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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Identificação de linhagens atípicas de Yersinia spp. por métodos moleculares
Roberto Antonio de Souza
Ribeirão Preto
2009
Roberto Antonio de Souza
Identificação de linhagens atípicas de Yersinia spp. por métodos moleculares
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à
Farmácia para obtenção do Título de Mestre em
Biociências Aplicadas à Farmácia
Área de Concentração: Biociências Aplicadas à
Farmácia
Orientadora: Profª Drª Juliana Pfrimer Falcão
Ribeirão Preto
2009
i
RESUMO
SOUZA, R.A. Identificação de linhagens atípicas de Yersinia spp. por métodos
moleculares. 2009. 140 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
O gênero Yersinia compreende 12 espécies. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y.
pestis são patógenos de vários animais, incluindo os humanos. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y.
frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti e Y. rhodei são
encontradas sobretudo no meio ambiente e alimentos e consideradas, usualmente, como
bactérias oportunistas não-patogênicas e Y. ruckeri é um importante patógeno de peixes.
Usualmente, as linhagens de Yersinia são classificadas em espécies de acordo com suas
características bioquímicas. O Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras
que Y. pestis recebeu mais de 700 linhagens que foram identificadas bioquimicamente.
Entretanto, sete linhagens de Yersinia não puderam ser identificadas pelos testes bioquímicos
convencionais em nenhuma das espécies até o momento conhecidas e, por esse motivo, foram
denominadas Yersinia atípicas. Os objetivos desse trabalho foram identificar as linhagens
atípicas de Yersinia spp. em espécies por técnicas moleculares como Enterobacterial
Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE),
sequenciamento do gene 16S rRNA e Multilocus Sequencing Typing (MLST) e definir dentre
as metodologias empregadas a que mais contribui para a identificação precisa dessas
linhagens. Foi estudado um total de 59 linhagens de Yersinia spp., sendo 52 linhagens
representantes das diferentes espécies do gênero e sete as linhagens bioquimicamente atípicas
de Yersinia. As técnicas de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e o MLST foram
eficientes na identificação molecular do gênero Yersinia, uma vez que conseguiram reunir
ii
todas as espécies em ramos espécie-específicos, com exceção de algumas linhagens de Y.
frederiksenii e Y. kristensenii. A técnica de PFGE, pelo contrário, não agrupou as linhagens
estudadas em clusters espécie-específicos. Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene
16S rRNA e MLST, sugerem que as linhagens atípicas FCF 229 e FCF 231 pertençam à
espécie Y. ruckeri. Os dados de ERIC-PCR e MLST sugerem que a linhagem atípica FCF 487
pertença à espécie Y. enterocolitica. Ademais, os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do
gene 16S rRNA e MLST sugerem que as linhagens atípicas FCF 216, FCF 465, FCF 457 e
FCF 494 pertençam a espécie Y. massiliensis. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem
dados importantes para a caracterização molecular de linhagens bioquimicamente atípicas de
Yersinia e contribuem para uma melhor descrição do gênero quanto a sua diversidade e
reforçam o MLST como uma técnica confiável e reprodutível a ser usada na identificação de
bactérias pertencentes a esse gênero, sendo dentre as metodologias utilizadas nesse estudo a
mais indicada para tipagem molecular de yersiniae.
Palavras-chaves: Yersinia; Linhagens atípicas; PFGE, ERIC-PCR, Sequenciamento do gene
16S rRNA e MLST
1. Introdução
“Aprender é a única coisa que a mente nunca se cansa, nunca tem
medo e nunca se arrepende.” (Leonardo da Vinci)
1. Introdução
2
1.1 Gênero Yersinia
O gênero Yersinia é composto atualmente por 12 espécies. Y. enterocolitica, Y.
pseudotuberculosis e Y. pestis são patogênicas para o homem e animais e são as espécies de
Yersinia melhor estudadas. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y.
kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti e Y. rhodei são encontradas no meio ambiente e
alimentos e consideradas, usualmente, como bactérias oportunistas não-patogênicas. Y.
ruckeri é um importante patógeno de peixes, principalmente de trutas (MERHEJ et al., 2008;
WANGER, 2007).
O nome Yersinia foi dado em homenagem ao bacteriologista francês Alexandre J.
Yersin, que isolou pela primeira vez, em 1894, o agente da peste. O Comitê Internacional de
Sistemática Bacteriana, em 1972, incluiu o gênero Yersinia na família Enterobacteriaceae
(FALCÃO; FALCÃO, 2006).
Como todos os membros da família Enterobacteriaceae, Yersinia é um bacilo gram-
negativo não formador de esporos. O bacilo é menor que os outros membros de sua família,
medindo de 0,5 a 0,8 µm de diâmetro e de 1 a 3 µm de comprimento, e tende a crescer mais
lentamente. Com exceção de Y. pestis que é imóvel e Y. ruckeri que apresenta motilidade
variável, todos os outros membros do gênero são móveis a temperatura de 25 a 28ºC, pela
presença de flagelos peritríquios ou peripolares, e imóveis a 37ºC (FOUZ; ZARZA; AMARO,
2006; WANGER, 2007).
Os membros do gênero Yersinia têm um conteúdo de G + C variando de 46 a 50% e
são relacionados aos demais membros da família Enterobacteriaceae de 10 a 32%. As
relações intra-espécies são muito diversas, variando, usualmente, de 55 a 74%, com exceção
de Y. pestis e Y. pseudotuberculosis, que apresentam mais de 90% de similaridade entre si
(WANGER, 2007).
