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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO – UFOP

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Implicações da evolução clínica e da carga parasitária em

aspectos histopatológicos da pele de cães naturalmente

infectados por Leishmania (Leishmania) infantum

JAMILLE MIRELLE DE OLIVEIRA CARDOSO

OURO PRETO - 2013

JAMILLE MIRELLE DE OLIVEIRA CARDOSO

Implicações da evolução clínica e da carga parasitária em

aspectos histopatológicos da pele de cães naturalmente

infectados por Leishmania (Leishmania) infantum Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro

Preto, como parte integrante dos requisitos para

obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas,

área de concentração Imunobiologia de Protozoários.

Orientadora: Cláudia Martins Carneiro

Co-orientador: Alexandre Barbosa Reis

OURO PRETO

Catalogação: [email protected]

C268i Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira.

Implicações da evolução clínica e da carga parasitária em aspectos histopatológicos

da pele de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania)

infantum [manuscrito] / Jamille Mirelle de Oliveira Cardoso - 2013.

xii, 75 f.: il. color.; grafs.; tabs.

Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Martins Carneiro.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de

Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa

de Pós-graduação em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.

1. Leishmania - Teses. 2. Pele - Teses. 3. Cão - Teses. 4. Inflamação - Teses. 5. Parasitismo

- Teses. I. Carneiro, Cláudia Martins. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III.

Título.

CDU: 591.557.8:616.993.12

mailto:[email protected]

DEDICATÓRIA

i

Dedico essa conquista aos meus pais,

Dalva e Eduardo, e ao meu irmão Felipe.

Sem vocês, nada teria sentido.

DEDICATÓRIA

ii

À Deus, fonte de toda sabedoria, pelo dom da vida, por me guiar no caminho do bem e

por ter colocado na minha vida pessoas tão especiais.

Aos meus pais e irmão, minha família linda, exemplo de força, amor e união. Minha

eterna gratidão pelo carinho, pelas palavras de amor e incentivo. Vocês são tudo o que

tenho de mais importante e saber que estão ao meu lado é suficiente para eu querer

seguir em frente sempre.

À Cláudia, exemplo de profissional, educadora e mãe. Agradeço a paciência,

disponibilidade e atenção, principalmente quando para mim tudo parecia estar perdido.

Obrigada pelas palavras de carinho. Você é especial.

Ao Alexandre, pela oportunidade e paciência. Uma das pessoas mais inteligentes que já

conheci, exemplo a ser seguido, um grande cientista. Obrigada pela atenção durante

esses seis anos de convivência. Espero retribuir toda confiança depositada em mim.

À Paula, que com sua humildade, própria de quem é detentor de grande sabedoria,

soube compartilhar conhecimentos, experiências e vida, com prestatividade inigualável.

Meu particular obrigado pelas horas me auxiliando, pelos conselhos, pela paciência e

acima de tudo, pela amizade e palavras de carinho.

À Nádia, meu anjo da guarda, por ter se disposto a meu favor e a me ajudar em vários

momentos. Sua atenção e carinho foram essenciais nesse tempo de convívio. Com você

aprendi a ser melhor e mais humana.

Ao Fabricio, pelo amor, companheirismo, amizade e por ter participado intensamente de

cada detalhe desta etapa final, me confortando e me acolhendo em todos os momentos

de angústias e me incentivando sempre com suas palavras sábias e animadoras.

Às amigas Flávia, Gláucia, Bruna, Dani e Gê, pelo amor, pela presença nos momentos

mais difíceis (e também mais felizes!) e pela constante paciência para com as minha

imperfeições. Sem vocês, tudo seria mais difícil.

DEDICATÓRIA

iii

À Helen, que mesmo distante continuou presente. Obrigada por me confortar com seus

conselhos amigos, por me fazer enxergar meus verdadeiros valores, por me ouvir, por

sua serenidade e por todo seu carinho. Você é muito especial, exemplo a ser seguido.

Ao Fernando e ao Levis, pela agradável companhia ao longo desses anos. Sem vocês,

todas as alegrias e dificuldades não teriam a mesma graça.

À Ana, Carolzinha, Katita e Lú, além de colegas de trabalho, verdadeiras amigas.

Obrigada pelos sinceros sorrisos, pela paciência, presteza e carinho dedicados a mim.

A todos do LIMP e LPC pela ótima convivência e colaboração em todos os momentos,

em especial à Maria Chaves.

Ao Wendel, pelas palavras de carinho e conforto e pela concessão do material de

estudo.

Ao Bruno, por despertar cada vez mais meu interesse pela pesquisa e por estar sempre

disposto a ajudar.

Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas e todo seu corpo docente pelo

ensino de boa qualidade.

À república Caso Sério, ex e atuais moradoras, por todo suporte prestado ao longo dos

anos e mais intensamente agora nos dois anos de mestrado. Vocês foram indispensáveis.

Gostaria de agradecer especialmente, às irmãs Cíntia, Nana e Karen, pelas palavras de

incentivo, pelo apoio nas horas mais difíceis e pelas alegrias compartilhadas.

RESUMO

iv

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose de grande impacto na saúde

pública sendo a pele o principal ponto de contato de organismos do gênero Leishmania

com os hospedeiros invertebrados. O objetivo desse trabalho foi avaliar a carga

parasitária, o processo inflamatório e as alterações da matriz extracelular na pele de cães

naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum apresentando diferentes

formas clínicas da doença. Para isso, foram utilizados 35 cães sem raça definida,

provenientes da região de Belo Horizonte, MG. Esses animais foram divididos em três

grupos, de acordo com a presença de sinais clínicos, como assintomáticos (n=11, CA),

oligossintomáticos (n=12, CO) e sintomáticos (n=12, CS), além de oito animais

controle. Posteriormente estes animais foram distribuídos em novos grupos, de acordo

com a intensidade do parasitismo cutâneo, sendo classificados em baixo parasitismo

(n=12, BP), médio parasitismo (n=11, MP) e alto parasitismo (n=12, AP). Após exame

clínico verificou-se que os sinais clínicos mais frequentes, sugestivos de LVC, foram as

dermatites (47, 2%), seguidas por linfadenopatia (36, 1%) e emagrecimento (33,3%).

Quanto à carga parasitária, verificou-se que essa foi maior nos grupos CS e CO quando

comparada a CA. Infiltrado inflamatório foi presente em todos os grupos clínicos,

porém esse foi maior nos grupos CA, CO e CS quando comparados ao grupo controle.

Ainda, a inflamação foi maior no grupo CS quando comparado aos grupos CA e CO.

Ao avaliar esse mesmo parâmetro nos grupos com distintos graus de parasitismo, foi

verificado maior inflamação em cães com BP e MP quando comparados aos cães

controle. Além disso, cães com MP e AP possuíam maior processo inflamatório que

cães com BP. A avaliação da matriz extracelular demonstrou redução de colágeno total

nos grupos infectados quando comparados ao grupo controle e nos grupos CO e CS em

relação ao grupo CA. Animais com AP e MP apresentaram diminuição da área de

colágeno em relação a animais controle. Na quantificação das fibras colágenas do tipo I

observou-se redução nos grupos CO e CS quando comparados ao grupo controle e

diminuição da mesma nos cães com MP em relação ao grupo controle. Ainda, em

relação às fibras colágenas do tipo III foi observado um aumento significativo no grupo

CO em relação aos grupos controle e CS e aumento em cães com BP quando comparado

a cães controle e com MP. Esses resultados sugerem que a inflamação crônica e o

intenso parasitismo dérmico foram diretamente relacionados à gravidade da doença e

que esse processo inflamatório está intimamente associado à carga parasitária e as

alterações da matriz extracelular desse órgão.

ABSTRACT

v

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis of major public health impact and the

skin the main point of contact of organisms of the genus Leishmania with invertebrate

hosts. Based on this, the aim of this study was evaluate the parasite load, inflammation

and the matrix cellular alterations in the ear skin of dogs naturally infected with

Leishmania (Leishmania) infantum with different clinical forms and different intensities

of cutaneous parasitism. For that, thirty five dogs naturally infected with Leishmania,

mongrels, from the Belo Horizonte, MG were categorized as asymptomatic (n=11),

oligosymptomatic (n=12) and symptomatic dogs (n=12) and these were compared to

control dogs (n = 8). Later were divided into new groups, according to three different

parasites density: low (n=12), medium (n=11) and high parasitism (n=12). The major

clinical manifestations of visceral leishmaniasis in dogs were dermatitis (47,2%),

lymphadenopathy (36,1%) and weight loss (33,3%). Inflammatory infiltrates were

observed in all groups, varying from intense and/or moderate in symptomatic to discrete

in asymptomatic and control animals. Moreover, the inflammation was higher in

symptomatic dogs when compared to oligosymptomatic and asymptomatic dogs. In

assessing this parameter in groups with different degrees of parasitism, greater

inflammation was observed in dogs with low, medium and high parasitism when

compared to control dogs. In addition, dogs with medium and high parasitism showed

higher inflammatory process those dogs with low parasitism. The mast cells’ number

was higher in oligosymptomatic dogs compared to control dogs and was higher in dogs

with low and medium parasitism when compared to control group. Extracellular matrix

assessment demonstrated decrease in the collagen area in all infected groups when

compared to control dogs and in symptomatic and oligosymptomatic dogs compared to

asymptomatic dogs. Moreover, dogs with high and medium parasitism showed a

decrease in collagen area relative to control animals. Regarding collagen type I there

was only a significant dicrease in symptomatic and oligosymptomatic dogs compared to

the group of uninfected dogs and decrease in dogs with medium parasitism compared to

the group of uninfected dogs. Furthermore, it was verified increase in collagen type III

in oligosymptomatic dogs compared to control group and symptomatic dogs and

increase in dogs with low parasitism in relation the group of uninfected dogs and

medium parasitism dogs. The results suggested that chronic dermal inflammation and

cutaneous parasitism were directly related to the severity of clinical disease and that this

inflammation is closely associated with the parasite load and changes in the

extracellular matrix of the skin.

LISTA DE TABELAS

vi

Tabela 1: Informações sobres os primers utilizados na qPCR. ................................................... 29

Tabela 2: Características fenotípicas e sinais clínicos sugestivos de LVC. ................................ 36

Tabela 3: Distribuição dos cães naturalmente infectados por L. infantum por diferentes formas

clínicas da LVC e por diferentes cargas parasitárias cutâneas .................................................... 39

LISTA DE FIGURAS

vii

Figura 1: Classificação clínica de cães naturalmente infectados por Leishmania

infantum. (A) assintomático, (B) oligossintomático e (C) sintomático. ......................... 23

Figura 2: Delineamento experimental do estudo ............................................................ 23

Figura 3: Curvas de dissociação de amostras de pele de cães naturalmente infectados..30

Figura 4: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L.

infantum no sistema SYBR®

-Green.. ............................................................................. 31

Figura 5: Principais sinais clínicos sugestivos de LVC apresentados pelos cães do

estudo. ............................................................................................................................. 37

Figura 6: Quantificação da carga parasitária na pele da orelha de cães naturalmente

infectados por Leishmania (Leishmania) infantum e agrupados de acordo com as

diferentes formas clínicas da doença: assintomáticos (CA), oligossintomáticos (CO) e

sintomáticos (CS). .......................................................................................................... 38

Figura 7: Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha de cães naturalmente



sintomáticos (CS).. ......................................................................................................... 40

Figura 8: Fotomicrografias de cortes histológicas da pele da orelha de cães naturalmente


diferentes formas clínicas da doença: (A) controle, (B) assintomáticos, (C)

oligossintomáticos e (D) sintomáticos. ........................................................................... 40

Figura 9: Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha de cães naturalmente

infectados por Leishmania (Leishmania) infantum e agrupados de acordo com a

intensidade da carga parasitária: baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e alto

parasitismo (AP). . .......................................................................................................... 41

Figura 10: Quantificação de mastócitos na pele da orelha de cães naturalmente



sintomáticos (CS). . ........................................................................................................ 42


infectados por Leishmania (Leishmania) infantum infantum e agrupados de acordo com

a intensidade da carga parasitária: baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e

alto parasitismo (AP).. .................................................................................................... 43

Figura 12: Quantificação da área de colágeno total na pele da orelha de cães

naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum e agrupados de acordo

com as diferentes formas clínicas da doença: assintomáticos (CA), oligossintomáticos

(CO) e sintomáticos (CS). .............................................................................................. 44

LISTA DE FIGURAS

viii

Figura 13: Fotomicrografias de cortes histológicas da pele da orelha de cães


com as diferentes formas clínicas da doença: (A) controle, (B) assintomáticos, (C)

oligossintomáticos e (D) sintomáticos. ........................................................................... 44



com a intensidade da carga parasitária: baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP)

e alto parasitismo (AP). .................................................................................................. 45

Figura 15: Quantificação de colágeno tipo I e II na pele da orelha de cães naturalmente



sintomáticos (CS).. ......................................................................................................... 46

Figura 16: Fotomicrografias representativas da presença de colágeno tipo I e tipo III na

pele da orelha de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum e

agrupados de acordo com as diferentes formas clínicas da doença: (A) controle, (B)

assintomáticos, (C) oligossintomáticos e (D) sintomáticos. ........................................... 46

Figura 17: Quantificação de colágeno tipo I e III na pele da orelha de cães naturalmente



parasitismo (AP). ............................................................................................................ 47

LISTA DE ABREVIATURAS

ix

AP - Alto parasitismo

BOD - Biochemical oxygen demand

BP - Baixo parasitismo

CA - Cães assintomáticos

CaCl2 - Cloreto de cálcio

CCZ-PBH - Centro de controle de zoonoses da Prefeitura de Belo Horizonte

CD4 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T

auxiliares/indutores

CD5 - Marcador de superfície celular de linfócitos T

CD8 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T

citotóxicos/supressores

CD21 - Marcador de superfície celular de linfócitos B

CO - Cães oligossintomáticos

CS - Cães sintomáticos

Ct - Ciclo Threshold

dNTP - Desoxirribonucleotídeos

DNA - Ácido desoxirribonucleíco

ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

GAG - Glicosaminoglicanos

GAPDH - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

GM-CSF - Fator estimulador de colônia de monócitos e granulócitos

GP - Glicoproteína

H&E - Hematoxilina e Eosina

KCl - Cloreto de potássio

Ig - Imunoglobulina

IgA - Imunoglobulina da classe A


x

IgE - Imunoglobulina da classe E

IgG - Imunoglobulina da classe G

IgG1 - Imunoglobulina da subclasse G1

IgG2 - Imunoglobulina da subclasse G2

IgM - Imunoglobulina da classe M

IFN- - Interferon-gama

IL-2 - Interleucina 2





IPTG- Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB - Meio de cultura “Luria Bertani”

