´s (mezcla dATP, dTTP, dGTP,

dCTP)

10mM 0.5 200 µM

CRF-4 CRR-1 CRR-3

20 pmoles/ µL 20 " 20 "

2 2 2

0.8 pmoles/ µL 0.8 " 0.8 "

16S-999rv 16S-880fw

20 " 20 "

2 2

0.8 " 0.8 "

Taq DNA polimerasa

5 U/ µL 0.3 1.5 U



Tabla 5. Mezcla de reacción empleados en la amplificación de los genes rdxA y frxA por PCR individual.

Reactivo Concentración original del patrón

Volumen por tubo

(µL)



MgCl2 25mM 1.5 1.5 mM

dNTP´s (mezcla dATP,

dTTP, Dgtp, dCTP)

10mM 0.5 200 µM

rdxA-F rdxA-R

10 pmoles/ µL 10 "

1 1

0.4 pmoles/ µL 0.4 "

frxA-F frxA-R

10 " 10 "

1 1

0.4 " 0.4 "

Taq DNA polimerasa

5 U/ µL 0.3 1.5 U




6.10 Secuenciación de productos de PCR La secuenciación de los amplicones del gen 23S rRNA (100 bp.) y del gen 16S

rRNA (120 bp.) se realizó con lo siguiente:

1. Electroforesis de los amplicones obtenidos de PCR, al 0.8% de agarosa

SFR.

2. Se tiñó el gel con bromuro de etidio por 15 min

3. Se cortaron las bandas (exponiendo lo menos posible a luz U.V).

4. Para purificación de bandas se siguió la metodología indicada por los Kits:

Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) y QIAquick Spin

Handbook for QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

5. La reacción de secuenciación se realizó utilizando el ABI PRISM

BigDye Terminador v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)

(Todo el procedimiento de secuenciación se realizo en oscuridad).

Tabla 6. Condiciones de reacción de secuenciación.

Terminador Ready Reaction Mix (BigDye) 4 L

Agua inyectable 4 "

Primer (0.5 pmoles/L) 1 "

DNA (50 ng/L) 1 "

Total 10 "

Tabla 7. Condiciones de PCR para reacción de secuenciación de los diferentes genes.

Desnaturalización inicial 96 C 2 min 1

ciclo

Desnaturalización 96 C 10 seg

35

ciclos

Alineamiento

23s primer CRR-1

16s primer 16S-999rv

55 C

62 C

4 min

Temp. almacenamiento 4 C

*Los amplicones se guardaron a -20 C, protegidos de la luz.


6. Para purificación del amplicón de secuenciación se siguió la metodología

indicada por el DyeExTM Handbook for DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN).

7. Al amplicón purificado se le agregó 12 L de Formamina y se calentó a 96

C por 2.5 min, se enfrió en hielo inmediatamente 5 min y se metió al

aparato de secuenciación.

6.11 Análisis estadístico

Se construyó una red para evaluar las relaciones genealógicas entre genotipos

por el método de Median-Joining (Bandelt et al., 1999) implementado en

NETWORK 4.2.0.1 (htt://www.fluxus-engineering.com, Polzin & Daneschmand

2003). Los parámetros utilizados fueron epsilon=0, peso de 1/1 de transiciones y

transversiones, peso de 10 caracteres y criterio de conexión.

Método de Neighbour Joining, prueba cada topología creada por la conexión de

un par de taxones de un subárbol y selecciona la topología con longitud mínima.

Como este proceso es repetido en cada paso, NJ puede verse como un algoritmo

voraz que minimiza la longitud total del árbol, dando así cumplimiento al principio

de evolución mínima.

El método de red-Neighbour empieza con un grupo de nodos representativos de

cada taxa, este selecciona pares de nodos remplazándolos por nuevos nodos

compuestos. Cuando los pares de nodos son seleccionados, estos no son

combinados y remplazados inmediatamente. En vez de eso, el método espera

hasta que haya sido vinculado por segunda vez, etapa en la cual tres nodos

vinculados son sustituidos con dos nodos vinculados.


7. RESULTADOS

Perfil de susceptibilidad antimicrobiana

100% (180/180) de las cepas fueron sensibles a amoxicilina y tetraciclina, 93%

(168/180) resistentes a metronidazol y 99% (178/180) sensibles a claritromicina

como se muestra en el cuadro 8.

Cuadro 8. Resistencia y sensibilidad por CMI a cuatro antibióticos empleados en cepas

de Helicobacter pylori.

Antibiótico No. cepas

resistentes

No. cepas

sensibles

% de

resistencia

(n= 180)

Amoxicilina 0 180 0 %

Metronidazol 168 12 93.3%

Claritromicina 2 178 1%

Tetraciclina 0 180 0%

En la figura 14, se muestra la distribución de la Concentración Mínima Inhibitoria

de los cuatro antibióticos empleados. La CMI de las dos cepas resistentes a

claritromicina fue de una concentración de 1 µg/mL. Asimismo, las cepas

resistentes a metronidazol presentaron una CMI que va de 8 µg/mL a 512 µg/mL,

el 50% de las cepas tuvo una CMI de 56.6 µg/mL y la moda fue de 32 µg/mL.

Ninguna de las 180 cepas presentaron resistencia a amoxacilina ( 4 g/mL) y

tetraciclina ( 4 g/mL), la concentración mayor de CMI obtenida para estos

antibióticos fue de 0.5 g/mL y 1 g/mL respectivamente.


Diversidad genotípica

En el cuadro 9, se muestra la frecuencia de los genes de virulencia. Para la isla

cag-PAI, el gen cagA predominó en 91.1% (164/180), gen cagE en 85% (153/180)

y gen cagT en 85% (159/180); para el gen vacA los alelos más predominantes

fueron s1 con 79.88% (143/179) y m1 con 82.35% (140/170), en el caso del gen

babA2 el 77.22% (139/180) la presentaron.

Fig 14. Distribución de la CMI de 180 cepas de Helicobacter pylori del HIMFG.