1. Introdução
3
As espécies do gênero são anaeróbias facultativas e multiplicam-se em uma ampla
faixa de temperatura (4 a 43ºC), mas as condições ótimas de multiplicação in vitro são entre
25 e 28ºC. Yersinia fermenta a glicose com produção de ácido, mas sem produção de gás, é
catalase positiva, oxidase negativa e reduz nitrato a nitrito. O meio seletivo usualmente
utilizado para seu isolamento é o ágar CIN (cefsulodina-irgasan-novobiocina). Y.
enterocolitica e Y. pseudotuberculosis crescem bem em meios com altas concentrações de sais
biliares, consequentemente são cultivadas com sucesso em ágar MacConkey e ágar SS
(Salmonella-Shigella). Nesses meios de cultura, as colônias são redondas, opacas, incolores,
medindo aproximadamente 1 mm de diâmetro após incubação de 25-30ºC por 24 horas. As
colônias de Yersinia não são hemolíticas em ágar sangue de carneiro a 5%. Somente Y. pestis
é fastidiosa e requer suplementos nutricionais de L-valina, L-metionina, L-fenilalanina e
glicina ou treonina. Acetoína (reação de Voges-Proskauer) é produzida a 25-28ºC, mas não a
37ºC, pela maioria das linhagens de Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia e Y.
aldovae, mas não pelas outras espécies de Yersinia. Com exceção de Y. pestis e Y. ruckeri,
urease é produzida quando cultivadas entre 25 a 28ºC. Ornitina é descarboxilada por todas as
espécies, exceto por Y. pestis e Y. pseudotuberculosis. A diferenciação das espécies de
Yersinia é feita frente a vários testes bioquímicos como: Voges-Proskauer, indol, citrato de
Simmons, ornitina-descarboxilase, urease, capacidade de metabolizar carboidratos como
sacarose, ramnose, celobiose, melibiose, sorbose, sorbitol e rafinose, além de testes de
motilidade depois de incubação a 25 e a 37ºC por 48 horas (ROBINS-BROWNE, 2001;
SULAKVELIDZE, 2000; WANGER, 2007).
Um quadro de identificação bioquímica apresentado na Tabela 1 é utilizado para a
identificação das espécies desse gênero bacteriano.
1. Introdução
4
Tabela 1 - Diferenciação bioquímica das espécies de Yersinia a Reações ou características b
Espécies
Mot
ilida
de
Ure
ase
VP
Indo
l
Citr
ato
Orn
itina
Saca
rose
Ram
nose
Cel
obio
se
Mel
ibio
se
Sorb
ose
Sorb
itol
Raf
inos
e
Y. pestis - - - - - - - - - V - - - Y. pseudotuberculosis + + - - - - - + - V - - V
Y. enterocolitica + + + V - + + - + - V V - Y. intermedia + + + + + + + + + + + + +
Y. frederiksenii + + + + V + + + + - + + - Y. kristensenii + + - V - + - - + - + + -
Y. aldovae + + + - V + - + - - - + - Y. rohdei c + Vd - - + + + - + V ND + V
Y. mollaretii + + - - - + + - + - + + - Y. bercovieri + + - - - + + - + - - + -
Y. ruckeri V - - - - + - - - - ND - - a incubação a 25ºC por 48 horas, exceção são os carboidratos para os quais as leituras são feitas por até 7 dias, se permanecendo negativas; b +, ≥ 90% de amostras positivas; -, ≥ 90% de amostras negativas; c para Y. rohdei biotipo 1, melibiose positiva e rafinose positiva e para Y. rohdei biotipo 2, melibiose negativa e rafinose negativa; d atrasado, positivo após 7 dias; V, variável; ND, não se aplica a prova. Fonte: ALEKSIC et al., 1987; BERCOVIER et al., 1984; BERCOVIER et al., 1980; BRENNER et al., 1980; EWING et al., 1978; SULAKVELIDZE 2000; URSING et al., 1980; WAUTERS et al., 1988.
Embora quase todas as espécies do gênero tenham sido isoladas de material clínico
humano, com exceção de Y. aldovae, somente Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e Y.
enterocolitica são consideradas importantes patógenos para o homem (WANGER, 2007).
Y. pestis que causa a peste negra ou bubônica e a peste pneumônica foi isolada e
descrita em 1894 por Alexandre Yersin durante um surto em Hong Kong. A peste ou praga é
uma das mais antigas doenças infecciosas conhecidas. Y. pestis geralmente é inoculada pela
picada de pulga infectada com o sangue de ratos contaminados que são o reservatório natural
da bactéria (ACHTMAN et al. 1999; FALCÃO; FALCÃO, 2006; WANGER, 2007).
Y. pestis causou três grandes pandemias. A primeira delas, conhecida como Peste de
Justiniano, que durou de 541 a 767 depois de Cristo teve início nas regiões central e leste da
África e a partir do Egito espalhou-se para países ao redor do mar Mediterrâneo. A segunda
pandemia, chamada Peste Negra, durou de 1346 até o final do século XVIII, iniciou-se na
1. Introdução
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África Central e a partir do Mar Cáspio espalhou-se por toda a Europa. A terceira pandemia
iniciou-se na região de Yunnan na China em meados do século XIX e espalhou-se
globalmente (ACHTMAN et al. 1999).
Y. pestis é dividida em três biovariedade (Antiqua, Medievalis e Orientalis) baseado
em pequenas diferenças fenotípicas. Observações epidemiológicas e relatos históricos
sustentam a hipótese que a biovariedade Antiqua, endêmica na África, é descendente da
bactéria que causou a primeira pandemia, enquanto a biovariedade Medievalis, endêmica na
Ásia, é descendente da bactéria que causou a segunda pandemia. A terceira pandemia foi
causada pela biovariedade Orientalis e hoje está espalhada em muitos países (ACHTMAN et
al. 1999).
Atualmente infecções causadas por Y. pestis são mais raras, sendo endêmicas em
apenas alguns países da Ásia e da África. Entretanto, a praga não desapareceu. Mesmo em
países desenvolvidos, como os Estados Unidos, são relatados todo ano, casos de peste
bubônica em andarilhos e caçadores que entram em contato com animais infectados. Grandes
epidemias e surtos ocorridos na Tanzânia (1991), Zaire (1992 a 1993), Peru (1993 a 1994),
Índia (1994) e Madagascar (1995) com taxas de mortalidade de 4,6 a 22,3% demonstram que
a doença causada por Y. pestis ainda está longe de ser erradicada (FALCÃO; FALCÃO, 2006;
WANGER, 2007).