LC - Leishmaniose cutânea

LCM - Leishmaniose cutâneo mucosa

LCD - Leishmaniose cutâneo difusa

LDU - Leishman Donovan Units

LDPK - Leishmaniose dérmica pós Kalazar

LIMP - Laboratório de Imunopatologia

LPC - Laboratório de Pesquisas Clínicas

LPG - Liposfosfoglicano

LV - Leishmaniose visceral

LVC - Leishmaniose visceral canina

LZOON - Laboratório de Zoonoses

MEC - Matriz extracelular

MgCl2 - Cloreto de magnésio


xi

MHC-I - Complexo de histocompatibilidade principal de classe I

MHC-II - Complexo de histocompatibilidade principal de classe II

MP - Médio parasitismo

NaCl - Cloreto de sódio

NUPEB - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas

OMS - Organização Mundial de Saúde

RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta

PCR - Reação em cadeia da polimerase

PVC-LV - Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral

TGF- - Fator de transformação do crescimento do tipo

Th1 - Células T CD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas

Th2 - Células T CD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas

TNF- - Fator de Necrose Tumoral tipo

Tris - Tris (Hidroximetil aminometano)

qPCR - Reação em cadeia da polimerase em tempo real

UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais

UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto

WHO - World Health Organization

X-Gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

ÍNDICE

xii

1- INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1

1.1 - Aspectos gerais das Leishmanioses ...................................................................... 2

1.2 - Leishmaniose visceral canina (LVC) ................................................................... 5

1.3 - Classificação clínica da LVC ............................................................................... 7

1.4 - Sinais clínicos e patológicos da LVC ................................................................... 8

1.5 - Estrutura da pele e alterações na matriz extracelular ......................................... 10

1.6 - Sangue: resposta imune sistêmica ...................................................................... 12

1.7 - Pele: a resposta imune compartimentalizada no sítio inicial de infecção ........... 13

2- JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 17

3- OBJETIVOS ....................................................................................................................... 19

3.1 - Objetivo geral ..................................................................................................... 20

3.2 - Objetivos específicos .......................................................................................... 20

4- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 21

4.1 - Animais ............................................................................................................... 22

4.2 - Caracterização clínica dos animais ..................................................................... 22

4.3 - Obtenção do material biológico e delineamento experimental .......................... 23

4.4 - Avaliação da carga parasitária na pele de orelha por Real time PCR ................ 24

4.4.1 - Extração de DNA das amostras de Pele .................................................................. 24

4.4.2 - Reação em cadeia da Polimerase – PCR ................................................................. 25

4.4.3 - Clonagem ................................................................................................................. 25

4.4.4 - Preparo de bactérias competentes e transformação bacteriana ............................. 26

4.4.5 - Purificação de DNA plasmidial ............................................................................... 27

4.4.6 - Construção de curvas-padrão para a qPCR em tempo real ...................................... 27

4.5 - Avaliação histológica ......................................................................................... 31

4.5.1 - Análise morfométrica ............................................................................................... 32

4.6 - Avaliação do processo inflamatório por microscopia ótica ............................... 32

ÍNDICE

xiii

4.6.1 - Hematoxilina-Eosina (H&E) ................................................................................... 32

4.7 - Avaliação do número de mastócitos por microscopia ótica ............................... 32

4.8 - Avaliação da matriz extracelular por microscopia ótica .................................... 33

4.8.1- Tricrômico de Masson .............................................................................................. 33

4.8.2 - Picrossirius-Red ....................................................................................................... 33

4.9 - Análises estatísticas ............................................................................................ 34

5- RESULTADOS ................................................................................................................... 35

5.1 - Características e sinais clínicos dos animais ...................................................... 36

5.2 - Avaliação da carga parasitária na pele de orelha ................................................ 37

5.3 - Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha ................................. 39

5.4 - Quantificação de mastócitos na pele da orelha ................................................... 42

5.5 - Quantificação da matriz extracelular na pele da orelha ...................................... 43

5.5.1 - Quantificação do colágeno total .............................................................................. 43

5.5.2 - Quantificação do colágeno tipo I e III na pele da orelha ........................................ 45

6 - DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 48

7 - CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 60

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 62

1- INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

2

1.1 - Aspectos gerais das Leishmanioses

Apesar de estarmos há mais de uma década no século XXI, as doenças causadas

por parasitos ainda representam um grave problema de saúde pública nos países em

desenvolvimento e países pobres do mundo (WHO, 2006). Dentre os inúmeros parasitos

de importância médica, destaca-se o protozoário Leishmania, que é agente de um amplo

espectro de doenças, coletivamente referidas como leishmanioses (Ashford, 2000).

Embora considerada a mais negligenciada de todas as doenças negligenciadas as

leishmanioses estão na terceira posição entre as mais importantes enfermidades

causadas por insetos vetores, ficando atrás apenas da malária e filariose (Solano-Gallego

et al., 2009).

Todas as espécies de Leishmania são transmitidas aos seus hospedeiros

vertebrados por fêmeas de insetos dípteros pertencentes à família Psychodidae

(Subfamília: Phlebotominae), conhecidos como flebotomíneos. Estes, por sua vez, estão

distribuídos por quase todas as regiões do mundo, com exceção da Oceania e Antártida,

sendo encontrados sob as mais diversas condições climáticas e de altitude, em

ambientes silvestres, rurais e urbanos. São representados por mais de 800 espécies, das

quais muitas são importantes vetores de patógenos humanos. Apesar da ampla

distribuição, os flebotomíneos são principalmente presentes em países tropicais. São

ativos durante os meses relativamente quentes nos países temperados (Killick-Kendrick,

1999; Sharma & Singh, 2008) e ainda são mais ativos ao amanhecer (Desjeux, 2004). A

subfamília Phlebotominae inclui seis gêneros: Phlebotomus, Sergentomyia e Chinius no

Velho Mundo e Lutzomyia, Brumptomyia e Warileya no Novo Mundo (Young &

Duncan, 1994). Existem mais de 400 espécies de Lutzomyia descritas, porém a maioria

delas sem importância na epidemiologia das leishmanioses. Das espécies descritas,

apenas 44 são vetores conhecidos ou suspeitos de transmitir Leishmania para o homem

(Young & Duncan, 1994; Williams & Dias, 2005). Há uma forte associação entre

espécies de flebotomíneos e a espécie de Leishmania, devido à atividade de enzimas

específicas e ligantes presentes no intestino do inseto vetor que permite apenas que

espécies específicas do parasito permaneçam na parede do intestino sem ser excretados

junto com o alimento digerido (Volf et al., 2008).

As leishmanioses constituem um grupo de doenças causadas por parasitos da

ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, pertencentes ao gênero Leishmania

(Ross, 1903) e são caracterizadas por um conjunto de síndromes complexas e

INTRODUÇÃO

3

multifacetadas, sendo capazes de infectar desde animais silvestres e domésticos até o

homem (Desjeux, 2004). Estimativas para essa doença indicam uma prevalência global

de 14 milhões de casos em 98 países, dos quais 79 são considerados subdesenvolvidos,

e aproximadamente 350 a 400 milhões de pessoas em risco de se infectarem pelos

parasitos. A incidência anual é de 1,5 a 2,0 milhões de casos, e destes, 1,0 a 1,5 milhões

de pessoas são acometidas pelas formas tegumentares da doença e cerca de 500.000 pela

forma visceral, das quais cerca de 59.000 indivíduos evoluem para o óbito, quando a

doença não é diagnosticada e tratada a tempo (Alvar et al., 2006; WHO 2010).

Devido aos diferentes aspectos pelos quais a doença pode se manifestar diversas

propostas de classificação clínica vem sendo utilizadas, porém a Organização Mundial

de Saúde (OMS) divide e reconhece as leishmanioses em cinco grupos distintos:

leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose cutâneo mucosa (LCM), leishmaniose cutâneo

difusa ou anérgica (LCD), leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose dérmica pós

Kalazar (LDPK) (Desjeux, 2004; Chappuis et al., 2007; Ameen, 2010). Dessas, a LV,

causada por Leishmania donovani (Laveran & Mesnil, 1903) no Velho Mundo e

Leishmania infantum (Nicolle & Comte, 1908) tanto no Velho quanto no Novo Mundo,

é considerada a mais grave, estando associada à elevada mortalidade, quando não

tratada, como citado anteriormente. A doença é, normalmente, precedida por uma lesão

seca ou ulcerada no local da picada do vetor, podendo o período de incubação no

homem variar de 3 a 8 meses, com um alcance de 10 dias a 34 meses (Piscopo &

Mallia, 2006). Os sinais sistêmicos de febre intermitente de grau médio, anemia,

hepatoesplenomegalia e caquexia progressiva desenvolvem-se em níveis variáveis, de

semanas a alguns anos após a infecção. Sinais clínicos menos frequentes incluem

linfadenopatia, diarréia persistente e, em alguns casos, sintomas neurológicos. A doença

em estágio avançado é fatal devido, principalmente às infecções concomitantes

resultantes do estado imunológico enfraquecido do paciente (Ashford, 2000).

Como anteriormente mencionado, a LV acomete cerca de 500.000 novos

indivíduos a cada ano (Alvar et al., 2006; WHO, 2010), sendo responsável por cerca de

59.000 óbitos anuais. Esta taxa de mortalidade só é superada pelas mortes causadas por

malária, no caso das doenças parasitárias (Desjeux, 2004; Alvar et al., 2006). Alguns

autores acreditam que o número de óbitos anuais devido à LV é subestimado, uma vez

que a doença não é de notificação compulsória em todos os países em que ocorre

(Desjeux, 2004). Em 2006, ocorreram 300 mil casos no sul da Ásia, 30 mil casos no

leste africano e o Brasil ficou em terceiro lugar no ranking mundial com quatro mil

INTRODUÇÃO

4

casos (Alvar et al., 2008). A LV está amplamente distribuída no Brasil, atingindo as

cinco regiões brasileiras. Na década de 90, aproximadamente 90% dos casos notificados

de LV ocorreram na região Nordeste, e recentemente, essa região representa 48% dos

casos de LV do país, mostrando que a doença vem se expandindo para as outras regiões.

Nos últimos 10 anos, dados epidemiológicos demonstram a urbanização da LV,

destacando-se surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba

(SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luis (MA),

Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e, mais recentemente, as epidemias ocorridas nos

municípios de Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO). Dados dos

últimos 10 anos relatam ainda, uma média anual de 3.379 casos, com uma incidência de

1,9 casos por 100.000 habitantes (Ministério da Saúde/Guia de vigilância

epidemiológica, 2009).

Desde os primeiros relatos de LV no Brasil na década de 30, o flebotomíneo

Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) tem sido apontado como o

principal vetor de L. infantum em nosso país e nas Américas (Chagas, 1936; Lainson et

al., 1977). Os parasitos são transmitidos para o hospedeiro vertebrado após a picada do

vetor que inocula, junto com sua saliva, algumas centenas de formas promastigotas

metacíclicas na derme do hospedeiro vertebrado, enquanto realizam seu repasto

sanguíneo. No local da picada, essas formas podem escapar dos mecanismos de defesa

do hospedeiro, representados principalmente pela imunidade inata e podem ser

fagocitadas por células residentes no local, tais como macrófagos, monócitos e células

de Langerhans (Sacks & Noben-Trauth, 2002; Engwerda et al., 2004). A interação

Leishmania-macrófago envolve mecanismos complexos, dependentes de fatores

múltiplos dos hospedeiros vertebrados e invertebrados, bem como do próprio parasito.

A saliva dos flebotomíneos exerce importante papel na transmissão de Leishmania,

potencializando a infecção, pela sua capacidade anticoagulante, por conter peptídeos de

grande poder vasodilatador, ou por apresentar moléculas imunoestimulantes na sua

composição (Aquino et al., 2010; Araujo-Santos et al., 2010). Após internalização, no

interior dos macrofágos, as formas promastigotas diferenciam-se em amastigotas,

permanecendo dentro de fagolisossomos, onde então, originam o vacúolo parasitóforo,

no qual iniciam os processos de reprodução por divisão binária e desenvolvimento

celular. Cada célula infectada é capaz de abrigar grande número de formas amastigotas,

quando então as células se rompem e liberam os parasitos, que podem ser tomados por

novas células (Hommel, 1999) Os macrófagos infectados movem-se do local da picada

INTRODUÇÃO

5

para os linfonodos drenantes e, posteriormente, migram para outros órgãos como o

baço, fígado e a medula óssea, visceralizando a infecção. Durante a hematofagia, um

novo flebotomíneo, ainda não infectado, pode ingerir células infectadas do hospedeiro

mamífero contaminado e que contenham formas amastigotas do parasito. As mesmas

chegam ao intestino do vetor e se diferenciam em promastigotas, que são encontradas

livres no trato digestivo médio e anterior do flebotomíneo. As promastigotas

denominadas procíclicas multiplicam-se, amadurecem e aderem-se ao epitélio do

esôfago e faringe do vetor. Essa aderência é em função dos liposfosfoglicanos (LPG),

presentes na superfície do parasito, que interagem com lectinas presentes no intestino do

inseto, impedindo que sejam eliminadas com o alimento digerido (Sacks & Kamhawi,

2001). As promastigotas procíclicas se multiplicam intensamente, e cerca de 30h - 60h

transformam-se em formas alongadas, finas, com relativa motilidade, denominadas

nectomonas. Estas formas aderem-se, via flagelo, às microvilosidades do epitélio celular

do intestino médio do flebotomíneo. Cerca de sete dias após, quando se completa a

digestão do sangue ingerido, estas formas migram para a região torácica do intestino,

onde algumas se transformam em promastigotas, chamadas haptomonas, que

rapidamente se transformam em formas finas, curtas, altamente ativas, e com flagelo

medindo no mínimo o dobro do comprimento do corpo, as promastigotas metacíclicas.

Estas formas são infectantes para o hospedeiro vertebrado e migram através da válvula

estomodeu para o esôfago, faringe e probóscida (Cardoso & Cabral, 1999; Sacks &

Kamhawi, 2001; Killick-Kendrick, 2002). O ciclo biológico do parasito completa-se

quando o vetor flebotomíneo, agora infectado, alimenta-se em um hospedeiro

vertebrado ainda não infectado (Cardoso & Cabral, 1999).

1.2 - Leishmaniose visceral canina (LVC)

A importância do cão no contexto da LV tem sido estudada desde 1908, quando

Nicolle & Comte, na Tunísia, observaram a presença do parasito na medula óssea e pele

destes animais, sugerindo que os mesmos participariam da cadeia de transmissão do

parasito como reservatórios (Alves, 2006). Esta hipótese foi confirmada mais tarde, em

1914, por Laveran que reproduziu a infecção experimental por L. infantum em 25 cães,

encontrando e descrevendo o parasito na pele e outros órgãos destes animais. No Brasil,

um dos primeiros estudos epidemiológicos foi realizado por Chagas, Ferreira, Deane &

INTRODUÇÃO

6

Guimarães em 1938, na região de Abaeté, localizada no estado do Pará, que relatarem

incidência de 1,48% de infecção humana e 4,49% de infecção canina. Posteriormente,

Deane & Deane em 1955, conduziram um amplo estudo no Estado do Ceará, região

com alta prevalência de LV, contribuindo para o entendimento da epidemiologia da L.

infantum e reforçando a importância do cão (Canis familiares) como reservatório

doméstico e da raposa (Dusicyon vetulus) como reservatório silvestre do parasito

(Deane, 1956; Deane & Deane, 1962). Outros membros da família Canidae também são

apontados como reservatórios: Licalopex vetulus (Deane, 1956); Cerdocyon thous

(Lainson & Shaw, 1987; Curi et al., 2006). Sendo que, de forma geral, o cão

desempenha o papel mais importante na transmissão urbana de L. infantum para o

homem, ficando aos demais canídeos a manutenção principalmente do ciclo silvestre do

parasito (Alvar et al., 2004). Esses animais preenchem as condições necessárias para

serem considerados reservatórios de L. infantum, por serem altamente susceptíveis à

infecção, por possuírem alto parasitismo cutâneo, e principalmente pelo seu convívio

junto ao homem (Dantas-Torres & Brandão-Filho, 2006). Ainda, a infecção canina

geralmente precede o aparecimento de casos humanos sendo mais prevalente que a

doença humana. No âmbito doméstico, a maioria dos cães com sorologia positiva não

apresenta sinais clínicos, atuando, no entanto, como reservatórios e podendo infectar os

flebotomíneos (Moreno & Alvar, 2002).

