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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO PROGRAMA DE DOUTORADO EM BIOTECNOLOGIA E
INOVAÇÃO EM SAÚDE
GUSTAVO ALVES ANDRADE DOS SANTOS
A UTILIZAÇÃO DE BIOMARCADORES NA DOENÇA DE ALZHEIMER
SÃO PAULO – SP 2016
GUSTAVO ALVES ANDRADE DOS SANTOS
BIOMARCADORES NA DOENÇA DE ALZHEIMER
Dissertação apresentada ao Programa de Doutorado em Biotecnologia e Inovação em Saúde, da Universidade Anhanguera de São Paulo, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia e Inovação em Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Niraldo Paulino
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Celso Pardi
SÃO PAULO
2016
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado a um grupo seleto de pessoas, sem as quais eu sequer
teria sonhado com os objetivos alcançados.
A minha companheira, eterno estímulo em todos os momentos, Cláudia, e a nossa
maior obra, Gabriela, um pedacinho de mim.
Meus pais, João e Belmira, que desde cedo, me deram toda a estrutura possível
para que eu ousasse me tornar um agente do conhecimento.
A todas as pessoas que fizeram e fazem parte da minha vida, meus amigos e
amigas, meus professores, fonte de inspiração, meus alunos, que tornam meus dias
cada vez mais felizes.
E a nosso Criador, que me deu a oportunidade de viver mais este momento.
AGRADECIMENTOS
Meu fiel amigo, incansável, sábio, determinado e para minha alegria, meu
orientador, Paulo Pardi. Sempre esteve comigo.
Prof. Niraldo Paulino, também meu orientador, pela excelência e
conhecimento, mas principalmente pelo acolhimento que me deu em momento tão
difícil, demonstrando grande caráter.
Aos voluntários da pesquisa e seus familiares, pela compreensão e carinho,
dando-nos várias lições sobre a vida e dignidade humana.
Dra. Maria Rita Aprile, receptiva e fundamental para as investigações clínicas.
Dr. Roberto Gomes de Azevedo e Dr. Miguel Angel Claros Paz, geriatras de
Cuiabá, extremamente generosos e colaboradores nesta pesquisa.
Sr. Hercílio Soares e o grupo de idosos da cidade de Louveira-SP.
Nos bastidores, foram muitos os atores que tiveram talvez participações
curtas, mas indispensáveis. A eles expresso também minha gratidão e respeito:
Caroline Dominguez, Cinthia Tavares, Dra. Andrea Bastos, Dr. Anderson Soares
Souza, Jussara Gois, Ricardo Gil, Juliana Souza e o enfermeiro Ruirez.
Dr. Ângelo Sória Pedersini do Neolabor Laboratórios.
Ao laboratório LEAC, pelo alto grau de competência técnica nas análises
necessárias.
Ao Senac Tiradentes, especialmente representado pela Rejane Bertuzzi, Ana
Beatriz Destrutti, e Silvana Aparecida de Lazari Rosa.
Aos membros do colegiado do Programa do Doutorado em Biotecnologia da
Universidade Anhanguera, pelo acolhimento e apoio, e principalmente às criticas,
essenciais para meu aprendizado.
“Só se vê bem com o coração, o essencial é invisível aos olhos”
Antoine de Saint-Exupéry
RESUMO
A utilização de biomarcadores na doença de Alzheime r
A ciência tem buscado nos últimos anos elucidar várias questões relacionadas
a Doença de Alzheimer (DA), sendo o diagnóstico o ponto mais investigado. As
hipóteses atualmente consideradas como causas mais prováveis para a DA,
são a deposição do peptídeo beta amiloide (Aβ) no córtex cerebral e a
hiperfosforilação da proteína Tau, com a consequente formação dos
emaranhados neurofibrilares (ENF). Na clínica, embora não seja preciso, o
diagnóstico baseia-se na exclusão de outras doenças, além de avaliações
comportamentais e exames complementares, como imagem e hematológicos.
Os avanços no campo da biotecnologia trouxeram perspectivas animadoras
para a possibilidade de detecção precoce da DA através da avaliação de
biomarcadores, considerados procedimentos mais seguros e eficientes. As
moléculas reconhecidas como biomarcadores podem ser expressas em alguns
fluídos corporais, com especial atenção para o líquido cefalorraquidiano (LCR),
saliva e sangue. A saliva tem a presença confirmada de Aβ e Tau, material
biológico de fácil coleta, com custo acessível e sem risco de invasividade. No
sangue são identificados outros marcadores ligados a processos patológicos
que podem estar correlacionados com a DA, como distúrbios tireoidianos e
colesterol, dentre outros. O trabalho teve como objetivo investigar e analisar as
concentrações de Aβ e Tau na saliva de pacientes com DA (=39) confirmada e
de indivíduos pertencentes ao grupo de inclusão, porém sem a DA (n=56),
juntamente com análises bioquímicas e hematológicas dos dois grupos.
Nossos resultados demonstraram que pode haver relação direta entre níveis
baixos de triiodotironina (T3) associados à maior probabilidade de DA, mesmo
com TSH em níveis parecidos; além de valores alterados de hemoglobina e
vitamina B12 para pacientes com DA, confirmando as diretrizes de alguns
protocolos clínicos. As análises de Aβ e Tau na saliva dos participantes
demonstraram redução de t-Tau e aumento de Aβ42 nos doentes, quando
comparada aos sadios, dados semelhantes aos descritos na literatura. Existem
muitos trabalhos voltados para a análise de Tau e Aβ no LCR, porém são
escassas as mesmas análises quando se trata de saliva. Desta forma, a partir
dos resultados observados no presente estudo, sugerimos continuidade nas
pesquisas, as quais poderão contribuir para o diagnóstico preciso e preditivo da
DA.
Palavras chave: biomarcadores, diagnóstico, Doença de Alzheimer.
ABSTRACT
Science has sought in recent years to elucidate various issues related to Alzheimer's
disease (AD), and the diagnosis was the most investigated point. The hypothesis
currently considered as the most probable cause for AD are the deposition of amyloid
beta peptide (Aβ) in cortex and hyperphosphorylation of Tau protein, with the
consequent formation of neurofibrillary tangles (NFT). In practice, although not
required, the diagnosis is based on exclusion of other diseases, as well as behavioral
and laboratory tests assessments, such as image and haematological. Advances in
biotechnology have brought encouraging prospects for the possibility of early
detection of AD by evaluating biomarkers, considered safer and more efficient
procedures. Molecules recognized as biomarkers can be expressed in some body
fluids, with special attention to the cerebrospinal fluid (CSF), saliva and blood. In
saliva has confirmed the presence of Aβ and tau, biological material easy collection,
affordably and without risk of invasiveness. In the blood are identified markers linked
to other pathological processes that may be correlated with AD, such as thyroid
disorders and cholesterol, among others. The study aimed to investigate and analyze
the concentrations of Aβ and tau in the saliva of patients (= 39) confirmed and
individuals belonging to the inclusion group, but without AD (n = 56), along with
biochemical and haematological the two groups. Our results showed that there may
be a direct relationship between low levels of triiodothyronine (T3) associated with
increased likelihood of AD, even with TSH at similar levels; plus abnormal values of
hemoglobin and vitamin B12 for patients with AD, confirming the guidelines of some
clinical protocols. Analyses of Aβ and tau in the saliva of the participants
demonstrated a reduction of t-Tau and Ab42 increase in patients compared to
healthy, data similar to those described in the literature. There are many studies
related to the Tau and Aß analysis in CSF, but are rarely the same analysis when it
comes to saliva. Finally, from the results observed in this study we suggest continuity
of research, which may contribute to the accurate and predictive diagnosis of AD.
Keywords: biomarkers, diagnosis, Alzheimer's disease.
SUMÁRIO
1. INTRODUCAO ................................................................................................. 14
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................. 15
2.1. DOENÇA DE ALZHEIMER – ASPECTOS GERAIS
................................................................................................. 15
2.2 CONCEITOS E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
................................................................................................. 16
2.3 DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL
................................................................................................. 19
2.4 PROCESSO FISIOPATOLÓGICO DA DA.
.
................................................................................................. 22
2.4.1 PROTEÍNA TAU ................................................................................................. 27
2.4.2 PEPTÍDEO BETA AMILOIDE (AΒ) ................................................................................................. 31
2.5 BIOMARCADORES ................................................................................................. 37
2.5.1 SALIVA ................................................................................................. 45
2.5.2 SANGUE ................................................................................................. 48
3. OBJETIVOS ................................................................................................. 51
3.1 GERAIS ................................................................................................. 51
3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................. 51
4. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 51
5. METODOLOGIA ................................................................................................. 52
5.1 ASPECTOS LEGAIS DA PESQUISA ................................................................................................. 52
5.1.1 GRUPOS DE PACIENTES ................................................................................................. 53
5.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
................................................................................................. 54
5.3 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
................................................................................................. 55
5.4 ANÁLISES BIOLÓGICAS ................................................................................................. 55
5.4.1. ANÁLISE DA SALIVA ................................................................................................. 55
5.4.2. ANÁLISES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS
................................................................................................. 58
5.4.3. FINANCIAMENTO ................................................................................................. 59
5.4.4. RISCOS E BENEFÍCIOS ................................................................................................. 59
6. RESULTADOS ................................................................................................. 61
6.1. GÊNERO E IDADE DOS PARTICIPANTES
................................................................................................ 61
6.2RESULTADOS HEMATOLOGIA E BIOQUÍMICA
................................................................................................ 64
6.3 RESULTADOS NA SALIVA ................................................................................................ 65
7. DISCUSSÃO ................................................................................................ 68
8. CONCLUSÕES ................................................................................................ 77
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 78 ANEXO 1 - Centro de Geriatria do
Mato Grosso ................................................................................................ 96
ANEXO 2 - Programa de Mestrado
profissional em reabilitação ................................................................................................ 97
ANEXO 3 - Portaria 1298 –
Ministério da Saúde ................................................................................................ 98
ANEXO 4 - Termo de
Consentimento livre e esclarecido ................................................................................................ 99
TABELAS TABELA 1 – Média das idades dos pacientes
................................................................................................ 62
TABELA 2 – Hematologia ................................................................................................ 64 TABELA 3 – Bioquímica ................................................................................................ 65 GRÁFICOS GRÁFICO 1 – Media de idade dos pacientes
................................................................................................ 61
GRÁFICO 2 – Diferença de gênero – pacientes D.A.
................................................................................................ 62
GRÁFICO 3 – Diferença de gêneros – pacientes sadios
................................................................................................ 63
GRÁFICO 4 – Concentração de t-tau na saliva dos pacientes sadios e pacientes de D.A.
................................................................................................ 67
GRÁFICO 5 – Concentração de ab40 na saliva de pacientes sadios e pacientes com D.A.
................................................................................................ 67
FIGURAS FIGURA 1 - Comparação entre Córtex e hipocampo de indivíduo com DA e indivíduo normal
................................................................................................ 24
FIGURA 2 - Cascata de eventos da Doença de Alzheimer
................................................................................................ 27
FIGURA 3 - Dinâmica microtubular comprometida
................................................................................................ 31
FIGURA 4 - Efeitos tóxicos sinápticos da Aβ
................................................................................................ 35
FIGURA 5 - Funções neuronais da ApoE ................................................................................................ 37 FIGURA 6 - Localização dos marcadores plasmáticos e neurológicos na DA
................................................................................................ 40
FIGURA 7 - Salivette® para coleta de saliva
................................................................................................ 55
FIGURA 8 - Representação de um kit para pesquisa de Aβ42, empresa Thermo Fisher Scientific
................................................................................................ 58
QUADRO QUADRO 1 - Critérios de diagnóstico para a DA no Brasil
................................................................................................ 21
QUADRO 2 - Marcadores periféricos para DA
................................................................................................ 38
QUADRO 3 - Distribuição de pacientes sadios e portadores de DA
................................................................................................ 63
QUADRO 4- Benefícios potenciais do diagnóstico precoce da Doença de Alzheimer
................................................................................................ 68
LISTA DE ABRAVIATURAS AA
.................................................................. AMINOÁCIDOS
AChE .................................................................. ACETILCOLINESTERASE
ADDF .................................................................. ALZHEIMER´S DRUG DISCOVERY FOUNDATION
ADRDA .................................................................. ALZHEIMER DISEASE AND RELATED DISORDERS ASSOCIATION
AIDS .................................................................. ACQUIRED IMUNE DEFICIENCY SYNDROME
ALT .................................................................. ALANINA AMINOTRANSFERASE
AMPA .................................................................. ÁCIDO Α-AMINO-3-HYDROXI-5-METIL-4-ISOXAZOLEPROPIONICO
APLP1 .................................................................. PROTEÍNA PRECURSORA DE AMILOIDE-LIKE 1
APLP2 .................................................................. PROTEÍNA PRECURSORA DE AMILOIDE-LIKE 2
ApoE .................................................................. APOLIPROTEÍNA E APP .................................................................. PROTEÍNA PRECURSORA DE AMILOIDE
APP .................................................................. AMYLOID PRECURSOR PROTEIN
APPL .................................................................. PROTEÍNA PRECURSORA DE AMILOIDE-LIKE
AST .................................................................. ASPARTATO AMINOTRANSFERASE Aβ .................................................................. PEPTÍDEO BETA-AMILOIDE
Aβ40 .................................................................. PEPTÍDEO BETA-AMILOIDE COM CADEIA DE 40 AMINOÁCIDOS
Aβ42 .................................................................. PEPTÍDEO BETA-AMILOIDE COM CADEIA DE 42 AMINOÁCIDOS
BuChE .................................................................. BUTIRILCOLINESTERASE
CCL .................................................................. COMPROMETIMENTO COGNITIVO LEVE
CNS .................................................................. CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE COX-2 .................................................................. CICLOOXIGENASE-2 CRP .................................................................. PROTEÍNA PLASMÁTICA C REATIVA DA .................................................................. DOENÇA DE ALZHEIMER DFT .................................................................. DEMÊNCIA FRONTO TEMPORAL DP .................................................................. DOENÇA DE PARKINSON
ECE-2 .................................................................. ENZIMA CONVERSORA DE ENDOTELINA
14
1. INTRODUÇÃO
A incidência de casos de Doença de Alzheimer (DA) aumentou de forma expressiva
nas últimas décadas, posicionando esta demência na escala mundial, dentre as doenças
neurodegenerativas, mais comum (AREVALO-RODRIGUEZ et al, 2013). Estima-se que
atualmente cerca de 35,6 milhões de pessoas convivam com esta doença, número que deverá
dobrar nos próximos 20 anos, atingindo a marca de 65,7 milhões em 2030 (WIMO;
WINBLAD; JONSSON, 2010).
O tempo de sobrevida após o diagnóstico da DA vai depender fundamentalmente do
momento em que foi realizado o seu diagnóstico. Na média, pacientes com DA sobrevivem
entre 8,3 anos, para diagnóstico próximo aos 65 anos de idade, e apenas 3,4 anos, se realizado
após os 90 anos, impactando respectivamente, em uma redução de 67 a 39% na expectativa de
vida (BROOKMEYER et al, 2002).
Em 2008, o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) previu que o número
de idoso em 2030 chegará a 30 milhões no Brasil, o que é um fator preocupante para as
autoridades de saúde pública, não só brasileira, mas de vários países, pois, a DA acomete em
sua absoluta maioria, indivíduos idosos
O principal desafio para a ciência, no que se refere à DA, reside na busca de
diagnóstico preditivo e especialmente mais preciso. Atualmente o diagnóstico para DA baseia-
se em avaliação clínica completa, que inclui testes de comportamento e de avaliação
psiquiátrica, além de exames de sangue e imagem (ALZHEIMER´S ASSOCIATION, 2016).