Y. pseudotuberculosis causa em humanos principalmente gastrenterite, adenite
mesentérica aguda, ileíte terminal, poliartrite reativa, eritema nodoso e infecção sistêmica.
Infecções sistêmicas ou septicemias podem provocar lesões hepáticas, abscessos no baço, rins
e pulmão, osteomielite, artrite séptica, meningite, peritonite e endocardite. Acomete
principalmente adolescentes e adultos jovens, especialmente indivíduos do sexo masculino,
sendo os sintomas mais comuns febre, dor abdominal, diarréia e vômitos. Essa espécie de
1. Introdução
6
Yersinia infecta, sobretudo, animais que podem apresentar diarréia severa e enterocolite
(ALEKSIC; BOCKEMÜHL; WUTHE, 1995).
As linhagens de Y. pseudotuberculosis podem ser divididas nos biotipos 1, 2, 3 e 4, em
relação ao seu metabolismo frente à melibiose, rafinose e citrato de Simmons, conforme
apresentado na Tabela 2. Além disso, podem ser classificadas em 14 sorogrupos somáticos
(O:1 a O:14) de acordo com o antígeno O de superfície, constituinte do lipopolissacarídeo
(LPS). Esses sorogrupos somáticos podem ser subdivididos em subgrupos 1a, 1b, 1c, 2a, 2b,
2c, 4a, 4b, 5a e 5b. Y. pseudotuberculosis pode ser agrupada de acordo com seus antígenos
flagelares em 5 grupos, denominados a, b, c, d e e (TSUBOKURA; ALEKSIC, 1995).
Tabela 2 – Biotipos de Y. pseudotuberculosis após incubação a 25ºC por 48 horas Reações para biotipos a Provas
1 2 3 4 Melibiose + - - +
Citrato de Simmons - - + - Rafinose - - - +
a +, ≥ 90% de amostras positivas; -, ≥ 90% de amostras negativas. Fonte: TSUBOKURA; ALEKSIC, 1995.
Y. enterocolitica emergiu como patógeno humano durante a década de 1930
(BOTTONE, 1999; SULAKVELIDZE, 2000). Entre as espécies de Yersinia, Y. enterocolitica
é o patógeno de maior prevalência entre os humanos. Infecções clínicas no homem ocorrem,
sobretudo, pela ingestão de água e alimentos contaminados por essa bactéria (BOTTONE,
1999). No homem, causa uma variedade de sintomas clínicos intestinais e extraintestinais,
com graus diversos de gravidade, que variam desde uma leve gastrenterite até uma
linfoadenite mesentérica, a qual mimetiza uma apendicite. Em casos mais graves e raros o
quadro pode evoluir para uma septicemia (ROBINS-BROWNE, 2001).
1. Introdução
7
A doença causada por Y. enterocolitica usualmente dura de poucos dias a três semanas
(FALCÃO; FALCÃO, 2006). A infecção pode levar também a complicações imunológicas,
incluindo eritema nodoso, artrite reativa e glomerulonefrite (BOTTONE, 1999).
A maioria das infecções sintomáticas causadas por Y. enterocolitica ocorre em
crianças, principalmente naquelas abaixo de cinco anos de idade. Nesses pacientes, a
yersiniose apresenta-se como diarréia, frequentemente acompanhada por febre baixa e dores
abdominais (ROBINS-BROWNE, 2001). Nos animais, Y. enterocolitica pode provocar
enterocolite e diarréia intensa. Pode ocorrer cura espontânea ou septicemia fatal e a bactéria
pode ser isolada de lesões da parede intestinal, linfonodos mesentéricos, fígado, pulmão e
baço (FALCÃO; FALCÃO, 2006).
Y. enterocolitica pode ser dividida em biotipos de acordo com sua atividade
bioquímica frente a determinados substratos, conforme a Tabela 3, o que possibilita dividir
essa espécie em subtipos de significado clínico e epidemiológico variável. Atualmente
existem cinco biotipos, sendo o biotipo 1 subdividido ainda nas biovariedades 1A e 1B
(BOTTONE, 1999). De maneira geral as variedades patogênicas para o homem e animais
enquadram-se nos biotipos 1B, 2, 3, 4 e 5, enquanto aquelas isoladas do meio ambiente
enquadram-se no biotipo 1A. O biotipo 4 é isolado com maior frequência de material clínico
humano (ROBINS-BROWNE, 2001).
1. Introdução
8
Tabela 3 – Biotipos de Y. enterocolitica após incubação a 25ºC por 48 horas Reações para biotipos a Provas
1A 1B 2 3 4 5 Lipase + + - - - -
Esculina + - - - - - Salicina + - - - - -
Indol + + (+) - - - Xilose + + + + - d
Trealose + + + + + - Redução de nitrato a nitrito + + + + + -
DNAse - - - - + + Pirazinamidase b + - - - - -
a +, ≥ 90% de amostras positivas, d, 11 a 89% de amostras positivas, -, ≥ 90% de amostras negativas, (+), reação fracamente positiva; b de acordo com KANDOLO; WAUTERS, 1985. Fonte: WANGER, 2007.
O esquema antigênico de Y. enterocolitica compreende 76 antígenos somáticos (O) e
44 flagelares (H) (WAUTERS et al., 1991). No entanto, rotineiramente, utiliza-se, na
sorotipagem, só a caracterização dos antígenos somáticos, pois segundo Wauters (1981), a
tipagem dos antígenos flagelares não tem importância prática para o propósito de diagnóstico
em laboratórios de rotina. O sorogrupo relacionado, mais frequentemente, com doenças no
homem é o O:3, seguido por O:9, O:5,27 e O:8 (BOTTONE, 1999; ROBINS-BROWNE,
2001). Y. enterocolitica também é classificada quanto à sensibilidade a diferentes fagos
(FALCÃO; FALCÃO, 2006; NICOLLE; MOLLARET; BRAULT, 1973).
