ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES

GISELDA MATOS XAVIER

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY

RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ MARÇO – 2003

ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES

GISELDA MATOS XAVIER

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal

Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos

CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ MARÇO – 2003

ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES

GISELDA MATOS XAVIER

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal

Aprovada em 24 de março de 2003

Comissão examinadora:

Prof a. Vera de Souza Gouvea (PhD - Epidemiologia/Virologia) - UFRJ

Prof a. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira (Doutora-Microbiologia) - UENF

Prof a. Rita Trindade Ribeiro Nobre Soares (Doutora-Zootecnia) - UENF

Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Microbiologia) – UENF (Orientador)

ii

"Todo mundo é um cientista maluco e a vida é o Laboratório. A gente está sempre

experimentando, tentando achar um jeito de viver, de resolver os problemas, de se

livrar da loucura do caos”.

-- David Cronenberg

iii

A

Lucila Matos, Gisele Matos e familiares

Dedico

iv

AGRADECIMENTO

Agradeço a Deus pelas vitórias e, principalmente, pelas dificuldades

enfrentadas durante a realização deste trabalho, pois, com certeza, foram estes os

momentos em que mais precisei e notei Sua presença.

À minha mãe Lucila amada que, mesmo sem entender quase nada do que

eu fazia, sempre esteve disponível para ajudar-me.

À Gisele Matos e minha “dinda” Jô, sempre prontas a ouvir explicações

sobre Mestrado, Teses, etc.

Ao Prof. Carlos Eurico Travassos, pelo exemplo de ética e profissionalismo

que me incentivam a continuar trilhando o caminho da Pesquisa.

À Profa. Sílvia Regina Pereira, pelas inestimáveis orientações, aulas

ministradas e conselhos.

À equipe de Virologia, que, mesmo tão pequena, mostra-se tão unida.

A toda equipe do Laboratório de Virologia Molecular e Tropical da UFRJ, que

muito me ajudou nestes momentos finais: profa. Vera Gouvea, André Domingues,

Alexsandra Mendonça, Felipe Naveca e João.

A Jamile dos Santos e Lucíula Kfuri, que, mesmo de longe, torceram por

mim.

A Iliani Bianchi, por “sofrer” junto comigo os desafios deste trabalho.

A Isabel Bonna, Francimar Gomes e André Fernandes, pelos momentos de

descontração muitas vezes vindos na forma de pizzas, crepes e churrascos.

Aos professores Olney Motta, Francisco Carlos, Marcos Matta e Rita

Trindade, pelas dicas de como desenvolver este e outros trabalhos.

v

A Gina Nunes pela paciência e atenção em ouvir meus problemas.

A Luciana Lemos, Rodrigo Crespo e Alessa Santos, pelo auxílio na

Anatomia Patológica e pelo cafezinho.

A Helaíne Haddad, que, mesmo em tão pouco tempo, já demonstrou ser

uma boa amiga.

A Etiene Ambrósio, que resolve quase tudo relacionado à pós-graduação,

sempre com muita paciência e bom humor.

A todos os suinocultores que permitiram o desenvolvimento deste trabalho.

À FENORTE, pelo auxílio financeiro.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização

deste trabalho.

vi

BIOGRAFIA

Giselda Matos Xavier, filha de Lucila Cruz Matos e Antonio Oliveira Xavier,

nasceu em 26 de julho de 1972, na cidade do Rio de Janeiro – RJ.

Desde 1992, desenvolve pesquisa na área de Microbiologia, iniciando-se em

Microbiologia de Alimentos e estendendo-se à Microbiologia Parasitária.

Em 1995, foi admitida no curso de Medicina Veterinária pela então

Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde continuou a dedicar-se à

pesquisa na área de Microbiologia.

Foi admitida, em março de 2001, no Curso de Pós-graduação em Produção

Animal, Mestrado, Sanidade Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa

de tese para conclusão do referido curso em março de 2003.

vii

CONTEÚDO

RESUMO................................................................................................................ ix

ABSTRACT............................................................................................................. x

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 4

2.1. Caracterização dos rotavírus............................................................................ 4

2.2. Epidemiologia................................................................................................... 7

2.3. Patogênese e Patologia ................................................................................... 8

2.4. Imunidade contra a infecção ............................................................................ 9

2.5. Manifestações clínicas ..................................................................................... 9

2.6. Diagnóstico....................................................................................................... 9

2.7. Rotavirose em crianças.................................................................................. 10

2.8.1. Rotavírus em suínos................................................................................... 11

2.9. Tratamento, prevenção e controle.................................................................. 11

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 12

3.1. Colheita das amostras.................................................................................... 12

3.2. Análise das fezes por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo

duodecil sulfato de sódio (SDS) ............................................................................ 14

3.2.1. Preparo das amostras fecais....................................................................... 14

3.2.2. Preparo dos géis e aplicação das amostras................................................ 14

viii

3.2.3. Corrida eletroforética ................................................................................... 15

3.2.4. Coloração do gel ......................................................................................... 15

3.3. Extração de RNA viral das fezes e RT-PCR .................................................. 16

3.3.1. Extração de RNA viral ................................................................................. 16

3.3.2. Preparo das amostras e RT-PCR (1a.amplificação) .................................... 18

3.3.2.1. RT-PCR baseada na especificidade de VP7 (genotipo G) ....................... 18

3.3.2.2. RT-PCR baseada na especificidade de VP4 (genotipo P) ....................... 18

3.3.3.Tipagem através de PCR a partir de cDNA (2a amplificação) ...................... 19

3.3.3.1. Tipagem através de PCR para VP7 ......................................................... 19

3.3.3.2. Tipagem através de PCR para VP4 ......................................................... 19

3.3.3.3. Adição de cDNA e PCR............................................................................ 19

3.3.4. Eletroforese em gel de agarose .................................................................. 20

3.4. Isolamento de rotavírus em células MA-104 .................................................. 20

3.4.1. Cultura de células........................................................................................ 20

3.4.2. Tratamento das fezes.................................................................................. 21

3.4.3. Inoculação ................................................................................................... 21

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 23

4.1. SDS - PAGE................................................................................................... 23

4.2. Caracterização através de PCR ..................................................................... 26

4.3. Cultivo celular................................................................................................. 28

5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 29

6. RECOMENDAÇÕES......................................................................................... 30

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 31

ix

RESUMO

XAVIER, Giselda, M., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; março de 2003; Rotavírus como causa de diarréia em leitões; Professor Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos. Professoras Conselheiras: Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira, Rita da Trindade R.N. Soares e Vera de Souza Gouvea.

O crescimento da produção interna e da exportação de carne suína depende da

sanidade das granjas brasileiras. Leitões com rotavírus podem sobreviver à infecção,

mas o número de refugos e os gastos com medicamentos geram prejuízos aos

produtores. De 226 amostras de fezes de leitões testadas através de PAGE, quatro

foram positivas para rotavírus e caracterizadas através de RT-PCR em G3P[7]; G1-

G5P[7]; G5P[7] e G5P[5]. Uma das amostras caracterizou-se por mistura de duas

espécies diferentes de rotavírus.

