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RMN 2D: DETECO INVERSA E GRADIENTE DE CAMPO NA DETERMINAO ESTRUTURALDE COMPOSTOS ORGNICOS

Carlos R. KaiserInstituto de Qumica - Universidade Federal do Rio de Janeiro - Fundo - CT - Bloco A - 21949-900 - Rio de Janeiro - RJ

Recebido em 13/7/98; aceito em 5/7/99

2D NMR: INVERSE DETECTION AND FIELD GRADIENT IN STRUCTURE DETERMINATIONOF ORGANIC COMPOUNDS. A view of the general aspects involving the 2D NMR spectroscopyusing inverse detection and field gradient techniques is presented through the analysis of asesquiterpene.

Keywords: 2D NMR; inverse detection; field gradient.

DIVULGAO

RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEARA Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) sem dvida uma

das mais poderosas tcnicas espectroscpicas no estudo de as-pectos estruturais e dinmicos de molculas orgnicas em so-luo. Tanto que na atualidade muito comum fazer medidasde RMN para uma determinada substncia, mesmo antes de seobter um espectro de infravermelho ou um espectro de massa.Esta constatao est diretamente relacionada com a evoluotcnica dos equipamentos de RMN nesta ltima dcada. Porexemplo: magnetos supercondutores com maior estabilidade docampo magntico e versatilidade no ajuste da homogeneidade;hardwares que permitem eficiente elaborao e preciso na pro-gramao das sequncias de pulsos, de forma a acomodar asmais variadas tcnicas multidimensionais (2D, 3D, etc.);softwares que fornecem uma interface mais simples e rpidacom o hardware, facilitando o controle do instrumento. Asmelhorias nos equipamentos geralmente vem acompanhadas daintroduo de novas sequncias de pulsos. Todavia, apesar desempre serem instigantes para o qumico espectroscopista, no-vas tcnicas de pulsos levam um longo tempo at que sejamplenamente absorvidas pela grande maioria dos usurios1-5.

Ainda rotina obter espectros em uma dimenso (1D) de 1H,13C{1H} e DEPT de um determinado composto, mesmo que emmuitas situaes estas duas ltimas tcnicas exijam um tempode medida muito grande devido a baixa sensibilidade inerentedo ncleo de 13C (1.59% relativa ao 1H) e normalmente, a poucaquantidade de amostra disponvel (< 0.03 mg/mol). parte daspossveis dificuldades experimentais, est comprovado, atravsdos anos, que os dados de deslocamentos qumicos de 13C soimportantes ferramentas em uma determinao estrutural2,3,5-7.No entanto, tambm ficou demonstrado que a metodologia decomparar os dados obtidos com os dados de compostos anlogosdescritos na literatura merece sempre cautela. Isto porque vriosdestes registros literrios sofrem de imprecises devido as limi-taes dos equipamentos e as dificuldades de assinalamento paramolculas estruturalmente complexas.

RMN EM DUAS DIMENSESNo to difundida quanto obter espectros 1D de compostos

orgnicos, a prtica de obter espectros em duas dimenses(2D), homo (1H,1H) e heteronucleares (1H,13C)1-7. As tcnicas2D permitem correlacionar hidrognios e/ou carbonos que pos-suam alguma relao escalar (nJH,H, nJC,H, nJC,C )6,7,9 ou espaci-al (H,H- ou H,C-NOE)2,3,6,8 entre si. Desta forma possvelfazer um mapeamento estrutural mais preciso do que utilizan-do somente as tcnicas 1D e dados de possveis compostos

similares da literatura, principalmente na anlise de estruturasmais complexas. No obstante, sempre recomendvel que ousurio de RMN 2D esteja familiarizado com a influncia defatores como eletronegatividade ou anisotropia magntica oucompresso estrica sobre os deslocamentos qumicos e/ouconstantes de acoplamentos6,7,10.