As demais espécies de Yersinia: Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y.
intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti, Y. rhodei e Y. ruckeri, não são tão
estudadas, devido ao fato de não possuírem os marcadores clássicos de virulência e, portanto,
são usualmente consideradas como não patogênicas. Entretanto, certos dados sugerem que
algumas dessas espécies podem causar doença (SULAKVELIDZE, 2000).
A taxonomia de Yersinia foi revolucionada por Brenner et al. (1976) que realizou a
técnica de hibridização DNA-DNA, em adição aos testes bioquímicos clássicos para a
classificação de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis. Quatro anos depois, como
resultados desses estudos, bactérias semelhantes a Y. enterocolitica foram separadas desta
1. Introdução
9
espécie recebendo a designação de Y. intermedia, Y. frederiksenii e Y. kristensenii
(BERCOVIER et al., 1980; BRENNER et al., 1980; URSING et al., 1980).
Bercovier et al. (1984), propuseram o nome Y. aldovae para um grupo de Y.
enterocolitica isolado de ecossistemas aquáticos e que era formalmente conhecido como Y.
enterocolitica grupo X2. Três anos mais tarde, Aleksic et al. (1987), propuseram a designação
de Y. rohdei para um grupo de amostras isoladas de fezes humanas e de cachorro. Wauters et
al. (1988), propuseram a designação Y. bercovieri e Y. mollaretti para isolados originalmente
classificadas como Y. enterocolitica biogrupos 3B e 3A, respectivamente. Y. ruckeri, que
causa a doença da “boca vermelha” em peixes, foi a primeira dessas bactérias semelhantes a
Y. enterocolitica a ser descrita (EWING et al., 1978).
Y. frederiksenii é facilmente diferenciada de Y. enterocolitica e outras espécies
semelhantes a Y. enterocolitica baseada na sua habilidade de fermentar a ramnose. Apenas Y.
intermedia e Y. aldovae também fermentam esse carboidrato. Y. frederiksenii é diferente de Y.
intermedia porque não fermenta a melibiose, rafinose e α-metil-D-glicosídeo. É diferente de
Y. aldovae porque fermenta a sacarose. Os antígenos H de Y. frederiksenii foram reportados
como sendo diferentes dos de Y. enterocolitica, mas esta espécie tem vários antígenos O em
comum com Y. enterocolitica sendo mais predominantes em Y. frederiksenii os antígenos
somáticos O:16, O:1 e O:2. Tem sido isolada sobretudo de águas de esgoto, solos, peixes,
roedores selvagens, alimentos, animais domésticos e fezes de humanos e animais doentes
(FALCÃO et al., 2008; SULAKVELIDZE, 2000; URSING et al., 1980).
Y. kristensenii é uma espécie de Yersinia que fermenta a trealose, mas não a sacarose.
Possui antígenos H diferentes de Y. enterocolitica, mas vários antígenos O são comuns a Y.
enterocolitica. Os sorogrupos mais comuns são o O:12, O:28 e O:11. Y. kristensenii tem sido
isolada de várias amostras ambientais, alimentos, animais e fezes de humanos saudáveis e
1. Introdução
10
doentes em várias partes do mundo (BERCOVIER et al., 1980; FALCÃO et al., 2008;
SULAKVELIDZE, 2000).
Y. intermedia é uma espécie que fermenta a ramnose e a melibiose e a maioria das
linhagens também fermenta a rafinose, uma minoria não descarboxila a ornitina. Pode ser
dividida em oito biotipos em relação ao seu metabolismo frente aos testes apresentados na
Tabela 4. Y. intermedia possui poucos antígenos flagelares espécie-específicos e tem poucos
antígenos O em comum com Y. enterocolitica. Os sorogrupos O:4 e O:17 parecem ser os
predominantes. Esta espécie tem sido isolada principalmente de peixes, ostras, camarão,
animais domésticos e selvagens, alimentos e de humanos, incluindo pessoas com desordem
gastrintestinal. No Brasil, essa espécie foi muito isolada a partir de amostras ambientais
(BRENNER et al., 1980; FALCÃO et al., 2008; SULAKVELIDZE, 2000).
Tabela 4 - Biotipos de Y. intermedia após incubação a 25ºC por 48 horas Reações para biotipos a Provas
1 2 3 4 5 6 7 8 Melibiose + + + + + + + - Ramnose + + + - - + + +
α-metil-D-glicosídeo + + - + - + - + Rafinose + + + + + - - +
Citrato de Simmons + - + + V - - + a +, ≥ 90% de amostras positivas, V, 10,1 a 89,9% de amostras positivas, -, ≥ 90% de amostras negativas. Fonte: BRENNER et al., 1980.
Y. aldovae produz ácido a partir da L-ramnose, não fermenta a celobiose, a melibiose e
a rafinose e produz acetoína (teste de Voges-Proskauer) quando cultivada a 25ºC, mas não a
37ºC. Os sorogrupos mais comuns são o O:17; O:6,31; O:6,30; O:7,8; O:21 e O:22. Y.
aldovae tem sido isolada de ecossistemas aquáticos e do solo, não tem sido isolada de
humanos e não é indicada como causa de infecções no homem e animais (BERCOVIER et al.,
1984; SULAKVELIDZE, 2000).
1. Introdução
11
Y. mollaretti fermenta a L-sorbose, mas não a L-fucose. Muitas linhagens dessa
espécie possuem antígenos somáticos idênticos ou muito similares aos de Y. enterocolitica. Y.
mollaretti foi isolada de carnes, vegetais crus, água potável e ocasionalmente de humanos,
incluindo pacientes com diarréia (SULAKVELIDZE, 2000; WAUTERS et al., 1988).
