imunohistoquímica

Imunohistoquímica

Licenciatura: Bioquímica

Unidade Curricular: Bioquímica Analítica

Daniela Pereira

Introdução:

Técnica para identificação de constituintes dos tecidos ou células

(antigénios (Ag)), através da interacção com um anticorpo (Ac) específico

e a sua ligação a um agente que produz cor.

É uma técnica selectiva e bastante específica.

Aplicações:

Diagnóstico quando a morfologia e dados clinicopatológicos não o permitem

Distinção entre tumores histologicamente semelhantes

Identificação do sub-tipo histológico

Caracterização de tumores malignos não diferenciados ou pouco diferenciados para determinar se são primários ou metásticos

Identificação de micrometástases

Permite diagnóstico, prognóstico e orientação terapêutica

Escolha da metodologia:

Tipo de amostra

Disponibilidade do Ac primário

Grau de sensibilidade

Tempo de processamento necessário

Custo dos reagentes

Materiais:

Procedimento (Método

Enzimático) :1 – Desparafinação e hidratação

2 – Recuperação antigénica (30m)

3 – Bloqueio das peroxidases endógenas (30m)

4 – Soro Normal

5 – Anticorpo primário (2h ou ON)

6 – Anticorpo secundário biotinilado

7 – Streptavidina Biotina Peroxidase

8 – Substrato/cromogéneo:3,3-diaminobenzidina (DAB)

9 – Contraste nuclear

10 – Desidratação

11 - Montagem



2 – Recuperação antigénica (30m) 3 – Bloqueio das peroxidases endógenas (30m)

4 – Soro Normal




8 – Substrato/cromogéneo: 3,3-diaminobenzidina (DAB)



11 - Montagem

Recuperação antigénica ( t ratamento

térmico) :

Microondas (MO)

Tampão citrato ou um detergente por exemplo o extran

Zonas quentes e frias

• Microondas a 750W

• Vários ciclos

• Arrefecimento no tampão durante 30m

Panela de Pressão (pp)

Tampão citrato ou um detergente por exemplo o extran

Distribuição homogénea de calor

• Panela de Pressão

• Arrefecimento brusco em tampão





4 – Soro Normal

5 – Anticorpo primário (2h ou ON) 6 – Anticorpo secundário biotinilado


8 – Substrato/cromogéneo: 3,3-diaminobenzidina (DAB)



11 - Montagem

Optimização do Anticorpo primário:

Diluição óptima do anticorpo:

• Tempo de incubação

• Temperatura de incubação (4ºC, temperatura ambiente, 37ºC)

• Série experimental de diluições

• Intensidade de coloração e presença mínima de ruído de fundo





4 – Soro Normal



7 – Streptavidina Biotina Peroxidase 8 – Substrato/cromogéneo: 3,3-diaminobenzidina (DAB)



11 - Montagem

Método Directo:

• O cromogénio está ligado ao anticorpo primário e é aplicado directamente sobre os tecidos.

• É um método rápido.

• Revela muitos falsos positivos e é pouco específico.

Método Indirecto

:

• É mais específico que o método directo e tem menos falsos positivos.

• Envolve a acção de dois anticorpos:

Primário que se liga especificamente ao antigénio que procuramos ;

Secundário que identifica o Ac primário e que tem já ligado a si o cromogénio.

MétodoEnzimáti

co:

• Diminui as ligações inespecíficas e

amplifica o sinal.

• Diminuição do preço da técnica.

• O Ac secundário não está ligado ao

cromogénio e liga-se a um complexo

enzimático, assim como acontece:

No método Streptavidina biotina

peroxidase (AVD) e no método

peroxidase-anti-peroxidase (PAP).





4 – Soro Normal




8- Substrato/cromogéneo:3,3-diaminobenzidina (DAB)9 – Contraste nuclear


11 - Montagem

Marcadores:

• Enzimas – a sua incubação com um cromogénio produz uma reacção cujo produto final é uma coloração estável, visível em microscopia fotónica. Peroxidase de rábano é a enzima usada.

• Metais coloidais

• Fluorescentes

• Radioactivos

Fases Críticas:

Fixação• Não existe fixador ideal • Mal fixado vs fixação em excesso

Recuperação antigénica• Conservação do material • pH correcto • Tipo de calor • Tipo de tampão • Métodos enzimáticos

Anticorpo• Afinidade, reactividade cruzada • Tempo de incubação

Revelação• Pouco revelado • Muito revelado / queimado

imunohistoquímica

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