A partir da descoberta e dos estudos envolvendo a doença, foram desenvolvidas

estratégias que visam o controle e combate da LV no Brasil baseados em programas

específicos para o combate da leishmaniose (Magalhães et al., 1980; WHO, 1990,

Lacerda, 1994). Neste sentido, as principais ações para o controle da LV atualmente no

país estão baseadas em uma tríade que preconiza o tratamento imediato de pessoas

doentes, pulverização de inseticidas com efeito residual em domicílio e peridomicílio

além da eutanásia de cães soropositivos. A grande e atual dificuldade das autoridades

sanitárias é que muitas vezes esses animais com sorologia positiva anti-Leishmania,

encontram-se com ausência total de sinais clínicos tornando questionável seu

recolhimento e eutanásia (Desjeux, 2004), além de que os cães, na maioria das vezes,

atuam como “membros” da família, dificultando ainda mais esse processo. Entretanto,

estudos mostram que a remoção desses animais soropositivos diminuem as taxas de LV

humana e canina (Ashford et al., 1998; Nunes et al., 2010)

Segundo Palatnik-de-Souza et al. (2001), o Brasil é o único país endêmico que

mantém e conduz regularmente um programa epidemiológico e profilático no combate à

INTRODUÇÃO

7

doença, baseado na integração das três medidas de saúde pública citadas acima, que

compõem a tríade de ações do Programa de Controle da LV (PCLV/MS/Brasil). Para

que o controle da LV seja eficaz, evitando dessa forma a reativação de focos, tais

medidas devem ser mantidas durante longo período (WHO, 1991). Entre os principais

fatores relacionados ao insucesso das medidas de controle da LV se destacam: as

dificuldades encontradas no combate ao vetor; grande número de pacientes que não

respondem à quimioterapia convencional, demonstrando a resistência das cepas locais

aos antimoniais; necessidade de métodos de diagnóstico rápidos, com elevada

sensibilidade e especificidade; logística nas estratégias de eliminação de cães

soropositivos das áreas endêmicas; a possibilidade de outros reservatórios poderem agir

como fontes de infecção de Leishmania infantum, como os canídeos silvestres e os

marsupiais; a escassez de estudos sobre o impacto das ações de controle dirigidas contra

os vetores; e a possibilidade de cães PCR+ e soronegativos servirem como fontes de

infecção atuando também como reservatórios ou mesmo como elementos mantenedores

das elevadas taxas de incidência (Ashford, 1996; Costa & Vieira, 2001; Gontijo &

Melo, 2004; Coura-Vital et al., 2011).

A LVC é uma doença heterogênea e com altas taxas de prevalência, chegando a

acometer 80% de toda a população canina de área endêmica, sendo que, apenas uma

pequena parcela desses cães apresenta a doença clínica de forma aparente. Dentre esses,

as manifestações clínicas da doença não seguem um padrão, apresentando diferentes

sinais clínicos que refletem graus de gravidade da doença (Solano-Gallego et al., 2001;

Moreno & Alvar, 2002; Baneth et al., 2008). É estimado que pelo menos 2,5 milhões de

cães estejam infectados atualmente, por L. infantum, somente no Sudoeste da Europa. O

número de cães infectados por L. infantum nas Américas é estimado em milhões, e a

maior prevalência de LVC, entre os treze países onde a LV foi notificada no Novo

Mundo, ocorre na Venezuela e no Brasil (Baneth et al., 2008; WHO, 2010).

1.3 - Classificação clínica da LVC

A doença no cão evolui de uma forma clínica assintomática, geralmente

relacionada ao controle do parasitismo, passando por uma forma intermediária,

oligossintomática, podendo evoluir até uma forma clínica debilitante, sintomática,

relacionada ao comprometimento do controle do parasitismo ocasionado pelo

INTRODUÇÃO

8

exacerbado grau de imunossupressão (Pinelli et al., 1994b; Pinelli et al., 1995; Reis,

2001; Giunchetti et al., 2006; Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Reis et al., 2006c;

Giunchetti et al., 2007b,c). Neste sentido, buscando identificar e categorizar os cães de

acordo com as manifestações clínicas foi proposta uma classificação para este modelo, a

qual divide esses animais em: (i) assintomáticos, animais infectados que não apresentam

sinais clínicos sugestivos de LVC, (ii) oligossintomáticos, animais infectados que

possuem até três sinais clínicos da doença e (iii) sintomáticos, onde os cães infectados

possuem mais de três sinais clínicos sugestivos da doença (Mancianti et al., 1988; Reis

et al., 2006a).

1.4 - Sinais clínicos e patológicos da LVC

Segundo Baneth et al. (2008) estudos longitudinais têm demonstrado que a

evolução da doença em cães de áreas endêmicas pode seguir diferentes padrões. Em

alguns cães, sinais clínicos graves da doença surgem logo após a infecção devido ao

fato desses animais não desenvolverem uma efetiva resposta celular contra o parasito.

Um segundo grupo de cães permanece infectado por um longo período de tempo, mas

são capazes de evitar o aparecimento de sinais clínicos. Isso é devido ao fato de que a

presença do parasito nos órgãos e tecidos, associado à resposta imune do cão frente à

infecção pode determinar as reações que produzem as lesões e sinais clínicos

característicos da LVC (Alvar et al., 2004; Reis et al., 2006). Essa doença apresenta-se

clinicamente nas formas aguda, subaguda e crônica. Nos estudos em cães

experimentalmente infectados têm-se observado um período de incubação bastante

variável, oscilando de três meses a vários anos. Observa-se variado espectro de lesões e

alterações patológicas, derivado das complexas interações da relação parasito-

hospedeiro, devido, principalmente, à cepa e à espécie de Leishmania envolvidas e à

variação na resposta imune individual do hospedeiro (Genaro, 1993). Assim, os sinais

clínicos e o tempo de aparecimento da doença são variáveis oscilando entre ausência

total de sinais até uma síndrome clínica caracterizada por febre, descamação e eczema,

principalmente no focinho e orelha, pêlo opaco e ulcerações leves localizadas

frequentemente nas orelhas, focinho, cauda e articulações, úlcera de decúbito. Com

grande frequência observa-se, nas fases mais adiantadas da doença, esplenomegalia,

alopecia generalizada, ulcerações mais acentuadas na pele, onicogrifose,

INTRODUÇÃO

9

ceratoconjuntivite, coriza, apatia, diarréia. Na fase final da infecção ocorrem, em geral,

paraparesia, caquexia, inanição e óbito do animal (Ciaramella et al., 1997; Alvar, 2004;

Da Costa-Val et al., 2004).

As principais lesões da LV, observadas em cães no Velho e Novo Mundo,

ocorrem em órgãos ricos em células do sistema monocítico mononuclear como os

linfonodos, baço, fígado, medula óssea, rins, pulmões, intestinos e pele (Tafuri et al.,

2001; Lima et al., 2004).

Dentre as manifestações clínicas presentes em cães com LVC, o acometimento

do tecido cutâneo é a alteração mais comum, embora possa ser variável quanto a sua

extensão e caracterização. Acredita-se que entre 81% a 89% dos cães infectados seja

observado algum tipo de lesão dermatológica (Alvar et al., 2004; Baneth et al., 2008).

Essas lesões podem ou não estar associadas a outros sinais clínicos e/ou anormalidades

patológicas (Solano-Gallego et al., 2009). Dentre as manifestações mais frequentes

destacam-se as dermatites não pruriginosas; dermatites seborréicas; dermatites

esfoliativas, localizadas principalmente ao redor dos olhos, orelhas e membros,

associada ou não a alopecia que, quando presente, pode ser generalizada ou localizada;

dermatites ulcerativas; dermatites nodulares focais ou multifocais; dermatites

proliferativas mucocutâneas e dermatites papulares (Alvar et al., 2004; Baneth et al.,

2008).

Após as alterações dermatológicas, as linfadenopatias seguem como segunda

maior alteração clínica presente em cães com LVC, acometendo cerca de 60-90% dos

animais (Amusategui et al., 2003; Alvar et al., 2004; Baneth et al., 2008; Lima et al.,

2004). O crescimento desse órgao é atribuído ao aumento do número e do tamanho dos

folículos linfóides e a marcante hiperplasia e hipertrofia dos macrófagos da região

medular do órgão (Lima et al., 2004).

Alterações no baço de cães portadores de LV são variáveis (Da Costa-Val,

2007). Os parasitos induzem uma desorganização na estrutura celular do órgão, com a

hiperplasia da polpa branca e polpa vermelha, formação de granulomas e atrofia de

folículos linfóides, que determinam esplenomegalia em graus variados (Alvar et al.,

2004; Santana et al., 2008). O aumento desse órgão parece estar associado, também, ao

aumento no número de monócitos e macrófagos, associado às alterações na estrutura da

microvasculatura e ao aumento do número das fibras reticulares (Santana et al., 2008).

No fígado, os parasitos podem provocar lesões, induzindo alterações na

morfologia dos hepatócitos e consequentemente no metabolismo do órgão. As

INTRODUÇÃO

10

hepatopatias associadas à LVC, bem como hepatomegalias são pouco frequentes (Alvar

et al., 2004; Solano-Gallego et al., 2009).

A medula óssea encontra-se hiperplásica, podendo ou não conter parasitos.

Foglia Manzillo et al. (2006) demonstraram que seis de quinze cães naturalmente

infectados, com sinais clínicos visíveis da doença, mostraram características displásicas

na medula óssea e eritrofagocitose.

As alterações renais mais comuns são as glomerulonefrites, em conseqüência de

lesões tubulares e glomerulares resultantes da deposição de imunocomplexos (Tafuri et

al., 1989; Alvar et al., 2004; Bonfanti et al., 2004). Essas alterações interferem na

capacidade funcional do órgão, provocando quadro de proteinúria, que geralmente

progride para síndrome nefrótica ou insuficiência renal crônica (Ferrer, 1999; Bonfanti

et al., 2004).

Em relação aos pulmões, Gonçalves et al. (2003), demonstraram uma crônica e

difusa pneumonite intersticial e espessamento dos septos inter lobulares em cães

naturalmente infectados por L. infantum.

A perda de peso e a atrofia da musculatura, em especial das fossas temporais,

estão presentes em boa parte dos animais, porém em frequência variável (Amusategui et

al., 2003; Alvar et al., 2004; Santana et al., 2008). O comprometimento das articulações

e ossos também é relatado em animais doentes (Baneth et al., 2008). Agut et al. (2003)

descrevem alterações de marcha em 45% de 58 cães com LVC, expressadas,

principalmente, pela claudicação.

1.5 - Estrutura da pele e alterações na matriz extracelular

A pele é o maior e mais acessível órgão e atua tanto como barreira física quanto

imunológica. Devido a estas características, esse órgão atua na conexão com o meio

externo, tendo importantes papéis na proteção, termorregulação, resposta imunológica,

bem como na manutenção e desenvolvimento da defesa, uma vez que está

constantemente sujeita a estímulos externos, tais como patógenos, agentes mecânicos,

agentes químicos e resposta auto-imune (Becker, 1997; Firestein, 2004).

Quanto à estrutura, a pele é dividida em três camadas: epiderme, derme e

hipoderme, dispostas e interligadas de modo a manter de maneira adequada o

desempenho de suas funções (Becker, 1997; Firestein, 2004). A epiderme é constituída

INTRODUÇÃO

11

por uma camada de tecido epitelial estratificado pavimentoso queratinizado que fica

acima da derme, camada formada por tecido conjuntivo denso não modelado, que é

constituído por uma variedade de células e uma matriz extracelular (MEC), complexo

de macromoléculas produzidas por fibroblastos e exportados por eles para o espaço

intercelular. Essa camada confere, além de organização estrutural, elasticidade, força

tensil e resistência mecânica à pele (Haake et al., 2000). A última e mais profunda

camada da pele denominada hipoderme, é composta por tecido adiposo ligado por fibras

colágenas que formam uma barreira térmica, além de armazenar energia e proteger

contra choque mecânico.

A inoculação de parasitos do gênero Leishmania pelos flebotomíneos irá atingir

a derme, camada vascularizada da pele. A MEC, que constitui esta camada, é composta

por proteína colagenosa e glicosaminoglicanos (GAG) que formam grandes agregados

através de ligações com proteínas, constituindo os proteoglicanos. Os colágenos são as

proteínas mais abundantes encontradas no reino animal, sendo as maiores proteínas

constitutivas da MEC. O sistema colágeno é formado por vários tipos de colágenos

geneticamente distintos que ocorrem em diferentes tecidos (Von Der Mark et al., 1976).

Dentre eles, os de maior importância são o colágeno do tipo I, II e III. O colágeno tipo I

representa o mais comum dos colágenos, forma fibras grosseiras e está presente no

tecido conjuntivo propriamente dito, padrão normal da pele, tendão, osso, dentina e

cemento. O colágeno do tipo II é formado por fibras delgadas e está presente quase

exclusivamente nas matrizes da cartilagem hialina e elástica e o colágeno do tipo III,

que está freqüentemente associado ao tipo I, sendo denominado também de fibra

reticular mais delgada é encontrado principalmente nos vasos sanguíneos (Montes,

1996). É sabido que a derme é formada de 90% de colágeno do tipo I e 10% do tipo III,

fato que deve ser levado em consideração ao se avaliar essa proteína na pele.

Em lâminas coradas por Picrosirius Red e visualizadas com auxílio de lentes

polarizadas, os colágenos tipo I e II mostram interferências de cores e intensidades de

birrefringências diferentes na mesma secção de tecido. Isso pode ser explicada pelo fato

de que os mesmos apresentam padrões distintos de agregação física. O colágeno tipo I

forma fibras espessas e apresenta uma birrefringência que vai do amarelo ao vermelho.

O colágeno tipo III forma fibras finas mostrando uma fraca birrefringência, que sob luz

polarizada é visualizada na cor verde (Montes, 1996).