Y. bercovieri fermenta a L-fucose, mas não a L-sorbose. Linhagens de Y. bercovieri
mostraram possuir um antígeno somático quimicamente distinto, o polissacarídeo O-
específico O:10. Essa espécie tem sido isolada de humanos saudáveis e pacientes com
diarréia, bem como de alimentos crus e de amostras obtidas do meio ambiente
(SULAKVELIDZE, 2000; WAUTERS et al., 1988).
Y. rohdei pode ser distinguida das outras espécies de Yersinia por sua reação positiva
nos testes de Citrato de Simmons e fermentação da sacarose e reações negativas para a
produção de indol, produção de acetoína após incubação a 25 e a 37ºC e fermentação da
ramnose. Linhagens dessa espécie possuem antígenos somáticos que não são tipáveis pela
maioria dos anti-soros disponíveis para tipagem de Yersinia, sendo que poucas linhagens
dessa espécie dão reação cruzada com o antígeno somático O:18 de Y. enterocolitica e O:38 e
O:60 de Y. frederiksenii. Tem sido isolada de água, fezes de cachorro e humanos, incluindo
pessoas com diarréia e cólicas intestinais (ALEKSIC et al., 1987; SULAKVELIDZE, 2000).
Y. ruckeri é um dos agentes etiológicos da doença chamada “boca vermelha” que
acomete peixes, principalmente trutas. Em contraste com Y. enterocolitica, Y. kristensenii e Y.
frederiksenii, mostra-se como uma espécie muito clonal. Y. ruckeri é filogeneticamente menos
relacionada à Y. enterocolitica que as demais espécies semelhantes à Y. enterocolitica. Y.
ruckeri não carreia a sequência homóloga do gene inv, que codifica uma proteína de invasão
denominada invasina (Inv) (FALCÃO; FALCÃO, 2006), encontrado em outros yersiniae.
Devido a esse fato e ao fato da taxa de homologia entre essa espécie e as demais espécies de
Yersinia ser de apenas 30%, há controvérsias sobre o status taxonômico de Y. ruckeri e alguns
1. Introdução
12
pesquisadores acreditam que a espécie não deva ser incluída no gênero Yersinia (EWING et
al., 1978; FERNÁNDEZ, MÉNDEZ, GUIJARRO, 2007; SULAKVELIDZE, 2000).
Recentemente, Sprague e Neubauer (2005), baseados no sequenciamento do gene 16S
rRNA, hibridação DNA-DNA, determinação do conteúdo de G + C do DNA e em alguns
testes fenotípicos, denominaram de Y. aleksiciae um grupo de Y. kristensenii que apresentava
um perfil eletroforético diferente por Multilocus Enzyme Eletrophoresis (MLEE).
Propostas para a criação de novas espécies de Yersinia surgiram nos últimos anos.
Marhej et al., (2008) propuseram a criação da espécie Y. massiliensis para duas linhagens
isoladas na França baseados no sequenciamento do gene 16S rRNA, no sequenciamento
parcial dos genes hsp60, rpoB, gyrB, sodA e na determinação do conteúdo de G + C do DNA.
Sprague et al. (2008) propuseram a criação da espécie Y. similis para um grupo originalmente
identificado fenotipicamente como Y. pseudotuberculosis que foi classificado mais
detalhadamente pela análise da sequência do gene 16S rRNA, hibridação DNA-DNA,
determinação do conteúdo de G + C do DNA e caracterização fenotípica.
1.2 Evolução dos métodos de tipagem bacteriana
Os estudos clássicos de tipagem bacteriana eram praticamente baseados em resultados
de metodologias fenotípicas, tais como biotipagem, sorotipagem, fagotipagem, padrão de
resistência a antimicrobianos, entre outras. Entretanto, esses métodos convencionais são,
muitas vezes, limitados por sua baixa capacidade de diferenciação entre linhagens de uma
determinada espécie e também devido, muitas vezes, à baixa reprodutibilidade dos testes
(OLIVE; BEAN, 1999).
Nas últimas duas décadas, muitos métodos genotípicos têm sido utilizados para a
identificação, caracterização em estudos epidemiológicos e taxonômicos bacterianos e vêm
substituindo os testes fenotípicos clássicos de tipagem bacteriana. Tais estudos de
1. Introdução
13
investigação epidemiológica molecular possibilitam determinar qual a fonte e os veículos de
transmissão, bem como, informam se os microrganismos envolvidos nos surtos representam
ou não um único clone. A premissa básica de todos esses métodos reside no fato que amostras
bacterianas relacionadas epidemiologicamente apresentam um precursor comum (OLIVE;
BEAN, 1999).
Vários métodos moleculares têm sido utilizados tanto na tipagem como em estudos
epidemiológicos de bactérias do gênero Yersinia. As metodologias de Enterobacterial
Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Repetitive Extragenic Palindrome PCR
(REP-PCR), ribotipagem, eletroforese em campo pulsado (PFGE) e sequenciamento do gene
16S rRNA vêm sendo utilizadas com sucesso para tais finalidades (FALCÃO et al., 2006;
GUIYOULE et al., 1997; ITEMAN; GUIYOULE; CARNIEL, 1996; KIM et al., 2003;
WOJCIECH et al., 2004).
Muitos desses métodos têm bom ou excelente poder discriminatório (por exemplo,
PFGE foi proposto como “padrão-ouro” para tipagem de amostras de Yersinia) e fornecem
bons dados para estudos epidemiológicos de pequeno porte. Entretanto, eles fornecem poucos
dados para estudos epidemiológicos de maior porte e para a determinação das vias de
evolução e das relações filogenéticas entre as espécies, o que tem sido resolvido pela
utilização da metodologia de Multilocus Sequence Typing (MLST) (KOTETISHVILI et al.,
2005; MAIDEN et al., 1998).
Recentemente, foi publicado um trabalho utilizando MLST para estudos taxonômicos
de Yersinia que demonstrou ser essa técnica excelente para tal finalidade (KOTETISHVILI et
al., 2005), o que sugere que essa metodologia possa ser aplicada na definição de novas
espécies bacterianas, incluindo linhagens de Yersinia que não puderam ser identificadas pelos
testes bioquímicos usuais em nenhuma das espécies até o momento descritas.