Entretanto, dos métodos atualmente utilizados nenhum consegue prever com exatidão
a DA, além disso, não é possível prever com antecedência o risco de surgimento da doença,
15
isto é, sua fase prodrômica.
Os pesquisadores têm buscado investigar técnicas mais precisas para a detecção da
DA, com especial destaque para os biomarcadores, os quais podem indicar a possibilidade do
surgimento desta doença.
Dentre os biomarcadores investigados, destacam-se a proteína Tau e o Aβ, ambos
encontrados no líquido cefalorraquidiano (LCR) (TAPIOLA et al, 2009).
Nosso trabalho se propõe à detecção dos níveis de proteína Tau e Beta Amilóide nas
salivas de pacientes com diagnóstico confirmado de DA, em comparação a pacientes sem a
doença, porém pertencentes ao grupo de inclusão.
Além disso, serão avaliados outros parâmetros plasmáticos de interesse para a análise
da relação de previsibilidade do surgimento da DA.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. DOENÇA DE ALZHEIMER – ASPECTOS GERAIS
A doença de Alzheimer (DA) foi apresentada pela primeira vez pelo psiquiatra e
neuropatologista, alemão, Alois Alzheimer em novembro de 1906 no 37º Encontro de
psiquiatras do Sudeste da Alemanha, dando origem a uma das descobertas mais importantes
da Medicina do mundo moderno. O caso descrito como: “Uma Doença peculiar dos
neurônios do córtex cerebral” era de sua paciente, Auguste D., 50 anos, que segundo dados
coletados de sua ficha clínica, passou a apresentar déficits cognitivos, perda de memória,
confusão entre tempo e espaço, com piora progressiva, levando-a a morte cinco anos depois.
Alois Alzheimer identificou em necropsia, no tecido cerebral desta paciente, a presença de
16
placas distintas e emaranhados neurofibrilares (MAURER et al, 1997; MAURER, 1998;
SCHACHTER; DAVIS, 2000; ALZHEIMER, 1907).
Entre 1906 e 1910, Emil Kraepelin, psiquiatra também de origem alemã, nomeou a
nova patologia como Doença de Alzheimer (DA) em homenagem a Alois Alzheimer. Assim, o
termo passou a ser utilizado para os casos deste tipo de demência, que poderiam acometer
também, pacientes pré-senis, ou seja, antes dos 65 anos (CARAMELLI, 2006).
Durante quase 90 anos o estudo realizado por Alois Alzheimer, com a paciente August
D., permaneceu intacto; sem qualquer tipo de evolução quanto às pesquisas, e as informações
quase foram perdidas dentro do Hospital Clínico de Frankfurt. Apenas em 1995, Konrad
Maurer, professor de psiquiatria da Universidade Alemã de Frankfurt, encontrou o prontuário
da paciente, dando início a novos estudos, mais específicos, para melhor compreensão da
etiologia e diagnóstico da DA (MENTAL HEALTH, 2007).
2.2 CONCEITOS E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
A DA é a forma mais comum de demência, contribuindo provavelmente com 60 a 70%
dos casos registrados. Outros tipos de demência incluem: demência vascular, demência com
corpos de Lewy, e um grupo de doenças que contribuem para a demência fronto-temporal. As
fronteiras entre os subtipos são indistintas e muitas vezes podem coexistir (WORLD
ALZHEIMER REPORT 2009).
Demência é uma síndrome caracterizada pela perturbação de múltiplas funções
cerebrais, incluindo memória, orientação do pensamento, compreensão, cálculo, capacidade
de aprendizagem, fala e julgamento. O prejuízo das funções cognitivas é normalmente
acompanhado, e ocasionalmente precedido, pela deterioração do controle emocional,
17
comportamento social e/ou motivação (WHO, 2008; ISCDRHP, 1992).
O termo demência descreve várias desordens neurovegetativas relacionadas à cognição
como a DA, a demência vascular e outras (SWANSON, 2007).
Demência é uma das mais incapacitantes doenças que afligem os idosos, com
escalonamento emocional e impacto econômico importante (NAGARAJA; SRIKANTH,
2005).
O aumento da longevidade em todo o mundo tem despertado a atenção e a
preocupação das autoridades de saúde, pois traz como principal viés o risco de maior
ocorrência de doenças como a DA, que é estritamente ligada ao avanço da idade. O
envelhecimento com qualidade de vida passa a ser o principal objetivo dos sistemas de saúde,
tendo como pontos fundamentais a prevenção, o diagnóstico preciso e a detecção precoce de
algumas patologias. No caso da DA, prioriza-se a qualidade de vida; portanto, quanto mais
cedo for realizado o diagnóstico, melhores serão as condições de tratamento e as
possibilidades de retardar o avanço da doença.
As previsões quanto ao avanço da DA no mundo inteiro, apontam para uma evolução
rápida e preocupante, visto que não existe, ainda, nenhuma terapia medicamentosa capaz de
deter o seu avanço.
Em idosos a prevalência de DA aumenta de forma exponencial, passando de 1% aos
65 anos para algo em torno de 50% aos 95 anos de idade (WANG; DING, 2008).
Nos Estados Unidos da América (EUA), a previsão é que em 2025 serão 7,1 milhões
de doentes com DA, com idade igual ou maior que 65 anos de idade, representando um
aumento de 40% nos atuais cinco milhões de americanos com DA (HEBERT LE et al, 2013).
18
Para o ano de 2050 estima-se que este número quase triplique, chegando a 13,8
milhões de casos (HEBERT LE et al, 2003).
Dados recentes apontam que nos Estados Unidos a cada 67 segundos, uma pessoa
desenvolve a doença (ALZHEIMER´S ASSOCIATION, 2015).
Estima-se que no Brasil a taxa de DA seja de 7,7 por 1000 pessoas ao ano, em
indivíduos com mais de 65 anos. A cada cinco anos esta taxa praticamente dobra, sendo que
as mulheres apresentam maior incidência, principalmente se tiverem idades mais elevadas
(NITRINI et al, 2004).
Na América Latina a taxa de prevalência da demência é 7,1%. O número de portadores
de DA no Brasil é estimado atualmente em 1,2 milhões de pessoas, com cerca de 100 mil
novos casos a cada ano; entretanto, acredita-se que este número possa ser ainda maior, visto
que o número de subnotificações é grande (IBGE, 2012; WHO, 2012).
Ainda sobre as projeções para o número de idosos no Brasil, é importante lembrar que
a proporção de indivíduos com idade igual ou superior a 60 anos, que representava 6% da
população em 1975, passou para 7,9% em 2000 e com expectativa de 15,4 para 2025
(IZQUIERDO, 2002).
O impacto econômico desta doença apresenta números impressionantes ainda que, no
Brasil não se disponha deste tipo de informação, nos Estados Unidos os valores gastos para
cada paciente com DA somam 174 mil dólares e os custos diretos e indiretos causados pela
DA, representam para a economia, norte americana, um custo aproximado de 100 bilhões de
dólares por ano (SQUIRE & KANDEL, 2000; NITRINI et al, 2002).
19
2.3 DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL
O paciente diagnosticado com DA apresenta algumas características típicas,
entretanto, cada indivíduo é afetado pela doença de forma diferente. O sintoma inicial mais
comum é o agravamento da incapacidade de se recordar de novas informações. De forma
geral, segundo a Alzheimer’s Association, 2014, os sintomas mais comuns da DA são:
• Sintomas clínicos precoces - Dificuldade em lembrar conversas recentes,
lugares, nomes ou eventos, apatia e depressão.
• Sintomas tardios – comunicação prejudicada, desorientação, confusão mental,
julgamento alterado, alterações de humor e personalidade; e em última análise,
dificuldade para falar, engolir e andar.
A DA caracteriza-se pelo déficit de memória e comprometimento cognitivo,
acometendo principalmente pacientes idosos acima de 65 anos (SERENIKI; VITAL, 2008).
Brooks e Bastouly (2004) afirmam que o diagnóstico para a DA pode ser definido
como uma questão de julgamento clínico, obtido a partir de uma história cuidadosa e um
exame criterioso do estado mental, devendo-se excluir outras causas que levem à demência.
Citam além da avaliação do MEEM (Mini Exame do Estado Mental):
• Exame de LCR para detecção do peptídeo amilóide e da proteína Tau
• Tomografia computadorizada
• Eletroencefalograma
• Presença do alelo APOE4
• Procura-se excluir outras patologias e para tanto, alguns exames podem dar
suporte para esta conclusão:
20
• Hemograma completo
• VHS
• Ureia, creatinina
• Cálcio
• Funções hepáticas
• Níveis séricos de vitamina B12
• Folato
• Função tireoidiana
• Sorologia para sífilis
• RX do tórax
• Tomografia computadorizada sem contraste
No Brasil, a Portaria 1298 do Ministério da Saúde (2013) estabeleceu "Protocolos
Clínicos, e Diretrizes Terapêuticas" para a DA, e trouxe critérios de diagnóstico, critérios de
inclusão e exclusão, além de tratamentos e mecanismo de regulação. Quanto ao diagnóstico
alguns pontos importantes mencionados pelo documento ministerial são expressos no quadro
1:
21
QUADRO 1 – Critérios de diagnóstico para a DA no Brasil (adaptado: Ministério da Saúde, 2010).
1. Diagnóstico Clínico
1.2 Diagnóstico de DA deve ser feito por exclusão.
1.3 Avaliação de depressão e exames de laboratório com ênfase na função da tireoide e níveis
séricos da vitamina B12.
1.4 Em pacientes que apresentem problemas de memória, deve ser baseado na identificação de
modificações cognitivas específicas, conforme descrito nos critérios do National Institute of
Neurologic and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer Disease and Related
Disorders Association (NINCDS-ADRDA).
1.5 Exames físicos e neurológicos cuidadosos, acompanhados de avaliação do estado mental para
identificar os déficits de memória, linguagem e viso-espaciais deverão ser realizados.
1.6 Demais sintomas cognitivos e não-cognitivos são fundamentais na avaliação do paciente com
suspeita de demência.
2. Diagnóstico diferencial
2.1 Rastreamentos de depressão, por ser considerada comorbidade comum em pacientes com
demência.
2.2 Doseamento de Vitamina B12.
2.3 Avaliação quanto a hipotireoidismo.
2.4 Tomografia computadorizada (TC) ou Ressonância nuclear magnética (RNM) para exclusão de
lesões estruturais.
2.5 Avaliação da história completa do paciente.
2.6 Avaliação clínica da demência, rastreio pelo MEEM.
2.7 Exames laboratoriais – hemograma, eletrólitos, glicemia, ureia e creatinina, TSH, ALT/AST,
sorologia sérica para sífilis (VDRL), eletrocardiografia, radiografia de tórax e imagem cerebral (TC
sem contraste ou RNM). O diagnóstico definitivo de DA só pode ser realizado por necropsia, com
identificação do número apropriado de placas e enovelados em regiões específicas do cérebro, na
presença de história clínica relacionada à demência. A biopsia não é recomendada como diagnóstico.
22
O consenso brasileiro exige mais exames do que o americano, devido ao perfil da
população brasileira e sua miscigenação. O exame deve ser realizado com auxílio de um
familiar ou cuidador, visa-se identificar comprometimentos presentes na memória, linguagem
e habilidades, coordenação motora e visual e pensamentos abstratos (APRAHAMIAN et al,
2009).
Apesar de todos os estudos realizados, o diagnóstico de Alzheimer ainda é obtido sob
a forma de hipótese, baseando-se fortemente, dentre alguns critérios, nas avaliações
comportamentais. A avaliação cognitiva pode ser iniciada com testes rápidos de rastreio,
como MEEM. Posteriormente é complementado com outros testes de memória, como o teste
do desenho do relógio. Em adição, o diagnóstico de demência se baseia na presença de déficit
de memória e outras funções como linguagem, capacidade de reconhecer objetos, organização
e capacidade de planejamento (NITRINI et al, 2005).
2.4 PROCESSO FISIOPATOLÓGICO DA DA.
A Doença de Alzheimer é uma patologia neurodegenerativa complexa com
características histológicas típicas, incluindo placas neuríticas, emaranhados neurofibrilares, e
uma variedade de déficits neuroquímicos que afetam os sistemas serotoninérgicos,
noradrenérgicos e colinérgicos (CUMMINGS, 2000).
Na DA, do ponto de vista histopatológico, ocorre maciça perda sináptica e morte
neuronal observada principalmente nas regiões cerebrais responsáveis pelas funções
cognitivas, destacando-se o córtex cerebral, o hipocampo, o estriado ventral e também o
córtex entorrinal. Além das características citadas, nos pacientes acometidos pela DA,
23
algumas mudanças orgânicas são marcantes, dentre as quais podemos destacar
(SELKOE, 2001):
• Depósitos fibrilares amiloidais localizados nas paredes dos vasos sanguíneos,
relacionados a uma variedade de diferentes tipos de placas senis.
• Formação de emaranhados neurofibrilares como resultado do acúmulo de
filamentos anormais da proteína Tau.
• Ativação da glia.
• Inflamação.
A DA está relacionada com a formação de placas senis ou amiloides no tecido
cerebral. Essas placas consistem em agregados de peptídeo amiloide, resíduos de ácidos
derivados de Proteínas Precursoras da Amiloide (PPA) e agregados intracelulares de Proteínas
Tau, formando emaranhados Neurofibrilares (ENF). Como consequência da formação destas
placas ocorre destruição sináptica e morte neuronal (SERENIKI; VITAL, 2008).
24
Se comparados córtex e hipocampo de um indivíduo com DA frente a um indivíduo
normal, na DA ocorre importante perda neuronal, com grande redução de sinapses, atrofia
cortical e hipocampal, além da dilatação dos ventrículos - possível de ser visualizada
macroscopicamente (figura 1).
Figura 1 – Comparação entre Córtex e hipocampo de indivíduo com DA e indivíduo normal. Fonte: modificado de http://anatpat.unicamp.br/bineualzheimer.html - acessado dia 10/01/2016 _às 23h: 54min.
Na DA ocorrem alterações nos sistemas de alguns neurotransmissores ligados às
mudanças estruturais e ao comprometimento neuronal. O sistema colinérgico é extensamente
afetado em algumas áreas cerebrais, mas não em outras, como no caso da perda do sistema
colinérgico corticobasal e da ausência de efeito sobre o sistema colinérgico do tronco cerebral.
Efeitos similares são observados no sistema noradrenérgico e glutamatérgico (HOLTZMAN,
2011; KURZ; PERNECZKY, 2011). A perda neuronal não pertence ao critério de diagnóstico
da DA, porém, vem sendo considerado um importante componente patológico que deve ser
aplicado em modelos de estudo da DA (DUYCKAERTS et al, 2008).
