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1 - INTRODUÇÃO

1.1 - INSULINA

As ilhotas de Langerhans foram identificadas, no pâcreas, por volta de 1860,

por Langerhans, daí a sua denominação. A relação entre diabetes e pâncreas foi

sugerida desde 1788 por Cawley, mas só foi comprovada por Frederick Banting &

Charles Best. Eles extraíram um potente fator hipoglicemiante de pâncreas de cães,

usando uma solução ácida de etanol (Banting et al., 1922). Esse fator denominado

insulina devido à sua origem (“islets of Langerhans”), rapidamente teve sua

utilização disseminada no controle do diabetes. A insulina é considerada um

hormônio modelo, uma vez que foi o primeiro a ser purificado, seqüenciado,

cristalizado e sintetizado através de técnicas químicas e de biologia molecular

(Murray et al. 2002).

A insulina é um peptídio formado por duas cadeias, uma de 21 aminoácidos e

a outra de 30 aminoácidos, ligadas por pontes dissulfeto. Ela é sintetizada por

ribossomos no retículo endoplasmático das células β do pâncreas sob a forma de

pré-pró-insulina, um polipeptídeo linear de 110 aminoácidos, com uma seqüência

sinal constituída por 23 aminoácidos hidrofóbicos, que direciona a pré-pró-insulina

para cisternas do retículo endoplasmático rugoso. Nas cisternas da referida organela

ocorre remoção da seqüência líder, formação das pontes dissulfeto e enrolamento

da cadeia. A pró-insulina tem de 77 a 86 aminoácidos sendo constituída pelas

cadeias A e B, conectadas pelo peptídeo C. O peptídeo C possibilita o dobramento

da cadeia permitindo, assim, a correta formação das três pontes dissulfeto. A

molécula de pró-insulina é transportada ao aparelho de Golgi, onde iniciam-se a

proteólise e o empacotamento em grânulos secretores. Nesses grânulos secretores

é convertida em insulina pela ação de uma peptidase específica que cliva ligações

peptídicas envolvendo aminoácidos básicos presentes nas extremidades do

peptídeo C. Quantidades equimolares do peptídeo C e moléculas de insulina estão

presentes no interior desses grânulos. Após estimulação apropriada, os grânulos

maduros se fundem com a membrana plasmática e descarregam seus conteúdos no

fluido extracelular por exocitose. Em vertebrados, as etapas de transcrição e

tradução da insulina são moduladas pela concentração de glicose sanguínea

(Dodson & Steiner, 1998).

2

A comparação das seqüências das insulinas de diferentes espécies animais

aponta para conservação da identidade e posição da maioria dos aminoácidos,

exceto para os resíduos 8, 9 e 10, da cadeia A, e o resíduo 30 da cadeia B. Embora

os aminoácidos nessas posições variem muito, as propriedades biológicas

aparentemente não são alteradas. As posições e regiões altamente conservadas

são: a localização das três pontes dissulfeto; os resíduos hidrofóbicos na região

carboxi-terminal da cadeia B e as regiões amino e carboxila-terminais da cadeia A. A

estabilização da estrutura da molécula de insulina ocorre por pontes de hidrogênio e

interações iônicas. Dímeros de insulina são formados pela interação por pontes de

hidrogênio entre os grupamentos peptídicos dos resíduos B24 e B26 de duas

moléculas de insulina. Quando a insulina está em alta concentração, organiza-se

como um hexâmero, cada uma associada a dois átomos de zinco (Baker et al., 1988

citado por Conlon, 2001).

As células β do pâncreas respondem aos diversos estímulos recebidos (na

forma de substratos, hormônios ou neurotransmissores) e liberam insulina em

intensidade proporcional ao balanceamento entre fatores estimulatórios e inibitórios.

A resposta mediada por insulina à concentração de glicose sangüínea é bifásica. A

primeira é rápida, ocorrendo secreção transitória de insulina. A segunda é

proporcional ao nível e duração do pré-estímulo de glicose, e é dependente

parcialmente da síntese continuada de insulina. O aumento dos níveis de glicose é o

regulador fisiológico mais importante da secreção da insulina. A estimulação da

liberação de insulina por aminoácidos depende do tipo de aminoácido e do nível de

glicose presente; lipídeos são também capazes de potencializar a liberação de

insulina (Rorsman et. al., 2000; Lang, 1999; Pagliara et al., 1974).

A degradação da insulina ocorre principalmente no fígado e rins e é

responsável pela remoção e inativação desse hormônio. O primeiro passo para o

catabolismo da insulina é a ligação ao seu receptor e a subseqüente internalização.

Interações intracelulares entre insulina e a protease específica para insulina (sistema

de degradação enzimática da insulina) promovem a clivagem da insulina. Outras

enzimas estão envolvidas na degradação da insulina como a proteína isomerase

dissulfeto que catalisa a redução das pontes dissulfeto após a clivagem iniciada pela

protease específica para insulina e, a catepsina D, localizada nos lisossomos

possivelmente relacionada a degradação ácida da insulina previamente quebrada

3

pela protease e proteína isomerase dissulfeto (Mora et al., 2003, Duckworth et al.,

1988).

A insulina liga-se ao seu receptor nas células alvo para exercer suas funções.

O receptor é constituído por duas subunidades α que se projetam para o lado

externo da membrana plasmática e duas subunidades β, transmembranares, cujas

extremidades carboxílicas encontram-se no lado citossólico. Um modelo propõe que

uma molécula de insulina liga-se com alta afinidade às duas subunidades α do

receptor, proporcionando mudança conformacional necessária a estimulação da

atividade tirosina quinase da subunidade β. Conforme esquematizado na figura 1, o

sítio 1 de uma molécula de insulina liga-se ao sítio de ligação 1 em uma das

subunidades α do receptor e o sítio 2 da molécula de insulina associa-se com a

região 2 de outra subunidade α do receptor (Schäffer, L., 1994).

Receptor de insulina

Insulina

Receptor de insulina ativado

Figura 1 - Ligação de Insulina ao Receptor (Schäffer, L., 1994). A região 1 de uma molécula de insulina interagiria com o sítio de ligação 1 em uma das subunidades α do receptor e a região

2 da molécula de insulina ligaria com a região 2 da outra subunidade α do receptor,

determinando mudança conformacional do receptor de insulina.

Subseqüente à autofosforilação do receptor de insulina, ocorre a fosforilação

dos resíduos de tirosina nos substratos intracelulares. Os substratos para os

receptores de insulina são quatro. Existem 20-22 resíduos de tirosina que podem ser

fosforilados no receptor de insulina. Esses sítios de fosforilação estão localizados no

domínio que interage com proteínas que possuem o domínio homólogo a src (SH)2

4

como fosfatidil inositol 3 quinase, proteína de ligação ao receptor do fator de

crescimento e a fosfatase tirosina Syp. A fosforilação dessas proteínas desencadeia

a ativação do sistema Ras-Raf-MAP quinase ou ativação da quinase serina AKT

quinase, resultando nos efeitos biológicos da insulina. Esse modelo de sinalização é

esquematizado na figura 2 (revisado por Baudler et al, 2003).

glicose Receptor de insulina

Quinase PI 3

QuinaseS6

Complexo RAS

Quinase MAP

Transporte de Glicose

Síntese de lipídios

Síntese de proteínas

Proliferação

Expressão GênicaExpressão gênica

glicose Receptor de insulina

Quinase PI 3

QuinaseS6

Complexo RAS

Quinase MAP

Transporte de Glicose

Síntese de lipídios

Síntese de proteínas

Proliferação

Expressão GênicaExpressão gênica

Figura 2: Esquematização da cascata de sinalização de insulina (Baudler et al, 2003).

AKt – quinase serina/treonina sensível a insulina; ATP – adenosina trifosfato; IRS – substrato do receptor de insulina; GAB-1 – proteína de ligação associada GBR2; GAP – proteína ativadora de GTPase; GLUT4 – tranportador de glicose do tipo 4; GRB2 – proteína 2 de ligação do receptor do fator de crescimento; GTP – guanosina trifosfato; GSK3 – quinase 3 da sintase do glicogênio; MAP – proteína quinase ativada por mitógeno; p110p85 – subunidade catalítica (p110) e subunidade regulatória da quinase PI-3; Shc proteína com domínio homólogo ao colágeno e com domínio homólogo a Src; SHP2 – fosfatases tirosinas com domínio homólogo a Scr; SOS – fator trocador de nucleotídeo guanidina específica para Ras (oncogene do vírus sarcoma Harvey); Raf – oncongene viral codificante de uma quinase serina/treonina (retrovírus de transformação rápida); MEK – quinase da MAP quinase; Rsk – quinase S6 ribosssomal.

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A insulina de vertebrados é conhecida por exercer uma ampla faixa de efeitos

regulatórios na célula. Tradicionalmente, esses efeitos são classificados em dois

tipos: metabólicos e estimuladores de crescimento. Os efeitos metabólicos da

insulina consistem na captação, transporte, armazenamento e metabolismo de

moléculas alimentares (as hexoses, aminoácidos e ácidos graxos). Enquanto os

efeitos metabólicos podem ser de curta e longa duração, os efeitos mitogênicos são

de longa duração e ocorrem no nível gênico. Consistem no aumento da expressão

de genes específicos, estimulação da síntese de DNA, RNA e proteínas específicas,

e, em seu conjunto, resultam no crescimento celular. A insulina, em baixa

concentração, tem ação metabólica e, em alta concentração, ação mitogênica

(Pertseva et al., 2003). Alexander-Bridges et al. (1992) sugerem que os efeitos da

insulina sobre os genes responsáveis pelo crescimento são realizados através de

fosforilação das proteínas, enquanto o efeito sobre os genes relacionados ao

metabolismo é efetuado pela inibição da fosforilação.

Uma entrada de glicose, nas células β do pâncreas, determina aumento de

ATP, via glicólise e ciclo de Krebs. Altos níveis de ATP inibem os canais de K+

sensíveis a ATP, despolarizando a membrana das células β, o que resulta no influxo

de Ca++, através dos canais de Ca++ sensíveis a voltagem. Uma vez elevada a

concentração de Ca++, ocorre o estímulo da exocitose da insulina. Isso resulta num

aumento nos níveis da insulina sangüínea que, por sua vez, mediará uma série de

efeitos descritos a seguir (Deeney et al., 2000).

Um dos efeitos consecutivos ao aumento nos níveis de insulina é o aumento

da transcrição do gene da glicoquinase no fígado, elevando a quantidade desta

enzima no órgão. Tal indução enzimática pode contribuir muito para diminuir os

níveis elevados de glicose no sangue. A glicoquinase é uma isoenzima da

hexoquinase com propriedades cinéticas muito diferentes das outras hexoquinases.

O Km é consideravelmente mais alto do que para outras hexoquinases. A

glicoquinase não está sujeita à inibição pela glicose 6-fosfato, o produto da reação

de fosforilação catalisada por essa enzima (Brady et al., 1999).

A glicose é transportada por oito membros de uma superfamília de proteínas

de membrana, produtos de genes singulares, expressos num padrão tecido-

específico. Os transportadores de glicose são chamados de GLUT1, GLUT2 e assim

por diante. A maioria dos transportadores está localizada na membrana plasmática e

o movimento do transporte de glicose é no sentido de fora para dentro da célula.

6

(Olson & Pessin, 1996). GLUT4 é o transportador sensível à insulina,

predominantemente encontrado, mas não exclusivamente, nos tecidos adiposo,

músculo esquelético e cardíaco. No estado basal, mais de 95 % dos transportadores

GLUT4 localizam-se nos diferentes compartimentos de armazenamento – elementos

túbulo-vesicular intracelular, compartimentos endomembranosos (endossomos de

reciclagem e distribuição) e complexo Trans-Golgi. A insulina estimula a

translocação de GLUT4 para a membrana plasmática através de duas vias de

sinalização: uma dependente de substrato do receptor de insulina/quinase do

fosfatidilinositol 3-fosfato e outra envolvendo CAP/CbI/TC10 (Kanzaki & Pessin,

2003; Brady et al., 1999; Pessin et al., 1999).

A glicose é fosforilada, após sua entrada na célula, por hexoquinases, sendo

dessa forma mantida no interior celular. Dependendo das necessidades metabólicas,

a glicose 6-fosfato poderá ser armazenada como glicogênio ou sofrer glicólise para

subseqüente oxidação do piruvato e produção de ATP. As duas enzimas do

metabolismo do glicogênio, a fosforilase do glicogênio e sintase do glicogênio, bem

como as enzimas chaves da glicólise, estão sujeitas à regulação por modificação

covalente, alostérica e compartimentalização (Brady et al., 1999).

No metabolismo do glicogênio, a sintase do glicogênio catalisa a incorporação

de UDP-glicose ao glicogênio, enquanto a fosforilase libera resíduos de glicose 1-

fosfato das cadeias do glicogênio (figura 3). A fosforilação de múltiplos sítios da

sintase do glicogênio resulta na sua progressiva inativação, enquanto a fosforilação

de um único sítio da fosforilase do glicogênio promove a sua ativação. A insulina

ativa a proteína fosfatase (PP1) responsável pela desfosforilação tanto da sintase do

glicogênio quanto da fosforilase do glicogênio, promovendo a estimulação máxima

da síntese de glicogênio e inibição da glicogenólise. A proteína fosfatase (PP1)

desfosforila e inativa uma quinase da fosforilase do glicogênio, o imediato ativador

desta enzima. A insulina, também, diminui a atividade da quinase da sintase do

glicogênio-3 (GSK-3) que por sua vez fosforila e inativa a sintase do glicogênio.

(Baudler et al., 2003; Brady et al., 1999).

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Receptor de insulina

PPI

+

Glicogênio sintase GSK-3

+

Desfosforilação da fosforilase do glicogênio

Desfosforilação da fosforilase quinase

Figura 3: Desfosforilação das enzimas do metabolismo do glicogênio (Brady et al., 1999).

A insulina promove regulação alostérica das enzimas do metabolismo do

glicogênio, à medida que aumentos nos níveis intracelulares de glicose, glicose 6-

fosfato e UDP-glicose contribuem para regulação de ambas enzimas. Por fim, a

insulina ativa a síntese do glicogênio por regular a localização subcelular da sintase

do glicogênio. Em hepatócitos, aumentos nos níveis de glicose 6-fosfato resultam na

translocação da sintase do glicogênio do citosol para a membrana plasmática

(Fernandez-Novell, et al., 1997).

A insulina sinaliza a ativação de fosfoproteínas fosfatases por mecanismos

não totalmente compreendidos. Uma fosfoproteína fosfatase remove o fosfato da

enzima bifuncional fosfofrutoquinase-2 e frutose 2,6-bifosfatase. Quando a enzima

bifuncional está desfosforilada, a atividade fosfofrutoquinase-2 está ativa e catalisa a

síntese de frutose 2-6 bifosfato. Quando a enzima bifuncional estiver fosforilada, a

atividade frutose 2,6-bifosfatase é estimulada e passa a catalisar a hidrólise da

frutose 2-6 bifosfato. Desse modo, a insulina converte a enzima bifuncional na forma

fosfrutoquinase 2, o que resulta no acúmulo de frutose 2-6 bifosfato. Frutose 2-6

bifosfato é um regulador positivo da enzima 6-fosfofruto-1-quinase e inibidor da

frutose 1,6 bifosfatase, por conseguinte, a glicólise é estimulada e a gliconeogênese

inibida (Saltiel & Kahn, 2001; Pilkis, 1992).