Palavras-chave: diarréia, leitões, PAGE, RT-PCR.

x

ABSTRACT

XAVIER, Giselda M., M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; março de 2003; Rotavirus causing diarrhea in piglets; Adviser: Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos. Counselor: Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira, Rita da Trindade R.N. Soares e Vera de Souza Gouvea

The growth of internal produce and of pork meat exportation depend on the health

conditions of Brazilian farm animals. Piglets contaminated by rotavirus could survive

but the number of refusals and the costs on veterinary drugs is considered. Of two

hundred and twenty-six fecal specimens from piglets were positive to group A

rotavirus and characterized by RT-PCR in G3P[7]; G1-G5P[7], G5P[7] and G5P[1].

One of fecal samples presented a case of mixed infection involving two different

strains of rotavirus.

Key words: diarrhea, piglets, RT-PCR, PAGE.

vii

1

1. INTRODUÇÃO

O Brasil ocupa a quarta colocação em exportação de carne suína, sendo

superado apenas pelos Estados Unidos, Canadá e União Européia. Somente no ano

de 2002, o país contribuiu com cerca de 320 mil toneladas de carne suína

exportada. Apesar da considerável participação brasileira no mercado exterior, o

consumo de carne suína no país ainda é baixo. A título de ilustração, enquanto nos

EUA e na Europa o consumo desta carne por habitante/ano é de 24,00 e 42,00 kg,

respectivamente, no Brasil, este consumo só atinge 10,09 kg/habitante/ano

(DESOUZART, 2003).

Dentro do mercado brasileiro, a região Sul ainda responde pela maior

representação numérica, econômica e tecnológica dentro da suinocultura,

contribuindo com 34,53% de todo o rebanho suíno brasileiro. As regiões Sudeste e

Centro Oeste também têm recebido destaque em relação à produção de suínos,

respectivamente, com 18,93% e 15,87% de toda a produção (IBGE, 2001).

O manejo apropriado em granjas suinícolas pode aumentar o desempenho

reprodutivo, reduzir a mortalidade entre os animais (SOBESTIANSKY et al., 1998) e,

conseqüentemente, favorecer o crescimento da produção interna e do volume de

exportação.

O manejo sanitário de uma granja suinícola pode ser dividido em dois

grupos:

2

a) Manejo sanitário dirigido aos animais – consiste no monitoramento clínico

e laboratorial dos animais, visando não somente à prevenção, mas também ao

tratamento e controle de doenças.

b) Manejo sanitário dirigido ao ambiente – inclui desde controle da qualidade

do ar, temperatura e ventilação da granja até controle de moscas, roedores e outros

agentes potencialmente transmissores de doenças (SOBESTIANSKY et al., 1998).

Um manejo inadequado, bem como alterações ambientais, fatores

nutricionais e fisiológicos e uma grande gama de agentes etiológicos contribuem

para a síndrome de diarréias em suínos (GREGORI et al., 2000).

Em criações de sistema intensivo da região Sul do Brasil, por exemplo, a

taxa de mortalidade média de leitões lactentes varia de 15 a 20%, sendo o

esmagamento, a inanição e as diarréias as principais causas dessas perdas

(TAGLIARI e BRITO, 1998).

A diarréia é uma das principais enfermidades que afetam leitões lactentes

(BRITO et al., 1999). Sua etiologia é complexa, sendo primariamente um quadro

induzido pelo estresse do desmame, onde vários agentes infecciosos como

bactérias, protozoários e vírus podem estar envolvidos (SILVA et al., 1999).

Os rotavírus têm sido reconhecidos como os principais agentes causadores

de gastroenterite aguda em humanos e animais (SANDERS, 1985). São

encontrados isolados ou associados a outros agentes patogênicos (KAMINJOLO e

ADESIYUN, 1994), o que agrava em muito a sua manifestação, como ocorre em

infecções mistas entre rotavírus e Cryptosporidium (BARBOSA et al., 1998).

A importância econômica das diarréias causadas por rotavírus, isolados ou

associados a outros agentes infecciosos não se deve somente à morte dos leitões,

mas, principalmente, ao comprometimento de seu desenvolvimento até o momento

do abate (TAGLIARI e BRITO, 1998). Um exemplo disto é que Svensmark et al.

(1989), citados por BRITTO et al. (1999), observaram que leitegadas com diarréia

pré-desmame apresentavam menor uniformidade e pesavam, em média, 400g a

menos aos 30 dias em comparação com leitegadas sem diarréia.

Ainda que leitões infectados por rotavírus possam sobreviver, o número de

refugos e os gastos com medicamentos aumentam consideravelmente, gerando

prejuízos significativos aos suinocultores (TAGLIARI e BRITO, 1998).

Diante da importância que as diarréias assumem em relação à produtividade

das granjas suinícolas, o presente estudo teve por objetivo principal avaliar a

3

presença de rotavírus em suínos através da técnica de eletroforese em gel de

poliacrilamida com duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

A partir das amostras positivas, foram traçados os seguintes objetivos:

• Caracterizar os eletroferotipos por PAGE.

• Isolar e adaptar o vírus em culturas de células.

• Caracterizar os genotipos utilizando a técnica de reação

em cadeia de polimerase RT-PCR (reverse transcriptase – polymerase

chain reaction).

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Caracterização dos rotavírus

Estes vírus são classificados como um gênero pertencente à família

Reoviridae (RAMIG, 1994), que contém ainda outros oito gêneros distintos

(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Os rotavírus não são envelopados e possuem

simetria icosaédrica (RAMIG, 1994). A partícula viral completa mede cerca de 70 nm

de diâmetro e é constituída de dois capsídeos, conhecidos como capsídeo externo e

interno. No interior do capsídeo interno existe uma terceira camada, o core (ou

cerne), que contém o genoma viral consistindo de 11 segmentos de RNA fita dupla

(dsRNA). O termo rotavÍrus é derivado da palavra em Latim “rota”, que significa

“roda”,e foi sugerido devido ao formato definido do capsídeo externo quando

observado por microscopia eletrônica de transmissão (KAPIKIAN e CHANOCK,

1996).

Os segmentos de RNA podem ser divididos em quatro classes com pesos

moleculares diferentes. Esta distribuição pode ser evidenciada através de PAGE-

SDS (RAMIG, 1994). Os segmentos de RNA de 1 a 4 são denominados como grupo

I, os segmentos 5 e 6 como grupo II, os segmentos 7 a 9 como grupo III e os

segmentos 10 e 11 como grupo IV (ESTES et al., 1984), formando, ao final da

análise, uma migração característica denominada eletroferotipo (SILVA et al., 2001),

que, no caso do rotavírus do grupo A, assume o padrão IV-II-III-II (4-2-3-2). Cada

5

segmento de RNA codifica, pelo menos, uma proteína específica, sendo seis delas

estruturais e cinco não-estruturais (PRASAD e CHIU, 1994).

Com base nas características antigênicas presentes na proteína VP6,

codificada pelo segmento 6 do RNA e presente no capsídeo interno do vírus, os

rotavírus podem ser classificados em grupos (ou sorogrupos). Rotavírus do grupo A

já estão bem estabelecidos como agentes causadores de diarréia em animais e

humanos jovens. Os vírus pertencentes ao grupo B têm sido associados a epidemias

de diarréia aguda em adultos na China (ESTES, 1996). De acordo com trabalhos de

Saif & Jiang, 1994; Morin et al., 1990; Saif, 1980; Saif et al., 1980 citados por KIM et

al. (1999), os rotavírus do grupo C têm sido relatados como causa de diarréia

esporádica em leitões nas fases de amamentação e creche.