Abreu-Silva et al. (2004) ao estudarem a pele de camundongos

experimentalmente infectados por Leishmania amazonensis observaram diminuição de

INTRODUÇÃO

12

fibras colágenas do tipo I, aumento de fibras colágenas do tipo III e redução de

fibronectina e laminina na pele desses animais, com alterações da arquitetura normal

desse órgão. Alterações na matriz extracelular podem ser vistas não somente na pele,

mas em diferentes órgãos de animais infectados por Leishmania sp.. Melo et al. (2009)

ao estudarem o fígado de cães naturalmente infectados por L. infantum, observaram

maior deposição de colágeno em cães sintomáticos quando comparado a cães

assintomáticos. Esse resultado mostrou que essa maior deposição no grupo sintomático

pode estar associada à maior carga parasitária nesse grupo. Uma significativa deposição

de colágeno, corado pela prata Amoniacal de Gomori, foi vista nos pulmões de cães

naturalmente infectados por L. infantum quando comparados ao grupo controle

(Gonçalves et al., 2003). Ainda, Kondo et al. (2008) mostraram ocorrência de alterações

acentuadas nos componentes da MEC caracterizadas pela substituição gradativa do

colágeno tipo III pelo colágeno tipo I no linfonodo poplíteo de cães naturalmente

infectados por L. infantum.

Dessa forma, o processo inflamatório na pele, ocasionado por parasitos do

gênero Leishmania, acarreta alterações na MEC de animais infectados. As inflamações

crônicas, conseqüência comum das infecções parasitárias é um potente promotor de

formação de MEC. O parasito inserido nesse meio irá promover alterações que

culminará com a degradação de fibras colágenas. Posteriormente, ocorrerá o

remodelamento ou restabelecimento do parênquima o mais próximo do normal.

1.6 - Sangue: Resposta Imune Sistêmica

Na leishmaniose a resposta imune protetora é mediada pela imunidade celular.

Cães infectados por L. infantum, tendem a desenvolver acentuada resposta imune

humoral caracterizada por hipergamaglobulinemia policlonal (Ferrer et al., 1995) que,

no entanto, não apresenta efeito protetor quanto à progressão da doença (Lopez et al.,

1996). Não se sabe em relação ao subtipo de imunoglobulina anti-Leishmania, qual

poderia estar associada a um perfil de resistência/susceptibilidade na LVC (Day, 2007).

Entretanto, nosso grupo de pesquisa relatou em cães assintomáticos, presença

predominante de IgG1 associada a menor frequência de intensidade parasitária em

diversos tecidos. Por outro lado, cães sintomáticos apresentaram elevada produção de

imunoglobulinas IgG2, IgA, IgM e IgE (Reis et al., 2006a,c).

INTRODUÇÃO

13

Em relação à resposta imune mediada por células, sabe-se que, em humanos e

especialmente em camundongos, que a resistência à infecção está associada a uma

resposta do Tipo 1 com acentuada produção de citocinas pró inflamatórias (IL-12, IFN-

e TNF- enquanto a suscetibilidade deve-se a uma resposta regulatória atualmente

denominada Tipo 2 com a produção de IL-4, IL-10 e TGF- (Barral et al., 1993;

Bogdan, 2001; Kane & Moser, 2001; Murray et al., 2002; Trinchieri et al., 2003;

Trinchieri et al., 2007).

De forma a esclarecer os perfis distintos de resistência/susceptibilidade frente à

infecção canina, a categorização dos cães pela manifestação clínica em assintomático

(perfil de resistência) e sintomático (perfil de susceptibilidade) foi previamente

estabelecida e vem sendo estudada por diversos pesquisadores de nosso grupo (Reis et

al., 2006, 2007; Reis et al., 2009, 2010). Esta estratégia permitiu identificar aspectos

imunopatológicos da LVC associados à resposta imune celular e à produção de

citocinas. De maneira geral, aqueles cães com a doença auto-limitante (assintomáticos)

possuem resposta imune protetora, mediada principalmente por células T CD4, com

produção de INF-γ, IL-2 e TNF-α, indutores da atividade anti-Leishmania pelos

macrófagos; e aqueles cães susceptíveis (oligossintomáticos e sintomáticos), que

manifestam a doença clínica, exibem resposta imune marcada por citocinas reguladoras

como IL-4 ou IL-10, indicando uma possível participação destes mediadores no

desenvolvimento de manifestações clínicas da doença (Nylén & Sacks, 2007).

Bourdoiseau et al. (1997b), avaliaram o fenótipo celular do sangue periférico na LVC

por L. infantum verificando que cães sintomáticos apresentavam queda no percentual de

linfócitos T CD4+ e linfócitos B CD21

+ circulantes em relação aos animais

assintomáticos, indicando assim supressão em ambos compartimentos (Te B).

1.7 - Pele: a resposta imune compartimentalizada no sítio inicial de infecção

Após a inserção da probóscida do vetor na pele do cão, ocorre a inoculação dos

parasitos, que provocará reação inflamatória local com internalização do mesmo

principalmente por células de Langerhans e/ou células dendríticas (Ferrer, 2002).

Apenas os vasos superficiais da derme e da interface derme/epiderme são atingidos com

a ajuda da atividade vasodilatadora da saliva, uma vez que sem ela o inseto dificilmente

poderia alcançar os capilares dérmicos (Ribeiro et al., 1984).

INTRODUÇÃO

14

No hospedeiro vertebrado, a defesa natural será ativada devido à presença, no

sítio de inoculação, dos mecanismos imunológicos tais quais: sistema do complemento,

trombinas, cininas, plaquetas, anticorpos naturais, fagócitos, dentre outros. Por outro

lado, na saliva do vetor encontram-se elementos farmacologicamente ativos como:

inibidores do complemento, maxadilan, IL-2, apirase, prostaglandinas. Na pequena

hemorragia formada, no sítio da picada do inseto, ocorre a quimiotaxia de células

inflamatórias como: neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, monócitos, macrófagos

dentre outras (De-Almeida et al., 2003).

Neutrófilos são células de vida curta, presentes em grande número no hospedeiro

vertebrado e que provavelmente desempenham papel mais relevante na eliminação do

parasito do que como célula hospedeira. Ainda são secretores de IL-12 e TGF- e

podem apresentar antígenos via complexo de histocompatibilidade maior (MHC) de

classe II na presença de fator estimulador de colônia de monócitos e granulócitos (GM-

CSF) (De-Almeida et al., 2003).

Células dendríticas da pele (células de Langerhans), potentes apresentadoras de

antígenos, têm um papel decisivo como ponte entre resposta imune inata e adaptativa

por ativar células do tipo T ou linfócitos T “virgem”. Elas podem capturar neutrófilos

apoptóticos infectados e fragmentos de Leishmania. Então, após essas etapas, adquirem

o fenótipo de células maduras por apresentarem MHC de classe I e II, aumento da

expressão de moléculas co-estimuladoras (CD40, CD54, CD80, CD86), liberação de IL-

12 e capacidade de transportar o parasito da pele infectada para os linfonodos para

apresentação ao linfócito T antígeno-específico (Moll, 2000).

Outras células como os mastócitos, basófilos e eosinófilos podem estar presentes

no sítio de inoculação, na fase inicial da infecção por Leishmania, no tecido ou na

corrente sanguínea. Mastócitos maduros são encontrados em todos os órgãos e tecidos,

mas tendem a se concentrar em regiões anatômicas expostas ao meio ambiente externo,

como a pele e as mucosas dos aparelhos digestivo e respiratório, estando

particularmente próximos aos vasos sanguíneos e linfáticos e aos nervos periféricos

(Oliveira et al., 2001). Por estarem presentes nos locais de entrada dos agentes

agressores, e por não exigirem um recrutamento específico, elas podem ser consideradas

células sentinelas das respostas inflamatórias locais (Sharma & Saxena, 2010). Segundo

Galli et al. (2005), os mastócitos podem estar envolvidos na apresentação de antígenos

para os linfócitos T, dentre outras funções, entretanto, os mecanismos pelos quais eles

INTRODUÇÃO

15

podem influenciar o papel dos linfócitos T ainda não foram esclarecidos. Esses estudos

sugeriram que os mastócitos poderiam participar na primeira linha de defesa, ou seja, na

imunidade inata, durante infecção cutânea local por parasitos de Leishmania. Mastócitos

são capazes de produzir histamina e citocinas como IL-4, IL-10 e IL-13, as quais estão

envolvidas na maturação de células dendríticas. Suas funções ainda não foram

totalmente demonstradas e os produtos derivados de seus grânulos, tais como, histamina

e proteoglicanos, os quais não estão presentes nos macrófagos, necessitam de estudos

mais aprofundados (Mazzoni et al., 2001).

Embora os parasitos do gênero Leishmania interajam e infectem uma variedade

de tipos celulares do hospedeiro, os macrófagos são as mais importantes células que

regulam a infecção. Por esses parasitos serem obrigatoriamente intracelulares, os

macrófagos são indispensáveis para sua sobrevivência (Liu & Uzonna, 2012). Os

macrófagos contêm, em sua superfície, um complexo arranjo de receptores capazes de

mediar na interação de uma ampla diversidade de ligantes. Dentre eles destacam-se os

receptores pertencentes à família das integrinas β2 que parecem ter importância

fundamental na interação Leishmania-macrófagos (De Almeida et al., 2003). Uma vez

internalizado pelo macrófago, o parasito pode multiplicar-se livremente dentro da

célula, eventualmente alterando o microambiente a seu favor (Moore e Matlashewski,

1994). Mas para isso, o parasito necessita se ligar à célula do hospedeiro, uma vez que

sua resistência ao sistema de complemento é dependente do tempo. Formas metacíclicas

são mais resistentes à lise pelo complemento. A Leishmania é capaz de ativar o

complemento, entretanto esse não consegue destruir o parasito devido à presença de

moléculas de LPG e gp-63 na superfície das promastigotas metacíclicas. Essa

resistência à lise se deve, em parte, a modificações estruturais da LPG que impedem a

inserção do complexo de ataque à membrana (C5b-9). A gp-63 também previne a lise

mediada por complemento e aumenta a adesão do parasito ao receptor CR3 por clivar

C3b em C3bi (Descoteaux e Turco, 1999; Alexander et al.,1999).

A elevada quantidade de parasitos na pele, mesmo na ausência de sintomatologia

clínica (Deane, 1956) favorece a infecção do inseto vetor e consequentemente, a

transmissão para o homem. A comprovação da presença de parasitos na pele é um dado

clínico-epidemiológico extremamente importante. Esse órgão assume papel relevante na

LVC, não somente pelas manifestações clínicas cutâneas presentes (Deane & Deane,

1955; Deane, 1956; Ferrer et al., 1988; Prats & Ferrer, 1995), mas também por ser a

fonte de contaminação para os flebotomíneos. Alterações histológicas na pele de cães

INTRODUÇÃO

16

infectados por Leishmania consistem de graus variáveis de infiltrado inflamatório focal

ou difuso e com variável número de diferentes tipos celulares (Solano-Gallego et al.,

2004). As mudanças ocasionadas nesse tecido vão depender da resposta imune

desencadeada por essas células e o direcionamento para uma resposta do tipo Th1 ou

Th2 (Pinelli et al., 1994). Giunchetti et al. (2006) observaram, em cães naturalmente

infectados por L. infantum, aumento da inflamação crônica e da carga parasitária na

pele de cães sintomáticos em relação aos não infectados e assintomáticos. Esse mesmo

resultado foi visto por Verçosa et al. (2008) além do fato de cães sintomáticos serem

mais infectivos para os hospedeiros invertebrados quando comparados aos

assintomáticos.

Visto os aspectos imunológicos sistêmicos e compartimentalizados da doença, é

sabido que a presença do parasito nos órgãos e tecidos, associada à resposta imune do

cão frente à infecção, determinam reações que produzem as lesões e sinais clínicos

característicos da LVC (Alvar et al., 2004; Reis et al., 2006b). De encontro a esses

fatores, intensas mudanças podem ser observadas na pele de animais infectados por

Leishmania. O processo inflamatório causado por esses parasitos pode danificar esse

tecido, ao passo que um sistema de reparo com alta eficiência pode auxiliar no reparo a

essas lesões, produzindo intensas alterações na MEC desse órgão.

2- JUSTIFICATIVA

JUSTIFICATIVA

18

Com o crescente número de casos da LVC nos grandes centros metropolitanos do país,

torna-se necessário a realização de estudos mais detalhados da doença no cão, uma vez

que ele é o principal mantenedor da leishmaniose no ambiente doméstico e

peridoméstico, seja na região rural ou urbana. A permanência e replicação do parasito

na pele de hospedeiros infectados faz deste órgão um reservatório de amastigotas de

Leishmania infantum para fêmeas de flebotomíneos. Portanto, um estudo

histopatológico desse órgão, associado à quantificação do parasitismo cutâneo bem

como às diferentes formas clínicas da doença é bastante relevante, permitindo assim

uma melhor compreensão da história natural da LVC bem como dos processos

relacionados à patogenia das lesões cutâneas.

3- OBJETIVOS

OBJETIVOS

20

3.1 - Objetivo geral

Avaliar as alterações histopatológicas na pele de orelha de cães naturalmente

infectados por Leishmania (Leishmania) infantum considerando as diferentes formas

clínicas bem como a carga parasitária.

3.2 - Objetivos específicos

Avaliar na pele de cães naturalmente infectado por Leishmania (Leishmania)

infantum:

a carga parasitária;

o processo inflamatório;

as alterações da matriz extracelular.

4- MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS E MÉTODOS

22

4.1 - Animais

Os animais utilizados nesse trabalho foram obtidos durante o doutoramento de

Wendel Coura-Vital (Coura-Vital, 2011). O uso dos mesmos foi aprovado pelos comitês

de ética das seguintes instituições: Universidade Federal de Ouro Preto/UFOP (Nº.

2007/83); Universidade Federal de Minas Gerais (Nº. 020/2007) e Prefeitura Municipal

de Belo Horizonte (Nº. 001/2008). Inicialmente foram utilizados 62 cães sem raça

definida, provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de

Belo Horizonte (CCZ-PBH). Estes animais foram recolhidos para serem eutanasiados,

conforme preconizado pelo Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose

Visceral (PVC-LV), por apresentarem resultado sorológico positivo - ELISA e RIFI

(Biomanguinhos, Fiocruz, RJ) para Leishmania sp. Esses testes foram realizados pelo

Laboratório de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (LZOON).

4.2 - Caracterização clínica dos animais

Com o auxílio de um médico veterinário, dos 62 cães inicialmente incluídos no

trabalho, 35 deles foram divididos em três grupos, de acordo com a presença ou

ausência de sinais clínicos sugestivos da infecção por L. infantum, tais como:

onicogrifose, atrofia muscular, lesões de pele, dermatite furfurácea, alopecia,

ceratoconjuntivite, paralisia dos membros posteriores, emagrecimento, dentre outras,

seguindo os critérios estabelecidos por Mancianti et al. (1998) e Reis et al. (2006) que

ao final possibilita subdividir os cães em: assintomáticos (CA), oligossintomáticos (CO)

e sintomáticos (CS), como representado na Figura 1. Sendo assim, 11 cães foram

classificados como assintomáticos, 12 cães como oligossintomáticos e 12 cães como

sintomáticos. Ainda, foram utilizados dez animais controle negativo nesse estudo.


23

Figura 1: Classificação clínica de cães naturalmente infectados por Leishmania

infantum. (A) assintomático, (B) oligossintomático e (C) sintomático.