Hipocampo
Córtex
Cérebro de indivíduo
normal
Córtex
Atrofia
hipocampal
Atrofia cerebralDilatação dos
ventrículos
Cérebro de indivíduo com DA
Hipocampo
Córtex
Cérebro de indivíduo
normal
Córtex
Atrofia
hipocampal
Atrofia cerebralDilatação dos
ventrículos
Cérebro de indivíduo com DA
25
Os neurônios glutamatérgicos e colinérgicos parecem ser particularmente afetados,
todavia neurônios serotoninérgicos e noradrenérgicos também são danificados e exibem
aumento do dano oxidativo, com metabolismo energético e homeostase do cálcio alterada,
que induzem ativação proteolítica pró-apoptótica. Todos esses efeitos estão associados à
deposição de placas amiloides e aglomerados neurofibrilares de proteína Tau (CITRON, 2004
e 2010). No processo fisiopatológico que envolve a DA ocorre formação de placas neuríticas e
de emaranhados neurofibrilares, essencialmente relacionados com a superprodução de
agregação do peptídeo Aβ (beta amiloide) no cérebro e hiperfosforilação da proteína Tau nos
neurônios afetados. Estas anormalidades levam à formação de cascatas neurotóxicas e a
alterações no citoesqueleto que eventualmente poderão causar disfunção neuronal e morte. Os
emaranhados neurofibrilares aparecem primeiro nas estruturas alocorticais, próximas ao
hipocampo, enquanto as placas amiloides podem ser encontradas inicialmente no neocórtex
(NELSON; BRAAK; MARKESBERY; 2009).
A neurodegeneração associada a DA está acompanhada de destruição apoptótica em
várias regiões do cérebro envolvidas em processos de aprendizagem e de memória, incluindo
os lobos temporais e lobos frontais. No diagnóstico dessas regiões, frequentemente, encontra-
se "placas" e "emaranhados" de depósitos extracelulares de fibrilas e amorfo agregados de Aβ
e emaranhados neurofibrilares intracelulares da proteína Tau associada à microtúbulos que
apresentam fosforilação e modificações hiperoxidativas (MATTSON 2004; BERNSTEIN et
al, 2009).
26
Gauthier e colaboradores (2012) descreveram o processo fisiopatológico da Doença de
Alzheimer caracterizado pelos seguintes fatores:
• Deposição de Aβ
• Hiperfosforilação da proteína Tau
• Ativação microglial
• Inadequada plasticidade sináptica
O acúmulo extracelular de peptídeo Aβ no núcleo da placa senil, o acúmulo
intracelular da proteína Tau, a formação dos emaranhados neurofibrilares e os fios no
neuropil, atualmente são considerados como assinaturas morfológicas e moleculares da
Doença de Alzheimer, obrigatórias para seu diagnóstico (BALL et al, 1997).
O aprendizado sobre os mecanismos patológicos e possíveis locais de ação para
fármacos levaram a descobertas sobre mecanismos que desencadeiam a DA. Para produção de
Aβ40, o tipo de peptídeo beta amiloide mais abundante, e Aβ42, o mais propenso à agregação
em placas, é necessário dois processos de clivagem sequenciais de PPA. O primeiro processo
ocorre no meio extracelular, pela enzima β-secretase. Nesse processo é produzido um
fragmento extracelular solúvel e um fragmento que está ligado à membrana celular, chamado
C99. Em seguida, no segundo processo é feita uma clivagem de C99 no meio da
transmembrana pela enzima γ-secretase, levando à formação de Aβ. Se a clivagem de PPA
(proteína precursora de amiloide) for feita pela enzima α-secretase, evita-se a formação de Aβ
(LICHTENTHALER; HAASS; STEINER, 2011).
O outro fator neuropatológico característico da demência do tipo DA, é os
emaranhados neurofibrilares (ENF), que são formados por filamentos de proteína Tau
hiperfosforilada, que é o componente principal dos filamentos de emaranhados helicoidais
27
intracelular. Seu surgimento promove a desestabilização da dinâmica microtubular neuronal e
leva a redução das funções sinápticas, com hiperfosforilação da proteína Tau e posterior
acúmulo nos compartimentos dendríticos, deixando os neurônios mais vulneráveis a efeitos
tóxicos das Aβ (ITTNER; GOTZ, 2011).
A cascata de eventos relacionados ao surgimento da Doença de Alzheimer pode ser
resumida conforme a Figura 2 (BATES et al, 2009; LESNE et al, 2006; BATEMAN;
KLUNK, 2008):
Figura 2 - Cascata de eventos da Doença de Alzheimer (Fonte: própria).
2.4.1 PROTEÍNA TAU
A proteína Tau integra a família das proteínas associadas aos microtúbulos
(microtubule-associated proteins – MAPT) e sendo uma das MAPT, sua principal função é
justamente estabilizar os microtúbulos pela agregação da tubulina. O gene que codifica a
proteína Tau associada ao microtúbulo possui 16 éxons e sua transcrição é completa,
originando 12 cópias de RNAm por splicing alternativo e seis isoformas da proteína. Trata-se
28
de uma proteína composta por 352 a 441 resíduos de aminoácidos (DE PAULA,
GUIMARÃES, FORLENZA, 2009).
Desde que se descobriu a proteína Tau como componente chave nos ENF na DA, esta
proteína passou a ser objeto de intensa pesquisa. A proteína Tau é causa de outras desordens
neurodegenerativas, além da DA, conhecidas como Tauopatias e estas doenças têm em
comum grandes quantidades de agregados de proteína Tau. (ROBERT; MATHURANATH,
2007).
O acúmulo de proteína Tau em células nervosas ou em células gliais é visto como um
importante marcador biológico das Tauopatias. Mecanismos neurodegenerativos estão
diretamente relacionados com alterações nas isoformas desta proteína (DE PAULA;
GUIMARÃES; FORLENZA, 2009).
Nas Tauopatias, a proteína Tau se encontra sobre o corpo celular e nos dendritos,
enquanto que em neurônios sadios, ela é encontrada na região dos axônios (SCHOLZ e
MANDELKOW, 2014; KIKKAWA et al, 1994). Esta proteína pode ser encontrada sob duas
formas: solúvel e insolúvel, sendo que esta última é identificada nos filamentos helicoidais
pareados (FHP), principal componente dos emaranhados neurofibrilares. Entende-se que os
ENF sejam o resultado da alteração da proteína Tau, apresentando-se por isoformas diferentes
em doenças neurodegenerativas, como é o caso da DA (KIKKAWA et al, 1994).
Cada molécula de proteína Tau identificada nos FHP apresenta de 6 a 8 grupos fosfato,
considerada assim, em estado hiperfosforilado, diferente de cérebros sadios, que apresentam
grau de fosforilação usual de proteína Tau, em torno de dois grupos fosfato por molécula
(JOSVIAK et al, 2015).
29
A proteína Tau controla a dinâmica dos microtúbulos durante a maturação e o
crescimento dos neuritos, e por ser a maior proteína do citoesqueleto, sua hiperfosforilação
afeta funções biológicas e morfológicas nos neurônios. Seu estado de fosforilação regulado é
resultado da ação de quinases e fosfatases que atuam de forma coordenada no tecido cerebral
(WANG; LIU, 2008; KNIBB; KIPPS; HODGES, 2006).
Com a hiperfosforilação da proteína Tau ocorre comprometimento da dinâmica
microtubular (figura 3), interferindo no transporte intraneuronal, o que provoca efeitos
deletérios sobre diversos processos celulares. Dentre estes efeitos está a não preservação da
morfologia e das funções da célula nervosa, interferindo na viabilidade da célula
(STOOTHOFF; JOHNSON, 2005; JAYAPALAN; NATARAJAN, 2013).
Os agregados de proteína Tau que formam os ENF bloqueiam o transporte de
proteínas neurotróficas e outras proteínas funcionais, o que provoca prejuízo no transporte
axonal e dendríticos nos neurônios (DE PAULA; GUIMARÃES; FORLENZA, 2009).
A interação entre a actina e os neurofilamentos é promovida pela proteína Tau,
sugerindo assim haver interelação dos microtúbulos com outros componentes do
citoesqueleto. Também há uma interação entre a proteína Tau e outras organelas
citoplasmáticas, permitindo a ligação entre os microtúbulos e as mitocôndrias. A proteína Tau
apresenta domínios na projeção N-terminal que permitem interação com a membrana
plasmática dos neurônios (BRANDT; HUNDELT; SHAHANI, 2005; BUÉE et al, 2000).
Acredita-se que a hiperfosforilação anormal da proteína Tau seja resultado da
hiperatividade das Tauquinases ou de mecanismos de subsensibilização das suas fosfatases
(WANG; LIU, 2008).
30
Em adição, a fosforilação da proteína Tau é regulada pela proteína fosfatase 2A
(PP2A) que por sua vez é regulada pelo inibidor 2, I2 PP2A. Em condições ácidas, como
aquelas geradas por isquemia e hipóxia cerebral, especialmente em associação com a
hiperglicemia, caso do diabetes, I2 PP2A é clivada por asparaginil endopeptidase em Asn-175
para o fragmento N-terminal (2NTF) e o fragmento C-terminal (I2CTF). Ambos I2NTF e I2CTF
são conhecidos por se ligarem à subunidade catalítica de proteína fosfatase 2A e inibir a sua
atividade. Observou-se que os níveis de asparaginil endopeptidase são aumentados de forma
significativa, e esta enzima em conjunto com a I2 PP2A transloca, respectivamente, do núcleo e
de lisossomas neuronais para o citoplasma onde eles interagem e são associados com a
proteína Tau hiperfosforilada no cérebro de indivíduos com DA (BASURTO-ISLAS G et al
2014). A atividade da PP2A relaciona-se com a integridade do citoesqueleto, além disso, esta
enzima participa da modulação da motilidade celular, diferenciação e citocinese. Possui
importante papel em doenças virais, parasitárias, no câncer e em doenças neurodegenerativas
(ALEXANDER, 2000).
Ao longo do desenvolvimento humano, o estado de fosforilação da proteína Tau é
modificado de forma dinâmica. Em fetos esta proteína é mantida de forma hiperfosforilada e
este estado tende a ser atenuado na medida em que ocorre a maturação do Sistema Nervoso
Central (SNC), pois passa a ocorrer crescente e progressiva ativação das fosfatases. Em
adição, no cérebro adulto, todas as isoformas da proteína Tau são expressas enquanto no
cérebro fetal apenas as isoformas pequenas são encontradas (WANG; LIU, 2008).
31
É possível detectar RNAm da proteína Tau em muitos tecidos periféricos, como no
coração, rim, pulmão, músculo, pâncreas, testículos, bem como nos fibroblastos (GU;
OYAMA, 1999; INGELSON; VANIER et al,1998).
Figura 3 – Dinâmica microtubular comprometida – Fonte: modificado DE PAULA et al, 2009. http://www.demneuropsy.com.br/detalhe_artigo.asp?id=167 acessado dia 12/01/2016 às 00h06min.
2.4.2 PEPTÍDEO BETA AMILOIDE ( Aβ)
Em 1984, GLENNER e WONG isolaram e purificaram a substância, que
segundo a descrição de Alois Alzheimer do começo do século XX, era a responsável pela
formação das placas senis. Inicialmente foi chamada de peptídeo 4.2KDa, primariamente com
40 ou 42 AA de comprimento, e que eles especulavam ter sido clivado de um precursor maior.
Em um curto espaço de tempo a previsão foi comprovada, quando a PPA foi clonada em 1987
por KANG et al. O peptídeo isolado por GLENNER e WONG ficou então conhecido como
Aβ.
Microtúbulo
Desestabilização dos Microtúbulos
Proteína Tau fosforilada
Filamentos helicoidais pareados
32
A PPA é membro de uma família de proteínas relacionadas que inclui as proteínas
precursoras de amiloide APLP1 e APLP2 em mamíferos e a proteína precursora de amiloide
PPAL em Drosophila. Todas são consideradas proteínas transmembrana de uma só passagem
com grandes domínios celulares, e todas são processadas de um modo semelhante à PPA.
Apenas PPA gera um fragmento amiloidogênico devido à divergência de sequência no local
interno do Aβ. O splicing alternativo do transcrito PPA gera 8 isoformas, das quais 03 são as
mais comuns: a forma de 695 AA, que se expressa predominantemente no SNC, e as formas
de 751 e 770 AA (BAYER et al, 1999).
A função fisiológica da proteína PPA não é precisamente conhecida, entretanto a
maioria dos estudos mostra que a PPA exerce efeito positivo na saúde e crescimento das
células. Este efeito é sintetizado em camundongos transgênicos que super-expressam PPA e
têm neurônios aumentados (OH et al, 2009). Em adição ao papel fisiológico da PPA, o Aβ
desempenha um papel importante na fisiologia sináptica, regulando o dimensionamento
sináptico (KAMENETZ et al, 2003) e a liberação sináptica das vesículas (ABRAMOV, 2009).
Em 1999, várias pesquisas foram publicadas demonstrando que uma parte significativa
da atividade de β-secretase origina de uma aspartil protease de membrana integral, codificada
pelo gene β-site PPA-cleaving enzyme 1 (BACE1) (HUSSAIN et al, 1999; SINHA et al, 1999;
VASSAR et al, 1999; YAN et al, 1999). Outros substratos para BACE1 incluem a
sialiltransferase ST6Gal I (Beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase I) (KITAZUME et al,
2003).
A proteína PPA é produzida em grandes quantidades nos neurônios, sendo
metabolizada rapidamente (LEE et al, 2008). Existem várias vias alternativas para a proteólise
da PPA, dentre as quais a que leva à formação do Aβ. Após a separação do retículo
33
endoplasmático (RE) e do complexo de Golgi, a PPA é entregue ao axônio, onde via
transporte axonal rápido é levada aos terminais sinápticos (KOO et al, 1990).
Na superfície da célula, a PPA pode ser proteolizada diretamente por α-secretase e em
seguida, γ-secretase, um processo que não gera Aβ, ou internalizada em poços revestidos por
clatrina para outro compartimento endossomal contendo as proteases BACE1 e ᵞ-secretase. O
último resulta na produção de Aβ, que é despejada no espaço extracelular seguindo vesículas
recicladas ou degradadas nos lisossomas (EHEHALT, 2003).
Portanto são dois mecanismos distintos de processamento da proteína PPA:
1- Ação da α-secretase formando a PPA secretada, com funções fisiológicas como
neuroproteção. A α-secretase cliva a proteína PPA na sua região Aβ (KOIKE et al,1999;
LAMMICH et al, 1999).
2- Ação da β-secretase, identificada como uma proteína chamada BACE (HUSSAIN et
al, 1999; VASSAR et al, 1999), e da ᵞ-secretase, que se acredita ser a presenilina 1 (PS1)
(SANGRAM et al, 2001; WOLFE et al,1999), originando o Aβ. A ação destas proteases
origina a fração solúvel da Aβ (predominantemente Aβ40) e a Aβ altamente fibrilogênica
(predominantemente Aβ42) associada a depósitos amiloides (LAMMICH et al, 1999).
As enzimas que clivam PPA têm sido extensivamente caracterizadas. BACE1 é uma
protease aspártica transmembrana, diretamente envolvida na clivagem de PPA e ᵞ-secretase é
um complexo multiproteico composto de PS1 ou presenilina 2 (DE STROOPER et al, 1999;
WOLFE et al, 1999).
34
O gene BACE1, que apresenta papel primordial na amiloidogênese cerebral tem sido
descrito na literatura como um auxiliar no diagnóstico precoce da DA. A amiloidogênese
constitui-se no processo pelo qual a proteína Aβ é gerada, resultado da proteólise sucessiva da
proteína precursora de amiloide (PPA). A investigação sugere que a BACE1 atue como a
principal β-secretase envolvida na formação de placas amiloides no cérebro (DECOURT;
SABBAGH, 2011).