A propriedade antigênica de VP6 permite ainda a classificação dos rotavírus

do Grupo A em subgrupos, representados por algarismos romanos, que indicam

uma migração eletroforética no gel de poliacrilamida curta (subgrupo I) ou longa

(subgrupo II), conforme descrito por KAPIKIAN e CHANOCK, 1996.

A caracterização sorotípica do grupo A de rotavírus é baseada nos

determinantes de neutralização, localizados nas proteínas do capsídeo externo, VP4

e VP7, que são segregadas independentemente. A VP4 é uma proteína não

glicosilada, sensível à ação de proteases (tripsina, por exemplo), que é codificada

pelo segmento quatro do genoma viral e determina o sorotipo P (protease). A VP7,

por sua vez, é uma glicoproteína codificada pelo segmento 7, 8 ou 9, dependendo

da linhagem viral,que determina o sorotipo G (glicoproteína) (ROSEN et al., 1994).

Ensaios de neutralização com soro hiperimune permitem a identificação de

14 sorotipos G (G1 a G14), sendo seis (G1 a G5 e G9) descritos tanto em porcinos

como em humanos (Ciarlet et al, 1995 citados por PONGSUWAANA et al.,1996) e

um (G11) descrito exclusivamente em porcinos (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996).

Dentre os sorotipos encontrados em suínos, G5 tem sido o mais prevalente

(SANTOS et al., 1999).

Uma classificação, baseada em ensaios de neutralização, permite também a

identificação de 11 sorotipos P, sendo dois específicos de porcinos (P9 e P2B)

(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Entretanto, a classificação sorológica dos sorotipos

P tem sido dificultada pela indisponibilidade de soro hiperimune que distinga os tipos

P individuais (GOUVEA et al., 1994 b).

6

Através de técnicas de seqüenciamento, hibridização e amplificação de

ácidos nucléicos, é possível, ainda, classificar os rotavírus em, pelo menos, 15 tipos

P diferentes de acordo com a especificidade de VP4 (GOUVEA et al., 1994 b), e 11

tipos G distintos em relação à VP7 (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Dentre os tipos

P, dois têm sido identificados em linhagens porcinas OSU e Gottfried (Estes e

Cohen, 1989, Negesha et al., 1993, Rosen et al., 1992, citados por GOUVEA et al.,

1994 b).

Desde 1985, a técnica de amplificação de DNA utilizando a reação em

cadeia de polimerase (PCR) tem sido uma ferramenta muito valiosa em biologia

molecular (KAWASAKI, 1990). O método simula o fenômeno de replicação do DNA

in vivo, onde, a partir de uma fita molde de DNA, é produzida uma nova fita

complementar ao molde (ROLFS et al., 1992). A partir de 1987, quando o PCR foi

utilizado para amplificar seqüências de mRNA a partir de cDNA, aumentou em muito

a sensibilidade de detecção do ácido nucléico, além de ter possibilitado a análise de

RNA a partir de amostras contendo poucas quantidades de RNA molde (KAWASAKI,

1990). Neste caso, o RNA deve ser transcrito a cDNA antes da amplificação. A partir

daí, o DNA é amplificado enzimaticamente através de vários ciclos de PCR, cada

ciclo envolvendo três etapas:

a) Desnaturação da fita molde de DNA, resultando na separação das fitas.

b) Anelamento dos primers à seqüência de DNA.

c) Duplicação e extensão do DNA (ROLFS et al., 1992).

A técnica de tipagem de produtos de PCR (PCR-Typing) para classificar

tipos G humanos de rotavírus foi desenvolvida por GOUVEA et al.(1990) e estendida

para incluir a classificação de tipos P humanos por GENTSCH et al. (1992), e G e P

animal por GOUVEA et al. (1994 a e b, respectivamente), contribuindo,

sobremaneira, para a caracterização genômica do vírus.

Uma das vantagens do PCR no diagnóstico molecular de rotavírus é sua

aplicabilidade para caracterizar linhagens virais difíceis de serem adaptadas em

cultura de células (SANTOS et al., 2002). Entretanto, a presença do RNA viral na

amostra não prova que a mesma seja infecciosa (GRATACAP-CAVALLIER et al.,

2000). Por esta razão, a adaptação e propagação de rotavírus em cultivos celulares

devem ser sempre requeridas para: facilitar o preparo de grandes quantidades de

vírus para uma caracterização adicional (incluindo PCR); estudos comparativos;

7

encontrar linhagens virais candidatas à produção de vacinas; e desenvolver novos

sorotestes adequados (THEIL et al., 1978).

Células de rim de macaco Rhesus (Linhagem MA-104) têm sido empregadas

na propagação de rotavírus de origem humana e animal (KITAMOTO et al., 1991). O

sucesso do isolamento de rotavírus humanos (WARD et al., 1984) e animais (RÁCZ

et al., 1993) tem sido relativamente alcançado com meio de cultura contendo tripsina

e estando livre de soro (WARD et al., 1984). Entretanto, em alguns casos são

necessárias várias passagens cegas em culturas de células, objetivando o

isolamento do vírus (RAMOS, 1996, THEIL et al., 1978). Isto porque não é raro o

vírus produzir um efeito citopático (CPE) moderado (THEIL et al. 1977) ou até

mesmo não se adaptar à cultura (SESTÁK e MUSILOVÁ, 1994).

2.2. Epidemiologia

A transmissão do vírus ocorre intraespécies e interespécies através,

principalmente, da via fecal-oral (MASCARENHAS, 1999), com um período de

incubação que pode variar de 1 a 4 dias, sendo que, em geral, a doença ocorre em

menos de 48 horas (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996) caracterizando-se por febre,

vômito e diarréia. Vale ressaltar que o período de incubação pode chegar a 10 dias,

conforme observado no surto de diarréia aguda de camundongos lactentes da

Universidade de Harvard em 1944, que tornou conhecido o vírus como EDIM (vírus

da epizootia da diarréia em ratos infantis) (FLEWETT e WOODE , 1978).

Um dado interessante referente à epidemiologia de rotavírus é o fato da

possibilidade de reassortment (reagrupamento), que pode ocorrer quando células

são infectadas por dois ou mais vírus de diferentes linhagens, de modo que a

progênie decorrente dessa infecção poderá ter segmentos genômicos originados

dos dois vírus progenitores, formando uma nova constelação genômica (GOMBOLD

e RAMIG, 1994). Tal reagrupamento pode amplificar a transmissão interespécies,

além de aumentar a capacidade infecciosa do rotavírus a partir da emergência de

novas linhagens de rotavírus (SANTOS et al.,1999).

Os rotavírus mostram um padrão sazonal de infecção em países

desenvolvidos de picos epidêmicos ocorrendo nos meses mais frios do ano

(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996), podendo, inclusive, variar muito em diferentes anos

(PARASHAR et al., 1998). No Brasil, a maior incidência de diarréias provocadas por

8

rotavírus, segundo observações de Cardoso et al., 1992, citados por LINHARES

(2000), ocorre nos meses mais secos do ano nas regiões Centro-Oeste, Sudeste e

Sul e nas demais regiões se mantém em torno de 20% durante todo o ano

(PEREIRA et al., 1993).