1. Introdução
14
1.3 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR
Famílias de pequenas sequências intergênicas repetitivas (30 – 150 bp) têm sido
descritas em bactérias entéricas (VERSALOVIC; KOEUTH; LUPSKI, 1991; WILSON;
SHARP, 2006).
Pouco é conhecido sobre a origem, evolução ou possíveis funções desses elementos.
Muitas famílias de elementos repetitivos são restritas a determinada espécie ou a espécies
muito relacionadas, enquanto outras espécies não possuem tais elementos. Isso sugere que, se
essas sequências repetitivas possuem alguma função, essas funções podem não ser aplicadas a
todos os membros da família e não são essenciais para o aspecto fundamental do crescimento,
sobrevivência e replicação bacterianos (GILSON; PERRIN; HOFNUNG, 1990).
Muitas sequências repetitivas são palíndromos imperfeitos com potencial de formar
estruturas secundárias, que podem melhorar a estabilidade de mRNA. Por outro lado, muitos
elementos repetitivos podem ser material genético não funcional (WILSON; SHARP, 2006).
Uma família de elementos repetitivos chamada Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus (ERIC) também conhecida como Intergenic Repeat Units (IRUs), um palíndromo
imperfeito de 127 bp que ocorre em múltiplas cópias no genoma de bactérias entéricas e
víbrios (WILSON; SHARP, 2006), foi definida usando informações de sequências genéticas
obtidas a partir de Escherichia coli e Salmonella enterica sorovariedade Typhimurium
(VERSALOVIC; KOEUTH; LUPSKI, 1991). Sequências menores produzidas por deleções
internas também têm sido descritas, bem como sequências maiores formadas por inserções de
fragmentos em torno de 70 bp em sítios internos específicos (WILSON; SHARP, 2006).
Esses elementos ERIC contêm uma região central altamente conservada e localizada
em regiões intergênicas não codificantes do genoma bacteriano, ou seja, situam-se entre genes
transcritos dentro ou fora de operons, com sua posição variando em relação à posição das
sequências de terminação e promotora de genes, fazendo com que apenas uma pequena parte
1. Introdução
15
destas sequências ERIC seja transcritas na forma de RNA (SHARPLES; LLOYD, 1990;
VERSALOVIC; KOEUTH; LUPSKI, 1991; WILSON; SHARP, 2006).
Quando a sequência ERIC encontra-se antes de uma sequência de terminação de um
determinado gene, ela é transcrita junto com o gene que a acompanha. Dessa forma, a parte do
mRNA correspondente às sequências ERIC formaria uma estrutura na forma de alça devido à
complementaridade entre algumas sequências invertidas. Essa estrutura em forma de alça
poderia interferir com a ligação do mRNA aos ribossomos, influenciando na tradução do
mesmo, o que sugere, uma função regulatória para os elementos ERIC (SHARPLES;
LLOYD, 1990).
As sequências ERIC poderiam ainda proteger a região 3’ do mRNA contra digestão
por exonucleases, e dessa forma aumentar a expressão de genes que estejam localizados
posteriormente a elas. Ainda não foi descrita nenhuma proteína traduzida a partir das
sequências ERIC. Porém devido à natureza conservada deste elemento em diferentes espécies
da família Enterobacteriaceae, sugere-se que ele possa designar um sinal estrutural para o
DNA destes microrganismos (SHARPLES; LLOYD, 1990).
O número de cópias de sequências ERIC varia entre as espécies. Foi estimado que
haveria ao redor de 30 cópias em Escherichia coli K-12 e 150 em S. enterica sorovariedade
Typhimurium LT2 (WILSON; SHARP, 2006). Em espécies patogênicas de Yersinia, as
sequências ERIC correspondem a aproximadamente 0,7% e 0,45% do conteúdo total de DNA
de Y. enterocolitica e Y. pestis, respectivamente. Em outras espécies, esses elementos estão
dispersos por todo o cromossomo, principalmente como cópias únicas (DE GREGÓRIO et
al., 2005).
Esse número diferente de cópias sugere que regiões intergênicas possam conter uma
sequência ERIC em uma espécie, mas não em outra (WILSON; SHARP, 2006).
1. Introdução
16
Não se tem um consenso estabelecido sobre a distribuição das sequências ERIC pelo
genoma. Segundo De Gregório et al. (2005) essa distribuição ocorre provavelmente por
transposição. Por outro lado, Wilson e Sharp (2006) afirmam que nada é conhecido sobre a
natureza da mobilidade desses elementos, bem como sobre a razão ou a geração das cópias.
Sequências ERIC são também de interesse porque elas têm sido usadas como base
para uma técnica de tipagem bacteriana denominada ERIC-PCR. Essa metodologia utiliza
uma reação de polimerase em cadeia (PCR) com primers consenso para amplificar regiões
entre sequências ERIC do genoma bacteriano (WILSON; SHARP, 2006).
Essas análises por PCR revelam distâncias inter-ERIC e padrões de bandas específicos
para as espécies bacterianas (VERSALOVIC; KOEUTH; LUPSKI, 1991). Dependendo da
distância entre duas destas sequências adjacentes, a porção de DNA compreendida entre elas
seria amplificada pela PCR. Se a posição das cópias varia entre diferentes linhagens, os
produtos de amplificação sustentam um perfil característico e seriam visualizados como
bandas de diferentes tamanhos em um gel de agarose (LUPSKI; WEINSTOCK, 1992;
WILSON; SHARP, 2006).
Como diferentes linhagens bacterianas apresentam polimorfismo quanto ao número e
posição dessas sequências, esse padrão de bandas resultante da PCR poderia ser utilizado para
diferenciá-los. A comparação entre os perfis eletroforéticos de diferentes linhagens poderia,
portanto, ser utilizada para determinar o grau de similaridade entre as linhagens testadas.