Cuadro 9. Frecuencia de genes, glmM, vacA, cagA, cagE, cagT, babA2 en cepas de

Helicobacter pylori.

Gen Alelo Número %

glmM 180/180 100%

vacA Positivo 180/180 100%

S 179/180 99.4%

s1 143/179* 79.88%

s2 36/179* 20.11%

m 170/180 94.4%

m1 140/170* 82.35%

m2 30/170* 17.64%

cag- PAI cagA positivo 164/180 91.1%

cagA negativo 16/180 8.88%

cagE positivo 153/180 85%

cagE negativo 27/180 15%

cagT positivo 159/180 88.3%

cagT negativo 21/180 11.6%

babA2 139/180 77.22%

*No tipificables 11 cepas con los iniciadores.

En el cuadro 10, se muestra la frecuencia de las diferentes combinaciones

alélicas para los genes cagA, cagE y vacA, se observa una asociación importante

entre estos tres genes para la formación de genotipos. 80% (104/130) presentó el

genotipo vacAs1m1 cagA+/cagE+; 13.84% (18/130) genotipo vacAs1m1

cagA+/cagE-; 5.38% (7/130) genotipo vacAs1m1 cagA-/cagE+; 80.76% (21/26)

genotipo vacAs2m2 cagA+/cagE+ y 15.38% (21/26) genotipo vacAs2m2 cagA-/

cagE+. Los genotipos heterólogos presentaron 25% (21/26) para vacAs1m2 cagA-

/cagE-; 75% (3/4) para vacAs1m2 cagA+/cagE-; 11.11% (1/9) para vacAs2m1

cagA-/cagE+ y 88.88% (8/9) para vacAs2m1 cagA+/cagE+ el cual no es muy

común.


Cuadro 10. Frecuencia de combinaciones alélicas para los genes vacA, cagA y cagE en cepas de Helicobacter pylori.

Gen vacA cagA+ /cagE+ n (%)

cagA-/ cagE- n (%)

cagA+/ cagE- n (%)

cagA-/ cagE+ n (%)

No. total de cepas

s1m1 104 (80%) 1 (0.76%) 18 (13.84%) 7 (5.38%) 130

s2m2 21 (80.76%) 0 (0%) 1 (3.84%) 4 (15.38%) 26

s1m2 0 (0%) 1 (25%) 3 (75%) 0 (0%) 4

s2m1 8 (88.88%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (11.11%) 9

En el cuadro 11, se muestra el número de cepas resistentes a claritromicina y

metronidazol versus los genotipos encontrados en cada una. 86 cepas resistentes

a metronidazol presentaron el genotipo vacAs1m1 cagA+/ cagE+ considerado

como virulento.

Cuadro 11. Resistencia vs. genotipo.

Genotipo Cepas Ch. resistentes

Cepas Mtz. resistentes

vacAs1m1 cagA+/ cagE+ 1 86

vacAs1m1 cagA+/ cagE - 0 16



Otros 0 23

*No tipificables 11 cepas con los iniciadores.


En el cuadro 12, se muestra la clasificación de cepas de H. pylori, en donde

66.6% (120/180) presento una cag-PAI completa y en la figura 15, se muestra los

resultados de cag-PAI.

Cuadro 12. Clasificación de cepas de Helicobacter pylori.

Clasificación No. de cepas (%)

Tipo de

cepa

I. cagA+ vacA+ 162/180 (90%)

II. cagA- vacA- 0

III. cagA+ vacA+ babA+ 127/180 (70.5%)

cag-PAI

Completa

120/180 (66.6%)

Incompleta

60/180 (33.3%)

cag II cag I cagT cagE cagA (+) (-) (+) (-) (+) (-) 159 21 153 27 164 16 cag-PAI completa (n=120) cag-PAI incompleta (n=60) n=27 n=11 n=4 n=12 n=2 n=4 Fig 15. Resultados de cag-PAI en 180 cepas de Helicobacter pylori.


La red de genotipos muestra la integración de dos grupos (A y B). El grupo A

estuvo integrado por aquellas cepas que presentaban el alelo s1; el grupo B por

cepas que presentaban el alelo s2. El genotipo vacAs1m1 cagA+/cagE+ babA+

fue el de mayor frecuencia (77 cepas), seguido por el genotipo vacAs1m1

cagA+/cagE+ babA- (27 cepas) y con menor frecuencia los genotipos vacAs1m2

cagA-/cagE- babA-, vacAs1m1 cagA-/cagE- babA-, vacAs1m1 cagA-/cagE+ babA-

vacAs2m1 cagA-/cagE+ babA+, vacAs1m2 cagA-/cagE- babA- y vacAs2m2

cagA+/cagE- babA+ que solo presentaron una cepa individual. La unión de los

diferentes genotipos en la red total y dentro de los grupos se explica por la

presencia de una o dos mutaciones. Los dos grupos están unidos por el genotipo

incompleto cagA-/cagE+ vacAm1 babA+, el cual no fue considerado en sentido

estricto como un genotipo.

Fig 16. Red de genotipos.

E

cagA-/cagE- vacAs1m2 babA- (1)

cagA-/cagE- vacAs1m1 babA- (1)

cagA+/cagE+

vacs1 babA- (2)

cagA-/cagE+ vacAs1m1 babA- (1)

cagA+/cagE+ vacAs1m1 babA+ (77)

cagA+/cagE- vacAs1m1 babA+ (16)

cagA-/cagE+ vacAs1m1 babA+ (6)


cagA+/cagE+ vacAs2m2 babA- (3)

cagA-/cagE+

vacA s2 bab- (1)






cagA-/cagE+

vacm1 babA + (1)

cagA+/cagE- vacAs1m1 babA- (2)



cagA+/cagE-

vacs1 babA+ (3)

cagA+/cagE+

vacs1 babA+ (4)

cagAcagEvacAs1vacAs2vacAm1vacAm2babA

Grupo A

Grupo B


En el cuadro 13, se muestran los diferentes genotipos encontrados versus

pacientes, siendo la paciente número 80, la que presentó mayor número de

genotipos y 8 pacientes presentaron un genotipo, los otros 23 pacientes restantes

presentaron de dos a tres genotipos cada uno.