A insulina estimula a lipogênese por vários mecanismos. Em função de uma

maior captação de glicose para o interior celular, aumenta-se a disponibilidade do

piruvato, necessário à síntese de ácidos graxos e também do glicerol 3-fosfato para

8

a esterificação de ácidos graxos recentemente formados. A insulina estimula a

ativação da piruvato-desidrogenase no tecido adiposo, mas não no fígado e

determina a conversão à forma ativa da acetil-CoA carboxilase. Um outro efeito da

insulina é a redução dos níveis de AMPc no tecido adiposo, conseqüentemente

ocorre inibição da lipólise, e portanto, a concentração de ácidos graxos livres reduz-

se acompanhada pela diminuição de acil-CoAs de cadeias longas o que inibe a

lipogênese. A principal ação da insulina no tecido adiposo é inibir a atividade da

lipase hormônio-sensível tanto pela redução do AMPc quanto pela ativação da

fosfatase da lipase. No fígado, a insulina estimula a síntese de triacilglicerídeos que

são transportados para o tecido adiposo na forma de VLDLs (lipopoproteínas de

densidade muito baixa). Nos adipócitos os ácidos graxos liberados dos triacilgliceróis

provenientes das VLDLs são usados na síntese de triacilglicerídeos (Devlin et al.,

2002; Geelen et al., 1980; Holm, 2003).

Além do transporte de glicose, insulina estimula o transporte de potássio. Dois

mecanismos são propostos para esta ativação: o estímulo do cotransportador de Na+

e K+ e o da Na+K+ATPase. O efeito máximo é observado em 10 minutos (Longo,

1996). Em fibroblastos, insulina aumenta a reciclagem da Na+K+ATPase sem afetar

a quantidade na membrana ou modificar a dependência intracelular de Na+ pela

Na+K+ATPase (Longo et al., 2001).

Insulina desempenha um papel chave na regulação da síntese protéica. Tal

papel tem sido observado em vários tecidos e em sistemas de cultura de células

(Antonetti et al., 1993; Asford & Pain, 1986; DePhilip et al., 1979). Múltiplos

mecanismos estão envolvidos nessa regulação: 1 – aumento da eficiência na

iniciação e/ou elongação na tradução do mRNA (Kimball et al., 1994); 2 – mudança

na transcrição de genes específicos (O’Brien & Granner, 1996); 3 – aumento do

número de ribossomos (Antonetti et al., 1993; Asford et al., 1986; DePhilip et al.,

1979). O grau de contribuição de cada um deles na regulação da síntese protéica

varia conforme os sistemas em estudo. Mudanças dos níveis basais dos ribossomos

podem envolver modulação na síntese ribossomal ou de sua degradação. Hannan et

al. (1998) observaram que insulina estimula a transcrição de rRNA em células de

fibroblastos de camundongos albinos 3T6 e células de hepatomas de rato –II-E.C3,

em parte, pelo aumento do conteúdo celular de componentes requeridos para

formação do complexo ativo de RNA polimerase I. As moléculas que tiveram os

9

níveis aumentados foram o UBF (fator de ligação “upstream”) e o fator 53 associado

a RNA polimerase I (Hannan et al., 1998).

1.2 - DISTRIBUIÇÃO DE INSULINA NOS ORGANISMOS

A insulina teve sua origem associada ao pâncreas nos vertebrados primitivos.

Verificou-se, no entanto, recentemente, que ela tem uma distribuição mais ampla,

tanto em termos dos tecidos em que se encontra quanto em relação à sua presença

em outros reinos (Le Roith et al.,1980). Já em 1923, Best & Scott descreveram uma

atividade hipoglicêmica em extratos de diversas glândulas, como a tireóide, o timo, a

submaxilar e o fígado. No sistema nervoso central, a insulina apresenta funções na

estimulação simpática e liberação do fator liberador de corticotropina, além de

possível ação no crescimento do sistema nervoso central (Schulingkamp et al., 2000;

Ferrannini et al., 1999). Há duas teorias para origem da insulina no cérebro de

vertebrados: uma seria através da produção local de insulina e a outra seria pelo

transporte ativo da insulina, contra o gradiente, da circulação para o sistema nervoso

central (Schulingkamp et al., 2000). Em invertebrados, a maioria dos trabalhos

publicados entre 1980 e 1997 sobre insulina, a descrevem no sistema nervoso mais

do que no sistema enteropancreático (Sower et. al., 2000).

1.2.1 – INSULINA EM PROCARIOTOS

Um único trabalho registra insulina em um procarioto. Este trabalho foi

publicado em 1981 por LeRoith et al. (1981b), onde foi descrita insulina em

Escherichia coli detectada por atividade imunológica e biológica.

1.2.2 – INSULINA EM EUCARIOTOS UNICELULARES Desde 1923, a presença de insulina havia sido descrita por Collip, em

levedura, baseando-se em atividade hipoglicêmica. Mais um indicativo da presença

de insulina, em levedura, seria o caminho de sinalização de insulina, descoberto

posteriormente, quando insulina exógena de humanos foi administrada à levedura

Saccharomyces cerevisae e houve estimulação do metabolismo de glicose e da

quinase Snf1 (Muller et al., 1998).

10

Em 1980, LeRoith et al. descreveram insulina em Tetrahymena pyriformis

(protozoário), Aspergillus fumigatus (fungo) e Neurospora crassa (fungo). Estes

peptídeos relacionados à insulina mostraram comportamento semelhante à insulina

de vertebrados em cromatografia de exclusão molecular, de troca iônica e de fase

reversa, além de apresentarem atividade imunológica e biológica (LeRoith et al.,

1980; LeRoith et al., 1985). Tentativas foram feitas para clonar o gene de insulina de

Neurospora crassa, mas Muthukumar e Lenard (1991) obtiveram um pseudogene

semelhante ao gene da preproinsulina humana. Ainda em Neurospora crassa foi

identificado e purificado um receptor de insulina de membrana com 55 kDa, o que

aponta um caminho de sinalização de insulina neste fungo (Dietz et al., 1989; Kole

et al., 1991).

1.2.3 – INSULINA EM INVERTEBRADOS

Em invertebrados, a insulina apresenta-se como um grupo de peptídeos,

estruturalmente muito diversos entre si e codificados por grandes famílias

multigênicas. As estruturas básicas das insulinas de vertebrados são mantidas

nestes peptídeos, tais como organização em duas cadeias e centro hidrofóbico. No

entanto, também apresentam características únicas tais como a incapacidade de

formar dímeros ou hexâmeros como acontece com o MIP (peptídeo de molusco

relacionado à insulina) e com o LIRP (peptídeo de lagosta relacionado à insulina); as

cadeias B são extremamente variáveis, em extensão, quando comparadas às

insulinas de vertebrados (Smit et al., 1998). Entre os filos de invertebrados, a

insulina foi descrita em urocordatos, equinodermes, artrópodes, anelídeos, moluscos

e esponjas (Sower et al., 2000; Robitzki et al., 1989). Em Apis mellifica (abelha),

Drosophila melanogaster e Annelida oligocheta, os peptídeos relacionados à insulina

foram detectados por ensaios imunológicos e biológicos (Maier et al., 1988; LeRoith

et al., 1981a).

A insulina da esponja Geodia cydonium, altamente homóloga à insulina de

vertebrados, não apresenta pontes dissulfeto intracadeia, e possivelmente está

envolvida na sinalização endócrina neste organismo. Várias são as evidências que

confirmam este fato: esta proteína é sintetizada por células sinalizadoras na esponja

e é capaz de estimular a transcrição de RNAm de calelectrina, além do fato de que

membranas citoplasmáticas contêm um receptor para insulina (Robitzki et al., 1989).

11

1.2.4 – INSULINA EM PLANTAS

Abordagens científicas no sentido de se investigarem atividades de plantas

eficientes no tratamento do diabetes têm sido feitas, mas pouco se sabe sobre o

mecanismo de ação e os princípios ativos de tais plantas. Foi demonstrado que

extratos aquosos da casca de sementes de Caesalpinia bonducella, administrados

oralmente, têm ação hipoglicêmica em ratos com diabetes induzido por

estreptozotocina e aloxano (Biswas et al., 1997) e que extratos aquosos do fruto de

Momordica charantia têm ação hipoglicêmica em ratos tratados com aloxano

(Srivastava et al., 1993).

Tantos são os tratamentos tradicionais empregados para o diabetes mellitus

que, se contabilizados, ultrapassam o número de 400. Compostos da classe dos

alcalóides, glicosídeos e polissacarídeos são descritos como tendo atividade

hipoglicêmica, embora seus mecanismos de ação não sejam totalmente definidos.

Os possíveis mecanismos de ação são: facilitação da ação da insulina e estimulação

de sua síntese (Bailey & Day, 1989). Um composto extraído de Salacia reticulata, um

açúcar sulfatado denominado salacinol, apresenta atividade hipoglicêmica por inibir

a atividade α- glicosidásica do intestino (Yoshikawa et al., 1997).

Já desde o descobrimento de insulina em vertebrados, sua presença foi

investigada em plantas. Um dos membros do grupo que descobriu a insulina em

cães, J. B. Collip, publicou um artigo em 1923, relatando atividade hipoglicêmica de

extratos de diferentes plantas como alface, cevada, cebola, trigo e feijão. Ele atribuiu

o nome de glucocinina a estes compostos hipoglicemiantes por considerar que o

hormônio deveria ter uma denominação relacionada à sua atividade, ou seja,

metabolismo de glicose e não relativa ao tecido de origem em vertebrados (Collip,

1923). Posteriormente, em 1979, um polipeptídeo extraído de Momordica charantia

(melão-de-São-Caetano), uma Cucurbitaceae, foi denominado p-insulina, dado suas

características semelhantes à insulina bovina quanto ao método de preparação,

cristalização e atividade hipoglicêmica (Khanna & Jain, 1979). Peptídeos

relacionados à insulina também foram detectados por ensaios imunológicos e

biológicos em espinafre, centeio e Lemna gibba (Collier et al.,1987). Embora já

estivesse sido descrita a presença de insulina em plantas, a primeira seqüência de

uma insulina vegetal, foi obtida por Oliveira e colaboradores em 1999, tendo sido

isolada de sementes de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco), uma leguminosa.

12

As proteínas solúveis do tegumento de Canavalia ensiformis foram

submetidas a cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose) e a fração adsorvida foi

separada, posteriormente, em cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G-

50). A fração eluída, em Sephadex G-50, no tempo de retenção das proteínas com

aproximadamente 8 kDa foi separada em gel de poliacrilamida e a banda protéica

com 6 KDa contida nessa fração foi seqüenciada. A principal seqüência foi a que

apresentou homologia com insulina bovina e a seqüência secundária mostrou-se

80% homóloga a uma seqüência interna do receptor do tipo tirosina quinase de

humanos. A fração da Sephadex G50 com 15,3 % de espécies responsivas ao

anticorpo anti-insulina humana, conforme determinado por radioimunoensaio,

reduziu a glicemia de camundongos com diabetes induzida por aloxano, em nível

comparável a solução de insulina bovina controle (Oliveira et al., 1999).

Imunolocalização demonstrou a presença de insulina, receptor do tipo proteína

quinase e proteínas do tipo fosfoserina na camada interna do tegumento de

sementes de Canavalia ensiformis. (Oliveira et al., 2004).

De Vigna unguiculata, também foram isoladas proteínas do tipo insulina com

homologia a insulina bovina. Foi observado que os níveis de proteínas do tipo

insulina aumentam durante o desenvolvimento de frutos de Vigna unguiculata e só

declinam com a fase do amadurecimento (Venâncio et al., 2003). Posteriormente,

esse mesmo grupo purificou uma proteína com afinidade a insulina de frutos de

Vigna unguiculata cuja seqüência primária foi homóloga a receptores do tipo quinase

de Arabidopsis thaliana e ao precursor do receptor de insulina de rato (Venâncio et

al., 2004).

Insulina foi detectada em cloroplastos e em vacúolos de células

parenquimáticas de folha de Bauhinia variegata (pata-de-vaca). No vacúolo, insulina

estava associada a cristais contendo cálcio provavelmente na forma de oxaloacetato

de cálcio. A proteína isolada do cloroplasto de folha de Bauhinia variegata

apresentou atividade hipoglicemiante e seqüência parcial homóloga a insulina

(Azevedo et al., 2003).

13

1.3 - EFEITOS DE INSULINA EXÓGENA EM PLANTAS

Um caminho de transdução de sinais envolvendo insulina tem sido

evidenciado, em plantas, pelos resultados de administração exógena desse

hormônio. Em sementes de melancia, pepino e girassol, insulina foi capaz de

estimular a atividade de enzimas do ciclo do glioxalato (Goodman & Davis, 1993). Já

em sementes de milho, a insulina acelerou a germinação e o crescimento das

sementes, além de aumentar a síntese de proteínas ribossomais. Em especial, o

fator de iniciação eIFiso-4E de sementes de milho teve o seu controle transcricional

relacionado à insulina que, ao que tudo indica, modularia a fosforilação de proteína

ribossomal S6 na subunidade 40S. No estado fosforilado da proteína ribossomal S6

há maior eficiência no recrutamento do RNAm da eIFiso-4E para os polissomos

(Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000).

Através de ensaio de ligação em membrana, Komatsu & Hirano (1991)

demonstraram que globulinas 7S básicas de Vigna radiata, Vigna anglaris, Vigna

sinensis, Lupinus albus e Glycine max e também uma glicoproteína epidermal de

cenoura são capazes de se ligarem à insulina e ao fator de crescimento do tipo

insulina I e II. As globulinas 7S básicas não têm homologia de seqüência com o

receptor de insulina ou com receptores de fatores de crescimento do tipo insulina.

No entanto, as globulinas 7S básicas apresentam diversas características

semelhantes ao receptor de insulina. As duas proteínas são glicosiladas e têm

domínios ricos em cisteína. Tanto o receptor de insulina quanto as globulinas 7S

básicas são formadas por duas subunidades ligadas por ponte dissulfeto, e são

sintetizadas na forma de um precursor com uma única cadeia. A subunidade de 16

kDa das globulinas 7S básicas tem atividade quinásica semelhante à subunidade β

do receptor. Watanabe e colaboradores (1994) isolaram um peptídeo de radículas

de soja em germinação, denominado leginsulina, capaz de ligar-se às globulinas 7S

básicas e estimular a atividade quinásica destas proteínas, embora leginsulina não

tenha homologia com insulina (Komatsu & Hirano, 1991; Komatsu et al., 1994;

Watanabe et al., 1994).

14

1.4 – EFEITOS DE ANÁLOGOS DA INSULINA E INIBIDORES DO EFEITO DA INSULINA EM PLANTAS Alguns compostos têm efeitos miméticos à insulina, entre estes estão o

vanadil sulfato e pinitol. O D-pinitol (3-O-metil-quiroinositol), isolado do Bougainvillea

spectabilis, reduziu a glicemia de camundongos diabéticos e aumentou o transporte

de deoxi-glicose em células musculares (Bates et al., 2000). Os D-quiroinositóis são

estruturalmente relacionados aos fosfatidilinositóis fosfato que participam na cascata

de ativação do transporte de glicose promovida pela insulina (Holman & Kasuga,

1997; White, 1997). Por sua vez, os fosfoglicanos inositóis são rapidamente

produzidos em resposta à insulina e atuam como mediadores da ação da insulina,

provavelmente, após o receptor (Kelly et al., 1987; Larner et al., 1998). Vanadil

reduziu as concentrações de glicose de ratos diabéticos (Thompson et al., 1993) e

estimulou o transporte de glicose e atividade da sintase do glicogênio em

hepatócitos isolados de ratos (Miralpeix et al., 1989). Em plantas, tanto o vanadil

sulfato quanto o pinitol tiveram efeitos similares aos da insulina. Pinitol e vanadil

sulfato quando adicionados ao meio de germinação de sementes de Canavalia

ensiformis promoveram aumentos significativos no comprimento e massa de raízes e

epicótilos com 120 horas após a embebição, semelhantemente à insulina. No

entanto, sementes de Canavalia ensiformis embebidas em solução de tifortin

(inibidor da atividade quinase do receptor de insulina) tiveram epicótilos e radículas

com tamanhos e massas inferiores daquelas sementes embebidas com solução de

insulina (Oliveira et al., 2004). Rapamacina e wortimanina, dois inibidores da

sinalização de insulina, preveniram o aumento da síntese das proteínas ribossomais

e da fosforilação de proteínas ribossomais S6 da subunidade ribossomal 40 S de

eixo embrionário de milho com 24 horas após a embembição, promovido pela

insulina (Sánchez de Jiménez et al., 1999) e também preveniram a ativação da

mobilização de RNAm do fator de inicialização de eucarioto – eIFiso4E,

desencadeada por insulina, nos polissomos de eixo embrionário de milho com 24

horas após embebição (Dinkova et al., 2000).