Considerando que o perfil de bandas gerado através desta reação é reprodutível e uma mesma
linhagem bacteriana testada repetidas vezes apresenta sempre o mesmo padrão, pode-se dizer
que esse método de tipagem é eficiente e que o padrão de bandas obtido é específico para
cada linhagem em questão (LUPSKI; WEINSTOCK, 1992).
1. Introdução
17
1.4 Eletroforese em Campo Pulsado
A técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi descrita pela primeira vez em
1984 como uma ferramenta para análise do DNA cromossômico de organismos eucariotos.
Subsequentemente, essa técnica provou ser altamente eficiente para tipagem molecular de
muitas espécies bacterianas (TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997).
Por meio dessa técnica, o DNA bacteriano é digerido com enzimas de restrições que
possuem poucos sítios de reconhecimento. Dessa forma, gera-se um perfil com
aproximadamente 10 a 30 fragmentos de restrição que variam de 10 a 800 Kb.
Essencialmente, todos esses fragmentos podem ser separados em um padrão de bandas
distintas por PFGE. Enquanto em uma eletroforese convencional a aplicação da corrente
elétrica em um gel é feita em um único sentido, na técnica de PFGE a corrente é aplicada
primeiro em uma direção a partir de um conjunto de eletrodos, em seguida, a corrente elétrica
migra para um segundo conjunto de eletrodos por um curto período de tempo e novamente
migra para um terceiro conjunto de eletrodos. Deste modo, o campo elétrico que provoca a
migração do DNA no gel é produzido em pulsos que alternam entre três conjuntos de
eletrodos. Isto faz com que o DNA migre de maneira serpentiforme através do gel, e esse
movimento “para a frente e para traz” resulta num maior nível de separação entre os
fragmentos de restrição (TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997).
Praticamente todas as espécies bacterianas podem ser tipáveis por PFGE, embora o
isolamento e a manutenção do DNA intacto até a digestão pela enzima de restrição sejam
tecnicamente difíceis para algumas espécies. Por exemplo, o DNA cromossômico de algumas
linhagens de Clostridium difficile degrada-se espontaneamente durante o processo de lise
celular, o que torna essa técnica impraticável. Entretanto, PFGE tem sido aplicado com
sucesso para tipagem de um vasto número de espécies bacterianas, tanto gram-positivas
quanto gram-negativas (TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997).
1. Introdução
18
Em geral, PFGE é uma das técnicas mais reprodutíveis e com maior poder
discriminatório disponíveis e é atualmente o método de tipagem de escolha para muitas
espécies (TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997).
Alguns fatores têm limitado o uso de PFGE na tipagem molecular. Um deles é o
tempo envolvido na análise completa do processo que pode durar de dois a três dias. Isso pode
reduzir a habilidade de alguns laboratórios em analisar um grande número de linhagens
(OLIVE; BEAN, 1999). Outro fator é o alto custo do equipamento necessário para a
realização da técnica (TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997).
1.5 Gene 16S rRNA
Na década de 1980, um novo método para identificação de bactérias começou a ser
desenvolvido. Esse método mostrava que as relações filogenéticas entre bactérias poderiam
ser determinadas por comparação entre segmentos de genes conservados. Regiões
codificantes do DNA como as regiões 5S, 16S e 23S rRNA e os espaços entre esses genes
foram usados para determinações filogenéticas, mas a região 16S rRNA é, dentre elas, a mais
usada para propósitos taxonômicos em bactérias (CLARRIDGE III, 2004).
O gene 16S rRNA possui aproximadamente 1550 bp e é composto tanto por regiões
conservadas quanto por regiões variáveis que flanqueiam essas regiões conservadas
(CHAKRAVORTY et al., 2007; CLARRIDGE III, 2004).
A utilização corriqueira da técnica de hibridação DNA-DNA na definição de novas
espécies ainda é um fato distante, embora essa metodologia tenha sido publicada como sendo
o “padrão-ouro” para tal finalidade (WAYNE et al., 1996). Essa técnica é cara, difícil de ser
executada, realizada em poucos laboratórios e nem sempre correlacionada com algumas
definições de espécies. Por sua vez, o sequenciamento do gene 16S rRNA é fácil de ser
determinado e, portanto, pode ser utilizado em determinações filogenéticas. Entretanto, não há
1. Introdução
19
ainda um consenso sobre o exato nível de diferença genética que defina uma espécie
(CLARRIDGE III, 2004; KOTETSHIVILI et al., 2005).
1.6 Multilocus Sequence Typing
A habilidade de identificar corretamente linhagens de agentes infecciosos que causam
doenças é o ponto central da vigilância epidemiológica e das decisões de saúde pública. Todos
os numerosos métodos fenotípicos que são frequentemente usados estão sujeitos a
significantes inconvenientes, incluindo identificações inadequadas, reprodutibilidade e
compartilhamento de dados insatisfatórios dentro e entre laboratórios e uma inabilidade para
determinar relações filogenéticas entre linhagens (MAIDEN et al., 1998).
Atualmente, um dos métodos de tipagem molecular que utiliza sequenciamento e que
vem sendo utilizado por diversos pesquisadores para diferentes microrganismos, é a tipagem
de bactérias por Multilocus Sequence Typing (MLST). Maiden et al. (1998) propuseram essa
técnica e a partir de então ela tem-se apresentado como uma importante e eficaz técnica na
caracterização molecular e investigação epidemiológica de patógenos bacterianos. Além
disso, MLST pode ser utilizado para inferências filogenéticas (COHAN, 2002; FEIL et al.,
2003; FEIL; SPRATT, 2001; TURNER; FEIL, 2007). Esse método tem a vantagem de ser
altamente reprodutível e seus resultados poderem ser compartilhados on-line (MAIDEN et al.,
1998).
MLST é uma técnica derivada da análise da mobilidade eletroforética de enzimas
bacterianas (MLEE). No MLST, ao invés de se analisar a expressão dos genes, analisa-se os
próprios genes por sequenciamento de seus nucleotídeos (URWIN; MAIDEN, 2003).