4.3 - Obtenção do material biológico e delineamento experimental

Para eutanásia dos cães, conforme determinado pelo PVC-LV (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2006), os animais foram anestesiados com Tiopentax® (30mg/Kg,

Cristália). Em seguida, com o animal ainda anestesiado, foi aplicada solução saturada de

KCl por via endovenosa. Após a eutanásia dos animais, as amostras de pele de orelha

dos cães foram obtidas de forma asséptica e subdivididas em fragmentos menores. Parte

deste material biológico foi armazenado em formol tamponado e destinado à avaliação

histopatológica. Outros fragmentos foram armazenados em freezer a temperatura de -

80ºC até o momento da extração de DNA total, para posterior avaliação da carga

parasitária por PCR em tempo real.

Figura 2: Delineamento experimental do estudo

Sintomático (CS)

(n=12)

Controle negativo (CN)

( n=10)

Assintomático (CA)

( n=11)

Oligossintomático (CO)

(n=12)

Processo inflamatório

Cães naturalmente infectados por L. infantum (n=35)

Pele da orelha

Parasitismo tecidual

Mastócitos Matriz

extracelular


24

4.4 - Avaliação da carga parasitária na pele de orelha por Real time PCR

4.4.1 - Extração de DNA das amostras de Pele

A extração do DNA foi realizada a partir de fragmentos de pele de orelha,

previamente armazenados em frezeer -80ºC no dia da necropsia. Para obtenção do DNA

das amostras um kit de extração WizardTM

Genomic DNA Purification Kit (Promega,

Madison, WI, USA) foi utilizado seguindo recomendações do fabricante com

modificações, conforme brevemente descrito. Foram utilizadas quantidades de tecidos

com peso de 30mg. Aos tubos contendo os fragmentos de pele foram adicionadas

proteinase K (30mg/mL) e a solução de lise nuclear. Em seguida as amostras foram

incubadas overnight (18 horas) em banho seco a 55°C. No dia seguinte foi adicionado

3µL da solução de RNase ao lisado nuclear, seguida de homogeneização e incubação

em banho seco a 37ºC por 30 minutos. As amostras foram resfriadas por cinco minutos

a 25ºC e em seguida foi adicionado 200μL da solução de precipitação protéica. Com

auxílio de um homogeneizador tipo vórtex, as amostras foram homogeneizadas por 20

segundos em baixa velocidade e incubadas no gelo por cinco minutos. Em seguida

foram centrifugadas a 16000 x g em microcentrífuga (Eppendorf

- Modelo 5418, NY,

USA) durante cinco minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo, onde se

adicionou 600µL de isopropanol (Merck

, Darmstad, Alemanha) e as amostras foram

homogeneizadas por inversão dos tubos. Após este procedimento, foi realizada

centrifugação a 16000 x g durante dois minutos e o sobrenadante descartado.

Posteriormente foi acrescentado 600µL de etanol 70% (Merck

, Darmstad, Alemanha),

a amostra homogeneizada e centrifugada a 16000 g por dois minutos, sendo o

sobrenadante desprezado. As amostras foram deixadas por 1 hora a 21-25ºC para total

evaporação do etanol. Posteriormente, foi adicionado 100µL de solução de hidratação e

as amostras foram mantidas em banho seco a 37º C por uma hora. Após este tempo as

amostras foram mantidas a 21-25ºC por duas horas e em seguida foram armazenadas em

geladeira a 4°C até o momento da análise da qualidade do DNA extraído e o início da

reação de PCR.


25

4.4.2 - Reação em cadeia da Polimerase – PCR

Para a reação, foi utilizado DNA de L. infantum (5,0ng/μL). A reação constituiu

de: tampão 1X, 1,5mM de MgCl2, 2,0µM de dNTP, primer (5pmol), 0,76µL U Taq

DNA polimerase (Fermentas -Sinapse®

), 2,5µL de DNA e H2O Milli Q totalizando um

volume de 12,5µL por poço da placa (MicroAmp®

Fast Optical 96-Well, Applied

Biosystems). As condições utilizadas na reação de PCR foram: desnaturação inicial a

94°C por um minuto, seguida por 40 ciclos a 93ºC por 30 segundos, 64°C por 1 minuto,

72°C por 1 minuto e uma extensão final a 72°C por sete minutos. O equipamento

utilizado para a realização de PCR foi o Verit Termal Cycler 96 well (Applied

Biosystems®

, Califórnia, USA). Parte do produto final da reação foi aplicada em um gel

de agarose 1,5% (Invitrogen by Life Technologies, EUA), para comprovar o resultado

da amplificação pela visualização da banda de interesse (90 pb).

4.4.3 - Clonagem

Para a construção da curva padrão utilizada na qPCR, foi realizada clonagem do

gene da DNA polimerase de Leishmania. Para isto, o gene de interesse foi amplificado

por PCR convencional a partir de DNA genômico extraído pelo kit WIZARD® DNA

isolation kit (PROMEGA, EUA), conforme descrito anteriormente. Para a reação de

PCR, foi utilizado DNA de L. infantum (5,0 ng/μL). A reação constituiu das mesmas

condições utilizadas para as amostras de pele. Parte do produto final da reação foi

aplicada em um gel de agarose 1,5% (Invitrogen by Life Technologies, EUA), para

comprovar o resultado da amplificação pela visualização da banda de interesse (90 pb).

Após confirmação da presença e integridade da banda de interesse, e a ausência de

outros amplicons, o produto da PCR foi clonado utilizando o sistema de clonagem

pGEM T (Promega, EUA) conforme manual do fabricante. Para cada reação de ligação,

foi preparado um mix contendo 5 μL de “2X Rapid Ligation Buffer”, 1 μL de “p-GEM-T

Easy Vector” e 1 μL de “T4 DNA Ligase” e a razão molar foi 8:1 de inserto e vetor.

Após ser homogeneizado, o tubo foi mantido overnight a 4ºC para ocorrer à reação de

ligação do inserto no vetor. Os plasmídios contendo insertos foram então utilizados para

transformar bactérias DH5 competentes.


26

4.4.4 - Preparo de bactérias competentes e transformação bacteriana

A- Preparo de bactérias competentes

As bactérias DH-5foram inoculadas em 5mL de meio Luria Bertani (LB)1X

(Bacto triptona 1%p/v; extrato de levedura 0,5%p/v; NaCl 171mM) e incubadas sob

agitação 180rpm (Shaker, Innova 44), a 37ºC por 16 horas. A cultura bacteriana foi

transferida para 500mL de meio LB e novamente incubada a 37ºC a 180rpm. O

crescimento foi acompanhado até a cultura atingir uma A600 nm igual a 0,6,

correspondendo ao crescimento equivalente à metade da fase logarítmica. As bactérias

foram centrifugadas a 5000rpm durante 10 minutos a 4ºC e o sedimento homogeneizado

em 150mL de 75mM de CaCl2,10mM de Tris-HCl pH 8,0. Subsequentemente, a

suspensão bacteriana foi incubada em gelo por 20 minutos e centrifugada, como

descrito previamente. O sedimento celular foi ressuspenso em 30mL da mesma solução,

acrescida de 15% de glicerol e congelado rapidamente em mistura, gelo seco álcool e

mantidas a -80ºC, até o momento do uso.

B-Transformação

A transformação bacteriana foi realizada utilizando 5μL da reação de ligação,

adicionadas a 50μL de bactéria Escherichia coli DH5-y quimiocompetentes,

descongeladas em gelo. Esta mistura foi homogeneizada levemente e mantida em gelo

por 30 minutos, subsequentemente foi transferida para um banho aquecido a 42ºC por 2

minutos, e em seguida, colocada em banho de gelo por 2 minutos, sendo imediatamente

adicionado a ela 1μL de meio LB 1X sem antibióticos a cada tubo, os quais foram

incubados por 1 hora no Shaker a 200-300rpm a 37ºC. A cultura bacteriana foi

sedimentada em microcentifuga, a 1000rpm por 5 minutos. Em seguida, foi

homogeneizada em 100L de meio LB e um volume de 50L foi semeada em placas de

Petri contendo LB-ágar (LB acrescido de 1% de ágar) acrescido de ampicilina

(100mg/mL), 0,4μL de Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 4μL de 5-

bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) 4%. Após este procedimento

foi incubada em estufa B.O.D. (Estufa D.B.O., EletroLab, Brasil) a 37ºC overnight (16

horas).


27

No dia seguinte, as colônias brancas, consideradas positivas, foram submetidas à

triagem por PCR conforme especificado no item 4.4.2, para a confirmação do inserto.

As colônias positivas para o inserto foram selecionadas para purificação do DNA

plasmidial.

4.4.5 - Purificação de DNA plasmidial

Para obtenção de DNA plasmidial em pequena escala foi utilizado o kit Wizard

Miniprep (Promega,USA). O crescimento bacteriano foi feito em 10mL de meio LB

com ampicilina a 37ºC por 16 horas. Posteriormente, a cultura bacteriana foi

centrifugada por 5 minutos a 5000rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o

sedimento foi ressuspendido em 250µL de solução de ressuspensão. Em seguida, foram

adicionados 250µL de solução de lise e a mistura foi homogeneizada por inversão 4

vezes. Subsequentemente foram adicionados 10µL de solução de protease alcalina, a

mistura foi invertida quatro vezes e incubada por cinco minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, foram adicionados 350µL de solução de neutralização e a mistura foi

homogeneizada por inversão, centrifugada a 13000rpm por 10 minutos a temperatura

ambiente. Em seguida, o sobrenadante foi removido e transferido para uma coluna

contida em tubo coletor. Posteriormente, a coluna foi acoplada a um tubo de

microcentrífuga e centrifugada a 13000rpm por 1 minuto, a temperatura ambiente.

Foram adicionados 750µL de solução de lavagem a coluna, centrifugada a 13000rpm

por 1 minuto. Este procedimento de lavagem foi repetido por mais uma vez. O DNA

plasmidial foi eluído em 50L de água livre de nucleases e mantido a - 20ºC, para

posterior análise por qPCR em tempo real.

4.4.6 - Construção de curvas-padrão para a qPCR em tempo real

O produto da clonagem do gene de L. infantum, foi utilizado para a construção

da curva-padrão. Os vetores contendo os insertos foram inicialmente dosados utilizando

o equipamento Nanovue (GE Healthcare Bio Sciences AB Sweden) a 260nm e 280nm.

A partir da dosagem obtida, calculou-se a concentração de DNA em μg/μL, de acordo

com a fórmula:


28

pmol/μL = μg/μL x 106pg x 1pmol x 1

1 μg 660pg N

Onde;

N é o número de nucleotídeos (plasmídeo e inserto);

660pg é a massa molecular média de um ácido nucléico.

Levando-se em consideração o número de Avogadro: 1mol = 6,02x1023

moléculas, e sabendo-se que a concentração de cada solução de plasmídeo+inserto de

interesse em pmol/μL, foi possível determinar o número de moléculas presentes por

microlitro de cada amostra.

Depois de realizados estes cálculos, as amostras foram diluídas sucessivamente,

sendo que aquelas contendo de 107 até 10

0 moléculas foram utilizadas para a construção

da curva-padrão. As reações de qPCR foram realizadas em placas de 96 poços -

MicroAmp®Optical 96 - Well Reaction Plate with Barcode (Applied Biosystems by

Life Technologies, EUA), cobertas com adesivos ópticos- Optical Adhesive Covers

(Applied Biosystems, EUA) e processadas em termociclador ABI Prism 7500 Sequence

Detection System (Applied Biosystems, EUA) no Laboratório de Pesquisas Clínicas

(LPC/CIPHARMA/UFOP). Além da curva padrão, o gene de referência G3PDH foi

utilizado com o objetivo de verificar a integridade das amostras de DNA extraídas dos

tecidos de cães (pele). As amostras dos diferentes tecidos em estudo foram analisadas

utilizando como gene alvo a DNA polimerase alfa. As informações referentes aos

primers utilizados neste trabalho estão listadas na Tabela 1.


29

Tabela 1: Informações sobres os primers utilizados na qPCR.

Gene Sequência do

nucleotídeo (5´-3´)

Organismo Função Tamanho

do

amplicon

(pb)

Número

de

acesso ao

GeneBank

Eficiência

da

Reação

(%)

R2

G3PDHa

Cão

Envolvido na glicólise

e gliconeogênese

90

AB038240

99,9%

0,99

F TCA ACG GAT TTG GCC

GTA TTG G

R TGA AGG GGT CAT TGA

TGG CG

DNA Pol

αb

F TGT CGC TTG CAG

ACC AGA TG

Leishmania Envolvido na síntese

do

DNA do parasito

90 AF009147 95% 0,97

R GCA TCG CAG GTG

TGA GCA C

a O gene G3PDH foi previamente amplificado por Peters et al., 2007. b O gene de cópia única que codifica a DNA polimerase α foi previamente amplificado por Bretagne et al., 2001. c Coeficiente de correlação.

Como controles positivos foram utilizadas as amostras diluídas do plasmídeo

contendo o inserto utilizado na curva padrão; e como controle negativo foi usado água

livre de nucleases. A reação de cada amostra foi realizada em duplicata nas seguintes

condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 min, seguida por 40 ciclos de 95ºC por 15

segundos e 60ºC por 1 minuto. As reações foram realizadas utilizando-se SYBR Green

PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA); DNA (5 ng/μL); iniciadores (5 pmol/μL)

e água livre de nucleases em quantidade suficiente para um volume final de 10 μL por

poço. As análises foram realizadas usando o software ABI SDS no equipamento

ABI7500 (Applied Biosystems), que permite avaliar: (i) a curva de dissociação; (ii) a

intensidade de fluorescência da amostra; (iii) o número de ciclos em que a fluorescência

cruza uma linha limiar arbitrária threshold (Ct) em cada ciclo e (iv) a quantificação do

número de parasitos de acordo com a curva padrão (quantificação absoluta) (Figuras 3 e

4).


30

A

B

C

Rep

ort

ern

orm

aliz

ado

Temperatura ( C)

Figura 3: Curvas de dissociação de amostras de pele de cães naturalmente infectados.

(A) Animal negativo (Tm= 76,34). (B) Animais com baixa carga (1 parasito). (C)

Animais com alta carga (4747 parasitos). No eixo x está representada a temperatura de

dissociação do amplicon gerado pela reação de PCR e no eixo Y a derivada do valor de

emissão de fluorescência.

Para a análise dos resultados foram consideradas as reações com eficiência entre

96-110% e curva padrão com valores satisfatórios de coeficiente de linearidade (r2 =

0,99) (Figura 4).


31

Figura 4: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L.

infantum no sistema SYBR®

-Green. Em X estão demonstrados os valores de Log da

concentração de parasitos (107 a 10

0) e em Y os valores de Ct correspondes a cada

diluição. Abaixo do gráfico está representado o valor do slope (-3,328), coeficiente de

linearidade (R2 =0,997) e a eficiência (99,74%).