Cuadro 13. Genotipos colonizantes vs. pacientes.

No. de paciente

Sexo No. de poblaciones

Genotipos

80 Femenino 5 cagA-,cagE-,vacAs1m2

cagA+,cagE+,vacAs1

cagA+,cagE-,vacAs1m2

cagA+,cagE+,vacAs1m1

cagA+,cagE+,vacAs2m1

20 Masculino 1 cagA+,cagE+,vacAs1m1

60 Femenino 1 cagA+,cagE+,vacAs1m1








En el cuadro 14, se muestra que hubo dos casos de reincidencia de infección por

H. pylori (igual color indica que provienen del mismo paciente). Observando que

en el primer caso persistió el mismo genotipo, pero se observa que las cepas

variaron en la CMI principalmente en metronidazol; en donde hubo un aumento de

la CMI. En el segundo caso sí hubo cambio en uno de los genotipos y los valores

de CMI fueron también diferentes para los cuatro antibióticos.

Cuadro 14. Dos casos reincidentes de infección por Helicobacter pylori.

Paciente Año Población colonizante

Genotipo CMI

Metro.

Claritro. Amoxa. Tetra.

77

(antes)

2006

1

cagA+/cagE+vacAs1m1

16 16 16 16 16

0.015 0.015 0.015 0.015 0.015

0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

0.125 0.5 0.5 0.5

0.062

138

(después)

2007

1

cagA+/cagE+ vacAs1m1

64 64 64 32

128

0.031 0.015 0.031 0.015 0.031

0.015 0.015 0.015 0.015 0.015

0.062 0.062 0.062 0.062 0.062

135 (antes)

2007

2

cagA+/cagE+ vacAs1m1 cagA+/cagE- vacAs1m1

32 32 32 16 64

<0.0078 <0.0078 <0.0078 <0.0078

0.031

0.015 0.015 0.015 0.015 0.015

0.062 0.062 0.031 0.062 0.125

166 (después)

2008

2

cagA+/cagE+ vacAs1m1 cagA-/cagE+ vacAs1m1

8 8 16 32 8

0.031 0.015 0.031 0.031 0.031

0.0078 0.062 0.015

0.0078 0.031

0.062 0.25 0.062 0.062 0.031


Identificación de mutaciones.

Claritromicina

En la figura 17, se muestra la distribución de la Concentración Mínima Inhibitoria a

claritromicina; el mayor número de cepas presento una CMI de 0.062 µg/mL. El

cuadro 15 se muestra que hubo dos cepas que presentaron resistencia a

claritromicina y 11 cepas que presentaron un valor cercano a la resistencia.

Cuadro 15. Cepas que presentaron resistencia a claritromicina y tuvieron un valor de corte cercano a la resistencia.

Antibiótico Resistencia Gen CMI No. cepa

Claritromicina

1 µg/mL

0.125 µg/mL 204, 1044, 1045, 172C1, 172C3

23s rRNA 0.25 µg/mL 1103, 1121, 1122, 1124, 1125

1 µg/mL 1123, 1241

Fig 17. Distribución de la CMI a claritromicina en 180 cepas de Helicobacter pylori.


En la figura 18, se muestra el alineamiento de las secuencias del gen 23S rRNA;

en donde no se presento mutaciones en las posiciones 2142 y 2143 asociadas a

la resistencia a claritromicina, utilizando el programa CLUSTAL 2.0.12.

HPrrnB23S AAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

HPrrnA23S AAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

jhpr2 AAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

jhpr5 AAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

ATCC ------TAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

172C1 ------TAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

20-4 ------TAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC



172C3 ------TAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC





112-4 --GGCCTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGACCCC

110-3 ----TTTAGTGGAGGTGAAAATTTCCTTCCTTTACCCGCGGCCCAAGACGGAAAGACCCC

112-5 --GCNTTAGTGGAGGNGAAAATTCCTCC----TACCCGCGGC--AAGACGGAAAGTCCCC

********* ******* * ********** *********** ****

HPrrnB23S -GTGGACCTTT-ACT-ACAACTTA-GCAC-TGCT-AATGGGAAT--ATCATGCGC-AGGA

HPrrnA23S -GTGGACCTTT-ACT-ACAACTTA-GCAC-TGCT-AATGGGAAT--ATCATGCGC-AGGA

jhpr2 -GTGGACCTTT-ACT-ACAACTTA-GCAC-TGCT-AATGGGAAT--ATCATGCGC-AGGA

hpr5 -GTGGACCTTT-ACT-ACAACTTA-GCAC-TGCT-AATGGGAAT--ATCATGCGC-AGGA

ATCC -GTGGACNTTT-ACT-ACAACTTT-TCTCCTGCTTAATGNNNAA--ATCATGCGC-AGGA

172C1 -GTGGACCTTT-ACT-ACAACTTA-GCAC-TGCT-AATGGGNAA--ATCATGCGC-AGGA

20-4 -GTGGACCTTTGACT-ACAACTTA-GCTC-TGCT-AATGGGNAA--AACATGCGC-AGGA

104-4 -GTGGACCTTTGANT-ACAACTT--AGCTCTGCT-AATGGGGAA--ATCA----------

104-5 -GTGGACCTTTGACT-ACAACTTT-AGCNCTGCTTAATGGGGAA--ANCATGCGC-AGGA

172C3 -GTGGACCTTTGACAGACAACTTA-NCTC-TCCT-AATGGGNAA--AACATGCNC-AGGA

112-1 -GTGGACCTTNGA-AAACAACTTA-GCTC-TCCCTAATGGGGAAGNANCATGCGC-AGGA

112-3 -GTGGACCTTNGACAGACAACTTA-GCTC-TTCTTAATGGGNNN--ANCATGCGC-AGGA

124-1 -GTGGACCTTNGAAT-ACAACTTT-ATNTTCTTCTAATGGGAAG--NNCATGCGC-AGG-

112-2 -GTGGACCTTG-ANT-ACAACTTN-TCTC-TCCTNAATGGGANA---NCATGCGC-AGGA

112-4 -GTGGACCTNGGAAA-ACAACTTN-TCTC-TCCTAA-TGGGA------------------

110-3 CGTGGACCTTTGANNACNAACTTTANCTCTCCCTCAATGGGGGNN-AACATGCGCCAGGA

112-5 --CGNACCGGNGANAC--------------------------------------------

* ** *

Fig 18. Alineamiento de secuencias del gen 23S de Helicobacter pylori con cepas

de referencia 26695 (no. acceso 899887-HPrrnB23S, 898882-HPrrnA23S), J99

(no. acceso 4794247-jhpr2, 4794244-hpr5) (programa CLUSTAL 2.0.12). Localización de mutación puntual (2142 y 2143) asociada a la resistencia a

claritromicina encerrada en rectángulo.