Um resumo das tcnicas 2D mais difundidas mostra-se en-to bastante oportuno:

COSY (homonuclear COrrelation SpectroscopY) comesta tcnica pode-se estabelecer as correlaces entre os hidro-gnios que esto acoplados por 2-3JH,H (acoplamentos geminaise vicinais, mensurveis no espectro 1D) e assim discernir amultiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN1H.Eventualmente, sinais devidos a 4-6JH,H so tambm visveis(acoplamentos a longa distncia, raramente mensurveis noespectro 1D)1-7,9.

COSYLR (COSY for Long Range couplings) uma vari-ante do COSY, mas neste caso, evidenciando as correlaesdevido a acoplamentos longas distncias. Em geral, as corre-laes devidas a acoplamentos 2-3JH,H tambm esto presentesno espectro, mas consideravelmente minimizadas1,5,9.

DQF-COSY (Double Quantum Filter-COSY) outra vari-ante do COSY, sendo que neste caso os sinais da diagonalesto ausentes ou, no mnimo, bastante minimizados. muitotil para observar correlaes de hidrognios com H muitoprximos uns dos outros. Outro fator positivo o de que mui-tas correlaes devido a acoplamentos longas distncias 4-6JH,H ficam visveis1-3,5,7,9.

TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) tem o aspectode um COSY, mas as correlaes envolvem a condioHOmonuclear HArtmann-Hahn (HOHAHA). Em uma visosimplificada, revela correlaes entre hidrognios no necessa-riamente acoplados, mas que possuem um hidrognio vizinhocomum ao qual ambos esto acoplados. uma tcnica muitotil na anlise de compostos que possuem um carbono semhidrognios ou um heterotomo, separando dois subsistemasna mesma molcula1,5.

NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY) tambm tem o aspecto de um COSY, contudo as correlaesenvolvem interaes devidas ao NOE entre os hidrognios queesto espacialmente prximos (em geral, menor do que 4 ).Atravs desta tcnica possvel estabelecer a configurao re-lativa de cada hidrognio na molcula e geralmente a geome-tria molecular como um todo. A mesma informao pode serobtida da difrao de Raio-X, mas apenas para compostos naforma de um slido cristalino1-5,7.

HETCOR (HETeronuclear CORrelation spectroscopy) com este experimento pode-se assinalar os carbonos que contm

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hidrognios, caso j tenham sido assinalados todos os hidrogni-os do espectro de RMN1H, ou vice e versa, pois a tcnica de-pende dos acoplamentos 1JC,H. O espectro apresentado com oeixo horizontal (dimenso F2) correspondendo aos C e o eixovertical (dimenso F1) correspondendo aos H1-3,5-7.

COLOC (COrrelation spectroscopy for LOng-range Cou-plings) o espectro apresentado como um HETCOR contudoas correlaes referem-se aos acoplamentos nJC,H (n > 2). Infe-lizmente os sinais devidos aos 1JC,H esto invariavelmente pre-sentes, o que torna imprescindvel um experimento HETCORprvio. As informaes obtidas das correlaes nJC,H so muitoimportantes em uma determinao estrutural, principalmente paraestabelecer a posio de carbonos no hidrogenados1-3,5.

Apesar das vantagens em termos de informaes estruturaisque as tcnicas 2D tradicionais oferecem, o tempo necessriopara executar certos experimentos, principalmente os heteronu-cleares, sempre foi uma grande limitao. Por exemplo, paraobter um espectro HETCOR e um COLOC em um equipamen-to de 7.05 Tesla (300 MHz para o 1H), de uma amostra de 10mg com massa molecular ~500u, o pesquisador necessitariadispor de, no mnimo, 48h/mquina !

RMN 2D COM DETECO INVERSAA dificuldade bsica em obter os espectros HETCOR e

COLOC, principalmente para amostras diludas, como tambmocorre para um experimento 1D de 13C{1H}, reside no fato deque a deteco feita por intermdio do heteroncleo poucosensvel (deteco direta no canal de 13C, 15N, etc.). Visandocontornar esta limitao, foram criadas tcnicas de pulso 2Dheteronucleares em que a deteco feita por intermdio deum ncleo muito mais sensvel (deteco indireta no canal de1H ou 19F ou 31P). Sequncias de pulsos engenhosas envolven-do transies multiplo-qunticas, denominadas de HMQC(Heteronuclear MultipleQuantum Coherence) e HMBC(Heteronuclear MultipleBond Coherence) substituram entoos recprocos HETCOR e COLOC. Os espectros HMQC e

Figura 1. gs-DQF-COSY (A) e expanso (B) do johnstonol; w = gua, i = impureza. Exemplo de assinalamento na Figura 1A: correlao entre H-4e e H-4a (----). Na Figura 1B, exemplo da determinao da multiplicidade de H-4a, H-1e, H-1a (). Tempo de anlise, T = 13min 18seg.