4.5 - Avaliação histológica

Fragmentos de pele de orelha fixadas em formol 10% tamponado pH 7,2, foram

processados rotineiramente e embebidos em parafina para posterior corte em

micrótomo. Sobre lâminas de vidro, previamente desengorduradas com álcool, foram

colocados cortes histológicos com espessura de aproximadamente cinco μm. Foram

confeccionadas quatro lâminas, sendo uma corada com Hematoxilina-Eosina (H&E)

para a avaliação do processo inflamatório, uma corada com Azul de toluidina para

avaliação do número de mastócitos e as demais para avaliação da matriz extracelular

coradas pelo Tricrômico de Masson e Picrosirius-Red. Estes procedimentos

operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas (LIMP/NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de

qualidade do laboratório.


32

4.5.1 - Análise morfométrica

As imagens de pele de orelha foram digitalizadas através da microcâmera Leica

DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B e todas as imagens foram

analisadas pelo software de análise e processamento de imagem Leica Qwin no

Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas/NUPEB da

UFOP.

4.6 - Avaliação do processo inflamatório por microscopia ótica

4.6.1 - Hematoxilina-Eosina (H&E)

A H&E foi utilizada para análise rotineira das alterações histopatológicas,

incluindo a quantificação do processo inflamatório. Os cortes de pele de orelha

desparafinados e hidratados foram corados pela Hematoxilina e após serem lavados em

água corrente para retirada do excesso do corante, foram contra-corados pela Eosina.

Após a última lavagem em água corrente, foram desidratados e montados com lamínula

e Entellan (Merck, Darmstadt, Germany).

O processo inflamatório na pele foi quantificado em 20 imagens aleatórias (área

total percorrida igual a 1,5 x 106

µm2). As imagens visualizadas pela objetiva de 40x

foram digitalizadas e o processo inflamatório determinado pelo número de núcleos de

células inflamatórias presentes nos animais infectados.

4.7 - Avaliação do número de mastócitos por microscopia ótica

4.7.1 - Azul de toluidina

Após desparafinização e hidratação, as lâminas foram imersas no corante Azul

de toluidina por dez minutos. Após lavagem rápida em água destilada as lâminas foram

colocadas na estufa para secagem. Posteriormente foram montadas com lamínula e

Entellan (Merck, Darmstadt, Germany). Após coloração, foi realizada quantificação do

número de mastócitos, com auxílio da objetiva de 100x, obtendo o número dessas

células após avaliação em 20 campos aleatórios.


33

4.8 - Avaliação da matriz extracelular por microscopia ótica

4.8.1- Tricrômico de Masson

As lâminas desparafinadas e hidratadas foram imersas no corante Sudam

III/Fucsina, seguido por diferenciação em solução de ácido

Fosfotúngstico/Fosfomolíbdico e contra-coradas pela solução de Azul de Anilina.

Posteriormente, desidratadas em álcool e montadas utilizando-se Entellan (Merck,

Darmstadt, Germany) para fixação das lamínulas às lâminas. Entre cada uma dessas

etapas as lâminas foram lavadas em água corrente.

Em lâminas coradas por Tricrômico de Masson, que distingue as fibras

colágenas em cor azul e as células inflamatórias em tons avermelhados, foram obtidas

30 imagens aleatórias com auxílio da objetiva de 40x, as quais foram digitalizadas e

analisadas semi-automaticamente pela função de segmentação de imagens. Logo, todos

os pixels com tons azuis foram selecionados para a criação de uma imagem binária e

posterior cálculo da área total ocupada por fibras colágenas.

4.8.2 - Picrossirius-Red

As lâminas desparafinadas e hidratadas foram imersas na solução de Picrossírius

Red por 1 hora, lavadas em água e contra-coradas com Hematoxilina por 3 minutos. A

seguir foram desidratadas em álcool e montadas utilizando-se Entellan (Merck,

Darmstadt, Germany) para fixação das lamínulas às lâminas.

Esse tipo de coloração foi utilizado para caracterização do tipo de colágeno

presente na matriz, o qual foi analisado em microscópio de luz polarizada, que segrega o

colágeno fino (tipo III - marcado em amarelo e vermelho) do denso (tipo I - marcado em

verde). As imagens obtidas com auxílio da objetiva de 10x de toda a extensão do corte

foram quantificadas com a seleção dos pixels em amarelo e vermelho ou em verde, que

correspondem à área de colágeno tipo I e III, respectivamente.


34

4.9 - Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 5.0 (Prism

Software, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados usando o

teste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-way)

seguida do teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos. Em

todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas quando o

valor de P foi menor que 0,05. Todos os resultados obtidos nesse trabalho foram

paramétricos, exceto o resultado de carga parasitária. Para análise desse resultado foi

também utilizado o programa Biostat (AnalystSoft Robust Business solutions).

5- RESULTADOS

RESULTADOS

36

5.1 - Características e sinais clínicos dos animais

Características fenotípicas como porte e pêlo além dos sinais clínicos sugestivos

de LVC foram notificados pelo médico veterinário responsável no momento da avalição

clínica. Os sinais clínicos encontram-se apresentados na Tabela 2 e Figura 5, sendo as

dermatites de um modo geral (47,2%) os sinais mais comuns seguidos por

linfadenopatias (36,1%), emagrecimento (33,3%), onicogrifose (30,5%),

esplenomegalia (27,7%), ferimentos (21,7%) e perda de pêlo (19,4%) os mais

frequentes. Quanto ao porte e pelagem desses cães, houve predominância de porte

médio (47,2%) e pêlo curto (75,0%).

Tabela 2: Características fenotípicas e sinais clínicos sugestivos de LVC.

Variáveis n %

Porte

Pequeno 6 17,1

Médio 16 45,7

Grande 13 37,1

Pêlo

Curto 26 74,2

Longo 9 25,7

Sinais clínicos

Dermatite 17 48,5

Linfadenopatia 13 37,1

Emagrecimento 12 34,2

Onicogrifose 11 31,4

Esplenomegalia 9 25,7

Perda de pêlo 7 20,0

Pelagem opaca 5 14,2

Hepatomegalia 3 8,5

Opacificação da córnea 3 8,5

Hipertrofia muscular 2 5,7

Palidez de mucosa 2 5,7

Conjuntivite purulenta 1 2,8

Icterícia 1 2,8

RESULTADOS

37

A

C

B

D

Figura 5: Principais sinais clínicos sugestivos de LVC apresentadas pelos cães do

estudo. A e B: dermatites de um modo geral, associadas ou não à alopecia. C:

emagrecimento acentuado. D: onicrogrifose

5.2 - Avaliação da carga parasitária na pele de orelha

A quantificação do parasitismo dérmico foi realizada por PCR em tempo Real e

os resultados estão apresentados na Figura 6. Verificou-se que os animais com sinais

clínicos sugestivos de LVC, sejam eles oligossintomáticos ou sintomáticos, possuíam

maior carga parasitária quando comparados aos animais assintomáticos. Esses

resultados apontam para uma relação entre progressão da sintomatologia acompanhada

pelo aumento do parasitismo. Entretanto, observa-se que cães oligossintomáticos podem

apresentar tanto baixa carga, a semelhança dos assintomáticos, como alta carga a

semelhança dos sintomáticos. Diferenças estatísticas não foram observadas entre

animais oligossintomáticos e sintomáticos.

RESULTADOS

38

CA CO CS0

2500

5000

7500

10000

1000000

2.0100 6

3.0100 6

4.0100 6

Nú

me

ro d

e a

masti

go

tas/m

g d

e p

ele

Figura 6: Quantificação da carga parasitária na pele da orelha de cães naturalmente



sintomáticos (CS). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão. Diferenças

significativas (p<0,05) entre os grupos estão indicadas pelas linhas conectoras.

Após análise dos dados de carga parasitária na pele, observou-se haver

discrepâncias quanto à quantidade de parasitos nos diferentes grupos, ou seja, houve

muita variação na carga parasitária nos animais de um mesmo grupo clínico (conforme

descrito anteriormente para os cães oligossintomáticos). Dessa forma, foi realizada uma

categorização dos dados de carga parasitária obtidos pela PCR em tempo real em tercis

objetivando agrupar os cães de acordo com a quantificação do parasitismo dérmico.

Dessa maneira, os 35 cães utilizados nesse estudo foram classificados em: baixo

parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e alto parasitismo (AP). Assim, uma nova

reclassificação foi abordada nesse trabalho, levando em conta a carga parasitária e não

apenas a presença dos sinais clínicos, e a partir daqui estaremos apresentando nossos

resultados sob estas duas abordagens (forma clínica e carga parasitária). A Tabela 3

mostra a distribuição dos cães em ambas as abordagens empregadas para classificação

dos animais. Pode-se notar que nenhum cão pertencente ao grupo assintomático (CA,

n=11) possuía alto parasitismo, da mesma forma que nenhum animal do grupo

sintomático (CS, n=12) possuía baixo parasitismo. Cães do grupo oligossintomático

(CO, n=12) possuíam tanto baixo parasitismo quanto médio e alto parasitismo.

RESULTADOS

39

Grupos BP MP AP

CA 7 4 0 11

CO 5 2 5 12

CS 0 5 7 12

Total 12 11 12 35

Tabela 3: Distribuição dos cães naturalmente infectados por L. infantum por diferentes

formas clínicas da LVC e por diferentes cargas parasitárias cutâneas

5.3 - Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha

Num primeiro momento foi realizada a quantificação do processo inflamatório na

pele de cães com diferentes manifestações clínicas da LVC e os resultados estão

apresentados na Figura 7. Observa-se que todos os animais avaliados, independente da

forma clínica, apresentaram processo inflamatório quando comparados aos animais do

grupo controle. Os animais sintomáticos apresentaram maior processo inflamatório em

comparação aos cães dos grupos assintomático e oligosintomático.

A avaliação histopatológica à microscopia ótica mostrou que o infiltrado

inflamatório presente em todos os grupos foi predominantemente

plasmohistiolinfocitário, com diferentes graus de intensidade, podendo estar distribuído

na derme superficial ou apresentar-se focal, principalmente ao redor de vasos, glândulas

e folículos pilosos na derme profunda (Figura 8).

RESULTADOS

40

C N C A C O C S

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

Nú

me

ro

de

cé

lula

s e

m 1

,5 x

10

6

m2

Figura 7: Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha de cães



(CO) e sintomáticos (CS). Os resultados estão expressos como soma ± erro padrão.

Diferenças significativas (p<0,05) entre os grupos estão indicadas pelas linhas

conectoras.




oligossintomáticos e (D) sintomáticos. Ausência de processo inflamatório nos animais

do grupo controle; discreto, moderado e intenso processo inflamatório nos animais

A

C

B

D

RESULTADOS

41

C N B P M P AP

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

Nú

me

ro

de

cé

lula

s e

m 1

,5 x

10

6

m2

assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos, respectivamente. Hematoxilina-

Eosina. Barra=50m.

Ao avaliar a presença e a intensidade de inflamação em cães naturalmente

infectados com L. infantum, portadores de diferentes cargas parasitárias, pode-se

perceber que animais com médio e alto parasitismo possuíam maior processo

inflamatório em relação aos cães com baixo parasitismo (Figura 9). Mesmo, em cães

com baixa carga parasitária cutânea observa-se ainda, que o processo inflamatório é

maior quando comparados a cães do grupo controle. Além disso, animais do grupo MP

e AP apresentaram maior processo inflamatório quando comparado aos animais do

grupo BP.

Da mesma forma, a avaliação histopatológica por microscopia ótica, mostrou

que o infiltrado inflamatório presente em todos os grupos foi semelhante ao apresentado

pelos cães com diferentes formas clínicas, conforme apresentado na Figura 8.

Figura 9: Quantificação do processo inflamatório na pele da orelha de cães



e alto parasitismo (AP). Os resultados estão expressos como soma ± erro padrão.


conectoras.

RESULTADOS

42

C N C A C O C S

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

Nú

me

ro

de

ma

stó

cit

os

em

1,5

x 1

06

m2

5.4 - Quantificação de mastócitos na pele da orelha

No presente estudo, foi proposta a investigação de mastócitos na pele de cães

naturalmente infectados por L. infantum, portadores de diferentes formas clínicas da

infecção. A quantificação de mastócitos na derme, após coloração por Azul de

Toluidina, permitiu evidenciar a presença dessas células em todas as camadas da derme,

com predomínio ao redor dos vasos sanguíneos e mostrou maior número deste tipo

celular em cães do grupo oligossintomático quando comparado aos animais do grupo

controle. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os cães dos grupos

assintomático e sintomático com relação ao grupo controle, bem como entre as

diferentes formas clínicas, como mostrado na Figura 10.




sintomáticos (CS). Os resultados estão expressos como soma ± erro padrão. Diferenças


De forma interessante, ao se avaliar a presença de mastócitos em cães com

diferentes intensidades de parasitismo cutâneo foi possível observar maior número de

mastócitos nos animais com baixo e médio parasitismo tecidual, quando comparados ao

grupo controle como mostrado no gráfico abaixo (Figura 11).

RESULTADOS

43

C N B P M P AP

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

Nú

me

ro

de

ma

stó

cit

os

em

1,5

x 1

06

m2


infectados por Leishmania (Leishmania) infantum infantum e agrupados de acordo com

a intensidade da carga parasitária: baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e

alto parasitismo (AP). Os resultados estão expressos como soma ± erro padrão.


conectoras.

5.5 - Quantificação da matriz extracelular na pele da orelha

5.5.1 - Quantificação do colágeno total

Para a quantificação da área de colágeno total da pele de orelha dos cães

naturalmente infectados com L. infantum, cortes histológicos foram confeccionados e

coradas por Tricrômico de Masson para posterior quantificação e análise. Os resultados

encontram-se apresentados nas Figuras 12 e 13.

Observou-se redução significativa da quantidade de fibras colágenas na derme de

cães sintomáticos e oligossintomáticos em relação aos animais do grupo controle. Nos

cães sintomáticos também foi observado uma redução significativa da área de colágeno

total em relação aos cães assintomáticos. Essa redução foi visível em todas as áreas

analisadas, tanto na derme superior quanto na derme inferior.

RESULTADOS

44

CN CA CO CS0

20000

40000

60000

80000

Áre

a d

e c

olá

ge

no

(

m²)




(CO) e sintomáticos (CS).Os resultados estão expressos como média ± erro padrão.


conectoras.




oligossintomáticos e (D) sintomáticos. Aspecto histológico dérmico normal em animais

controle; menor área de colágeno nos animais oligossintomáticos e sintomáticos.

Tricrômico de Masson. Barra=50m

A

C

B

D

RESULTADOS

45

CN BP MP AP0

20000

40000

60000

80000

Áre

a d

e c

olá

ge

no

(

m²)

Na avaliação da área de colágeno total, nos cães com distintos graus de

parasitismo cutâneo, foi observada uma diminuição dessa área nos cães com médio e

alto parasitismo quando comparados ao grupo controle. Além disto, também foi

observada uma diminuição significativa da área de colágeno em cães com médio

parasitismo quando comparados aos cães com baixo parasitismo. Esses resultados

podem ser observados na Figura 14:




e alto parasitismo (AP). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão.


conectoras.

5.5.2 - Quantificação do colágeno tipo I e III na pele da orelha

Com o objetivo de avaliar e quantificar alguns tipos de colágeno, após o estudo da

área de colágeno total, foi realizada a técnica de Picrosirius red buscando identificar o

tipo de fibra colágena (tipo I ou III) que se encontrava reduzida em cães naturalmente

infectados com L. infantum, portadores de diferentes formas clínicas e graus de

intensidade parasitárias cutâneas.