Na última década a presença de Aβ no plasma tem recebido muita atenção dos
pesquisadores e a hipótese estudada é a de que este peptídeo provoque danos às células
vermelhas do sangue (red blood cells – RBC) devido ao acúmulo de hidroperóxidos de
fosfolipídios (Phospholipid hydroperoxides – PLOOH), um tipo de marcador específico para
danos em membrana de RBC (MATTSON et al, 1997; MOHANTY et al, 2008;
NAKAGAWA, 2011et al.; JAYAKUMAR et al, 2003).
O peptídeo Aβ possui uma cadeia de 40 a 42 aminoácidos (AA) que se alojam em
regiões do cérebro como cerebelo, estriado e tálamo. O Aβ é sintetizado no retículo
endoplasmático rugoso (RER) pelas células do sistema nervoso (SN) e facilita a produção de
oxiradicais, sendo tóxicos ou não para os neurônios e células da glia (GUZEN e
CAVALCANTI, 2012; CUMMINGS, 2003; KAWASUMI et al, 2002).
No cérebro, a deposição de Aβ é lenta e prolongada, podendo se estender por mais de
duas décadas, o que pode favorecer intervenções terapêuticas que possam modificar o curso
de provável doença neurodegerativa (VILLEMAGNE et al, 2013).
Foram reconhecidos três efeitos tóxicos sinápticos provocados pela Aβ: inibição do
potencial de ação em longo prazo (long-term potentiation – LTP), remoção dos receptores
35
sinápticos de glutamato e eliminação das sinapses de glutamato (figura 4). As sinapses de
glutamato representam entre 85 a 90% das sinapses no córtex de mamíferos (DE FELIPE et
al, 1997; MEGIAS et al, 2001).
Figura 4 – Efeitos tóxicos sinápticos da Aβ – modificado de ZETTERBERG; BLENNOW; HANSE, 2010.
Sabe-se que as placas senis são formadas pelo Aβ, e que são as primeiras
características que surgem na DA. A proteína PPA possui grande seguimento extracelular
amino terminal e um curto seguimento carboxil terminal. Estudos apontam que uma das
funções da proteína PPA é atuar como receptor de proteínas G nas membranas. Estes
funcionam como canal de comunicação entre as células. A expressão da PPA também é maior
em situações de estresse celular (MENENDEZ et al, 2002).
Vesícula sináptica Aβ
Receptor AMPA
Receptor NMDA
Receptor Aβ
• Inibição do LTP • Aumento da
depressão em longo prazo das sinapses
• Aumento da remoção de receptores de glutamato
• “Silêncio” pós-sináptico
• Retração da coluna • Desmontagem do terminal pré-
sináptico • Eliminação das sinapses
AMPA – ácido α-amino-3-hydroxi-5-metil-4-isoxazolepropionico NMDA – N-Metil D-aspartato
36
Em indivíduos com DA quando comparados com saudáveis, há aumento na produção
de frações insolúveis e amiloidogênicas de Aβ, ou queda na sua depuração (LEBLANC, 1999;
SHIBATA et al, 2000).
Em adição ao estudo sobre a Aβ, duas linhas de pesquisa afirmam que a ApoE
(apoliproteína E), tem ligação direta com o acúmulo de Aβ no cérebro. Uma destas linhas
aponta que a Aβ solúvel atua com a ApoE, ligando-se a um lipídio, através de endocitose,
mediada por um receptor. Essas lipoproteínas são digeridas por enzimas nos lisossomos, onde
parte da ApoE- Aβ é degradada e a outra se mantém associada a Aβ, gerando a agregação em
fibrilas amiloides, que retornam para o meio extracelular. Na outra linha de estudo, a ApoE
além de auxiliar a entrada de Aβ na célula e sua agregação, aumenta a produção de Aβ,
decorrente do aumento de colesterol na célula (PUGLIELLI et al, 2003; VAYA; SCHIPPER,
2007).
A ApoE é composta por 317 AA, sintetizada no fígado e posteriormente encontrada no
plasma humano, sendo a principal apoliproteína presente no cérebro, onde apresenta funções
diversas, embora vitais para a maquinaria neuronal (figura 7). Sua função no plasma é
redistribuir os triglicerídeos e o colesterol em diferentes tecidos, pois é o principal
componente das lipoproteínas de baixa densidade (low-density lipoprotein - LDL), além de
lipoproteínas de alta densidade (high-density lipoprotein - HDL) (OJOPI; BERTONCINI;
DIAS, 2004).
Alterações nas sequências do gene ApoE4 indicam geneticamente um fator de risco
para a DA, sugerindo que o colesterol tenha uma importante relação nesta patologia
(ROCCHI, et al,2003; TANZI; BERTRAM, 2001).
37
Figura 5 - Funções neuronais da ApoE
Modificado de http://www.nature.com/nrn/journal/v1/n1/images/nrn1000_051a_f3.gif acessado dia 13/01/2016 as 16h:00min.
2.5 BIOMARCADORES
O desafio-chave na atual gestão clínica da Doença de Alzheimer é a falta de um
biomarcador preciso para o diagnóstico confiável da doença. As características clínicas da
Doença de Alzheimer coincidem com uma série de outras patologias demenciais, e o
diagnóstico conclusivo só é alcançado na autópsia.
Um biomarcador é objetivamente medido e evoluído como um indicador de um
processo biológico normal, processo patogênico ou resposta farmacológica a uma intervenção
Migração Orientação axonal
Estabilidade do microtúbulo Plasticidade sináptica
Sobrevivência
Deposição de Aβ
Regeneração
38
terapêutica (BLENNOW, 2010). Quando usado em ensaios clínicos, pode ser definido como
uma medida laboratorial que reflete a atividade do processo de uma doença (KATZ, 2004;
BLENNOW et al, 2010).
Biomarcadores são potencialmente úteis como ferramentas para testes de drogas
experimentais em pacientes diagnosticados com DA. Eles podem ser usados como
marcadores para o estágio em que a DA se encontra, ou também, como critérios de inclusão
ou exclusão adicional. Se forem utilizados como marcadores indiretos da DA, em quase todos
os casos, os efeitos de supostas drogas modificadoras da doença podem ser determinados com
poucos indivíduos usando imagens ou biomarcadores bioquímicos, além do uso de medidas
cognitivas (THAL et al, 2006).
Muitas proteínas têm sido medidas no soro, plasma ou plaquetas com o objetivo de
encontrar um marcador periférico para a DA. Em 2011, Cummings apresentou prováveis
medidas que podem ser aplicadas em ensaios clínicos realizados para a DA (quadro 2).
Quadro 2 – Marcadores periféricos para DA
Medida Ação biológica
Relacionada com a PPA Menor relação de PPA prediz declínio cognitivo e está relacionada com status cognitivo na DA.
Aβ40 plasmática e Aβ42 Medição no plasma não diferencia normal de DA ou CCL; Níveis diminuem com inibição da secretase, podendo ser um indicador alvo para DA.
Isoprostanos séricos Se elevados na DA, podem estar correlacionados com prejuízo da memória.
Atividade da β-secretase nas plaquetas Atividade aumentada na DA se comparada com controles.
Leptina Diminuição da incidência de DA com níveis mais altos de Leptina
Fagocitose de Aβ pelos macrófagos Macrófagos de pacientes com DA tem fagocitose de A prejudicada.
Fator α de necrose tumoral Níveis elevados em pacientes com DA estão associados ao aumento da taxa de progressão; indicativo de inflamação crônica.
39
ECE-2 Degrada Aβ up-regulation na DA. Melanotransferrina Proteína envolvida no transporte de ferro no cérebro.
Apresenta níveis séricos aumentados na DA. Glutationa plasmática e seu metabólito Glicina Cisteína
Proteínas antioxidantes reduzidas em pacientes com CCL e DA quando comparados com pacientes saudáveis (grupo controle).
GGT Níveis elevados em pacientes com DA quando comparados a grupos controle com pacientes saudáveis.
Proteínas inflamatórias (proteína-C reativa) Níveis superiores em pacientes idosos estão associados com risco aumentado para DA.
IL-6 Aumentada na DA IL-6 receptor Reduzida na DA e em outras doenças neurológicas,
correlacionada com o MEEM. TNF-α Aumentado na DA - indicativo de inflamação crônica IFN-α plasmático IFN-α é aumentado em pacientes com CCL se
comparado com pacientes com DA e grupos controle saudáveis.
COX 2 plaquetária Níveis das plaquetas são aumentados em pacientes com DA e CCL quando comparados a grupos controle saudáveis.
Cistatina C sérica Níveis mais baixos em pessoas cognitivamente normais estão relacionados com risco aumentado de desenvolver DA.
MCP-1 Proteína indicadora de inflamação, elevada em CCL e DA inicial, progressivamente diminuída em pacientes com CCL que progrediram para DA.
Homocisteína Aumentada em pacientes com DA quando comparada com indivíduos normais em grupos controle.
24S-hydroxi-colesterol Índice do metabolismo do colesterol no cérebro. É normal na DA, podendo funcionar como uma medida de tratamento que afete o metabolismo do colesterol.
CCL, comprometimento cognitivo leve; CRP, proteína plasmática C reativa; COX-2,Ciclooxigenase-2; ECE-2, enzima conversora de endotelina; IFN, Interferon; IL-6, Interleucina 6; MEEM, mini exame do estado mental; MCP-1, proteína quimioatrativa de monócitos; TNF-α, fator α tumor de necrose plasmático.
(Fonte: Adaptado de J.L. Cummings / Alzheimer’s & Dementia 7 (2011) e13–e44)
O biomarcador ideal para detectar a DA deve apresentar especificidade e sensibilidade,
tal como o diagnóstico clínico, além de ser confiável e reprodutível, de fácil execução, baixo
custo e não invasivo, como estudos com sangue, urina, saliva e raspados buscais. Testes
invasivos como pele, biópsias retais, amostras de medula óssea ou liquido cefalorraquidiano
(LCR) ou mesmo biópsia cerebral, apresentam-se como inconvenientes para a prática clínica
(BERMEJO-PAREJA et al,2010). Os biomarcadores tornam possível o monitoramento da
atividade biológica em pacientes com DA quanto ao comprometimento neuronal e nível de
40
progressão da doença. Inicialmente, os biomarcadores completam avaliações
neuropsicológicas e de imagem, além de serem utilizados para testar a ação farmacológica de
drogas antidemência (IRIZARRY, 2004).
A formação dos emaranhados neurofibrilares e das placas senis, ocasionadas
respectivamente pela proteína Tau e pelo peptídeo Aβ proporciona quanto à localização
destas, amplas possibilidades de diagnóstico, seja como marcadores neurológicos ou como
marcadores plasmáticos (SABBAGH et al, 2013), conforme descrito na figura 6.
Figura 6 – Localização dos marcadores plasmáticos e neurológicos na DA.
(Fonte: adaptado de J.J. SABBAGH et al. / Neurobiology of Disease 56 (2013) 116–130)
Os biomarcadores atualmente estudados são as proteínas Aβ e Tau. Ao analisá-las no
LCR, os cientistas concluíram que quando surgem placas Aβ no cérebro, os níveis de Aβ42
diminuem em comparação com o LCR de um indivíduo saudável, enquanto ocorre um
aumento de Tau. Em um exame de imagem molecular como a Tomografia por Emissão de
Prótons (Positron emission tomography - PET), no qual é possível visualizar o metabolismo
de glicose no cérebro, notaram-se placas Aβ em áreas topográficas envolvendo o córtex
temporoparietal. Também se observou através de exame de RNM, a atrofia das áreas mediais,
Região do Cérebro Marcador Neurológico Marcadores Plasmáticos e CSF
Hipocampo, córtex, amígdala, estriado, etc
Plaquetas, Aβ, oligômeros e emaranhados
Hipocampo, córtex, amígdala, estriado, etc
Isoprostanos, citocinas e marcadores microgliais
Oligômeros Aβ
Aβ, Tau e
p-Tau
Isoprostanos, citocinas e marcadores microgliais
41
basais e laterais do córtex dos lobos temporais e regiões medias basais parietais (SOUZA et
al, 2014; HU et al, 2010).
Os biomarcadores das proteínas Aβ e Tau, apresentam sensibilidade entre 90 e 95% para
o diagnóstico da DA, sendo que ambos demonstram boa correlação com a proteína Tau
cerebral e as patologias beta amiloides (BUERGER et al, 2006). Segundo Craig-Schapiro,
Fagan e Holtzman (2009), o uso de biomarcadores na DA, como elementos para a sua
identificação, visam menor invasividade e melhor acurácia do diagnóstico.
Em 2011, MARÇÔA descreveu que os biomarcadores Aβ1−42, Tau total (t-Tau) e Tau
fosforilada (p-Tau) no LCR, foram avaliados em um grande número de estudos. De forma
global, foi verificado aumento nos níveis de t-Tau e p-Tau, nas razões t-Tau/ razões t-Tau/
Aβ1−42 e p-Tau/ Aβ1−42 com redução nas concentrações de Aβ42, comparando pacientes com
CCL com indivíduos cognitivamente normais, e com indivíduos portadores de DA com CCL.
Constatou-se que pacientes com DA apresentavam maiores níveis de t-Tau, p-Tau, p-Tau/
Aβ42 e t-Tau/ Aβ42 e menores níveis de Aβ1−42 e razão Aβ1−42 e Aβ1−40 comparando com
CCL que desenvolveram demências, porém, não a de Doença de Alzheimer e cognitivamente
normais. Para caracterização entre DA e não - DA, geralmente, os níveis de Aβ, t-Tau ou p-
Tau tiveram uma baixa sensibilidade (LEWCZUK, et al.2008; BRANDT et al, 2005) e uma
especificidade elevada (BRANDT et al, 2005).
Mudanças no padrão da Aβ podem ser observadas e detectadas no LCR e por imagem até
20 anos antes dos sintomas clínicos da DA. Atrofia estrutural pode ser detectada em RNM até
10 anos antes dos sinais clínicos (RASKIN et al, 2015).
Em 2007, um grupo internacional de trabalho, (International Working Group-IWG),
propôs um novo conceito para a DA através da descoberta de biomarcadores utilizados para a
42
detecção da doença. Para este grupo, uma espécie de força-tarefa, a DA passa a ser definida
como uma dupla entidade clínico-biológica que pode ser reconhecida in vivo, antes do
surgimento da demência, por uma síndrome hipocampal e pela evidência de biomarcadores
que possam apontar o local ou a natureza da DA e as alterações provocadas por ela. (DUBOIS
et al, 2014).
O IWG amplia o conceito de DA em um estado de pré-demência, uma fase chamada
prodrômica, utilizando os mesmos critérios diagnósticos da DA, segundo o NINCDS-
ADRDA, independente dos déficits cognitivos e funcionais percebidos. Os biomarcadores
passam a ser considerados uma assinatura da doença, reforçando o diagnóstico da DA em
qualquer fase, mesmo nos períodos prodrômicos. Se identificada na fase prodromal, vários
benefícios podem ser percebidos, possibilitando medidas mais adequadas e decisões mais
eficientes, com a doença sendo tratada mais cedo (DUBOIS et al, 2007).
Um esforço considerável vem sendo empreendido para o desenvolvimento de
melhores técnicas de diagnóstico para a DA, o que pode abrir caminho para que esforços
terapêuticos sejam usados cada vez mais cedo. Biomarcadores baseados em soro podem ser a
modalidade com menor custo e com menor invasividade para rastreamento e monitoramento
de rotina.
A identificação e validação de biomarcadores para o diagnóstico de DA e outras
formas de demência, são cada vez mais importantes. A quantificação através do método de
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), de Aβ-42, t-Tau e p-Tau-181 no LCR é o mais
avançado e aceito método de diagnóstico provável para a DA com alta especificidade e
sensibilidade (WILTFANG, 2007).
