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Ciência Rural, v.36, n.5, set-out, 2006.

Ciência Rural, Santa Maria, v.36, n.5, p.1507-1510, set-out, 2006

ISSN 0103-8478

RESUMO

Descreve-se um caso de infertilidade de umjumento SRD confirmada por meio de microscopia eletrônicade transmissão (MET). O espermiograma, avaliado sobmicroscopia ótica, revelou baixa motilidade e altaconcentração de anormalidades espermáticas do tipo gotacitoplasmática proximal. O material foi avaliado por MET,observando-se um acúmulo desordenado de microtúbuloscausando protusões irregulares na região do colo espermático.O último teste realizado correspondeu ao de fertilidade in vivo,utilizando-se quatro éguas portadoras de bom históricoreprodutivo, nas quais não foi possível confirmar nenhumaprenhez. Frente aos resultados obtidos, associados aos achadosda MET, estabeleceu-se o diagnóstico de infertilidade associadaa defeito microtubular dos espermatozóides.

Palavras-chave: jumento, espermatozóides, defeitomicrotubular, microscopia eletrônica,infertilidade.

ABSTRACT

A donkey infertility was described by transmissionelectron microscopy (MET). The spermiogram evaluated bylight microscopy showed low sperm motility and highconcentration of abnormal sperm with proximal cytoplasmicdroplets. The material was evaluated by MET, where it wasobserved disarrangement of microtubules, causing irregularprotrusions in the spermatic neck. The last test done was the invivo fertility, using four mares, with a reproductive healthyhistoric, where no pregnancy occurred. Facing the results thatwe had in vivo, associated with the MET findings, we diagnosedinfertility associated with microtubular defect of thespermatozoa.

Key words: donkey, spermatozoa, microtubular defect, electronmicroscopy, infertility.

INTRODUÇÃO

Ao longo dos anos, muitos pesquisadorestêm buscado desenvolver ensaios laboratoriaiscapazes de predizer com exatidão a capacidadefertilizante de amostras seminais (GRAHAM, 2001),permitindo dessa forma um manejo efetivo dereprodutores (KIRK et al., 2005). Nesse sentido, osespermatozóides são avaliados rotineiramente por meiode microscopia ótica, observando-se as característicasfísicas relacionadas à morfologia e à qualidade domovimento desenvolvido pelas células espermáticas(JOSHI et al., 2001). No entanto, isoladamente, amorfologia e a motilidade espermática representamapenas indicações grosseiras da real capacidadefertilizante de um ejaculado (BLOTTNER et al., 2001),que depende, sobretudo, da integridade dos diferentescompartimentos celulares dos espermatozóides e desuas funções características (MAGISTRINI et al., 2001).

Embora os ensaios laboratoriais, como adeterminação da motilidade espermática, possam serutilizados para uma rápida avaliação de uma amostraseminal, esses testes não permitem o acesso àsalterações que ocorrem em proporções sub-celulares(KIRK et al., 2005). Quando os defeitos morfológicosse expressam por alterações em escala nanométrica(nm), ocorrem falhas nos métodos tradicionais deavaliação, havendo a necessidade do emprego damicroscopia eletrônica (JOSHI et al., 2001).

A ultra-estrutura dos espermatozóides devertebrados e invertebrados tem sido intensivamente

1Programa de Pós-graduação em Reprodução Animal, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (FMVZ, UNESP).Distrito de Rubião Junior, s/n, 18610-000, Botucatu, SP, Brasil. Email: andremacc@yahoo.com.br. Autor para correspondência.

2Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ-UNESP), Botucatu, SP, Brasil.

Infertilidade associada a defeito microtubular dos espermatozóides de jumento (Equusasinus) avaliados por microscopia eletrônica de transmissão

André Maciel Crespilho1 Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga2 Frederico Ozanam Papa2

Infertility associated with microtubular defect in a donkey (Equus asinus) spermatozoa evaluated bytransmission electron microscopy

Recebido para publicação 27.09.05 Aprovado em 05.04.06

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estudada ao longo de muitos anos, especialmente pormicroscopia eletrônica de transmissão (ELLIS et al.,2002; JOSHI et al., 2001). A avaliação do sêmen eqüinopor meio de microscopia eletrônica de transmissão(MET) é caracterizada pela observação de grandeheterogeneidade morfológica e pela presença de váriasanomalias que não podem ser evidenciadas pelamicroscopia ótica convencional (LANDIM-ALVARENGA & ALVARENGA, 1997).

Descreve-se um quadro de infertilidaderelacionada a asthenoteratozoospermia de um jumentoSRD, apresentando uma alta incidência deespermatozóides portadores de gotas citoplasmáticasproximais à microscopia ótica.