Nas Figuras 15 e 16 encontram-se representados os dados obtidos na avaliação de

colágenos do tipo I e III em cães portadores de diferentes formas clínicas. Em relação às

fibras colágenas do tipo I, observa-se uma diminuição significativa em cães

oligossintomáticos e sintomáticos em relação aos cães do grupo controle. Já na análise

das fibras colágenas do tipo III, houve aumento das mesmas nos cães do grupo

RESULTADOS

46

CN CA CO CS0

200000

400000

600000

Áre

a d

o c

olá

ge

no

Tip

o III (

m2)

Tipo I Tipo III

CN CA CO CS0

200000

400000

600000

Áre

a d

o c

olá

ge

no

Tip

o I (

m2)

oligossintomático em relação aos animais do grupo controle e aos animais do grupo

sintomático.

Figura 15: Quantificação de colágeno tipo I e II na pele da orelha de cães naturalmente



sintomáticos (CS). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão. Diferenças


Figura 16: Fotomicrografias representativas da presença de colágeno tipo I e tipo III na

pele da orelha de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum e

agrupados de acordo com as diferentes formas clínicas da doença: (A) controle, (B)

assintomáticos, (C) oligossintomáticos e (D) sintomáticos. Picrossirius Red.

Barra=50m

A

C

B

D

RESULTADOS

47

CN BP MP AP0

200000

400000

600000

Áre

a d

o c

olá

ge

no

Tip

o I (

m2)

Tipo I Tipo III

CN BP MP AP0

200000

400000

600000

Áre

a d

o c

olá

ge

no

Tip

o III (

m2)

A avaliação das fibras colágenas I e III nos grupos com distintos graus de

parasitismo cutâneo encontram-se mostradas na Figura 17. Foi observada redução

significativa das fibras colágenas do tipo I em cães com médio parasitismo em relação

aos grupo controle. Por outro lado, as fibras colágenas do tipo III apresentavam-se

aumentadas em cães com baixo parasitismo em relação aos animais com médio

parasitismo e aos animais controle.

Figura 17: Quantificação de colágeno tipo I e III na pele da orelha de cães naturalmente



parasitismo (AP). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão. Diferenças


6 - DISCUSSÃO

DISCUSSÃO

49

A leishmaniose visceral é uma doença negligenciada que afeta principalmente os

países mais pobres do mundo, levando ao óbito cerca de sessenta mil pessoas

anualmente. Mesmo com os avanços científicos relacionados ao diagnóstico, tratamento

e prevenção ocorridos nos últimos 10 anos, a LV mostra taxas de mortalidade com

preocupante tendência ao crescimento (WHO, 2010). Essa doença faz parte de um

complexo sistema biológico que envolve o hospedeiro humano, o parasito, o vetor e na

maioria dos casos um reservatório animal, o cão, que é o responsável pela manutenção

do parasito nos focos endêmicos e o mais importante reservatório no ciclo zoonótico,

devido à alta prevalência da doença entre estes animais, com presença de formas

amastigotas na pele, e ao estreito convívio do cão junto ao homem (Deane, 1956; Alvar

et al., 2004; WHO, 2010).

A presença do parasito nos órgãos e tecidos, associada à resposta imune do cão

perante a infecção, determinam reações que produzem as lesões e sinais clínicos

característicos da LVC (Alvar et al., 2004; Reis et al., 2006b). Esta caracteriza-se por

apresentar um largo espectro de lesões que variam desde a infecção inaparente até uma

forma clínica grave, que normalmente leva à morte do animal (Reis et al., 2006b).

Nesse sentido, estudos relacionados à patogênese da doença canina têm se intensificado

com intuito de um melhor esclarecimento dos mecanismos envolvidos na formação dos

sinais clínicos e lesões apresentadas pelos animais infectados (Palatinik et al., 2004). A

compreensão dos fatores relacionados à evolução clínica, bem como o estabelecimento

e manutenção de lesões cutâneas e viscerais na LVC, tem sido alvo de recentes estudos

visando o entendimento dos mecanismos imunológicos relacionados ao controle do

parasitismo e ao estabelecimento das formas clínicas no cão (Reis, et al., 2006).

Além da resposta imune, não está ainda bem elucidado como outros fatores

poderiam influenciar na resistência ou na susceptibilidade à doença nos cães. A idade,

sexo, nutrição, genética, co-morbidades, carga parasitária, virulência da cepa de

Leishmania, além de outros fatores, podem contribuir para o aparecimento e expressão

das manifestações clínicas da LVC (Baneth et al., 2008; Solano-Gallego et al., 2009).

Além disso, informações a respeito de aspectos clínicos dos cães além de outros

elementos, como o porte e tamanho do pêlo são importantes para o entendimento da

epidemiologia da LVC no ambiente urbano.

DISCUSSÃO

50

Quanto ao porte dos cães e sua relação com o parasito, observou-se que houve

predomínio de porte médio nos animais desse estudo (47,2%), o mesmo visto por

Coura-Vital et al. (2011) que, ao estudarem fatores de risco associados à soroconversão

canina por L. infantum em Belo Horizonte, Minas Gerais, observaram que cães de

grande porte possuem duas vezes mais risco de soroconverter que animais de pequeno

porte. Isso pode ser atribuído à maior superfície corporal do cão exposto ao vetor. Além

disso, cães de grande porte permanecem mais tempo no quintal de residências e dormem

nesse local, aumentando os riscos de acesso ao vetor. Durante avaliações

epidemiológicas nas regiões sudeste e sul da Espanha, observou-se que a

soroprevalência de LVC aumenta gradualmente com o porte do animal sendo esta

característica, um fator de risco para a doença (Martín-Sánchez, 2009; Gálvez et al.,

2010), fato que sustenta nossos resultados. Em estudo realizado em Montes Claros,

Minas Gerais, França-Silva et al. (2003) constataram que a soroprevalência de LVC é

maior em cães de pêlo curto quando comparada a cães de pelo longo. Possivelmente o

pelo curto torna o cão mais vulnerável às picadas do flebotomíneo e consequentemente,

à infecção por parasitos do gênero Leishmania. Moreira et al. (2003) acreditam que

animais de pêlo curto atraem mais facilmente o vetor, uma vez que o calor irradiado

pela sua pele seria facilmente percebido pelo invertebrado. Resultado semelhante foi

visto em nosso estudo, onde houve uma prevalência de 75% de animais de pêlo curto.

Os resultados da avaliação física dos animais estudados reproduzem o que já foi

descrito na literatura quanto ao tipo e a frequência das alterações encontradas em cães

com LVC (Amusategui et al., 2003; Alvar et al., 2004; Baneth et al., 2008; Solano-

Gallego et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2011). Embora a frequência de apresentação

destes sinais normalmente varie de um estudo para outro, a ocorrência dos mesmos está

de acordo com nossos resultados, já que os sinais clínicos mais comumente encontrados

nos cães acometidos pela LVC são lesões cutâneas, linfadenopatia e perda de peso.

As anormalidades na pele são consideradas as manifestações clínicas mais

usuais na LVC, acometendo entre 81% a 89% dos animais infectados (Ferrer, 2002;

Solano-Gallego et al., 2004; Alvar et al., 2004). Sinais clínicos como ulceração crônica

principalmente localizada nas orelhas e membros, onicogrifose e descamação são

frequentes (Ciaramella et al., 1997). Dentre os sinais clínicos presentes nos animais

infectados avaliados neste estudo, as dermatopatias foram os mais comuns (47,2%), e na

maioria dos cães foram observadas mais de um tipo e em variados graus de

DISCUSSÃO

51

acometimento. Estes resultados também estão em acordo com a literatura, que sugere

não ser possível estabelecer um padrão patognomômico das alterações dermatológicas à

LVC (Alvar et al., 2004; Amusategui et al., 2003; Baneth et al., 2008; Solano-Gallego

et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2011).

As linfadenopatias seguiram em segundo lugar como sinal clínico mais

prevalente nos cães desse estudo, acometendo 36,1% dos mesmos. Em geral, ocorre

aumento sugestivo desse órgão em função do aumento do número e do tamanho dos

folículos linfóides e a marcante hiperplasia e hipertrofia dos macrófagos da região

medular do órgão associado à linfadenite capsular e inflamação dos seios subcapsulares

(Lima et al., 2004). Estudos apontam que aproximadamente 60-90% de cães com LVC

apresentam esse sinal clínico (Alvar et al., 2004; Amusategui et al., 2003; Baneth et al.,

2008; Lima et al., 2004). Amusategui et al. (2003) observaram em estudo realizado com

61 cães naturalmente infectados por L. infantum, que o sinal clínico mais frequente foi a

linfadenopatia generalizada, acometendo 80% dos cães. De acordo com Lima et al.

(2004) e Costa et al. (2008), os linfonodos cervicais são os primeiros envolvidos na

disseminação do parasito em cães naturalmente infectados. Segundo estes autores a

maior reatividade dos linfonodos cervicais deve-se à sua posição anatômica, uma vez

que estes drenam as regiões cutâneas e subcutâneas da cabeça e orelha.

Outros sinais clínicos sugestivos de LVC, bastante frequentes nesse estudo

foram emagrecimento, acometendo 33,3% dos cães, seguidos por onicogrifose, presente

em 30,5 % dos animais avaliados. Em cães naturalmente infectados por L. infantum, o

emagrecimento é um dos sinais mais relatados na literatura. Para alguns autores, este

quadro deve-se, provavelmente, a um desequilíbrio protéico, em virtude da proteinúria

associada à deficiência imunológica crônica do animal doente (Alvar et al., 2004;

Amusategui et al., 2003). A onicogrifose, relacionada com a intensa apatia apresentada

por cães infectados, impossibilitando o desgaste natural das unhas (Genaro, 1993) é

também um sinal clínico bastante frequente. Verçosa et al. (2008) observaram

frequência de onicogrifose em 83,3% de vinte e oito cães naturalmente infectados de

uma área endêmica em Tereseina, Piauí.

Os critérios de inclusão dos cães deste estudo nas diferentes formas clínicas da

LVC, seguiram as recomendações de classificação clínica proposta por Manciantti et al.

(1988) e revisada por Reis et al. (2006). Embora os sinais clínicos observados nesse

DISCUSSÃO

52

estudo não sejam patognomônicos para LVC, o fato de que todos os animais infectados

são sorologicamente positivos sugere que os sinais clínicos encontrados sejam em

decorrência da doença.

A pele de orelha é um tecido amplamente utilizado para diagnóstico na LVC,

visto que a detecção direta do parasito, em biopsias de pele, pode ser obtida através de

um procedimento cirúrgico extremamente simples (Tafuri et al., 2004). Xavier et al.

(2006) demonstraram que amostras de pele da orelha, espelho nasal e abdômen são

potencialmente utilizadas para diagnóstico da LVC independente do estado clínico do

cão. Porém, esses autores relatam um maior parasitismo na pele de orelha quando

comparado aos outros locais. Travi et al. (2001) observaram que a pele de orelha tende

a ser mais infectiva à flebotomíneos em relação a pele do abdômen. Ao avaliarem duas

distintas regiões anatômicas da pele de orelha, Moura et al. (2008) observaram maior

parasitismo na extremidade quando comparado ao terço inferior desse órgão. A

susceptibilidade da pele de orelha parece ser devido ao fato desse local ser bastante

vulnerável a auto traumatismos, estimulando o prurido e dessa forma o acúmulo de

células inflamatórias nesse local, contribuindo para a manutenção do parasitismo

(Tafuri et al., 2000). Nesse sentido, devido ao grande parasitismo observado na pele da

orelha por outros autores, este órgão foi o escolhido como alvo das análises do presente

estudo.

A avaliação das alterações histopatológicas e parasitológicas na pele vem sendo

realizada buscando ampliar a compreensão tanto da história natural da LVC quanto em

função da importância deste sítio no contexto epidemiológico como fonte primária de

infecção para os insetos vetores. Os dados obtidos no presente estudo, abordando os

aspectos parasitológicos na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum,

portadores de diferentes formas clínicas, apontam para relação entre progressão da

sintomatologia acompanhada pelo aumento do parasitismo. Dessa forma, cães com

sinais clínicos sugestivos de LVC, sejam eles oligossintomáticos ou sintomáticos,

apresentaram maior carga parasitária na pele, quando comparados a cães assintomáticos.

O mesmo resultado foi encontrado por Giunchetti et al. (2006) que ao estudarem cães

naturalmente infectados, da mesma área endêmica, também observaram maior carga

parasitária cutânea em cães sintomáticos em relação a cães assintomáticos por imuno-

histoquimica anti-Leishmania e Leishmania Donovan Units - LDU. Xavier et al. (2006)

DISCUSSÃO

53

também encontraram os mesmos resultados ao estudarem a pele de diferentes partes do

corpo, por H&E e imuno-histoquímica, de cães naturalmente infectados por L. infantum.

A razão de cães assintomáticos apresentarem menor carga parasitária cutânea

deve-se à resposta imune nestes animais ser mais efetiva e, portanto permitir o controle

da replicação do parasitismo. Estudos pioneiros desenvolvidos por Pinelli et al. (1994a),

Pinelli et al. (1994b) e Pinelli et al. (1995) permitiram estabelecer uma associação entre

um perfil de resposta relacionado à resistência em cães assintomáticos, caracterizado

pela produção de citocinas como IL-2 e TNF-. Posteriormente, pesquisadores

associados ao nosso grupo de pesquisa ao estudarem o fenótipo de leucócitos do sangue

periférico de cães naturalmente infectados por L. infantum, evidenciaram um aumento

de linfócitos T CD5+ e das subpopulações de linfócitos T (CD4

+ e CD8

+) em cães

assintomáticos em relação aos cães sintomáticos. Além disto, foi observada queda na

população de linfócitos B CD21+ nos animais sintomáticos quando comparados aos cães

não infectados e assintomáticos. Quando os mesmos animais foram reagrupados

levando-se em conta a carga parasitária da medula óssea, resultados semelhantes foram

observados, com aumento de linfócitos T CD5+ e da subpopulação de linfócitos T CD8

+

nos grupos com baixo e médio parasitismo quando comparados ao grupo com alto

parasitismo. Ainda, o grupo com alto parasitismo apresentou queda na população de

linfócitos B CD21+ e monócitos CD14

+ em relação ao grupo com médio parasitismo. A

associação desses resultados esclarece o encontro de baixa carga parasitária em cães

assintomáticos (Reis et al., 2006b).