HMBC so editados com o eixo horizontal (dimenso F2) cor-respondendo aos H e o eixo vertical (dimenso F1) correspon-dendo aos C1,5. No preciso muito esforo para entender avantagem da deteco indireta sobre a direta, apenas umaquesto de sensibilidade!

Para otimizar ainda mais este efeito da deteco indiretaforam criadas sondas inversas. As sondas so acessriospermutveis, que inseridos no vo central dos magnetos, soresponsveis pela emisso da radiofrequncia de excitao bemcomo da deteco do sinal devido a perturbao da amostra.As sondas inversas so construdas de forma que a bobina docanal de 1H fique posicionada como a mais interna, mais pr-xima do tubo contendo a amostra, em relao a outras bobinas(ex. 13C e 2H), tornando mais sensvel a deteco para estencleo. Tecnicamente, a diferena entre uma sonda direta (bo-bina de 13C mais interna) e uma inversa, so apenas alguns mi-lmetros mas, em termos prticos, consegue-se uma economiade vrias horas nas medidas 2D homo e heteronucleares1,5.

RMN 2D COM GRADIENTE DE CAMPO

As sondas inversas podem ainda ser providas de bobinas adi-cionais de gradiente de campo, tornando possvel reduzir ou eli-minar os vrios ciclos de modulao de fase (phase cycling) notransmissor e no receptor de frequncias. Esta modulao defase faz-se necessria para a perfeita coerncia de ordem qunticae cancelamento das ordens no desejadas, nos experimentos 2Dcitados acima. O gradiente de campo conduz a uma seleoquntica muito mais eficiente e em um tempo muito menor. Oespectro gs-2D (gradient selected-2D) quase no possui rudos(artefatos), que so causados justamente pelo cancelamento im-perfeito das ordens qunticas no desejadas usando-se o phasecycling.1-5 As tcnicas homonucleares como COSY1,5,11,COSYLR1,5,11,12, DQF-COSY (ex. Figura 1)1,5,13 e TOCSY1,5,14,bem como as tcnicas heteronucleares HMQC1,5,15 e HMBC (ex.Figura 4)1,5,15, podem todas ser executadas com gradiente decampo. Alm disso vrias tcnicas muito interessantes foram

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estrutural de protenas e carboidratos)1,4,5 e j vem se tornandoindispensveis tambm nas demais reas da Qumica. Para ilus-trar melhor como algumas das tcnicas de RMN 2D envolvendodeteco inversa e gradiente de campo podem ser utilizadas,apresentamos uma anlise estrutural de um composto orgnicomodelo, o johnstonol22. Os vrios aspectos experimentais estodescritos no item Detalhes Tcnicos.

APLICAO NA DETERMINAO ESTRUTURALA frmula molecular C15H21O3Br2Cl (442.9546u) do

johnstonol foi determinada por espectrometria de massa de altaresoluo (EMAR). J a espectroscopia de infravermelho (IV)revelou a presena de grupamento hidroxila e a ausncia deinsaturaes (C=C ou CC ou C=O). O johnstonol um pro-duto natural extrado do molusco marinho Aplysia dactylomela,encontrado inclusive em guas brasileiras, rico em sesquiterpe-nos com esqueleto chamigreno11,22,23. Estes sesquiterpenos socompostos que apresentam estruturas cclicas, bicclicas, etc.,contendo halognios (bromo, cloro) e eventualmente tambminsaturaes, hidroxilas e epxidos. At aqui os dados deixamclaro que o johnstonol formado por quatro ciclos saturados,considerando o grau de insaturao da frmula C15H21O3Br2Cle a inexistncia de anis aromticos, carbonilas, ligaes du-plas ou triplas.