43
A identificação de um biomarcador ideal deve ser consistente entre os vários métodos
disponíveis, sendo utilizados proteomas primários em análise de plasma ou soro (ZABEL et
al. 2012).
Ainda não existem ferramentas de diagnóstico para a detecção de indivíduos
assintomáticos, ou que sejam capazes de prever a taxa de progressão da doença em indivíduos
sintomáticos. Estudo recente demonstra que os níveis de biomarcadores no LCR, tais como o
peptídeo Aβ, a t-Tau e a p-Tau podem aumentar a precisão do diagnóstico (LI et al, 2013).
Em adição, outras susbtâncias, além da Aβ e da Tau, como as citocinas, quimiocinas,
fatores de complemento, e proteínas de sinalização no LCR ou sangue, podem ser uma rica
fonte de biomarcadores de diagnóstico, mas o poder destes testes terá de ser analisado em
estudos futuros. Recentemente foi descrito teste de citometria de fluxo para detectar pacientes
com DA com uma alta sensibilidade e especificidade em populações distintas (pacientes
confirmados versus professores universitários ativos), mas ainda é necessária experiência para
sua utilização na população com risco de DA (FIALA; VEERHUIS, 2010).
Plaquetas anucleadas podem ser consideradas um modelo disponível para estudar os
mecanismos metabólicos que ocorrem no SNC, e relacionados com DA. Além disso, várias
vias de sinalização intracelular, importantes para a ativação de plaquetas envolvem moléculas
essenciais, que também têm sido descritas para modular o processamento de PPA
(CATRICALA; TORTI; RICEVUTI, 2012).
44
A Lipocalina 2 é um novo componente pró-inflamação, que atualmente tem sido
sugerida como uma molécula que atua na neuroinflamação nos estágios iniciais de DA
(NAUDE et al, 2012).
Dados demonstram que a taxa de YKL-40, uma glicoproteína reconhecida como
indicador de neuroinflamação, é elevada na DA e em conjunto com a Aβ-42, tem utilidade
como potencial biomarcador para a fase pré doença, ou seja, ainda no período prodromal da
DA. Em um esforço para se determinar se o YKL-40 pode ter potencial para distinguir a DA
de outras doenças demenciais, foram avaliados os níveis de duas outras doenças
neurodegenerativas: degeneração lobar frontotemporal e paralisia supra nuclear progressiva.
Embora este estudo não tenha avaliado o diagnóstico diferencial completo para o
comprometimento cognitivo leve ou demência leve, os dados fornecidos sugerem que o YKL-
40 pode ser útil para distinguir DA de outras formas de doenças neurodegenerativas (CRAIG-
SCHAPIRO et al, 2010).
Em 2011, Santos et al, demonstrou existir correlação entre as esterases contidas no
plasma e a progressão da DA. O estudo baseou-se na comparação entre os dados obtidos pelo
exame de MEEM dos pacientes e os valores das concentrações das esterases AchE e BuChE
em pacientes fazendo uso do medicamento Rivastigmina na forma transdérmica. Verificou-se
que os níveis de Butirilcolinesterase (BuChE) apresentaram flutuação em pacientes com DA,
ensejando a possibilidade de seu uso como biomarcador.
45
2.5.1 SALIVA
A urina e a saliva são atraentes alvos para o desenvolvimento de biomarcadores devido
à facilidade da coleta. Entretanto, algumas moléculas amostradas a partir destas fontes,
submetidas à filtração e processamento metabólico, podem não refletir as alterações
bioquímicas que ocorrem no cérebro. Por esta razão, a investigação de DA tem ignorado esses
compartimentos biológicos (ZURBIG; JAHN, 2012). Em contrapartida, estudo realizado em
2010 detectou redução da atividade de Acetilcolinesterase (AChE) na saliva de pacientes com
DA quando comparados a grupos controle normais (SAYER et al, 2004). Aumento dos níveis
de Aβ salivar tem sido verificado em pacientes com DA em estágio leve quando comparados a
indivíduos saudáveis e pacientes com doença de Parkinson (DP) (BERMEJO-PAREJA et al,
2010). Somente havendo mais estudos com estes fluídos, é que será possível determinar se
eles refletem de forma eficiente as condições cerebrais.
O fluído salivar bucal é produzido principalmente por três pares de glândulas salivares
maiores; as glândulas submandibulares, parótida e sublinguais; juntamente com secreções de
muitas outras glândulas salivares da submucosa. A saliva bucal contém um conjunto de
biomarcadores potenciais de muitas doenças, derivados de células epiteliais, neutrófilos,
microbioma, fluído gengival e do soro. Alguns exemplos podem ser citados no que diz
respeito ao uso da saliva como fluído de pesquisa para biomarcadores; na saliva são medidos
os níveis de Cortisol para a avaliação do estresse, as metaloproteinases para as cáries e
doenças periodontais, além de um painel de RNAm e proteínas que tem sido usados como
marcadores de carcinoma epidermoide oral (PERIODONTOL, 2000). A saliva é
frequentemente utilizada para testar os níveis de um número específico de hormônios, sendo
considerada uma técnica não invasiva (COOK, 2002). Em pacientes com DA, a glândula
46
submandibular, que produz a maior parte do volume salivar, é significativamente prejudicada
(SHIP et al, 1990; SHIP; PUCKETT, 1994).
Vários testes que utilizam a saliva como elemento de diagnóstico para determinadas
doenças estão no mercado. Em 2005, nos Estados Unidos, a agência reguladora de
medicamentos e alimentos (Food drug and administration – FDA), já havia aprovado um
teste para detecção do vírus da imunodeficiência humana (Acquired imune deficiency
syndrome – AIDS). Moléculas de RNA e de outras proteínas na saliva podem ser indicativas
do diagnóstico de diabetes e câncer. Os dentistas usam o aforismo de que “a saliva é o
espelho do corpo”, já que a saliva reflete os níveis de substâncias naturais e sintéticas, usadas
com fins terapêuticos ou não. Atualmente a maioria dos testes moleculares é feita por
pesquisas no sangue, devido à grande concentração no soro de moléculas de interesse clínico.
Contudo, os testes de saliva podem ser mais vantajosos devido ao baixo custo, e por
permitirem, para investigações iniciais, o seu uso em um contingente populacional maior
(WONG, 2008).
A compreensão sobre como os componentes entram na saliva torna-se um aspecto
importante para validar a utilização destes biomarcadores para as doenças neurodegenerativas,
como é o caso da DA.
Até este momento, a maioria dos estudos sobre possíveis biomarcadores para a DA
tem sido centradas no LCR e no plasma sanguíneo como fontes de diagnóstico, entretanto, a
forma invasiva de coleta de plasma e LCR motivou a necessidade de obtenção de método
mais fácil e simples para a pesquisa. Sem dúvida alguma, a saliva é um dos fluídos corporais,
não invasivo, mais simples e de fácil acesso. Recentemente, com o rápido avanço da
biotecnologia, muita atenção tem sido dada à saliva como um fluído corporal útil a ser
47
utilizado como biomarcador. Amostras de saliva foram utilizadas em uma vasta gama de
aplicações e foram consideradas úteis não apenas para o papel que cumpre na digestão ou por
suas propriedades antibacterianas, mas também pelo seu potencial para aplicações biomédicas
(SPIELMANN; WONG, 2011; HUANG, 2004). A saliva contém uma variedade de
biomoléculas, incluindo DNA, RNA codificante e não codificante, proteínas, metabólito e
microbiota. As alterações nos níveis salivares destes constituintes moleculares podem ser
utilizadas para o desenvolvimento de marcadores, para a detecção de doenças e de avaliação
de riscos (ZHANG et al, 2016).
No caso da DA, a detecção precoce dos sintomas relacionados à doença é criticamente
importante para o delineamento do tratamento, além disso, a saliva é de fácil obtenção,
transporte simples e pode ser um teste repetido por dias seguidos (ALZHEIMER’S
ASSOCIATION, 2015), possibilitando o acompanhamento eficiente da evolução dos estágios
da doença.
Atualmente, existem diversos estudos para o diagnóstico precoce da DA através da
saliva. Procura-se identificar a presença de substâncias como o peptídeo Aβ e a p-Tau, como
biomarcadores. Estes testes são não-invasivos e a análise posterior é realizada pelo método de
ELISA, sendo este altamente sensível (STARLING, 2012). Os níveis salivares de Aβ42 podem
ser considerados um marcador potencial de DA, cooperando para a exclusão de outros tipos
de desordens degenerativas. Os níveis de Aβ42 diferem nos indivíduos controle sem demência
leve, sendo marcadores de risco para o desenvolvimento de DA em pacientes (BERMEJO-
PAREJA et al, 2010).
Shi et al afirmam que a p-Tau presente na saliva de pacientes com DA, comparada
ao nível de pacientes saudáveis, mostra-se aumentada de forma significativa, demonstrando
48
que esta descoberta, embora preliminar, comprova que os níveis de p-Tau/ t-Tau são elevados
na saliva de pacientes com DA, podendo desta forma ser excelentes marcadores para o
diagnostico desta doença” (SHI et al, 2011). Outras pesquisas, ao inves de utilizar
biomarcadores como a Tau e a Aβ, investiga outros metabólitos presentes na saliva (AGHA,
2009). O RNAm de Tau é altamente expresso nas glândulas salivares (CONRAD, 2002).
A identificação da expressão reprodutível e robusta de Aβ42 na saliva é de particular
importância, pois pode servir como potencial indicador de DA, sendo medido sem o menor
esforço do paciente sujeito ao exame. O mecanismo de acúmulo de Aβ42 na saliva não é claro.
Acredita-se que seja o resultado da liberação deste peptídeo a partir de glândulas salivares do
processamento de PPA em função da ação de enzimas salivares do tipo secretase em células
epiteliais (OH; TURNER, 2006).
A grande maioria das pesquisas realizada até agora relata um aumento de Aβ42 no
parênquima cerebral, principalmente com placas senis (HARDY; SELKOE, 2002), ao passo
que os níveis de Aβ42 foram reduzidos no LCR de pacientes com DA (SUNDERLAND et al,
2003; DIETRICH et al, 2008). O significado quanto à proporção entre as concentrações de Aβ
salivar e cerebral é desconhecido, entretanto seus níveis são comparados com aqueles
observados em outros tecidos, inclusive nos olhos (GOLDSTEIN et al, 2003).
Na cidade de Washington (EUA) foi realizado um estudo sobre a avaliação de
substâncias presentes na saliva capazes de diferenciar precocemente a DA, quando comparada
ao CCL. A pesquisa avaliou 82 voluntários, dos quais 35 normais, 25 com CCL e 22 com
DA.Os pesquisadores identificaram e quantificaram um grupo de diversos metabolitos por
meio de espectrometria, com a finalidade de testar novos biomarcadores ligados a DA. No
inicio da pesquisa eram cerca de 1000 biomarcadores presentes na saliva, mas recentemente,
49
em dados atualizados, identificou-se um total de 1500 metabolitos, a maioria ainda em fase de
avaliação, para provar se possuem relação com biomarcadores. A detecção destes metabólitos
está sendo feita pela saliva, e os resultados demonstraram que alguns metabolitos apresentam-
se em numero maior, em casos de DA; se comparados a pacientes com envelhecimento
normal. O maior desafio é comprovar se estes biomarcadores podem ou não ser utilizados
para o diagnóstico da DA (SAPKOTA, 2015).
2.5.2 SANGUE
O sangue, como uma fonte de biomarcadores, contém diferentes tecidos. As
proteínas, lipídios e outros metabólitos podem ser examinados no plasma, soro ou
compartimentos celulares. Nestes locais podem ser identificados eritrócitos, plaquetas ou
células brancas, utilizando-se para melhor verificação a citometria de fluxo. Estudos de
células podem ser obtidos por meios de cultura em períodos de curta duração e os respectivos
resultados aferidos. Obviamente que o RNA pode ser obtido de células, mas também está
presente em exossomas no plasma, uma intrigante e potencial fonte de biomarcadores
(THAMBISETTY; LOVESTONE, 2010; HUNTER et al, 2008; SIMPSON, 2009).
O projeto Plasma Proteoma, parte da Organização Proteoma Humano (Human
Proteome Organization - HPO), pretende mapear todas as proteínas do plasma e nesta
primeira fase já identificou mais de 9000 proteínas (OMENN et al, 2005; STATES et al,
2006). Várias formas de abordagens proteômicas são usadas na descoberta de biomarcadores,
todas utilizando a espectrometria de massa para a identificação das proteínas (BARELLI,
2007; PERNEMALM, 2009). Havendo a descoberta de uma proteína ou painel de proteínas
com potencial para atuar como biomarcador, é necessário validar, bem como replicar o
achado. A terminologia biomarcador é confusa e os termos de validação, replicação e
50
qualificação são muitas vezes usados de forma intercambiável, mas podem ter sentidos
diferentes (THAMBISETTY; LOVESTONE, 2010).
A Associação de Alzheimer (ALZHEIMER´S ASSOCIATION) e a Fundação
Descoberta de Drogas para Alzheimer em 2013 (ALZHEIMER´S DRUG DISCOVERY
FOUNDATION – ADDF) selecionaram universalmente grandes cientistas a fim de discutir a
presença de biomarcadores no sangue (JACK et al, 2013).
Estudos recentes relatam a existência de novos biomarcadores no sangue para a DA.
Estes testes precisam ser de fácil acesso, baixo custo e de alta sensibilidade para o diagnóstico
em estágio inicial, para o controle progressivo da doença e para a concepção de novos
tratamentos (MORENO L; OSTA R; CALVO AC, 2015). Biomarcadores detectam
precocemente e com muita precisão a doença de Alzheimer e também podem classificar os
estágios da doença (TAPIOLA et al, 2009).
Os estudos realizados para identificar biomarcadores para a DA no sangue carecem de
mais investigações, pois enquanto alguns pacientes mostram um aumento de nível de Aβ42 ou
Aβ40, outros não apresentam nenhuma alteração nestes níveis (IRIZARRY, 2004). Ainda não
há resultados significantes para o diagnóstico da DA através da proteína Tau no sangue,
porém há estudos que relatam o aumento do nível desta proteína em pacientes com Alzheimer,
onde a quantidade se apresenta dobrada em relação à pacientes saudáveis, com a mesma faixa
etária (BIELEWICZ et al, 2011; NOGUCHI et al, 2011; CUMMINGS, 2011). Em 2011
existiam aproximadamente 26 investigações avaliando Aβ no plasma, associando a Aβ42 como
um fator de risco biológico.
51
3. OBJETIVOS
3.1 GERAIS
Avaliar em indivíduos idosos normais e com demência do tipo Doença de Alzheimer, a
concentração das proteínas t-Tau e Aβ42 na saliva, além da avaliação hematológica e
bioquímica destes indivíduos na busca de indicadores que possam ser utilizados na prática
clínica diária.
3.2 ESPECÍFICOS
- Quantificar os níveis hematimétricos dos grupos sem DA / cognitivamente saudáveis e com
DA, para analisar possíveis diferenças de interesse clínico.
- Quantificar os níveis de proteína Tau e do peptídeo Aβ42 na saliva dos grupos sem DA /
cognitivamente saudáveis e com DA, para analisar possíveis diferenças de interesse clínico;
- Quantificar os níveis bioquímicos dos grupos sem DA / cognitivamente saudáveis e com
DA, para analisar possíveis diferenças de interesse clínico.