Tetraciclina

En la figura 19, se muestra la distribución de la Concentración Mínima Inhibitoria a

tetraciclina; el mayor número de cepas presento una CMI de 0.25 µg/mL. El

cuadro 16, se muestra las tres cepas que presentaron un valor cercano a la

resistencia a tetraciclina.

Tabla 16. Cepas que presentaron resistencia a tetraciclina o valor de corte cercano a la resistencia.

Antibiótico Resistencia Gen CMI No. cepa

Tetraciclina

4 µg/mL

16S rRNA

0.5 µg/mL 14,

1 µg/mL 1121, 1125

Fig 19. Distribución de la CMI a tetraciclina en 180 cepas de Helicobacter pylori.


En la figura 20, se muestra el alineamiento de secuencias del gen 16S; en donde

no se presento mutaciones en las posiciones AGA926-928 asociadas a la resistencia

a tetraciclina, utilizando el programa CLUSTAL 2.0.12.

jhpr3 ACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT-CGAAGATACACGAAGAACCTTACCTA

jhpr6 ACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT-CGAAGATACACGAAGAACCTTACCTA

HPrrnB16S ACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT-CGAAGATACACGAAGAACCTTACCTA

HPrrnA16S -CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT-CGAAGATACACGAAGAACCTTACCTA

1-4 ---------GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT-CGAAGATNCTCGAAGAACCTGG---

112-1 ----------GCGGTGGAGCATGTGGTTTAANT-CGAAGATACACGAAGNACCTTACCGN

112-5 ----------GCGGTGGAGCATGTGGTTTNAATACGAAGATTCNCCNTCCTCCCTTGAAA

******************* * * ******* * * **

Identificación de los genes rdxA y frxA.

Metronidazol

En el cuadro 17, se muestra el número de cepas que fueron resistentes,

intermedias y sensibles, siendo las cepas resistentes las que se presentaron en

mayor número 93.3% (168/180).

Cuadro 17. Cepas de Helicobacter pylori que fueron resistentes, intermedias y sensibles a metronidazol.

METRONIDAZOL No. de cepas

baja resistencia >8 µg/mL

moderada resistencia 32 a 64 µg/mL

alta resistencia 128 µg/mL

48

81

22

Intermedia 2 a 4 µg/mL 17

Susceptible <2 µg/mL 12

Fig 20. Alineamiento de secuencias del gen 16S de Helicobacter pylori con cepas

de referencia 26695 (no. acceso 899855-HPrrnB16S, 899682-HPrrnA16S), J99

(no. acceso 4794248–jhpr3, 4794245-hpr6) (programa CLUSTAL 2.0.12). Localización de mutaciones (AGA926-928) asociada a la resistencia a tetraciclina

encerrada en rectángulo.


En el cuadro 18, se muestran las cepas que presentaron los genes asociados a la

resistencia a metronidazol, siendo el gen rdxA el más alto 88.3% (159/180).

Cuadro 18. Cepas de Helicobacter pylori que presentaron los genes rdxA y frxA.

Gen No. de cepas

que

presentaron (%)

rdxA 159/180 (88.3%)

frxA 118/180 (65.5%)

rdxA y frxA 113/180 (62.7%)

En el caudro 19, se muestra los mecanismos de resistencia propuestos para las

168 cepas resistentes a metronidazol. 130 cepas resistentes fueron clasificadas

según Jeong et al., 2001, en donde dependiendo de la inactivación de los genes

rdxA y frxA las cepas pueden ser clasificadas en tipo I, II o III.

Cuadro 19. Mecanismo de resistencia involucrados en cepas de Helicobacter pylori resistentes a metronidazol.

No. de

cepas

resistentes

Mecanismo de resistencia

propuesto

16 No presencia de genes rdxA y frxA

22 Deleciones en el gen rdxA

130 Inactivación de alguno de los genes

(rdxA o frxA)


En la figura 21, se muestra el corrimiento electroforético del gen rdxA de las cepas

de H. pylori; en donde 22 cepas resistentes a metronidazol, presentaron un

amplicón menor al esperado de 886 bp. lo que indicaría que hubo deleciones en

el gen.

Figura 21. Electroferograma. Corrimiento del gen rdxA de cepas de Helicobacter pylori, carril:1. marcador de talla molecular (1 kb.); 2. cepa clínica 42 ; 3. cepa clínica 43 ; 4. cepa clínica 44 ; 5. cepa clínica 45 ; 6. cepa clínica 51; 7. cepa clínica 52

; 8. cepa clínica 53; 9. cepa clínica 54 ; 10. cepa clínica 55; 11. cepa clínica 71 ; 12. cepa clínica 72.


8. DISCUSIÓN

Se estudiaron cepas de Helicobacter pylori de pacientes pediátricos del Hospital

Infantil de México Federico Gómez, debido a que es un microorganismo que se

adquiere en los primeros años de vida (Kusters et al, 2006). La infección con

cepas resistentes indudablemente influye en el éxito o falla de la terapia de

erradicación, las tasas de cura a esta infección han sido asociadas por poco

cumplimiento por parte de los pacientes, el tiempo de tratamiento y la relación

médico-paciente importante para el éxito de la terapia (Sugimoto et al., 2009).