As medidas de RMN foram feitas com uma amostra dejohnstonol a 0.016 mg/mol em 0.6 ml de CDCl3. Do espectrode RMN1H foram extrados todos os H e 2-3JH,H, sendo queeste mostra (veja projeo na dimenso F2 das Figuras 1-4)quatro singletos entre 1.10-1.80 (desprezando-se o sinal em 1.55 devido a gua do solvente e o pequeno sinal em 1.20devido a alguma impureza) cada um destes com rea proporci-onal para trs hidrognios, sugerindo quatro metilas ligadas acarbonos no hidrogenados; multipletos entre 2.00-2.20 comrea total igual a trs; e seis sinais de rea igual a um: singletoem 3.15, dois dubletos em 3.98 e 2.61 e trs duplo dubletosem 4.60, 4.24 e 2.50.

Atravs do espectro gs-DQF-COSY (gs = gradient selected)da Figura 1 podemos estabelecer a origem dos acoplamentosescalares observados nos sinais do espectro de RMN1H. Paraisto basta correlacionar os sinais observados no espectro 2D entrehidrognios com H distintos (veja exemplo na Figura 1A). Coma expanso apresentada na Figura 1B podemos resolver os

Figura 2. HSQC-ED do Johnstonol; w = gua, i = impureza. Contornosem linhas cheias correspondem a grupos CH e CH3 e em linhas pontilha-das a grupos CH2. As retas mostram as relaes 1JC,H. T = 15min 43seg.

Figura 4. gs-HMBC do johnstonol; w = gua, i = impureza. Os des-locamentos qumicos de todos os carbonos esto assinalados no eixode 13C. T = 31min 42seg.

criadas, principalmente as heteronucleares que fundem duas oumais tcnicas 1D/2D num s experimento 2D:

HSQC-ED (Heteronuclear Single Quantum Coherence Editing) tem o aspecto de um HMQC, s que neste casoenvolvendo transies qunticas simples e, alm disso, edita-do com os cruzamentos devidos a grupos CH2 em fase opostaa grupos CH e CH3 como num DEPT135 (ex. Figura 2)1,5,16-20.

HSQC-TOCSY mostra correlaes C,H,H ou seja tem oaspecto de um HSQC mas alm das correlaes C,H h tam-bm correlaes H,H como no TOCSY (ex. Figura 3)1,5,15,16,21.

Figura 3. HSQC-TOCSY do johnstonol; w = gua, i = impureza. Aslinhas identificam as quatro subestruturas do Esquema 1: a(......), b(),c(-..-), d(----). T = 32min 51seg.

Desde o incio da presente dcada os equipamentos de RMNcomerciais podem ser providos de sondas inversas e, mais re-centemente, do sistema de gradiente de campo. So acessriosopcionais, contudo, o ganho em tempo de anlise e variedade deinformaes que se pode obter justifica o investimento. So atu-almente imprescindveis na rea de Bioqumica (determinao

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multipletos entre 2.00-2.20 (dimenso F2) como sendo consti-tudos de trs duplo dubletos com os dois das extremidadesdesdobrados de 14.47 e 13.62 Hz ( 2.18, H-4ax) e 14.52 e12.97 Hz ( 2.07, H-1ax) e o central de 14.52 e 2.82 Hz ( 2.16,H-1eq). O gs-DQF-COSY apresenta ainda trs sinais que envol-vem acoplamentos a longas distncias, mas cujas magnitudesno so mensurveis no espectro de RMN1H : um sinal, bastanteintenso, entre os hidrognios metlicos mais protegidos em 1.12 (H-13) e 1.23 (H-14) mostrando serem metilas ligadas aomesmo carbono e acopladas por 4JH,H ; e dois sinais, de baixaintensidade, dos hidrognios metlicos H-15 ( 1.40) com oshidrognios metnicos em 3.15 (H-10) e 3.98 (H-9) a quatro(4JH,H) e cinco ligaes ( 5JH,H), respectivamente7,9.