15

1.5 – METABOLISMO DE AÇÚCARES EM PLANTAS A fotossíntese constitui a rota pela qual toda a energia solar entra na biosfera

(Raven et al., 1996). Em vegetais, a fotossíntese ocorre em uma organela

intracelular especializada, o cloroplasto. Os produtos da fotossíntese são usados

pelas células fotossintetizantes para processos biossintéticos e são geralmente

exportados na forma de sacarose para suprir as necessidades metabólicas das

células não fotossintetizantes do vegetal. Alternativamente, os produtos podem ser

armazenados na forma de amido, um polissacarídeo osmoticamente inerte (Alberts

et al., 1997).

A síntese de sacarose é restrita ao citosol. Entretanto, é armazenada

principalmente no vacúolo, que é cerca de 10 a 20 vezes maior que o citosol. O

transporte intracelular de sacarose que ocorre entre vacúolo e citosol envolve um

antiporter sacarose-H+ (Winter & Huber, 2000).

O transporte intercelular pode ocorrer por via de duas rotas principais. A

primeira delas envolve o transporte mediado por carreador através da membrana

plasmática e a difusão através da fase aquosa da parede celular (rota apoplástica).

A segunda envolve o transporte direto célula-célula via plasmodesmata (rota

simplástica). O transporte intercelular de sacarose ocorre dentro de uma planta por

ambas as rotas, dependendo do tipo celular e da espécie. Células do mesófilo, por

exemplo, estão conectadas por uma rede extensa de plasmodesmatas. O transporte

da sacarose por via simplástica poderia ocorrer entre os tubos crivados e o

complexo das células companheiras, que estão interconectados via plasmodesmatas

(Winter & Huber, 2000).

Se o transporte da sacarose no floema ocorre por via simplástica ou

apoplástica, é ainda motivo de controvérsia. A figura 4 apresenta um caminho

hipotético do fluxo de solutos dentro e fora do floema. Nas veias menores, o soluto

passaria através do parênquima do floema ou células da bainha do feixe para as

células companheiras através do plasmodesmata (A) ou por via apoplástica (B). Das

células companheiras, os solutos seriam translocados para os tubos crivados

seguindo uma rota simplástica (D) ou apoplástica (C). A perda continuada de soluto

durante o transporte dirigiria o fluxo de líquido para os tubos crivados. No tecido

floemático, o complexo das células companheiras/tubos crivados é simplasticamente

isolado, o que permitiria o equilíbrio do soluto entre os dois tipos celulares. Alguns

16

solutos poderiam sair do caminho floemático, via rota apoplástica, para tecido de

alimentação (F). Nos órgãos drenos, o fluxo ocorreria pela rota simplástica (A) ou

apoplástica (F) (Turgeon, 2000).

Veias menores Floema Tecido “dreno”

Tubo crivado Tubo crivado Tubo crivado

Célula companheira

Célula do floema Célula do floema

Célula companheiraCélula companheira

Células do floema ou feixe da bainha

Veias menores Floema Tecido “dreno”

Tubo crivado Tubo crivado Tubo crivado

Célula companheira

Célula do floema Célula do floema

Célula companheiraCélula companheira

Células do floema ou feixe da bainha

Figura 4: Caminhos hipotéticos do fluxo de solutos dentro e fora do floema (Turgeon, 2000). Nas veias menores, os solutos seriam transportados das células do parênquima do floema ou da bainha do feixe para as células companheiras pela via simplástica (A) ou apoplástica (B). O caminho apoplástico envolve efluxo e influxo através dos transportadores associados à membrana. Das células companheiras, os solutos seriam transportados para os elementos de tubo crivados por via apoplástica (C) ou simplástica (D). O controle do transporte de solutos para os elementos de tubo crivados, nas veias menores, ocorre pela especificidade dos carreadores (C) ou pela recuperação dos solutos transferidos pelo caminho simplástico mediada por carreadores (E). No floema, os solutos dos elementos de tubo crivados, poderiam seguir para o tecido dreno ou ter fluxo bidirecional com as células companheiras. Nas células companheiras do tecido floemático, os solutos seguiriam por via apoplástica (F) para células do parênquima do floema. Nos tecidos drenos, ocorreria o fluxo birecional dos solutos entre os elementos do tubo crivados e células companheiras (D). Os solutos das células companheiras poderiam ser transportados por via simplástica (A) ou apoplástica (F) para células do parênquima do floema.

O caminho apoplástico envolve entrada e saída de solutos via carreadores

associados à membrana. Os açúcares são translocados através da membrana

plasmática, mediante transportadores, direcionados por gradiente de prótons

(Stadler et al., 1995 citado por Yistra et al., 1998). Esses transportadores são de

monossacarídeos ou dissacarídeos. Os genes para transportadores de

dissacarídeos são transcritos, “a priori”, em folhas maduras, e os transportadores de

17

monossocarídeos em órgãos drenos, ou seja, folhas jovens, órgãos florais e de

armazenamento (Sauer & Stadler, 1993 citado por Yistra et al.,1998). O tubo polínico

de Petunia hibrida, um órgão dreno, capta açúcar na forma de hexoses e para tanto

a sacarose deverá ser clivada por invertases associadas à parede celular. O gene

Pmt1 (transportador de monossacarídeo de Petúnia 1) somente é expresso no grão

de pólen e este transportador só é ativo após a primeira mitose desta célula

reprodutora (Yistra et al., 1998). Diferentemente de outros transportadores de

membrana, o transportador de sacarose isolado de cotilédones de soja, que é

homólogo à vicilina, não depende de um gradiente de próton para promover o

transporte (Overvoorde et al., 1997).

Sacarose tem papel chave no crescimento e desenvolvimento das plantas

podendo atuar como açúcar transportador, nutriente e molécula sinalizadora. Como

resultado dessa importante participação, diversos estudos têm sido desenvolvidos

para identificar os mecanismos que regulam o metabolismo da sacarose. A figura 5

representa um modelo do metabolismo da sacarose nas células das plantas no qual

sacarose seria clivada por uma invertase no apoplasto ou no interior da célula. As

hexoses resultantes (glicose e frutose) seriam convertidas a hexoses-fosfato por

frutoquinases e hexoquinases presentes no citosol. A sacarose poderia também ser

clivada pela sacarose sintase, produzindo UDP-glicose e frutose. Após fosforilações

as hexoses-fosfato resultantes poderiam ser metabolizadas pela glicólise (Pego &

SmeeKens, 2000).

A sacarose é sintetizada nas folhas como um dos produtos finais da

fotossíntese. Durante o dia, o substrato para síntese de sacarose é a triose fosfato,

liberada do cloroplasto através de um sistema antiporte que troca sacarose por Pi. À

noite, o substrato para síntese de sacarose é proveniente da quebra do amido,

provavelmente na forma de glicose (Winter & Huber, 2000).

A biossíntese da sacarose é catalisada pela ação seqüencial da sintase da

sacarose fosfato (SPS) e fosfatase da sacarose 6-fosfato (SPP):

(1) UDP-Glicose + Frutose 6-fostato sacarose 6-fosfato + UDP + H+SPS

(2) Sacarose 6-fosfato + H2O sacarose + Pi

SPP

18

Sacarose

Transportador de sacarose

Transportador de hexoses

Sacarose

UDP-glicose + frutose

Sacarose sintase

Frutose 6-fosfato

Frutoquinase

invertaseFrutose + glicose

Frutose + glicose

Glicose 6-fosfato

Glicólise

hexoquinase

Sacarose

Transportador de sacarose

Transportador de hexoses

Sacarose

UDP-glicose + frutose

Sacarose sintase

Frutose 6-fosfato

Frutoquinase

invertaseFrutose + glicose

Frutose + glicose

Glicose 6-fosfato

Glicólise

hexoquinase

citosol

apoplasto

invertase

Figura 5: Metabolismo da sacarose nas células das plantas (Pego & SmeeKens, 2000).

A sacarose seria transferida do apoplasto para o interior celular através do transportador de sacarose localizado na membrana plasmática, ou seria clivada pela invertase, ainda, no apoplasto, formando glicose e frutose. As hexoses (glicose e frutose) seriam transferidas para o interior celular através do transportador de hexoses. A sacarose no interior celular poderia ser clivada pela invertase formando glicose e frutose ou pela sacarose sintase formando UDP glicose e frutose. As hexoses, glicose e frutose, poderiam ser fosforiladas, respectivamente, por hexoquinase e frutoquinase e então serem metabolizadas através da glicólise.

A rápida remoção da sacarose 6-fosfato por uma fosfatase específica conduz

a síntese de sacarose à irreversibilidade, embora a primeira reação, catalisada pela

SPS, seja reversível (Winter & Huber, 2000).

O estado de fosforilação da SPS constitui um importante mecanismo da

regulação da atividade desta enzima e ocorre em resposta a estímulos endógenos e

ambientais. A fosforilação foi, originalmente, descoberta como mecanismo

modulador da atividade claro/escuro. Mais recentemente foi relacionada à ativação

da enzima que ocorre quando o tecido de folhas é submetido a estresse osmótico. A

enzima é fosforilada em vários resíduos de serina, “in vivo”. Em espinafre, a serina

158 quando fosforilada, inativa a enzima no escuro por alterar a afinidade da enzima

19

pelo substrato e efetores (McMichael et al., 1993). Recentes evidências sugerem

que há um segundo sítio de regulação por fosforilação na serina 424, altamente

conservado entre as espécies, assim como a serina 158. A fosforilação da serina

424 ativa a enzima em resposta a estresse osmótico nos tecidos foliares (Toreser &

Huber, 1997).

A clivagem reversível da sacarose é catalisada pela sintase da sacarose

(SuSy). A energia da hidrólise é conservada na ligação glicosídica da UDP-glicose

que constitui substrato para síntese da celulose e da calose ou ainda pode entrar na

via glicolítica pela ação combinada da UGPase e fosfoglicomutase. Em tecidos não

verdes a glicose-1 fosfato e glicose 6-fosfato são as hexoses fosfatos, geralmente

envolvidas na síntese de amido (Winter & Huber, 2000).

(1) Sacarose + UDP UDP-glicose + frutose

SuSy

(2) UDP-glicose + PPi UTP + glicose-1 fosfato UGPase

(3) glicose-1 fosfato glicose-6 fosfato

fosfoglicomutase

Tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas possuem pelo menos duas

isoformas da enzima SuSy. No entanto, nas leguminosas, SuSy possui apenas uma

isoforma. As isoenzimas exibem diferente expressão espacial e temporal e sofrem

regulação diferenciada no nível transcricional e traducional, o que pode ser

relacionado com importante papel no metabolismo da planta (Winter & Huber, 2000).

As invertases são grupos de β-frutosidases que diferem quanto à solubilidade,

localização e pH ótimo para sua atividade. As invertases são classificadas em: (1)

invertase ácida solúvel encontrada no vacúolo; (2) invertase ácida insolúvel

associada à parede celular e (3) invertase alcalina/neutra encontrada no citosol. As

invertases ácidas vacuolares clivam sacarose nos eventos que requerem demanda

aumentada da hidrólise da sacarose como expansão celular. As invertases solúveis

alcalinas/neutras são importantes na quebra de sacarose quando as atividades das

invertases ácidas estão baixas. Como as invertases ácidas de parede celular podem

promover gradiente de sacarose nos tecidos fontes e drenos, provavelmente, este

tipo de invertase está envolvido nas relações que definem tecido fonte e tecido

dreno (Winter & Huber, 2000).

20

Plantas são maquinarias fotoautotróficas que coordenam a fixação de

carbono da fotossíntese com sua utilização, mobilização e distribuição em vários

tecidos e em diferentes estágios do desenvolvimento. Assim, os genes que

codificam proteínas envolvidas nestes processos são altamente regulados por

açúcares. Evidências indicam que açúcares afetam a expressão de genes

relacionados a fotossíntese, metabolismo do glioxilato, glicólise, metabolismo de

sacarose, nitrogênio e amido, regulação do ciclo celular e mecanismos de defesa

(Koch, 1996). Altos níveis de açúcares reprimem a expressão de genes

responsáveis por rotas anabólicas de carboidratos e induzem genes envolvidos no

armazenamento e utilização dos mesmos. Conseqüentemente, a depleção de

açúcares exerce o efeito oposto (Jang & Sheen, 1997).

Glicose e sacarose têm sido mostradas como importantes moléculas

sinalizadoras em plantas. Entretanto, genes que são regulados por sacarose são

também regulados por glicose e frutose, levando à hipótese de que estas últimas

podem atuar como moléculas sinalizadoras diretas. É provável que a sacarose seja

convertida a uma hexose, antes de se tornar um sinal (Jang & Sheen, 1997).

Os mecanismos de sensibilidade a açúcares em plantas, ainda, são pouco

entedidos, mas ao que tudo indica, as hexoquinases estão envolvidas (Smeekens,

2000). Estudos com plantas transgênicas de Arabidopsis com alterados níveis de

hexoquinase ou expressando hexoquinase de levedura indicam a existência de três

vias de sinalização envolvendo glicose que seriam: uma via independente de

hexoquinase, uma via dependente de hexoquinase e do metabolismo da glicose

(alteração da taxa de ATP/AMP ou concentrações de fosfato no citosol resultante da

atividade da hexoquinase) e uma terceira via dependente de hexoquinase e

independente do metabolismo de glicose. Interessantemente, a repressão de genes

relacionados à fotossíntese e ativação dos genes relacionados à patogenicidade têm

sido observadas como conseqüência de todas as diferentes vias de sinalização por

glicose (Shen et. al., 1999). As frutoquinases também estão envolvidas na regulação

metabólica sinalizada por açúcares, e apresentam expressão diferencial: a do tipo 1,

por exemplo, é encontrada nos tecidos fontes de açúcares e a do tipo 2, em tecidos

drenos (Pego & Smeekens, 2000).

Análises genéticas e fenotípicas de mutantes de Arabidopsis, na sinalização

por açúcares, têm revelado interações complexas entre sinalização por açúcares e

as cascatas de sinalização por hormônios (Leon & Sheenm 2003). A sinalização por

21

glicose interage com a via do etileno, de maneira antagônica, como tem sido

evidenciado pelos estudos com mutantes gin 1 (insensível à glicose) e mutantes ein1

(insensível ao etileno). Segundo o modelo para interação de açúcares e hormônios

na regulação de crescimento da plântula de Arabidopsis, proposto por Gazzarrini &

McCourt (2001), a plântula no estágio 1 do desenvolvimento seria altamente sensível

a ABA. No estágio 1, o carbono requerido para o desenvolvimento da plântula é

fornecido pelo catabolismo de lipídeos e proteínas armazenados no embrião.

Quando o desenvolvimento está no nível 2, ou seja, a plântula está

fotossinteticamente independente, a sensibilidade para ABA diminui. Aplicações

exógenas de açúcares, em concentrações elevadas (não fisiológicas), resultam em

um aumento nos níveis endógenos de ABA. Entretanto, o efeito de ABA depende do

estado do desenvolvimento da plântula: no estado 1, ABA inibe o desenvolvimento e

no 2 tem pouco efeito sobre o desenvolvimento. A sinalização para altas

concentrações de açúcar é negativamente regulada por etileno através da

modulação negativa da sinalização por ABA (Gazzarrini & McCourt, 2001).

1.6 – GERMINAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DA PLÂNTULA A germinação é um processo fisiológico que tem seu início com a captação de

água pela semente quiescente e termina quando ocorre o alongamento do eixo

embrionário. Eventos subseqüentes à emersão da radícula, incluindo a mobilização

das reservas, são associados ao desenvolvimento da plântula (Bewley, 1997;

Bewley & Black, 1994).

O início do alongamento da radícula é determinado por três possíveis fatores.