2.3. Patogênese e Patologia

Os vírus liberados nas fezes podem chegar à ordem de 109-1011 partículas

infecciosas por mililitro de fezes (FLEWETT e WOODE, 1978), sendo que a

excreção máxima ocorre entre o 3º e 4º dia após o início dos sinais clínicos

(MASCARENHAS, 1999). Água, alimentos e fômites contaminados funcionam como

fontes de infecção (MURPHY, 1995) tanto para o homem como para os animais. A

alta taxa de liberação viral nas fezes, associada à estabilidade que os rotavírus

possuem frente a diversos fatores ambientais, garante a grande transmissibilidade

deste vírus, o que, de um modo geral, dificulta em muito o seu controle. Por

exemplo, rotavírus presentes em fezes de bovinos conservam sua infecciosidade por

sete meses quando mantidos à temperatura ambiente (KAPIKIAN e CHANOCK,

1996) e rotavírus suínos mantidos nas fezes originais por 32 meses a 10oC ainda

são infecciosos (RAMOS et al., 2000).

Uma vez no hospedeiro, os vírus resistem ao pH ácido do estômago e

alcançam o trato intestinal, onde replicam nos enterócitos de revestimento das

vilosidades do intestino delgado (RAMIG, 1994), no duodeno e porção anterior do

jejuno (FLEWETT e WOODE , 1978). A partir da replicação, são liberadas novas

partículas virais que irão infectar outras células ou serão eliminadas através das

fezes, contaminando outros animais. Em pouco tempo, as lesões determinam a

atrofia e fusão das vilosidades intestinais, infiltração da lâmina própria por células

mononucleares, distensão das cisternas do retículo endoplasmático, turgidez e

diminuição de mitocôndrias, dentre outras lesões. Como conseqüência, ocorrerá

redução da área de absorção, impedindo a digestão de lactose e o transporte celular

de nutrientes e sais minerais, culminando com o quadro de diarréia (MARECO e

KROEFF, 2000).

9

2.4. Imunidade contra a infecção

Os mecanismos imunológicos de proteção contra a diarréia provocada pelos

rotavírus envolvem a participação de anticorpos presentes no intestino,

principalmente imunoglobulinas das classes A e G (IgA e IgG) (MASCARENHAS,

1999). Os anticorpos produzidos protegem, parcialmente, contra reinfecções futuras,

de modo que estas tenderão a se tornarem não muito severas (OFFIT, 1994).

Além disso, a imunidade adquirida contra rotavírus parece ser sorotipo-

específica. Assim, em infecções onde o sorotipo envolvido seja G5 (protótipo OSU-

Ohio State University), por exemplo, a proteção alcançada para futuras infecções

será para G5, mas não para G4 (protótipo Gottfried) (SOLARTE et al., 1999).

2.5. Manifestações clínicas

A infecção por rotavírus produz vários tipos de respostas, que variam de

infecções subclínicas a doença severa e ocasionalmente fatal (KAPIKIAN e

CHANOCK, 1996). Inicialmente, observa-se febre e, em seguida, diarréia, podendo

ocorrer com ou sem vômito e agravar-se quando associada a outros

microorganismos (FLEWETT e WOODE, 1978) . A desidratação está

freqüentemente presente e o óbito ocorre de modo ocasional (KAPIKIAN e

CHANOCK, 1996).

2.6. Diagnóstico

O diagnóstico de rotavirose não pode ser fundamentado apenas na

observação dos sinais clínicos, uma vez que muitas patologias provocam sinais

semelhantes. Dessa forma, torna-se necessária a detecção do vírus ou do antígeno

viral e/ou a manifestação da resposta sorológica (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996),

através de provas tais como: SDS-PAGE, microscopia eletrônica, PCR,

imunofluorescência, ELISA e aglutinação em látex. Dentre elas, a microscopia

eletrônica e o SDS-PAGE são as mais utilizadas, sendo a última freqüentemente

empregada em estudos epidemiológicos de infecções por rotavírus em humanos e

animais, com o objetivo de identificar as diferentes espécies do vírus envolvidas na

infecção (DANIEL et al., 1996).

10

2.7. Rotavirose em crianças

Em países desenvolvidos, tais como EUA, Austrália e Japão, estima-se que

entre 39 e 63% das hospitalizações de crianças com diarréia aguda deve-se à

infecção por RV (SANDERS, 1985). Em países em desenvolvimento, este vírus

também representa a causa mais isolada de diarréia aguda (NETO, 1987), sendo

responsável pela morte de 600.000 a 870.000 crianças por ano, o que corresponde

a 20-25% do total de óbitos por doença diarréica (LINHARES, 2000).

No Brasil, em particular, vários estudos foram realizados objetivando

determinar a prevalência das diarréias causadas por rotavírus entre crianças com

menos de seis anos de idade. Os índices de positividade variaram de 11,6% no Rio

de Janeiro a 42% no Rio Grande do Sul (LINHARES, 2000).

Estudos mostram uma alta prevalência de diarréias causadas por rotavírus

nos meses mais frios do ano (NETO, 1987). De acordo com Pereira et al., (1983),

citado por LINHARES (2000), nas regiões Centro-Oeste e Sudeste/Sul, observa-se

maior incidência de diarréia por RV nos meses mais frios e mais secos: cerca de

20% nos meses de maio a setembro, com picos de aproximadamente, 40% entre

junho e julho. Em contrapartida, nas regiões Norte e Nordeste tal sazonalidade não

foi observada, tendo sido encontrada prevalência em torno de 15% durante todo o

ano. Apesar do possível perfil sazonal das infecções por rotavírus, não se exclui a

ocorrência de surtos por este agente viral em meses do ano que não são

caracteristicamente frios e/ou secos.

2.8. Rotavirose em animais

Enterites em animais são freqüentemente multifatoriais e a interação de

outros agentes infecciosos com fatores imunológicos, ambientais e nutricionais pode

exacerbar a doença (MURPHY, 1995).

Rotavírus já foram descritos em bovinos, ovinos, suínos, eqüinos, caninos,

felinos, lagomorfos, roedores, símios e espécies aviárias (MURPHY et al., 1995).

Em aves, já foram relatados em frangos, pombos e patos (GARCIA et al., 1999).

11

2.8.1. Rotavírus em suínos

Devido ao fato da infecção por rotavírus ser restrita tipicamente à célula do

intestino delgado, tanto a imunidade passiva como a ativa é mediada por anticorpos

locais. Entretanto, os leitões nascem sem anticorpos maternos, pois não há

transferência transplacentária de anticorpos em suínos, apesar de serem

imunocompetentes. A proteção alcançada pela ingestão de colostro tão logo o leitão

nasça pode abreviar ou prevenir a doença em recém-natos, principalmente se a

ingestão ocorrer durante o período de absorção máxima do colostro pelo intestino,

nas primeiras 24-36 horas de vida do leitão (WARD et al., 1996).