O experimento HSQC-ED apresentado na Figura 2 revela quetemos dois carbonos metilnicos (CH2), com dois grupos de si-nais para cada carbono pois os hidrognios correspondentes noso equivalentes; quatro carbonos metlicos (CH3); e quatro car-bonos metnicos (CH). O HSQC-ED (resumido no Quadro 1)revela tambm que o sinal em 2.61 no est ligado a umcarbono, pois no h sinal no 2D e, assim, trata-se de um hidro-gnio hidroxlico que devido troca qumica lenta tem um aco-plamento de 2.31 Hz (3JH,H) com o hidrognio carbinlico H-9em 3.98 (C 74.61). J os deslocamentos qumicos C 59.75(C-10) e H 3.15 (H-10) so caractersticos de um grupo metnicoque faz parte de um anel epxido. No espectro de RMN1H osinal em H 3.15 apresenta-se como um singleto, o que indicaque este hidrognio o nico ligado diretamente a um dos doiscarbonos deste ciclo de trs membros, considerando-se os pa-dres de acoplamentos 2-3JH,H possveis6,7.

O HSQC-TOCSY apresentado na Figura 3 mostra, em um sexperimento, o que foi observado nos experimentos gs-DQFCOSYe HSQC-ED separadamente. Levando-se em considerao as rela-es C,H,H representadas no espectro e os deslocamentos qumi-cos envolvidos, podemos gerar as substruturas a e b que so ne-cessariamente delimitadas por carbonos no hidrogenados, comoilustra o Esquema 1. Seguindo o mesmo raciocnio, com as linhastraadas na Figura 3, podemos isolar outras duas subestruturas, ce d, com ambos os hidrognios metnicos 4.60 (H-5) e 4.24 (H-2) em posio axial levando em conta as constantes deacoplamento de 13.62 e 12.97 Hz, respectivamente.

Determinadas as subestruturas deste sesquiterpeno, resta agoradefinir como estas esto interligadas atravs dos carbonos nohidrogenados. Para isso podemos utilizar o espectro gs-HMBC daFigura 4. Este experimento envolve os acoplamentos nJC,H (com n 2) que so dependentes das distncias e dos ngulos de ligaoentre os ncleos envolvidos.6 Em geral, as intensidades relativasdos sinais no espectro podem ser diretamente relacionadas com asmagnitudes das constantes de acoplamento1,5,24. Como so neces-

srias vrias ampliaes para uma melhor visualizao do gs-HMBC, utilizamos o Quadro 1 para facilitar a anlise dos sinaisobservados no espectro. Partindo-se do subsistema a observa-seque as metilas mais protegidos H-13 e H-14 (H 1.12 e 1.23 )mostram quatro correlaes cada: uma entre eles (C 24.60, C-14,e C 18.19, C-13, respectivamente) e as outras com os carbonosno hidrogenados em C 49.36, 50.43 e 113.40. Destes trs, oprimeiro corresponde ao carbono ao qual C-13 e C-14 esto liga-dos, ou seja C-7 pois este carbono s apresenta correlaes comH-13 e H-14. Acontece que os hidrognios metlicos em H 1.40

QUADRO 1. Resumo dos sinais observados no HSQC-ED e gs-HMQC para o johnstonol.a

/C\/H 4.60/5 4.24/2 3.98/9 3.15/10 2.61/OH 2.50/4e 2.18/4a 2.16/1e 2.07/1a 1.68/12 1.40/15 1.23/14 1.12/1318.19/13 +++ ###21.51/15 ++ ###24.60/14 ### +++31.09/12 ++ ###33.65/1 ### ###45.16/4 ### ### +++49.36/7 +++ +++50.43/6 + +++ ++ +++ ++ +++ +++57.91/2 ### +++ ++ ++ +++59.75/10 + ### +++61.23/11 ++ ++ ++ +++67.88/3 +++ ++ +++ +++74.59/5 ### +++ +++74.61/9 ### ++113.40/8 ++ +++ +++ +++

a (###) sinais do HSQC-ED; intensidades dos sinais do gs-HMBC (+) baixas, (++) mdias, (+++) altas.