O primeiro seria redução do potencial osmótico que ocorre em função do aumento

da concentração do soluto proveniente da hidrólise de polímeros de reserva. A

redução do potencial osmótico promoveria um aumento da captação da água e

dessa forma o aumento da pressão de turgor (Welbaum & Bradford, 1990). O

relaxamento da parede celular constitui o segundo fator. Possivelmente xiloglicano-

endotransglicosilases e expansinas estão envolvidas neste processo de relaxamento

da parede celular. A atuação de xiloglicano-endotransglicosilases possibilitaria a

extensão da parede, já que catalisam a clivagem reversível de moléculas de

xiloglicanos, responsáveis pela ligação das microfibrilas de celulose (Wu et al.,

1994). Expansinas rompem pontes de hidrogênio entre os polímeros da parede

22

celular (McQueen-Mason & Cosgrove, 1995). O último fator seria o enfraquecimento

de estruturas adjacentes à ponta da radícula o que permitiria a sua passagem

(Watkins & Cantliffe,1983).

Sob condições ótimas, a absorção de água pela semente é trifásica. No

primeiro momento, ocorre captação rápida de água devido ao alto potencial mátrico,

isto é, habilidade de ligar a água em função da hidratação da parede celular, amido

e corpos protéicos. Na segunda fase, a absorção de água estabiliza e a massa

fresca da semente permanece constante. A segunda fase é conseqüência do

balanço entre o potencial osmótico e o potencial de pressão (pressão exercida sobre

a parede celular decorrente da entrada da água). A última fase é caracterizada pela

rápida absorção e tem seu início com emersão da radícula, ou seja, com o fim da

germinação. Nesse momento, a absorção de água é dirigida pelo potencial osmótico

(Bewley & Black, 1994).

As estruturas e enzimas necessárias para reiniciar a atividade metabólica

durante a germinação estão presentes na semente seca e foram sintetizadas

durante o processo de maturação da semente. A reintrodução de água é suficiente

para retomada do metabolismo. Inicialmente, observa-se um aumento no consumo

de oxigênio, atribuído em parte à ativação e hidratação das enzimas mitocondriais

envolvidas no ciclo do ácido cítrico e na cadeia transportadora de elétrons. Após a

hidratação da semente, o consumo de oxigênio é estabilizado ou quase não se

eleva, aumentando somente após alongamento da radícula. Nessa fase estacionária

da respiração, provavelmente há pouco aumento das enzimas da respiração e do

número de mitocôndrias. Tecidos de sementes secas contêm mitocôndrias pouco

diferenciadas (Attuci et al., 1991, Ehrenshaft & Brambl, 1990). Dois padrões de

desenvolvimento de mitocôndrias são observados, nos tecidos de armazenamento,

durante a germinação de sementes. No grupo de sementes armazenadoras de

amido há, predominantemente, reparo e ativação de organelas pré-existentes

(Morohashi et al., 1980). Enquanto, nas sementes armazenadoras de gordura,

observam-se síntese de novas mitocôndrias (Morohashi et al., 1981). Em

conseqüência da deficiência interna de oxigênio provocada pelas estruturas ao redor

da semente (testa) e da densidade interna dos tecidos que limitam a difusão dos

gases, sementes em germinação freqüentemente produzem etanol (Morohashi &

Shimokoriyama, 1972 citado por Bewley, 1997).

23

A maquinaria para síntese de proteínas também está presente nas sementes

secas. Após a rehidratação da semente observa-se o recrutamento de ribossomos

isolados para formarem complexos polissomais sintetizadores de proteínas

(Dommes & Van de Walle, 1990). RNAm(s) presentes no embrião seco podem ser

utilizados transitoriamente durante o início da germinação (Lane, 1991). Com o

decorrer do tempo, a síntese de proteínas torna-se mais dependente da síntese de

novos transcritos (Sanchez-Martinez et al., 1986, Bewley & Marcus, 1990). No

decorrer da germinação, ocorre reparo de DNA danificado durante o processo de

desidratação da semente. A síntese de DNA é um evento pós germinativo (Osborne

& Boubriak, 1994).

O primeiro sinal que a germinação se completou é o aumento da massa

fresca e comprimento da radícula. Após a emersão da radícula ocorre um aumento

rápido no consumo de oxigênio em decorrência do aumento de enzimas respiratórias

e mitocôndrias recém sintetizadas durante a proliferação celular. A síntese de DNA

está associada aos eventos de divisão celular durante o crescimento do eixo

embrionário. O desenvolvimento da plântula pode ser dividido em dois tipos segundo

as características dos cotilédones pós-germinação: (1) epigeal – os cotilédones são

suspensos em decorrência da extensão do hipocótilo e torna-se foliado e

fotossintetizante. (2) hipogeal – o hipocótilo permanece curto e compacto e os

cotilédones permanecem abaixo do solo. O epicótilo se expande para elevar as

primeiras folhas verdadeiras. Plântulas de Phaseolus vulgaris tem desenvolvimento

epigeal (Bewley & Black, 1994).

A mobilização de reservas nos tecidos de armazenamento é um evento pós-

germinativo; no entanto, no eixo embrionário, pode ocorrer antes do final da

germinação. As reservas contidas no eixo embrionário são geralmente presentes em

pequenas quantidades, mas são importantíssimas para o desenvolvimento inicial da

plântula. As reservas nos tecidos de armazenamento estão na forma de polímeros

de alto peso molecular que são hidrolisados e convertidos em formas facilmente

transportáveis para os tecidos em crescimento ou com metabolismo acelerado.

Estudos da mobilização de reservas em sementes de ervilha, uma leguminosa não

endospermática, mostraram que carboidratos, proteínas e triacilgliceróis presentes

na radícula, e sacarose, rafinose e estaquiose são os substratos para respiração nos

estágios iniciais do desenvolvimento da plântula. Para o desenvolvimento posterior

da raiz e ramos é necessária a hidrólise de reservas dos cotilédones e transporte

24

dos produtos para o eixo em crescimento. Assim os açúcares livres e dextrinas

liberados da hidrólise do amido são rapidamente translocados para o eixo em

crescimento já que não é observado acúmulo destes açúcares nos cotilédones. A

atividade da fosforilase do amido nos cotilédones produz glicose 1-fosfato que pode

reagir com UTP para formar UDP-glicose e então ser convertida em sacarose pela

sintase da sacarose fosfato e fosfatase da sacarose. Esse açúcar provavelmente é

transportado para o eixo embrionário em desenvolvimento, onde estão presentes

enzimas de hidrólise (Bewley & Black, 1994).

A germinação é um processo complexo que é controlado por fatores externos

(luz, umidade, temperatura) e por reguladores internos (ácido abscíssico e

giberelinas). O ácido abscíssico está envolvido no estabelecimento e manutenção da

dormência enquanto as giberelinas estão relacionadas à indução da germinação. As

giberelinas induzem a expressão de genes cujo produtos são responsáveis pela

mobilização de reservas (Bewley, 1997, Peng & Harberd, 2002).

1.7 – INSULINA PODERIA ATUAR COMO HORMÔNIO EM PLANTAS? Por muito tempo, atribuiu-se o papel de sinalização nos processos de

crescimento e desenvolvimento de plantas a seis hormônios não protéicos. Tais

hormônios são identificados como auxina, citocinina, etileno, giberelinas, ácido

abscísico, brassinosteróides.

Auxina é um dos mais importantes hormônios de plantas e a forma primária

presente na maioria das plantas foi caracterizada como o ácido 3-indol acético. Este

hormônio é responsável pelo controle de diversos processos fisiológicos de planta,

entre eles: divisão celular, crescimento celular por expansão, diferenciação da raiz e

resposta da raiz à gravidade (Kulaeva & Prokoptseva, 2004).

Citocininas têm importantes funções nos processos fisiológicos e no

desenvolvimento das plantas, tais como: divisão celular, regulação do crescimento

da raiz e broto, desenvolvimento de cloroplastos, senescência da folha e resistência

a patógeno. As citocininas são percebidas e transmitidas por um sistema com várias

etapas de fosforilação (Kulaeva & Prokoptseva, 2004; Heyl & Schmülling, 2003).

As giberelinas ativas (GA), ácidos carboxílicos diterpenóides, são hormônios

com importantes funções na modulação de diversos processos durante o

25

desenvolvimento da planta. GAs promovem crescimento de folhas e caules. Em

algumas espécies, GAs induzem germinação e regulam o tempo do florescimento e

do desenvolvimento das flores, frutos e sementes. A via de transdução das

giberelinas promove alterações na expressão gênica e morfologia da planta (Sun &

Gubler, 2004, Olszewski et al., 2002).

Ácido abscísico (ABA) tem importante papel em diversos aspectos do

crescimento e desenvolvimento da planta. ABA regula o depósito de reservas

durante o desenvolvimento da semente, controla a fase de desidratação da

embriogênese e maturação da semente. ABA também está envolvido nos processos

de dormência, fechamento dos estômatos e respostas a estresse hídrico, salinidade

e frio. Algumas das respostas mediadas por ABA são rápidas e envolvem

modificações do fluxo de íons, enquanto outras são demoradas e relacionadas à

mudança na expressão gênica (Kulaeva & Prokoptseva, 2004).

A sinalização de ABA interage com diversas vias de sinalização em plantas

através de mediadores. Alguns desses mediadores têm sido determinados

geneticamente e consistem em proteínas quinases e fatores de transcrição que

podem regular a atividade de várias proteínas e genes (Finkelstein & Gibson, 2001).

A tabela 1 apresenta um resumo dos processos fisiológicos de plantas e a forma de

regulação por ABA e outros sinalizadores.

Os brassinosteróides são esteróis de plantas que desempenham diversos

efeitos como expansão das células adaxiais da junta entre a lâmina foliar e bainha

da plântula de arroz, estimulação do alongamento do segundo e terceiro internodo

do caule do feijão, diferenciação vascular e reorientação de microtúbulos (Bishop &

Koncz, 2002, Crozier et al., 2000).

Etileno está relacionado à regulação de vários processos fisiológicos,

variando desde amadurecimento de fruto e senescência de folha à resposta ao

estresse biótico e abiótico. Um efeito do etileno no crescimento da planta, muito

conhecido, é a resposta tripla de plântulas etioladas de dicotiledôneas. A resposta

tripla consiste na inibição do hipocótilo e alongamento celular da raiz, aumento radial

do hipocótilo e curvatura exagerada apical (Gazzarrini & McCourt, 2001; Guo &

Ecker, 2004).

26

Tabela 1: Processos fisiológicos de plantas e a forma de regulação por ABA e outros

sinalizadores (Finkelstein & Gibson, 2001).

Processos

fisiológicos

Açúcares e seus

efeitos

Efeitos do ABA Outros sinalizadores

Divisão celular na fase de embrião

Glicose promove

Sacarose inibe

Bloqueia a fase

G/S

Giberelinas, auxinas

e citocinas

promovem divisão.

Armazenamento de reservas em sementes

Sacarose promove Promove Genes reguladores

FUS e LEC

(cotilédones

foliares) promovem

Germinação: emergência da radícula

Baixa glicose e

sacarose revertem

inibição por ABA

Inibe Giberelinas, etileno,

brassinosteróides e

luz promovem.

Germinação: mobilização de reservas (síntese de amilases)

Glicose e sacarose

inibem a expressão

do gene da α-

amilase 1A e do

gene da α-amilase

3D do arroz.

Acentua a inibição

da expressão das

α-amilase de arroz,

promovida pelos

açúcares.

Giberelinas

promovem a

expressão do gene

da α-amilase 1A e

não tem efeito sobre

a expressão do

gene da α-amilase

3D do arroz.

Desenvolvimento da plântula

Altas

concentrações de

glicose e sacarose

inibem.

Inibe Etileno diminui a

sensibilidade a

açúcares.

Tuberização Sacarose promove Promove Giberelinas inibem.

27

Diversos trabalhos indicam que as poliaminas, em plantas superiores, estão

envolvidas na regulação do crescimento e desenvolvimento e em resposta a

estresse (Evans & Malmberg, 1989; Kumar et al., 1997).

Embora não haja dúvidas sobre a importância das moléculas sinalizadoras

citadas acima, extensivos estudos genéticos e bioquímicos, realizados na década de

90 do século passado, têm demonstrado a importância de alguns peptídeos nos

sistemas de sinalização nos vegetais durante o crescimento e desenvolvimento,

incluindo regulação dos mecanismos de defesa em resposta a pestes, controle de

divisão e expansão celular, determinação de incompatibilidade à auto-polinização.

Atualmente, são reconhecidos cinco principais peptídeos sinalizadores em plantas:

sisteminas; PSK (fitossulfocinas); ENOD40 (fator de nodulação); CLV3 (clavata 3) e

SCR (proteína rica em cisteína do locus S) (Frassen & Bisseling, 2001), os quais

descreveremos resumidamente a seguir.

A sistemina, o primeiro peptídeo sinalizador identificado em plantas, foi

isolada de folhas feridas de tomate e foi capaz de induzir a expressão de genes

codificadores de diversas proteínas de defesa, incluindo inibidores de proteases. O

emprego de sistemina marcada radioativamente mostrou que este peptídeo se move

do sítio de ferida para outro sítio distante e também induz a expressão de inibidores

de proteases, isto é, confere resposta sistêmica à ferida (Pearce et al., 1991).

Scheer & Ryan (1999) purificaram um receptor para sistemina de 160 kDa, SR 160,

da membrana plasmática de tomate, sendo caracterizado como receptor do tipo

quinase rico em leucina.

Recentemente, dois peptídeos do tipo sistemina foram extraídos de folhas de

tabaco, Tob Sys I e Tob Sys II. Embora os dois peptídeos contenham 18

aminoácidos e induzam a expressão de inibidores de tripsina e proteína quinase

ativada por mitógeno de 48 kDa, a seqüência destes dois peptídeos é muito distinta

da sistemina (Pearce et al., 2001a). Durante a purificação de Tob Sys I e Tob Sys II,

RALF (fator de alcalinização rápida) foi identificado como um peptídeo do tipo

sistemina por induzir alcalinização do meio e estimular a atividade da proteína

quinase ativada por mitógeno. Diferente de Tob Sys I e Tob Sys II, RALF não induz a

expressão de inibidores de proteases. RALF é ativo em quantidades que variam de

nano a micromolar e sua aplicação exógena inibiu o crescimento da raiz e formação

de pêlos radiculares (Pearce et al., 2001b).

28

Dois fatores promotores de crescimento celular, denominados fitossulfocinas

(PSK-α e PSK-β) foram isolados de suspensão de Aspargus officinalis. PSK-α e

PSK-β são pequenos peptídeos sulfatados, constituídos, respectivamente, por 5 e 4

aminoácidos. PSK-β provavelmente é um produto de hidrólise do PSK-α, pois

apresentam a mesma seqüência diferindo somente no número de aminoácidos.

Fitossulfocinas foram identificadas em outras espécies de plantas, além do Aspargus

e são funcionalmente semelhantes às PSK-α e PSK-β. As fitossulfocinas estimulam

a proliferação de culturas de células de baixa densidade, em concentrações

nanomolares, e estimularam outros eventos, incluindo, a diferenciação dos

elementos traqueóides. Como as sisteminas, as fitossulfocinas são resultantes do

processamento de polipeptídeos precursores maiores (Matsubayashi & Sakagami,

1996; Yang et al., 2000).

O gene de nodulação recente (ENOD40) é expresso nos nódulos recém

formados no córtex da raiz de leguminosas após infecção por rizóbios simbiônticos.

O gene ENOD40 é encontrado em plantas leguminosas e não leguminosas e

codifica um curto mRNA que não contém ORF (quadro de iniciação de leitura), mas

tem duas regiões conservadas. A região I, próxima ao 5’ terminal codifica 10-13

aminoácidos e a região II, próxima ao 3’ terminal é codificadora de 27 aminoácidos.

O ENOD40 induziu divisão celular no córtex interno da raiz de alfafa (Crespi et al.,

1994; Sousa et al., 2001).