2.9. Tratamento, prevenção e controle

O tratamento baseia-se na reposição imediata das perdas hidroeletrolíticas,

preferencialmente por via oral (NETO, 1987), através da administração de soluções

contendo glicose. A aplicação de antibióticos para controle de infecções bacterianas

secundárias pode auxiliar na recuperação do animal, além da melhoria das

condições de higiene da maternidade, através, por exemplo, de limpeza das celas

duas vezes ao dia, desinfecção semanal e colocação de uma espessa camada de

maravalha para proteger os leitões da umidade e do frio (EMBRAPA, 1987) e

contribuir bastante para a diminuição da incidência de infecções por rotavírus.

Uma vacina eficiente é a principal meta a ser alcançada para controlar e

prevenir a doença, tanto em países desenvolvidos como naqueles em

desenvolvimento, uma vez que medidas sanitárias resultam em impacto inexpressivo

em relação à morbidade causada pelo vírus (LINHARES, 2000).

12

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Colheita das amostras

A baixa representatividade do Estado do Rio de Janeiro como produtor de

suínos dificultou a localização de granjas nas regiões Norte e Noroeste fluminense;

principalmente granjas onde algum tipo de manejo fosse empregado visando a um

maior aumento da produtividade e prevenção de doenças. Sendo assim, outras

granjas foram rastreadas, além do estado do Rio de Janeiro, em diferentes

localizações.

Foram colhidas 226 amostras de fezes entre o período de março de 2001 e

janeiro de 2003, a partir de leitões com idade variando de dois a 60 dias. Os locais

de colheita são mostrados na Tabela 1.

As amostras de fezes foram colhidas diretamente da ampola retal dos

animais, através de massagem abdominal ou estímulo com “swabs” e em condições

que inviabilizaram estes procedimentos foram colhidas das superfícies das

instalações, desde que as fezes fossem, evidentemente, recentes.

13

Tabela 1: Locais de colheita das amostras fecais

Municípios (Estado) Número de amostras colhidas

Campos (RJ) 16

Itaocara (RJ) 10

Carapebus (RJ) 14

Itaperuna (RJ) 29

Quissamã (RJ) 01

São João da Barra (RJ) 06

Magé (RJ) 06

Rio das Ostras (RJ) 07

Macaé (RJ) 01

São Francisco de Itabapoana (RJ) 01

Amparo do serra (MG) 39

Muriaé (MG) 50

Limeira (MG) 07

Guarapari (ES) 13

Castelo (ES) 19

Cachoeiro de Itapemirim (ES) 03

Venda Nova do Imigrante (ES) 04

Total 226

As fezes foram classificadas de acordo com sua consistência, em líquidas

(53 amostras), pastosas (101 amostras) e firmes (72 amostras).

Após a colheita e identificação, as amostras foram transportadas em isopor

contendo gelo até o Setor de Virologia Veterinária do Laboratório de Sanidade

Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, onde foram

armazenadas em freezer a –20oC, até o processamento.

14

3.2. Análise das fezes por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

contendo duodecil sulfato de sódio (SDS)

3.2.1. Preparo das amostras fecais

Cada amostra de fezes estocada a –20oC foi parcialmente descongelada,

de modo que uma alíquota pudesse ser retirada e homogeneizada em uma

concentração aproximada de 10% (p/v) em 600 µL de tampão fosfato salina (PBS)

pH 7,4. A mistura foi, então, centrifugada (Centrifuge 5402 Eppendorf) a 8.000 x g

durante 4 minutos e à temperatura de 4o C.

Após a centrifugação, 15µL de sobrenadante foram transferidos para um

tubo tipo “eppendorf” contendo 5µL de tampão de tratamento da amostra (TA: 4 mL

de H2O destilada; 1 mL de Tris-HCL pH 6,8; 800 µL de glicerol; 1,6 mL de SDS a

10%; 400 µL de 2-β-mercaptoetanol; 400 µL de azul de bromofenol a 1%). A amostra

foi, então, incubada em banho-maria a 56o C durante 30 minutos.

3.2.2. Preparo dos géis e aplicação das amostras

Os géis foram preparados conforme descrito por LAEMMLI (1970), com

modificações.

Para a corrida eletroforética foram utilizadas concentrações diferentes de

poliacrilamida para formação dos géis (4% para o gel de concentração e 10% ou

7,5% para o de resolução) (Tabela 2), que foram mantidos em repouso por, pelo

menos, 30 minutos para completa polimerização.

Tabela 2: Preparo de um gel de poliacrilamida para mini-cuba 10 X 10 cm com espaçadores de 0,5 mm de espessura

Soluções Volumes para cada concentração do gel Concentração do gel 4,0 4,5% 10%

Água destilada (dH2O) 1,5 mL 2,4 mL 2,0 mL Tris-HCl (0,5 M-pH 6,8)

625 µL (1,5 M-pH 8,8)

1,25 mL (1,5 M-pH 8,8)

1,25 mL SDS 10% 25 µL 50 µL 50 µL

Persulfato de Amônia 25 µL 50 µL 50 µL Acrilamida/Bis 325 µL 1,25 mL 1,65 mL

TEMED 5 µL 10 µL 10 µL Volume total 2,5 mL 5 mL 5 mL

15

As amostras previamente incubadas a 56 oC/10-15 min. com TA foram

aplicadas individualmente no volume de 20 µL. Em cada gel foi aplicado um controle

positivo com rotavírus Wa, obtido a partir de cultivo celular e cedido pelo Laboratório

de Virologia Molecular e Tropical da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O

controle aplicado foi adicionado a TA e incubado juntamente com as amostras.

3.2.3. Corrida eletroforética

As amostras processadas foram analisadas em cuba vertical (Mini-Protean

3, Bio-Rad) contendo solução tampão de corrida 1x (tampão concentrado 10x: 30g

Tris-Base; 144,1g glicina; 10g SDS) e utilizando-se uma fonte elétrica (modelo FB

300, Fisher Scientific).

A corrida eletroforética foi realizada obedecendo-se às condições descritas

abaixo:

• Gel com 10% de poliacrilamida ⇒ a corrida foi realizada a

100v, durante 30 minutos e, após este tempo, a voltagem foi elevada

para 150v. Depois da saída do corante azul, a corrida ainda prosseguiu

por mais 2 horas.

• Gel com 7,5% de poliacrilamida ⇒ a corrida foi realizada a

100v, durante 30 minutos e, após este tempo, a voltagem foi elevada

para 150v. Depois da saída do corante azul, a corrida ainda prosseguiu

por mais 1 hora.

3.2.4. Coloração do gel

Depois da corrida eletroforética, o gel foi impregnado com nitrato de prata

para observação das bandas de RNA viral (HERRING, 1982).

Inicialmente, o gel foi agitado em solução fixadora (10mL de etanol; 0,5mL

de ácido acético glacial; 100mL de água destilada - dH2O) durante 30 minutos e,

após este período, foi rapidamente lavado com água destilada, sendo em seguida

mantido sob agitação em uma solução de nitrato de prata (0,16g de AgNo3; 100mL

de dH2O) durante 30 minutos. Novamente, o gel foi rapidamente lavado com água

destilada e mantido sob agitação em solução reveladora (10mL de NaOH 7,5M;

16

750µL de formaldeído; 100mL de dH2O) até o aparecimento das bandas de dsRNA.

O aparecimento destas foi possível através do monitoramento do controle positivo.