Los antibióticos analizados fueron metronidazol (nitroimidazol), amoxicilina

(betalactámico), claritromicina (macrólido) y tetraciclina; ya que son utilizados en

la terapia combinada para la erradicación de H. pylori en adultos y en niños (solo

los tres primeros) (Torres et al., 2001; García-Campos et al., 2003; Steven et al.,

2005).

La resistencia a metronidazol es una variable importante en el tratamiento de

infecciones por H. pylori y su presencia reduce significativamente la eficiencia en

las terapias de erradicación (Vallejos et al., 2003); ya que existen estudios

alrededor del mundo donde se ha observado que del 50 al 90% de las cepas son

resistentes (Kalach et al., 2001; Lopez-Brea et al, 2001; Sugimoto et al., 2009).

En el caso de México, esta resistencia ha aumentado hasta un 70% (Torres et al.,

2001); en este estudio se obtuvo una resistencia a metronidazol del 168/180

(93.3%) de las cepas pediátricas como se esperaba (cuadro 8) de las cuales, 48

fueron de baja resistencia (8 µg/mL), 81 de moderada resistencia (32 a 64 µg/mL)

y 22 de alta resistencia (128 µg/mL) (cuadro 17). La presencia de esta resistencia

a metronidazol puede atribuirse a la repetida administración de esté, en el

tratamiento de infecciones no asociadas a H. pylori como enfermedades

parasitarias (giardiasis y amebiasis) y gastrointestinales que permiten la selección

de cepas resistentes (López-Brea et al., 2001; Vallejos et al., 2003). Además, que

se ha reportado que la resistencia a metronidazol es debida a la actividad

mutagénica del antibiótico en las células (Kwon et al., 2001).

Para claritromicina que es usado a nivel mundial en la erradicación de H. pylori,

se ha reportado un aumento en la resistencia en los últimos años (Kalach et al.,


2001; Torres et al., 2001). En este estudio se encontró que solo el 2/180 (1%) de

las cepas presentaron resistencia (cuadro 8), similar a lo encontrado por Ahmad

et al., 2009 en donde reportaron 4/187 (2.1%) de cepas resistentes. Además, se

ha reportado que después de dos a cinco sub-cultivos (Xia et al., 1996), la

resistencia a claritromicina se vuelve inestable, por lo cual se debe considerar

que la reversibilidad de la resistencia a claritromicina en las cepas estudiadas

puede ser a consecuencia de que: (i) la claritromicina podría erradicar a H. pylori,

a pesar de la aparente resistencia in vitro, debido a la inestabilidad de la

resistencia; (ii) la tasa de resistencia a claritromicina in vitro puede ser

subestimada debido a la realización de sub-cultivos desde el primer aislamiento,

al momento de la realización de la prueba de susceptibilidad (Alarcón et al.,

2001).

Cepas resistentes a amoxicilina son raramente encontradas, debido a que la

resistencia pudiera estarse perdiendo por repetidos sub-cultivos de las cepas en

ausencia de amoxicilina o por congelación y descongelamiento de las cepas

(Torres et al., 2001; Gerrits et al., 2006), lo cual explica que ninguna cepa fue

resistente a amoxicilina por CMI (cuadro 8), por lo que amoxicilina pudiera

considerarse clave en la terapia de erradicación de H. pylori en pacientes

pediátricos (Lai et al., 2006; Poon et al., 2009). En el caso de tetraciclina, la

búsqueda de la resistencia fue motivada por considerar su disponibilidad sin

prescripción médica, ya que es utilizada en enfermedades diarreicas (Dailidiene et

al., 2002), por lo cual pudiera ser administrado por los padres a los hijos. Un

estudio realizado por Vallejos et al., 2007 reportaron resistencia del 0.7% en

España, 0.5% en Reino Unido y 0.5% en Hong Kong, observándose la misma

tendencia en este estudio con ninguna cepa resistente a tetraciclina por CMI

(cuadro 8). Además, que el riesgo de presentar resistencia en cepas de H. pylori

de población joven es muy poca (Poon et al., 2009). Nuevas drogas como

fluoroquinolonas (levofloxacina), furazolidona y rifabutina han sido recomendados

como un tratamiento alternativo (Sugimoto et al., 2009).


Los factores de virulencia cagA y vacA que posee H. pylori, han sido reportados

como los principales factores que determinan las tasas de erradicación además,

que aumentan la inflamación de la mucosa gástrica y están asociados con el

desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico (Sugimoto et al., 2009). En la

caracterización de genes de virulencia, se encontró una frecuencia elevada de

cagA+ 164/180 (91.1%), cagE+ 153/180 (85%), cagT+ 159/180 (88.3%) y babA2

139/180 (77.2%) (cuadro 9), diferente a lo encontrado por Paniagua et al., 2009

en pacientes mexicanos donde reportan porcentajes del 50% para los genes. En

el caso del gen cagE involucrado en la inducción de interleucina 8 por células

epiteliales gástricas (Yamazaki et al., 2005), el alto porcentaje es indicativo de que

los pacientes cursan la enfermedad con inflamación persistente; el alto porcentaje

del gen babA2 es indicativo de la habilidad de las cepas de expresar la adhesina

de unión al antígeno de Lewisb (Gerhard et al., 1999).

Se realizó la clasificación del mosaico de vacA, que es importante para predecir

los resultados clínicos de la infección por las distintas combinaciones alélicas

(Ribeiro de Gusamo et al., 2000); encontrándose que el 100% de las cepas

presentaron alguno de los alelos de vacA, siendo el alelo s1 y m1 los más

frecuentes en la población infantil con 143/179 (79.8%) y 140/170 (82.3%)

respectivamente (cuadro 9). En cuanto a las combinaciones alélicas se encontró

una mayor prevalencia del genotipo vacAs1m1 (130 cepas), las cuales producen

la toxina VacA e inducen una actividad vacuolizante en células epiteliales

gástricas, mientras que genotipos vacAs2m2 (26 cepas) producen bajas

cantidades o no producen la toxina VacA (cuadro 10) (Yamazaki et al., 2005;

Sugimoto et al., 2009). Se encontraron además ocho cepas con el genotipo

vacAs2m1 cagA+/ cagE+, el cual no es común en cepas de H. pylori, solo dos

estudios en México, realizados por Morales-Espinosa et al., 1999 y Paniagua et

al., 2009 encontraron este genotipo lo cual indica que desde edades tempranas

se presenta esta combinación alélica.