Um jumento de 4,5 anos foi encaminhadoao Departamento de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP, Botucatu/SP, em 15/04/2004, com um quadrosugestivo de infertilidade, uma vez que cobriu cerca de50 fêmeas nas estações de monta de 2003 e 2004, nãose confirmando nenhuma prenhez. O exame físico geralnão revelou nenhuma anormalidade indicativa deenfermidade sistêmica. Ao exame específico externo,observou-se tamanho e consistência normal paraambos os testículos. A libido apresentava-se semalterações, recebendo uma pontuação “8” (escala de 0a 10).

Uma amostra seminal foi obitida por meiode vagina artificiala, observando-se normalidade devolume e concentração espermática. No entanto, aanálise computadorizada do movimento espermático,realizada por meio do aparelho Hamilton ThornResearch®, revelou baixa motilidade total (MT=20%) eprogressiva (MP=5%), padrão que se repetiu em umasegunda coleta. A morfologia espermática foideterminada por meio de esfregaços corados pelométodo de Karras modificado por PAPA et al (1988),observando-se 55,5% de células normais; 18,5% degotas citoplasmáticas proximais e 10,5% distais; 6,5%de anormalidades de peça intermediária, entre outrosdefeitos.

Com o objetivo de se determinar a origemprimária da asthenoteratozoospermia, foram instituídascoletas seminais seriadas para realização de exameslaboratoriais complementares. Em uma primeira análise,objetivou-se avaliar o efeito da retirada do plasmaseminal e da adição de meios diluentes a base de leiteem pó desnatadob (Botu-Turbo®) sobre a motilidadeespermática. Em uma segunda análise, foram avaliadasas características do sêmen frente à adição de plasmaseminal heterólogo, testando-se a hipótese deimobilização espermática relacionada à produção deisoanticorpos anti-espermatozóides. Nesse teste, ascélulas espermáticas foram separadas por meio de

centrifugação (250 x g por 10 minutos) e ressuspendidasem plasma seminal de um garanhão Árabe, portador dehistórico reprodutivo normal.

A terceira análise correspondeu àpreparação das amostras seminais para microscopiaeletrônica de transmissão, segundo LANDIM-ALVARENGA & ALVARENGA (1997). O ejaculado foicentrifugado a 300 x g por 10 minutos, fixando-se opellet formado em uma solução de glutaraldeído a 2,5%,tamponado em PBS 0,1mol l-1, em pH de 7,4. Após 3 a 24horas de fixação, os pellets foram enxaguados emsolução tampão fosfato e pós-fixados em solução detetróxido de ósmio a 1%, tamponada em PBS, durante 3horas à temperatura de 4°C. Subseqüentemente, osespermatozóides foram desidratados em gradientecrescente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) por 5minutos em cada escala. Foi utilizada resina Araldite502 para as inclusões do material, que finalmente foicortado (cortes ultrafinos de 50 nm) e corado comsolução saturada de acetato de uranila em álcool etílico50% e, posteriormente, em citrato de chumbo. Asamostras foram examinadas e fotografadas utilizando-se o aparelho Phillips EM® 301.

A última análise correspondeu ao teste defertilidade in vivo, realizado com 4 éguas de históricoreprodutivo sabidamente normal, acompanhadas ultra-sonograficamente (Pie Medical Scanner® 200) quantoao desenvolvimento folicular a cada 12 horas. Todasas fêmeas tiveram ovulação induzida com 2500 UI dehCGc (Vetecor®), procedendo-se as inseminações com1 bilhão de espermatozóides totais, a cada 12 horas atéa constatação da ovulação. Cada égua foi utilizada por2 ciclos estrais consecutivos, sempre inseminadas commaterial proveniente do jumento em teste. Odiagnóstico de gestação foi realizado com 12 econfirmado aos 14 dias pós-inseminações por meio daultra-sonografia trans-retal.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O primeiro teste indicou que a ressuspensãopromoveu evidente melhora nas característicasseminais (MT=70%, MP=46%), resultadosprovavelmente relacionados ao efeito estimulante daatividade flagelar proporcionada pelos açúcares quecompõem o meio diluidor. Já a ressuspensão em plasmaseminal heterólogo não revelou melhora apreciável nascaracterísticas do ejaculado, descartando-se apossibilidade de toxicidade do tipo antígeno/anticorpos(MT=30%; MP=12%).