O meristema do caule é conhecido por ter duas regiões: uma zona central

contendo células meristemáticas no estado indiferenciado e uma zona periférica,

onde as células entram em processo de diferenciação. O desenvolvimento do

meristema do caule, em Arabidopsis, está sob regulação dos genes CLAVATA1 e

CLAVATA3. O locus CLAVATA promove diferenciação das células meristemáticas e

restrição à proliferação de células no centro do meristema. CLV1 codifica um

receptor do tipo serina/treonina quinase (RLK). CLV2 codifica uma proteína do tipo

receptor similar à codificada por CLV1, mas faltando o domínio quinase. CLV3

codifica uma proteína de aproximadamente 9kDa. Estudos bioquímicos demonstram

que CLV1 existe na forma de dois complexos, um de 185 kDa e outro de 450 kDa. O

complexo de 185 kDa consiste no heterodímero de CLV1 e CLV2 ligados por ponte

dissulfeto. O complexo de 450 kDa contém, além do dímero CLV1 e CLV2, uma

proteína relacionada a GTPase Rho (Rop) e a uma proteína fosfatase (KAPP). É

postulado que CLV3 seja secretado pelas células apicais e interaja com CLV1 e

29

CLV2 nas células inferiores para induzir a autofosforilação de CLV1 e subseqüente

formação do complexo de 450 kDa. A fosfatase KAPP promove desfosforilação de

CLV1, funcionando como regulador negativo da sinalização promovida por CLV1

(Clark, 2001; Trotochaud et al., 1999; Stone et al., 1998).

O sistema de auto-incompatibilidade de plantas com flores é um mecanismo

que garante a diversidade dentro da espécie, pois possibilita o reconhecimento e

rejeição de pólen de indivíduos próximos. A genética clássica revelou que o SI

(sistema de incompatibilidade) é controlado por um único locus multialélico

denominado locus da esterilidade (S-locus) (Bateman, 1955 citado por

Matsubayashi, 2003). Quando pólen e pistilo têm o mesmo alelo, interações

moleculares entre determinantes masculinos e femininos disparam uma resposta SI

que inibe o metabolismo e crescimento do grão de pólen (Kanno & Hinata, 1969). O

locus S de Brassica contém 03 genes altamente polimórficos: (1) o gene SRK que

codifica um receptor do tipo quinase serina/treonina com domínio extracelular

homólogo a SLG; (2) um gene codificador de uma glicoproteína do locus S (SLG); e

(3) o gene SP11/SCR que codifica um peptídeo de 8 aminoácidos chamado de

proteína 11 do locus S (SP11; também chamada de proteína rica em cisteína do

locus S - SCR). No sistema de incompatibilidade, os determinantes feminino e

masculino são, respectivamente, SRK e SP11/SCR. SLG tem a função de

intensificar o processo de reconhecimento (Schopfer et al., 1999; Shiba et al., 2001;

Takasaki et al., 2000).

Um grande número de informações na literatura científica sugere a ocorrência

de proteínas de plantas que são relacionadas à cascata de sinalização de insulina

de vertebrados (tabela 1) (Xavier-Filho et al., 2003). Esses dados associados a

recente descoberta de proteínas com seqüência homóloga a insulina em sementes

de Canavalia ensiformis, fruto de Vigna unguiculata e folhas de Bauhinia variegate

(Oliveira et al., 1999; Venâncio et al., 2003; Azevedo et al., 2003) e a observação

dos efeitos de aplicação exógena de insulina em processos vegetais por diversos

autores (Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000; García-Flores et al.,

2001; Goodman & Davis, 1993; Oliveira et al., 2004), nos levam a acreditar no

potencial sinalizador dessa molécula em plantas. Esse trabalho tem por objetivo

contribuir para esclarecimento das funções da insulina e a confirmação do seu papel

hormonal em plantas.

30

Tabela 2: Lista de proteínas associadas à sinalização de insulina encontradas em

vertebrados e plantas (Xavier-Filho et al., 2003).

Proteínas Animais Plantas

Insulina + +

Receptor de insulina

(quinase tirosina)

+ +

Substrato do receptor de

insulina, proteínas IRS-1 e

IRS-2.

+ +

Transportador de glicose + +

Quinase 3-fosfaditilinositol + +

Hexoquinase + +

Via da MAPK + +

TOR + +

Quinase S6 ribossomal + +

31

2 – OBJETIVOS

A insulina tem uma ampla distribuição filogenética e acreditamos que sua

função reguladora no metabolismo e proliferação celular seja conservada também

em plantas. Este trabalho tem a perspectiva de tentar elucidar esta questão e assim

pretendemos:

• Quantificar o transporte de glicose marcada radioativamente em cultura de

células de fumo na presença e ausência de insulina comercial;

• Avaliar o efeito da insulina e pinitol (mimetizador da insulina) sobre

desenvolvimento de plântula de Phaseolus vulgaris;

• Avaliar o efeito da insulina sobre produção de etileno e CO2 por sementes

germinadas na presença e ausência de insulina;

• Quantificar a concentração de glicose, frutose, sacarose e amido de sementes

de Phaseolus vulgaris germinadas na presença e ausência de insulina;

• Quantificar atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de açúcares

(invertase, sintase da sacarose fosfato) de sementes de Phaseolus vulgaris

germinadas na presença e ausência de insulina;

• Caracterizar moléculas do tipo insulina endógena no eixo embrionário de

Phaseolus vulgaris;

• Testar a capacidade de ligação de moléculas do tipo insulina de Phaseolus

vulgaris a vicilinas.

32

3 – MATERIAIS 3.1 – MATERIAL BOTÂNICO

A planta de Phaseoluls vulgaris é originária das Américas onde foi

domesticada. Suas raízes apresentam crescimento primário e secundário, o caule é

herbáceo apresentando durante fase adulta seção transversal cilíndrica e levemente

angulosa, sendo constituído por nós e internódios intercalados, com números

variáveis e dependentes do hábito alimentar. Suas folhas são de dois tipos, as

simples e compostas. As folhas simples são as primeiras a serem formadas e caem,

antes do completo desenvolvimento da planta. Elas estão localizadas no segundo nó

do caule e são duas com filotaxia oposta. As folhas compostas são formadas por

estípulas, pecíolo, raque, peciólulo, pulvínulas e lâmina foliar composta. Suas flores

são papilionadas e o fruto é um legume, ou seja, é constituído por um carpelo seco,

deiscente, zigomorfo, geralmente alongado e comprimido com as sementes

dispostas em uma fileira central com deiscência na sutura dorsal e ventral (Santos e

Gavilanes , 1998).

As sementes de Phaseolus vulgaris L. cv. Carioca foram cedidas pelo Centro

de Ciências Tecnológicas Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte

Fluminense.

3.2 - REAGENTES

Os reagentes principais utilizados no trabalho são listados a seguir:

[U]14C-glicose líquido de cintilação (Ready to use, Beckman) insulina humana - Península insulina bovina - Sigma acrilamida – MERCK

bis-acrilamida – Sigma

glicose 6-fosfato - Sigma

Hepes - Sigma

Sacarose - Sigma

33

Acetato de sódio - Sigma

UDP glicose – Sigma

Glicose 6-fosfato desidrogenase – Sigma

NAD+ - Sigma

Frutose 6-fosfato – Sigma

Hexoquinase – Sigma

Fosfoglicoisomerase – Sigma

Invertase – Sigma

Kit de dosagem de amido – Sigma

Os demais reagentes empregados neste trabalho são de grau analítico e

foram adquiridos comercialmente.

3.3 - ANTICORPOS

Os anticorpos empregados neste trabalho foram adquiridos comercialmente,

como se segue:

IgG de “guinea pig” anti-insulina humana – Peninsula Laboratories

Anticorpo anti IgG de “guinea pig” complexado a peroxidase – Sigma

3.4 – EQUIPAMENTOS Os equipamentos usados neste trabalho são relacionados a seguir:

Balança 2100S – Sartorius Basic

Balança 110S – Sartorius Basic

Agitador Mixer 5432 – Eppendorf

Mini centrífuga 5415C – Eppendorf

Fonte Pac 300 – BioRad

Sistema de Eletroforese – BioRad

Leitor de ELISA – BioRad

Espectrofotômetro UV mini 1240 - Shimadzu

34

4 – MÉTODOS 4.1 – CULTURA DE CÉLULAS DE TABACO

As células de cultura de tabaco em suspensão, fornecidas pela Universidade

Federal de Viçosa, foram mantidas em meio líquido NT-1 [sais MS 0,43% (p/v),

sacarose 3% (p/v), tiamina-HCl 0,0001% (p/v), inositol 0,01% (p/v), 2,4-D 0,2 mgL-1,

KH2PO4 1,32 mmol/L, pH 5,7]. Semanalmente foram feitas repicagens da suspensão

celular.

4.2 – EFEITOS DE INSULINA EXÓGENA NO TRANSPORTE DA GLICOSE EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE TABACO.

Insulina humana foi adicionada a uma suspensão de células (55 g), na

concentração de 2,0 μg/mL. Decorridas 12 horas, adicionaram-se 2 μL de [U]14C-

glicose (0,8 uCi/mL). Com o objetivo de acompanhar o transporte de glicose para o

interior das células, alíquotas (10 mL) foram coletadas nos tempos 8, 16, 32, 46 e 60

horas e filtradas sob vácuo. As frações foram acrescentadas ao líquido de cintilação

(Ready to use, Beckman), agitadas vigorosamente num vortex e analisadas por

cintilografia. O controle consistia na suspensão de células não incubadas com

insulina.

4.3 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus vulgaris.

Para este estudo, as sementes de Phaseolus vulgaris foram esterilizadas em

etanol 70% por um minuto, SDS 0,1% e hipoclorito 0,5% por 30 segundos e, em

seguida, lavadas cinco vezes com água destilada estéril (2 minutos cada). Em

seguida foram colocadas para germinar em placas de petri contendo algodão

embebido em solução aquosa de diferentes concentrações de insulina bovina: 0

μg/mL (controle); 0,036 μg/mL; 0,36 μg/mL; 0,9 μg/mL; 1,8 μg/mL; 3,6 μg/mL. As

sementes foram mantidas à temperatura ambiente. Após 72 horas, as sementes

foram dissecadas e as medidas de massa e comprimento de epicótilos e radículas

foram determinadas, assim como os números de raízes secundárias presentes nas

35

radículas. Neste trabalho, optamos por trabalhar com o tempo de 72 horas, pois,

neste estágio as plântulas têm as partes bem definidas e ainda não estão

fotossintetizantes. Cada experimento compreendia 10 sementes e foi repetido por 3

vezes (Sanches de Jiménez et al., 1999, Oliveira et al., 2004).

4.4 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE ETILENO DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris.

A emissão de etileno por um grupo de 30 sementes de P. vulgaris, embebidas

em água ou solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL), foi medida empregando-

se um espectrômetro fotoacústico. A diferença entre 10P14 (949.479 cm-1) e 10P12

(951.192 cm-1), as duas maiores linhas de absorção de etileno, foi utilizada na

determinação. As medidas foram feitas nos tempos de 0, 24, 48, 72 e 96 horas após

embebição e repetidas por 3 vezes.

4.5 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE CO2 DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris.

O dióxido de carbono (CO2) emitido por um grupo de 30 sementes de P.

vulgaris, embebidas em água ou solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL), foi

medido, por um analisador infravermelho PA de gás – Hartmann & Braun URAS 14,

do início da embebição até as 96 horas. O experimento foi feito em triplicata.

4.6 – EXTRAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS E AMIDO

Os tecidos frescos das sementes (cotilédones, radículas e epicótilos) com 72

horas da embebição tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foram

triturados em nitrogênio líquido. 140 mg destes tecidos foram pesados em tubos

eppendorfs, e a estes foram adicionadas 400 μL de etanol 80 %, sendo o conteúdo

homogeneizado. Em seguida, foram adicionados mais 400 μL de etanol 80 % e a

mistura foi novamente homogeneizada. Os eppendorfs foram pesados antes de

serem incubados em banho-maria a 70 ºC por 90 minutos. Após o aquecimento a

massa foi restituída com etanol 80 % e os eppendorfs contendo a mistura foram

centrifugados a 12.000 x g, 4 ºC, por 15 minutos. O sobrenadante foi usado na

36

determinação de açúcares solúveis. Ao sedimento, acrescentaram-se 800 μL de

etanol 80 % e centrifugou-se a mistura por 10 minutos a 12.000 x g, 4 ºC. O

sobrenadante foi descartado e o sedimento mais uma vez foi lavado com 800 μL de

etanol 80 %. O sedimento foi ressuspenso com 400 μL de hidróxido de potássio 0,2

M, homogeneizado e incubado por 60 minutos a 95 ºC. Após o aquecimento, 70 μL

de ácido acético 1 M foram adicionados. Procedeu-se a última centrigação por 15

minutos a 12.000 x g, 4 ºC. O sobrenadante foi empregado para dosagem de amido

dos referidos tecidos. Três experimentos de germinação independentes foram

usados para o procedimento de extração para posterior dosagem de açúcares.

4.7 - EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS EM EPICÓTILOS, RADÍCULAS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO

Os teores de açúcares solúveis (glicose, frutose e sacarose) dos tecidos

(cotilédones, radículas e epicótilos) de sementes com 72 horas da embebição não

tratadas e tratadas com insulina bovina (0,9 μg/mL) foram determinados por

métodos enzimáticos, acompanhando aumentos de absorvâncias a 340 nm. A

glicose foi medida como descrito a seguir: 20 μL do material a ser dosado foram

transferidos para placas de cultura e adicionaram-se 260 μL de tampão A (Imidazol

100 mM pH 6,9, MgCl2 5 mM, NAD+ 2 mM, ATP 1mM, glicose 6-fosfato

desidrogenase 2U/mL). A absorvância da mistura foi determinada em leitor de ELISA

até estabilização dos valores. Adicionaram-se 5 μL de hexoquinase (1U/5 μL).

Procedeu-se a leitura das absorvâncias a 340 nm até estabilização dos valores, no

leitor de ELISA. O seguinte controle foi feito: (1) água mais tampão A e hexoquinase;

e (2) uma solução 100 μM de glicose. A diferença entre as leituras de absorvância

antes e após adição da hexoquinase foi usada nos cálculos da concentração de

glicose. Para determinação de frutose adicionaram-se à mistura anterior 5 μL de

fosfoglicoisomerase (10 U/mL) e a leitura foi realizada a 340 nm até estabilização da

mesma. Quando a sacarose foi dosada, adicionaram-se à mistura anterior 5 μL de

invertase (solução saturada em tampão A) e a absorvância a 340 nm foi

acompanhada até estabilização dos valores. As dosagens foram feitas em número

37

de três para cada extrato (três experimentos independentes). Assim foram obtidos

para cada tecido 9 valores.

4.8 - EFEITO DA INSULINA NA CONCENTRAÇÃO DE AMIDO DOS EPICÓTILOS, RADÍCULAS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO. As concentrações de amido dos tecidos (cotilédones, radículas e epicótilos)

de sementes com 72 horas da embebição tratadas (0,9 μg/mL) e não tratadas com

insulina bovina foram determinadas por metodologia enzimática, com o emprego do

Kit de dosagem de amido da Sigma. Aos 25 μL do extrato obtido segundo

metodologia do ítem 3,6, foram adicionados 25 μL do reagente de ensaio de amido

que continha amiloglicosidase (50 U/mL) e sais. O primeiro controle consistiu em

misturar 25 μL do reagente de ensaio de amido com 25 μL de água miliQ. No

segundo controle só foram utilizados 50 μL de água miliQ. Para o controle da

amostra, 25 μL de cada extrato foram acrescidos de 25 μL de água miliQ. Soluções

de amido (6 mM e 30 mM) foram usadas para calibração. As misturas foram

incubadas por 15 minutos a 60 ºC. Uma alíquota de 20 μL dessas misturas foi

transferida para placas de cultura e adicionaram-se 100 μL do reagente de ensaio de

glicose que continha NAD+ 1,5 nM; ATP 1 mM; hexoquinase 1 U/mL e glicose 6-

fosfato desidrogenase 1 U/mL. Após 15 minutos, as absorvâncias foram lidas no

leitor de Elisa a 340 nm. As determinações foram feitas em triplicata para cada

extrato.