Esquema 1. Estrutura final inclundo os H e C (estes entre parnte-ses), obtida conectando-se as subestruturas a-d por meio dos tomoscomuns ( ) e ligaes (---) com base nos principais 2JCH ( )e 3JCH ( ) detectados no gs-HMBC ( , carbonos nohidrogenados).

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As tcnicas inversas com gradiente de campo deixam aindaaberto um grande campo para o desenvolvimento de novassequncias de pulsos, que resultem em experimentos to inte-ressantes como o HSQC-ED e o HSQC-TOCSY aqui apresen-tados. Por exemplo, mesmo fora do presente contexto, valeressaltar o WATERGATE (WATER supression by GrAdient-Tailored Excitation)25,26 como uma eficiente tcnica de supres-so do sinal devido a gua, principalmente quando usada comosolvente em amostras de polissacardeos e protenas1,3,5 e oDOSY (Diffusion-Ordered SpectroscopY) 27,28 que muito tilpara discernir sinais devidos a solutos com coeficientes de di-fuso diferentes em uma mistura.

Apesar de todos estes benefcios, necessrio ter em menteque a amostra a ser analisada deve possuir uma concentraotal que seja possvel obter um bom espectro de 1H em apenasum pulso (ex. > 0.01 g/mol.l utilizando um equipamento de7.05 Tesla - 300 MHz para 1H). Caso contrrio, as tcnicas deRMN 2D usando gradiente de campo no oferecem nenhumavantagem sobre aquelas que empregam o phase cycling, poisas dificuldades sero grandes para qualquer tcnica 2D oumesmo 1D. A concentrao da amostra continua, apesar dasevolues tcnicas, sendo um fator limitante para a determina-o estrutural por RMN. Vale lembrar que para uma anlise deRMN necessita-se de uma concentrao, no mnimo, 10.000vezes maior do que para uma anlise de ultra-violeta (UV).

Em geral, a possibilidade da reduo do tempo de anlise deum experimento de RMN 2D por um fator de dez ou mais, as-sim como o restante das vantagens discutidas acima, significaque em um futuro prximo todos os equipamentos de RMNestaro providos dos acessrios de deteco inversa e gradientede campo. Para muitos laboratrios, a aquisio destes acessri-os para incorporao no equipamento j existente, pode ser feitosem maiores mudanas no hardware. J para aqueles equipa-mentos mais antigos ( > 8 anos), esta mudana pode significar acompleta troca do console, ou seja de quase todo o hardware,tornando-se pouco exeqvel devido ao elevado custo.

DETALHES TCNICOSO johnstonol foi isolado e purificado no Laboratrio de Pro-

dutos Naturais do Instituto de Qumica da UFRJ e apresenta-se

Tabela 1. Deslocamentos qumicos de 1H e 13C, e constantesde acoplamento 2-3JH,H, para o johnstonol.

C H a C H (J/Hz)b1 ax 33.65 2.07 dd (12.97, 14.52)

eq 2.16 dd (2.82, 14.52)2 ax 57.91 4.24 dd (2.82, 12.97)3 67.88 4 ax 45.16 2.18 dd (13.62, 14.47)

eq 2.50 dd (4.59, 14.47)5 ax 74.59 4.60 dd (4.59, 13.62)6 50.43 7 49.36 8 113.40 9 peq 74.61 3.98 d (2.31)

OH 2.61 d (2.31)10 pax 59.75 3.15 s11 61.23 12 12 31.09 1.68 s13 13 18.19 1.12 s14 14 24.60 1.23 s15 15 21.51 1.40 s

a ax = axial, eq = equatorial, peq = pseudo-equatorial, pax =pseudo-axial.b multiplicidades: singleto (s), dubleto (d), e duplo dubleto (dd).