Ao exame de MET, foi observado umacúmulo desordenado de microtúbulos na região da

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cabeça e do colo espermáticos (Figuras 1A e 1B). Osignificado desses microtúbulos não foi elucidado,porém sua ocorrência pode ocasionar protusõesirregulares no colo, segundo LANDIM-ALVARENGA& ALVARENGA (1997), semelhantes a gotascitoplasmáticas (Figura 1C), indicam uma anormalidadeem alguma das etapas da espermatogênese,provavelmente de caráter genético. Originalmente, asgotas representam pequenas massas citoplasmáticasde 2-3μ de diâmetro, sendo comumente encontradasem baixas porcentagens na região da cauda dosespermatozóides (BARTH & OKO, 1989). No entanto,em estudos ultra-estruturais de espermatozóideseqüinos conduzidos por CACECI & VARNER (1987),observou-se que em alguns casos muitos microtúbulospodem aparecer no interior das massas citoplasmáticas,sendo essa alteração classificada como defeitomicrotubular espermático, conforme relato anterior deLANDIM-ALVARENGA & ALVARENGA (1997), quediagnosticaram a patologia em um garanhão Árabe,também portador de histórico reprodutivo deinfertilidade.

Em relação ao possível caráter genético dodefeito microtubular, ESCALIER (2003) indica que aenzima conjugada ubiquitina (UBE2B) está envolvidana organização das estruturas periaxonemais de ratos,observando-se, em animais “knock out”, um grandeprejuízo na espermatogênese em relação a falhas namorfogênese da cauda espermática. Nesse sentido,LATINI et al (2004) apontam uma clara importância decomponentes genéticos nos quadros de infertilidadehumana, relatando um caso de união consangüíneaque resultou em um indivíduo do sexo masculino com

100% de teratozoospermia, traduzida por agenesias decauda espermática, defeitos microtubulares e alteraçõesnas fibras que compõem o axonema. Uma possívelexplicação para estes achados corresponde àpersistência da manchete espermática, representada porum conjunto de microtúbulos responsáveis peloalongamento e formatação do núcleo das espermátidesdurante a espermiogênese (KNOBIL et al., 1994). Amanchete não é normalmente observada em célulasmaduras, evidenciando-se sua migração em sentidocaudal durante a fase final do desenvolvimento dasespermátides, formando um eixo de suporte para o canalflagelar (JOHNSON et al., 1997).

O defeito microtubular em espermatozóidesde invertebrados também parece estar relacionado àpersistência da manchete espermática, provavelmentecomo resultado do não-silenciamento de genesexpressos exclusivamente durante a fase inicial daespermiogênese (BACCETTI et al., 2004). Nessesentido, ESCALIER (2003) aponta o proteossoma 26Scomo componente protéico encontrado no interior damanchete, apresentando uma função marcadamenteproteolítica durante a fase de remodelamento estruturaldos componentes da cauda espermática. Tendo emvista sua importância, torna-se plausível especular anão tradução do proteossoma 26S como um possívelfator causal envolvido nos quadros de defeitosmicrotubulares espermáticos.

Conclui-se então que a alta ocorrência degotas citoplasmáticas observadas sob microscopiaótica relacionavam-se à presença de pequenasquantidades de citoplasma protruído, correspondenteao defeito microtubular observado, fator este

Figura 1 - Micrografias de espermatozóides de jumento obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A) micrografiaeletrônica mostrando o acúmulo de microtúbulos (mt) na região do colo espermático (ce); B) cortes transversais da regiãopós-acrossomal da cabeça espermática ilustrando o acúmulo de microtúbulos (mt) lateralmente ao núcleo (n); C) detalhe docolo espermático de espermatozóides com acúmulo de microtúbulos em ambos os lados; onde: ax= axonema; m= mitocôndria;dc= debris celulares.

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determinante da baixa motilidade espermática pós-coleta. Ao teste de fertilidade, não foi constatadanenhuma prenhez, resultados que, associados aosachados de MET, forneceram subsídios para oestabelecimento do diagnóstico definitivo do quadrode infertilidade do animal.

Em suma, a popularização das técnicas deMET na avaliação da infertilidade masculina humana eanimal proporcionam a formação de uma base sólidapara o melhor entendimento dos processospatofisiológicos envolvidos e para uma melhoradequação das condutas terapêuticas a seremseguidas. Até o presente, muitos aspectos relacionadosà infertilidade do macho continuam obscuros,sobretudo nos quadros envolvendo componentesgenético-familiares, linha de pesquisa carente por maisestudos, especialmente no tocante à expressão gênicadiferencial da espermatogênese, base inicial dosdiversos quadros de infertilidade.

FONTES DE AQUISIÇÃO

aVagina artificial e meio bBotu-Turbo® (Biotech Ltda, Botucatu/SP).cVetecor® (Laboratórios Calier do Brasil Ltda).

REFERÊNCIAS

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