UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS TIPO 2 E DO TORQUE TENO

VÍRUS EM SUÍNOS DE CRIAÇÕES INTENSIVAS DO ESTADO DE

GOIÁS

Patrícia Soares

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito

GOIÂNIA

2011

ii

iii

PATRÍCIA SOARES

IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS TIPO 2 E DO TORQUE TENO

VÍRUS EM SUÍNOS DE CRIAÇÕES INTENSIVAS DO ESTADO DE

GOIÁS

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientadora:

Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo

Prof. Dr. Jürij Sobestiansky

GOIÂNIA

2011

iv

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

S676i

Soares, Patrícia.

Identificação do circovírus tipo 2 e do torque teno vírus

em suínos de criações intensivas do Estado de Goiás

[manuscrito] / Patrícia Soares. - 2011.

117 f. : il., figs, tabs.

Orientadora: Profª. Drª. Wilia Marta Elsner Diederichsen

de Brito; Coorientadores: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de

Araújo, Prof. Dr. Jurij Sobestiansky.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,

Escola de Veterinária e Zootecnia, 2011.

Bibliografia.

Inclui lista de figuras, abreviaturas, quadros e tabelas.

Anexo.

1. Circovírus suíno – Coinfecção – Goiás (Estado). 2.

Torque teno vírus - Suíno. 3. Suíno – Doença multifatorial. I.

Título.

CDU: 636.4:616-022(817.3)

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vi

Aos meus pais, pela oportunidade da vida e por me ajudarem na descoberta mais importante: Meu caminho e minha verdade, por meio dos seus esforços e apoio a minha educação.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por ser fonte inesgotável de luz que ilumina e

guia todos os meus passos. Por ter sido sustentação nestes anos de estudo

que direcionaram para a obtenção deste título.

Agradeço a toda minha família (apesar da distância), especialmente aos meus

pais, Marta e Rafael, ao meu irmão Marcinho e tios Adair, Mirtes, Meire e

Marcelo e à Lorenna pelo amor, pela força e motivação que dedicaram a mim,

muitas vezes sem nem saberem ao certo o que seria este trabalho.

A tia Aninha (sempre presente) , ao Juninho, ao Wagner, ao Reis e ao

Vinícius...vocês me possibilitaram o início e eu nunca esquecerei por

acreditarem, ampararem e investirem em mim.

Ao meu amorzinho Diego, que mesmo sem entender o meu trabalho e sem

saber rezar, me ajudou com seus pensamentos positivos, seu companheirismo,

suas horas de sono, com suas palavras de amor, conforto e incentivo. Você me

faz querer ser melhor a cada dia, como profissional e principalmente como

pessoa.

Ao Netinho, por todos estes anos de convivência, pelo apoio, amor e carinho.

Eu não poderia deixar de agradecê-lo, por tudo que vivemos. Você faz parte de

tudo isso e uma parte importante. Crescemos juntos e esta vitória também é

sua.

A minha querida orientadora, a Wi, que mais que orientar, foi como uma mãe com seus valiosos conselhos que me fizeram crescer pessoal e profissionalmente. Agradeço por todo carinho e amizade incondicionais, pois sei que muitas vezes não os mereci. Pela alegria de trabalharmos juntas e pela compreensão silenciosa dos momentos difíceis pelos quais passei, permitindo que meu tempo interno fluísse, respeitosamente. A disponibilidade que sempre manifestou e a empatia com que recebeu as minhas ideias foram o estímulo que me permitiu vencer as inseguranças deste processo. Ao professor Jürij Sobestiansky, por tentar corrigir minhas falhas e por me

apresentar ao Bordin, com certeza a melhor herança profissional que eu

poderia receber. Sei que o senhor só fez tudo isso porque, mesmo no seu jeito

alemão de ser, deseja-me o melhor.

Agradeço também à Anna Sobestiansky, pelas vezes que lhe roubei a

companhia do professor, por toda ajuda e pelos incômodos sem dia e nem

horários marcados que ela tão docemente compreendia.

Ao Professor Eugênio, por ser o ponto de equilíbrio e tranquilidade desta

equipe, sempre com saldo bancário e pensamentos positivos. Obrigada por

viii

compreender e perdoar minhas falhas, pelo auxílio, amizade e por ter me

recebido de maneira tão acolhedora na UFG.

Ao Professor André Kipnis. Faltam-me palavras para agradecer todo

conhecimento transmitido, a paciência e por ter aberto as portas de sua sala e

do seu laboratório. Levo comigo o seu exemplo de doação e amor a profissão

de ensinar.

As minhas amigas do laboratório, Dri, Du, Keiloca, Mari,Tatá e, em especial, a

Taty, com quem dividi todos os acontecimentos dessa dissertação. Eu poderia

dizer muitas coisas sobre vocês, mas tudo a ser dito está para sempre

guardado em nossos corações e em nossas memórias. Obrigada por todos os

momentos de alegrias e agonias. Mais que um título, a amizade de vocês foi o

maior presente que eu conquistei ao longo desta caminhada.

À Denise por plantar a sementinha da biologia molecular e da pesquisa com

meus óinc-óincs no Lab.

À Marília (Bá), Fábio (Filhote) e ao Adriano (Dri), meus queridos amigos de

todas as horas nesta jornada.

Aos colegas do Laboratório de Virologia Humana, Fabíola, Menira, Anna e

Tâmera e de Bacteriologia do IPTSP, Lorena, Aureliano, Aline e Vivi, pela

colaboração na obtenção dos resultados.

À Nutrial, em especial ao Marquinhos e à Vanessa, não só porque sem eles

este estudo seria mais difícil, mas pela amizade sincera que construímos. Muito

obrigada por tudo.

Aos produtores de suínos visitados, que gentilmente cederam sua atenção,

animais, a boia e um dedinho de prosa.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela oportunidade de

realizar este trabalho e conviver com profissionais que me mostraram o tipo de

pessoa e profissional que quero ser. Agradeço de maneira especial aos

professores Ana Paula, Cíntia, Auxiliadora, Guido e Valéria. Agradeço também

a todos os funcionários, principalmente ao Gerson e ao Tiago, e colegas que

contribuíram direta ou indiretamente para realização deste.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento e ao Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (CNPq/MAPA) pelo apoio financeiro e

bolsa concedidos.

ix

“Sede como os pássaros que, ao

pousarem um instante sobre ramos muito

leves, sentem-nos ceder, mas cantam!

Eles sabem que possuem asas...”

(Victor Hugo)

"É do buscar e não do achar que

nasce o que eu não conhecia."

(Clarice Lispector)

x

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO _______________________________________________ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ____________________________________ 5

2.1 Circovírus suíno tipo 2 ________________________________________ 5

2.1.1 O circovírus suíno e seus aspectos moleculares __________________ 5

2.1.2 Histórico _________________________________________________ 7

2.1.3 Aspectos epidemiológicos ____________________________________ 9

2.1.4 Patogenia _______________________________________________ 12

2.1.5 Sinais clínicos e aspectos patológicos _________________________ 17

2.1.6 Diagnóstico ______________________________________________ 20

2.1.7 Controle e prevenção ______________________________________ 22

3. OBJETIVO _________________________________________________ 31

3.1 Objetivo Geral _____________________________________________ 31

3.2 Objetivos específicos ________________________________________ 31

4. MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________ 32

4.1 Local e período de realização do experimento _____________________ 32

4.2 Material e população de estudo ________________________________ 32

4.3 Extração do DNA ___________________________________________ 35

4.4 Aplicação da técnica de PCR __________________________________ 37

4.4.1 Identificação do PCV2 ______________________________________ 37

4.4.2 Identificação do TTV1 e TTV2 ________________________________ 38

4.5 Análise dos resultados _______________________________________ 41

5. RESULTADOS ______________________________________________ 43

5.1 Material e população de estudo ________________________________ 43

5.2 Circovírus suíno tipo 2 _______________________________________ 46

5.2.1 Aspectos clínicos e das lesões macroscópicas ___________________ 46

5.2.2 Identificação do DNA do PCV2 _______________________________ 49

5.2.2.1 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de soro ____________ 52

5.2.2.2 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de suabes __________ 54

5.2.2.3 Identificação do DNA do PCV2 em amostras fecais _____________ 56

xi

5.2.2.4 Identificação do DNA do PCV2 em fragmentos de tecidos ________ 57

5.3 Validade dos testes diagnósticos _______________________________ 59

5.3.1 Soros __________________________________________________ 59

5.3.2 Suabes orais ____________________________________________ 59

5.3.3 Suabes nasais ___________________________________________ 60

5.3.4 Fezes __________________________________________________ 61

5.4 Identificação do TTV ________________________________________ 62

5.4.1 Coinfecção PCV2 e TTV ____________________________________ 62

6. DISCUSSÃO _______________________________________________ 65

7. CONCLUSÕES _____________________________________________ 72

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ____________________________________ 73

REFERÊNCIAS _______________________________________________ 75

xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Representação esquemática do genoma circular do circovírus

suíno Tipo 1 (PCV1) (a) e Tipo 2 PCV2 (b) ___________________________ 6

FIGURA 2- Representação (vermelho) dos países em que a circovirose suína

foi relatada ____________________________________________________ 9

FIGURA 3 – Representação esquemática da estrutura genômica do TTV suíno

____________________________________________________________ 28

Figura 4- Identificação das microrregiões de Goiás segundo a produção de

suínos _______________________________________________________ 33

Figura 5 - Procedimento para coleta de amostras _____________________ 35

Figura 6- Diagrama dos métodos de extração de DNA utilizados _________ 36

FIGURA 7- Condições utilizadas para amplificar os fragmentos de TTV`s __ 40

FIGURA 8- Localização das granjas de criação intensiva de suínos do Estado

de Goiás selecionadas para coleta de amostras ______________________ 43

Figura 9 – Sistemas clássicos de produção de suínos __________________ 44

Figura 10- Sinais clínicos identificados na seleção de animais para coleta

de amostras __________________________________________________ 47

Figura 11: Achados macroscópicos ________________________________ 49

FIGURA 12- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir de espécimes clínicos de suínos de sistemas intensivos de

criação ______________________________________________________ 50

FIGURA 13- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir dos soros de suínos de sistemas intensivos de criação ___ 52

FIGURA 14- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir de suabes orais dos suínos de sistemas intensivos de criação

____________________________________________________________ 54

FIGURA 15- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir de suabes nasais dos suínos de sistemas intensivos de

criação ______________________________________________________ 55

xiii

FIGURA 16- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir de amostras fecais dos suínos de sistemas intensivos de

criação ______________________________________________________ 56

FIGURA 17- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA

de PCV2 a partir de fragmentos de tecidos dos suínos de sistemas intensivos

de criação ____________________________________________________ 57

FIGURA 18- Frequência de positivos em relação ao tecido avaliado ______ 58

FIGURA 19- Reação de PCR para TTV1 a partir de soros de suínos de sistema

intensivo de criação ____________________________________________ 62

FIGURA 20- Reação de PCR para TTV2 a partir de soros de suínos de sistema

intensivo de criação ____________________________________________ 62

Figura 21- Resultados referentes a identificação de coinfecção entre o

circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e o torque teno vírus (TTV1, TTV2, TTV1/TTV2).

____________________________________________________________ 63

xiv

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1- Lesões macroscópicas mais frequentes associadas à circovirose

suína _______________________________________________________ 19

QUADRO 2- Sequência e posições de nucleotídeos dos iniciadores utilizados

nas reações de PCR para identificação do PCV2 _____________________ 37

QUADRO 3- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura

de reação ____________________________________________________ 38

QUADRO 4- Sequência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR para

identificação dos TTV's _________________________________________ 39

QUADRO 5- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura

de reação para identificação do TTV1 ______________________________ 39

QUADRO 6- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura

de reação para identificação do TTV2 ______________________________ 40

QUADRO 7- Matriz de cálculos das principais medidas de risco __________ 41

QUADRO 8- Matriz de cálculos de correção da prevalência obtida com a

aplicação de um teste diagnóstico imperfeito _________________________ 42

QUADRO 9– Fatores de risco avaliados nas granjas de suinocultura intensiva e

associados à ocorrência de PCVAD _______________________________ 45

QUADRO 10 - Número de animais selecionados por exploração, faixa etária,

fases de criação, sexo e sinais clínicos _____________________________ 46

QUADRO 11- Positividade para PCV2 nos fragmentos de tecidos coletados dos

suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás, no período de

março de 2009 à janeiro de 2010 __________________________________ 58

xv

LISTA DE TABELAS

TABELA 1– Prevalência de agentes bacterianos isolados em animais

infectados com PCV2 ___________________________________________ 14

TABELA 2- Frequência dos sinais clínicos observados nos suínos selecionados

em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março de 2009 à

janeiro de 2010 ________________________________________________ 48

TABELA 3- Frequência dos sinais macroscópicos observados nos suínos

selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março

de 2009 à janeiro de 2010 _______________________________________ 48

TABELA 4 - Distribuição dos resultados para PCV2 nos espécimes clínicos

coletados dos suínos de granjas de criação intensiva do Estado de Goiás,

segundo a fase de criação, manifestação clínica e sexo, no período de março

de 2009 à janeiro de 2010. _______________________________________ 51

TABELA 5- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos

para PCV2 nos soros dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de

Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010 _________________ 53

TABELA 6- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos

para PCV2 nos suabes orais e nasais dos suínos de granjas de criação

intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

____________________________________________________________ 55

TABELA 7- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos

para PCV2 nas fezes dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de

Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010 _________________ 57

TABELA 8- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

soros de suínos _______________________________________________ 59

TABELA 9- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

suabes orais de suínos _________________________________________ 60

Tabela 10- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

suabes nasais de suínos ________________________________________ 60

TABELA 11- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

fezes de suínos _______________________________________________ 61

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

AGS Associação goiana de suinocultores

BFDV Vírus da doença dos bicos e penas de galinhas e psitacídeos

BVDV Vírus da diarreia viral bovina

CAV Circovírus do canários

CE Comunidade Europeia

CS Circovirose suína

CsCl Cloreto de Césio

CoCV/PiCV Circovírus dos columbídeos ou pombos

CoGV Circovírus dos gansos

HEV Vírus da Hepatite E

ICTV Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus

MEM Meio mínimo essencial

ORF Quadros de leitura aberta

PCR Reação em cadeia pela polimerase

PCVAD Circovirose suína e doenças associadas

PCV Circovírus suíno

PCV1 Circovírus suíno tipo 1

PCV2 Circovírus suíno tipo 2

PERV Retrovírus Respiratório Endógeno Suíno

PEV Enterovírus suíno

PLHV-1 Herpesvírus linfotrópico suíno Tipo 1

PMWS Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PNP Pneumonia necrosante proliferativa

PPV Parvovírus suíno

PRCV Coronavírus respiratório suíno

PRRSV Vírus Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína

SDNS Síndrome da Dermatite e Nefropatia Suína

SIV Vírus da Influenza suína

SMDS Síndrome Multissistêmica do Definhamento do Leitão

xvii

TBE Solução tampão Tris- Borato- EDTA

TE Solução tampão Tris- EDTA

TEN Solução tampão Tris- EDTA- NaCl

TES Solução tampão Tris- EDTA-SDS

TGEV Vírus da Gastroenterite transmissível

TTV Torque teno vírus

TTV1 Torque teno vírus Tipo 1

TTV2 Torque teno vírus Tipo 2

VDA Vírus da doença de Aujeszky

xviii

RESUMO

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) ocorre em todas as áreas produtoras de suínos do mundo e suas manifestações clínicas são cada vez mais reconhecidas como uma séria ameaça à suinocultura mundial. Vários estudos tem indicado que a coinfecção de PCV2 com outros agentes, pode exacerbar as doenças associadas ao vírus. Nos últimos anos, o torque teno vírus (TTV) foi identificado em soros de suínos nas diferentes partes do mundo. Este parece não ser patogênico para suínos. No entanto, pode potencializar as manifestações clínicas causadas por PCV2. Assim, com o objetivo de verificar a ocorrência de PCV2 e TTV (tipos 1 e 2) ou a coinfecção, em animais hígidos e com manifestação clínica relacionada à PCVAD, em sistemas intensivos de criação de suínos, diferentes espécimes clínicos foram analisados por meio da técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR) com oligonucleotídeos específicos para região da ORF2 do PCV2 e para os dois genótipos de TTV. De um total de 368 espécimes clínicos que incluem soro, suabes nasais e orais, fezes e tecidos, obtidas de suínos em fases de creche e recria, o DNA do PCV2 foi identificado em 71% delas, com maior ocorrência (85%) nos animais com alguma evidência clínica. Foi observada um maior índice de positividade pontual nos animais de recria (74%) quando comparada aos índices referentes à creche (67%). Também houve maior detecção nas fêmeas (71%) quando comparado ao percentual de identificação viral nos machos (69%). Alguns animais apresentaram positividade para o DNA viral em todos os espécimes avaliados. Para o TTV, 47 amostras de soros foram analisadas por PCR e 47% delas amplificaram fragmentos específicos para o TTV suíno, sendo 19% corresponde ao TTV1, 32% positivas para o TTV2 e 13% para ambos os vírus. A associação entre PCV2 e TTV foi verificada em 45% das amostras. O índice de coinfecção nos suínos com PCVAD (76%) foi significativamente maior que o observado nos animais sem evidência clínica (24%), com um destaque para a coinfecção pelo TTV2 (38%) em relação àquela pelo TTV1 (33%) ou ambos (29%). Este foi o primeiro estudo com amostras de suínos de sistema intensivo de criação, em Goiás, a comprovar a presença dos dois vírus nos plantéis. Além disso, os resultados apontaram que manifestações clínicas respiratórias são os sinais mais comuns em infecções pelo PCV2. Palavras-chave: coinfecção, doenças multifatoriais, PCV2, PCVAD, TTV

xix

ABSTRACT

The porcine circovirus type 2 (PCV2) occurs in all pig producing areas of the world and its clinical manifestations are increasingly recognized as a serious threat to the swine industry worldwide. Several studies have shown that co-infection of PCV2 with other agents may exacerbate the disease associated with the virus. In recent years, the torque teno virus (TTV), was identified in sera from pigs in different parts of the world. This appears not to be pathogenic for pigs. However, you can enhance the clinical manifestations caused by PCV2. Thus, in order to verify the occurrence of TTV and PCV2 (types 1 and 2) or coinfection in healthy animals and clinical manifestation related to PCVAD in intensive systems of rearing pigs, different clinical specimens were analyzed by technique of polymerase chain reaction (PCR) with primers specific for the region of ORF2 of PCV2 and the two genotypes of TTV. From a total of 368 clinical specimens including serum, nasal swabs and oral, feces and tissues obtained from pigs in the nursery and recreates the PCV2 DNA was identified in 71% of them, with higher prevalence (85%) in animals with some clinical evidence. We observed a higher rate of positivity in occasional rearing animals (74%) compared to the indices relating to daycare (67%). There was also greater detection in females (71%) compared to the percentage of viral identification in males (69%). Some animals were positive for viral DNA in all specimens evaluated. For the TTV, 47 serum samples were analyzed by PCR and 47% of amplified fragments specific for porcine TTV, which corresponds to TTV1 19%, 32% positive for TTV2 and 13% for both viruses. The association between TTV and PCV2 was detected in 45% of samples. The rate of coinfection with PCVAD in pigs (76%) was significantly higher than that observed in animals with no clinical evidence (24%), with a highlight for the coinfection TTV2 (38%) compared to that at TTV1 (33%) or both (29%). This was the first study with samples of pigs from intensive system of creation, in Goiás, to prove the presence of both viruses in herds. Furthermore, the results showed that respiratory clinical manifestations are the most common signs in PCV2 infections. Keywords: coinfection, multifactorial diseases, PCV2, PCVAD, TTV

1

1. INTRODUÇÃO

Os resultados zootécnicos e os baixos custos de produção conferem

à suinocultura brasileira uma posição de destaque no cenário mundial.

