Ginkgo biloba –Importantes parâmetros de controle de qualidade na escolha do extrato de Ginkgo biloba

O Ginkgo biloba

Os extratos de Ginkgo biloba foram intro-duzidos na medicina em 1965, através das pesquisas do médico-farmacêutico alemão Willmar Schwabe. A folha de Ginkgo con-tém muitos ingredientes ativos, incluindo flavonóides, diterpenos, ginkgolideos, sesquiterpenos entre outros (Banov e colaboradores, 1999; WHO, 1999). Os fla-vonóides aparecem na forma glicosilada, sendo as agliconas mais comuns o kaempferol, a quercetina e a isorhamneti-na. Entre os biflavonóides encontra-se a amentoflavona, a bilobetina, a ginkgetina e a isoginkgetina. Dentre os demais com-postos se destacam os diterpenos (gink-golídeos A, B, C, J, K, L e M) e os sesqui-terpenos (bilobalídeos) (Singh et al., 2008). De acordo com a composição quí-mica, a literatura preconiza que o extrato padronizado EGB761 deve conter um teor mínimo de 24% de flavonóides glicosila-dos e 6% de terpenóides. Entretanto, a concentração dos ácidos ginkgólicos (alquilfenóis) não deve ser superior a cin-co partes por milhão (5 ppm), devido à sua toxicidade (Blumenthal, 2000). Dentre as partes utilizadas do Ginkgo biloba encontramos os grãos de pólen, semen-tes, frutos, troncos e folhas, esta última das quais têm se extraído a maioria dos princípios ativos de ação terapêutica e de onde baseiam-se a grande maioria dos

estudos farmacológicos. A Farmacopéia Chinesa recomenda o emprego de Ginkgo biloba para o tratamento de coração e pulmões. Estudo recentes comprovaram a sua atuação em situações de alteração de fluxo sanguíneo e na arterosclerose cere-bral. (Banov e colaboradores, 1999; WHO, 1999).

As ações farmacológicas de G. biloba L. encontram-se bem descritas cientifica-mente e consistem na diminuição da hipóxia no tecido cerebral, inibição do desenvolvimento de edema cerebral pós-traumático e induzido por toxina, redução do edema da retina e lesões celulares na mesma, inibição da diminui-ção da quantidade de receptores relacio-nada à idade e comum entre os recepto-res colínicos muscarínicos e adrenér-gicos α2, melhora a captação de colina no hipocampo, aumenta a memória e a capacidade de aprendizagem, ajuda na compensação de distúrbios do equilí-brio, melhora o fluxo sanguíneo na região da microcirculação, melhora as propriedades reológicas do sangue, remove radicais livres derivados do oxigênio, exerce antagonismo ao fator de agregação das plaquetas (PAF) e efeito neuroprotetor (Blumenthal, 2000; Cupp, 2000).

Ginkgo biloba L. é indicado em doenças cerebrais orgânicas, como por exemplo, a falha de memória, dificuldades de con-centração, depressão, vertigem, zumbido e dor de cabeça, melhora na distância que o paciente consegue andar sem sen-tir dor causada pela doença arterial periférica oclusiva (claudicação intermi-tente), vertigem ou zumbido de origem vascular ou complexa (Mckenna et al., 2001).

As toxicidades aguda e crônica dos ex-tratos de Ginkgo biloba são muito baixas; a DL 50 em camundongos foi 7725 mg/Kg de peso corporal após administração via oral e 1100 mg/Kg de peso corporal após aplicação intravenosa.

Pesquisas com o extrato não mostraram efeitos mutagênicos, carcinogênicos ou teratogênicos (Rister 1994).

Aspectos regulatórios

Uma pesquisa de Carvalho et al. em 2008 determinou um panorama dos medicamentos fitoterápicos registrados pela ANVISA no Brasil. Encontraram 432 fitoterápicos simples e 80 compostos registrados, dentre estes, até a data do estudo, a espécie vegetal com maior número de derivados registrados era o Ginkgo (Ginkgo biloba), com 33 respecti-vamente. (Carvalho 2008)

A Anvisa buscou estabelecer a padroni-zação de marcadores químicos para diver-sas plantas e limite diário para seu uso, sendo assim por meio da Instrução Nor-mativa nº 5, de 11 de dezembro de 2008 (Brasil, 2008), publicou em sua lista de fitoterápicos de registro simplificado a padronização para o extrato de Ginkgo biloba: “Extrato a 22-27% ginkgoflavonói-des (Quercetina, Kaempferol, Isorhamne-tina), 5 a 7% de terpenolactonas (Biloba-lídeo, Ginkgolídeos A,B,C,J)”. Estes números são baseados em ensaios da literatura mundial, principalmente nas farmacopéias Européia e Americana (EP 6.1; USP 32).