4.9 – EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Os tecidos frescos das sementes com 72 horas a partir da embebição

tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foram macerados em

nitrogênio líquido e extraídos com tampão Hepes 100 mM pH 7,5, DTT 1mM, MgCl2

5mM. A proporção entre massa e volume de tampão foi 1:3 para extração de

cotilédones, epicótilos e radículas, e 1:9 para extração de tegumento. A mistura foi

centrifugada a 12.000 x g, 4 ºC, por 15 min e o sobrenadante utilizado para dosagem

38

da atividade de invertase e sintase da sacarose fosfato. Três experimentos

independentes de germinação foram utilizados para extração obtendo-se 03 extratos

de partidas diferentes. Em cada experimento foram extraídos os tecidos

mencionados acima. Assim os extratos de cada tecido eram em número de três.

4.10 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DE INVERTASE ÁCIDA EM EPICÓTILOS, RADÍCULAS, TEGUMENTOS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO

A atividade do tipo invertase dos diferentes tecidos das sementes

(cotilédones, tegumentos, epicótilos e radículas) com 72 horas da embebição

tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foi quantificada num meio

reacional contendo 60 μL do extrato protéico em estudo (obtido conforme item 4.9),

20 μL de acetato 100 mM pH 4,7 e 20 μL de sacarose 500 mM. A reação se

processou por 60 minutos a 37 ºC. A glicose foi quantificada segundo método

descrito no ítem 3.7. Foram feitos 02 controles. O primeiro controle consistiu em 60

μL de água miliQ, 20 μL de acetato 0,1 M pH 4,7 e 20 μL de sacarose 500 mM. O

segundo controle continha 60 μL de extrato, 20 μL de água miliQ, 20 μL de acetato

0,1 M pH 4,7. Duas determinações da atividade enzimática foram procedidas para

cada extração que foram em número de 3, assim obtivemos no final 6 valores para

cada tecido (Geigenberger and Stitt, 1993).

4.11 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DE SINTASE DA SACAROSE FOSFATO EM EPICÓTILOS, RADÍCULAS, TEGUMENTOS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus

vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO

A atividade da sintase da sacarose fosfato dos diferentes tecidos das

sementes (cotilédones, tegumentos, epicótilos e radículas) com 72 horas da

embebição tratados (0,9 μg/ml) e não tratados com insulina bovina foi medida pelo

método da antrona, conforme descrito por Huber & Huber, 1989. Volumes de 20 μL

de extrato protéico de cotilédones e epicótilos, e 40 μL de extrato protéico de

39

radículas e tegumentos foram ensaiados num volume reacional de 70 μL contendo

Hepes 7,1 mM pH 7,4, MgCl2 171 μM, frutose 6-fosfato 171 μM, glicose 6-fosfato 0,5

mM e UDP glicose 85,7 μM. A reação processou-se por 30 minutos a 25 ºC. Em

seguida, foram adicionados 70 μL de hidróxido de potássio 30 %. As amostras foram

aquecidas em banho a 100 ºC por 10 minutos e, posteriormente, centrifugadas por

18 segundos a 10.000 x g e, em seguida, resfriada em gelo. Adicionou-se 1mL do

reativo de antrona (0,14 % de antrona em ácido sulfúrico 85 %) e incubou-se a 40 ºC

por 20 minutos. A leitura da absorvância foi feita a 620 nm e os valores foram

comparados às absorvâncias da curva padrão de sacarose. Como controle, extratos

protéicos fervidos por 10 minutos foram incubados por 30 minutos a 25 ºC, em

Hepes 7,1 mM pH 7,4, MgCl2 171 μM e UDP glicose 85,7 μM e a seguir foi dosado

sacarose conforme descrito acima. Num segundo controle 70 μL de água miliQ foi

usada para dosar sacarose. Cada extrato foi dosado por duas vezes assim feitas 6

dosagens para cada tecido.

4.12 – EFEITO DE PINITOL NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus

vulgaris

As sementes foram esterilizadas como descrito no item 4.3 e foram

germinadas nas seguintes concentrações de pinitol: 0 μg/mL (controle); 0,36 μg/mL;

0,9 μg/mL; 1,8 μg/mL; 3,6 μg/mL e 36 μg/mL. Os parâmetros medidos foram massa

e comprimento de radículas e epicótilos, e número de raízes secundárias das

radículas. Cada placa de Petri continha 10 sementes e cada experimento foi repetido

3 vezes.

4.13 - LIGAÇÃO DE INSULINA A VICILINA POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE. Para preparação da coluna de afinidade, Sepharose 4B ativada com brometo

de cianogênio (2,5 g) foi embebida com bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5

M. Exaustivas lavagens foram realizadas com este mesmo tampão, após as quais, a

resina foi ressuspensa em um volume deste tampão, suficiente para solubilizar 25

mg de vicilina de feijão-de-corda IT81D (preparada segundo Macedo et al., 1993). A

40

suspensão foi mantida a temperatura ambiente, sob agitação lenta, por 4 horas,

seguida de incubação a 4 ºC por 16 horas. Após decantação, o sobrenadante foi

descartado e adicionou-se tampão glicina 0,1 M pH 9,0 ao precipitado. O material foi

agitado lentamente por 3 horas e decantado posteriormente. Logo após o descarte

do segundo sobrenadante, foi adicionado ácido acético 0,1 M pH 3,0. O material foi

novamente decantado e procederam-se exaustivas lavagens com tampão

bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5 M (Cua trecasas, 1970).

A coluna de vicilina acoplada a Sepharose 4B (1 mL) foi utilizada para testar a

capacidade de ligação de insulina à vicilina. Para verificar a eficiência deste

processo aplicamos 670 μg de insulina comercial bovina (Sigma) dissolvida no

tampão em bicarbonado de sódio pH 9,0 em diferentes concentrações de EDTA à

coluna de vicilina acoplada a Sepharose 4B. As condições de eluição também foram

variadas. Três diferentes condições cromatográficas foram testadas. Na primeira, a

insulina foi dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1 M e NaCl 0,5 M pH 9,0, esse

mesmo tampão foi empregado para lavar a coluna. A eluição foi feita com ácido

acético 0,1 M pH 3,0. Na segunda condição cromatográfica testada, a insulina foi

dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0 com EDTA 5 mM que também foi

empregado para lavar a coluna. O material retido foi eluído primeiro com bicarbonato

de sódio 0,1 M pH 9,0, EDTA 5mM e NaCl 2 M e depois com ácido acético 0,1 M pH

3,0. No terceiro sistema testado, a insulina foi dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1

M pH 9,0 com EDTA 20 mM, este mesmo tampão foi empregado para lavar a

coluna. A eluição foi precedida com bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM e

NaCl 2 M pH 9,0 e depois ácido acético 0,1 M pH 3,0. Os experimentos foram feitos

em duplicata.

4.14 – EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE EIXO EMBRIONÁRIO DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DE GERMINAÇÃO

Os eixos embrionários com 48 horas de embebição em água foram

macerados em nitrogênio líquido e extraídos numa proporção de 1:5 com

bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, EDTA 0,2 mM, triton X-100 0,1%, glicerol 10 %,

benzamidina 10mM e PMSF 2mM. O homogenato foi centrifugado a 27.000 x g por

30 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi submetido à cromatografia de afinidade em

coluna de vicilina acoplada à Sepharose 4B para isolamento de moléculas.

41

4.15 - SEPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DO TIPO INSULINA DE EXTRATO DE EIXO EMBRIONÁRIO DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DA EMBEBIÇÃO Os extratos dos eixos embrionários de Phaseolus vulgaris com 48 horas de

embebição (65 mL) obtido segundo metodologia descrita no item 4.14 foi aplicado à

coluna de vicilina Sepharose 4B (1 mL) num fluxo de 30 mL/hora. Uma coluna

diferente da que foi usada para testar a ligação de insulina a vicilina foi empregada

para cromatografia de extratos dos eixos embrionários de Phaseolus vulgaris. A

coluna foi lavada com tampão bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5 M. O

material retido na coluna a partir dos extratos dos eixos embrionários foi eluído com

ácido acético 0,1 M pH 3,0.

4.16 - TESTE DIAGNÓSTICO DE INSULINA POR ELISA Os picos retidos da insulina, dos extratos de eixos embrionários de Phaseolus

vulgaris foram analisados quanto a sua reatividade ao anticorpo anti-insulina

humana, por técnica de ELISA. Os materiais foram ressuspensos em tampão

carbonato/bicarbonato 0,05 M pH 9,6. A placa de ELISA foi sensibilizada por 16

horas com diferentes amostras. Após este período, descartaram-se os extratos e a

placa foi lavada 03 vezes por 20 minutos com Tween-20 0,05% em tampão fosfato

0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M. Adicionaram-se aos poços 300 μL de tampão bloqueador

(gelatina 1%, Tween-20 0,05 % em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M) por um

período de 1 hora. Lavou-se a placa 3 vezes por 20 minutos com Tween-20 0,05 %

em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M e depois incubou-se com o anticorpo

anti-insulina humana, diluído na proporção de 1: 2.000 no tampão bloqueador, a 37

ºC, por um período de 45 minutos. Fizeram-se 03 lavagens, de 5 minutos cada, da

placa com Tween 0,05% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M. Incubou-se a

placa com o conjugado anti-IgG-peroxidase, diluído 1: 2.000 em tampão bloqueador,

a 37 ºC, por um período de 45 minutos. A placa foi mais uma vez lavada em tampão

fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M Tween-20 0,05 %, por 4 vezes, durante 5 minutos

cada lavagem. Adicionou-se o substrato (10 mg de orto-fenil-diamina dissolvido em

25 mL de tampão citrato 26 mM/fosfato 52 mM pH 5,0 com 10 μL de água

42

oxigenada) e deixou-se a placa no escuro por 10 minutos a temperatura ambiente. A

reação foi interrompida com a adição de 50 μL de ácido sulfúrico 3 N. Procedeu-se,

então a leitura das placas a 410 nm em leitor de ELISA. Uma curva com diferentes

concentrações de insulina bovina comercial foi elaborada para referência.

Considerou-se uma reação positiva a leitura maior do que a do controle, que

consistia do tampão de extração (carbonato/bicarbonato 0,05 M pH 9,6) (Cainelli-

Gebara et al, 1995).

4.17 – VISUALIZAÇÃO EM GEL DE POLIACRILAMIDA SOB CONDIÇÕES DESNATURANTES DE PROTEÍNAS Os procedimentos eletroforéticos foram realizados segundo o método de

Laemmli (1970). O gel de concentração foi preparado a uma concentração de 3,75

% de acrilamida com SDS 10 % e Tris-HCl 1 M pH 6,8 e o de separação com

concentração de 15 % de acrilamida com SDS 10 % e Tris-HCl 1,5 M pH 8,8.

Amostras protéicas foram dissolvidas em tampão de amostra contendo SDS 4 %,

glicerol 12 %, Tris-HCl 50 mM pH 6,8 e azul de bromofenol 0,01 %. A corrente

utilizada foi de 15 mA. O gel foi revelado por nitrato de prata (Blum et al., 1987).

4.18 – LOCALIZAÇÃO DE INSULINA EM TECIDOS EMBRIONÁRIOS DE Phaseolus vulgaris por IMUNOCITOQUÍMICA

Radículas e epicótilos de embrião de Phaseolus vulgaris com 48 horas de

embebição em água foram cortados e fixados em glutaraldeído 0,1%,

paraformaldeído 4% em tampão cacodilato de sódio 0,05 M pH 7,0. A desidratação

processou-se com metanol 50 % (trinta minutos), 70 % (uma hora) e 90 % (uma

hora). Depois desta etapa, o material foi incluído em resina LR Gold,

seqüencialmente, em 50 % de metanol e 50 % de LR Gold (dezoito horas); 30% de

metanol e 70 % de LR Gold (dezoito horas), 100 % de LR Gold (quatro dias), 100 %

de LR Gold e catalisadores (dez horas). Os catalisadores são benzil e peróxido de

benzoil. A polimerização da resina ocorre sob baixa temperatura e incidência de luz

visível.

Cortes de aproximadamente 60 nm foram obtidos em ultramicrótomo Reichert

Ultracuts e coletados em grades de níquel forradas com filme “formvar”. Os cortes

43

foram incubados com cloreto de amônio 50 mM por duas horas, seguido de bloqueio

com PBS (10 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 0,15 M de NaCl) contendo 1% de BSA

(tampão bloqueador) por duas horas. Em seguida, os cortes foram incubados com

anticorpo anti-insulina humana produzido em “guinea pig”, diluído1:100 em tampão

bloqueador, por duas horas. Os cortes foram lavados quatro vezes com tampão de

bloqueio e seis vezes com tampão PBS (com intervalos de cinco minutos entre as

lavagens). A próxima etapa foi incubar as lâminas com anti-IgG de cobaia conjugado

a partículas de ouro coloidal 10 nm, numa diluição 1:200, em tampão bloqueador,

por duas horas. Seguiram-se quatro lavagens com tampão bloqueador e seis vezes

com tampão PBS (com intervalos de cinco minutos entre as lavagens). Os cortes

controle não foram incubados com anticorpo anti-insulina humana. Os cortes foram

contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo, e analisados ao

microscópio de transmissão Omega 900 da Zeiss operado em 80KV.

44

5 – RESULTADOS

5.1 – EFEITOS DE ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NO TRANSPORTE DA GLICOSE EM CÉLULAS DE TABACO

A insulina comercial humana quando adicionada a células de tabaco em

suspensão aumentou o transporte de glicose para o interior celular. Como podemos

visualizar na figura 6, a partir do tempo de 16 horas a quantidade de glicose

radioativa é bem maior nas células tratadas com insulina do que nas não tratadas. O

efeito máximo da insulina no transporte de glicose para o interior da célula foi

observado no tempo de 16 horas, e a quantidade de glicose nas células tratadas

com insulina foi aproximadamente 17 vezes maior do que nas células não tratadas.

As contagens de cintilações por minuto (cpm) nas células tratadas com insulina nos

tempos de 32, 46 e 60 horas foram respectivamente 11, 9 e 7 vezes maiores do que

as das células controles.

45

0

5000

10000

15000

20000

25000

8 16 32 46 60

horas

CPM

controle Insulina (2,0 ug/ml)

**

**

Figura 6 – Efeito da Insulina na absorção de glicose. * Amostras estatisticamente diferentes (Teste T - P ≤ 0.05). As colunas representam a média de três experimentos e as barras indicam o desvio padrão.

46

5.2 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus vulgaris

Insulina adicionada ao meio de germinação estimulou o crescimento do eixo

embrionário de Phaseolus vulgaris conforme podemos visualizar na figura 7. A figura

7 A apresenta o tamanho das radículas de eixo embrionário de sementes com 72

horas da embebição, germinadas em presença de diferentes concentrações de

insulina bovina. O maior aumento no tamanho das radículas em torno de 19 % foi

observado quando as sementes germinaram em meio contendo de 0,036 μg/mL a

1,8 μg/mL de insulina. O menor aumento no tamanho das radículas foi de 11 % em

meio contendo uma concentração de 3,6 μg/mL. Os epicótilos de sementes tratadas

com insulina foram significativamente maiores que as não tratadas conforme

podemos observar na figura 7 B. O maior aumento no tamanho dos epicótilos foi

observado na concentração de 0,9 μg/mL, tendo sido na ordem de 41 %. Já o menor

aumento (12%) foi observado na concentração de 3,6 μg/mL. As massas, tanto de

radículas (Figura 7 C) quanto de epicótilos (Figura 7 D), foram estatisticamente

maiores nas sementes germinadas na presença de insulina. As taxas de aumento

nas massas das radículas variaram de 25 % (3,6 μg/mL) a 74 % (0,036 μg/mL).

Insulina na concentração de 0,9 μg/mL aumentou em cerca de duas vezes a massa

dos epicótilos. O aumento nas massas dos epicótilos promovido pela insulina na

concentração 3,6 μg/mL foi menor (1,4 vez) do que nas demais concentrações de

insulina, o que nos indica que este hormônio em concentrações elevadas reduz seu

efeito promotor do crescimento. A insulina nas diferentes concentrações

empregadas, aproximadamente dobrou o número de raízes laterais (Figura 7 E).