Cepas resistentes a metronidazol (86) y a claritromicina (1), estuvieron

relacionadas con el genotipo virulento vacAs1m1 cagA+/ cagE+ (cuadro 11),

contrario a lo reportado por Elvis et al., 2004 donde encontraron que cepas

resistentes a metronidazol y claritromicina presentaban con mayor frecuencia el


alelo s2. El que estas cepas resistentes presenten el genotipo virulento, es

indicativo de que hay inflamación en el epitelio gástrico y que la presencia de este

genotipo pueda ser un factor que contribuya en la poca liberación del antibiótico y

obstaculizar la erradicación del microorganismo.

Se realizó la clasificación de las cepas propuesta por Xiang et al., 1995 y Gerhard

et al., 1999; encontrándose 162/180 (90%) de cepas tipo I cagA+ vacA+, ninguna

cepa tipo II cagA- vacA- y 127/180 (70.5%) cepas triple positivas cagA+ vacA+

babA2+ (cuadro 12). Lo que sugiere que los pacientes pueden desarrollar úlcera

duodenal predominante en cepas tipo I o desarrollar adenocarcinoma gástrico

predominante en cepas triple positivas que aumentan la respuesta inflamatoria en

la mucosa gástrica y dañan el epitelio gástrico, comparado con aquellas cepas

que no presentan estos factores de virulencia (Cover et al., 2009). Además, varios

estudios han observado que el cáncer gástrico y úlcera péptica se presentan en

personas infectadas con cepas cag-PAI positivas (intacta y funcional) que en

personas con cepas cag-PAI negativas (incompleta), ya que estas tienen poca

capacidad de causar progresión de la enfermedad (Ikenoue et al., 2001; Scott et

al., 2006; Kusters et al., 2006). Se analizó el estado de la isla cag-PAI de las

cepas pediátricas (figura 15), encontrándose que 120 cepas presentaron la isla

cag-PAI completa (cagA+, cagE+, cagT+) y 60 cepas una isla cag-PAI incompleta;

por lo cual si los pacientes pediátricos no son tratados oportunamente podría

llegar a desarrollar estas patologías, ya que más del 50% de las cepas analizadas

presentaron una isla cag-PAI completa, que contribuye a la inflamación del tejido

epitelial gástrico y tienen la característica de estimular a células epiteliales

gástricas a producir altos niveles de citocinas pro-inflamatorias como IL-8 (Elvis et

al., 2004; Kauser et al., 2004).

La red de genotipos (figura 16), mostró la integración de dos grupos (A y B) en

base a los alelos del gen vacA, indicando que la presencia o ausencia de genes

de cag-PAI (cagA, cagE) y la adhesina (babA2) no son determinantes para la

distribución de los genotipos. En el grupo A el genotipo con mayor frecuencia fue

el virulento vacAs1m1 cagA+/cagE+ babA+ (77 cepas) que presenta la adhesina

(babA2) la cual permite la adherencia de H. pylori a las células; presentando

también los alelos s1m1 que secretan altos niveles de la citotoxina vacuolizante


VacA y los genes de cag-PAI que codifican para la proteína CagA (gen cagA) que

es altamente inmunogénica y para la IL-8 (gen cagE) que es un quimiotrayente de

neutrofilos, todas estas características van a contribuir a la infección por H. pylori.

Este genotipo virulento dio origen a otros genotipos como vacAs1m1

cagA+/cagE+ babA- segundo con mayor frecuencia (27 cepas). En este grupo se

observa que entre cada genotipo solo se presento un paso mutacional a

excepción del genotipo vacAs1m1 cagA-/cagE- babA- (1 cepa) que requirió cuatro

pasos mutacionales en total partiendo del genotipo vacAs1m2 cagA+/cagE-

babA+ (3 cepas); sin embargo, si se parte del genotipo vacAs1m1 cagA+/cagE-

babA- (2 cepas) solo se requirió de un solo paso mutacional para la pérdida del

gen cagA+. En el grupo A se agruparon todos aquellos genotipos que secretan

niveles altos (s1m1) o niveles intermedios (s1m2) de la citotoxina vacuolizante

VacA que induce el daño a la célula epitelial gástrica causado por la vacuolización

de la toxina (Dundon et al., 2001; Sugimoto et al., 2009).

En el grupo B el genotipo con mayor frecuencia fue vacAs2m2 cagA+/cagE+

babA+ (18 cepas) que a diferencia del genotipo virulento, este presenta los alelos

s2m2 en donde está ausente la capacidad citotóxica. En este grupo se observo la

presencia de genotipos hipotéticos que sirvieron para la unión de genotipos como

vacAs2m1 cagA-/cagE+ babA+ (1 cepa) con el genotipo vacAs2m1 cagA+/cagE+

babA- (3 cepas) y la unión del genotipo vacAs2m2 cagA-/cagE+ babA+ (4 cepas)

con el genotipo vacAs2m2 cagA+/cagE+ babA- (3 cepas); estos cuatro genotipos

fueron relacionados por genotipos hipotéticos al genotipo incompleto vacAs2

cagA-/cagE- babA- el cual no es considerado en sentido estricto como un

genotipo. En el grupo B se agruparon aquellos genotipos que presentaron el alelo

s2 en combinación con el alelo m2 o m1, los cuales se presentan en menor

número entre las cepas de H. pylori ya que no hay secreción de la citotoxina

vacuolizante VacA que daña a la célula epitelial gástrica (Kusters et al., 2006).

También en la red se pudo distinguir que cepas cag+ y cag- pueden coexistir y

recombinar, ya que están distribuidas uniformemente por toda la red lo que

demuestra el alto nivel de diversidad genética que presenta H. pylori y que puede

ser vista como una evidencia de la versatilidad poblacional de las cepas

estudiadas (Blaser and Atherthon 2004).