Mudanças na estrutura produtiva do setor tais como a utilização de técnicas de

manejo intensivas, alterações no ambiente, aprimoramento da nutrição, uso de

animais geneticamente melhorados, aumento na densidade dos rebanhos e a

concentração da produção em algumas áreas geográficas, conduziram ao

crescimento da suinocultura como atividade econômica.

A pecuária goiana possui forte participação na economia nacional e

faz com que o Estado de Goiás figure entre os maiores produtores brasileiros,

sendo o quinto na produção em 2009 (IBGE, 2010) e o quarto maior exportador

brasileiro de suínos no ano de 2010 (ABIPECS, 2011).

O plantel suíno do Estado de Goiás é de 1.929.062 animais,

distribuídos de forma heterogênea entre 18 microrregiões. A região Sudoeste é

a maior produtora, com uma participação de 45,62% do efetivo total do Estado,

e a região da Chapada dos Veadeiros com cerca de 1% deste total, a que

representa a menor participação (GOIÁS, 2010).

O Centro-Oeste brasileiro, especialmente os Estados de Mato

Grosso e Goiás, tem recebido de empresas nacionais e multinacionais, novos

investimentos no setor. Tais aplicações na atividade suinícola elevaram o

rebanho da região, estimado em torno de dois milhões e meio de cabeças em

1998, para cerca de cinco milhões em 2009 (GIROTTO, 2006; IBGE, 2010).

Por outro lado, os desafios sanitários presentes na suinocultura

intensiva acompanham esta expansão. Num cenário mundial, no qual o

desenvolvimento da pecuária aponta para o aumento no trânsito de animais e

produtos entre países há uma maior facilidade para a emergência e

disseminação de doenças. Isso demanda maior atenção quanto à questão

sanitária dos rebanhos, uma vez que, algumas destas enfermidades, elevam os

custos de produção, podendo inclusive comprometer os lucros da atividade ou

até mesmo serem responsáveis pelo fechamento de mercados.

Entre estes desafios, a síndrome circovirose suína e doenças

associadas ou “porcine circovirus associated diseases” (PCVAD) tem sido

2

descrita em vários países e ocasionando um grande impacto econômico na

produção de suínos (SEGALÉS et al., 2005).

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é reconhecido como o agente

essencial da PCVAD e é constantemente encontrado em rebanhos comerciais.

Sua detecção foi realizada em suídeos com e sem sintomatologia (MORÉS et

al., 2007).

O PCV2 foi descrito pela primeira vez no Canadá, em 1991 sendo,

mais tarde, identificado em países da Europa, Ásia, nas Américas, Oceania e

África, confirmando a sua ubiquidade (GRAU-ROMA et al., 2011).

No Brasil, o vírus foi descrito pela primeira vez no ano de 2000, no

Estado de Santa Catarina (CIACCI-ZANELLA et al., 2001) e, posteriormente,

nos Estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, Minas Gerais, Bahia, Espírito

Santo e Paraná (PESCADOR et al., 2003; CASTRO et al., 2003; FRANÇA et

al., 2005; CHIARELLI-NETO et al., 2005; PINTO et al, 2003; BARBOSA et al.,

2005; CHIARELLI-NETO et al., 2007; CIACCI-ZANELLA et al., 2009a; DEZEN

et al., 2010).

Poucos são os dados existentes no Estado de Goiás. ARAÚJO et al.

(2002) relataram evidências clínicas de infecção, reforçadas pela identificação

de lesões compatíveis com PCV2, à necropsia e análise histopatológica dos

tecidos de suínos de um caso suspeito de circovirose. Em adição, fetos

mumificados e natimortos provenientes de granjas do Estado, com e sem

evidências de circovirose, também apontaram para a circulação do vírus na

região (ROCHA, 2007). E ainda, dados do Laboratório de Virologia Animal do

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de

Goiás (LVA/IPTSP/UFG) indicaram a presença do DNA de PCV2 em soros e

amostras de tecidos animais de criações extensivas (BARTHASSON, 2009).

O vírus pode determinar um complexo de manifestações clínicas que

envolvem a circovirose suína (CS) (HARDING et al., 1998), a síndrome da

dermatite e nefropatia suína (SDNS) (ROSSEL et al., 2000), doenças do

complexo respiratório suíno (KIM et al., 2003), a pneumonia necrosante

proliferativa (PNP), enteropatias, encefalopatias, distúrbios reprodutivos e

tremor congênito (ALLAN et al., 1998; LUKERT & ALLAN, 1999; HARDING et

3

al., 1998; HARDING, 2004; SEGALÉS et al., 2004; SEELIGER et al., 2007;

MATEUSEN et al., 2007; LEFEBVRE et al., 2008; BATISTA, 2009).

A síndrome da circovirose suína, a mais importante das

manifestações clínicas, é uma enfermidade multifatorial que leva à queda da

imunidade nos animais afetados. Além das perdas diretas provocadas pela

morte dos animais, a doença gera elevados prejuízos econômicos em função,

principalmente, da redução da conversão alimentar e da maior susceptibilidade

dos animais às infecções secundárias (BATISTA, 2009).

O papel do PCV2 neste complexo é claro em termos de sua

associação com as patologias. No entanto, a patogenia e imunogenicidade não

estão bem compreendidas. Ainda há dúvidas sobre a importância dele como

agente causal e à provável existência de outro agente principal para ocorrência

da enfermidade (ALLAN, 2007). Contribui para isto, o fato do vírus ser

cosmopolita e estar presente tanto em granjas afetadas ou não pela doença,

além de, até o momento, não existir um modelo consistente que reproduza a

progressão dos sinais clínicos após a inoculação experimental ou infecção

natural a campo (DONADEU & TUCKER, 2005; ALLAN, 2007; SEGALÉS,

2007a).

Em função desta incerteza com relação à etiologia e a necessidade

de múltiplos fatores para ocorrência da CS, o estudo de outros agentes que

possam estar de alguma forma associados ao PCV2 e a manifestação dos

sinais clínicos é de suma importância. Assim, nos últimos anos, o torque teno

vírus (TTV) tem sido identificado em soros de suínos em diferentes partes do

mundo (LEARY et al., 1999; OKAMOTO et al., 2002; McKEOWN et al., 2004;

JELCIC et al., 2004; BIGARRÉ et al., 2005; NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et

al., 2006). Esse vírus parece ser não patogênico para suínos. No entanto,

alguns pesquisadores tem apontado o TTV como um potencializador das

manifestações clínicas causadas pelo PCV2. Estudos em suínos domésticos

mostraram que a infecção pelo TTV é mais comum em suínos afetados pela

CS que os não afetados (KEKARAINEN et al., 2006; ELLIS et al. 2008).

Dois genogrupos de TTV (TTV1 e TTV2) tem sido detectados em

suínos (NIEL et al., 2005), havendo poucas informações sobre a epidemiologia

da infecção por este vírus atualmente.

4

A identificação destes agentes poderá auxiliar no desenvolvimento

de métodos diagnósticos de rotina, bem como na compreensão da patogenia e

epidemiologia viral, possibilitando o direcionamento de estratégias para

controle e prevenção do complexo circovirose suína e doenças associadas, no

Estado e no Brasil.

Em face ao exposto, neste estudo objetivou-se identificar a presença

do PCV2 e do TTV em amostras provenientes de animais de criações

intensivas do Estado de Goiás, visando fornecer informações a respeito da

ocorrência e associação entre esses vírus.

5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Circovírus suíno tipo 2

2.1.1 O circovírus suíno e seus aspectos moleculares

O circovírus suíno pertence ao gênero Circovírus da família

Circoviridae. De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus

(ICTV), este gênero compreende os circovírus suínos tipos 1 e 2 (PCV1 e

PCV2), o vírus da doença dos bicos e penas das galinhas e dos psitacídeos

(BFDV), o circovírus dos columbídeos ou pombos (CoCV/PiCV), circovírus dos

gansos (CoGV) e o circovírus dos canários (CAV) (TOOD et al., 2001).

Os circovírus são pequenos vírus não envelopados, com cerca de

17nm de diâmetro, capsídeos icosaédricos e possuem genoma DNA circular de

fita simples. É um dos menores genomas de vírus animais, com cerca de 1760

nucleotídeos (nt) (FINTERBUSCH & MANKERTZ, 2009).

O PCV é resistente à inativação pós-exposição a pH 3,0, clorofórmio

e a temperaturas entre 56°C e 70°C por 15 minutos. Possui densidade de

flutuação em CsCl de 1,33-1,34 g/mL e um gradiente de sedimentação

correspondente a 57S (ALLAN et al., 1994).

Os genomas do PCV1 e do PCV2 possuem 1759 pares de base (pb)

e 1768pb, respectivamente, com identidade de 65% a 76% entre eles

(BATISTA, 2009). Ambos possuem dois principais quadros de leitura aberta

("open reading frames" – ORF's), denominadas ORF1 e ORF2 (Figura 1). Além

destas, já foram mapeadas outras 10 ORF's (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12),

porém, com exceção da ORF3 que parece codificar proteínas que induzem a

apoptose das células infectadas, estas regiões não foram caracterizadas

(HAMEL et al., 1998; MANKERTZ et al., 2004; LIU et al., 2006).

A ORF1, com 945nt, codifica uma proteína com 315 aminoácidos

(aa) e é essencial para a replicação do DNA viral (proteína Rep). Há uma

identidade de 85% entre os nucleotídeos e de 86% na sequência de

6

aminoácidos da ORF1 entre os vírus PCV1 e PCV2 (HAMEL et al., 1998;

MANKERTZ et al., 2004).

FIGURA 1 - Representação esquemática do genoma circular do circovírus suíno Tipo 1 (PCV1) (a) e Tipo 2 PCV2 (b)

Fonte: (a) SWISS INSTITUTE OF BIOINFORMATICS (2008); (b) DEZEN (2007)

A ORF2, com 699nt, codifica uma proteína estrutural com 30kDa,

composta por 233aa e formadora do capsídeo (proteína Cap) (MEEHAN et al,

1998; LUKERT & ALLAN, 1999; CHAE, 2004). A ORF2 é mais variável entre os

dois tipos virais, com identidade de 67% na sequência de nucleotídeos e de

65% na configuração dos aminoácidos (MOROZOV et al., 1998).

PCV1 é considerado um contaminante e é persistente em células

PK-15. A infecção experimental de neonatos não produziu sintomatologia

clínica e o vírus foi, portanto, considerado não patogênico para suínos.

Entretanto, o PCV2 tem sido frequentemente detectado em animais com

manifestações clínicas da síndrome circovirose suína e doenças associadas.

Ambos possuem um antígeno que pode ser distinguido por meio de técnicas

moleculares e sorológicas específicas tais como a PCR, hibridização in situ

e/ou imunohistoquímica (CHAE, 2004), sendo os dois vírus classificados como

duas espécies diferentes dentro do gênero Circovirus pelo ICTV (ALBINA et al.,

2001).

7

Por meio de análise filogenética, o PCV2 foi dividido em três

subgrupos, também chamados de genótipos, nos quais as principais diferenças

moleculares localizam-se na ORF2. Nesta ORF estão as mais elevadas taxas

de variação entre as amostras de PCV2 analisadas em todo mundo. A

identidade das sequências nucleotídicas é de, aproximadamente, 90% (HAMEL

et al., 2000; GRAU-ROMA et al., 2008). Nomenclatura utilizada na América do

Norte descrevia os genótipos em PCV2a, PCV2b, os quais eram classificados

pela Comunidade Europeia (CE) como PCV2 do grupo 2 e PCV2 do grupo 1,

respectivamente. Entretanto, o consórcio para estudos sobre a circovirose

suína da CE propôs que a nomenclatura norte-americana fosse admitida como

a classificação padrão (ROWLAND & HESSE, 2009). A análise de amostras

dinamarquesas de suínos infectados indica a presença de um terceiro

genótipo: o genótipo c (PCV2c) (DUPONT et al., 2008).

As últimas evidências indicam que as amostras originárias da Nova

Zelândia, da Tailândia e do Reino Unido possuam somente características do

genótipo b. Por sua vez, amostras com origem na Austrália, no Japão, no

Canadá, na Espanha, em Taiwan e na África do Sul possuam somente

características do genótipo a. Ainda, amostras da França, da Coréia, da

Hungria, da Áustria, da Alemanha, dos Estados Unidos e do Brasil

compartilham as duas sequências nucleotídicas, porém, não há evidências de

um ancestral comum (DONG-JUN et al., 2007).

2.1.2 Histórico

A circovirose suína (CS) foi descrita pela primeira vez, como

entidade clínica, em 1996, por meio do estudo de um surto ocorrido em 1991,

no Canadá. Os animais envolvidos no surto apresentavam sinais de

refugagem. O exame histopatológico de fragmentos de tecidos destes animais

revelou a presença de lesões linfoides que foram, primeiramente, associadas

ao vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS), porém todas as

análises para este vírus foram negativas (CLARK, 1997). No entanto,

similaridades foram observadas entre essas lesões com as produzidas pelo

8

circovírus aviário na Bursa de Fabricius. Nas lesões, foi também identificada

grande quantidade de antígenos de PCV (ALLAN et al., 1994; ALLAN,1996).

Em 1996, nos Estados Unidos, e no ano seguinte, no Canadá, a

doença até então desconhecida, foi denominada de “postweaning

multisystemic wasting syndrome” (PMWS) ou síndrome multissistêmica do

definhamento dos suínos (SMDS) (DAFT et al., 1996; CLARK, 1997), sendo

circovirose suína (CS), a denominação mais correta. O termo síndrome da

refugagem multissistêmica, gerou, por muito tempo, debates sobre a utilização

de um termo tão inespecífico do ponto de vista etiológico, uma vez que,

doenças como as provocadas por Lawsonia intracellularis, Mycoplasma

hyopneumoniae, Haemophilus parasuis (e até mesmo intoxicações) cursam

com a síndrome da refugagem (SEGALÉS, 2005). Assim, dado o

estabelecimento internacional de critérios diagnósticos bem definidos para a

CS, atualmente a terminologia adotada é “porcine circovirus associated

diseases” (PCVAD) ou complexo da circovirose suína e doenças associadas

(SEGALÉS, 2007a).

Diferenças genômicas importantes entre os vírus encontrados nas

lesões provenientes dos casos de CS e daqueles presentes em células PK-15,

observadas após o sequenciamento genômico em 1998, estabeleceram uma

nova classificação para os mesmos, sendo o PCV1 relacionado às células da

linhagem PK-15 e o PCV2 à PMWS (HAMEL et al., 1998; MEEHAN et al.,

1998; MOZOROV et al., 1998).

As dúvidas quanto ao papel do PCV2 na indução da CS passaram a

ser menores quando, em 2004, surgiram as primeiras vacinas para o controle

da doença (CHARREYRE et al., 2005). Os resultados da utilização destas

vacinas na Europa e, principalmente, nos Estados Unidos mostraram uma

redução significativa da mortalidade e do número de animais refugos, fazendo

que com que, na atualidade, não existam dúvidas sobre o papel fundamental e

necessário do circovírus tipo 2 para o desenvolvimento da síndrome

(LATORRE & BAUTISTA, 2009).

Apesar da primeira descrição da CS ter ocorrido somente em 1996,

relatos de estudos retrospectivos, com amostras de tecidos parafinizados,

apontam para uma circulação viral ainda mais precoce: a partir de 1962, na

9

Alemanha (JACOBSEN et al., 2009); desde 1968, no Brasil (SILVA JÚNIOR et

al., 2009); desde 1985, no Japão (SATO et al., 2000); desde 1986, na Espanha

(RODRIGUEZ-ARRIOJA et al., 2003) e na Suíça (STAEBLER et al., 2005); e,

desde 1993, na Tailândia (KIATIPATTANASAKUL-BANLUNARA et al., 2002).