47

0

2

4

6

0 0.036 0.36 0.9 1.8 3.6

insulina (ug/mL)

radí

cula

(cm

) a a a a

b

bc

A 0

0,20,40,60,8

11,2

0 0.036 0.36 0.9 1.8 3.6

insulina (ug/mL)

epic

ótilo

(cm

) ab a

b

b cd

B

0

50

100

0 0.036 0.36 0.9 1.8 3.6

insulina (ug/mL)

radí

cula

(mg)

a b a b cd

C 0

5

10

15

0 0.036 0.36 0.9 1.8 3.6

insulina (ug/mL)ep

icót

ilo (m

g) a b a b cd

D

0

2

4

6

8

0 0.036 0.36 0.9 1.8 3.6

insulina (ug/mL)

raíz

es la

tera

is(n

º) a ab a bc c

d

E

Figura 7 – Efeito de insulina no comprimento de radículas (A) e epicótilos (B), na massa de radículas (C) e epicótilos (D) e no número de raízes laterais (E) de eixos embrionários de Phaseolus vulgaris, com 72 horas de embebição. As colunas indicam a média de três resultados e as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são estatisticamente diferentes (Teste de Duncan - P ≤ 0.05).

48

5.3 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE ETILENO DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris.

Conforme podemos observar na figura 8 a insulina reduziu a emissão de

etileno na ordem de 8 % (±8), 25% (±10) e 38 % (±4) nos tempos de 48, 72 e 96

horas, respectivamente. Dado o grande desvio no tempo de 48 horas

consideraremos uma redução efetiva na emissão de etileno nos tempos de 72 horas

e 96 horas. O comportamento de redução na emissão de etileno nos tempos de 72

horas e 96 horas foi característico para os três experimentos. No tempo de 72 horas,

as sementes germinadas na presença de insulina produziram menos etileno do que

sementes germinadas na ausência de insulina, tendo sido a redução da ordem de

16, 24 e 37 %, nos três experimentos independes enquanto no tempo de 96 horas

as reduções foram da ordem de 34, 41 e 38 %.

5.4 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE CO2 DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris. Nossos resultados sugerem que insulina aumenta a taxa de respiração das

sementes ao longo do desenvolvimento do eixo epicótilo-radícula. A figura 9

apresenta a taxa de emissão de CO2 de sementes tratadas com insulina e não

tratadas.

49

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

48 72 96

tempo (horas)

% d

e re

duçã

o da

em

issã

o de

etil

eno

Figura 8 – Efeito da administração de insulina exógena na emissão de etileno durante a germinação de sementes de Phaseolus vulgaris. A coluna representa a média da redução da taxa de emissão de etileno de três experimentos. As barras indicam o desvio padrão.

50

0 20 40 60 80 1000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0B

Res

pira

tion

Rat

e ( μ

L.g-1

.h-1)

Time ( hours )

Water Aqueous solution of insulin

Tempo (horas)

Insulina (0,9 ugmL)

Água

Figura 9 – Efeito da administração de insulina exógena na emissão de CO2 durante a germinação de sementes de Phaseolus vulgaris. O experimento foi feito em triplicata cujos perfis foram similares. O gráfico representa um experimento.

51

5.5 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO. Os níveis de glicose, frutose e sacarose de cotilédones, epicótilos e radículas

provenientes de sementes com 72 horas da embebição em presença de insulina

bovina (0,9 μg/mL) ou de água são apresentados na figura 7. Os níveis de glicose e

frutose nos três tecidos analisados das sementes tratadas com insulina não foram

estatisticamente diferentes dos níveis desses açúcares em sementes não tratadas

com insulina. Na presença deste hormõnio, somente a concentração de sacarose foi

alterada; reduções da ordem de 11, 19 e 40 % foram observados em cotilédones,

radículas e epicótilos, respectivamente (Figura 10).

5.6 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA CONCENTRAÇÃO DE AMIDO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO. As concentrações de amido nos cotilédones e epicótilos de sementes

embebidas em solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL) não foram

estatisticamente diferentes das concentrações de amido nesses mesmos tecidos de

sementes embebidas com água, conforme podemos observar na figura 11. A

insulina, no entanto, reduziu a concentração de amido de radículas, na ordem de 54

% em referência às radículas de sementes não tratadas.

52

0

100

200

300

400

glicose frutose sacarose

umol

/MF

controle insulina (0,9 ug/mL)

a aa a

a b

A

0

100

200

300

400

glicose frutose sacarose

umol

/gM

F

controle insulina (0,9 ug/mL)

a a

a a

ab

B

0100200300400500600

glicose frutose sacarose

umol

/gM

F

controle insulina (0,9 ug/mL)

a a

a

a

a

b

C

Figura 10 – Concentrações de glicose, frutose e sacarose nos cotilédones (A), radículas (B) e epicótilos (C) de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. As colunas indicam média de três experimentos independentes e as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).

53

0

5

10

15

20

25

30

Cotilédones Radícula Epicótilo

ug d

e am

ido/

gram

a de

mas

sa fr

esca

controle insulina (0,9 ug/ml)

aa

a

b aa

Figura 11 – Concentrações de amido nos cotilédones, radículas e epicótilos de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. Colunas indicam média de três experimentos independentes. As médias com mesma letra não são estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).

54

5.7 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DA INVERTASE DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO. A figura 12 apresenta a atividade de invertase em tegumentos, cotilédones,

radículas e epicótilos de sementes germinadas em presença de insulina ou em água.

A insulina não alterou a atividade da invertase nos epicótilos e radículas de

sementes de P. vulgaris com 72 horas da embebição, pois os valores da atividade

não foram estatisticamente diferentes daquelas sementes não tratadas com insulina.

A atividade invertásica não foi detectada em tegumentos e cotilédones de sementes

de P. vulgaris com 72 horas da embebição, nem em sementes tratadas, nem nas

não tratadas com insulina.

5.8 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DA SINTASE DA SACAROSE FOSFATO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO. A insulina reduziu em 59 % a atividade da sintase da sacarose fosfato de

radículas de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição (Figura

13). No entanto, a atividade da sintase da sacarose fosfato dos cotilédones e

epicótilos de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embembição

tratadas e não tratadas com insulina não diferiram nos níveis de atividades (Figura

13). A atividade da sintase da sacarose fosfato não foi detectada em tegumentos de

sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embembição, nem em sementes

tratadas, nem nas não tratadas com insulina.

55

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

tegumentos cotilédones radículas epicótilos

uMol

de

glic

ose

gMf-1

min

-1

controle

a a

a a

nd nd

insulina (0,9 ug/mL)

Figura 12 – Atividade invertásica nos tegumentos, cotilédones, radículas e epicótilos de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. As colunas indicam média de três experimentos independentes e as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05). nd – não detectado.

56

0

20

40

60

80

100

120

140

tegumentos cotilédones radículas epicótilos

uMol

de

saca

rose

gM

F-1 m

in -1

controle (água)

a a

b

aa

a

nd

insulina (0,9 ug/mL)

Figura 13 – Atividade da sintase da sacarose fosfato nos tegumentos,

cotilédones, radículas e epicótilos de Phaseolus vulgaris com 72 horas da

embebição. As colunas indicam média de três experimentos independentes e

as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são

estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05). nd – não

detectado.

57

5.9 - EFEITO DO PINITOL (MIMETIZADOR DA AÇÃO DE INSULINA) NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus vulgaris

Os quiro-inositóis são compostos que atuam como mediadores da ação da

insulina, provavelmente, após ligação ao receptor. No nosso estudo, o efeito do D-

pinitol (3-O-metil-quiroinositol) na germinação de sementes de Phaseolus vulgaris

nas concentrações de 0,36, 0,9, 1,8, 3,6, 36 foi testado. As variáveis analisadas

foram: tamanho de epicótilos e radículas, massa de epicótilos e radículas, e número

de raízes laterais de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição.

Os valores são apresentados na figura 14. O pinitol teve efeito estimulador do

crescimento tanto de epicótilos quanto de radículas. O aumento proporcionado pelo

pinitol no tamanho das radículas variou de 30 % (1,8 μg/mL) a 77 % (0,9 μg/mL),

enquanto a variação no tamanho dos epicótilos foi de 20 % (3,6 μg/mL) a 41 %

(36 μg/mL). As massas de epicótilos e radículas de sementes embebidas em

solução aquosa de pinitol foram maiores do que das sementes embebidas somente

em água. O maior aumento na massa dos epicótilos e das radículas foi obtido

utilizando-se a concentração de 0,9 μg/mL, sendo da ordem de 83 % e 98 %,

respectivamente (Figuras 14 C e 14 D). Na concentração de 1,8 μg/mL, o pinitol

promoveu as menores taxas de aumento na massa dos epicótilos (33 %) e radículas

(63 %) pinitol aumentou o número de raízes laterais de 3 (1,8 μg/mL) a 5 vezes (36

μg/mL) aproximadamente (Figura 14 E).

58

00,20,40,60,8

1

0 0,36 0,9 1,8 3,6 36

pinitol (ug/mL)

epic

ótilo

(cm

)

ab a ab b cd

B

0

2

4

6

0 0,36 0,9 1,8 3,6 36

pinitol (ug/mL)

radí

cula

(cm

) a b d a ce

A

020406080

0 0,36 0,9 1,8 3,6 36

pinitol (ug/mL)

radí

cula

(mg)

a b a a

b

b

c

C

02468

10

0 0,36 0,9 1,8 3,6 36

pinitol (ug/mL)

epic

ótilo

(mg)

ac

b ab a

d

D

02468

0 0,36 0,9 1,8 3,6 36

pinitol (ug/mL)

raíz

es la

tera

is (n

o )

c

a b a a b

E

Figura 14 – Efeito do pinitol no comprimento de radículas (A), epicótilos (B), na

massa de radículas (C) e epicótilos (D), e no número de raízes laterais (E) de

eixos embrionários de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. As

colunas indicam média de três experimentos independentes e as barras

representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são

estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).

59

5.10 - LIGAÇÃO DE INSULINA A VICILINAS POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE. Nossos resultados demonstram que insulina bovina liga-se a vicilinas de

Vigna unguiculata (IT81D) acoplada a Sepharose 4 B (figuras 15, 16 e 17). Em

média 63 μg de insulina ficaram retidos em 1 mL da matriz de vicilina acoplada a

Sepharose 4B. O EDTA reduziu a capacidade de ligação de insulina a vicilina

conforme podemos observar nas figuras 15, 16 e 17. Quando comparamos os três

gráficos observamos leituras de absorvâncias menores do pico de insulina retida

quando o EDTA estava presente no tampão do bicarbonato. No entanto, quando

EDTA foi usado na concentração de 20 mM, a insulina ligada só foi eluída com ácido

acético 0,1 M pH 3,0 (figura 17). Quando EDTA estava nos tampões na

concentração de 5 mM, parte da insulina que ficou retida foi eluída com aumento da

força iônica (NaCl 2M) e outra com ácido acético 0,1 M pH 3,0. Todos os picos

retidos foram testados por ELISA e uma reação positiva indicava que a proteína

eluída se tratava de insulina.

60

Ácido Acético 0,1 M pH 3,0

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

volume (mL)

abso

rvân

cia

(280

nm

)

Figura 15 – Perfil cromatográfico de insulina bovina em coluna de vicilina-Sepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de amostra – bicarbonato de sódio 0,1 M NaCl 0,5 M pH 9,0. Tampão de Eluição – Ácido acético 0,1 M pH 3,0.

670 μg de insulina foram aplicados a coluna.

61

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

volume (mL)

abso

rvân

cia

(280

nm

)

B A

Figura 16 – Efeito do EDTA (5mM) no perfil cromatográfico de insulina bovina em coluna de vicilina-Sepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de amostra – bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 5 mM pH 9,0. Tampão de Eluição – (A) bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 5 mM NaCl 2 M pH 9,0, (B) Ácido acético

0,1 M pH 3,0. 670 μg de insulina foram aplicados a coluna.

62

00,050,1

0,150,2

0,251 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45

volume (1 mL)

abso

rvân

cia

(280

nm

)

B A

Figura 17 – Efeito do EDTA (20mM) no perfil cromatográfico de insulina bovina em coluna de vicilina-Sepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de amostra – bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM pH 9,0. Tampão de Eluição – (A) bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM NaCl 2 M pH 9,0, (B) Ácido

acético 0,1 M pH 3,0. 670 μg de insulina foram aplicados a coluna.

63

5.11 - SEPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DO TIPO INSULINA DE EIXOS EMBRIONÁRIOS DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DA EMBEBIÇÃO POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM VICILINA-SEPHAROSE

A Figura 18 apresenta o perfil cromatográfico de extrato de eixos

embrionários de Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição em coluna de

Vicilina-Sepharose 4B. Observa-se que houve retenção de material quando este foi

eluído com ácido acético 0,1 M pH 3,0. Quando essa fração foi analisada por ELISA,

mostrou-se reativa ao anticorpo anti-insulina humana. Essa fração também foi

submetida à separação por SDS-PAGE e conforme podemos visualizar na figura 19,

uma proteína com massa molecular próxima a da insulina está presente. Esses

resultados indicam presença de insulina endógena nos eixos embrionários de P.

vulgaris.

5.12 – IMUNOLOCALIZAÇÃO DE INSULINA NOS EIXOS EMBRIONÁRIOS DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DE EMBEBIÇÃO. Pela microscopia eletrônica de transmissão, foi detectada marcação de

insulina nos vacúolos de epicótilos de Phaseolus vulgaris com 48 horas da

embebição em água (Figura 20) e nos vacúolos e citoplasmas de radículas de

Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição em água (Figura 21). No controle,

os cortes não foram tratados com o anticorpo anti- insulina humana.

64

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102

108

114

volume (mL)

abso

rvân

cia

(280

nm

)

A

0

0,005

0,01

0,015

0,02

95 97 99 101

103

105

107

109

111

113

115

117

volume (mL)

abso

rvân

cia

(280

nm

)

B Figura 18 – A – Perfil cromatográfico do extrato de eixos embrionários com 48 horas da embebição em Sepharose 4B acoplada a vicilina. B - Ácido Acético 0,1 M pH 3,0 (região de eluição ampliada). Tampão de equilíbrio – bicarbonato de sódio 0,1 M NaCl 0,5 M pH 9,0.

65

I 1

5,7 kDa Figura 19 – SDS-PAGE em gel 15 % de acrilamida. I – Insulina bovina comercial, 1 – Pico retido do extrato total de Phaseolus vulgaris em cromatografia de afinidade em vicilina acoplada a Sepharose 4B.

66

Figura 20 – Detecção de insulina em epicótilos de Phaseolus vulgaris com 48

horas da embebição por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Painel:

A – Controle. B – Vacúolo marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm.

Barra = 200 nm.

67

Figura 21 - Detecção de insulina em radículas de Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A – Controle. B – Vacúolo marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. C – Espaço intercelular marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. D – Citoplasma marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. E – Parede celular. Barra corresponde a 400 nm em A, 250 nm em C e E, 90 nm em B e D.

68

6 – DISCUSSÃO

É sabido que a insulina, em animais, aumenta o transporte de glicose para o

interior celular. Esse processo é mediado pelo aumento da translocação de

transportadores GLUT4 para a membrana plasmática (Kanzaki & Pessin, 2003;

Brady et al., 1999; Pessin et al., 1999). Nossos resultados demonstram efeito similar

da insulina em plantas. As células de tabaco tratadas com insulina apresentam

quantidades de glicose significativamente maiores do que células não tratadas nos

tempos de 16 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas (figura 6). Acreditamos que a

insulina, de forma semelhante em animais, esteja sinalizando o aumento de

transportadores de hexoses na membrana citoplasmática das células de tabaco em

suspensão.

A primeira descrição do efeito de insulina sobre os processos germinativos foi

publicada em 1923, por Ellis & Eyster. Neste trabalho, insulina de pâncreas de boi e

de cebola preparadas segundo o método de Collip’s, foram testadas em plântulas de

milho de um genótipo clorótico e outro normal durante a fase de crescimento

dependente do endosperma. Este hormônio, em concentrações inferiores a 0,005 %,

teve efeito estimulador do crescimento da raiz, extremidades e número de raízes

laterais dos genótipos testados, enquanto em altas concentrações a insulina passou

exercer efeito inibitório do crescimento das plântulas. Plantas do genótipo clorótico

tratados com insulina apresentaram cerca de 28,7 % a mais de pigmentos verdes do

que plântulas de milho não tratadas (Ellis & Eyster, 1923).