Apesar do diagnóstico definitivo de LVC ser baseado na detecção de formas

amastigotas através do estudo imuno-histoquímico de cortes dos tecidos (Tafuri et al.,

2001; Solano-Gallego et al., 2004; Tafuri et al., 2004,; Xavier et al., 2006) e o fato de

esta técnica utilizar anticorpos imunomarcados específicos para o parasito, aumentar sua

sensibilidade e especificidade (Tafuri et al., 2004), a detecção de formas amastigotas

pela PCR em tempo real se torna mais abrangente uma vez que é uma técnica mais

sensível e específica. Atualmente, essa técnica vem sendo utilizada, por vários autores,

para diagnosticar ou monitorar a evolução da LV através da quantificação da carga

parasitária, em substituição a outras técnicas, como a PCR convencional ou a imuno-

histoquímica, por apresentar alta sensibilidade, acurácia e reprodutibilidade (Manna et

al., 2006). A PCR em tempo real mostra-se mais sensível que a técnica de PCR

convencional no diagnóstico e monitoração da infecção canina. Francino et al. (2006)

DISCUSSÃO

54

verificaram que enquanto a PCR convencional foi negativa para amostras que

apresentaram menos que 30 parasitos por mililitro de sangue periférico ou medula

óssea, a PCR em tempo real apresentou sensibilidade de 0,001 parasitos. Esta

sensibilidade elevada é de particular importância no acompanhamento da infecção

canina, uma vez que, uma marcante característica da doença no cão é a presença de

parasitos residuais ou latentes após o tratamento. A abordagem quantitativa é

importante não somente para elucidar o “status” de positividade de cães em áreas

endêmicas, mas também para monitorar o número de parasitos no pós-tratamento ou em

triagens de quimioterápicos (Francino et al., 2006).

Figueiredo et al. (2010) ao quantificarem a carga parasitária de cães

naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum, de duas distintas áreas de Belo

Horizonte (área central e metropolitana), observaram maior carga parasitária na pele de

cães naturalmente infectados pertencentes a área central dos que o da área metropolitana

Esses autores destacam com esses resultados a importância da urbanização da infecção

por esse parasito em muitas cidades brasileiras. Ainda, desvinculam a hipótese de que

somente animais residentes em áreas desfavorecidas estariam mais propensos a

infecções.

Vale ressaltar a presença de parasitos em cães assintomáticos, mesmo que com

baixa carga parasitária. O papel desses cães no contexto epidemiológico se torna muito

evidente, uma vez que esses animais podem infectar flebotomíneos, disseminando a

doença (Moreno & Alvar, 2002). Costa-Val et al. (2007) demonstraram, através de

xenodiagnóstico, que cães sintomáticos infectavam em maior proporção os

flebotomíneos (51,9%), ao passo que 18,3% dos cães assintomáticos infectaram esses

vetores. Apesar de menor, esses resultados comprovam a participação destes animais no

ciclo do parasito revelando a importância desses cães na epidemiologia da LVC como

discutido por Abranches et al. (1998) em Portugal, Solano-Gallego et al. (2001) na

Espanha e Lima et al. (2004) no Brasil. Cabe ressaltar que cães assintomáticos

representam o maior percentual de animais soropositivos em uma área endêmica e

portanto, mesmo sendo menos infectivos eles possuem uma forte contribuição como

reservatório do parasito (Coura-Vital, et al., 2011).

Após quantificação do parasitismo nos grupos de diferentes formas clínicas, foi

observado haver uma grande discrepância na carga parasitária entre animais de um

DISCUSSÃO

55

mesmo grupo, ou seja, houve uma heterogeneidade em alguns grupos clínicos como,

por exemplo, os cães oligossintomáticos. Desta forma, os animais foram reclassificados,

conforme a quantificação do parasitismo cutâneo empregando tercis, em baixo, médio e

alto parasitismo. Guerra et al. (2009) observaram essa mesma heterogeneidade nos

grupos formados de acordo com os sinais clínicos após estudar cães naturalmente

infectados por L. Infantum. Estes autores, também categorizaram os cães pela carga

parasitária cutânea, por LDU, e mostraram haver correlação negativa entre carga

parasitária na pele e níveis de linfócitos T CD5+ e CD8

+, onde cães com alto parasitismo

cutâneo apresentavam baixos percentuais desses fenótipos celulares. Dessa forma, esses

dados demonstram que a classificação dos cães de acordo com os diferentes graus de

parasitismo teciduais pode auxiliar na melhor compreensão da história natural da LVC e

da patogenia desta doença, contribuindo com com os dados obtidos quando estes

animais são avaliados por diferentes formas clínicas.

A fim de averiguar se a carga parasitária cutânea contribuía no processo

inflamatório, um estudo histológico da pele, através da quantificação das células

inflamatórias foi realizado. Apesar de infiltrado inflamatório ser uma alteração

histológica comum na pele de cães procedentes de áreas endêmicas (Dos Santos et al.,

2004) foi observado um maior infiltrado inflamatório na pele de cães sintomáticos

quando comparado aos cães controles e assintomáticos. Resultados semelhantes

também foram descritos por outros grupos de pesquisa: Dos Santos et al. (2003), Solano

Gallego et al. (2004), Giunchetti et al. (2006), Xavier et al. (2006) e Verçosa et al.

(2012).

Em relação à composição do infiltrado inflamatório presente na pele, podemos

descrever que este era composto por células mononucleares com predomínio de

macrófagos, linfócitos e plasmócitos, respectivamente, presentes na derme superficial e

em focos ao redor de vasos sanguíneos, folículos pilosos e glândulas. Apesar da

presença de macrófagos ser alta, esses não formavam granulomas, mesmo em cães com

alto parasitismo corroborando com os dados de Giunchetti et al. (2006) e contrariando

os dados de Dos-Santos et al. (2004) os quais observaram formação de granuloma de

células epitelióides na pele de cães infectados com alta carga parasitária.

Calabrese et al. (2008) ao analisarem histopatologicamente a pele de cães

naturalmente infectados por L. infantum de duas diferentes áreas endêmicas no Brasil,

DISCUSSÃO

56

observaram diferenças no perfil histopatológico desse órgão: cães da região de Campo

Grande (MS) apresentaram infiltrado dérmico difuso, composto de inúmeros

macrófagos parasitados, poucos linfócitos e muitos mastócitos. Na outra região, São

Luis (MA), a pele desses dos cães apresentava uma notável reação inflamatória com

presença de plasmócitos, linfócitos e poucos parasitos. Esses autores sugerem que há

diferenças quanto ao padrão histológico na pele de cães naturalmente infectados e esse

fato está diretamente relacionado à área endêmica que o animal habita, possivelmente

devido as características genéticas distintas entre as cepas de L. infantum que circulam

nas diferentes regiões do Brasil.

Considerando a quantificação do processo inflamatório na pele dos cães com

diferentes intensidades de parasitismo, foi observado maior número de células

inflamatórias em cães com média e alta carga parasitária. De fato, possivelmente, a

carga parasitária tem efeito sobre o estabelecimento e bem como as características e a

intensidade do processo inflamatório. Verçosa et al. (2008) observaram uma correlação

positiva entre carga parasitária e inflamação em cães naturalmente infectados por L.

infantum.

A infecção por Leishmania é caracterizada pela presença de inúmeros tipos

celulares, incluindo os mastócitos, porém o papel desse tipo celular ainda não está bem

esclarecido na LVC. Estudo realizado com camundongos resistentes (C57BL/6) e

susceptíveis (BALB/c) à Leishmania demonstrou que o número de mastócitos aumenta

significativamente em camundongos susceptíveis, mas não em resistentes. Além disso,

citocinas derivadas de mastócitos desempenham papel pró-parasito nos animais

susceptíveis e anti-parasito naqueles resistentes. Romão et al. (2009) mostraram que

quando ocorre degranulação dos mastócitos antes do desafio com Leishmania major,

camundongos BALB/c tornam-se mais resistentes à infecção, com diminuição do

tamanho das lesões e da carga parasitária, evidenciando um papel protetor destas células

associados a sua principal capacidade funcional.

Mastócitos possuem grânulos citoplasmáticos ricos em proteoglicanos,

proteases, como as quimases e triptases e outras substâncias. Quando ativadas, seja por

IgE, histamina, macrófagos, linfócitos T ou por componentes do sistema complemento

(C3a, C5a), estas células realizam o processo de degranulação, por meio do qual

diversas substâncias são liberadas no espaço extracelular (Chatterjee et al., 2008). Além

DISCUSSÃO

57

de sua ação na resposta imune, os mastócitos podem estar envolvidos no reparo tecidual

e na síntese de colágeno, por meio da produção de triptase, que estimula os fibroblastos

a produzirem colágeno, contribuindo assim para o reparo e fibrose (Ledesma-Montes et

al., 2004). Estudos in vitro, demonstraram que quimases, produzidas por mastócitos de

humanos e roedores também ativam a procolagenase, degradam matriz extracelular e

processam procolágeno para formação de fibrilas colágenas (Nishikori et al., 1998).

Adicionalmente, mastócitos podem ativar metaloproteinases, que por sua vez degradam

a matriz extracelular (Heikkilä et al., 2008). Esses achados justificam nossos resultados,

uma vez que cães oligossintomáticos possuem maior número de mastócitos na pele e

maior deposição de fibras colágenas do tipo III. A maior quantidade de colágeno tipo III

nesse grupo pode estar relacionada àa produção de triptases e quimases pelos mastócitos

na pele desses cães. O mesmo pôde ser visto nos cães com baixo parasitismo, os quais

apresentaram maior número de mastócitos e maior deposição de fibras colágenas do tipo

III.

É amplamente conhecido que a resposta imune cutânea, no estágio inicial da

infecção, tem papel determinante no curso da doença. Avaliar as alterações cutâneas

torna-se importante devido a sua fonte como sítio de infecção e consequente influência

na transmissão da leishmaniose (Giunchetti et al., 2006). É sabido que a pele é

constituída por uma variedade de células e uma matriz extracelular composta por

inúmeras fibras, principalmente fibras colágenas. A instalação do parasito nesse meio

irá deslocar, poucas horas após a inoculação dos parasitos, um massivo infiltrado celular

constituído principalmente por macrófagos os quais entram em contato rapidamente

com o parasito. Essas células inflamatórias se rearranjarão em meio à matriz

extracelular, ocupando espaços até então ocupados por fibras colágenas. Além do mais,

os parasitos são capazes de produzir proteases que degradam proteínas da matriz

extracelular, facilitando a penetração na barreira dérmica e difusão da infecção. Quando

as formas promastigotas de Leishmania são inoculadas na pele do hospedeiro ocorre um

afrouxamento ou desprendimento da matriz do tecido conjuntivo da derme, permitindo

então o estabelecimento da infecção (Lira et al.,1997). Pesquisas têm mostrado que as

metaloproteases, enzimas proteolíticas que tem a função de manutenção e

remodelamento da arquitetura tecidual, podem modificar a função da matriz extracelular

não somente pela degradação de proteínas da matriz, mas também por afetarem fatores

de crescimento, citocinas e moléculas de adesão. Essas enzimas são produzidas por

DISCUSSÃO

58

leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e também por mastócitos

(Yamada & Kemler, 2002; Heikkilä et al., 2008). Esses fatos justificam nossos

resultados, uma vez que cães sintomáticos, onde o processo inflamatório era mais

intenso, houve maior perda de fibras colágenas quando comparados a cães controle e

assintomáticos. O mesmo resultado foi observado em cães oligossintomáticos em

relação ao controle e aos assintomáticos e em cães com baixo e médio parasitismo.

Além do infiltrado inflamatório ser maior em cães com sinais clínicos, a carga

parasitária também é maior, fato que fortifica ainda mais os achados desse trabalho,

uma vez que tanto o parasito quanto células do infiltrado inflamatório tem capacidade

de degradar componentes da matriz extracelular.

Na derme, estão presentes inúmeros fibroblastos que além de sintetizarem

grande parte da matriz extracelular como proteoglicanos, fibronectina, elastina e

laminina, sintetizam colágeno, que é a proteína mais abundante nos seres humanos e o

principal componente da pele. Em torno de 90% dessas fibras colágenas da pele são do

tipo I ao passo que 10% são do tipo III (Li et al., 2007). Em nosso estudo ficou

evidenciado que nos animais com sinais clínicos de LVC, a quantificação das fibras

colágenas do tipo I foi menor que nos cães do grupo controle e assintomático,

mostrando que em cães oligo e sintomáticos houve perda da arquitetura normal da pele,

ou seja, houve lesão. A fim de reparar essa perda, fibras colágenas do tipo III foram

sintetizadas nos cães do grupo oligossintomático, dando lugar as do tipo I que foram

perdidas, mostrando que esses animais conseguiram reparar o tecido danificado. Por

outro lado, cães do grupo sintomático perderam fibras de maior abundância na pele,

porém não conseguiram recuperar o tecido lesionado. Esse fato pode estar relacionado a

alta carga parasitária e intenso processo inflamatório nesses animais, que impedem que

o tecido conjuntivo seja reparado.

Abreu-Silva et al. (2004) trabalhando com infecção experimental em várias

linhagens de camundongos com cepas de L. amazonensis e utilizando Picrossirius red

sob luz polarizada observaram que na fase inicial da infecção havia predominância de

colágeno tipo I na lesão cutânea primária dos animais. Ainda constataram que o mesmo

tipo de colágeno era observado no tecido cutâneo dos animais não infectados.

Entretanto, este autores observaram que no decorrer da infecção havia um decréscimo

gradual desse tipo de colágeno sendo substituído pelo colágeno tipo III. Esses mesmos

autores, ainda demonstraram que essas mudanças eram mais evidentes nos animais mais

DISCUSSÃO

59

susceptíveis, BALC/c, principalmente quando apresentavam lesões contendo intenso

infiltrado inflamatório, constituído por macrófagos altamente parasitados por

Leishmania, culminando com a perda da arquitetura normal desse órgão.

A pele pode ser considerada o mais importante tecido reservatório de parasitos

em cães infectados por Leishmania (Abranches et al., 1991; Solano-Gallego et al.,

2001; Solano-Gallego et al., 2004). O estudo detalhado desse órgão frente a cães com

diferentes formas clínicas e distintos graus de parasitismo cutâneo e suas alterações

histopatológicas causadas pelo parasito são bastante relevantes, permitindo assim uma

melhor compreensão da história natural da LVC bem como dos processos relacionados

à patogenia das lesões cutâneas que estão diretamente relacionadas a fonte de parasitos

para o inseto vetor, reforçando a importância desses animais no ciclo epidemiológico da

leishmaniose visceral.

7 - CONCLUSÕES

CONCLUSÕES

61

Cães sintomáticos apresentam maior carga parasitária cutânea do que cães

assintomáticos e oligossintomáticos e esse parasitismo é diretamente proporcional ao

infiltrado inflamatório na pele desses animais.

Cães com médio e alto parasitismo apresentam maior processo inflamatório na

pele em relação a cães com baixo parasitismo, mostrando que a carga parasitária tem

efeito sobre o recrutamento de células inflamatórias.

Os mastócitos além de serem células atuantes na resposta imune, também são

células envolvidas na recuperação e remodelamento do tecido lesionado, mostrando

nesse estudo que esse último papel está ocorrendo com maior frequência nos cães

oligossintomáticos.

A perda de fibras colágenas de maior abundância na pele, fibras colágenas do

tipo I, em cães oligossintomáticos e sintomáticas demostram haver lesão no tecido.

Porém, cães oligossintomáticos conseguem recuperar o tecido lesionado com a

produção de fibras colágenas do tipo III ao passo que animais sintomáticos não

conseguem realizar esta recuperação. Esse fato está relacionado à alta carga parasitária

na pele de cães sintomáticos.

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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