(H-15), do subsistema b, tambm mostram correlao com o car-bono C 50.43 (C-6), bem como os hidrognios em H 3.15 (H-10) e 3.98 (H-9) com o carbono em C 113.40 (C-8). Consequen-temente, podemos fundir a com b em um anel de seis membrosonde, de um lado temos o carbono no hidrogenado maisdesprotegido e do outro o mais protegido. O carbono C-6 (C50.43) tambm mostra correlaes com os hidrognios metilnicosH-1 (H 2.07 e 2.16) e H-4 (H 2.18 e 2.50), sendo portanto umdos pontos de fechamento de outro ciclo. O outro ponto compre-ende o carbono no hidrogenado C-3 em C 67.88, pois os hidro-gnios metlicos em H 1.68 (H-12) mostram correlao com C-3bem como com os carbonos C-2 e C-4 em C 57.91 (c) e 45.16(d). O ltimo ciclo envolve o tomo de oxignio que est ligadoaos dois carbonos mais desprotegidos.

A estrutura molecular est definida e ainda com boas indica-es da estereoqumica oriunda da dependncia angular do aco-plamentos nJH,H e nJC,H com n > 1. Pode-se estabelecer a este-reoqumica relativa atravs das interaes espaciais H,Hobservveis em um experimento NOESY (no realizado comgradiente de campo pois no conduz a uma boa seleoquntica). Neste ponto, altamente recomendvel utilizar mode-los moleculares para visualizar as proximidades espaciais. Emresumo, o experimento revelou que a metila mais protegida H-13 (H 1.12) localiza-se do mesmo lado do ciclo de seis mem-bros que contm a hidroxla, pois h apenas correlaes com H-15 (H 1.40), O-H (H 2.61) e H-10 (H 3.15). Isto indica tam-bm que o hidrognio H-10 ligado ao anel epxido est emposio pseudo-axial e que o hidrognio carbinlico H-9 (H3.98) est em posio pseudo-equatorial, justificando o primeirocomo singleto pois o ngulo diedro no favorvel ao acopla-mento 3JH,H entre ambos ( ~ 90o). A metila H-14 (H 1.23) estdo mesmo lado do ciclo tetraidrofurano, pois h correlaesapenas com H-1ax e H-4ax em H 2.07 e 2.18. A inexistncia decorrelaes da metila H-12 (H 1.68) com H-14, H-2ax e H-5axindica que ela est em posio equatorial em um anel com con-formao bote. Visto que as magnitudes de 3JHax,Hax e 3JHax,Heqdo sistema C-1/C-2 so consideravelmente menores do que parao sistema C-4/C-5, h um ligeira distoro da conformao boteao redor da ligao C1-C2, de forma que a ligao C2-Br nofique eclipsada com a ligao C3-C12.

A Tabela 1 resume os dados de 1H e 13C referentes aojohnstonol. Vale ressaltar que todos os dados de C podem serextrados dos experimentos 2D heteronucleares, conforme foiexemplificado nas Figuras 2-4.

CONSIDERAES FINAISO propsito deste artigo no foi fazer uma discusso exaustiva

da estrutura do johnstonol. A determinao estrutural deste produ-to natural foi apenas uma maneira encontrada para ilustrar, deforma prtica, aspectos gerais e principalmente os avanos tcni-cos que aconteceram na rea de RMN 2D nesta ltima dcada.

O reduzido tempo de anlise dos experimentos 2D e a quali-dade dos espectros so, sem sombra de dvida, as maiores vir-tudes das tcnicas inversas com gradiente de campo. Assim foipara o exemplo do johnstonol, que consumiu um total de1h35min para o gs-DQF-COSY, HSQC-ED, HSQC-TOCSY egs-HMBC, eliminando ainda a necessidade de um espectro decarbono-13 e um de DEPT135 em 1D (para a presente amostranecessita-se respectivamente de 1h30min e 30min, para obteruma razovel relao sinal/rudo nos espectros). Evidentementeno so todos os casos em que se pode abdicar de um espectrode RMN de 13C. No entanto, so muitos os casos em que todauma determinao estrutural e assinalamento dos sinais de hi-drognios e carbonos podem ser conduzidos fazendo-se uso ape-nas de algumas tcnicas gs-2D. uma opo importante paralaboratrios de RMN que possuem condies de executar tcni-cas inversas com gradiente de campo pois, em geral, h maisanlises do que equipamentos disponveis para execut-las.