Quando o gel apresentou a coloração desejada, foi rapidamente lavado em

água destilada e colocado sob solução de parada (5mL de ácido acético glacial;

10mL de etanol; 1mL de Glicerol; 100mL de dH2O), permanecendo nesta solução

por, no máximo, 24 horas. Em seguida, o gel foi dessecado entre duas folhas de

papel celofane em suporte de vidro.

3.3. Extração de RNA viral das fezes e RT-PCR

3.3.1. Extração de RNA viral

A maior dificuldade no processo de extração de RNA é evitar a ação de

ribonucleases (RNases). Estas enzimas são muito estáveis e não requerem

cofatores para suas atividades. Por isso, todo material usado deve ser esterilizado e

livre de RNases, bem como o uso de luvas é imprescindível para que a

contaminação por microrganismos (que podem funcionar como fontes de RNases)

seja evitada (ROLFS et al.,1992).

Em tubo eppendorf contendo 400µL de isotiocianato de guanidina (GITC) 4M

foram adicionados cerca de 10% de fezes (p/v), sendo a mistura homogeneizada em

agitador de tubos (modelo AAP 56- Phoenix) por pelo menos dois minutos e em

seguida centrifugada (Biofuge Haemo- Heraeus Instruments) a 9000 x g durante 15

minutos.

O sobrenadante clarificado foi transferido para outro tubo e igual volume de

fenol-clorofórmio foi adicionado, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a

10000 x g durante 5 minutos.

O sobrenadante foi transferido para outro tubo e igual volume de Clorofórmio

foi adicionado, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a 10000 x g durante

1 minuto.

A fase aquosa foi separada em outro tubo e NaCl 5M foi adicionado, de

modo que a concentração final alcançada fosse de 0,2M. Feito isto, dois volumes de

etanol P.A., previamente estocado a –20oC, foram adicionados e a mistura

homogeneizada e incubada “overnight” a –20oC.

17

Após a incubação, a mistura foi centrifugada (Micro Table Top Refrigerated

Centrifuge CR 15T- Hitachi) a 6500 x g durante 20 minutos a 4oC e o sobrenadante

desprezado.

Ao sedimento foi adicionado 1mL de etanol a 75%, previamente

acondicionado a –20oC, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a 6500 x g e

4oC durante 20 minutos.

O sobrenadante foi desprezado e o sedimento seco em forno de hibridização

(Fisher Scientific Isotemp) a 37oC. Em seguida 400 µL de água de milliQ estéril

foram adicionados ao sedimento e a mistura homogeneizada.

Um volume de 50 µL de hidroxiapatita foi adicionado ao tubo e a mistura

homogeneizada durante 30 minutos em homogeneizador de sangue Phoenix,

modelo AP22. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 6000 x g durante 1 minuto e

1mL de solução KP 10 mM foi adicionado. A mistura foi, então, homogeneizada,

durante, pelo menos, um minuto e centrifugada, em seguida, a 6000 x g rapidamente

(1 minuto). Em seguida, o sobrenadante foi descartado e 200 µL de solução KP 200

mM adicionados. Esta mistura foi então homogeneizada, incubada em forno de

hibridização a 37OC durante 10 minutos e centrifugada rapidamente a 6000 x g (1

minuto), sendo o sobrenadante transferido para outro tubo (tubo1).

Ao tubo contendo a hidroxiapatita precipitada foram adicionados 200µL de

solução KP 200 mM e a mistura homogeneizada, incubada a 37oC durante 10

minutos e rapidamente centrifugada, sendo o sobrenadante adicionado ao tubo que

já continha igual volume de sobrenadante (tubo1), perfazendo um volume final de

400 µL de solução.

Ao volume final de 400µL foram adicionados 65µL de hexadeciltrimetil-

brometo de amônio (CTAB) 5%, 40 µL de NaCl 5 M e 40 µL de EDTA 0,5 M. A

mistura foi homogeneizada, incubada em banho-maria a 56oC durante 30 minutos e

centrifugada a 10000 x g durante 5 minutos, sendo o sobrenadante desprezado em

seguida.

Ao sedimento foram adicionados 400 µL de água de milliQ estéril e a mistura

foi homogeneizada por pelo menos 2 minutos. O volume de 40 µL de NaCl 5M e 1

mL de Etanol P.A. gelado foi adicionado à suspensão, sendo a mesma incubada a –

20oC “overnight”.

Após incubação, a suspensão foi centrifugada a 10000 x g, durante 10

minutos e o sobrenadante desprezado. Este procedimento foi realizado novamente,

18

sendo, por fim, o sedimento seco em forno de hibridização a 37oC e adicionado de

40 µL de água de milliQ estéril, sob forte agitação.

3.3.2. Preparo das amostras e RT-PCR (1a.amplificação)

Em fluxo laminar (modelo FLV-Trox), eppendorfs foram adicionados de 1,5

µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e 4 µL de cada amostra de dsRNA, previamente

extraídas. Cada tubo foi incubado em banho-seco a 94OC durante 3 minutos e

imediatamente repousado em banho de gelo.

3.3.2.1. RT-PCR baseada na especificidade de VP7 (genotipo G)

Em tubo eppendorf foi preparada uma mistura de reação padrão

(Mastermix), conforme preconizado por GOUVEA et al. (1990), com as seguintes

modificações: 17 µL de água de milliQ estéril; 0,75 µL de MgCl2 50 mM (Gibco-BRL);

2,5 µL de 10X PCR Buffer sem Mg ++(Gibco-BRL); 0,5 µL dNTP 10 mM; Primer G

(gene 9, Beg9-End9); 0,1 µL de RT-AMV (Promega) e 0,25 µL de Platinum-Taq

Polimerase (Gibco-BRL).

O volume de 20,5 µL da reação padrão foi adicionado a cada tubo mantido

em banho de gelo, sendo a mistura homogeneizada e colocada em termociclador

(Gene Amp PCR System 2400- Applied Biosystems). A amplificação em PCR a partir

de dsRNA (primeira amplificação) foi realizada segundo a metodologia descrita por

Gouvea et al. (1990) com modificações: incubação inicial durante 50 minutos a 45oC;

ativação de PT-Taq durante 2 minutos a 94oC, seguida por 35 ciclos de PCR com

temperatura e tempo de desnaturação, anelamento e extensão iguais,

respectivamente a 94oC por 30 segundos, 45oC por 60 segundos e 70oC durante 90

segundos, seguida de uma incubação final de 70oC durante 7 minutos e outra de

25oC.

3.3.2.2. RT-PCR baseada na especificidade de VP4 (genotipo P)

O procedimento realizado foi o mesmo descrito anteriormente, exceto pelo

primer que, neste caso, correspondeu ao segmento do gene 4 (Con2-Con3).

19

3.3.3.Tipagem através de PCR a partir de cDNA (2a amplificação)

A tipagem (PCR-Typing) foi realizada a partir do dsDNA obtido com a 1a

amplificação, conforme descrito por GOUVEA et al. (1990), com algumas

modificações.