4. JUSTIFICATIVA
A possibilidade de identificação precoce da DA é elemento chave para a busca de
estratégias de tratamento mais eficazes. Exames realizados por coleta de saliva são simples e
podem ser estendido a um contingente populacional maior, criando melhores condições de
acompanhamento quanto à evolução da doença. Nosso grupo entende que exista viabilidade
na associação entre os biomarcadores Aβ e Tau da saliva, e alguns marcadores sanguíneos
como chave para diagnósticos cada vez mais precisos.
52
5. METODOLOGIA
Trata-se de um estudo de caso-controle realizado em pacientes com diagnósticos de
DA provável, e pacientes cognitivamente saudáveis sem DA, que, teve como polos de
pesquisa as cidades de São Paulo e a de Cuiabá, respectivamente, capitais dos estados de São
Paulo e Mato Grosso, no Brasil.
5.1 ASPECTOS LEGAIS DA PESQUISA
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Anhanguera,
protocolo CAAE 32791814.4.0000.5493, parecer 792.091.
Em cumprimento às determinações legais da Resolução 466 do Conselho Nacional de Saúde –
CNS, de 12/12/2012, todos os participantes e/ou seus respectivos responsáveis legais foram
devidamente esclarecidos quanto aos objetivos da pesquisa, para em seguida assinarem o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) - anexo I. A participação de todos os
voluntários foi por aquiescencia espontânea, e todos foram identificados com códigos para
que todo o sigilo fosse mantido.
Foram enviadas cartas de anuência para as instituições convidadas a integrarem a pesquisa,
respectivamente o Laboratório de Reabilitação Vestibular do Programa de Mestrado em
Reabilitação Vestibular e Inclusão Social da Universidade Anhanguera na cidade de São Paulo
– SP, anexo II, e o Centro de Geriatria do Mato Grosso, anexo III.
53
5.1.1 GRUPOS DE PACIENTES
Foram convidados a participar deste experimento, 120 idosos, assim dispostos:
• Grupo sem DA: 60 indivíduos cognitivamente saudáveis e sem diagnóstico de
DA, com idade igual ou superior a 60 anos, oriundos do Laboratório de Reabilitação
Vestibular do Programa de Mestrado em Reabilitação Vestibular e Inclusão Social da
Universidade Anhanguera na cidade de São Paulo - SP.
• Grupo com DA: 60 pacientes com diagnóstico de DA provável, oriundos do
Centro de Geriatria na cidade de Cuiabá - Mato Grosso
Algumas considerações importantes quanto à elegibilidade dos voluntários
participantes:
• Foram selecionados aleatoriamente pacientes de ambos os sexos, sem que
houvesse limite numérico conforme o sexo.
• Não foi levado em consideração o grau de alfabetização e condição
socioeconômica dos voluntários.
• Não houve distinção quanto ao estágio em que a doença se encontrava nos
pacientes com DA provável.
• Nenhum dos pacientes avaliados apresentou quaisquer sinais de lesão na boca
até o momento da coleta da saliva.
• O recrutamento dos pacientes no Grupo sem DA ocorreu após palestras de
orientação sobre a DA, promovidas junto ao corpo frequentativo do Laboratório de
Reabilitação Vestibular do Programa de Mestrado em Reabilitação Vestibular e Inclusão
Social da Universidade Anhanguera na cidade de São Paulo. Para o Grupo com DA, a seleção
dos pacientes ficou sob a responsabilidade da equipe de geriatras do Centro de Geriatria de
54
Cuiabá- MT.
As coletas de saliva e sangue em São Paulo foram realizadas entre 01/12/2014 e
8/05/2015, enquanto as coletas de saliva e sangue em Cuiabá aconteceram entre os dias 1 e 30
de abril de 2015.
5.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Os critérios de inclusão e exclusão para classificação dos voluntários sem DA e os
pacientes com DA, foram norteados pela Portaria 1298 de 21/11/2013 do Ministério da Saúde
(anexo III), que aprova o protocolo clínico, e diretrizes terapêuticas da DA no Brasil. O
presente documento define o conceito de “DA provável”, utilizado na descrição metodológica
do projeto. Todos os pacientes com DA já tinham o diagnóstico emitido pelo Centro de
Geriatria de Cuiabá – MT, enquanto, os pacientes sem DA encaminhados pelo Laboratório de
Reabilitação Vestibular do Programa de Mestrado em Reabilitação Vestibular e Inclusão
Social da Universidade Anhanguera, vinham sendo acompanhados clinicamente no citado
programa, sem diagnóstico e/ou sinal de demência.
Os critérios de inclusão adotados foram:
• Grupo com DA: diagnóstico de DA provável de acordo com os critérios da
Portaria 1298 de 21/11/2013 do Ministério da Saúde (anexo III), sem limite de idade,
ambos os sexos, sem distinção de grau de instrução.
• Grupo sem DA: idade igual ou superior a 60 anos, ambos os sexos.
• Os critérios de exclusão adotados foram:
• Grupo com DA: uso de estatinas, fibratos e tiroxina sintética (T4), feridas na
gengiva ou doenças gengivais.
55
• Grupo em DA: idade inferior a 60 anos.
5.3 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Todos os voluntários da pesquisa, sadios ou com diagnóstico provável de DA, foram
selecionados a partir dos critérios de inclusão e exclusão, e de forma randomizada.
Antecipadamente, para ambos os grupos, houve palestra elucidativa quanto aos objetivos da
pesquisa. No ato das coletas, todos os voluntários foram codificados numericamente e seus
dados protegidos e guardados sob sigilo.
A divisão dos grupos quanto ao gênero, foi aleatória, seguindo o volume de adesões ao
projeto.
O cálculo quanto à prevalência foi realizado com base no percentual representado pelos
grupos.
5.4 ANÁLISES BIOLÓGICAS
5.4.1. ANÁLISE DA SALIVA
A saliva foi coletada com a utilização de frascos do tipo Salivette®, que consistem de
tubo plástico (figura 7) contendo um rolo de algodão e um filtro plástico.
Figura 7 - Salivette® para coleta de saliva. Fonte: acervo próprio.
56
Para o correto procedimento de coleta foram fornecidas as seguintes informações aos
voluntários da pesquisa:
• Colocar o algodão presente no interior do Salivette® no interior da boca,
próximo a língua, aguardando um período de 3 minutos (cronometrado pela nossa
equipe), preferencialmente sem mastigar o algodão.
• Durante a coleta não foi permitida a ingestão de água, café ou qualquer outro
líquido, bem como qualquer alimento.
• Os pacientes foram avisados quanto à necessidade de não ter ingerido líquidos
ou alimentos até 1 hora antes da coleta, bem como não ter escovado os dentes nas
últimas 3 horas antes da coleta.
• Após os 3 minutos, o voluntário retirou o algodão da boca e o acondicionou de
volta dentro do Salivette®, devolvendo o tubo a um membro de nossa equipe.
Em pacientes com DA provável, em estágio mais avançado da doença, quando
necessário, foi solicitada a ajuda do acompanhante ou de um profissional de saúde presente.
Imediatamente, após as coletas, as salivas foram acondicionadas em refrigerador sob a
temperatura de –20ºC, até o momento em que foram processadas para leitura dos resultados.
Após serem retiradas da temperatura de congelamento, as salivas, foram submetidas à
centrifugação, durante cinco minutos a 3.000 rotações por minuto (rpm).
Nesta fase, chamada de processamento das amostras, o algodão do Salivette® foi
descartado, e a saliva separada em alíquotas de 200 µL em tubos do tipo Eppendorf® para a
quantificação do peptídeo Aβ e da proteína Tau pelo método de ELISA.
O método de ELISA é comumente utilizado para pesquisas in vivo e in vitro dos
biomarcadores ligados à DA. A técnica de ELISA se caracteriza por reações antígeno-
57
anticorpo, que são detectáveis por reações enzimáticas.
Existem vários modelos de testes de ELISA, e na forma mais comum, o ELISA
indireto, um antígeno é colocado em uma placa com 96 poços, em seguida a amostra do
paciente é inserida e, se houver anticorpos nesta amostra, ocorrerá à reação antígeno-
anticorpo, devendo adicionar um segundo anticorpo específico ligado a enzima (NAKAYA et
al, 2005).
Atualmente existem no mercado, kits que detectam biomarcadores da DA através da
utilização de ensaios imunoenzimáticos que determinam quantitativamente a Aβ42, t-Tau e p-
Tau, em amostras de LCR, sangue e saliva. Estes procedimentos podem ser realizados em
laboratórios de análises clinicas (VILLEGAS et al, 2007).
Para a quantificação de Aβ40 pelo método de ELISA na saliva dos participantes da
pesquisa, utilizamos o Amyloid beta 40 ELISA kit human (figura 8), com número de catálogo
KHB3481, da empresa Thermo Fisher Scientific.
Para a quantificação de t-Tau pelo método de ELISA na saliva, dos participantes da
pesquisa, utilizou-se o TAU (total) ELISA kit human, com número de catálogo KHB0041, da
empresa Thermo Fisher Scientific.
Ambos os kits, após serem adquiridos, foram mantidos sob refrigeração entre 2 e 8º C.
Os kits de ELISA utilizados apresentam de 2 a 10 vezes mais sensibilidade que os de
western blotting. A sensibilidade melhorada permite detectar proteínas de baixa expressão.
Além disso, a quantidade de amostra necessária para a execução do ensaio é menor do que
aquela necessária para o Western Blot. A detecção de Aβ42, t-Tau e p-Tau saliva pelo Tau
(total) ELISA kit human e pelo Amyloid beta 40 ELISA kit human não sofre a influência de
58
quaisquer outros tipos de proteínas encontradas na saliva, dado o alto perfil de sensibilidade
dos testes (Thermo Fisher Scientific, 2016).
Figura 8 - Representação de um kit para pesquisa de Aβ42, empresa ThermoFisherScientific. (Fonte: Thermo Fisher Scientific – disponível em https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/KHB3481, acessado em janeiro de 2016).
5.4.2. ANÁLISES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS
Foram realizados os seguintes exames de sangue:
• Hemograma completo.
• Glicose.
• Colesterol total.
• Triglicérides.
• Fosfatase alcalina, Gama glutamil transferase (Gama GT), Transaminase
oxalacética, Transaminase pirúvica.
• Ureia e Creatinina.
• Dosagem de potássio, sódio, fósforo, proteína C reativa e proteínas totais.
• Ácido fólico, Vitamina B12.
• Triiodotironina (T3), Tiroxina (T4) e hormônio estimulante da Tireoide
(Thyroid stimulating hormone - TSH).
59
As coletas, processamento do material e análise das amostras de sangue estão de
acordo com as recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica (2010), e estes
testes foram realizados no Neolabor – Laboratório de Análises Clínicas em São Paulo e pelo
Laboratório Clinico da Universidade Federal de Mato Grosso em Cuiabá. Todos os
voluntários foram avisados de forma antecipada, que deveriam comparecer em jejum para a
coleta do material (sangue).
5.4.3. FINANCIAMENTO
O presente projeto contou com recursos próprios dos pesquisadores envolvidos e com
a parceria dos laboratórios citados.
5.4.4. RISCOS E BENEFÍCIOS
A participação nesta pesquisa não traz complicações legais para os voluntários.
Os possíveis riscos e desconfortos durante a pesquisa podem ter ocorrido quando da
punção de veia, ressaltando que o mesmo foi realizado por profissional devidamente
habilitado para este fim. Os principais cuidados observados no momento da punção, para se
evitar riscos e desconfortos foram:
• Reunir todo o material a ser utilizado antes do procedimento;
• Lavagem das mãos antes de cada sessão de punção;
• Selecionar adequadamente a veia, evitando veias lesadas, avermelhadas ou
inchadas e próximas a áreas infeccionadas;
• Aplicar adequadamente o garrote;
60
• Calçar as luvas e realizar antissepsia da pele no local escolhido. A solução de
álcool 70º deve estar seca antes da realização do procedimento;
• Após o término do procedimento, o local de punção foi checado e os materiais
descartáveis utilizados foram desprezados na caixa de perfuro cortantes. Para as
coletas feitas através da saliva dos pacientes e urina, não houve qualquer risco
envolvido.
• Todo material utilizado era estéril e não houve risco de contaminação ao
paciente.
A coleta de saliva não trouxe nenhum tipo de risco ou desconforto aos voluntários, por
não ter se tratado de procedimento invasivo.
Benefícios: Esta pesquisa investiga uma provável correlação entre os biomarcadores
descritos no presente termo, como preditivos, mas não conclusivos do possível
desenvolvimento da Doença de Alzheimer.
Caso existam indícios de que os biomarcadores estudados estejam em níveis próximos
ou iguais aos dos pacientes com Doença de Alzheimer; estes pacientes serão encaminhados
aos cuidados do médico, colaborador deste projeto - Dr. Roberto Gomes de Azevedo, CRM
1958MT, onde serão examinados a fim de serem orientados, e, se necessário, clinicamente
entrevistados pelo médico.
Os pacientes que já tem a Doença de Alzheimer poderão ser beneficiados pelas
informações e resultados da pesquisa, que visa contribuir para um maior esclarecimento e
futuras alternativas para o diagnóstico precoce e o tratamento da Doença de Alzheimer.
61
6. RESULTADOS
Todos os dados deste experimento foram tratados estatisticamente com auxílio do
software GRAPH PAD PRISM 5.0. Aplicamos o teste não paramétrico de Mann-Whitney
para a comparação dos diferentes grupos (concentrações).
Foi também aplicado o teste de Kruskal-Wallis para a comparação entre os tempos
experimentais.
O nível de significância de hipótese de nulidade foi de 5% (p≤ 0,05).
6.1. GÊNERO E IDADE DOS PARTICIPANTES
No presente estudo foram analisados 84 pacientes com idade média de 77 anos para os
pacientes com DA e 72 anos para os pacientes sadios, sem DA (SD) conforme gráfico 1.
62
A tabela 1 apresenta os números absolutos e as respectivas médias de idade dos participantes do estudo.
O gráfico 2 demonstra a diferença de gênero dos portadores de Doença de Alzheimer envolvidos no estudo.
63
O gráfico 3 demonstra a diferença de gênero dos pacientes sadios envolvidos no estudo.
O quadro 3 demonstra a distribuição quantitativa absoluta dos pacientes sadios e dos
portadores de DA segundo os seus respectivos gêneros.
Quadro 3 – Distribuição de pacientes sadios e portadores de DA
Sadios DA
Masculino 11 (22%) 22 (50%)
Feminino 28 (78%) 22 (50%)
A caracterização da amostra experimental dos pacientes empregada neste estudo é
compatível com a incidência de DA na faixa etária avaliada.
A população idosa vem aumentando em todo o mundo, especialmente nos países em
desenvolvimento. Estudos epidemiológicos prospectivos indicam que até 2025 o Brasil será o
sexto país do mundo em número absoluto de idosos (RAMOS, et al,1987).
Esta afirmação está de acordo com a observação de que o processo de envelhecimento
populacional aumenta significativamente a prevalência de doenças crônico-degenerativas.
64
Dentre elas, destacam-se as demências, sendo a mais comum a Doença de Alzheimer. A
prevalência da DA dobra a cada cinco anos em pessoas com idades entre 65 e 85 anos
(MAYEUX; STERN, 2012).
No entanto, a distribuição destes cenários apresentou-se de forma diferente em vários
países. Em nossos resultados atentamos para a inclusão dos pacientes nas faixas etárias
sugeridas pela revisão e descrevendo uma amostra de população tipicamente brasileira.