2.1.3 Aspectos epidemiológicos

A infecção pelo PCV2 é cosmopolita em suínos domésticos, sendo

relatada em todos os continentes (ALLAN et al., 1998a; ALLAN et al., 1999a;

ONUKI et al., 1999; CHOI et al., 2000; CIACCI-ZANELLA et al., 2001;

TRUJANO et al., 2001; RAYE et al., 2005). Contudo, isto não se correlaciona

necessariamente com a distribuição da CS em âmbito mundial (Figura 2).

Curiosamente, na Austrália, apesar da infecção estar presente, o processo

clínico ainda não foi descrito, gerando dúvidas sobre a baixa sensibilidade de

métodos de diagnóstico ou da ausência real da enfermidade (RAYE et al.,

2005; FINLAISON et al., 2007;SEGALÉS, 2007b).

FIGURA 2- Representação (vermelho) dos países em que a circovirose suína foi relatada.

Fonte: GRAU-ROMA et al. (2011)

10

No Brasil, o vírus foi detectado pela primeira vez no ano de 2000, no

Estado de Santa Catarina (CIACCI-ZANELLA et al., 2001). Posteriormente, foi

descrito nos Estados do Rio Grande do Sul (PESCADOR et al., 2003), Paraná,

São Paulo (CASTRO et al., 2003), Rio de Janeiro (FRANÇA et al., 2005),

Espírito Santo (CHIARELLI-NETO et al., 2005), Minas Gerais (PINTO et al,

2003; BARBOSA et al., 2005) e Bahia (CHIARELLI-NETO et al., 2007).

Apesar dos estudos iniciais sugerirem que a infecção pelo PCV

possa ocorrer em humanos, bovinos e camundongos (TISCHER et al, 1995;

NAYAR et al, 1999), inquéritos sorológicos subsequentes não indicaram

evidência de infecção nessas espécies e outras (ALLAN et al, 2000b;. ELLIS et

al., 2000b, ELLIS et al., 2001). Infecção experimental de ovinos e coelhos com

PCV2 não resultou na soroconversão ou no desenvolvimento de lesões

(ALLAN et al, 2000b;. CASALMIGLIA et al, 2002). Embora o PCV2 possa

replicar e ser transmitido entre camundongos acredita-se que somente os

suídeos sejam susceptíveis à infecção pelo PCV2 e que outras espécies não

desempenhem nenhum papel na sua epidemiologia (KIUPEL et al., 2001;

OPRIESSNIG et al., 2009a). PCV2 pode causar circovirose em javalis (ELLIS

et al., 2003; SCHULZE et al., 2004; LIPEJ et al., 2007), mas a importância

epidemiológica desta infecção ainda não está clara (VICENTE et al., 2004).

Distintas vias de eliminação viral tem sido apontadas, incluindo

secreções nasais, muco traqueal, saliva, urina, fezes, leite, sêmen e secreções

oculares de animais soropositivos (SHIBATA et al., 2003; OPRIESSNIG et al.,

2007). Além disso, sabe-se que os animais que padecem de CS, além de

apresentarem uma carga viral significativamente superior no soro, também

excretam maior quantidade de vírus (OPRIESSNIG et al., 2008; PARK et al.,

2009, GRAU-ROMA et al., 2009; HA et al., 2009). Machos infectados com

PCV2 podem excretar o vírus no sêmen (KIM et al., 2003). MADSON et al

(2007) afirmam que a transmissão do vírus por esta via às porcas, pode não

ser suficiente para desencadear patologias, como uma infecção intrauterina

que provocasse a morte embrionária ou fetal, ou ainda desenvolvimento

posterior de CS nos fetos infectados.

A presença do PCV2 foi detectada por meio de reação em cadeia

pela polimerase (PCR) em colostro e leite de porcas infectadas natural e

11

experimentalmente (SHIBATA et al., 2006; HA et al., 2009). Por meio de

análises imuno-histoquímicas e de hibridização in situ, o vírus foi encontrado

também em tecido mamário e outros tecidos de porcas experimentalmente

infectadas, demonstrando ser esta uma fonte viável de transmissão (PARK et

al., 2009).

A rota de transmissão mais provável parece ser a via oronasal,

indicando que a transmissão horizontal (porca - leitão ou leitão - leitão) é muito

frequente. Leitões com duas semanas de idade, privados da ingestão de

colostro e livres de PRRS e vírus influenza, desenvolveram viremia sete dias

após a administração oral de tecidos, como o músculo esquelético, medula

óssea e linfonodos, infectados com partículas virais/antígenos de PCV2. Ao

exame histopatológico foram observadas depleções leves a moderada em

órgãos linfoides, demonstrando a efetividade da via oral na transmissão do

vírus (OPRIESSNIG et al., 2009a).

Pesquisas com porcas gestantes inoculadas com PCV2 são

escassas, mas tem mostrado que a infecção pode ser transmitida verticalmente

(PARK et al., 2005). Além disso, tem-se encontrado PCV2 em lesões

miocárdicas de leitões abortados (BRUNBORG et al., 2004; ROCHA, 2007). A

análise microscópica de fragmentos de tecidos de leitões com dois dias de

idade, provenientes do Estado do Rio Grande do Sul e com suspeita clínica de

CS apontaram para atrofia dos órgãos linfoides ou depleção de folículo linfoide

com infiltrado de macrófagos e células gigantes no baço, lesões estas

sugestivas de CS. O DNA de PCV2 foi detectado no “pool” de órgãos dos

leitões, porém na imunohistoquímica, somente um leitão foi positivo para PCV2

(CIACCI-ZANELLA et al., 2006). A ocorrência de PCV2 em leitões recém-

nascidos reforça a possibilidade da transmissão vertical do vírus.

Num período de dois a quatro meses o vírus é capaz de infectar

todos os animais de uma granja. Além disso, pode ser transmitido de um

animal enfermo para outro sadio, sugerindo ser altamente contagioso

(SEGALÉS, 2008a). Animais saudáveis infectados podem desenvolver

manifestações clínicas após quatro a cinco semanas (DUPONT et al., 2009;

KRISTENSEN et al., 2009).

12

2.1.4 Patogenia

Na tentativa de esclarecer o papel do PCV2 na patogenia do

PCVAD, modelos com infecções experimentais pelo PCV2 provocando sinais

clínicos da CS levaram à aceitação de que o vírus é o agente causal do

complexo (ALLAN et al., 2004).

O PCV2 possui a capacidade de infectar células de origem epitelial,

endotelial e mielóide, o que ajuda a explicar a vasta distribuição tecidual do

vírus e das suas manifestações clínicas O antígeno viral está presente em

órgãos de suínos como linfonodos, amígdalas, pulmões, baço, rins, pele e

fígado (STEINER et al., 2008).

O vírus infecta células de sistema imune como macrófagos, linfócitos

e células dendríticas e se replica em vários tipos celulares, preferencialmente

células em divisão celular ativa. Após a replicação e infecção de células do

sistema imune, o PCV2 causa viremia e é distribuído no organismo do suíno.

Devido à inabilidade do animal infetado em elaborar uma resposta imune

satisfatória, o PCV2 pode infectar as células permissivas nos órgãos alvo,

causar lesões e agravar o quadro clínico. Um desequilíbrio nas substâncias

mediadoras da imunidade, morte celular de linfócitos, falha na reposição de

células linfoides colaboram para esta imunodeficiência (STEINER et al., 2008).

Análises de citometria de fluxo demonstraram que suínos

acometidos pela CS apresentam alterações nas populações de células

mononucleares periféricas. Durante a infecção ocorre um aumento em

monócitos, porém uma redução em linfócitos T (CD4+) e linfócitos B, e a

presença de granulócitos imaturos de baixa densidade, sugerindo uma

inabilidade transitória dos suínos afetados em conseguir uma resposta imune

eficaz (OPRIESSNIG et al., 2007).

O mecanismo exato de ação do PCV2 e sua interação com outros

patógenos e fatores não infecciosos necessitam de maiores esclarecimentos.

Presume-se que a patogenia desta síndrome seja bastante complexa (ALLAN

et al., 2004) e que a estimulação antigênica proporcionada pelos múltiplos

fatores, infecciosos ou não, aumenta o número de células entrando na fase S

13

do ciclo celular, condição necessária para replicação do PCV2 (ELLIS et al.,

1998; KRAKOWKA et al., 2000).

O grau de suscetibilidade à PCVAD é desconhecido, sendo que a

maioria dos animais não apresenta nenhuma manifestação clínica (QUINTANA

et al., 2001). Ainda não está claro porque alguns leitões adoecem e outros,

mesmo infectados, não apresentam a doença. Sabe-se que animais com

infecção inaparente tem no organismo uma carga viral menor do que aqueles

com a CS, além de menores títulos de anticorpos neutralizantes para o PCV2

(LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2008).

Para o completo desenvolvimento da CS, alguns autores sugerem

que exista a necessidade de coinfecções (ALLAN et al., 1999b; CHOI e CHAE,

2001; HARMS et al., 2001) ou cofatores estimulatórios do sistema imune

(KRAKOWKA et al., 2001). São ainda citados fatores relacionados à

diversidade genética entre os isolados do PCV2 (OPRIESSNIG et al., 2006) e a

predisposição ou resistência de algumas raças suínas e mesmo de suídeos ao

agente (LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2009a).

Em um estudo para avaliar a coinfecção, leitões gnotobióticos foram

infectados com PCV1, PCV2 e PPV, isolados ou em combinação. Os animais

inoculados somente com o PCV2 não desenvolveram a doença clínica. Animais

coinfectados com PCV2 e PPV apresentaram doença clínica severa e lesões

macroscópicas da CS (KRAKOWKA et al., 2000).

Nas propriedades onde CS é relatada, geralmente, observa-se a

associação entre o PCV2 e outros vírus e/ou bactérias que intensificam os

sinais clínicos da doença, dificultando a sua identificação. Vários

microrganismos estão implicados nesta hipótese, tais como o parvovírus suíno

(PPV), o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), vírus da

hepatite E (HEV), vírus da doença de Aujeszky (VDA) e mais recentemente, o

torque teno vírus (TTV) (ALLAN et al., 1999a; CHOI & CHAE, 2001; HARMS et

al., 2001, ELLIS et al., 2004; FERNANDES et al., 2006; KEKARAINEN et al.,

2006).

O TTV, similarmente ao PCV2, é cosmopolita em criações de suínos

(McKEOWN et al., 2004). Pesquisas visando entender o papel deste vírus na

etiopatogenia da CS demonstram que os animais com ele infectados são mais

14

susceptíveis à doença (KEKARAINEN et al., 2006; TEIXEIRA, 2008), tendo

sido encontrado em 97% das amostras de animais com diagnóstico positivo e

em 78% das amostras de animais negativos para CS (KEKARAINEN et al.,

2006).

POGRANICHNIY et al. (2002) efetuaram um estudo em suínos

saudáveis e naqueles com histórico clínico e lesões microscópicas

características da CS. Foram testados os vírus PCV2, PRRSV, enterovírus

suíno (PEV), vírus influenza suíno (SIV), coronavírus respiratório suíno

(PRCV), vírus da gastroenterite transmissível (TGEV), retrovírus endógeno

suíno (PERV), herpesvírus linfotrópico suíno Tipo 1 (PLHV-1) e o vírus da

diarreia viral bovina (BVDV), tendo o PCV2 apresentado maior correlação com

a CS. Além disso, os animais apresentaram maior risco de desenvolver a

síndrome quando estavam coinfectados com PCV2 e PRRSV.

Um estudo feito por RISTOW et al. (2007) em 46 granjas brasileiras,

em seis Estados da federação, caracterizou as bactérias mais frequentemente

associadas ao PCV2 em animais positivos para circovirose suína (Tabela 1).

TABELA 1– Prevalência de agentes bacterianos isolados em animais infectados com PCV2

Bactéria % Bactéria %

Streptococcus suis 97,80 E. coli beta hemolytic 8,69

E. coli gamma hemolytic 52,17 Clostridium sp. 4,34

Bordetella bronchiseptica 41,30 E. coli alpha hemolytic 2,17

Haemophilus parasuis 28,30 Salmonella sp. 2,17

Pasteurella multocida 15,20

Fonte: RISTOW et al.(2007)

15

A reprodução mais consistente da CS tem sido obtida não só com a

utilização de cofatores infecciosos, mas também de não infecciosos.

Apesar de ter sido demonstrado, em modelos experimentais

inoculados com PCV2, que a aplicação de vacinas que contenham adjuvante

oleoso como imunoestimulantes, favoreça a manifestação clínica da CS

(ALLAN et al., 2000; KRAKOWKA et al., 2001; OPRIESSNIG et al., 2003),

estudos utilizando protocolos similares, em suínos convencionais, obtiveram

um resultado diferente (LADEKJAER-MIKKELSEN et al., 2002, RESENDES et

al., 2004). De acordo ALLAN et al. (2007) e evidências epidemiológicas na

Holanda (DE JONG et al., 2003), foi ainda proposto que o uso de vacinas vivas

modificadas, para controle e prevenção da PRRS, pode potencializar a

infecção por PCV2 em suínos. Estas observações indicam a necessidade de

mais pesquisas para verificar em quais circunstâncias a imunoestimulação

amplifica os efeitos da infecção por PCV2. Entretanto, até o momento, é

preconizado evitar a vacinação habitual de suínos que possam estar

convalescendo de circovirose (SEGALÉS, 2005).

A diversidade e evolução do PCV2 são também fatores que podem

estar relacionadas à emergência da CS no mundo e por este motivo a

caracterização molecular do PCV2 tem sido o objeto de investigação em vários

países (ALLAN et al., 1998; FENAUX et al., 2000; SATO et al., 2000; CIACCI-

ZANELLA et al., 2001; WANG et al., 2004; CASTRO, 2005; CHIARELLI NETO

et al., 2007; HESSE et al., 2008).

O PCV2a é considerado o mais antigo do ponto de vista evolutivo

(GRAU-ROMA et al., 2008). Alguns estudos indicam que o genótipo PCV2b

apresenta ocorrência nas infecções naturais (ALLAN et al., 2007; CHIARELLI-

NETO et al., 2009; DUPONT et al., 2008; TAKAHAGI et al., 2009; TIMMUSK et

al., 2008; CORTEY et al., 2010). Segundo SEGALÉS (2007b), este fato pode

estar relacionado a uma maior virulência do genótipo PCV2b e pode ser

creditada em função de dois indícios: 1) os casos de aparição epizoótica na

América do Norte muito marcado pela prevalência deste; 2) um estudo

realizado em 2007 (SEGALÉS, 2007b), na Europa, que associa

sistematicamente o genótipo b à existência de enfermidade, o que não ocorre

com o genótipo a.

16

Investigações epidemiológicas dos surtos ocorridos no final da

década de 90 na Europa e Sudeste Asiático e, em 2004-2005, nas Américas do

Norte e do Sul sugerem que PCV2a, potencialmente menos virulento, teria sido

o genótipo mais frequente durante muito tempo, representando os casos

esporádicos da enfermidade ocorridos entre os anos de 1993 a 1996. O

surgimento de um genótipo mais patogênico, presumidamente o PCV2b,

poderia ter sido o responsável pela emergência dos surtos ocorridos entre 1997

e 2006 (DUPONT et al., 2008).

Amostras dinamarquesas de tecidos suínos obtidas nos anos de

1980, 1987 e 1990 foram enquadradas no genótipo C. O PCV2c foi detectado

somente na Dinamarca e apresentou a menor patogenicidade dentre os três

genótipos conhecidos até o momento. Isto sugere que houve um aumento

gradativo da patogenicidade, desde os anos 80 até a atualidade, que segue a

sequência genotípica c, a e b (DUPONT et al., 2008).

Visando elucidar o papel da genética suína na

susceptibilidade/resistência à circovirose, estudos envolvendo a avaliação dos

sinais clínicos, anatomopatológicos e moleculares das diferentes linhagens de

suínos foram desenvolvidos. Os resultados foram semelhantes entre os

autores, inferindo que há diferenças entre as linhagens frente ao PCV2, sendo

que animais da linhagem Landrace foram mais susceptíveis em desenvolver os

sinais da doença que suínos das linhagens Duroc e Large White (ROSE et al.,

2003; LÓPEZ-SORIA et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2009a).

Uma hipótese que poderia justificar a maior ou menor predisposição

das linhagens suínas ao PCV2 é a existência de diferentes mecanismos de

resposta imunológica ou alterações genéticas relacionadas a essas respostas.

No entanto, pouco se sabe sobre a relação do PCV2 com seu hospedeiro

quanto à ativação do sistema imune. A habilidade do vírus de se replicar e

persistir por um longo tempo no organismo indica falha na resposta imune do

indivíduo em reconhecer ou remover as partículas virais e as células infectadas

(MEERTS et al., 2006).

17

2.1.5 Sinais clínicos e aspectos patológicos

Entre o final da década de 90 até os meados de 2003, a circovirose

suína se manifestava por um significativo incremento da mortalidade e retardo

no crescimento de suínos em um número elevado de granjas em todo mundo.

Estes percentuais, hoje, são menores e em um número limitado de granjas,

não significando, entretanto, que não haja granjas com elevados índices de

mortalidade e animais refugos (SEGALÉS, 2008a).

Segundo CIACCI-ZANELLA et al. (2006), no Brasil estas novas

manifestações incluem mudanças tanto na severidade dos sinais clínicos

quanto na fase em que são observadas, sendo atualmente percebidas não só

na fase de creche, mas no período de crescimento-terminação e, até mesmo,

na maternidade.

O vírus é detectado em praticamente todas as faixas etárias, ainda

que o pico de infecção se encontre entre a 6ª e a 14ª semana de vida, sendo

pouco frequente em idades menores (SIBILA et al., 2004).

A circovirose inclui síndromes com diferentes manifestações clínicas

e lesionais, apesar de estar geralmente associada à elevada mortalidade,

atraso no crescimento, aumento no tamanho dos linfonodos, palidez corpórea,

dispneia (na maioria das vezes associada à PRRSV, vírus influenza e ao

Mycoplasma hyopneumoniae), diarreia (semelhante à apresentada pela ileíte

subaguda ou crônica), pelo opaco e arrepiado e, ocasionalmente, icterícia.