3.3.3.1. Tipagem através de PCR para VP7

Duas soluções foram preparadas do mesmo modo, variando apenas no

conjunto de primers empregados. Um conjunto continha primers tipo-específico para

tipos G humanos (G/H), enquanto que o outro era composto de primers G animal

(G/A). Nos dois casos foram adicionados 18,38 µL de H2O de milliQ estéril; 1,75 µL

de DMSO (Sigma); 2,5µL de Thermophilic DNA Polymerase 10XPCR Buffer minus

Mg++ (Gibco-BRL); 7,5 µL de MgCl2 25 mM (Promega); 0,5 µL de dNTP; 0,125 µL de

Taq DNA Polymerase Storage in Buffer A (Promega). Em seguida, 0,25 µL do pool

de G/H foram adicionados em um dos tubos e a mesma quantidade de pool de G/A

adicionada ao outro tubo.

3.3.3.2. Tipagem através de PCR para VP4

Para genotipar os produtos da RT-PCR com base na especificidade de VP4,

foi realizado o mesmo procedimento descrito anteriormente, sendo utilizados pool de

primers P humano (P/H) e animal (P/A).

3.3.3.3. Adição de cDNA e PCR

O produto da primeira amplificação foi adicionado aos tubos contendo as

reações com misturas de primers específicos para os tipos G predominantemente

encontrado em humanos (G/H) e em animais (G/A), ou para os tipos P encontrados

em humanos (P/H) e em animais (P/A). Em seguida, as amostras foram submetidas

ao termociclador para 30 ciclos de 94oC durante 30 segundos, 50oC durante 50

segundos e 72oC durante 60 segundos, com períodos de incubação inicial de 94oC

durante 60 segundos e final de 72oC durante 7 minutos e 25oC.

20

3.3.4. Eletroforese em gel de agarose

Os produtos de PCR podem ser visualizados em gel de agarose corado com

Brometo de Etídio (EtBr) em baixas concentrações. O EtBr é um corante que se

intercala entre as fitas de dupla hélice de DNA e, como é altamente mutagênico,

deve ser manuseado com luvas e extremo cuidado (SAMBROOK et al.,1989).

Um volume de 8µL de cada amostra amplificada anteriormente foi

adicionado de 2 µL de tampão “loading” concentrado 6x (0,25% de azul de

bromofenol e 40% de sacarose (p/v) diluída em dH2O) e aplicado no gel de agarose

0,6% contendo EtBr (5µL/100mL). Em poços adjacentes foram aplicados 8 µL de

marcador de peso molecular (100bp) como controle.

A corrida eletroforética foi realizada em meio contendo solução tampão Tris-

Acetato-EDTA (TAE: 48,4 g Tris-Base; 11,42 mL Ácido Acético; 20 mL EDTA; pH8,0)

e com voltagem de 100 volts até que o azul de bromofenol tivesse percorrido 2/3 do

gel.

Depois da eletroforese, o gel foi observado em transiluminador com luz

ultravioleta e posterior à leitura das bandas fluorescentes, o gel foi fotografado com

câmera digital e filtro especial, sendo congelado em seguida.

3.4. Isolamento de rotavírus em células MA-104

3.4.1. Cultura de células

As monocamadas de células foram preparadas conforme descrito por RÁCZ

et al. (1993), com modificações.

Células de rim de macaco rhesus (linhagem Ma-104) foram cultivadas em

tubos de ensaios (13 x 100mm) na presença de meio mínimo essencial de Eagle

(MEM-Eagle) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) penicilina,

estreptomicina, fungizona e glutamina. O meio de manutenção das células foi o

mesmo, exceto pela ausência de SFB.

21

3.4.2. Tratamento das fezes

Foram adicionados 100 µL de MEM em eppendorfs e quantidade de fezes

suficientes para obtenção de uma suspensão a 10%. A mistura foi homogeneizada

em agitador de tubos e centrifugada a 10000 x g durante 15 minutos a uma

temperatura de 4oC.

O líquido clarificado (sobrenadante) foi transferido para um novo tubo e

adicionado de 100 µL de Freon, sendo homogeneizado e centrifugado a 10000 x g,

durante 3 minutos a 4oC.

A fase aquosa foi, então, transferida para novo tubo e adicionada de 150 µL

de MEM contendo uma quantidade cinco vezes maior que o normal de Penicilina,

Estreptomicina, Fungizona e Tripsina, sendo a mistura incubada em banho-maria a

37oC, durante no mínimo uma hora. Um tubo contendo apenas MEM concentrado e

suplementado foi incubado juntamente com as amostras, servindo de controle de

tripsina (CT).

3.4.3. Inoculação

Antes de receberem o inóculo (rotavírus), as células foram lavadas duas

vezes com solução de Hank’s e incubadas em estufa a 37oC durante, no mínimo,

uma hora entre cada lavagem.

A solução de Hank’s da segunda lavagem deve ser desprezada antes da

adição de 1 mL de MEM.

Cada inóculo (200µL de solução total) foi dividido para dois tubos contendo

as monocamadas celulares previamente lavadas e incubadas,

Um dos tubos de cada amostra foi submetido à incubação em estufa a 37oC,

enquanto que o outro foi incubado à mesma temperatura, entretanto em “roller”.

As culturas foram diariamente observadas em microscópio invertido, quanto

à presença ou não de efeito citopático (CPE).

Uma semana após a inoculação, os tubos foram congelados e

descongelados por duas vezes, com a finalidade de otimizar a liberação viral através

da lise celular.

22

Tripsina T-USO foi diluída em 1:10 em meio MEM, sendo 20 µL desta

solução transferidos para tubos que receberam 200 µL de inóculos e foram

incubados a 37oC durante 30 minutos, para promover a ativação do vírus.

Novos tubos contendo monocamadas celulares foram lavados como descrito

anteriormente e adicionados de 1 mL de MEM, sendo o vírus ativado inoculado

nestes tubos e novamente incubados a 37oC em estufa e em “roller”. Esta etapa

consiste na primeira passagem (P1).

Pretende-se, ao final da 5a passagem (P5), testar as amostras quanto à

presença de RV através de PAGE.

23

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As granjas visitadas caracterizaram-se por apresentarem diferentes padrões

tecnológicos, variando da produção rústica (38 granjas) à tecnificada (11 granjas),

estas últimas com restrição de entrada de pessoas estranhas.

Das 38 granjas de produção rústica, 17 não possuíam qualquer tipo de

manejo voltado a um aumento de produtividade ou prevenção de doenças. Nestas

granjas as condições de criação foram consideradas extremamente precárias,

inclusive pelo fato dos animais não receberem qualquer tipo de tratamento contra

bacterioses, parasitoses ou viroses. Conseqüentemente, o índice de produtividade e

sanidade eram baixos.

4.1. SDS - PAGE

Para verificar a presença de rotavírus em fezes de leitões criados nas

microrregiões citadas na Tabela 1, foi utilizado o PAGE, considerado um método

sensível e amplamente utilizado em estudos epidemiológicos de rotavírus (DANIEL

et al., 1996).

Das 226 amostras de fezes de leitões examinadas, quatro (1,77%) foram

positivas para rotavírus. Do total de amostras testadas, 53 (23,45%) foram

classificadas como diarréicas, 101 (44,69%) como pastosas e 72 (31,86%) foram

classificadas como firmes.

24

Durante o período de colheita, foram visitadas 49 propriedades, sendo que

em 27 propriedades não foram observados casos de diarréias entre leitões no dia da

visita.

Das amostras positivas para rotavírus (n=4), duas eram diarréicas (amostras

204 e 211) e duas eram pastosas (amostras 79 e 179) no momento da colheita.