Relatos do efeito positivo da insulina sobre a germinação e desenvolvimento

da plântulas de milho também foram publicados pelo grupo da Sáchez de Jiménez,

em 1999 (Sánchez de Jiménez et al., 1999). Esse trabalho demonstra que insulina

acelera a incorporação de metionina 35S em proteínas ribossomais, aumenta a

mobilização de mRNA da proteína ribossomal S6 para os polissomos e também

intensifica a fosforilação da proteína ribossomal S6 na subunidade ribossomal 40S

em eixos embrionários de milho em germinação. Em 2000, esse mesmo grupo

apresentou os resultados referentes aos efeitos da insulina na síntese de novo das

duas principais isoformas dos fatores de iniciação de eucariotos 4E em plantas,

eIF4E e eIFiso4E. Insulina acelerou a síntese de novo do fator eIFiso4E, mas não do

eIF4E (Dinkova et al., 2000). Esses dados, em conjunto, indicam um processo de

regulação da tradução, promovido pela insulina em plantas. De milho, foi isolada

69

uma proteína de 20 kDa com propriedades homólogas a insulina. No processo de

purificação desta proteína empregou-se uma coluna de anticorpo anti-insulina

acoplado a Sepharose 4B (García-Flores et al., 2001).

Insulina, também, tem efeito estimulador no desenvolvimento de plântulas de

cevada, sementes oleaginosas (pepino, girassol e melão) e Canavalia ensiformis

(Csaba & Pál, 1982; Goodman & Davis, 1993; Oliveira et al., 2004). Insulina, quando

presente em concentração de 10-8 M, no meio de germinação de sementes de

cevada, foi capaz de promover aumento no comprimento e massa das raízes, massa

do coleóptilo e atividade mitótica das plântulas (Csaba & Pál, 1982).

Sementes de pepino, girassol e cevada, quando germinadas na presença de

insulina, apresentaram atividades aumentadas das enzimas cotiledonárias

relacionadas à conversão de gorduras em carboidratos. As atividades das enzimas

acil CoA desidrogenase, citrato sintase e malato desidrogenase de cotilédones das

três espécies de sementes citadas foram maiores na presença de insulina do que na

ausência. Somente as atividades das isoformas glioxissomais foram alteradas por

insulina. Tratamento com insulina, também, aumentou a atividade de enzimas

específicas do ciclo do glioxilato, a isocitrato liase e malato sintase. Duas enzimas do

peroxissoma, catalase e oxidase do glicolato, não diretamente envolvidas na

conversão de gorduras armazenadas em carboidratos, tiveram atividades

aumentadas após tratamento com insulina (Goodman & Davis, 1993).

Nossos dados estão de acordo com trabalhos anteriores, à medida que

insulina estimulou o desenvolvimento de plântulas de Phaseolus vulgaris. Na figura 7

A podemos constatar que as sementes tratadas com insulina em concentrações de

0,036, 0,36, 0,9, 1,8 e 3,6 μg/ml tinham tamanhos de radículas maiores do que em

sementes não tratadas. Um outro parâmetro analisado foi a massa dessas radículas

que foi maior nas sementes tratadas com insulina nas concentrações de 0,036, 0,36,

0,9, 1,8 e 3,6 μg/mL do que as não tratadas (figura 7 C). Tanto o tamanho quanto a

massa dos epicótilos de sementes tratadas com insulina (0,036, 0,36, 0,9, 1,8, e 3,6

μg/mL) foram estatisticamente maiores do que as de sementes não tratadas,

conforme podemos observar entre as figuras 7 B e 7 D, respectivamente. A figura 7

E apresenta o número de raízes secundárias de sementes tratadas com diferentes

concentrações de insulina, notando-se que em todas concentrações empregadas

insulina ativou a formação de raízes secundárias.

70

Em nosso trabalho, observamos que a insulina, por mecanismos ainda não

conhecidos, reduz a síntese de etileno ou aumenta a sua degradação, resultando na

menor taxa de emissão de etileno de sementes germinadas na presença deste

hormônio (figura 8). Se por um lado consideramos difícil a análise do efeito da

insulina na redução da emissão de etileno uma vez que a sinalização de hormônios,

em planta, seja resultante de múltiplas interações, seja dependente do tipo celular,

do estágio do desenvolvimento e da concentração. Por outro lado, constatamos que

no processo de desenvolvimento de plântula, insulina e etileno têm papéis

antagônicos. A insulina estimula o desenvolvimento da plântula enquanto etileno

inibe o crescimento de epicótilo e hipocótilo (Kende, 1993).

Através dos estudos com mutantes ein (insensível a etileno) e ctr (resposta

tripla constitutiva) uma via de sinalização foi delineada, na qual etileno se ligaria aos

receptores para etileno (ETR) e este evento pára a ativação de uma proteína com

alta homologia com MAPKKK (quinase da quinase da quinase ativada por

mitógenos) do tipo Raf, a CTR1. Os receptores de etileno quando estão ligados ao

etileno inativam a quinase serina/treonina do tipo Raf (CTR1). A inativação de CTR1

libera reguladores positivos EIN2 e ativadores transcricionais, EIN3, da regulação

negativa de CTR1, permitindo, assim, a resposta ao etileno. Possivelmente, na

ausência do gás etileno, a via de ETR ativa o crescimento celular. A repressão de

ETR pelo etileno inibe a expansão celular (Gazzarrini & McCourt, 2001; Guo &

Ecker, 2004).

Sugerimos que a insulina possa estar atuando na cascata de sinalização de

etileno e ative a proteína CTR1 (proteína do tipo quinase Raf que ativa cascata de

fosforilações na rota da MAP quinase), ao mesmo tempo iniba a atuação do etileno.

Interessantemente, insulina aumenta a expressão gênica e síntese de DNA, em

vertebrados, atuando na via de sinalização por proteínas MAPK (quinase ativa por

mitógenos). Mas cabe ressaltar que o papel da cascata de MAPK na sinalização de

etileno é controverso e mais evidências genéticas são necessárias (Guo & Ecker,

2004). Existem evidências que etileno ative MAP quinase em epicótilos e em folhas

de Arabidopsis (Novikova et al., 2000) e em células de suspensão de Medicago

(Quaked et al., 2003).

Neste trabalho, também, avaliamos o efeito da insulina sobre a taxa da

respiração de sementes germinadas na presença e ausência de insulina. Era de se

esperar um aumento na taxa respiratória já que insulina acelera o desenvolvimento

71

de eixo embrionário e para tanto há uma maior necessidade energética. Os

resultados apresentados na figura 9 reforçam essas expectativas.

Os açúcares são moléculas importantíssimas durante o crescimento e

desenvolvimento das plantas. Estão envolvidos nos processos de transporte de

fotossintatos bem como em processos metabólicos e de sinalização. Em diversos

processos fisiológicos, os açúcares não só participam, mas também os regulam. Um

exemplo da importância do metabolismo de açúcares encontra-se no evento da

passagem da fase de diferenciação para a fase de armazenamento que ocorre

durante o desenvolvimento de sementes. Em Vicia faba, durante a fase de pré-

armazenamento, a sacarose é hidrolisada por uma invertase associada à parede

celular. A atividade invertásica é alta nesta fase, resultando em altos níveis de

glicose que promovem crescimento por divisão celular. Nas células parenquimáticas

a sacarose é ressintetizada pela sintase da sacarose fosfato. Quando o embrião

estende-se, ocasiona a destruição da camada de parênquima de parede fina; ocorre,

então, depleção do nível de invertase ocasionando a elevação dos níveis de

sacarose. Os altos níveis de sacarose e os baixos nívies de glicose promovem

diferenciação celular e síntese dos produtos de armazenamento (Weber et al., 1995;

Weber et al., 1996; Weber et al., 1998).

Nesse trabalho procuramos analisar alterações no metabolismo de açúcares

durante o desenvolvimento da plântula de Phaseolus vulgaris, como conseqüência

do tratamento de sementes com insulina. Para tanto dosamos glicose, frutose,

sacarose e amido nas diferentes partes do embrião e atividades das enzimas sintase

da sacarose fosfato e invertase. Os níveis de glicose e frutose dos cotilédones,

epicótilos e radículas alteraram pouco em função do tratamento com insulina (Figura

10). Na presença de insulina, redução significativa do nível de sacarose foi

observada nos cotilédones, radículas e epicótilos tendo sido na ordem de 11 %, 19

% e 40%, respectivamente (Figura 10). A redução da concentração de sacarose nas

radículas de sementes tratadas com insulina pode ser explicada pela redução da

atividade da enzima sintase da sacarose fosfato resultante do tratamento com

insulina (figura 13). Esta enzima é capaz de catalisar tanto a síntese quanto a

hidrólise da sacarose. Entretanto concentrações da SPS são normalmente altas nos

tecidos que sintetizam sacarose, indicando que é uma enzima predominantemente

de biossíntese (Dennis & Blakeley, 2000). Analisando os resultados, acreditamos

que na radícula a insulina estaria interferindo nos processos de síntese da sacarose

72

e não nos processos de hidrólise já que não houve diferença nos níveis de atividade

da enzima invertase entre radículas dissecadas de sementes embebidas com

insulina e radículas dissecadas de sementes embebidas com água (Figura 12). Não

podemos correlacionar a redução de sacarose observada nos epicótilos tratados

com insulina com diferenças entre as atividades das enzimas invertase e sintase da

sacarose fosfato já que estatisticamente as atividades das duas enzimas foram

iguais nos epicótilos de sementes embebidas com insulina e nos epicótilos de

sementes embebidas com água (figura 12 e 13). A insulina nos epicótilos estaria

interferindo em outros processos metabólicos da sacarose que ainda não foram

analisados. Tais processos poderiam ser um aumento da mobilização de sacarose

para outros tecidos (radícula) ou ainda utilização de sacarose na síntese de outros

compostos, tais como proteínas. Nos cotilédones de Phaseolus vulgaris, similar ao

que acontece em sementes de ervilha em germinação (Bewley & Black, 1994), não

detectamos atividade invertásica (figura 12) e a atividade da sintase da sacarose

fosfato não sofreu alteração em função do tratamento com insulina (figura 13). Assim

as atividades destas enzimas não justificam a redução de sacarose também

observada nos cotilédones. Essa redução pode ser atribuída a um aumento na

mobilização de sacarose para os tecidos drenos. No geral, observamos que insulina

reduz as concentrações de sacarose nos tecidos do eixo embrionário e nos

cotilédones. Esse efeito da insulina no metabolismo dos açúcares poderia ser

conseqüência de um maior requerimento metabólico e estrutural resultante das

maiores taxas de crescimento de epicótilos e radículas promovidas por esse

hormônio ou ainda que a insulina estaria sinalizando a redução da sacarose para

evitar o efeito inibitório de altas concentrações deste açúcar sobre o

desenvolvimento da plântula (Finkelstein & Gibson, 2001).

Um outro efeito da insulina nas concentrações de açúcares foi a redução dos

níveis de amido, um polissacarídeo de reserva, nas radículas de sementes tratadas

com insulina (figura 11). Esse efeito resulta, provavelmente, das maiores taxas

metabólicas requeridas para um crescimento acelerado. Nos demais tecidos

analisados não houve diferença estatística entre as concentrações de amido de

sementes tratadas e não tratadas com insulina.

Conforme podemos visualizar na figura 12 e 13, não detectamos atividade

invertásica e nem da sintase da sacarose fosfato nos tegumentos das sementes que

73

é um tecido de origem materna, mais relacionado a funções de proteção das

sementes do que metabólicas (Bewley & Black, 1994).

Após a confirmação do efeito de insulina sobre o desenvolvimento de plântula

de Phaseolus vulgaris, foi investigado se a cascata de sinalização de insulina seria

conservada em plantas. Então, testamos um composto quiro-inositol, o pinitol,

conhecido por ser mediador, pós-receptor, na cascata de sinalização da insulina

(Bates et al., 2000). O pinitol teve efeito análogo à insulina, conforme observamos na

figura 14, promovendo o crescimento de epicótilos, radículas e aumento no número

de raízes laterais. O pinitol também mimetizou o efeito da insulina no

desenvolvimento de plântulas de Canavalia ensiformis (Oliveira et al., 2004). Esses

resultados nos indicam que, em plantas, existe uma via de sinalização de insulina

similar à encontrada em vertebrados.

Se insulina tem efeito sobre o desenvovimento de eixo embrionário e

possivelmente existe um sistema de sinalização semelhante ao dos vertebrados,

uma pergunta surgiu: Existiria insulina endógena no eixo embrionário de Phaseolus

vulgaris? Partindo da reconhecida capacidade de insulina de ligar-se a globulinas 7S

básicas (Komatsu & Hirano, 1991) em ensaios de ligação de membrana e de dados

obtidos por Ribeiro (2003), demonstrando por ensaios de ELISA, que insulina

também liga-se a globulinas 7S ácidas, do tipo vicilinas, idealizamos um processo de

purificação de insulina baseado em cromatografia de afinidade em coluna de vicilina-

Sepharose. Assim acoplamos vicilinas de Vigna unguiculata a Sepharose 4B e

testamos sua capacidade de ligação à insulina bovina bem como a forma de eluição.

As figuras 15, 16 e 17 apresentam os perfis cromatográficos de insulina. Os picos

retidos foram testados por Elisa e mostraram-se reativos ao anticorpo anti-insulina

humana, indicando que a proteína eluída se tratava de insulina. Insulina é conhecida

por associar-se a metais divalentes (Howell et al., 1978 citado por Dodson & Steiner,

1998) e esta associação poderia interferir com a ligação de insulina a vicilina, por

isso o EDTA (quelante) foi empregado no tampão bicarbonato. Os resultados

demonstram que insulina, aparentemente, interage mais fortemente com vicilina

quando EDTA está ausente no tampão bicarbonato. O extrato de eixo embrionário

de Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição foi aplicado na coluna de vicilina

acoplada a Sepharose 4B. A figura 18 apresenta o perfil dessa cromatografia e

podemos observar que houve retenção de material que foi eluído com ácido acético

0,1 M pH 3,0. Essa fração foi testada por Elisa e apresentou antigenicidade ao

74

anticorpo anti insulina humana. Quando analisada em SDS PAGE, observamos a

presença de uma banda protéica com massa molecular próxima à da insulina

conforme podemos visualizar na figura 19. Os dados dos experimentos de

imunolocalização confirmam que eixo embrionário contém insulina endógena.

Insulina foi imunolocalizada nos vacúolos de epicótilo (figura 20) e nos vacúolos e

citoplasmas de radículas (figura 21) de Phaseolus vulgaris com 48 horas da

embebição em água.

75

7- CONCLUSÕES

Os dados apresentados neste trabalho sugerem que a insulina aumenta o

transporte de glicose em células de tabaco em suspensão e tem papel ativador do

crescimento de eixo embrionário de Phaseolus vulgaris assim como o pinitol,

conhecido mimetizador da ação de insulina. Insulina também tem efeito inibidor

sobre a emissão do hormônio etileno em sementes de Phaseolus vulgaris em

germinação e apresenta efeito estimulador na emissão do CO2. Insulina afeta o

metabolismo de carboidrato já que reduziu a concentração de sacarose nos

epicótilos, nas radículas e cotilédones de sementes de Phaseolus vulgaris com 72

horas da embebição assim como reduziu a concentração de amido e da atividade da

sintase da sacarose fosfato nas radículas de sementes no mesmo estágio de

desenvolvimento. Insulina está presente em eixo embrionário de semente com 48

horas da embebição. Esses resultados indicam fortemente que insulina tem papel

regulador no metabolismo e crescimento de plantas. Concluímos, também, que

insulina pode ser isolada utilizando a técnica de cromatografia de afinidade de

vicilina acoplada a Sepharose 4B.

76

8- Referências bibliográficas

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