Entretanto, estes sinais clínicos podem não ser vistos em todos os animais

afetados pela CS, que na maioria das vezes se apresenta na forma inaparente

(ALLAN, 2007; BATISTA, 2009).

Além da apresentação habitual com elevada morbidade e

mortalidade, com quadros claros de refugagem, há apresentações onde as

evidências clínicas não são tão nítidas (SAUCE et al., 2009). Assim, é possível

que na mesma granja haja animais com evidências de um processo

respiratório, outros com diarreia, outros com morte por úlcera gástrica e outros

cuja morte não apresenta explicação aparente (SEGALÉS, 2008a). Isto ocorre

porque, provavelmente, os mecanismos de interação com agentes ou outros

18

fatores não infecciosos são desconhecidos e, na sua maioria, dificultam o

diagnóstico (SAUCE et al., 2009).

Também é necessário destacar que a aparição do processo clínico

tende a ter um caráter individual e que os animais enfermos podem apresentar

sinais irregulares dentro de uma mesma criação, sendo comum encontrar

animais doentes e sadios em uma mesma baia. Portanto, é sugerido que exista

também uma susceptibilidade individual, provavelmente de origem genética

(SEGALÉS, 2008a).

Cabe lembrar que a circovirose suína é uma enfermidade

multifatorial e o fator genético deve ser encarado como um fator há mais na

dinâmica da infecção. No fim, a expressão clínica em uma granja afetada pela

doença será aquela que reúne o conjunto das distintas enfermidades

presentes, com um domínio de animais com atraso no crescimento e elevada

mortalidade (SEGALÉS, 2008a).

O PCV2 tem sido associado a um conjunto de outras enfermidades

além da circovirose, tais como: a síndrome da dermatite e nefropatia suína,

doenças do complexo respiratório suíno, a pneumonia necrosante proliferativa,

enteropatias, encefalopatias, distúrbios reprodutivos e tremor congênito

(ALLAN et al., 1998; LUKERT & ALLAN, 1999; HARDING et al., 1998; ROSSEL

et al., 2000; KIM et al., 2003; SEELIGER et al., 2007; MATEUSEN et al., 2007;

LEFEBVRE et al., 2008; BATISTA, 2009). Os sinais clínicos associados a

problemas reprodutivos devem incluir abortos e/ou natimortos e/ou

mumificados (ALLAN, 2007).

As lesões macroscópicas mais importantes encontradas em animais

com CS são: hipertrofia de linfonodos (sendo mais frequentes nos linfonodos

mesentéricos, mediastínicos, inguinais e submandibulares), atrofia de timo, e

pulmão não colapsado que pode apresentar ou não áreas disseminadas de

hepatização vermelha. Hipotrofia e áreas descoloridas ou com pontos brancos

podem aparecer em fígados ictéricos. Pontos brancos multifocais puntiformes

ou difusos podem ser observados na superfície renal. Em animais com morte

súbita é comum a ocorrência de úlcera gastroesofágica, responsável pela

hemorragia interna que produz um quadro de palidez de pele e mucosas, mas

não se sabe se estas ocorrem por ação direta do PCV2 (Quadro 1) (SEGALÉS

19

et al., 2004; ALLAN, 2007; MORÉS et al., 2007; SEGALÉS, 2008a). Outras

lesões como poliserosite, consolidação pulmonar, colite, pneumonia intersticial

e enterite, são encontradas dependendo das infecções intercorrentes

observadas (SEGALÉS et al., 2004). No Brasil, as mais comuns são as

poliserosites e colites. Lesões de pele (manchas avermelhadas) podem ser

observadas em alguns casos (MORÉS et al., 2007). SEGALÉS (2008a) cita,

ainda, a ocorrência de atrofia da serosa com edemaciação da gordura, infartos

no baço e atrofia hepática ou hepatomegalia, com icterícia ocasional.

QUADRO 1- Lesões macroscópicas mais frequentes associadas à circovirose suína

Achado macroscópico Interpretação

Espinha dorsal marcada Emagrecimento progressivo geralmente presente nas infecções por PCV2

Linfadenopatia regional ou generalizada

Achado característico da infecção pelo PCV2 em animais que desenvolvem clinicamente a circovirose suína

Pulmões não-colapsados Sugere uma pneumonia intersticial comumente associada a outros agentes concomitantes

Edemaciação Gelatinização da gordura devido à mobilização da mesma das reservas do animal com perda progressiva de peso

Rins com pontos brancos multifocais

Sugere nefrite intersticial. É uma lesão habitualmente associada ao PCV2 mas pode ser devido à outra enfermidade

Atrofia hepática/ hepatomegalia

Manifestação ocasional em animais que desenvolvem a circovirose suína e apresentam icterícia

Fonte: Adaptado de SEGALÉS (2008a)

A principal lesão histológica observada consiste em depleção de

linfócitos em um grau variável, com perda de folículos e associação à presença

de infiltrados histiocitários de células multinucleares gigantes nos órgãos

linfoides com distribuição multifocal a difusa (ALLAN, 2007).

Além disso, tem sido descrita a inflamação granulomatosa

disseminada em um ou mais tecidos, tais como baço, timo, intestino, nódulos

20

linfáticos e pulmão ocasionando pneumonia intersticial, hepatite, nefrite

intersticial/glomerulonefrite e pancreatite. Nas inflamações observadas nestes

órgãos, há um predomínio de macrófagos mononucleares, às vezes formando

células multinucleadas. Dependendo da fase evolutiva da doença podem ser

observados corpúsculos de inclusão basofílicos intracitoplasmáticos nos

macrófagos, principalmente nos órgãos linfoides (BATISTA, 2009).

Vale ressaltar que os sinais clínicos, os achados macro e

microscópicos apontam somente indícios mais ou menos consistentes, de que

a manifestação pode se tratar de CS. É certo que, quanto mais evidente o

quadro clínico e quanto maior o número de animais com lesões associadas de

forma direta à enfermidade, maior a possibilidade de ser a doença (ALLAN,

2007).

2.1.6 Diagnóstico

Os critérios para o diagnóstico individual da CS e aceitos

internacionalmente, são baseados em sinais clínicos e lesões típicas

associadas ao isolamento do PCV2 (ALLAN, 2007).

É reconhecido que um suíno, como indivíduo, padece

especificamente de CS, quando apresenta sinais clínicos caracterizados por

atraso no crescimento e/ou alterações respiratórias / digestivas, lesões macro e

microscópicas características em órgãos linfoides (linfadenopatias e marcada

depleção linfocitária com infiltração histiocitária) e presença do DNA de PCV2,

em quantidade moderada a elevada, em lesões linfoides (SEGALÉS, 2008a).

Uma questão a ser levantada é o fato de alguns animais

desenvolverem a forma crônica da doença de maneira que as lesões

microscópicas nos órgãos linfoides podem ser consideradas leves ou

inexistentes, o que não permitiria o diagnóstico. Para evitar esta situação, no

diagnóstico individual de circovirose é recomendado examinar animais na fase

mais aguda ou subaguda do processo, sendo avaliado o maior número

possível de animais (ALLAN, 2007).

21

É sabido que uma granja com bons índices produtivos podem ter

casos esporádicos da enfermidade. Assim, para se estabelecer um

“diagnóstico de granja” deve-se relacionar a análise individual dos animais com

a situação epidemiológica da exploração (SEGALÉS, 2008a).

ALLAN (2007) destaca que o aumento excessivo do índice de

mortalidade e de refugos, em comparação com o nível histórico de uma granja,

permite diagnosticar um caso de rebanho. Segundo esse mesmo autor,

existem duas condições para o reconhecimento deste aumento:

1) Quando há registros de mortes de animais na propriedade, a

elevação do coeficiente pode ser reconhecida quando o número atual desta for

superior, em 1,66 x desvio padrão, à média dos níveis históricos anteriores, ou

seja, a mortalidade é a prevalência de mortes dentro de um período de tempo

específico (geralmente de três meses);

2) Quando não há registros, um aumento de mortalidade no rebanho

superior em 50% ao nível nacional ou regional é considerado indicativo de CS.

No Brasil, o índice de mortalidade média aceitável na fase de creche é de 1%

(SOBESTIANSKY, 2007).

Além de aumento significativo na mortalidade e dos sinais clínicos

compatíveis com a CS, para que se estabeleça um diagnóstico de rebanho é

necessário que seja realizado o diagnóstico individual, em pelo menos cinco

animais por rebanho. Um rebanho é considerado positivo para circovirose

quando os achados macro e microscópicos indicativos da doença e a detecção

do genoma viral estiverem presentes ao mesmo tempo em pelo menos um dos

animais necropsiados (SEGALÉS, 2008a).

É conveniente enfatizar que, animais com retardo no crescimento

não são necessariamente animais com CS, assim como um diagnóstico

negativo não descarta a possibilidade de existência da doença em uma granja.

Isto revela a importância do estabelecimento de diagnósticos diferenciais e da

avaliação da situação epidemiológica de cada propriedade. No diagnóstico

diferencial as doenças mais comumente avaliadas são a síndrome reprodutiva

e respiratória suína (PRRS), enfermidades respiratórias inespecíficas,

colibacilose pós-desmame, ileíte proliferativa, úlcera gástrica, disenteria suína,

22

colite espiroquetal, eperitrozoonose e intoxicações por desinfetantes

(SEGALÉS, 2008b).

Devido à dificuldade de isolamento do PCV2 em cultivos celulares,

uma vez que o vírus não produz efeito citopático, um grande número de

estudos para identificação do agente tem sido conduzido com métodos que

visem à detecção do DNA ou antígenos virais (ALLAN & ELLIS, 2000). Para

análise e correlação da presença do PCV2 nos tecidos e as lesões histológicas

encontradas, técnicas como a imunohistoquímica (IHQ) e a hibridização in situ

(HIS) tem sido empregadas (CHAE, 2004). Apesar de ser uma técnica bastante

sensível, a IHQ possui limitação devido à dificuldade de produção de

anticorpos monoclonais para sua realização (MCNEILLY et al., 1999).

A reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem sido adotada para

identificar fragmentos específicos do DNA de PCV2 em amostras como

sangue, soro, secreções oronasais e oculares, fezes, urina, leite, sêmen e

tecidos fixados em formol, o que permitiu a realização de estudos

retrospectivos para PCV2 (ROSELL et al., 2000; KIM & CHAE, 2001;

FERNANDES et al., 2006). A elevada sensibilidade, a especificidade, a

facilidade de execução e a análise de grande número de amostras

simultaneamente, sendo capaz de detectar um único vírus mesmo na presença

de outros microrganismos, fazem dessa técnica uma opção atrativa para

estudos epidemiológicos e para caracterização de microrganismos causadores

de doenças. Uma das vantagens sobre outras técnicas, é que ela se constitui

como excelente ferramenta de indicação de infecção em rebanhos, o que

permite tomar as medidas necessárias para evitar a transmissão do agente e

reduzir ou eliminar a apresentação da doença (MANKERTZ et al., 2000).

2.1.7 Controle e prevenção

O comprometimento do sistema imune em animais acometidos pela

CS e a utilização de práticas inadequadas de manejo predispõem à severidade

da doença. O conhecimento destes fatos fez com que, em 2000, um programa

conhecido por “20 pontos de Madec”, ganhasse destaque. Este se refere

23

basicamente a melhorias na higiene, nas condições ambientais e para redução

de estresse aos animais. As recomendações incluem: manejo do tipo “todos

dentro, todos fora”, desinfecção, contato limitado com os animais, não misturar

lotes, isolamento ou a eutanásia de animais doentes; a manutenção da

temperatura ideal, do fluxo de ar e espaço dentro das baias e adequada

utilização de tratamentos antiparasitários e vacinação, entre outras (MADEC et

al., 2000). As medidas relatadas se mostraram efetivas à prevenção da maioria

das doenças multifatoriais e crônicas levando ao importante aprendizado de

produzir animais com boas práticas de criação, sendo esta a maior contribuição

da CS, já que as medidas passaram a ser aplicadas e consideradas após a

disseminação da doença e seus prejuízos nos plantéis em todo mundo.

No entanto, como já citado anteriormente, é sabido que a CS pode

estar presente em propriedades com bons índices zootécnicos e que possuam

boas práticas de produção devido à existência de múltiplos fatores

desencadeantes (FINTERBUSCH & MANKERTZ, 2009). Por meio de outro

estudo, Madec apontou os principais fatores de risco relacionados ao

desenvolvimento da doença. Assim, foi concluído que os leitões desmamados

com idade inferior a 21 dias, também aqueles provenientes de matrizes com

lesões decorridas de aplicação incorreta de injeções, bem naqueles em que há

presença de coinfecções são mais susceptíveis à infecção e manifestação

clínica (ROSE et al., 2007).

O controle de doenças consideradas multifatoriais, como é o caso da

CS, deve ter também um enfoque multifatorial (SEGALÉS, 2005). Além da

adoção de programas de melhoria na higiene e redução do estresse dos

animais, também são sugeridas outras estratégias que minimizem os fatores de

risco para sua ocorrência (ALLAN et al., 2007). As estratégias mais relevantes

se relacionam ao controle de enfermidades concomitantes, estimulação do

sistema imune, estado de infecção e nível de anticorpos da fêmea frente ao

PCV2 no momento do parto, nutrição, características genéticas dos animais e

vacinação (SEGALÉS, 2005; ALLAN, 2007; BATISTA, 2009).

Dentre as medidas, o controle das enfermidades concomitantes é

considerado o segundo ponto mais importante para redução do impacto da

doença. Diante da complexidade patológica existente hoje nas granjas, é

24

fundamental que ferramentas diagnósticas adequadas sejam usadas para

confirmação de qual enfermidade está ocorrendo (SEGALÉS, 2008b).

Diagnosticada a doença concomitante, o controle da mesma deve

apoiar-se em medidas efetivas, já descritas anteriormente. Nos Estados

Unidos, por exemplo, HALBUR & OPRIESSNIG (2006a; 2006b) afirmam que a

vacinação de animais em fase de terminação contra o PPV, reduziu a

severidade e a ocorrência da CS.

Como o sêmen continua a ser uma potencial fonte de transmissão

do PCV2 (MAES et al, 2008;. MADSON et al, 2007), as centrais de

inseminação artificial devem atentar para utilização de material livre desse e

outros patógenos (MAES et al., 2008).

O estado infeccioso e sorológico das fêmeas no momento do parto

são outros fatores que devem ser considerados. Acredita-se que a imunidade

materna proteja os leitões em relação ao desenvolvimento da síndrome

(RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002; LAROCHELLE et al., 2003; SIBILA et

al.,2004). Assim, é indicado que haja redução da viremia no período periparto e

que os títulos de anticorpos contra PCV sejam incrementados nas fêmeas, o

que pode ser alcançado com o uso de vacinas frente ao PCV2 nas fêmeas ou

com uma infecção controlada em áreas de adaptação de leitoas (SEGALÉS,

2005). Neste sentido, antes da disponibilidade de vacinas comerciais, a

soroterapia foi amplamente utilizada em rebanhos europeus para controle de

PCVAD (OPRIESSNIG et al., 2008). Uma vez colhido ao abate, o sangue

proveniente de matrizes descartadas ou suínos terminados acometidos ou

recuperados de infecção pelo PCV2 era processado para separação do soro e

tratamento pelo calor e injetados intraperitonealmente em leitões ao desmame,

levando a redução de 3 a 10% nos índices de mortalidade. Todavia, as

incertezas quanto as variações no título de anticorpos ou a possibilidade de

veiculação de doenças, bem como as dificuldades de obtenção, conservação e

aplicação do soro desencorajou a utilização desta medida (BARCELLOS,

2006).

Outra alternativa ao controle da CS foi a utilização de plasma suíno

ultrafiltrado pelo método "spray dry" em rações para estes animais na fase de

creche. As publicações existentes indicam que a utilização do plasma "spray-

25

dried" (SDP) melhora os parâmetros produtivos e a saúde e bem-estar de

animais afetados com algumas doenças comuns em suíno, como a CS. O

modo de ação está relacionado à presença de imunoglobulinas, peptídeos,

fatores de crescimento e outros nutrientes com atividade biológica que levam

ao melhor consumo, crescimento e produtividade dos leitões (COFFEY E

CROMWELL, 2001; VAN DIJK et al., 2001). PUJOLS et al. (2008)

demonstraram que rações contendo 6% de inclusão de plasma promoveram

uma maior imunização do rebanho que não apresentou sinal clínico de doença

em nenhum dos animais avaliados e não havia soroconversão para o PCV2.

Além disso, MORÉS et al. (2007) avaliando o efeito da administração de SDP

em uma granja que apresentava problemas de CS com mortalidade acima de

5% em leitões em crescimento e com presença PCV-2 demonstrada por

análise laboratorial, observaram aos 66 dias de idade dos suínos que, quando

SDP foi incluído nas dietas de desmame e crescimento, os leitões cresceram

mais rápido, atingindo 1,92 kg a mais que os controles que não receberam

plasma nas dietas. Também, foi observada redução significativa no número de

animais que apresentaram sinais clínicos de PCVAD aos 94 dias de idade.

Atualmente, a utilização de SDP na nutrição animal tem sido encarada como

uma alternativa ao uso de promotores de crescimento, uma vez que possuem

alto valor nutricional e potencial na prevenção de diversas enfermidades

(LALLÈS et al., 2009).

O efeito dos aditivos alimentares sobre o controle da doença

também foi investigado em alguns países. Dentro do consórcio europeu de

estudos para controle da PCVAD foram adicionados na dieta de modelos

experimentais, ácido linoleico e óleos essenciais. Quando comparados os

resultados com a dieta normal, houve uma redução na manifestação clínica da

doença e na excreção de partículas virais. Pesquisas realizadas a campo na

Irlanda e nos EUA corroboraram com estes resultados (ALLAN, 2007),

estimulando a realização de mais estudos na busca por terapias nutricionais

com potencial controle sobre a síndrome e outras doenças em que o sistema

imune se mostre mais acometido.

