Gustavo Garcia

Luiz Gustavo Gardinassi

Thais Herrero

pDCs play off scratch

Modelo de desenvolvimento das células dendríticas

Função das células dendríticas

Subpopulações de Células Dendríticas

CD45+

LC- células de Langerhans

IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas.

PDC- células dendríticas plasmocitóides

CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3

RT-PCR

J. Exp. Med- September 17, 2001

Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)

Importância da produção dos IFNs do tipo 1

•Expressam TLR7 e TLR9

•Produz grande quantidade de interferons tipo 1

•pDC são população de células circulantes

• Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada

LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina

Controle da infecção/lesão Autoimunidade

Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides

(pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?

Derme Quantificação das células dérmicas

Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?

Assim,  lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de

pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?

Pele total (0, 6, 24, 48 e

72h)

Análise da expressão gênica por Real-time PCR

As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas

inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as

pDCs.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?

48hs

24hs

2 Acs (PDCA1 e

mAb 927) ou IgG como controle antes da

lesão

48hs

24hs

Acs (anti-Ly6C) ou IgG

como controle antes da

lesão

24h

Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de

pDCs.

Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β?

MyD88 -/-

Pele total (24h)

Análise da expressão gênica por

Real-time PCR

Lesão

IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg)

Lesão Pele total (24h)Análise da

expressão gênica por real-time

PCR

As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele?

Pele total (0, 6, 24, 48 e

72h)

Análise da expressão de catelecidina

(CRAMP) por Real-time PCR

pDCs do baço

Overnight

• DNA

• CRAMP

• CRAMP+DNA

• scCRAMP+DNA

• scCRAMP

ELISA

Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos

nucléicos próprios.

As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo?

CRAMP

scCRAMP

Salina

Pele total (0, 24 e 48h)

• FACs

• Real-time PCR

Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de

pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.

Pele total (24h)Análise da

expressão gênica por Real-time PCR

Com ou sem lesão

CRAMP -/-

As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada?

Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da

tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs

na pele danificada.

As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada?

2 Acs (PDCA1 e

mAb 927) ou IgG como controle antes da

lesão

Pele total (24h)Citocinas

inflamatórias por Real-time PCR

Com ou sem lesão

Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17

As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada?

Pele com lesão Análise da expressão de Keratina 6 (K6)

Imunofluorescência

Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada

desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida

reepitelização da lesão.

Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo?

IFNAR -/-

Pele com lesão Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR

Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta

inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada

por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?

Biópsias antes e 24h depois da lesão

7 voluntários

• Fita adesivaImunoistoquímica para

BDCA2 (marcador específico de pDCs

humana) e Real-time PCR

Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e

produziram IFN-α na pele danificada.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?

Biópsias antes e 24h depois da lesão

7 voluntários

• Lauril sulfato de sódio (SLS)

Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs

humana)

Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu

uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA

de IFN-α na pele danificada.

Conclusão

Controle da infecção/reparo tecidual

Objetivo:Investigar o papel das pDCs na inflamção da

pele de indivíduos suscetíveis a doença autoimune

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?

Linhagem 129

Tape stripping

24hCitometria de fluxo

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?

Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde pDCs produzem IFN- e neutrófilos produzem NETs.

Linhagem 129

Tape stripping

24hImunomarcação

INFAR-/- ou WT

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

Os IFN tipo I atuam na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada?

A indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada envolve a sinalização via

TLR?MyD88-/- ou WT

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios demonstra um importante papel da

sinalização via TLR.

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de genes pró-inflamatórios na

pele lesionada?IRS 954

Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças na expressão de genes pró-inflamatórios na

pele danificada.

pDC e Neutrófilos são necessários para a indução de genes pró-inflamatórios na pele

lesionada?

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCRAnti-120G8

Anti-GR1-Ly-6GWT

pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes pró-inflamatórios, porém promovem respostas

inflamatórias diferentes.

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele

lesionada?Tape

stripping

1, 4, 20d

Real Time PCRQuant. Lesão abertaHistologia

(NZBxNZW)F1

C57/BL6129

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele

lesionada?

Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvem lesões crônicas na pele, semelhantes a lesões observadas em CLE

de humanos.

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões

cutâneas?

Tape stripping

15-23d Quant. Lesão

aberta

(NZBxNZW)F1

Anti-120G8 ouIRS 954

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões

cutâneas?

As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto durante a inflamação, resultam em uma

melhora da cicatrização.

Tape stripping

15-23d Quant. Lesão

abertaHistologia

(NZBxNZW)F14d

IRS 954

Conclusão

AutoimunidadeControle da infecção/reparo tecidual

?

Doença

Exacerbação da lesão