Com exceção da amostra de número 79 (colhida no mês de junho de 2002),

as demais amostras foram colhidas durante o mês de janeiro de 2003, após longos

períodos de chuva. Este resultado difere do padrão sazonal de distribuição que o

vírus assume na região Sudeste do Brasil, segundo dados de Cardoso et al. (1992)

citados por LINHARES, 2000 e os achados de PEREIRA et al. (1993), onde

infecções causadas por rotavírus podem ocorrer de modo endêmico em todo o país.

Na faixa etária de 0 a 15 dias, foram testadas 94 amostras, sendo duas

positivas para rotavírus (amostras 79 e 204), enquanto que entre as 88 amostras

testadas de animais com idade entre 16 e 30 dias, duas foram positivas para

rotavírus (amostras 179 e 211). A Figura 1 mostra a distribuição total das amostras

colhidas de acordo com a faixa etária dos animais e a ocorrência de diarréia

segundo o mesmo parâmetro.

25

Figura 1: Distribuição das amostras colhidas de acordo com a faixa etária dos animais (A) e da ocorrência de diarréia entre as faixas representadas (B).

Ainda que o número de amostras positivas tenha sido baixo em relação a

dados da literatura, o fato de duas amostras positivas terem apresentado

consistência pastosa (amostras 79 e 179) e não diarréica reforça a importância de se

pesquisar a presença de rotavírus, também neste tipo de fezes.

As amostras positivas para rotavírus, de acordo com PAGE, apresentaram

os 11 segmentos de dsRNA, distribuídos de acordo com o padrão 4-2-3-2,

característico do grupo A. Entretanto, a amostra de número 179 apresentou uma

banda extra entre os segmentos 3 e 4 após coloração do gel (Figura 2).

26

Figura 2: Análise de PAGE das amostras fecais de suínos sendo K8 o controle positivo.

4.2. Caracterização através de PCR

Após identificação através do PAGE, as amostras positivas foram

submetidas à caracterização genotípica através de RT-PCR. O resultado é mostrado

na Tabela 3.

Tabela 3: Caracterização dos rotavírus através de PCR das amostras positivas por PAGE.

Amostra de fezes

Consistência das fezes

Idade dos animais

Caracterização por PCR

79 pastosas 9 dias G3P[7] 179 pastosas 21 dias G1-G5P[7] 204 líquidas 9 dias G5P[7] 211 líquidas 21 dias G5P[1]

A amostra caracterizada como G1-G5 foi a mesma que apresentou uma

banda extra de dsRNA revelada através do PAGE.

O tipo G5 de rotavírus em sido descrito em vários países, tais como,

Colômbia (SOLARTE et al., 1999), Estados Unidos (ROSEN et al., 1994), Venezuela

e Argentina (Ciarlet et al., 1995 citados por PONGSUWAANA et al.,1996), sendo

79 179 204 211 K8

27

predominantemente de suínos. No Brasil, G5 aparece relacionado a infecções em

humanos e suínos, reforçando a hipótese de que o reagrupamento genômico

interespécies ocorra naturalmente (GOUVEA e BRANDTLY, 1995).

O sorotipo G1 é caracteristicamente humano, apresentando-se amplamente

distribuído em todo o mundo, mas também já foi descrito em suínos no Brasil

(SANTOS et al., 1999).

A mistura G1-G5 foi também observada por SANTOS et al. (1999) em um

estudo desenvolvido no Brasil com amostras provenientes do Paraná, onde, de 10

amostras analisadas, uma demonstrou o caso de infecção mista em suínos,

entretanto, não foi possível relacionar o surgimento de banda extra a um padrão

eletroforético diferente de 4-2-3-2 observado no grupo A de rotavírus.

O sorotipo G3 também foi descrito para rotavírus suínos, sendo

antigenicamente relacionado ao mesmo sorotipo humano.

O tipo P[7], encontrado em três das quatro amostras positivas (79, 204 e

211), já havia sido identificado na linhagem OSU de rotavírus suíno, bem como o

tipo P[1], identificado em linhagens NCDV (Neonatal Calf Diarrhoea Vírus) de

bovinos (Estes e Cohen, 1989, Negesha et al., 1993, Rosen et al., 1992, citados por

GOUVEA et al., 1994 b).

Informações relacionadas à diversidade sorotípica e prevalência de rotavírus

em suínos têm relação direta com a eficiência no desenvolvimento de novas vacinas

(ROSEN et al., 1994), já que linhagens distintas do vírus comportam-se de diferentes

maneiras em vários locais do mundo, induzindo, assim, diferentes respostas no

sistema imune do hospedeiro.

O fato de apenas quatro amostras de 226 terem sido positivas para RV,

sendo duas diarréicas, pode ser explicado por três motivos básicos:

o Provavelmente, no momento da colheita, em casos onde os rotavírus

pudessem estar presentes, a excreção viral máxima não tenha sido

alcançada, ou seja, o animal poderia ter eliminado o vírus antes ou vir

a eliminá-lo depois da obtenção das amostras. Como o pico de

liberação viral máxima ocorre 3 a 4 dias após o início dos sinais

clínicos (MASCARENHAS, 1999), o momento da colheita torna-se um

fator importante para detecção dos rotavírus.

o O fato de diarréias serem relativamente comuns entre leitões faz com

que muitos produtores não notifiquem seu aparecimento, a menos que

28

muitos animais venham a óbito, os gastos com tratamento veterinário

sejam altos ou que o retardo no crescimento do animal seja acentuado

(SOLARTE et al., 1999), o que termina por comprometer os estudos

relacionados à ecobiologia do vírus.

4.3. Cultivo celular

O efeito citopático (CPE) do vírus sobre as células MA-104 não foi

observado, entretanto, passagens cegas têm sido realizadas objetivando este fim.

A dificuldade observada neste trabalho, em relação à propagação dos

rotavírus em cultura de células, encontra-se em acordo com resultados de alguns

autores que relatam o sucesso na adaptação e propagação do vírus após, pelo

menos, três passagens cegas (SESTÁK e MUSILOVÁ, 1994; THEIL et al., 1978;

RAMOS, 1996).

29

5. CONCLUSÕES

O pequeno número de amostras positivas para rotavírus não diminui a

importância de se estudar a presença deste agente como causador de gastroenterite

entre animais de produção.

A aplicação de técnicas de Biologia Molecular como diagnóstico para

rotavírus provou ser de grande utilidade, pois viabilizou a determinação de diferentes

genotipos G e P circulantes entre a população estudada.

30

6. RECOMENDAÇÕES

A continuidade dos estudos, não somente nas microrregiões citadas neste

trabalho, é essencial para o conhecimento da epidemiologia dos rotavírus entre

suínos e outras espécies, de modo a identificar os sorotipos circulantes e detectar a

introdução de novos sorotipos.

A faixa etária compreendida até 30 dias é a de eleição para a colheita de

espécime fecal visando à detecção de rotavírus.

A colheita de fezes consideradas normais (sejam de consistência pastosa ou

firme) não deve ser descartada, uma vez que, de acordo com resultados

encontrados neste trabalho, das quatro amostras positivas para rotavírus, duas

apresentavam consistência pastosa (que pode ser considerada normal de acordo

com a alimentação do animal).

31

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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