Entretanto, sem nenhuma dúvida, sob o aspecto de controle e

mesmo da etiologia, o sucesso com a vacinação frente ao PCV2 foi a maior

26

novidade em torno da doença (SEGALÉS, 2008b), alterando significativamente

o impacto do PCV2 na suinocultura em todo mundo. Inicialmente, uma vacina

autógena preparada com o vírus inativado com formaldeído 2%, proveniente de

tecido linfoide de animais com lesões de PCVAD, foi muito utilizada por alguns

veterinários clínicos. Esta ferramenta possibilitou a redução dos grandes

prejuízos causados pelas doenças associadas ao PCV2 quando o fornecimento

das vacinas comerciais ainda era limitado (OPRIESSNIG et al.,2008).

Atualmente, as vacinas comerciais contra PCV2 estão entre as vacinas mais

comumente utilizadas na produção de suínos, sendo que nos Estados Unidos é

estimado que aproximadamente 98% do rebanho que chega ao abate seja

vacinado contra o vírus (DÍAZ, 2009).

Quatro vacinas comerciais contra o PCV2, produzidas com o vírus

inativado, estão disponíveis no mercado. O objetivo da vacinação contra PCV2

é a proteção do rebanho contra manifestações clinicas de PCVAD e diminuição

da excreção viral no ambiente pelas vias fecais, ou de secreção nasal, oral e

sêmen e dos efeitos da infecção subclínica. As vacinas comerciais são

baseadas no genótipo PCV2a e tem se mostrado eficientes na prevenção de

lesões e doenças associadas com PCV2a ou PCV2b. Os sítios candidatos à

produção de vacina mais eficazes são aqueles que induzem resposta imune

contra a ORF2, que tem sido identificada como o principal antígeno

imunogênico de PCV2, induzindo resposta imune humoral (NAWAGITGUL et

al., 2000).

As evidências de controle da patologia com a utilização destas se

baseiam na diminuição significativa da expressão da doença clínica, além da

melhoria dos parâmetros de produtividade. Todas revelaram ser eficazes tanto

em condições experimentais como em condições de campo, reduzindo a

incidência da CS e melhorando o ganho de peso diário e os índices de

conversão alimentar (FACHINGER et al., 2008;. HORLEN et al., 2008; PEJSAK

et al., 2009; SEGALÉS et al., 2009). Além disso, a vacinação reduz o número

de coinfecções (KIXMÖLLER et al., 2008) e a severidade das lesões em

tecidos linfoides (SEGALÉS et al., 2009). Com o uso de vacina contra PCV2

em condições experimentais, tem sido relatados: diminuição da viremia no soro

após desafio com PCV2, diminuição das lesões linfoides associadas, da

27

quantidade de antígeno viral nos tecidos, da excreção nasal e fecal e da

indução de anticorpos anti PCV2. Em condições de campo, foi observada

melhora no ganho de peso diário e conversão alimentar, diminuição das taxas

de mortalidade e gastos com medicação e aumento do número de animais

terminados e de nascidos vivos (KIXMÖLLER et al., 2008).

Com relação ao protocolo de vacinação, pesquisa recente

demonstra que a vacinação da porca e do leitão tem efeitos semelhantes em

termos de redução da carga viral em suínos em crescimento (OPRIESSNIG et

al., 2009a). A vacinação de porcas e marrãs tem por finalidade a elevação dos

títulos de anticorpos anti-PCV2 no soro e no colostro para consequente

proteção dos leitões contra o desenvolvimento da CS (JOISEL et al., 2007;

OPRIESSNIG et al., 2009a). A vacinação das fêmeas também protege os

leitões contra desafios ambientais e diminuem as excreções virais via

naso/fecal, conforme demonstrado por CIACCI-ZANELLA et al. (2008). Os

leitões são vacinados após três semanas de idade, quando há redução no título

de anticorpos maternos. Isso provoca uma resposta de anticorpos

neutralizantes e reduz ou retarda a infecção pelo PCV2 durante o desmame ou

engorda (FORT et al., 2008; OPRIESSNIG et al., 2009b).

O momento de maior eficácia para administração da vacina contra

PCV2 é um período de pelo menos três a quatro semanas antes da fase de

exposição ao vírus no ambiente da granja. Anticorpos maternais são

observados em animais com uma semana de idade e apresentam queda

gradual até alcançarem níveis mínimos ao redor das seis a sete semanas

(GRAU-ROMA et al., 2008). Assim, em granjas onde PCVAD ocorra na creche,

a vacina deve ser administrada em animais com dois a três semanas de idade

(OPRIESSNIG et al., 2008).

2.2 Torque Teno Vírus

2.2.1 Torque teno vírus em suínos

28

O torque teno vírus, segundo o Comitê Internacional de Taxonomia

de Vírus (ICTV), é classificado na família Anelloviridae e gênero

Iotatorquevirus, é um vírus pequeno, não-envelopado, com DNA circular de fita

simples, diâmetro de 30-32nm, possui três ORFs (Figura 3) e é composto por

2.878 nucleotídeos (ITOH et al., 2000; KAMAHORA et al., 2000; OKAMOTO et

al., 2002; NIEL et al., 2005; KAKKOLA, 2008).

Primeiramente isolado em humanos em 1997 (NISHIZAWA et al.,

1997), o TTV tem sido identificado em animais de produção e de companhia

como os suínos, aves, bovinos, ovinos, cães e gatos (LEARY et al., 1999;

OKAMOTO et al., 2002), assim como em primatas e animais selvagens como

os javalis (INAMI et al., 2000, OKAMOTO & MAYUMI, 2001; MARTÍNEZ et al.,

2006). Os TTV's são considerados espécie-específicos e possuem baixa

homologia entre eles (44%) no que se refere à sequência nucleotídica. Em

suínos, dois genogrupos distintos, TTSuV1 e TTSuV2, foram detectados e, até

o presente, as informações indicam que eles não são patogênicos para esta

espécie (NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et al., 2007).

FIGURA 3 – Representação esquemática da estrutura genômica do TTV suíno. As setas representam as ORFs (1-3). A faixa tracejada no centro da ORF3 indica a região de um íntron no mRNA mais curto. A área sombreada representa a região rica em GC e o ponto preto indica a região TATA box.

Fonte: OKAMOTO et al. (2002)

29

Embora a infecção pelo TTV suíno ainda não tenha sido associada a

nenhuma doença clínica específica e a sua função em coinfecções com outros

patógenos permaneça desconhecida, uma maior frequência de infecção pelo

TTV2 foi relacionada a animais com manifestações (sistêmica, respiratória,

entérica) atribuídas ao PCV2. Problemas reprodutivos foram mais

frequentemente observados em porcas infectadas pelo TTV2 e coinfectadas

por ambos os TTV's (LIWÉN et al, 2002; KEKARAINEN et al. 2006;

KEKARAINEN et al. 2007; GAGNON et al., 2007; BRASSARD et al., 2008;

ELLIS et al., 2008; TEIXEIRA, 2008; RITTERBUSCH, 2009).

Alguns estudos indicaram um possível papel do TTV em exacerbar a

patogenia causada pelo PCV2 em leitões (KEKARAINEN et al., 2006), porém

não se sabe qual a sua importância em animais adultos. Também foi relatado

que leitões gnotobióticos inoculados com TTV1 em um momento anterior à

inoculação pelo PCV2 desenvolveram a circovirose suína mais facilmente

(ELLIS et al., 2008). Estudo semelhante recentemente demonstrou a

coinfecção entre TTV e PCV2 em amostras de suínos no Brasil (CIACCI-

ZANELLA et al., 2009b).

KRAKOWKA et al. (2008) relataram em modelos experimentais

infectados com PCV2 ou TTV ou ambos, que as coinfecções poderiam

modificar a manifestação clínica de CS. MARTIN-VALLS et al. (2008) chegou a

uma conclusão similar. Os autores encontraram o DNA de TTV amplamente

distribuído nos tecidos dos animais que sofriam de CS, mas não em tecidos de

animais saudáveis. Isso os levou a sugerir que uma infecção simultânea de

TTV e PCV2 pode resultar no desenvolvimento da CS. Em contradição, estudo

de detecção de TTV em suínos com presença de CS frente a animais controle,

não encontrou nenhuma diferença significativa entre os grupos (TAIRA et al.,

2009).

Um estudo retrospectivo realizado na Espanha indica que ambos

TTV's tem circulado desde 1985 em suínos (SEGALÉS et al., 2009). Até o

momento, foi detectada a presença de TTV1 em amostras de soro de suínos

no Brasil, Canadá, China, Coréia, Espanha, Itália, França, Tailândia, Estados

Unidos, Japão e Hungria, com prevalências entre 17% e 100% (McKEOWN et

al., 2004; BIGARRÉ et al. 2005; KEKARAINEN et al. 2006; MARTELLI et al.

30

2006; TEIXEIRA, 2008; TAKÁCS et al., 2008; TAIRA et al., 2009; CIACCI-

ZANELLA et al., 2009b). Para TTV2, a presença do vírus no soro foi descrita

apenas no Brasil, Espanha e Japão (NIEL et al., 2005; KEKARAINEN et al.,

2006; KEKARAINEN et al., 2007; TEIXEIRA, 2008; TAIRA et al., 2009; CIACCI-

ZANELLA et al., 2009b). No entanto, acredita-se que ambos os TTV's suínos

se encontrem distribuídos por toda população suína mundial com prevalência

variável entre 24 a 100% (MARTÍNEZ-GUINÓ et al., 2009).

Apesar de disseminado em suínos, a importância deste vírus nesta

espécie ainda não está esclarecida. Segundo SIBILA et al. (2009), a infecção

pelo TTV pode ser transmitido tanto da porca para os leitões, quanto entre

leitões e ocorre precocemente nos sistemas de produção. Ambos genogrupos

já foram detectados em frações de colostro e amostras de soro de leitões

recém nascidos, indicando a rota de transmissão vertical (MARTÍNEZ-GUINÓ

et al., 2009). Em suínos com idades variadas, a eliminação viral foi detectada

em soros, secreções nasais, fezes, sêmen e colostro.

Ainda que tenha ampla distribuição e elevada prevalência, poucos

são os conhecimentos relativos à capacidade de infecção e manifestação

clínica de enfermidades causadas direta ou indiretamente por este vírus.

Faltam técnicas laboratoriais ideais para o estudo do vírus. Semelhante ao

PCV2 e PPV, sabe-se que o TTV necessita de células em fase S para sua

replicação (ALLAN et al., 1994), mas ainda não é conhecida a população

celular na qual o TTV se replica, apesar de ser constantemente detectado em

células mononucleares do sangue periférico (OKAMURA et al., 1999;

OKAMOTO et al., 1999) e em células hematopoiéticas da medula óssea

(KANDA et al., 1999; KIKUCHI et al., 2000). Assim, seu cultivo in vitro não é

realizado, o que poderia acelerar a obtenção de informações. Torna-se

fundamental a continuidade de pesquisas que visem à compreensão da

biologia e especialmente das estratégias de disseminação deste agente em

populações humanas e animais, bem como seu papel na manifestação clínica

da circovirose suína e doenças associadas.

31

3. OBJETIVO

3.1 Objetivo Geral

Conhecer a dinâmica de infecção pelo PCV2 e TTV em suínos de

propriedades com sistemas intensivos de criação do Estado de Goiás.

3.2 Objetivos específicos

Identificar granjas de suínos de criação intensiva do Estado de

Goiás, bem como animais, com casos suspeitos de enfermidade relacionada

ao PCV2 e hígidos, do mesmo plantel, para obtenção das amostras.

Identificar a presença do circovírus suíno tipo 2 nas granjas

analisadas

Identificar as principais manifestações clínicas associadas ao

complexo circovirose suína e doenças associadas na população estudada

Detectar a presença do torque teno vírus 1 e 2 em suínos de

criação intensiva

Avaliar a existência de coinfecção entre PCV2 e TTV

Identificar entre os espécimes clínicos obtidos, aquele de eleição

para um primeiro diagnóstico de infecção pelo PCV2 num rebanho

32

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local e período de realização do experimento

A análise das amostras foi realizada no Laboratório de Virologia

Animal do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (LVA-IPTSP) da

Universidade Federal de Goiás, na cidade de Goiânia/GO, no período de março

de 2009 a dezembro de 2010.

4.2 Material e população de estudo

Para participar do estudo, foram selecionadas propriedades onde

ocorria a suspeita clínica das síndromes associadas à circovirose suína,

indicada por elevados índices de mortalidade e grande número de animais

refugos nas fases de creche e recria, indicadas por veterinários de campo e

pela Agência Goiana de Criadores de Suínos (AGS), colaboradores deste

estudo. Após a localização da granja, e autorização dos proprietários, os

materiais para análise foram coletados em seis granjas com densidade de 150

a 500 matrizes, localizadas em região com produção média de suínos no

Estado (Figura 4).

Para o cálculo do número de animais a serem eutanasiados, utilizou-

se uma estimativa de prevalência de 62,2% para animais em fase de creche e

de 66,75% para suínos em fase de recria/terminação (CIACCI-ZANELLA,

2005). Utilizando a tabela estatística de amostragem indicada por

SOBESTIANSKY et al. (2005), com o intervalo de confiança de 95%, foi

determinado o número mínimo de dois suínos por granja para coleta dos

tecidos. Os animais escolhidos foram submetidos à eutanásia utilizando-se

tiopentato de sódio (10mg/Kg) e cloreto de potássio 10%, aplicados por via

endovenosa, de acordo com a Resolução nº 714 de 20 de junho de 2002 do

Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV, 2002). As amostras foram

obtidas de suínos alojados em sistemas intensivos de criação, com água e

33

alimento à vontade, temperatura e umidade controladas. O estudo em questão

integra outro projeto institucional aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Universidade Federal de Goiás, registrado sob o número 259/10.

Figura 4- Identificação das microrregiões de Goiás segundo a produção de suínos. Os círculos identificam a localização das granjas.

Fonte: GOIÁS (2010).

Nas granjas foram selecionados animais com evidência de

circovirose em diferentes estágios clínicos da doença, coletando-se também,

de forma aleatória, amostras de animais hígidos dentro da mesma faixa etária.

Foram coletados soro, suabes nasal e oral, fezes e tecidos.

O número de indivíduos, bem como a fase de criação selecionadas

em cada granja ocorreu de acordo com a permissão obtida junto aos

proprietários. No entanto, a amostragem mínima pré-estabelecida de dois

animais a serem eutanasiados, foi mantida. Assim, foram colhidos soros,

suabes nasais, suabes orais e fezes de todos os 47 animais selecionados, nas

seis granjas. Em adição, dos 20 suínos eutanasiados foram colhidos

34

fragmentos de linfonodos inguinal, mediastínico e mesentérico, tonsila, pulmão,

fígado, baço, intestino e rim, totalizando 368 espécimes clínicos.

Para coleta dos espécimes clínicos, foi utilizada a metodologia

descrita por SOBESTIANSKY et al. (2005). Assim, foram obtidos com seringas,

5 mL de sangue por punção venosa da veia cava cranial, para posterior

obtenção dos soros. Os tubos foram identificados e deixados inclinados (45°),

em repouso, à temperatura ambiente, até a retração do coágulo. Após a

retirada do coágulo, os tubos foram colocados em caixas térmicas e mantidos

sob refrigeração para transporte até o LVA-IPSTP. Os suabes nasais foram

colhidos fazendo-se uma introdução profunda do suabe nos seios nasais, com

movimentos de rotação.

Para coleta dos suabes orais, a boca dos animais foi mantida aberta

com o auxílio de cachimbo e a saliva dos mesmos foi colhida com movimentos

de rotação próximo às tonsilas palatinas. Após a coleta, os suabes foram

inseridos em tubos contendo 2,0 mL de meio essencial mínimo (MEM) e

transportados sob refrigeração até o LVA-IPTSP.

As fezes foram colhidas diretamente da ampola retal, em volume

aproximado de 10g de material fecal acondicionados em sacos plásticos,

devidamente identificados e transportados sob refrigeração ao local

supracitado.

Durante a necropsia, inicialmente foram verificados os aspectos

macroscópicos dos diversos órgãos na busca de possíveis alterações. Em

seguida, colheram-se os fragmentos de tecidos, com aproximadamente 10 cm,

que foram acondicionados em sacos plásticos individuais e devidamente

identificados. As amostras foram encaminhadas ao laboratório sob

refrigeração. A dinâmica de coleta das amostras está representada na Figura

5. No laboratório, os soros foram estocados em freezer a -20ºC e as outras

amostras a -80ºC, até o momento da análise.

A fase de creche é representada pelos animais de três a oito

semanas, os animais de nove a 14 semanas constituem a fase de recria e

acima de 15 semanas os animais da terminação.

35

Figura 5 - Procedimento para coleta de amostras

4.3 Extração do DNA

As técnicas de extração do ácido nucléico viral (com modificações)

para os diferentes espécimes clínicos podem ser visualizadas pelos esquemas

representados na Figura 6.

Em cada procedimento de extração, 18 amostras foram

processadas. Para verificar a presença do DNA extraído, ao final de cada

processo, foi feita uma corrida de eletroforese em gel de agarose a 2%, em

tampão TBE numa cuba horizontal sob uma corrente de 100 V. O gel foi corado

em brometo de etídeo a uma concentração final de 0,5 µg/mL (SAMBROOK et

al., 1989) e o DNA foi visualizado por meio de um transluminador ultravioleta

(UV) modelo DP-CF-011-C (VILBER LOURMAT®) e fotografado para registro

dos resultados.

36

Figura 6- Diagrama dos métodos de extração de DNA utilizados. Amostras de soro (KIM et al., 2001), suabes (ABRÃO et al.,2005), fezes (YANG et al.,2003) e tecidos (DEZEN, 2007a) de suínos para amplificação de ácido nucléico de PCV2. *PBS: Tampão fosfato salino; BM: banho-maria; TE: tampão Tris-EDTA; SDS: Dodecilsulfato de sódio; TEN: Tampão Tris-EDTA-NaCl.