6.2 RESULTADOS HEMATOLOGIA E BIOQUÍMICA
Os dados da tabela 2 demonstram a avaliação dos parâmetros hematológicos dos
pacientes sadios e portadores de DA durante o ciclo de avaliação experimental realizado neste
estudo.
Tabela 2: Resultados dos valores da avaliação hematológica dos grupos DA e Sadio (n= 60)
DA SADIOS Valores de referência
(FLEURY)
Eritrócitos (106/mm3) 4,39±0,63 4,75±0,44 4,0-5,5
Hemoglobina (g/dL) 12,87±1,60 14,45±0,87A 14,0-16,0
Plaquetas (103/µL) 228,75±81,29 217,37±49,49B 150-400 AP < 0,001 aumento em relação ao Grupo DA (Kruskal-Wallis-Anova) BP < 0,001 aumento em relação ao Grupo DA (Kruskal-Wallis-Anova)
Como podemos visualizar os níveis de hemoglobina e plaquetas estão estatisticamente
mais baixos nos pacientes portadores de DA. Estes dados estão de acordo com a literatura que
relata que níveis mais baixos de hemoglobina estão associados ao enfraquecimento cognitivo
na DA (FAUX et al, 2011). Além disso, outros fatores relacionados ao funcionamento do
sistema hematológico também estão diretamente alterados em pacientes portadores de DA,
65
tais como, homocisteína, vitamina B12 e folatos. Estes dados reforçam a associação de
homocisteína presentes no plasma com deterioração cognitiva, embora não seja exclusivo
para DA (FAUX et al, 2011), mas essas alterações podem também estar associadas à quadros
de depressão (COPPEN; BOLANDER-GOUAILLE, 2005).
Recentemente foi sugerida a associação entre os níveis séricos de plaquetas e a
ocorrência de DA (PLAGG et al, 2015), que confirmam disfunções plaquetárias na DA.
As plaquetas são a primeira fonte periférica de PPA. Elas possuem uma maquinaria
proteolítica capaz de produzir fragmentos Aβ similares àqueles produzidos em neurônios. As
plaquetas processam a PPA através da via da α-secretase para liberação da fração solúvel da
PPA (sPPA). Elas produzem pequenas quantidades de Aβ, predominantemente a Aβ40 mais
que a Aβ42. As PPA e Aβ são estocadas em α-grânulos e liberadas depois da ativação
plaquetária por trombina e colágeno, ou agentes que promovem a degranulação plaquetária
(EVIN, LI, 2012). Relatos de mudanças na expressão de PPA pelas plaquetas (EVIN, LI,
2012), bem como alterações nos níveis séricos de plaquetas tem sido demonstrado em
pacientes portadores de DA (VEITINGER et al, 2014).
66
Tabela 3: Resultados dos valores da avaliação bioquímica dos grupos DA e Sadio (n= 60 )
DA SADIOS Valores de referência
(FLEURY)
Glicemia ( mg/dL) 87,77±9,14 92,53±14,12 70-100
Colesterol (mg/dL) 189,87 ± 41,77 223,15±44,03 < 200
HDL (mg/dL) 52,97±12,47 55,80±58,68 > 35
Vit. B12 ( pg/dL) 267,72±117,82 388,52±58,68A 174-878
TSH ( µU/mL) 2,89±3,23 2,50±1,24 0,3 - 4,0
T4 (µg/dL) 10,27±1,77B 1,53±2,10 0,7 - 1,5 T3 (ng/dL) 90,74±18,37C 140,19±22,78 0,25 - 0,45
AP < 0,001 aumento em relação ao Grupo DA ( Kruskal-Wallis-Anova) BP < 0,001 aumento em relação ao Grupo DA ( Kruskal-Wallis-Anova) CP < 0,001 aumento em relação ao Grupo Sadio ( Kruskal-Wallis-Anova)
6.3 RESULTADOS NA SALIVA
O gráfico 4 apresenta a concentração de t-Tau expressa na saliva de pacientes sadios e
de pacientes com DA. Podemos observar que a expressão de t-Tau em pacientes com DA é
significativamente maior se comparada a pacientes sem a DA, o que confirma a hipótese de
que a t-Tau possa ser usada como biomarcador para a DA.
67
Gráfico 4 – Concentração de t-Tau na saliva de pacientes sadios e pacientes com DA. Comparativo da expressão de Tau-T na saliva de pacientes sadios (coluna preta) e portadores de Doença de Alzheimer (coluna branca) expresso em pg/µl. As colunas representam a média +/- o EPM e ** representam diferenças estatística entre os grupos. Avaliados por análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste T de Student para amostras não pareadas para um n=40. EPM sadios: 14,5; doentes: 8,4.
O gráfico 5 apresenta a concentração de Aβ42 na saliva de pacientes sem DA e com DA, sendo possível observar que a variação, embora pequena, aponta para maior concentração de Aβ42 nos pacientes com DA.
Gráfico 5 - Concentração de Aβ40 na saliva de pacientes sadios e pacientes com DA. Comparativo da expressão de peptídeo Aβ na saliva de pacientes sadios (coluna preta) e portadores de Doença de Alzheimer (coluna branca) expresso em pg/µl. As colunas representam a média +/- o EPM e a diferença estatística entre os grupos foi avaliada por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste T de Student para amostras não pareadas para um n=40.
68
7. DISCUSSÃO
A busca de métodos diagnósticos precisos e capazes de predizer o surgimento da DA
tem sido objeto de pesquisa incessante pelos cientistas.
Nos últimos anos diversos biomarcadores para a DA foram desenvolvidos, incluindo
os ensaios para Aβ40 e t-Tau. Os clínicos usam os biomarcadores para diagnosticar a doença
na fase moderadamente sintomática de comprometimento cognitivo leve ou mesmo na fase
completamente assintomática. Desta forma, torna-se possível, desenvolver e pesquisar drogas
capazes de interromper a degeneração e o acúmulo do que acredita ser o principal culpado
neurotóxico da DA, o peptídeo beta amiloide e a proteína Tau (FRISONI; VISSER, 2015).
Com a identificação precoce da DA, por meio de biomarcadores precisos e eficientes,
vários seriam os benefícios conforme demonstrado no quadro 2.
Quadro 4 – Benefícios potenciais do diagnóstico precoce da Doença de Alzheimer.
Benefícios
• Obter tratamento adequado para retardar a progressão da DA no início ao invés de fazê-lo no curso
ou em estágios avançados da doença.
• Fornecer intervenção neuroprotetora secundária em fase prodrômica.
• Parar a procura (diagnóstico) por outras causas.
• Evitar iatrogenias (benzodiazepínicos, antipsicóticos, etc.)
• Ajudar o paciente e sua família a aceitar e compreender a doença.
• Planejamento financeiro e jurídico competente.
• Habilitar o paciente e os familiares a fazerem escolhas quanto ao estilo de vida.
• Induzir melhor adesão e gestão de outras condições médicas.
• Tomar as medidas apropriadas para prevenir lesões.
• Obter maior acesso a ajuda no âmbito do sistema de saúde e dentro das comunidades.
• Participar de ensaios clínicos com tratamentos modificadores da doença.
Fonte: (BROOKMEYER et al, 2002).
69
A identificação de biomarcadores, de forma geral, é realizada por meio de análise no
sangue ou na urina, mas com os recursos tecnológicos é possível a detecção de um grande
número de metabólitos na urina. Os novos resultados obtidos por meio de pesquisas,
adicionam peso à ideia de que é possível detectar precocemente o risco de DA em pessoas
com distúrbios cognitivos leves ou mesmo com envelhecimento normal, e a saliva, por sua
facilidade na coleta, possibilita que estas investigações sejam feitas em áreas remotas
(SAPKOTA et al, 2015).
Nosso trabalho buscou correlacionar às concentrações de biomarcadores encontrados no
sangue e na saliva de voluntários saudáveis e de pacientes com diagnóstico de DA. No
sangue, avaliou-se o hemograma, frações de colesterol e hormônios tireoidianos, enquanto
que na saliva buscamos evidências quanto à expressão do peptídeo beta amiloide e da proteína
Tau na forma total.
A média de idade dos voluntários da pesquisa apresentou-se dentro dos níveis
esperados para a DA, sendo 48% da amostra composta por indivíduos sem DA e 52% com
DA. A média de pacientes com DA foi de 77 anos, faixa etária a partir da qual a prevalência
de DA começa a crescer de forma exponencial (ALZHEIMER’S ASSOCIATION, 2016).
Na distribuição dos gêneros, chamou a atenção o fato de que no grupo de indivíduos
sem DA, 78% era constituído por mulheres, enquanto apenas 22% eram homens, prevalência
pouco comum em estudos com populações maiores, mas que pode ser explicada pela escolha
aleatória dos participantes, condicionada exclusivamente ao aceite para a pesquisa. Segundo
VIÑA e LLORET (2010), a incidência da DA é mais elevada em mulheres, e isto não pode ser
atribuído apenas à maior longevidade das mulheres se comparada aos homens. Uma das
probabilidades diz respeito às mitocôndrias das mulheres mais jovens estarem mais protegidas
70
contra a toxicidade da Aβ se comparada a mulheres de idade mais avançada.
Nossos resultados demonstraram que não há alterações estatisticamente significativas
nos parâmetros de metabolismo de carboidratos (níveis séricos de glicose) nem tampouco no
metabolismo dos lipídios (colesterol e sua fração HDL). Contudo, quando analisados os níveis
de vitamina B12, demonstramos que os pacientes portadores de DA apresentam níveis mais
baixos dessa vitamina, corroborando o trabalho descrito anteriormente por Faux et al, (2011).
A análise dos hormônios tireoidianos revelou que a DA não altera de forma
estatisticamente importante os níveis de TSH plasmáticos, mas promovem mudanças
estatisticamente muito significativas nos níveis de T4 e T3.
Os hormônios tireoidianos apresentam inúmeros efeitos sobre o desenvolvimento,
crescimento e fundamentalmente modulam todas as rotas metabólicas, através de alterações
no consumo de oxigênio, além de mudança no metabolismo das proteínas, lipídios,
carboidratos e vitaminas (RIBEIRO, 2008; SMITH et al, 2002); além de desempenhar um
papel fundamental no desenvolvimento e maturação do SNC. Níveis diminuídos dos
hormônios tireoidianos durante o desenvolvimento do SNC podem levar a danos irreversíveis
relacionados com o crescimento axonal e neurítico, sinaptogênese, migração e sobrevivência
neuronal, mielinização e eficácia sináptica (THOMPSON; POTTER, 2000).
Na espécie humana o T4, considerado como um pró-hormônio representa cerca de
90% da produção de hormônios tireoidiano, enquanto o T3, que é a forma biologicamente
ativa que se liga ao seu receptor, representa apenas 10% da produção dessa glândula
(CATALDO et al, 2001), sendo que a maior parte do T3 circulante é derivado da desiodação
do T4 mediada por desiodases (NUNES, 2003).
71
A desiodação do hormônio tireoidiano é dependente das desiodases do tipo I, II e III
(D1, D2, D3, respectivamente). D1 e D2 ativam T4 em T3, enquanto a D1 é muito menos
ativa em humanos. A D2 é encontrada na tireóide, cérebro, hipófise anterior, gordura marrom,
coração, músculo esquelético e placenta e parece ser a principal responsável pelo T3
circulante. Em contraste, a D3 previne a ativação do T4, convertendo-o em T3 reverso (T3r) e
transformando T3 em T2, que são formas inativas do hormônio (GEREBEN et al, 2015).
Assim, o equilíbrio dinâmico entre as concentrações ativas e inativas dos hormônios
tireoidianos é o resultado da expressão e atividade das isoformas das enzimas D1 e D3 nos
tecidos. A isoforma D3 pode ser encontrada no cérebro, pele, intestino, útero e placenta, e sua
expressão está aumentada em pacientes criticamente doentes, incluindo em doenças
neurodegenerativas e no estresse oxidativo neural, e sua atividade está associada à redução de
T3 sistêmico (BERNAL, 2015; GEREBEN et al, 2015).
Nossos resultados demonstraram que em pacientes portadores de DA, os níveis de T4
estão cerca de 10 vezes mais altos que os normais, sugerindo que ao longo do
desenvolvimento da DA ocorra uma redução na expressão da isoforma da enzima D2, ou que
a neurodegeneração oxidativa colinérgica que acompanha esta patologia, contribua para a
redução da atividade enzimática D2. Este efeito pode ajudar a explicar os níveis reduzidos de
T3 circulantes (35% menores) que acompanham o paciente portador de DA, como
demonstrado em nossos experimentos.
Gereben et al, (2015) sugerem que uma mudança no fenótipo celular para a expressão
de D2/D3 pode modificar drasticamente a capacidade de resposta à sinalização de T3.
72
Armentero (2011) demonstrou que em linfócitos, as formas fosforilada e não fosforilada de
proteina Tau, foram detectadas pelo método de Western Blot, e ambas se mostraram
significativamente aumentadas em pacientes com DA se comparados a grupos controle. O
aumento notado foi de quase duas vezes o normal, demonstrando haver relação direta entre a
fosforilação da proteína Tau e a duração da doença. Os linfócitos de pacientes com DA ou
seus respectivos parentes de primeiro grau, mostraram diferenças substanciais em relação aos
controles com respeito aos lipídios intracelulares (PANI et al, 2009).
As plaquetas são conhecidas por desempenhar um papel importante em uma variedade
de doenças cardiovasculares, psicossomáticas, psiquiátricas e neurodegenerativas. Por esse
motivo, as plaquetas têm sido alvo promissor na busca de biomarcadores periféricos em DA
(EL HAOUARI, ROSADO et al, 2009; PLAGG et al, 2015). As plaquetas humanas são
conhecidas por serem a fonte de mais de 90% da proteína PPA circulante (LI et al, 1994;
PADOVANI et al, 2002) e armazenam Aβ em seus grânulos, especialmente Aβ40, que é
estimulado por agonistas fisiológicos como trombina, colágeno ou cálcio (LI et al. 1999;
BUSH et al. 1990; KOKJOHN et al. 2011; SKOVRONSKY et al. 2001).
Foram realizadas investigações quanto à expressão das plaquetas em pacientes com
DA, e verificou-se que há alterações durante alguns estágios da doença. A proporção de duas
isoformas, produtos da proteína PPA que ocorrem em plaquetas, foi estudada como potencial
biomarcador e apresentou-se diminuída nas membranas de plaquetas de pacientes com DA e
CCL quando comparadas a grupos controle (PADOVANI et al, 2002; BORRONI et al, 2010).
Foram encontradas frações de proteína Tau, significativamente aumentadas nas plaquetas de
pacientes com DA comparados com grupo controle saudáveis, indicando que marcadores
periféricos, como as isoformas de Tau, podem servir como potenciais biomarcadores na DA
73
(NEUMANN et al, 2011; NEUMANN et al. 2011; MUKAETOVA-LADINSKA et al, 2013).
Muitos estudos têm relacionado queda significativa de frações de plaquetas em
pacientes com DA, correlacionando-os positivamente com o declínio cognitivo (DI LUCA et
al, 1996; DI LUCA et al, 1998; BORRONI et al, 2004; TANG et al, 2006; ZAINAGHI et al,
2012).
Estudos anteriores demonstraram a presença de hemoglobina em neurônios de
roedores e de humanos, indicando assim que a hemoglobina é um componente normal de
células nervosas, podendo desempenhar um papel na homeostase de oxigênio intraneural
(FERRER et al, 2011).