El riesgo de infección con múltiples cepas de H. pylori no está relacionado solo

con la edad, también intervienen características del huésped y ambientales como

condiciones de vida y hábitos de higiene (Ribeiro de Gusamo et al., 2000). La

colonización con más de una cepa distinta de H. pylori es común y la multiplicidad

de infección proporciona sustratos para la adquisición de nuevas secuencias

genéticas (Cover et al., 2009). Salama et al., 2007 reportaron que la población

Mexicana tiene una alta probabilidad de infección mixta con múltiples cepas

comparada con poblaciones de Estados Unidos y el Este de Europa con bajas

tasas de infección. En este estudio se encontró que un mismo paciente puede

estar infectado por diferentes genotipos (cuadro 13). El Paciente número 80

presentó 5 genotipos diferentes, lo que demuestra el alto nivel de diversidad

genética que puede presenta este microorganismo ya sea por competencia

natural, mutaciones o recombinaciones que dieron lugar a una extensa diversidad

alélica en el mismo huésped. Además, que se ha reportado que una persona

puede estar infectada por más de un genotipo en un rango de 0 a 85% (promedio

20%) (Blaser and Berg 2001; Wong et al., 2001;Peek et al., 2002; Salama et al.,

2007;Costa et al., 2009).

Se pudo analizar la reincidencia de infección en dos pacientes que recayeron en

diferentes periodos de tiempo (tabla 14). Paciente número 77 año 2006 presento

solo una población colonizante (genotipo virulento) de las cinco cepas analizadas,

con una CMI igual entre las cinco cepas para metronidazol, claritromicina y

amoxacilina, pero no a tetraciclina que solo dos cepas presentaron CMI diferente,

un año después el mismo paciente con número 138 volvió a presentar el genotipo

virulento pero con valores altos de CMI para metronidazol y claritromicina. El

segundo caso paciente número 135 año 2007 presentó dos poblaciones

colonizantes (uno genotipo virulento) con una CMI diferente para metronidazol,

claritromicina y tetraciclina, ya que en el caso de amoxacilina las cinco cepas

fueron iguales, un año después el mismo paciente con número 166 volvió a

presentar el genotipo virulento sin embargo, el otro genotipo fue diferente (antes

cagA+/cagE-, después cagA-/cagE+) y con una CMI menor en cuatro de cinco

cepas para metronidazol, en cambio con los otros antibióticos algunas cepas

aumentaron su CMI. Todo esto confirma la versatilidad que tiene H. pylori, ya que


es capaz de maximizar sus recursos para crecer, aun en un nicho hostil como es

el estómago humano (Blaser and Atherthon 2004).

En la identificación de mutaciones en el gen 23S del rRNA como un evento de

resistencia a tetraciclina por la modificación del sitio blanco, solo dos cepas de las

180, presentaron resistencia por CMI (cuadro 15) y la mayoría de cepas cayeron

en la concentración de 0.062 µg/ml (figura 17). Ninguna de las 12 cepas

estudiadas presento mutación en las posiciones A2142G y A2143G con las

enzimas de restricción MboII y BsaI. Las cepas secuenciadas del gen 23S fueron

comparadas con secuencias de referencia publicadas de 23S de H. pylori. En la

figura 18, se muestra las secuencias alineadas, las cuales no presentan mutación;

sugiriendo que las cepas de H. pylori necesitan la mutación en ambas copias del

gen 23S rRNA para conferir la resistencia a claritromicina (Taylor et al., 1997).

Además, no es de sorprender que las dos cepas resistentes no presentaran la

mutación en las posiciones A2142G y A2143G ya que otros investigadores como

Fontana et al., 2002 reportaron que cepas de H. pylori presentan un mecanismo

de resistencia diferente el cual todavía no ha sido determinado, lo que podría

suceder con las cepas aquí estudiadas.

En la identificación de mutaciones del gen 16S del rRNA ocasionadas por

tetraciclina como uno de los eventos de resistencia descrita, ninguna de las 180

cepas presentó resistencia por CMI (cuadro 16) y la mayoría de las cepas cayeron

en la concentración de 0.25 µg/ml (figura 19), lo cual es usual entre cepas

sensibles a tetraciclina ya que el rango varía entre 0.125 y 0.5 µg/mL (Trieber and

Taylor 2002). En la figura 19 se muestra las cepas secuenciadas del gen 16s

comparadas con secuencias de referencia publicadas de 16S de H. pylori. Las

secuencias alineadas, no presentaron mutación en ninguno de los nucleótidos

reportados (AGA926-928); confirmando lo obtenido por CMI donde ninguna cepa

presento resistencia.

En la identificación de los genes rdxA y frxA que ayudan a la activación del

metronidazol a su forma activa (hidroxilamina) para matar a H. pylori (Gerrits et

al., 2002), se encontró que 158/180 (88.3%) presentaron el gen rdxA, 118/180

(65.5%) el gen frxA y 113/180 (62.7%) ambos genes (tabla 18). En H. pylori se


han descrito varios mecanismo de resistencia a metronidazol; en la tabla 19 se

muestran los mecanismos de resistencia que pudieran estar involucrados en las

168 cepas resistentes a este antibiótico por CMI; 16 cepas no presentaron los

genes rdxA y frxA lo que indica que no hay producción de las enzimas para la

activación del metronidazol; 22 cepas presentaron deleciones en el gen rdxA ya

que el amplicón fue menor (figura 21), esto indica que la enzima generada tal vez

no es funcional y 130 cepas clasificadas según Jeong et al, 2001 donde

reportaron que cepas de H. pylori pueden ser resistentes a metronidazol si

presenta inactivación del gen rdxA (tipo I), inactivación de los genes rdxA y frxA

(tipo II) o inactivación de frxA (tipo III), lo que pudiera estar ocurriendo en las

cepas estudiadas ya que 43 cepas (33%) presentaron el gen rdxA, 82 cepas

(63%) ambos genes y 5 cepas (3.8%) el gen frxA.