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como um slido cristalino incolor. As medidas de RMN foramtodas feitas em tubo de 5 mm de dimetro com uma amostra de7.2 mg em 0.6 ml de CDCl3 (12 mg/ml), contendo 0.1% v/v deTMS (referncia), a 303 K e sem rotao (fundamental para 2Dinverso). O equipamento de RMN utilizado nas anlises foi umBRUKER DRX300 (300.13 MHz/1H e 75.47 MHz/13C, a 7.0463Tesla), equipado com sonda inversa multinuclear (1H, 2H, 31P-107Ag) contendo trs bobinas de gradiente (X,Y,Z; mas todos osexperimentos aqui descritos podem ser executados apenas com abobina do eixo Z) e uma unidade geradora de pulsos de gradi-ente de campo de amplitude mxima de 50 gauss/cm para cadaeixo. Nos experimentos 1D (1H) e 2D (1H,1H e 1H,13C) foramutilizadas: para as aquisies, larguras espectrais SWH = 7.7 ppm(determinado no espectro de 1H) e SWC = 160 ppm (estimado),perdodo de relaxao de 1.3s (D1), pulso de 90o para 1H de8.9ms com 6.0dB de potncia ( conveniente calibrar cadaamostra) e para 13C de 14.0ms com 2.0dB de potncia, pulsossenoidais de gradiente de 1ms de durao e 100 ms de recupe-rao; e para os processamentos matrizes de dados de 2048 x1024 (F2 x F1) com zero filling e linear prediction1,5,29,30. To-dos os programas de pulsos e de processamentos foram executa-dos com o software XwinNmr 1.3/9.

gs-DQF-COSY: Foi utilizada na aquisio uma matriz de da-dos de 2048 x 256 com NS = 2 (number of scans ou nmero devarreduras em cada um dos 256 experimentos) e trs pulsos degradiente (PG) de intensidades 10:10:30 gauss/cm por eixo1,5,29,30.

HSQC-ED: Foi utilizada na aquisio uma matriz de dadosde 2048 x 256 com NS = 2 e PG= 40:10:-40:10 gauss/cm emcada eixo, no modo fase sensitivo Echo/Antiecho-TPPI edesacoplado de carbono (GARP)1,5,16-20,29,30.

HSQC-TOCSY: Foi utilizada na aquisio uma matriz dedados de 2048 x 256 com NS = 4 e PG = 40:10:-40:10 gauss/cm em cada eixo, no modo fase sensitivo Echo/Antiecho-TPPI,desacoplado de carbono (GARP) e pulso gaussiano de excita-o de 50ms com spin-lock de 2.5ms e 40 loops para o cicloMLEV-161,5,15,16,21,29,30.

gs-HMBC: Foi utilizada uma matriz de dados de 2048 x128 com NS=8 e PG=25:15:20 na aquisio. Note na Fig. 4que devido ao no desacoplamento de carbono durante aaquisio e ao baixo corte dos sinais 3D para a obteno doscontornos 2D, alguns sinais esto desdobrados de poucos ( 150). O primeiro deve-se a diferena entrea constante de acoplamento mdia utilizada (8 Hz) para omixing time ( a 1/J) e a real, que maior, resultando em umdubleto de magnitude nJC,H. O segundo deve-se a imperfeiesdo filtro quntico (low pass filter) utilizado para eliminar osacoplamentos 1JC,H, e que no deve ser confundido com sinaisdevidos a nJC,H1,5,15,24,29,30.

NOESY: Foi utilizada uma matriz de dados de 2048 x 256com NS=32, com tempo de mistura (mixing time) de 1.0s, nomodo fase sensitivo usando TPPI. necessrio otimizar o tem-po de evoluo dos spins (tempo de mistura), que dependen-te do tempo de relaxao T1 (pode ser estimado por um rpidoexperimento de inverso-recuperao)1,2,3,5,29,30.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, CAPES, FINEP-PADCT I, FUJB e FAPERJ pe-los auxlios financeiros recebidos. Em especial a Dra. Liane F.Pitombo pela amostra de johnstonol e ao Prof. Angelo da Cu-nha Pinto pela reviso e comentrios sobre o texto.

REFERNCIAS

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