Sequências diferentes são consideradas alelos distintos daquele gene e recebem
arbitrariamente um número com o propósito de identificação. Como no MLEE, o perfil alélico
determina o “tipo” do microrganismo. Portanto, MLST é um método de genotipagem baseado
1. Introdução
20
na amplificação e sequenciamento de diferentes loci. Cada produto de PCR, ou seja, cada
locus amplificado é sequenciado, analisado e de acordo com as mutações encontradas na
sequência determina-se o número de genes alelos para aquele locus. Para cada gene, as
sequências são referidas como alelos e do conjunto de diferentes alelos provém um perfil
alélico que define o sequence type (ST) de cada amostra bacteriana. Sequências que diferem
em apenas um nucleotídeo são consideradas como alelos diferentes (MAIDEN et al., 1998;
URWIN; MAIDEN, 2003).
Estudos recentes têm demonstrado que a metodologia de MLST tem-se mostrado mais
eficiente em análises filogenéticas bacterianas quando comparado à técnica de PFGE
(HARBOTTLE et al., 2006; NEMOY et al., 2005). No entanto, essa comparação ainda é
controversa e necessita de maiores estudos, pois há estudos que enfatizam a superioridade da
técnica de PFGE em relação à MLST na tipagem molecular de espécies bacterianas (JI et al.,
2006).
Dados de MLST podem ser utilizados para calcular a contribuição de mutações e
recombinações na evolução de complexos clonais dentro de uma dada espécie de bactérias
(FEIL et al., 2003). Informações desta natureza podem auxiliar, por exemplo, na tomada de
medidas epidemiológicas preventivas. Sabe-se que algumas populações de patógenos
bacterianos possuem um grande e heterogêneo número de isolados que raramente causam
doenças e um pequeno número de linhagens muito relacionadas geneticamente que são
particularmente associadas a surtos. Isso é evidente em Neisseria meningitidis. Nessa espécie
bacteriana, as linhagens virulentas que circulam atualmente pela população possuem alelos
idênticos para todos os genes housekeeping, ao contrário das linhagens de menor importância
clínica que possuem diferentes alelos para cada um dos genes housekeeping (MAIDEN et al.,
1998). Assim, o isolamento de uma linhagem pertencente a um complexo clonal característico
de linhagens virulentas possibilita a tomada de medidas preventivas que impeçam o
1. Introdução
21
surgimento de uma epidemia. Contudo, essa relação entre linhagens virulentas e alelos nem
sempre é válida para outros gêneros e espécies.
MLST é fortemente indicado como a nova alternativa para as análises taxonômicas de
procariotos. Diversos pesquisadores têm sugerido que a definição de espécie seja baseada em
sequências de genes, devido às características de facilidade de construção de bases de dados
de acesso público, incorporação de novos dados e recursos de análise computacional (LA
SCOLA et al., 2003; THOMPSON et al., 2005a).
1.7 Identificação de Yersinia spp. no Brasil
Nos últimos 40 anos, mais de 700 linhagens de Yersinia foram identificadas e tipadas
pelo Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras que Y. pestis, localizado na
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP, usando testes bioquímicos
clássicos para a caracterização das espécies. As linhagens foram posteriormente classificadas
em biotipos, sorogrupos e fagotipos quando pertinente. Estes testes possibilitaram a
identificação de culturas de Yersinia, pertencentes às espécies Y. enterocolitica, Y.
pseudotuberculosis, Y. intermedia, Y. frederiksenii e Y. kristensenii. Não foram identificados
pelos testes bioquímicos convencionais representantes das espécies Y. aldovae, Y. bercovieri,
Y. mollaretii, Y. rohdei e Y. ruckeri. As linhagens de Yersinia foram isoladas de materiais
clínicos de humanos e animais sadios e/ou doentes, de diferentes tipos de alimentos e do meio
ambiente, por pesquisadores de várias instituições em diferentes cidades e regiões do Brasil.
No entanto, sete isolados não puderam ser identificados bioquimicamente em nenhuma das
espécies de Yersinia conhecidas e, portanto, foram denominados de Yersinia atípicas
(FALCÃO et al., 2008).
6. Conclusões
“Nos campos da observação, o acaso favorece apenas as mentes
preparadas.” (Louis Pasteur)
6. Conclusões
96
As técnicas de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST foram
eficientes na identificação molecular das espécies do gênero Yersinia, uma vez que
tais metodologias conseguiram agrupar as linhagens de Yersinia spp. em clusters
espécie-específicos, com exceção de alguns representantes de Y. frederiksenii e Y.
kristensenii.
A técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição XbaI não foi eficiente para a
identificação molecular das espécies do gênero Yersinia, apesar do seu elevado
índice de discriminação.
As técnicas de ERIC-PCR e MLST discriminaram similarmente as linhagens de
uma mesma espécie do gênero Yersinia, o que é evidenciado pelo índice de
discriminação (D).
Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST, juntamente
com os resultados da amplificação da região do gene 16S rRNA específica para Y.
ruckeri e do sequenciamento dessa região sugerem que as linhagens atípicas FCF
229 e FCF 231 pertençam à espécie Y. ruckeri e dessa forma sejam os primeiros
representantes dessa espécie isolados e identificados no Brasil.
Os dados de ERIC-PCR e MLST sugerem que a linhagem atípica FCF 487
pertença à espécie Y. enterocolitica.
Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST sugerem que
as linhagens atípicas FCF 216, FCF 465, FCF 457 e FCF 494 pertençam a espécie
Y. massiliensis e dessa forma sejam os primeiros representantes dessa espécie
isolados e identificados no Brasil.
O MLST, dentre as metodologias utilizadas nesse trabalho, apresentou-se como a
técnica mais indicada para a identificação molecular de bactérias do gênero
Yersinia.
7. Referências *
_____________ * De acordo com:
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – NBR 6023: informação e documentação:
referências: elaboração. Rio de Janeiro, 2002.
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