A ciência tem buscado nos últimos anos, mecanismos cada vez mais resolutivos,
menos complexos e economicamente viáveis para a predição ou identificação de patologias.
Nesse contexto, a possibilidade de utilização da saliva para o diagnóstico da DA, por meio da
expressão de proteínas específicas, como a proteína Tau e a Aβ, abre um vasto campo de
possibilidades.
O diagnóstico precoce da DA representa uma meta primária, e o papel dos
biomarcadores parece ser crucial para a rotina do ambiente clínico. Estudo realizado em 2010
por Bermejo-Pareja et al, demonstrou que os níveis de Aβ42 são significativamente elevados
em estágios precoces da doença quando comparados a grupos controle. O mesmo estudo
sugere que a medição de Aβ42 possa ser usada para detecção da DA de forma precoce.
Nossos resultados demonstraram elevação da Aβ na saliva de pacientes com DA se
comparados a pacientes sadios, entretanto esta diferença não foi considerada estatisticamente
significativa. Ainda assim, considerando-se que a elevação da proteína Aβ está relacionada ao
74
processo de envelhecimento e neurodegeneração, os dados podem sustentar que mesmo no
grupo de sadios possa haver indícios do surgimento da doença, visto que o primeiro critério
de inclusão, além de possuírem diagnóstico provável de DA, foi a idade igual ou acima de 60
anos de idade.
A proteína Tau, encontrada na saliva, está intimamente relacionada à patogênese da
DA. A descoberta preliminar de que os níveis de Tau estão aumentados em indivíduos com
DA, pode ser um excelente diagnóstico para DA (SHI et al, 2011).
Entretanto, praticamente inexistem dados sobre a t-Tau salivar em pacientes com DA,
principalmente se comparado ao grande número de publicações que tratam da t-Tau e da p-
Tau no LCR de pacientes com DA e outras demências. Desta forma, nosso estudo se propõe a
trazer estas informações comparativas da proteína Tau e beta amiloide salivar, para futuros
estudos sobre o diagnóstico e predição da DA,
Observamos que a expressão de t-Tau em pacientes com DA é significativamente
menor, com redução de 35,5% se comparada à pacientes sem a DA; que confirma a hipótese
de que a t-Tau possa ser usada como biomarcador para a DA.
Nossos resultados coincidem com SHI et al, (2011), que apurou redução da t-Tau e
aumento da p-Tau salivar em pacientes com DA quando comparados a sadios. Os autores
sugerem que o aumento da p-Tau salivar é condizente às mudanças do cérebro e no LCR de
pacientes com DA. Desta forma, comprova que a expressão da proteína Tau na forma total e
na forma fosforilada se dá em concentrações antagônicas de saliva em pacientes com DA.
75
As glândulas salivares estão muito próximas do SNC, e as espécies de Tau podem ser
secretadas por células neuronais para o espaço extracelular (KIM; LEE; HALL, 2010; KIM et
al, 2010). É possível que as espécies de Tau sejam liberadas pelos nervos presentes nas
glândulas salivares, enquanto o LCR pode se comunicar com os compartimentos periféricos,
transportando a Tau ao longo dos nervos cranianos (MOLLANJI et al, 2002; JOHNSTON et
al, 2004).
De acordo com a faixa etária, os valores de referência da t-Tau no LCR de pacientes
com DA, são:
Alvaro, (2016): 21 a 50 anos: 47 a 225 ng/L; 51 a 70 anos: 116 a 360 ng/L; Maior que
70 anos: 170 a 512 ng/L.
Grossman et al, (2005), apresentaram valores um pouco diferentes dos descritos
acima, inclusive com outra unidade de referência: t-Tau no grupo controle: 260,4 pg/ml; t-Tau
em pacientes com DA: 534,6 pg/ml
Existe uma controvérsia com relação à medição de t-Tau e Aβ e a sua correlação, que
se confirmada e esclarecida, torna o presente estudo ainda mais importante. O estudo afirmou
que o aumento de t-Tau e p-Tau, com a redução de Aβ pode ser usado para diferenciar grupos
de pacientes com DA, de grupos controles, isto é, grupos formados por voluntários sadios,
sem a doença (HULSTAERT et al, 1999; DE JONG et al, 2007).
Em adição, a glândula submandibular, que produz a maior parte da estimulação
salivar, é significativamente prejudicada em pacientes com DA (SHIP et al, 1990; SHIP et al,
1994). Isto pode explicar o motivo pelo qual encontramos dificuldades para a coleta de
volume necessário para a realização do teste de ELISA, além de outras situações, onde
mesmo com o volume coletado, foi necessária diluição posterior da amostra.
76
Ao realizarmos correlação das avaliações bioquímicas e hematológicas com os
achados encontrados na saliva dos voluntários, podemos perceber que o grupo que apresenta
concentrações de t-Tau reduzidas, é exatamente o mesmo em que a Vitamina B12 se encontra
abaixo dos níveis considerados normais e principalmente, onde o hormônio T3 mostra-se
significativamente abaixo das concentrações normais.
A literatura não relata a avaliação simultânea, com a utilização dos mesmos grupos,
dos biomarcadores t-Tau, Aβ, T3, TSH e Vitamina B12, tal como demonstrado neste estudo,
fato que motivou nosso grupo a iniciar as investigações. Se o comprometimento neuronal
trazido pela DA traz redução de hormônios tireoidianos é fato que existe relação entre o
sistema endócrino e a patogênese da DA.
Muitos estudos transversais demonstraram aumento ou diminuição dos níveis de
TSH em pacientes com perda cognitiva (VAN BOXTEL et al, 2004; WAHLIN et al, 2005).
Mais recentemente, surgiu a ideia de que a disfunção tireoidiana é um possível fator de risco
para o desenvolvimento irreversível de demência, com muitos estudos epidemiológicos
associando como causa o hiper e o hipotireoidismo (VAN OSCH et al, 2004; GANGULI et al,
1996). Nossa investigação demonstrou esta desproporcionalidade entre o T3 que decai em
pacientes com DA, enquanto a Tiroxina aumenta significativamente, com equilíbrio nas
concentrações de TSH de sadios e pacientes com DA.
77
8. CONCLUSÕES
Os resultados experimentais e a sua respectiva validação pela busca bibliográfica
permitiram assumir como desfecho possível os seguintes pontos:
• A doença de Alzheimer ao longo de sua evolução pode levar a alterações
hematológicas, sobretudo nos níveis de hemoglobina e plaquetas; além disso, foram
demonstrados níveis reduzidos de vitamina B12;
• Nossos resultados demonstraram ainda, que os pacientes portadores de DA
apresentam alterações significativas na atividade tireoidiana, aumentando os níveis
de T4 e reduzindo os níveis de T3;
• A redução dos níveis de T3 ocorreu no mesmo grupo (DA) onde houve a
redução da expressão da t-Tau salivar, condizendo com os achados da literatura
científica.
• A redução da expressão de t-Tau e o aumento de p-Tau salivar ocorreram no
mesmo grupo de pacientes com DA provável, demonstrando haver viabilidade
quanto ao uso destas substâncias como biomarcadores.
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Novos experimentos são necessários, envolvendo a avaliação salivar da expressão de
substâncias como o peptídeo Beta Amiloide e a proteína Tau para comprovar o envolvimento
destes componentes nos pacientes portadores de DA.
78
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96
ANEXOS ANEXO -1 ANUÊNCIAS
97
ANEXO 2
98
ANEXO 3
Ministério da Saúde Secretaria de Atenção à Saúde
PORTARIA Nº 1.298, DE 21 DE NOVEMBRO DE 2013
Aprova o Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas da Doença de Alzheimer.
O Secretário de Atenção à Saúde, no uso de suas atribuições,
Considerando a necessidade de se atualizarem parâmetros sobre a doença de Alzheimer no Brasil e de diretrizes nacionais para diagnóstico, tratamento e acompanhamento dos indivíduos com esta doença;
Considerando que os Protocolos Clínicos e Diretrizes Terapêuticas (PCDT) são resultado de consenso técnico-científico e são formulados dentro de rigorosos parâmetros de qualidade e precisão de indicação;
Considerando as atualizações bibliográficas feitas após a Consulta Pública nº 15/SAS/MS, de 31 de março de 2010, e o Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas consequentemente publicado em portaria; e
Considerando a avaliação técnica do Departamento de Assistência Farmacêutica da Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos (DAF/SCTIE/MS) e da Assessoria Técnica da Secretaria de Atenção à Saúde (SAS/MS), resolve:
Art. 1º Ficam aprovados, na forma do Anexo desta Portaria, o Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas - Doença de Alzheimer.
Parágrafo único. O Protocolo objeto deste artigo, que contém o conceito geral da doença de Alzheimer, critérios de diagnóstico, critérios de inclusão e de exclusão, tratamento e mecanismos de regulação, controle e avaliação, é de caráter nacional e deve ser utilizado pelas Secretarias de Saúde dos Estados e dos Municípios na regulação do acesso assistencial, autorização, registro e ressarcimento dos procedimentos correspondentes.
Art. 2º É obrigatória a cientificação do paciente, ou do seu responsável legal, dos potenciais riscos e efeitos colaterais relacionados ao uso de medicamento preconizado para o tratamento da doença de Alzheimer.
Art. 3º Os gestores estaduais e municipais do SUS, conforme a sua competência e pactuações, deverão estruturar a rede assistencial, definir os serviços referenciais e estabelecer os fluxos para o atendimento dos indivíduos com a doença em todas as etapas descritas no Anexo desta Portaria.
Art. 4º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação.
Art. 5º Fica revogada a Portaria nº 491/SAS/MS, de 23 de setembro de 2010, publicada no Diário Oficial da União nº 184, de 24 de setembro de 2013, Seção 1, página 670.
99
ANEXO 4
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO “Análise comparativa de biomarcadores na demência do tipo Doença de Alzheimer”. Aprovado pelo Comitê de Ética CAAE: 32791814.4.0000.5493 Parecer: 792.091 Pesquisador principal: Paulo Celso Pardi Pesquisadores assistentes: Gustavo Alves Andrade dos Santos 1. Natureza da Pesquisa: o (a) Sr (Sra.) está sendo convidada (o) a participar desta pesquisa que tem como finalidade a avaliação de alguns biomarcadores presentes no sangue e urina de paciente idosos normais ou com o diagnóstico de Doença de Alzheimer. As substâncias a serem pesquisadas são: Proteína TAU total, TAU fosforilada, Beta amiloide, Hormônio T4, além dos níveis séricos de glicemia. 2. Participantes na Pesquisa: Serão convidados a participar deste experimento 120 idosos, de ambos os sexos, sendo 60 indivíduos normais, isto é, sem a Doença de Alzheimer diagnosticada, e 60 diagnosticados com Doença de Alzheimer pelo MiniExame de estado mental(MEEM) e pelo inventário neuropsiquiátrico (NPI). 3. Envolvimento na Pesquisa: ao participar deste estudo o (a) Sr (Sra.) permitirá que o pesquisador Gustavo Alves Andrade dos Santos realize a coleta de sangue para a realização dos exames laboratoriais acima mencionados. O (A) Sr (Sra.) tem a liberdade de se recusar a participar e ainda se recusar a continuar participando em qualquer fase da pesquisa, sem qualquer prejuízo para o (a) Sr (Sra.). Sempre que quiser poderá pedir mais informações sobre a pesquisa através do telefone do pesquisador do projeto e, se necessário através do Comitê de Ética em Pesquisa. 4. Coletas: Será realizada em datas agendadas e de acordo com a conveniência do paciente. 5. Riscos e desconforto: a participação nesta pesquisa não traz complicações legais. Possíveis riscos e desconfortos durante a pesquisa: por tratar-se de puncionamento de veia, isto é, retirada de material biológico (sangue), pode haver certo desconforto no momento da incisão da agulha, não significando dor. O procedimento em si apenas pode trazer risco ao paciente, caso não sejam observados cuidados específicos quanto ao procedimento em si. Os principais cuidados a serem observados no puncionamento para não trazer riscos aos pacientes são: Reunir todo o material a ser utilizado antes do procedimento; Lavagem das mãos antes de cada sessão de puncionamento; Selecionar adequadamente a veia, evitando veias lesadas, avermelhadas e inchadas ou próximas a áreas infeccionadas; Aplicar adequadamente o garrote; Calçar as luvas e realizar antissepsia da pele no local escolhido. A solução de álcool 70º deve estar seca antes da realização do procedimento; Após o término do procedimento, checar o local de puncionamento e desprezar os materiais descartáveis utilizados na caixa de perfuro cortantes. Para as coletas feitas através da saliva dos pacientes, não há qualquer risco envolvido. 6. Confidencialidade: todas as informações coletadas nesse estudo acerca dos pacientes com ou sem a Doença de Alzheimer, são estritamente confidenciais. Somente o pesquisador e o orientador terão conhecimento dos dados. Os pesquisadores irão tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo. Os resultados das coletas serão de uso exclusivo dos pesquisadores e permanecerão confidenciais. Seu nome ou o material que indique a sua participação não será liberado sem a sua permissão. Você não será identificado (a) em nenhuma publicação que possa resultar deste estudo. Uma cópia deste consentimento informado será arquivado no Comitê de Ética em Pesquisa. 7. Benefícios: A Pesquisa investiga a provável relação entre biomarcadores e o surgimento da Doença de Alzheimer. Caso existam indícios da doença para aqueles integrantes do grupo que não tem a Doença de Alzheimer, os mesmos serão encaminhados aos cuidados médicos do Dr. Roberto Gomes
100
de Azevedo, CRM 1958MT, presidente da Sociedade brasileira de Geriatria e Gerontologia de Mato 2 Grosso, onde serão examinados a fim de confirmar ou não a possibilidade levantada pela pesquisa. Os pacientes que já tem a Doença de Alzheimer poderão ser beneficiados pelas informações e resultados da pesquisa, que poderão contribuir para maior esclarecimento e futuras alternativas de diagnóstico e tratamento da Doença de Alzheimer. 8. Pagamento: o (a) Sr (Sra.) não terá nenhum tipo de despesa para participar desta pesquisa, bem como nada será pago por sua participação. Estes pacientes já estarão no ambiente onde será coletado o material, não havendo gastos com transporte, hospedagem, creche, alimentação e outros. Não obstante às informações prestadas, não haverá também compensação por danos ou algum tipo de seguro, desnecessário no âmbito deste tipo e pesquisa. Após estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma livre para participar desta pesquisa. Portanto, preencha por favor, os itens que se seguem. Observação: não assine este Termo se ainda tiver dúvida a respeito. Consentimento Livre e Esclarecido. Tendo em vista os itens acima apresentados, eu de forma livre e esclarecida, manifesto meu consentimento em participar da pesquisa “Análise comparativa de biomarcadores na demência do tipo Doença de Alzheimer”. Declaro que recebi cópia deste termo de consentimento, e autorizo a realização da pesquisa e a divulgação dos dados obtidos neste estudo. Nome do Participante da Pes quisa (paciente) RG (ou documento de identidade) do participante da pesquisa:_______________________________
___________________________________________________________________
Assinatura do participante da pesquisa
___________________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador
___________________________________________________________________
Assinatura do Orientador
Prof. Dr. Paulo Celso Pardi - RG 15470099 e CPF 089.878.328.30
Pesquisador Gustavo Alves Andrade dos Santos – RG 18771625 e CPF 10643375899
Telefones para contato: (11) 3336 2041 e (11) 99999 8015
(Gustavo); (11) 2967 9101 e (11) 99815 7090.