O Ginkgo biloba é um dos mais famosos fitoterápicos do mercado mundial, seu processo de produção é extremamente complexo e custoso, o que torna este extrato alvo comum de adulteração. A padronização atual determinada mundial-mente e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária na IN 5 (Brasil 2008, USP 32, EP 6.1) é: Extrato a 22-27% ginkgoflavonóides (Quercetina, Kaempfe-rol, Isorhamnetina), 5-7% de terpenolac-tonas (Bilobalídeo, Ginkgolídeos A,B,C,J). Entretanto, testes de produtos comerciais vendidos em farmácias realizados por laboratórios independentes revelam adul-teração no extrato de Ginkgo biloba por glicosídeos flavonóicos de outras origens.

Em 1999 o laboratório independente ame-ricano, ConsumerLab testou o conteúdo de glicosídeos flavonóicos em 32 amostras de medicamentos tendo como base de comparação o extrato padronizado 24/6 de Ginkgo biloba. 75% das amostras passaram no teste. Embora este resultado seja satisfatório, em 2003 este mesmo teste foi realizado e o resultado foi que apenas 25% das amostras passaram (Myers 2008), o que demonstra uma que-da na qualidade da matéria-prima utiliza-da na produção destes medicamentos nos EUA.

A presença característica de terpeno lac-to-nas (Bilobalídeo e Ginkgolídeos A, B, C e J) fornece evidências de que o extrato é originário da planta Ginkgo biloba. As fo-

lhas de Ginkgo biloba possuem natural-mente mais terpenolactonas que glicosí-deos flavonóicos, portanto atingir os 6% de terpenolactonas raramente é um pro-blema.

Por outro lado, para atingir 24% de flavo-nóides uma quantidade maior de folhas se faz necessária (Myers, 2008).

A quantificação de glicosídeos flavonóicos (quercetina, kaempferol e isorhamnetina) não exclui necessariamente a possibilidade de adulteração dos extratos de ginkgo por agliconas isoladas (ex. quercetina, kaempferol e isorhamnetina), flavonóides glicosilados isolados (ex. hiperosídeo, rutina) ou outro material vegetal contendo flavonóides e flavonóides glicosilados (Sloley 2003). Essa adulteração é de baixo custo e pode facilmente contornar os testes realizados no controle de qualidade. Segundo métodos farmacopéicos (USP 32, EP 6.1), a determinação quantitativa desse extrato é feita por hidrólise ácida, sendo a quantificação reduzida à 3 agliconas. A mutiplicação do resultado pelo fator de 2.5 permite calcular o teor total de glicosí-deos flavônicos. Caso o controle de quali-dade não seja minucioso, isso abre prece-dente para um produtor inescrupuloso que, constatando que seu extrato não tem o teor necessário de glicosídeos flavonói-cos, fica tentado à incluir flavonóides pro-venientes de outras fontes. Um exemplo de adulteração foi a encontrada por Sloley et al., que em seu estudo encontrou uma

Qualidade da matéria-prima, adulterações, métodos de detecção

Quantidade de flavonóides provenientes de outras fontes adicionados a extratos adulterados de Ginkgo biloba versus o teor de glicosídeos flavonóicos que estes simulam no produto final.

das amostras com uma alta concentração de Rutina (indicando adulteração) e outra mais grave ainda, sem a presença de Ginkgolideos B e C (que indica sequer a presença da planta Ginkgo biloba) (Sloley 2003).

Como forma de exemplificação, na Figura 1 observamos o cromatograma de um genuíno extrato 24% de flavonóides com todos os seus glicosídeos flavonóicos. Já a Figura 2 mostra o resultado somente das Ginkgo agliconas, ou seja, um extrato genuíno de Ginkgo biloba 24% após hidró-lise ácida.

Os glicosídeos flavonóicos podem ser sepa-rados dos terpenos durante a produção, o que facilita o produtor desonesto a sim-plesmente controlar os terpenos a 6%, enquanto adiciona glicosídeos em forma de rutina (que contém 98% de quercetina e é encontrada em abundância no trigo sarraceno), e/ou kaempferol (proveniente da planta chinesa Fructus Sophorae) ou ainda de outra forma barata de quercetina (Myers 2008; Patterson 2009).

Fig. 2: Cromatograma de CLAE – Ginkgo Agliconas – Extrato genuíno 24% Glicosídeos flavonóico (Fonte Finzelberg GmbH).

Fig. 1: Cromatograma de CLAE – Ginkgoflavonóides – Extrato genuíno 24% Glicosídeos flavonóicos (Fonte Finzelberg GmbH).