37

4.4 Aplicação da técnica de PCR

4.4.1 Identificação do PCV2

Os produtos de extração foram submetidos à técnica de PCR para

detecção do PCV2, por amplificação de um segmento da ORF2 do genoma

viral, foram utilizados iniciadores (Quadro 2) descritos por KIM et al. (2001),

com sequências específicas para esta região. As sequências do gene estão

disponíveis no banco de dados do “National Center for Biotechnology

Information” (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

QUADRO 2- Sequência e posições de nucleotídeos dos iniciadores utilizados nas reações de PCR para identificação do PCV2

Primers Sequências Posição forward 5'– CGG ATA TTG TAG TCC TGG TCG – 3' 1095-1115

reverse 5'– ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTC A – 3' 1570–1549

Fonte: KIM et al.(2001)

Para otimizar a reação, modificações foram realizadas no protocolo

sugerido por KIM et al (2001). Assim, um primeiro ensaio foi realizado com

diferentes quantidades de DNA extraído, a saber: 1 µL, 2 µL, 3 µL e 4 µL,

sendo a quantidade de 2 μL a que se mostrou mais adequada para reação. As

reações foram realizadas com um volume final de 25 μL, sendo 2 μL de DNA

da amostra a ser testada com concentração entre 25 e 50 ng (determinada por

meio da comparação com marcador de peso molecular LAMBDA®) e 23 μL da

mistura de reação composta por desoxirribonucleotídeos (dNTPs), tampão da

enzima, cloreto de magnésio (MgCl2), iniciadores (“Primers”) e enzima (Tac

DNA polimerase). As concentrações dos reagentes são indicadas no Quadro 3.

A reação de amplificação foi realizada em termociclador automático,

modelo MX-BCL-7 (ESCO), sob as seguintes condições: desnaturação inicial

com um ciclo a 94ºC por cinco minutos; seguida de 34 ciclos com desnaturação

da fita a 94ºC durante um minuto, anelamento a 65ºC por um minuto, extensão

38

a 72ºC por um minuto e extensão final a 72º C por 10 minutos, resultando em

um produto final amplificado de, aproximadamente, 481pb (KIM et al., 2001).

QUADRO 3- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura de reação

REAGENTES CONCENTRAÇÃO

Tampão* 1x

dNTP’s* 0,4 mM

MgCl2* 1,2 mM

Primer Forward* 10 pmoles

Primer Reverse* 10 pmoles

Enzima** 1,0 U

*Invitrogen, Brasil; **Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen, Brasil)

Fonte: KIM et al. (2001), com modificações

Os produtos amplificados foram observados por eletroforese em gel

de agarose 2%, corados em brometo de etídio 5 μg/mL e visualizados sob luz

ultravioleta. O tamanho dos fragmentos amplificados foi determinado por

comparação com um marcador de peso molecular de 100 pares de base

(LUDWIG®).

Amostra de referência e/ou representativa para PCV2 foi gentilmente

cedida pelo Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves (CNPSA) da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e incluída no

estudo como controle positivo das reações. Água ultrapura estéril foi utilizada

como controle negativo.

4.4.2 Identificação do TTV1 e TTV2

Para identificação dos TTV's, os produtos de extração, provenientes

das amostras de soro, foram submetidos à técnica de PCR utilizando

iniciadores específicos (Quadro 4) descritas por SILVA et al. (2009). Estes

amplificam uma região não-codificante dentro do genoma viral, mas que é

39

responsável pela diversidade genética entre os genogrupos resultando em

produtos de 349pb e 623pb para o TTV1 e para o TTV2, respectivamente.

QUADRO 4- Sequência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR para identificação dos TTV's

Iniciadores Sequências Posição

TTV1F 5'– GGG TTC AGG AGG CTC AAT TTG G –3' 10-31

TTV1R 5'– CCC AGT CGC TAG ACA GTT CTG T–3' 358-337

TTV2F 5'– CCA CAA AGT ATT ACA GGA AAC TGC–3' 66-89

TTV2R 5'– AAC CAT TGT ATG ACC GGA GCT TT –3' 688-666

Fonte: SILVA et al. (2009)

Diferentes quantidades de DNA extraído foram testadas visando à

otimização da PCR, a saber: 1 µL, 2 µL, 3 µL, 4 µL e 5 µL, sendo as

quantidades de 2 μL e 4 μL as que se mostraram mais adequadas para as

reações de identificação do TTV2 e TTV1, respectivamente. Modificações

foram realizadas no protocolo sugerido por SILVA et al. (2009). As reações

foram realizadas com um volume final de 25 μL, sendo utilizadas as amostras

nas quais o DNA a ser testado possuía concentração entre 10 e 50 ng. As

concentrações dos reagentes e as condições de amplificação foram

determinadas segundo Silva et al. (2009), com modificações, e são

apresentadas nos Quadros 5 e 6 e na Figura 7.

QUADRO 5- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura de reação para identificação do TTV1

REAGENTES CONCENTRAÇÃO

Tampão* 1x

dNTP’s* 0,4 mM

MgCl2* 1,2 mM

DMSO* 6%

Primer Forward* 10 pmoles

Primer Reverse* 10 pmoles

Enzima** 1,0 U

*Invitrogen, Brasil; **Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen, Brasil)

40

QUADRO 6- Concentrações dos reagentes utilizados na preparação da mistura de reação para identificação do TTV2

REAGENTES CONCENTRAÇÃO

Tampão* 1x

dNTP’s* 0,4 mM

MgCl2* 1,2 mM

DMSO** 8%

Primer Forward* 10 pmoles

Primer Reverse* 10 pmoles

Enzima*** 1,0 U

*Invitrogen, Brasil; ** DMSO- Dimetilsulfóxido (Amresco, Biosystems); ***Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen, Brasil)

FIGURA 7- Condições utilizadas para amplificar os fragmentos de TTV`s.

Os produtos de amplificação foram analisados por meio de

eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio 5 μg/mL e

posteriormente visualizados por meio de um transluminador, sob luz

ultravioleta. O tamanho dos fragmentos amplificados foi determinado pela

comparação com um marcador de peso molecular de 100pb (LUDWIG®). Água

ultrapura estéril foi utilizada como controle negativo.

41

4.5 Análise dos resultados

Os dados foram analisados por meio de estatística descritiva

conforme citado por PEREIRA (2005). Foram utilizadas para estes fins tabelas

de distribuição de frequências e cálculos de prevalência pontual para cada

categoria analisada. Assim, para o cálculo da prevalência pontual nas

categorias manifestação clínica, fase de criação e sexo, a seguinte fórmula foi

considerada:

P= f/n (prevalência pontual)

P± 2√P(1-P)/n (limites inferior e superior do intervalo de confiança)

Para verificar uma possível associação entre a positividade para

PCV2 e cada categoria analisada foram utilizadas as medidas de risco relativo

conforme modelo apresentado no Quadro 7. Para todas estas e para a

prevalência foi considerado um intervalo de confiança de 95%, calculado como

citado anteriormente.

QUADRO 7- Matriz de cálculos das principais medidas de risco

Segundo PEREIRA (2008), a odds ratio informa quantas vezes ou

qual a chance de um o risco ser maior em um grupo, quando comparado a

outro. O risco atribuível informa a parte da prevalência que é devida a uma

Exposição Positivos Negativos

Afetados a b

Hígidos c d

Total n n1

Odds ratio (OR): = ad / bc

Risco Atribuível (RAP)= P (RR -1)

a População P (RR - 1) + 1

42

exposição. Assim, para comparação entre as categorias "sexo" e "fase de

criação" foi utilizada a odds ratio. O risco atribuível populacional foi usado para

comparação entre "afetados" e "hígidos" quando na infecção pelo PCV2, assim

como para avaliar uma possível associação entre manifestação clínica e a

presença do torque teno vírus.

A análise do poder diagnóstico dos espécimes clínicos utilizados se

deu por meio da análise da sensibilidade, especificidade, valores preditivos

positivo e negativo, razão de verossimilhança positiva e negativa e acurácia

dos testes, conforme descrito no Quadro 8. Não foi realizada esta análise para

tecidos, uma vez que só foram colhidos fragmentos de animais com alguma

alteração sugestiva de PCVAD.

QUADRO 8- Matriz de cálculos de correção da prevalência obtida com a

aplicação de um teste diagnóstico imperfeito

Teste "x" Doentes Sadios `Total

Positivo

a

(verdadeiro

positivo)

b

(falso positivo) a + b

Negativo c

(falso negativo)

d

(verdadeiro

negativo)

c + d

Total a + c b + d a + b + c + d

INDICADORES

Sensibilidade= a/ (a+c)

Especificidade= d/ (b+d)

Valor Preditivo positiva (VP) = a / a + b Acurácia: a + d

Valor Preditivo negativo (VN)

Razão de Verossimilhança

positiva (RVP)

Razão de Verossimilhança

negativa (RVN)

= d /c + d a + b + c + d

= a / a + c

b/ b + d

= c/ a + c

d/ b + d

43

5. RESULTADOS

5.1 Material e população de estudo

A localização geográfica das granjas envolvidas neste estudo está

representada na Figura 8.

FIGURA 8- Localização das granjas de criação intensiva de suínos do Estado de Goiás selecionadas para coleta de amostras (marcadores azuis).

Fonte: Google Earth

44

Os animais provinham de sistemas clássicos de produção de suínos,

sítios de ciclo completo e/ou produção em dois sítios, esquematizados na

Figura 9.

As granjas D e E são explorações em que há dois sítios de criação,

sendo estes: UT (unidade de terminação e recria) e UPL (unidade produtora de

leitão), respectivamente, nas quais não há mistura de lotes nas baias, porém

há coexistência de animais das mais variadas idades no mesmo galpão, sendo

possível contato animal/animal na divisória das baias. As demais criações, A,

B, C e F, atuam com tipo de produção em ciclo completo, nas quais ocorre a

mistura de lotes em uma mesma baia. Com relação às origens, com exceção

da granja D, em que há recebimento de leitões de diferentes fontes, todas as

granjas recebem animais de uma única origem, sendo que as granjas A e B

repõem os animais, em sua maioria, a partir do próprio plantel. Apenas a granja

B utiliza vacinação contra PCV2. Esses dados constituem, entre outros, os

fatores de risco para ocorrência da PCVAD, apresentados no Quadro 9.

Figura 9 – Sistemas clássicos de produção de suínos. (Granja 1) – Produção em ciclo completo; (Granja 2) – Produção em dois sítios.

45

QUADRO 9– Fatores de risco avaliados nas granjas de suinocultura intensiva e associados à ocorrência de PCVAD

Granjas A B C D E F

Sítio Completo Completo Completo Dois Dois Completo

Mistura de lotes SIM SIM SIM NÃO NÃO SIM

Origem 1 1 1 2 ou mais 1 1

Desmame 24d 23d 21d Recebe c/60d

28d 23d

Biosseguridade Média Baixa Baixa Média Baixa Baixa

Assistência técnica

Não Não Não Não Não Não

Controle produção

Sim Sim Sim Sim Não Sim

Densidade próxima a granja

Baixa Média Baixa Alta Alta Alta

Vazio sanitário Não Não Não Não Não Não

Outras espécies Não Sim Sim Sim Sim Sim

Vacinação Tríplice Circo/tríp.

e mic. Tríp./mic. Não Tríplice

Tríp./ Mic./ Rinite/coli

Sinais entéricos Sim Sim Não Sim Não Não

Sinais nervosos Não Não Não Não Sim Sim

Sinais respiratórios

Sim Sim Não Sim Sim Sim

Desuniformidade Sim Sim Não Sim Sim Sim

Peso desmama 7 kg 7 kg 6 kg - 6 kg 6 kg

Cortinas Sim Não Sim Não Não Sim

Medicações Sim Sim Sim Sim Sim Sim

Exame sêmen Não Não Não Na Não Não

Exame água Não Não Não Não Não Não

Nascidos Bom/fraco Bom/fraco Bom - Baixo/fraco Baixo/fraco

Higienização/ limpeza

Média Boa Média Boa Ruim Ruim

Densidade populacional

Alta Alta Média Média Alta Média

Quarentena Não Não Não Não Não Não

Os dados referentes às coletas em cada granja, abordando o

número de animais com sinais clínicos e hígidos, suas respectivas idades,

fases de criação e sexo, são apresentados no Quadro 10.

46

QUADRO 10 - Número de animais selecionados por exploração, faixa etária, fases de criação, sexo e sinais clínicos

GRANJAS ANIMAIS IDADE

(semanas) FASE SEXO

PCVAD Sem sinal

A 7 2 3 a 16 6 creche

3 recria

6 machos

3 fêmeas

B 4* 4** 3 a 17 4 creche

4 recria

5 machos

3 fêmeas

C 0 6 4 a 16 4 creche

2 recria

3 machos

3 fêmeas

D 3 3 9 a 16 6 recria 3 machos

3 fêmeas

E 4 2 4 a 9 6 creche 3 machos

3 fêmeas

F 5 7 4 a 16 6 creche

6 recria

5 machos

7 fêmeas

TOTAL: 6 23 24

26 creche

21 recria

25 machos

22 fêmeas 3 a 16

(*)Animais não vacinados (**) Animais vacinados

5.2 Circovírus suíno tipo 2

5.2.1 Aspectos clínicos e das lesões macroscópicas

Os sinais clínicos observados nos animais com suspeita clínica de

CS foram: emagrecimento, dispneia, apatia, pelos arrepiados e opacos, palidez

corpórea, diarreia e sinais respiratórios e/ou entéricos. Além disso, foram

observadas manchas púrpuro-avermelhadas, em relevo, de diversos tamanhos

e formas sobre o tórax, abdômen e coxas, indicativas de SDNS (Figura 10).

47

Figura 10- Sinais clínicos identificados na seleção de animais para coleta de amostras. A, B e C- Apatia, pelos arrepiados e emagrecimento, sinais relativos à CS; D- Manchas avermelhadas de tamanho e forma variáveis sugestivos de SDNS.

A frequência dos sinais clínicos observados está indicada na Tabela

2. Apatia e sinais respiratórios foram os principais sinais clínicos.

Sintomatologia respiratória foi encontrada em todas as granjas, sendo que

tosse acompanhada de respiração abdominal e presença de secreção nasal

foram os mais característicos. Não foi encontrada icterícia. Morte súbita estava

presente em suínos da exploração A. Sinais entéricos estavam presentes em

quatro granjas, A, B, D e E. Assim, do total de animais analisados, 53% (25/47)

apresentavam alguma manifestação clínica de PCVAD.

48

TABELA 2- Frequência dos sinais clínicos observados nos suínos selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

Alterações Total Frequência (%)

Apatia 23/25 90%

Tosse 18/25 72%

Palidez e Emagrecimento 16/25 64%

Sinais entéricos 13/25 52%

Secreção nasal 10/25 40%

Alterações de pele 3/25 12%

Na Tabela 3 são demonstradas as alterações macroscópicas dos

órgãos observados durante a necropsia dos 20 animais eutanasiados e suas

respectivas frequências. A Figura 11 representa alguns dos sinais

macroscópicos evidenciados durante a necropsia.

TABELA 3- Frequência dos sinais macroscópicos observados nos suínos selecionados em criações intensivas do Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

Alterações Total Frequência (%)

Linfadenopatia 16/20 80

Pulmões não colapsados/hepatização 15/20 75

Hiperplasia de polpa branca 11/20 55

Hipotrofia do Timo 8/20 40

Palidez renal/presença de pontos brancos 8/20 40

Aumento do padrão lobular/hepatomegalia 7/20 35

Edemaciação 6/20 30

O pulmão foi o órgão no qual foram identificadas mais alterações e

estas estavam presentes em quase todos os animais. Aderências pleurais e

pleurite, muitas vezes com presença de fibrina na cavidade, foram associadas

49

Figura 11: Achados macroscópicos. A: Pneumonia intersticial; B: Linfadenopatia; C: Hepatomegalia e icterícia; D: Hiperplasia da polpa branca do baço.

à infecções bacterianas secundárias e estavam presentes em duas granjas

(A e F).

5.2.2 Identificação do DNA do PCV2

50

O DNA do PCV2 foi detectado em pelo menos uma amostra clínica

de todos os animais testados neste estudo, independente destes manifestarem

alguma manifestação de PCVAD. Em 15% (7/47) dos suínos avaliados foi

encontrado material genético do PCV2 em todas as amostras coletadas, ou

seja, nos suabes nasal e oral, fezes, soros e tecidos de um mesmo animal

(Figura 12).

FIGURA 12- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir de espécimes clínicos de suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100 pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (SR) Soro; (SR’) Soro1; (SN) Suabe nasal protocolo 12; (SN’) Suabe nasal protocolo 2; (SO) Suabe oral; (FZ) Fezes; (Li) Linfonodo inguinal; (T) Tonsila; (Ld) Linfonodo mediastínico; (Lm) Linfonodo mesentérico; (P) Pulmão; (F) Fígado; (B) Baço; (R) Rim.

Na Tabela 4 são apresentados os dados gerais acerca da

identificação do DNA de PCV2 nas amostras segundo o espécime clínico,

fases de criação, manifestação clínica e sexo dos animais testados.

NOTA:

1Soros com diferentes diluições;

2Nos testes para avaliação do melhor protocolo de

extração do DNA viral a partir de suabes foram analisados 2 protocolos, sendo adotado o primeiro protocolo segundo Abrão et al. (2005).

51

TABELA 4 - Distribuição dos resultados para PCV2 nos espécimes clínicos coletados dos suínos de granjas de criação intensiva do Estado de Goiás, segundo a fase de criação, manifestação clínica e sexo, no período de março de 2009 à janeiro de 2010.