9. CONCLUSIONES

Más del 80% de las cepas pediátricas fueron resistentes a metronidazol,

1% resistentes a claritromicina y total sensibilidad a amoxicilina y

tetraciclina.

104/180 cepas pediátricas presentaron el genotipo virulento vacAs1/m1

cagA+/ cagE+ y 8/180 el genotipo vacAs2/m2 cagA+/ cagE+ el cual no es

común entre cepas de Helicobacter pylori.

Se encontró un mayor número de cepas triple positivas

(cagA+vacA+babA+).

No se encontró las mutaciones implicadas en la resistencia a claritromicina

(A2142G, A2143G) y tetraciclina (AGA926-928) en cepas resistentes o con

valor de corte cercano a la resistencia.

130/168 cepas pediátricas resistentes a metronidazol fueron clasificadas

según Jeong et al., 2000 en tipo I, tipo II o tipo III; 33% presentaron gen

rdxA, 63% ambos genes y 3.8% gen frxA.


10. APÉNDICE

Gelosa base de Casman con sangre de caballo al 7.5% sin inhibidores

a. Pesar la cantidad necesaria para 1litro de agar Casman (BBL No. Cat.

11106), diluir en 915 mL de agua destilada y preparar según las

indicaciones.

b. Enfriar a 45C. Adicionando 10 mL del antibiótico es decir con inhibidores

(vancomicina 3mg/mL, trimetroprim 5mg/mL, anfotericina B 2mg/mL) y 75

mL de sangre de caballo desfibrinada estéril (BBL No. Cat. 12382)

c. Agitar y vaciar 30 mL en placas desechables estériles. Para 1 litro de medio

se obtienen aproximadamente 32 placas.

Caldo Brucella con suero de caballo 10%

Peptona de caseína (BBL No. Cat. 11910) 10 g/L

Peptona de carne (BBL No. Cat. 12303) 10 g/L

Dextrosa (BBL No. Cat. 11863) 1 g/L

Extracto de levadura (BBL No. Cat. 11928) 2 g/L

NaCl 5 g/L

Agua destilada 1000 mL

Ajustar el pH 7.3 0.2. Esterilizar 121 lb por 15 minutos. Enfriar a 45C. Adicionar

10 mL de suero de caballo en condiciones de esterilidad por cada 100mL de caldo

preparado. Repartir en volúmenes que se requieran.

Caldo Brucella para congelación a –70º C

Caldo Brucella (preparado como se indicó) 65mL

Glicerol (esterilizado 121 lb por 30 minutos) 25 mL

Suero de caballo 10 mL

Mezclar todos los ingredientes en condiciones de esterilidad.

Colocar 800 µL del caldo Brucella-glicerol en criotubos para congelación a –70ºC

de 1.5 mL.


Medio de Mueller Hinton con 10% de sangre de caballo.

a. Pesar la cantidad necesaria par 1 litro de agra Mueller-Hinton (BBL No.

Cat. 11438), disolver en agua destilada y preparar según las indicaciones.

b. Enfriar a 45 C y adicionar 100mL de sangra de caballo desfibrinada estéril

(BBL No. Cat. 12382).

c. Agitar y vaciar 30 mL en placas desechables estériles. Para 1 litro de medio

se obtienen aproximadamente 32 placas.

Medio de urea

Agar bacteriológico (BBL No. Cat. 11848) 0.6 g

Rojo de fenol 0.1 % 5 mL

Urea 10% 10 mL


Disolver 0.6 g de agar bacteriológico en 85 mL de agua destilada, calentar a

ebullición hasta su disolución completa, adicionar 5 mL de rojo de fenol 0.1%,

mezclar perfectamente y ajustar al pH 6.0 (amarillo). Esterilizar 121 lb por 15

minutos. Enfriar a 45 C y agregar 10 mL de urea esterilizada por filtración. Vaciar

2 mL del agar en tubos.

Rojo de fenol 0.1%

Rojo de fenol (BBL No. Cat. 12055) 0.1 g

NaOH 1N c.b.p disolver el rojo de fenol


HCL 1N c.b.p ajustar pH

Disolver 0.1 g de rojo de fenol en 50 mL de agua destilada, adicionar una gotas de

NaOH 1N hasta su disolución completa, agitando constantemente por 5 minutos.

Ajustar el pH a 6.8 (neutro: color rojo) con HCL 1N. Esterilizar 121 lb por 15

minutos. Guardar a 4 C en frasco ámbar libre de la luz.

Nota: El reactivo preparado tiene una caducidad de 6 a 12 meses. No utilizar si se

observa precipitado.


Solución de urea 10%

Urea grado reactivo 10 g


Esterilizar con filtro de nitrocelulosa 0.22 m. Guardar a 4 C en frasco ámbar.

Nota: El reactivo preparado tiene una caducidad de 6 a 12 meses. No utilizar si se

observa precipitado o turbio.

Catalasa al 30%

H2O2 (30%) 30 mL


Proteger de la luz y almacenar en un lugar frío. Mantener en un frasco ámbar con

tapón de rosca.

Reactivo de Kovacs, para la evaluación de la oxidasa

Dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina 1 g


Proteger de la luz, refrigerar y evitar la oxidación agregando ácido ascórbico al

1%. Conservar en frasco ámbar.

Regulador TE, pH 8.0: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1Mm pH 8.0

Solución stock 5x

Trizma base 0.6055 g

EDTA 0.2081 g

Disolver con agua desionizada 50 mL

Ajustar el pH a 8.0 con HCl 1N aforar a 100 mL.


Solución de Bromuro de etidio 0.5 g/mL

Solución patrón 5 g/mL

Bromuro de etidio 25 mg

Agua desinozada 5 mL

Diluir 100 L de la solución patrón 5 mg/mL en 999.9 mL de agua destilada para

obtener una concentración final de 0.5 g/mL.

Nota: El bromuro de etidio es cancerígeno por lo que debe ser tratado con precaución

utilizando guantes y cubre bocas. Una vez preparado debe mantenerse fuera de la luz.


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