Fig 1: Cromatograma de CLAE Ginkgoflavonóides Extrato genuíno

Substância adulterante Porcentagem de glicosídeos flavo-nóicos simulados no produto final

1% quercetina 2.5%

1% kaempferol 2.5%

1% rutina 1.24%

O aspecto mais preocupante desta adul-teração é que não há estudos que com-provem a eficácia e segurança no extrato modificado, já que este não é mais fiel aos extratos utilizados nos testes clínicos e toxicológicos do Ginkgo biloba.

Embora a adição de rutina ou outros adulterantes seja contornada facilmente, uma observação minuciosa nos resultados da identificação por Cromatografia em Camada e da quantificação de flavonóides dão indicativos da falsificação.

A cromatografia em camada delgada com leitura sob luz UV é um procedimento simples descrito na Farmacopéia Européia (EP 6.1) muito utilizado na identificação de material vegetal. Observe na Figura 3 um exemplo de como é fácil identificar uma adulteração de material.

As amostras que sofreram adição inescru-pulosa de material possuem a coloração respectiva ao aditivo mais acentuada que a amostra genuína, como podemos obser-var nas amostras 1, 3, 5 e 6.

Entretanto, o teste mais comumente utili-zado na indústria para análise de extrato vegetal é a CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência). Comparando os resul-tados das Figuras 4 e 5 notamos que a análise minuciosa de todos os glicosídeos flavonóicos (Figura 4) mostra com clareza a adulteração dos flavonóides específicos. Já a análise das ginkgo agliconas (Figura 5) deve ser cuidadosamente observada. Note que no caso de adulteração a proporção entre os componentes é discrepante.

Fig. 3: Cromatograma da análise de Ginkgo Glicosídeos Flavonóicos por Cromatografia em camada delgada de amostras comerciais de Ginkgo biloba (Fonte Finzelberg GmbH).

Amostra 1 Adulteração por Rutina; Amostra 2 Extrato Genuino; Amostra 3 Adulteração por Rutina e Quercetina; Amostra 4 Substâncias de Referência; Amostra 5 Adulteração com Quercetina; Amostra 6 Adulteração com Rutina e Kaempferol.

Obs.: Fotografado sob luz UV 365 nm

Fig. 4:Cromatogramas de CLAE – Ginkgo Glicosídeos Fla-vonóicos – Extratos Adulterados (Fonte Finzelberg GmbH). Comparação do extrato adulterado com o extrato genuíno (Fonte Finzelberg GmbH).AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Kaempferol

FigCrovonGm

AMOSTRA 1: Adulteração Rutina AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Quercetina

Extrato Finzelberg

Finzelberg apresenta seu extrato de Gink-go Biloba com 2 especificações diferentes, um contempla todos os parâmetros exigi-dos pela Farmacopéia Européia e o outro os parâmetros da Farmacopéia Americana. A tabela ao lado apresenta um resumo de ambos. Para maiores informações entre em contato com nosso escritório no Brasil: MB Brasil. Quadro comparativo entre as diferentes especificações dos extratos de Ginkgo biloba apresentados pela Finzelberg

Farmacopéia Americana (USP) Farmacopéia Européia (EP)

Identificação por CCD de Flavonóides

Confere com padrão Confere com padrão

Ensaio Glicosídeos Flavonóicos (%)

22,0 - 27,0 22,0 - 27,0

Ensaio Terpenolactonas (%) 5,4 - 7 5 - 7

Ensaio Bilobalídeo (%) min 2,6 2,6 - 3,2

Ensaio Ginkgolídeos A, B, C (%) min 2,8 2,8 - 3,4

Ensaio Ácidos Ginkgolicos (%) max 5ppm max 5ppm

Fig. 5:Cromatogramas de CLAE – Ginkgo Agliconas – Comparação do extrato adulterado com o extrato genuíno (Fonte Finzelberg GmbH).AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Kaempferol

AMOSTRA 1: Adulteração Rutina AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Quercetina

Observe também que os picos referentes a quercetina e kaempferol são muito pareci-dos quando não iguais, e o pico da iso-rhamnetina é cerca de 1/5 destes. Muitos fatores podem influenciar a razão entre os picos analisados (mudança geográfica, clima, safra, processamento, etc.) entre-tanto, estudos realizados com amostras provenientes da Alemanha, França, EUA e China, juntamente com a literatura já publicada possibilitaram a American Her-bal Pharmacopeia a sugerir uma propor-ção de 4:4:1 a 6:5:1 de Quercetina, Kaemp-ferol e Isorhamnetina respectivamente (Myers 2008).

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BG-F

BGiB

i-P1

-05.

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