A amplificação do DNA viral na população estudada demonstrou

uma prevalência pontual de 70,6% ± 4,6. A prevalência nos suínos que

apresentavam alguma manifestação clínica associada a PCVAD foi de 84,8% ±

4,2. Já nos hígidos, o índice foi de 46,4% ± 5,4. De acordo com o risco

aparente populacional, nos animais em que há manifestação clínica de

PCVAD, a possibilidade de identificação viral é 63% maior que nos animais

hígidos, conforme RAP= 1,63.

Nos animais de recria a prevalência foi de 74,3% ± 5,4 enquanto na

creche se observou o índice de 67% ± 5,6. A chance de animais da recria

apresentarem o DNA do PCV2 nos espécimes clínicos analisados é maior que

os animais da creche, segundo a OR=1,42% (IC=95%, [0,92 - 2,18]), com

p>0,05.

Com relação ao sexo, o índice de 71,2 ± 5,8 e de 68,7 ± 5,2 foi

observado em fêmeas e machos, respectivamente. Se comparado com os

machos, as fêmeas apresentam maiores chances de se infectar por PCV2, haja

52

vista que a OR para machos e fêmeas foi de OR=1,12% (IC=95%, [0,72- 1,71]),

não sendo um risco significativo (p>0,05).

A identificação do DNA viral em animais com idades inferiores à 20

dias somente foi possível com o suabe nasal. Nos outros espécimes a

identificação ocorreu nas amostras provenientes de animais com idades entre

20 e 125 dias.

5.2.2.1 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de soro

Considerando as amostras de soro, 62% (29/47) apresentaram

positividade para o PCV2 (Figura 13).

A presença do DNA viral foi identificada em 92% (23/25) dos animais

nos quais os sinais clínicos de PCVAD foram observados e em 27% (6/22) dos

hígidos, sendo significativa a maior chance de identificação viral nos animais

afetados, com OR=30,6 (IC=95%, [5,58 - 167,33]), p<0,05.

FIGURA 13- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir dos soros de suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1-17) Soros dos animais 1 a 17.

53

A porcentagem de positivos dentre os soros dos animais com

sintomatologia respiratória foi de 92% (23/25) e dentre aqueles com sinais

entéricos foi de 46% (6/13). A frequência de resultados por animal em cada

granja está representada na Tabela 5.

TABELA 5- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos para PCV2 nos soros dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

Exploração N° de animais Resultado

Positivo (%) Negativo (%)

A 9 9 100 0 -

B 8 8 100 0 -

C 6 3 50 3 50

D 6 3 50 3 50

E 6 3 50 3 50

F 12 3 25 9 75

TOTAL 47 29 62 18 38

Com relação à fase de criação, na creche 58% (15/26) dos soros

foram positivos e na recria 67% (14/21), havendo maiores chances de ser

identificado material genético viral no soro de animais de recria, porém sem

valor estatístico significativo de acordo com OR=0,68 (IC=95%, [0,21 - 2,22]),

p>0,05.

Quanto ao sexo, 64% (16/25) dos soros dos machos e 59% (13/22)

das fêmeas foram reagentes, revelando, assim, maior chance de detecção do

DNA viral nos soros de machos, segundo OR=1,33 (IC=95%, [0,40 - 4,30]), não

sendo este valor significativo (p>0,05).

O DNA viral foi detectado em animais com faixa etária entre 3 a 17

semanas, sendo a maior frequência de positivos na faixa entre 3-4 semanas

nas granjas em que havia manifestação clínica de PCVAD e na faixa entre 8 a

17 semanas na granja sem animais com sinais clínicos.

54

5.2.2.2 Identificação do DNA do PCV2 em amostras de suabes

A identificação do DNA viral nos suabes orais (Figura 14) ocorreu

em 51% (24/47) das amostras.

Por fase de criação revelou um maior percentual de animais

positivos na recria/terminação 57% (12/21) em comparação ao percentual de

positivos na creche 46% (12/26), não sendo um dado significativo de acordo

com a OR= 1,55 (IC=95%, [0,49 - 4,75]), p>0,05.

Os machos tiveram 48% (12/25) de positividade e as fêmeas 55%

(12/22), com OR=0,76 (IC=95%, [0,24 - 2,36]) revelando ser este um dado não

significativo (p>0,05).

O único animal hígido, que amplificou o fragmento do DNA do PCV2

no teste com suabe oral, era representante do sexo masculino e da fase de

creche. A faixa etária em que foi observada maior frequência de animais

positivos está entre 7 a 10 semanas. Em animais acima de 10 semanas de

idade, o DNA viral foi demonstrado somente naqueles que apresentavam sinais

clínicos respiratórios.

FIGURA 14- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir de suabes orais dos suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1-31) Suabes dos animais 1 ao 31.

55

Os resultados referentes às amostras de suabes que amplificaram o

DNA do PCV2 são demonstrados na Tabela 6.

TABELA 6- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos para PCV2 nos suabes orais e nasais dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

A Figura 15 revela a amplificação do material genético viral em todas

as amostras de suabes nasais coletadas.

Granja N° de animais

Resultados

Suabe oral Suabe nasal

+ (%) - (%) + (%) - (%)

A 9 7 78 2 22 9 100 0 0

B 8 1 13 7 88 8 100 0 0

C 6 2 33 4 67 6 100 0 0

D 6 3 50 3 50 6 100 0 0

E 6 4 67 2 33 6 100 0 0

F 12 7 58 5 42 12 100 0 0

TOTAL 47 24 51 23 49 47 100 0 0

FIGURA 15- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir de suabes nasais dos suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1CG1-1CG5) Suabes dos animais 1 ao 30, suas respectivas fases e origem.

56

5.2.2.3 Identificação do DNA do PCV2 em amostras fecais

Na Figura 16 podem ser vistos os resultados de amplificação a partir

das amostras fecais. O material genético viral foi detectado em 45% (21/47)

dos espécimes analisados.

O DNA viral foi identificado em 76% (19/25) dos animais nos quais

os sinais clínicos de PCVAD foram observados e em 9% (2/22) dos hígidos,

sendo significativamente maiores as chances de identificação do DNA viral nas

fezes de animais com sinais clínicos, OR=31,6 (IC=95%, [5,75 - 172,43]),

p<0,05. Dos animais que tinham sinais entéricos, 100% (13/13) foram

reagentes.

Do total de análises da creche, 38% (10/26) foram positivas. Já para

a fase de recria/terminação, a positividade foi de 52% (11/21), não sendo

significativa a maior chance de detecção em fezes de animais na fase de

recria, segundo OR=1,76 (IC=95%, [0,59 - 1,71]), p>0,05.

FIGURA 16- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir de amostras fecais dos suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1-9) Amostras dos animais 1 ao 9.

57

Em relação ao sexo, a frequência de amostras positivas nos machos

56% (14/25) foi superior a observada nas fêmeas 32% (7/22), não sendo este

um dado significativo segundo OR=2,72 (IC=95%, [0,36 - 3,74]), p>0,05.

Os resultados desta avaliação estão demonstrados na Tabela 7.

TABELA 7- Distribuição de frequência dos resultados positivos e negativos para PCV2 nas fezes dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás no período de março de 2009 à janeiro de 2010

Granja N° de

animais

Resultados

Positivo (%) Negativo (%)

A 9 9 100 0 -

B 8 3 38 5 62

C 6 0 - 6 100

D 6 4 67 2 33

E 6 4 67 2 33

F 12 1 8 11 92

TOTAL 47 21 45 26 55

5.2.2.4 Identificação do DNA do PCV2 em fragmentos de tecidos

Do total de fragmentos de tecidos amostrados, 77% (139/180)

amplificaram o DNA do PCV2 pela técnica de PCR (Figura 17).

FIGURA 17- Reação de PCR - amplificação de uma região da ORF2 do DNA de PCV2 a partir de fragmentos de tecidos dos suínos de sistemas intensivos de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (C+) Controle positivo; (1) linfonodo inguinal; (2) tonsila; (3) linfonodo mediastínico; (4) pulmão; (5) fígado; (6) baço; (7) intestino; (8) linfonodo mesentérico e (9) rim.

58

Os dados referentes a identificação do DNA do PCV2 em

fragmentos de tecidos são mostrados no Quadro 11 e na Figura 18.

QUADRO 11- Positividade para PCV2 nos fragmentos de tecidos coletados dos suínos de granjas de criação intensiva no Estado de Goiás, no período de março de 2009 à janeiro de 2010

(+)reação positiva (-)reação negativa

Todos os 47 animais amplificaram DNA viral em mais de um ou em

todos os fragmentos analisados. Entre as amostras positivas, observou-se que

o pulmão foi o órgão no qual o DNA do PCV2 foi identificado com maior

frequência (100%), como demonstrado na Figura 18.

FIGURA 18- Frequência de positivos em relação ao tecido avaliado

59

5.3 Validade dos testes diagnósticos

5.3.1 Soros

Na Tabela 8 estão demonstrados os dados para análise da validade

dos testes em que foram utilizados soros.

TABELA 8- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

soros de suínos

Soros

Positivos

PCVAD

23

Hígidos

6

TOTAL testes

29

Negativos 2 16 18

TOTAL Animais 25 22 47

Em relação aos soros, a sensibilidade dos testes foi de 92%

(IC=95%, [85,7 - 98,3]), a especificidade de 73% (IC=95%, [65 - 81]), o valor

preditivo positivo de 79% (IC=95%, [72 - 86]), o valor preditivo negativo de 89%

(IC=95%, [80 - 98]), a razão de verossimilhança positiva de 3,4, a razão de

verossimilhança negativa de 0,11 e a acurácia de 82%.

De acordo com os dados, o teste com soros tem boa precisão para

diagnosticar indivíduos positivos na presença de doença, porém sua

confiabilidade, determinada pelo valor preditivo positivo e acurácia, é apenas

satisfatória. Além disso, o baixo valor de especificidade demonstra que não

houve boa precisão na detecção de negativos na ausência de doença.

5.3.2 Suabes orais

Na Tabela 9 estão demonstrados os dados para análise da validade

dos testes em que foram utilizados suabes orais.

60

TABELA 9- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

suabes orais de suínos

Suabes orais

Positivos

PCVAD

17

Hígidos

7

TOTAL testes

24

Negativos 8 15 23

TOTAL Animais 25 22 47

Nos testes com suabes orais, a sensibilidade observada foi de 68%

(IC=95%, [54 - 82]), a especificidade de 68% (IC=95%, [54 - 82]), o valor

preditivo positivo de 71% (IC=95%, [58 - 84]), o valor preditivo negativo de 65%

(IC=95%, [51 - 79]), a razão de verossimilhança positiva de 1, a razão de

verossimilhança negativa de 0,47 e a acurácia de 68%.

De acordo com os dados, o teste com suabes orais não apresentam

boa precisão e confiabilidade em determinar verdadeiros positivos e

verdadeiros negativos.

5.3.3 Suabes nasais

Na Tabela 10 estão demonstrados os dados para análise da

validade dos testes em que foram utilizados suabes nasais.

Tabela 10- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

suabes nasais de suínos

Suabes nasais

Positivos

PCVAD

17

Hígidos

7

TOTAL testes

24

Negativos 8 15 23

TOTAL Animais 25 22 47

61

Nos testes com suabes nasais, a sensibilidade observada foi de

100%, a especificidade de 0%, o valor preditivo positivo de 53%, o valor

preditivo negativo de 1%, a razão de verossimilhança positiva de 100, a razão

de verossimilhança negativa de 1 e a acurácia de 53%.

De acordo com os dados, o teste com suabes nasais apresentam

elevada precisão em determinar verdadeiros positivos. Entretanto, devido a

baixa especificidade, pode incitar erros quanto a resultados falso positivos.

5.3.4 Fezes

Na Tabela 11 estão demonstrados os dados para análise da

validade dos testes em que foram utilizadas amostras fecais.

TABELA 11- Tabela de contingência para avaliação da validade do teste com

fezes de suínos

Fezes PCVAD Hígidos TOTAL testes

Positivos 19 2 21

Negativos 6 20 26

TOTAL Animais 25 22 47

.

Nos testes com amostras fecais, a sensibilidade observada foi de

76% (IC=95%, [64 - 88]), a especificidade de 91% (IC=95%, [83 - 99]), o valor

preditivo positivo de 90% (IC=95%, [82 - 98]), o valor preditivo negativo de 76%

(IC=95%, [64 - 88]), a razão de verossimilhança positiva de 8,4, a razão de

verossimilhança negativa de 0,26 e a acurácia de 83%.

De acordo com os dados, o teste com amostras fecais apresentam

elevada precisão em determinar verdadeiros negativos. Entretanto, devido a

baixa sensibilidade, pode incitar erros quanto a resultados falso negativos.

62

5.4 Identificação do TTV

Nas reações de PCR dos soros, 47% (22/47) das amostras

amplificaram fragmentos específicos para o TTV suíno. Destas, 19% (9/47)

amplificaram um produto de 349pb correspondente ao TTV1, enquanto que

32% (15/47) foram positivas para o TTV2, amplificando um produto de 671pb

(Figuras 19 e 20). Amplificaram os dois tipos virais, 13% (6/47) das amostras.

FIGURA 19- Reação de PCR para TTV1 a partir de soros de suínos de sistema intensivo de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (1-13) Soros dos animais 1 a 13.

FIGURA 20- Reação de PCR para TTV2 a partir de soros de suínos de sistema intensivo de criação. (PM) Peso molecular 100pb; (C-) Controle negativo; (1-13) Soros dos animais 1 a 13.

5.4.1 Coinfecção PCV2 e TTV

Os resultados relativos a identificação do DNA de PCV2 e TTV's são

evidenciados na Figura 21.

63

Figura 21 - Resultados referentes a identificação de coinfecção entre o

circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e o torque teno vírus (TTV1, TTV2, TTV1/TTV2).

Das amostras de soro analisadas para PCV2 e TTV, 17% (8/47)

amplificaram apenas o fragmento de DNA do PCV2. A identificação apenas do

fragmento de DNA do TTV2 ocorreu em 6% (3/47) das amostras. Em 30%

(14/47) das amostras nenhum dos DNA’s virais pesquisados foi identificado.

A coinfecção entre PCV2 x TTV foi identificada em 45% (21/47) das

amostras. Destas, 76% (16/21) foram provenientes de animais com PCVAD e

24% (5/21) de animais hígidos. Estes dados indicam que as chances de

identificar uma coinfecção em animais com manifestações clínicas associadas

à PCVAD é 90% maior que nos animais sem nenhuma manifestação, conforme

RAP=1,9 (p<0,05). Com relação ao sexo, de acordo com os dados OR= 0,58

(IC=95%, [0,33 - 1,01], p>0,05), as chances de amplificar fragmentos de DNA

de TTV é 1% maior em fêmeas.

64

PCV2 associado ao TTV1 foi amplificado em 33% (7/21) das

amostras, sendo que 71% (5/7) destas originaram-se de animais da creche que

apresentavam sinais clínicos respiratórios. Na recria, apenas uma amostra

(29% - 2/7) desta associação foi obtida de um macho que também apresentava

problemas respiratórios. Assim, houve maior amplificação nas amostras

procedentes de fêmeas 71% (5/7), em comparação aos machos 29% (2/7).

A coinfecção entre PCV2 e TTV2 foi obtida em 38% (8/21) das

amostras, sendo 25% (2/8) proveniente dos animais da fase de creche sem

sinais clínicos de PCVAD e 75% (6/8) da recria, na qual a identificação ocorreu

em dois machos com sinais clínicos e quatro fêmeas, duas com manifestações

clínicas.

Curiosamente, na granja E foi detectada apenas a associação entre

PCV2 e TTV1. Já nas granjas C e F, foi detectada somente a associação entre

PCV2 e TTV2.

A amplificação dos três tipos virais (PCV2/TTV1/TTV2) em uma

mesma amostra ocorreu em 29% (6/21) das análises, três em cada fase de

criação, sendo 83% (5/6) provenientes de animais com expressão clínica de

PCVAD e 67% (4/6) provenientes de fêmeas.

65

6. DISCUSSÃO

A circovirose suína é uma doença que acomete os plantéis suínos

em todo mundo e, devido ao impacto econômico gerado, tem sido considerada

uma das doenças mais importantes da atualidade. Este fato apresenta dois

lados distintos. O primeiro está relacionado à busca por um melhor

entendimento a respeito da doença e dos mecanismos de transmissão e

patogenia, visando alternativas para o controle e prevenção da infecção ou

mesmo da enfermidade. O segundo ponto refere-se ao diagnóstico equivocado

e muitas vezes precoce que enfermidades que cursam com emagrecimento

progressivo, o sinal clínico mais pronunciado da circovirose, podem gerar. Por

estar disseminada na população suína, a infecção dos suínos pelo PCV2 é

bastante frequente. No entanto, para se estabelecer o diagnóstico definitivo da

doença é necessário que os três pressupostos sejam preenchidos: sinais

clínicos, achados macro e microscópicos característicos e identificação do

agente nas lesões, conforme afirmado por SEGALÉS (2007).

No Estado de Goiás, a vacinação contra o agente é uma prática

comum. Apesar de alguns relatos que apontassem para a circulação do PCV2

na região desde 2001, o diagnóstico da CS ainda não foi estabelecido. A

realização deste estudo permitiu identificar a infecção pelo PCV2 nas seis

granjas avaliadas em duas microrregiões com volume médio de produção de

suínos, nas quais ainda não era realizada vacinação. A indicação desta

ferramenta é realizada quando os prejuízos com definhamento e/ou

mortalidade de animais em um plantel atinge índices elevados, uma vez que as

vacinas existentes atualmente no mercado não promovem cura ou prevenção,

mas são capazes de induzir uma redução nos sinais clínicos tais como

refugagem, pneumonias e diarreias, SDNS e falhas reprodutivas atribuídas ao

PCV2, assim como melhorarem o ganho de peso e a conversão alimentar e

reduzir a mortalidade de animais (ARAÚJO et al., 2002; FACHINGER et al.,

2008; THACKER et al., 2008).

Nos casos analisados neste estudo, os principais sinais clínicos dos

animais e as lesões macroscópicas observadas nos diversos órgãos são

semelhantes às citadas na literatura (SEGALÉS, 2004; CORREA et al., 2006).

66

Apesar de o emagrecimento progressivo, principal indicativo da doença, estar

presente na maioria dos animais, outros sinais clínicos compatíveis com a

PCVAD, como diarreia e tosse foram observados. A identificação destes sinais

reforça a ideia de que doenças entéricas e do complexo respiratório, das quais

o PCV2 faz parte, são frequentemente observadas nas explorações intensivas

de suínos em Goiás, semelhante ao que ocorre em outros locais

(CALSAMIGLIA et al., 2002; SEGALÉS et al., 2004; OPRIESSNIG et al., 2007;

CǍTANA et al., 2010). As observações de alterações macroscópicas que,

embora também denotem a indicação de infecção por PCV2, precisam ser

associadas a um quadro microscópico característico para diagnóstico

confirmativo de CS. Ainda que a presença dos sinais e as observações

macroscópicas sejam indicativas da doença, a maioria destes é inespecífica e

podem ser relacionados a outras enfermidades. Contudo, a observação destes

achados neste estudo contribuiu para a identificação de propriedades com

casos suspeitos de PCVAD e consequentemente, para orientação na seleção

dos animais e coleta de amostras.

Sabe-se que a severidade e o tipo de manifestação clínica podem

variar consideravelmente entre os suínos, podendo alguns animais não

apresentarem quaisquer sinais característicos da doença (MADEC et al., 2008).

Nos animais avaliados, a maior detecção do agente ocorreu naqueles que

apresentavam alguma manifestação clínica quando comparados aos hígidos,

independente do espécime clínico analisado. Este fato pode estar relacionado

a uma maior excreção viral nos indivíduos afetados pela CS (GRAU-ROMA et

al., 2011). Ainda, a detecção em animais hígidos pode sugerir uma infecção na

forma subclínica, uma vez que trata-se de uma doença multifatorial que pode

ser expressa na medida em que concorrem cofatores infecciosos e não

infecciosos, além de ser dependente da resposta imune de cada indivíduo

(MADEC et al., 2008). OPRIESSNIG (2008) também descreve a ocorrência de

infecções subclínicas em plantéis e define esta como a presença de animais

sorologicamente positivos, virêmicos, mas com ausência de sinais clínicos.

Os resultados confirmam, como já foi demonstrado por outros

(KRAKOWKA et al., 2000; BOLIN et al., 2001; SHIBATA et al., 2003; SIBILA et

al., 2004, SEGALÉS et al., 2005), que o genoma do PCV2 é potencialmente

67

detectável em diferentes espécimes clínicos. A presença do vírus nos suabes

nasais e orais e fezes nesse estudo corroboram o sugerido por GRAU-ROMA

et al. (2008) que apontaram a via oronasal como, provavelmente, a principal via

de transmissão horizontal do PCV2.

A identificação do PCV2 em 100% dos suabes nasais analisados

neste estudo, pode indicar ser este o sítio de infecção e pode estar relacionado

ao fato de ter sido observada uma maior ocorrência de sinais respiratórios

associados à manifestação clínica de PCVAD. Contudo, como a detecção viral

neste espécime ocorreu de forma semelhante em animais acometidos de

doença e naqueles com uma possível infecção inaparente, este tipo de amostra

não se mostra útil para auxiliar no estabelecimento do diagnóstico de rotina da

doença. Todavia, ele pode ser utilizado para o diagnóstico de infecção no

rebanho, ou seja, quando se deseja realizar um rastreamento da doença no

grupo populacional.

Neste mesmo sentido, as amostras de soros podem ser utilizadas

com maior segurança para esta diferenciação, na medida em que os resultados

apontaram para uma maior sensibilidade destas, ou seja, para uma maior

identificação do agente em animais acometidos por doença clínica. Além disso,

de acordo com os resultados, as fezes podem ser utilizadas para confirmação

de diagnóstico de animais verdadeiramente negativos, por serem mais

específicas. Assim, em populações com baixa prevalência, o ideal seria realizar

os testes de rastreamento com suabe nasal e confirmatórios com amostras

fecais e soros, visando reduzir o número de animais falso positivos e otimizar

estratégias de controle e prevenção.

Com base nestes dados, sugere-se que o epitélio nasal possa ser o

sítio de infecção e que a doença clínica coincida com a viremia. Estes

resultados ratificam os descritos por MADSON et al (2009) e SEGALÉS et al.

(2005). Os autores afirmam que normalmente se observa que a doença clínica

associada à PCVAD é precedida de baixa titulação de anticorpos e do aumento

de vírus circulante. Além disso, quanto ao material utilizado para análise,

parece haver maior carga viral em soros de animais afetados pela CS, seguido

de suabes orais, nasais, fecais e urinários quando comparados aos mesmos

espécimes obtidos de animais hígidos.

68

Diferente do observado nesta pesquisa, que demonstrou haver uma

maior detecção do DNA do PCV2 nas fêmeas e entre estas, naquelas que

apresentavam alguma manifestação clínica, estudos de campo indicaram que

machos castrados são mais suscetíveis que as fêmeas (CORRÉGÉ, 2001;

RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002). Os autores sugerem que ao invés de

verdadeiramente ligada ao sexo, essa diferença possa ser devido à castração.

Além disso, os mesmos autores destacam que alterações hormonais podem

influenciar numa maior predisposição dos animais à manifestação clínica da

doença. Como as alterações hormonais são mais pronunciadas no gênero

feminino, a maior ocorrência de manifestações clínicas com identificação do

agente em fêmeas neste estudo pode ser creditada a este fator. Todavia,

outras investigações se fazem necessárias para averiguar a importância

biológica destas informações.

Os coeficientes de identificação encontrados na creche e na recria

estão de acordo com os valores de obtidos por CIACCI-ZANELLA (2005) em

animais das mesmas fases em granjas da Região Sul brasileira. SEGALÉS et

al. (2005) destacam que a infecção é mais frequente em animais mais velhos

do que em suínos jovens. Este fato pode estar relacionado à dinâmica de

infecção pelo PCV2 já que quase todos os leitões apresentam elevado título de

anticorpos contra PCV2 derivados do colostro e não desenvolvem viremia até

que estes anticorpos diminuam. Aliado a diminuição dos anticorpos maternos, o

animal entra em contato com o agente presente no plantel e contrai a infecção

(LAROCHELLE et al, 2003;. GRAU-ROMA et al., 2009). Esta presença do

agente no plantel pode explicar porque alguns permanecem persistentemente

infectados e eliminando o vírus, apesar da maioria soroconverter. Aliado a isto,

está o fato de que em alguns animais há uma ineficiência da resposta imune

em limitar a replicação viral no momento anterior à soroconversão, culminando

com a presença do vírus nos órgãos linfóides e com a imunodepressão

(RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2002). Os animais persistentemente infectados,

juntamente com animais em fase de infecção aguda, podem, então, ser

responsáveis pela manutenção do agente viral no meio ambiente. Nestes

casos, a mistura de lotes no momento da desmama, fator frequentemente

identificado na suinocultura em Goiás, pode favorecer o estabelecimento da

69

infecção. Entretanto, a ocorrência ou não de manifestações clínicas associadas

ao vírus permite julgar que são necessárias causas adicionais ou

circunstâncias particulares (fatores de risco) que acionem a replicação viral ao

ponto de suplantar o sistema imunitário (MADEC et al., 2008). Assim, além do

fator mistura de lotes já citado, e da característica imunossupressora do vírus,

situações estressantes, como aumento de densidade populacional e

coinfecções, entre outros como os demonstrados no Quadro 9, comuns na

época da desmama, propiciam uma frequência mais elevada da CS em suínos

com dois a quatro meses de idade, ou seja, final da fase de creche e início da

fase de recria, como observado neste estudo.

A identificação do genoma em todos os espécimes clínicos e em

todos os tecidos analisados está de acordo com o descrito na literatura

(CALSAMIGLIA et al., 2002; SEGALÉS et al., 2005; GRAU-ROMA et al., 2011).

Neste estudo, o pulmão foi órgão onde mais se identificou o DNA do PCV2 e

também pode ser devido ao elevado índice encontrado de sinais e alterações

macroscópicas relacionadas ao sistema respiratório.

A maioria dos autores relata um percentual mais elevado de

identificação de DNA viral em órgãos linfóides. Nesses casos, é usual observar

também a detecção do vírus no soro e/ou em secreções orais (CALSAMIGLIA

et al., 2002; SEGALÉS et al., 2005; LOPES, 2009). Contudo, em nosso estudo,

a identificação em órgãos linfoides, apesar de observada, não foi maior que a

identificada nos pulmões. Além disso, nem sempre foi caracterizada uma

relação entre identificação viral em órgãos linfoides e no soro e vice-versa. Tais

observações permitem sugerir que quando os animais estão acometidos por

enfermidades do complexo respiratório, uma maior detecção do vírus pode ser

observada nas secreções nasais e no pulmão. Esta constatação está de

acordo com o destacado por KRAKOWKA et al. (2005) de que a presença de

PCV2 nos tecidos está diretamente relacionada com as manifestações clínicas

subsequentes.

Curiosamente nas amostras fecais, a maior positividade foi

encontrada em granjas nas quais o sinal clínico de diarreia foi observado. Além

disso, as amostras negativas foram provenientes de animais de creche, sem

nenhuma evidência clínica de CS. Este fato demonstra que o PCV2 pode

70

ocorrer em animais com ou sem doença entérica e que pode ser excretado

rotineiramente com as fezes de suínos doentes e saudáveis. Assim, a

propagação fecal-oral pode ser um modo prático de transmissão deste vírus,

especialmente em animais mais velhos, o que já foi confirmado por outros

estudos (YANG et al., 2003; SEGALÉS et al., 2005). Na indústria suína, o

conhecimento sobre a introdução e os modos de propagação do vírus são

fundamentais para a prevenção e erradicação de PCV2 dos rebanhos.

A pesquisa do DNA viral de TTV e PCV2 nas amostras de soro,

coinfectando os animais, indicou que o TTV também circula entre os suínos de

criações intensivas de Goiás. Ambos os genótipos, TTV1 e TTV2, foram

identificados, com maior ocorrência do genótipo 2 em relação ao genótipo 1.

Os genótipos podem ocorrer separadamente ou coinfectando um mesmo

animal (CIACCI-ZANELLA et al., 2009b; RITTERBUSCH, 2009), o que foi

observado também nesse estudo.

Com relação à ocorrência nas fases de criação, neste estudo houve

uma maior suscetibilidade de leitões à infecção pelo TTV1 do que os animais

de recria. Resultado semelhante foi observado por MARTELLI et al. (2006) que

também detectaram o DNA de TTV1 com frequência maior em animais jovens.

Já para o TTV2, uma maior ocorrência foi observada nos animais de recria,

diferentemente do relatado por MARTELLI et al. (2006), que encontrou uma

maior prevalência deste genótipo em javalis jovens.

Poucos são os relatos sobre uma possível ligação entre o sexo e a

suscetibilidade a infecção por TTV. Neste estudo, as fêmeas apresentaram um

maior índice de infecção do que os machos para os dois genótipos avaliados.

Num experimento com javalis, MARTINÉZ et al. (2006) demonstraram que as

fêmeas apresentam uma maior taxa de infecção por TTV2 que os machos.

Assim como na infecção pelo PCV2, este efeito pode estar mais relacionado a

fatores individuais que ao sexo em si, indicando a necessidade de maiores

investigações.

Coinfecções de PCV2 com outros agentes são apontados na

literatura como importantes fatores de desenvolvimento da circovirose

(KRAKOWKA et al., 2000, FERNANDES et al., 2006; LÓPEZ-SORIA et al.,

2008). Análises experimentais em suínos envolvendo PCV2 e outros agentes

71

virais demonstraram um aumento da carga viral de PCV2, das lesões

associadas ao vírus e da incidência da PCVAD (OPRIESSNIG et al., 2007).

Dentre os agentes que têm sido incluídos em investigações de coinfecção, o

TTV tem assumido papel de destaque, por ser ubíquo, assim como o PCV2,

(KEKARAINEN et al., 2006) e por apresentar coinfecção em um elevado

número de casos de CS (ELLIS et al., 2008; SIBILA et al., 2009).

KEKARAINEN et al. (2006) identificaram uma maior frequência de

TTV em animais infectados pelo PCV2 e acometidos pela CS em relação aos

não afetados (97% versus 78%) e o consideraram como um suposto

desencadeador de quadros clínicos de CS. Este fato pode ser observado

também neste estudo, uma vez que as chances de identificar uma coinfecção

em animais com manifestações clínicas associadas à PCVAD foi 90% maior

que nos animais sem nenhuma manifestação. Resultados semelhantes foram

descritos por GAGNON et al. (2007), ao investigar a ocorrência do TTV em

casos mais severos de CS em rebanhos norte-americanos.

Estes relatos levantam a possibilidade de um papel do TTV na

apresentação da CS. Embora uma ligação clara entre o TTV e PCV2 e as

PCVAD ainda não esteja definida, fica evidente a necessidade de mais

pesquisas que esclareçam o papel de ambos na epidemiologia e patogenia das

doenças suínas associadas. Apesar de bastante relatados em suínos, a

importância biológica destes achados ainda não está esclarecida.

Os dados aqui apresentados comprovam a coinfecção entre PCV2 e

TTV e o maior risco de animais com PCVAD apresentarem esta coinfecção e

podem apontar para uma possível participação do TTV no desenvolvimento

das enfermidades, o que não foi possível avaliar devido ao baixo universo

amostral.

Assim, sugere-se a realização de novas investigações para elucidar

questões referentes ao papel do TTV como agente isolado ou quando

relacionado a infecções pelo PCV2. Todavia, mais estudos sobre a

epidemiologia molecular e investigações sobre a real ocorrência das PCVAD,

com diagnóstico confirmativo das mesmas, devem ser realizados a fim de

elucidar pontos ainda obscuros sobre a patogenia da circovirose suína e sua

presença no Estado de Goiás e no Brasil.

72

7. CONCLUSÕES

O presente estudo permitiu concluir que:

O PCV2 circula nas granjas com sistema intensivo de criação de suínos do

Estado de Goiás, tanto em animais doentes como nos clinicamente saudáveis;

A elevada ocorrência das manifestações clínicas relacionadas ao sistema

respiratório indica que este possa ser um dos sinais clínicos mais

frequentemente associados à PCVAD em suínos no Estado e que o PCV2 é

um agente que participa na patogenia das denominadas doenças do complexo

respiratório suíno;

O TTV circula entre os suínos de criação intensiva em Goiás;

Coinfecções entre ambos os genótipos de TTV ocorre em suínos infectados

pelo PCV2, sugerindo a possível relação entre os agentes;

A maior sensibilidade e especificidade em soros e fezes, respectivamente,

aponta que esses espécimes devem ser combinados para realização de

diagnósticos de rotina;

Esse foi o primeiro estudo que identificou Circovírus suíno tipo 2 e Torque

teno vírus, tipos 1 e 2, em amostras de suínos de criação intensiva do Estado

de Goiás.

73

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados obtidos neste trabalho reforçam os conhecimentos

sobre epidemiologia e dinâmica de infecção por PCV2 nas explorações

intensivas de suínos no Estado de Goiás e no Brasil.

De forma a otimizar a lucratividade das explorações intensivas de

suínos, deve existir um adequado monitoramento da infecção por PCV2 por

meio de um correto diagnóstico clínico, confirmado por provas de diagnóstico

laboratorial adequadas, evitando que uma ferramenta tão importante de

controle e prevenção, como as vacinas, seja utilizada com indicações e de

maneira incorretas. O uso inadequado muitas vezes mascara o real problema

sanitário das granjas devido à presença de coinfecções recorrentes e ao

caráter imunossupressor do PCV2.

Apesar das indicações clínicas, macroscópicas e moleculares da

ocorrência de circovirose suína e doenças associadas no Estado, outras

investigações precisam ser realizadas para um diagnóstico confirmativo da

síndrome. Além disso, nenhum estudo que avaliasse a distribuição genética

das amostras, em granjas comerciais, foi conduzido em Goiás. O conhecimento

da variabilidade genotípica poderá auxiliar no desenvolvimento de métodos de

diagnósticos de rotina no Estado e na região Centro-Oeste, bem como no

direcionamento de estratégias para controle e prevenção do complexo

circovirose suína, uma vez que poderá demonstrar se há relação entre o tipo

viral circulante e a manifestação clínica observada.

Muitos autores defendem que o PCV2 isoladamente não consegue

induzir doença. Ou seja, as manifestações clínicas provocadas por este agente

necessitam de fatores desencadeantes. Esta nova realidade que representam

as doenças multifatoriais é um desafio para produtores e veterinários. Não é

possível encarar estas doenças como consequência da infecção por parte de

um agente patogênico, mas como reflexo de uma conjugação de fatores.

Assim, outras investigações não só em torno do TTV, mas de outros

microrganismos e de condições individuais dos animais, tais como influências

do sexo, idade e especialmente relacionados à imunologia do hospedeiro e do

74

agente, poderão esclarecer as dúvidas existentes sobre a circovirose suína e

abrir pressupostos para o entendimento de outras doenças multifatoriais.

75

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ANEXOS

ANEXO 1 - Ficha individual dos animais

Nome da granja: Número do animal:

Idade: Peso: Sexo: Fase:

Sinais clínicos:

diarreia sintomas respiratórios

Achados de necropsia:

inguinais

hipotrofia do timo

ausência de colabamento pulmonar

consolidação pulmonar

esplenomegalia

pontos esbranquiçados no parênquima renal

severa hipertrofia renal

difusa aderência da cápsula renal

irregularidade de superfície

úlcera gastroesofágica

lesões de pele (manchas avermelhadas)

Observações: