gil monteiro novo filho
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Gil Monteiro Novo Filho
Estudo das variações no número de cópias (CNVs) das
regiões subteloméricas em portadores de malformações
congênitas e deficiência intelectual
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Programa de Pediatria Orientadora: Dra. Leslie Domenici Kulikowski
São Paulo
2014
Gil Monteiro Novo Filho
Estudo das variações no número de cópias (CNVs) das
regiões subteloméricas em portadores de malformações
congênitas e deficiência intelectual
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Programa de Pediatria Orientadora: Dra. Leslie Domenici Kulikowski
São Paulo
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Dedico esse trabalho à minha mãe, pelo seu amor e dedicação a mim. Meu maior exemplo de caráter.
Agradecimentos
Ao meu pai Gil Monteiro Novo, por ter me incentivado e aconselhado nos
momentos difíceis, por ter sempre me incentivado aos estudos, ao ceticismo
e à leitura e por ter me apoiado em minhas escolhas.
À minha noiva Mariana Mahmoud Cimatti, por sempre ter estado ao meu lado
em todos momentos, me apoiando e incentivando em todas etapas do
processo, fazendo com que cada dia fosse muito mais belo.
Às minhas irmãs Roberta Monteiro Novo e Flávia Monteiro Novo, por todo
companheirismo, suporte e todos os momentos de alegria que me
proporcionaram.
À minha tia, Eliane Victório, por ter me acolhido durante todos esses anos, me
ajudado em tudo que eu precisei, possibilitando todo trabalho.
À minha orientadora Dra. Leslie Domenici Kulikowski, por ter acreditado e
confiado em mim, por sua dedicação, seus conselhos e por sua exímia
capacidade de despertar otimismo ante às maiores dificuldades.
À Profa. Dra. Chong Ae Kim, por ter e acolhido e me dado todo suporte
necessário para desenvolvimento e conclusão deste trabalho.
À Marilia Montenegro, por toda sua amizade, pelas horas de discussões
genéticas intensas, calorosas e, principalmente, edificantes; à Évelin Zanardo
e Roberta Dutra, por todo o trabalho imprescindível realizado, pelo
companheirismo e por todos os momentos que passamos.
Aos meus amigos do Laboratório de Citogenômica, Amom Nascimento,
Alexandre Dias, Thaís Moura e Flávia Piazzon, por todo o suporte em todos
os sentidos, que foram responsáveis diretos da realização desse trabalho.
A todos alunos e estagiários, Yanca, Camila, Fábio, Mariana, Fernanda,
Andreza, Mayra, Thalita, Natália e Fabrícia, por toda ajuda e empenho nos
trabalhos.
Aos médicos da Unidade de Genética Instituto da Criança, Dra. Rachel Honjo
e Dra. Débora Bertola, e aos residentes Caio, Ellaine, Guilherme, Larissa,
Diogo, Stephanie, Tatiana, Larissa, Diogo pelo competente atendimento aos
pacientes, imprescindível para a realização deste trabalho.
À Fernanda Macaferri e Ana Carolina Teixeira, por todo apoio e amizade,
tornando os dias de trabalhos definitivamente menos penosos e mais alegres.
Ao pesquisador Daniel Silvestre pelo denodo e trabalho com as análises de
bioinformática e com os gráficos presentes nessa dissertação.
Ao Prof. Dr. Alberto Duarte, ao departamento de Patologia da FMUSP e aos
coordenadores do Laboratório de Investigação em Pediatria Clínica (LIM36),
Profa. Dra. Magda Carneiro Sampaio e Prof. Dr. Carlos Moreira Filho, pela
oportunidade de realização desse trabalho.
Epígrafe
“A universal complexidade é que Ela Compreende. E se, por vezes, se divide, Mesmo ainda assim, seu todo não reside No quociente isolado da parcela!”
- Augusto dos Anjos
Sumário
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................... 2
1.1. CNVs ................................................................................................ 3
1.2. CNVs e Subtelômeros ...................................................................... 4
1.3. Mecanismos de formação das CNVs ................................................ 5
1.4. Técnicas de Análise das CNVs ......................................................... 9
2. Objetivos ............................................................................................... 13
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .................................................................. 15
3.1. Extração de DNA genômico ............................................................ 16
3.2. Reações de MLPA .......................................................................... 16
3.3. Análise dos resultados de MLPA .................................................... 17
3.4. Triagem genômica comparativa por oligoarrays ............................. 18
3.5. Análise de bioinformática ................................................................ 19
4. Resultados ............................................................................................ 21
5. Discussão .............................................................................................. 33
5.1. CNVs no cromossomo 4 ................................................................. 35
5.2. Demais CNVs ................................................................................. 39
5.3. Detecção das CNVs ........................................................................ 41
6. Conclusões ............................................................................................ 44
ANEXO A ..................................................................................................... 46
ANEXO B ..................................................................................................... 51
7. Referências ........................................................................................... 53
8. APÊNDICES .......................................................................................... 65
Listas
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação gráfica da estrutura da porção mais distal
de um cromossomo ....................................................................... 4
Figura 2 - Comparação entre NAHR e NHEJ ................................................ 6
Figura 3 - Comparação entre FoSTeS (A) e MMBIR(B) ................................ 8
Figura 4 - Alterações subteloméricas mais prevalentes detectadas
por MLPA utilizando os kits P036 e P070 ..................................... 23
Figura 5 - Resultados do exame de MLPA realizado no
paciente G-158 evidenciando uma deleção em 4q
e uma duplicação em X/Yp .......................................................... 24
Figura 6 - CGH array Agilent 180K do paciente G-92, evidenciando
uma deleção de 10,8 Mb em 4q e uma duplicação de 20 Mb
em 5q ............................................................................................ 25
Figura 7 - Resultado do SNP array Illumina da paciente G-68,
evidenciando uma deleção de 3,8 Mb em 2q e uma
duplicação de 8,5 Mb em 5q ......................................................... 26
Figura 8 - Elementos repetitivos encontrados próximos aos pontos
de quebra ...................................................................................... 29
Figura 9 - Mapa de todas alterações encontradas nos testes realizados ...... 30
Figura 10 - Esquema representativo do cromossomo 4 mostrando os
principais genes contidos nos subtelômeros ................................. 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Pacientes com alterações subteloméricas encontradas por
MLPA utilizando os kits P036 e P070 ........................................... 22
Tabela 2 - Resultado dos arrays de 7 pacientes detectados com
alterações subteloméricas ............................................................ 26
Tabela 3 - Elementos encontrados na análise por bioinformática nos
pontos de quebra dos pacientes analisados por oligoarrays ........ 28
Tabela 4 - Resumo das principais características clínicas dos pacientes
que apresentaram resultado anormal no MLPA, além da DI ........ 31
LISTA DE ABREVIATURAS
aCGH do inglês, Array Comparative Genomic Hybridization ADNPM Atraso no Desenvolvimento Neuropsicomotor CNV do inglês, Copy Number Variation DI Deficiência Intelectual DNA Ácido Desoxirribonucleico FISH do inglês, Fluorescent In Situ Hybridization FoSTeS do inglês, Fork Stalling and Template Switching LCR do inglês, Low Copy Repeat LINE do inglês, Long Interspersed Elements LTR do inglês, Long Tandem Repeats MC Malformações Congênitas MLPA do inglês, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification MMBIR do inglês, Microhomology-Mediated Break-Induced
Replication NAHR do inglês, Non-Allelic Homologous Recombination NHEJ do inglês, Non-Homologous End Joining PCR do inglês, Polymerase Chain Reaction RFLP do inglês, Restriction Fragment Lenght Polymorphism SINE do inglês, Short Interspersed Elements ssDNA do inglês, Single strand DNA STR do inglês, Short Tandem Repeats VOUS do inglês, Variants of Uncertain Clinical Significance
LISTA DE SIGLAS DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated
Discovery DECIPHER Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in
Humans using Ensembl Resource DGV Database of Genomic Variants IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística NCBI National Center for Biotechnology Information UCSC University of California Santa Cruz USP Universidade de São Paulo
Resumo e Abstract
Resumo Novo Filho, GM. Estudo das variações no número de cópias (CNVs) das regiões subteloméricas em portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2014. A variação no número de cópias gênicas (CNVs) é a alteração estrutural mais prevalente no genoma humano. Estas alterações estão presentes em alta proporção nos subtelômeros, quando comparados com o resto do genoma. Isso ocorre principalmente porque essas regiões são ricas em genes e porque apresentam sequências repetitivas que as tornam suscetíveis a rearranjos genômicos. Na literatura os rearranjos subteloméricos, como deleções, duplicações e translocações estão associados à etiologia da deficiência intelectual (DI), do atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) e das malformações congênitas (MC). Estudos prévios com pacientes com DI revelaram taxas de CNVs patogênicas em regiões subteloméricas variando de 2,4% a 4,8%. Os objetivos desse trabalho foram: investigar a presença das CNVs subteloméricas nos pacientes portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual, caracteriza-las quanto a extensão e patogenicidade e sugerir os mecanismos produtores dessas alterações. Foram analisadas 105 amostras de DNA de pacientes com DI/ADNPM associada a MC. Utilizamos a técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) com kits específicos para regiões subteloméricas (P036 e P070). Dentre os pacientes que apresentaram alterações pela técnica de MLPA, 7 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando as plataformas Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K e HumanCytoSNP-12 BeadChip Illumina®. O MLPA permitiu identificar alterações subteloméricas em 14,28% dos casos, sendo 7 pacientes com uma deleção isolada, 7 pacientes apresentaram uma deleção concomitante a uma duplicação e um paciente apresentou duas duplicações. A análise por array confirmou as alterações encontradas por MLPA e permitiu a delimitação acurada dos pontos de quebra genômicos. A análise combinada utilizando bioinformática com diferentes ferramentas: DGV (Database of Genomic Variants), DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics e DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revelou um total de 8 genes sugestivos de serem responsáveis por fenótipos clínicos distintos. Dentre eles, o gene DIAPH1 foi relacionado à microcefalia, o gene CTNND2 à DI e o gene OTOS à surdez. O array revelou elementos repetitivos, sequências teloméricas e/ou STRs nas regiões próximas aos pontos de quebra estudados. Também nos permitiu inferir que os pontos de quebra com deleção simples são sugestivos de NHEJ ou MMEJ e os casos que apresentaram rearranjos complexos: FoSTeS ou MMBIR. A estratégia teve sucesso em identificar CNVs subteloméricas e associá-las ao fenótipo dos pacientes e, adicionalmente, possibilitou a sugestão dos mecanismos que as produziram.
Descritores: Deficiência intelectual, Deficiências do desenvolvimento, Anormalidades congênitas, Variações do número de cópias de DNA, Reação em cadeia da polimerase multiplex/métodos, Análise de sequência com séries de oligonucleotídeos.
ABSTRACT
Novo Filho, GM. Study of copy number variations (CNVs) of subtelomeric regions in patients with congenital malformations and intellectual disabilities [Dissertation].São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2014. Copy number variation (CNV) is the most prevalent structural changes in the human genome. These changes are present in a high rate in subtelomere compared with the rest of the genome. This is primarily because these regions are gene rich and because of the presence of repetitive sequences that make them susceptible to genomic rearrangements. Subtelomeric rearrangements, such as deletions, duplications and translocations are associated with the etiology of intellectual disability (ID), the developmental delay (DD) and congenital malformations (CM). Previous studies with patients with ID have revealed rates of pathogenic CNVs in subtelomeric regions ranging from 2.4% to 4.8%. The objectives of this study were to investigate the presence of subtelomeric CNVs in patients with congenital malformations and intellectual disability, characterized them as the extent and pathogenicity and suggest mechanisms of formation. DNA samples from 105 patients with ID/DD associated with CM were analysed. We use the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique with specific subtelomeric regions (P036 and P070) kits. Among patients with CNVs changes by MLPA, seven were submitted to array technique, using Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray HumanCytoSNP or 180 K-12 BeadChip Illumina® platforms. The subtelomeric MLPA analysis identified alterations in 14.28% of cases, 7 patients presented an isolated deletion, 7 patients presented a concomitant deletion and duplication and 1 patient presented two duplications. The array analysis confirmed the alterations found by MLPA and allowed the accurate delineation of the genomic break points. The analysis combined with bioinformatics using different tools: DGV (Database of Genomic Variants), Decipher (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics and DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revealed a total of eight genes that are suggestible responsible for distinct clinical phenotypes. Among them, DIAPH1 gene was related to microcephaly, CTNND2 gene to ID and OTOS gene to deafness. Array revealed repetitive elements, telomeric sequences and / or STR close to breakpoints regions. We propose that the breakpoints with single deletions are suggestive of NHEJ or MMEJ and cases with complex rearrangements: FoSTeS or MMBIR. This strategy could identify subtelomeric CNVs, improve the genotype-phenotype association and also allowed the investigation of mechanisms for formation.
Descriptors: Intellectual disability, Developmental disabilities, Congenital abnormalities, DNA copy number variations, Multiplex polymerase chain reaction/methods, Oligonucleotide array sequence analysis.
Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
Alterações genômicas estão presentes em cerca de 0,7 a 0,8% dos
recém-nascidos vivos e podem ser responsáveis por diversas alterações
fenotípicas, causando malformações congênitas (MC) e deficiência intelectual
e/ou atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (DI/ADNPM)1,2.
A DI/ADNPM ocorre entre 1-3% da população geral. A DI caracteriza-
se por um déficit cognitivo, com QI abaixo de 703,4. Entretanto, a realização
de um diagnóstico de DI em crianças menores de cinco anos não é possível,
pois os métodos de avaliação não são confiáveis. Por esse motivo, o termo
ADNPM é utilizado para identificar pacientes dentro dessa faixa etária5. No
Brasil, segundo dados do IBGE no ano de 2010, 1,4% da população geral
possuía deficiência intelectual.
Malformações congênitas estão relacionadas ao aumento da
mortalidade, da morbidade, do risco de complicações clínicas, do número de
internações e da gravidade das intercorrências. Elas se caracterizam por
alterações morfológicas, estruturais ou funcionais, isoladas ou múltiplas,
presentes ao nascimento. Sua prevalência na população geral está em torno
de 4%6.
A etiologia das MCs tem sido associada à presença de anormalidades
cromossômicas, incluindo duplicações, deleções e/ou inversões e, mais
recentemente, as variações genômicas estruturais7,8.
Existem diferentes formas de variações conhecidas no genoma
humano, dentre elas as RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms),
as VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats), as STRs (Short Tandem
Repeats), os SNPs (single-nucleotide polymorphisms) e as CNVs (Copy
Number Variations)9.
3
1.1. CNVs
As CNVs são definidas por um segmento de DNA, maior que 1 kb, com
um número variável de cópias em relação a um genoma de referência. Assim
sendo, as CNVs abrangem deleções, transposições, duplicações ou
rearranjos complexos. Podem também afetar a função de genes envolvidos
por disrupção da região codificadora ou reguladora, pela geração de um gene
quimérico ou por efeito de posição10. Sua presença no genoma humano é
estimada em 12%11 com mais 100.000 CNVs já identificadas12.
São consideradas CNVs benignas aquelas que não acarretam prejuízo
fenotípico. Essas variações contribuem ainda com a heterogeneidade
genética. Já as consideradas CNVs patogênicas podem ser a causa de
inúmeras doenças genômicas raras e também de doenças mendelianas13.
Estas CNVs foram encontradas em pacientes com múltiplas malformações
congênitas, dismorfismos, atraso no desenvolvimento, deficiência intelectual,
e doenças neurológicas14. Além disso, as CNVs também são determinantes
na susceptibilidade de algumas doenças como lúpus eritematoso sistêmico,
AIDS/HIV-1, síndrome de Li-Fraumeni e glioma15-19.
Utiliza-se, por fim, o termo VOUS (variants of uncertain clinical
significance), para designar as CNVs cuja patogenicidade é incerta20. É
necessária uma interpretação cuidadosa para a determinação da
patogenicidade das CNVs, principalmente quando se analisa pacientes
fenotipicamente afetados, pois uma eventual alteração pode não estar
diretamente associada com a manifestação clínica observada8.
Podemos classificar as CNVs, em dois grandes grupos que variam em
relação ao seu mecanismo de formação, chamadas de CNVs recorrentes e
CNVs não-recorrentes. As CNVs “recorrentes” são mediadas por sequências
com mais de 95% de similaridade, que variam de 1 a 5 kb, chamadas LCRs
(do inglês, Low Copy Repeats). A maioria das CNVs benignas e uma grande
parte das CNVs patogênicas são “não-recorrentes”. Essas variações são
caraterizadas, na maioria dos casos, por microhomologias por apresentar
“blunt ends” ou inserções pequenas nas junções de ponto de quebra21.
4
Apesar de as CNVs estarem presentes por todo o genoma, elas são
abundantes nas regiões próximas aos telômeros, conhecidas pelo nome de
regiões subteloméricas, principalmente devido à presença de sequências
(TTAGGG) que tornam esses loci propensos a rearranjos22.
1.2. CNVs e Subtelômeros
As características estruturais do genoma humano podem resultar numa
suscetibilidade região-específica a rearranjos, levando então a instabilidade
genômica23. Acredita-se que CNVs aparecem prevalentemente nas regiões
subteloméricas, pois estas são mais suscetíveis a rearranjos com outras
regiões cromossômicas, devido às sequências repetitivas encontradas
nessas áreas22,24,25. Essas sequências compreendem 25% dos 500 kb e 80%
do 100 Kb mais distais do DNA humano e são sítios preferenciais de
instabilidade genômica, relacionadas com patologias genômicas associadas
a pontos de quebra recorrentes26, a polimorfismos de número de cópias de
larga escala9 e regiões de pontos de quebra cromossômicos evolucionários27.
Figura 1. Representação gráfica da estrutura da porção mais distal de um cromossomo. Adaptado de Knight e Flint, 200028.
5
Os rearranjos subteloméricos são responsáveis por uma alta proporção
das anormalidades citogenéticas14. A análise de dados de 20 estudos
encontrou que 4,8% de 2500 pacientes com deficiência intelectual possuíam
deleção ou duplicação em regiões subteloméricas29. Uma investigação
realizada com 11.688 casos não selecionados encontrou uma taxa de
desequilíbrio subtelomérico de 3,0% sendo que 2,6% foram considerados
patogênicos30. Estudos posteriores também mostraram resultados
significativos. Foi encontrada uma taxa de 4,4% de desequilíbrio
subtelomérico patogênico de uma análise de 5.380 casos e uma taxa de 2,4%
de uma investigação de aproximadamente 7.000 casos14,31.
1.3. Mecanismos de formação das CNVs
A maioria das deleções subteloméricas terminais parecem ocorrer
devido a uma quebra na dupla fita de DNA, seguida por perda telomérica e
então por processos de reparação32.
O mecanismo de estabilização mais simples dos subtelômeros consiste
no mecanismo de cicatrização, no qual a enzima telomerase adiciona
sequências teloméricas (TTAGGG)n à região danificada33.
As características estruturais do genoma humano podem resultar numa
suscetibilidade região-específica a rearranjos, levando então a instabilidade
genômica. Esse tipo de alteração pode ser chamado de “recorrente”. O
principal mecanismo causador desse tipo de alteração é a recombinação
homóloga não-alélica (NAHR) e ocorre preferencialmente por intermédio das
LCRs. Essas sequências, devido sua alta similaridade, podem eventualmente
se alinhar durante a divisão celular, tanto mitótica quanto meiótica. Esse
alinhamento pode ocorrer tanto entre cromossomos distintos, sejam eles
homólogos ou não, quanto entre diferentes loci do mesmo cromossomo.
Desta maneira, esse alinhamento indevido pode propiciar um cruzamento
entre esses dois loci, resultando num rearranjo genômico. O NAHR pode levar
a deleções, duplicações e inversões, quando as LCR estão localizadas num
6
mesmo cromossomo, ou em translocações, quando as LCRs estão
localizadas em cromossomos diferentes23,34.
Figura 2: Comparação entre NAHR e NHEJ. A - Os blocos em cor azul representam LCRs que se alinham erroneamente devido a alta similiaridade entre elas, resultando em rearranjos que podem causar deleção ou duplicação do segmento que é flanqueado por elas. B - Uma quebra na dupla fita entre duas sequências (representadas pelos blocos em azul e vermelho) sem homologia entre elas. O mecanismo de NHEJ modifica e realiza a junção das duas extremidades, causando deleção do segmento entre as duas regiões. Adaptado de Gu et al, 200834.
Os rearranjos genômicos podem também ocorrer de forma não
recorrente, apresentando extensões variáveis e pontos de quebra dispersos,
sem que haja, aparentemente, um hotspot para que essa recombinação
aconteça35. Dentre os mecanismos propostos, estão a junção das
extremidades não-homólogas (NHEJ – non-homologous end joining), a
replicação induzida pela quebra de DNA por homologia (MMBIR -
microhomology-mediated break induced replication) e o enrolamento da
forquilha de replicação e mudança de molde de DNA (FoSTeS - fork stalling
and template switching) e retrotransposição34.
O mecanismo NHEJ ocorre quando há uma quebra na dupla fita de
DNA sucedido de um reparo pela ligação de ambas as extremidades. Esse
reparo não requer a presença de um molde homólogo e, em consequência
7
disso, pode ser notada a presença de pequenas deleções (1-34 pb) e
inserções no ponto de quebra. Sequências repetitivas podem proporcionar
uma instabilidade genômica, tornando a região suscetível a uma quebra na
dupla fita, culminando num reparo por NHEJ. Já o mecanismo MMEJ se utiliza
da excisão de bases para expor regiões de microhomologia para o
anelamento e posterior junção das extremidades. Esses mecanismos podem
gerar deleções e translocações nas fitas envolvidas36-40.
FoSTeS e MMBIR são dois mecanismos que ocorrem devido a erros
na forquilha de replicação. No caso do FoSTeS, um erro na fita simples de
DNA interrompe a forquilha de replicação. Para dar continuidade à replicação,
a extremidade 3’ se desvencilha da do molde original e se anela em outra
forquilha, podendo ser adjacente ou em proximidade tridimensional, que
apresente microhomologia à região. Desta maneira, a fita recomeça sua
síntese na forquilha invadida. Este processo pode se repetir diversas vezes,
gerando regiões deletadas (caso a outra forquilha de replicação invadida
esteja posicionada posteriormente em relação à sequência original),
duplicadas (caso a outra forquilha de replicação invadida esteja posiciona da
anteriormente em relação à sequência original) e invertidas (dependendo da
direção da progressão da forquilha invadida). Esses três tipos de rearranjos
podem estar presentes concomitantemente num único fragmento, iniciado por
um único evento33,34,41.
Já no MMBIR, quando ocorre o erro na dupla fita de DNA
interrompendo a forquilha de replicação, esta entra em colapso. Isto resulta
numa cauda 3' de fita simples (ssDNA) gerada pela quebra da dupla fita. Essa
extremidade 3' se anela a outras ssDNAs expostas por microhomologia (2-5
nucleotídeos). A extensão por este primeiro molde ocorre em baixa
capacidade de processamento, o que pode gerar um novo colapso,
acarretando numa mudança do molde, gerando um ciclo. Finalmente, a fita
rearranjada retorna à cromátide irmã original, restabelecendo a replicação.
Como resultado final, temos uma translocação não recíproca complexa33,40.
8
Figura 3: Comparação entre FoSTeS (A) e MMBIR(B). A) Uma quebra na fita lagging durante a replicação (a1) pode levar à formação de uma estrutura secundária (a2) que impede que a replicação prossiga. A extremidade 3’ fica então livre (a3) podendo se alinhar com outra fita simples exposta numa forquilha de replicação próxima ou adjacente, que apresente micro-homologia. B) A forquilha de replicação entre em colapso (b1) e se separa da mesma (vermelha), expondo uma cauda na extremidade 3’ (b2). Essa extremidade pode se anelar à fita lagging de outra forquilha de replicação por micro-homologia (azul) (b3) que pode ser estabilizada com a síntese de das duas fitas leading e lagging à partir da junção de micro-homologia (b4). A fita, que foi copiada de uma sequência diferente da sua (azul), se separa da forquilha que utilizou como molde e gera uma nova cauda 3’ que irá então se anelar novamente a uma outra fita simples também por micro-homologia, repetindo o processo (b5). Esta fita estendida se separa e anela novamente com outra fita simples da molécula que estava anteriormente (vermelha) (b6). Uma nova forquilha se forma (b7), agora totalmente funcional que continua até o final da extensão da molécula (b8), carregando consigo sequências curtas de outras localidades genômicas. Adaptado de Hastings et al., 200942.
A presença de retrotransposons no genoma humano, como LINEs (do
inglês, Long Interspersed Elements), SINEs (do inglês, Short Interspersed
Elements), e LTRs (do inglês, Long Terminal Reapeats) também podem
acarretar em rearranjos, gerando CNVs tanto recorrentes como não
recorrentes42.
9
1.4. Técnicas de Análise das CNVs
A análise citogenética clássica por bandamento G tem uma resolução
de 400-550 bandas, sendo capaz de identificar apenas anormalidades
maiores que 3 Mb. Portanto, outras técnicas são necessárias para a avaliação
dessas alterações. O desenvolvimento de técnicas relativamente novas de
diagnóstico molecular possibilitou a identificação mais precisa das CNVs e
dos rearranjos subteloméricos3.
Dentre essas, a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification) é uma técnica vantajosa por ser capaz de avaliar cerca de 48
loci em uma única ligação e foi desenvolvida no intuito de avaliar o número de
cópias gênicas em uma região de interesse, tornando possível a detecção de
aneuploidias, deleções e duplicações em um único teste. A técnica baseia-se
na amplificação e quantificação das sondas utilizadas no ensaio. Cada sonda
consiste em dois oligonucleotídeos, um sintético e outro derivado de um
bacteriófago M13, que hibridam em locais adjacentes da sequência alvo. Uma
vez hibridadas, os oligonucleotídeos são unidos por uma ligase. Cada
oligonucleotídeo carrega uma sequência para um primer universal em sua
extremidade, permitindo a amplificação simultânea por reação de polimerase
em cadeia (PCR) utilizando-se de apenas um par de primers marcado com
fluorescência. Existem atualmente mais de 400 kits diferentes de MLPA
(www.mlpa.com). Cada um desses kits contêm uma combinação de sondas
específicas para identificação de CNVs que variam de acordo com o objetivo
desejado. Há dois kits que, separadamente, são capazes de detectar a
alteração no número de cópias em todos os subtelômeros do genoma
humano. A técnica de MLPA mostra-se, portanto, econômica, sensível,
precisa e pouco trabalhosa43.
Outra técnica capaz de identificar alterações no número de cópias é a
FISH (hibridação in situ por fluorescência), que é caracterizada pela utilização
de sondas específicas marcadas por nucleotídeos fluorescentes que hibridam
na sequência alvo, possibilitando o reconhecimento de alterações numéricas
e estruturais. A vantagem é que esta técnica possibilita identificar diretamente
10
a localização cromossômica da alteração, inclusive em células a fresco44.
Entretanto, as sondas de FISH detectam alterações entre 100 – 500kb, sendo,
assim, incapazes de detectar alterações menores.
Por fim, a triagem molecular utilizando oligoarrays é uma técnica que
realiza uma varredura em alta resolução no genoma em busca de alterações
no número de cópias. A quantidade de loci contemplados pelo teste varia
muito de acordo com a plataforma, disposição de sondas e a densidade da
lâmina utilizada. Entretanto, seu custo é muito elevado em comparação ao
MLPA e sua prática é muito mais laboriosa45.
Dois tipos de plataforma são comumente utilizados para análise de
CNVs: os comparativos (array-CGH) e os não comparativos. O aCGH se
baseia na comparação do DNA genômico do paciente com um DNA de
referência, diferentemente marcados em vermelho e verde. Essas duas
amostras vão hibridar competitivamente em sequências de DNA genômico
presentes numa lâmina. Essas sequências são conhecidas e previamente
mapeadas. Em cada ponto da lâmina é identificada a intensidade do sinal dos
dois fluorocromos. Essa intensidade de cada ponto será proporcional à
quantidade de DNA de referência e do paciente que estão ligados àquela
sequência e posição específica. A razão entre a intensidade derivada dos dois
fluorocromos será utilizada para identificar a quantidade de uma amostra em
relação à outra46.
As regiões subteloméricas, dadas suas características, apresentam
uma alta taxa de variação de cópias gênicas em relação ao resto do genoma
e essa variação pode ser a causa principal de diversas alterações fenotípicas
relevantes para o fenótipo clínico. Além de que, são necessárias
investigações visando a distinção das CNVs patogênicas e benignas.
Portanto, é de grande importância um estudo voltado para a identificação e
interpretação dessas sequências.
Desta forma, investigamos pacientes portadores de malformação
congênita e deficiência intelectual e/ou atraso no desenvolvimento
neuropsicomotor utilizando a técnica de MLPA para identificar possíveis
11
fatores etiológicos e relacioná-los ao fenótipo. Alguns pacientes foram
selecionados para testes com oligoarrays com o objetivo de delimitar melhor
os pontos de quebra genômicos e estreitar a relação genótipo-fenótipo.
12
Objetivos
13
2. OBJETIVOS
• Investigar a presença das CNVs subteloméricas nos pacientes
portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual
utilizando MLPA.
• Avaliar a extensão das alterações encontradas por MLPA e verificar a
presença de alterações concomitantes em pacientes portadores de
CNVs relevantes por array.
• Identificar as CNVs associadas ao fenótipo clínico.
• Investigar os mecanismos produtores dessas alterações.
14
Casuística e Métodos
15
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
Para o estudo prospectivo, participaram do projeto 105 pacientes,
sendo 53 pacientes do gênero feminino e 52 do gênero masculino. Os
pacientes foram atendidos na Unidade de Genética Clínica do Instituto da
Criança da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICr-HC-
FMUSP).
O critério de inclusão foi a presença de malformações congênitas
associadas à deficiência intelectual ou malformações congênitas associadas
ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor, dependendo da idade, com
cariótipo por bandamento G prévio normal ou considerado insuficiente para a
conclusão diagnóstica e clínica.
Consideramos malformados os pacientes que apresentavam
alterações morfológicas, estruturais ou funcionais, isoladas ou múltiplas,
presentes ao nascimento.
Como métodos de avaliação de QI de pacientes menores de cinco anos
não são confiáveis, utilizamos como critério de inclusão o ADNPM nesses
casos.
Os pacientes ou pais e/ou responsáveis foram informados da
realização da pesquisa, assinando um termo de consentimento informado
aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição - CAPPesq nº 0718/11.
Todos os pacientes passaram por anamnese detalhada, abordando
dados de: identificação, história clínica evolutiva, desenvolvimento
neuropsicomotor, antecedentes gineco-obstétricos maternos, história familiar,
heredograma e exames complementares pré e pós-natais.
O exame físico dos pacientes foi realizado por geneticistas clínicos da
Unidade de Genética do Instituto da Criança e dos demais centros de
referência em genética clínica, por meio da descrição detalhada do fenótipo.
A coleta dos pais foi realizada posteriormente à detecção de anormalidades
no MLPA.
16
3.1. Extração de DNA genômico
Para a extração de DNA genômico, foi obtido do probando e/ou
genitores 4 mL de sangue periférico, utilizando como anticoagulante o EDTA.
O material genético foi extraído pelo QIAamp DNA Blood Midi Kit (250)
(QIAGEN, Valencia, Califórnia) segundo protocolo fornecido pelo fabricante
com algumas modificações. Foi reduzido o volume de eluição, de 250uL para
150 uL, com a finalidade de aumentar a concentração de DNA genômico, se
adequando melhor à alta sensibilidade das reações de MLPA e à utilização
do mesmo material para repetição, caso necessário. A velocidade e o tempo
de centrifugação foi aumentado, a fim de evitar a retenção da amostra na
coluna de sílica.
As amostras do DNA extraído foram quantificadas em
espectrofotômetro (Nanoview - GE®). As amostras de uso imediato foram
então diluídas em TE (Tris-EDTA 10:1) para uma concentração final de 50
ng/µL. Os tubos contendo DNA total foram armazenados em freezer a -80°C.
3.2. Reações de MLPA
Para a investigação de cada paciente foram utilizados dois kits
comerciais, P036 e P070, que possibilitam a investigação de alterações
subteloméricas de todos os cromossomos.
As reações de MLPA foram realizadas de acordo com as indicações do
fabricante dos kits-probemix (MRC-Holland®, Amsterdan, The Netherlands) e
com algumas modificações segundo protocolo desenvolvido do Laboratório
de Citogenômica, objetivando um maior rendimento dos reagentes, conforme
padronizado por Dutra, 201447.
Foram adicionados aproximadamente 250 ng de DNA genômico (5uL)
a um microtubo e levados ao termociclador (Veriti® Thermal Cycler – Life
Technologies) para denaturação a 98 °C por 15 minutos. Em seguida, foi
adicionada ao DNA denaturado uma mistura das sondas (específicas para
17
cada kit) e solução tamponada, para o processo de hibridação das sondas de
MLPA ao DNA a 60°C por 3 horas.
Após esse período, foi iniciada a etapa de ligação das sondas em cada
região alvo específica. Com os tubos permanecendo no termociclador,
adicionou-se a enzima ligase à solução de hibridação, juntamente a soluções
tamponadas. A reação ocorreu a 54°C por 15 minutos. Para finalizar, os
reagentes da reação de PCR foram adicionados à solução de ligação em
temperatura ambiente, para a amplificação dos fragmentos unidos pela ligase.
Os produtos amplificados foram então colocados em microplacas
juntamente com marcador de peso molecular (LIZ - GS600) e formamida HiDi
(Life Technologies) e levados ao sequenciador automático ABI 3500 (Life
Technologies) para as reações de análise de fragmentos.
Por se tratar de um teste citogenômico comparativo, em todas as
reações de MLPA foram utilizados três controles normais. A escolha dos
controles ocorreu ainda no processo de padronização da técnica de MLPA,
onde foram incluídos cinco amostras genômicas de pessoas consideradas
fenotipicamente normais. Das cinco amostras, elegemos três que
apresentavam número de cópias normais para todas as sondas. Assim, cada
corrida de MLPA apresentava além dos três controles normais, uma amostra
positiva para cada kit de MLPA.
3.3. Análise dos resultados de MLPA
Os dados foram gerados por sequenciador automático ABI 3500 (Life
Technologies), da Rede de Equipamento Multiusuário no laboratório de
Imunologia do Instituto do Coração – INCOR – HC / FMUSP.
A análise dos resultados da reação de MLPA foi realizada utilizando o
software GeneMarker® (Softgenetics, LLC, State College, PA -
www.softgenetics.com). Foram considerados alterados os resultados cujo
tamanho do pico relativo fosse menor do que 0,75 (duplicação) ou maior do
que 1,25 (deleção) em comparação às amostras normais. O resultado final da
18
análise gerou um gráfico com todas as sondas do kit de MLPA juntamente
com os valores limites para normalidade e uma tabela de número de cópia
genômica para o grupo de sondas utilizado no kit específico.
3.4. Triagem genômica comparativa por oligoarrays
Com o objetivo de avaliar a extensão das alterações encontradas por
MLPA e verificar se havia outras alterações concomitantes que não foram
detectadas pela técnica de MLPA, nós realizamos análise genômica
comparativa por oligoarrays em 7 pacientes anteriormente identificados como
portadores de CNVs relevantes e representativas do estudo.
Amostras de dois pacientes foram analisadas utilizando a lâmina de
CGH-array Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EUA), contendo aproximadamente 180.000
oligonucleotídeos com um espaçamento médio de 17 kb entre as sondas. As
reações e análises para esta plataforma foram realizadas pelo Laboratório de
Citogenômica de acordo com as instruções do fabricante, em colaboração
com o Laboratório de Citogenética e Genômica da Faculdade de Medicina da
Universidade de Coimbra – Portugal.
Amostras de cinco pacientes foram realizadas utilizando a plataforma
de SNP array Illumina. O chip utilizado foi HumanCytoSNP-12 BeadChip
(Illumina Inc., San Diego, CA) com ~300.000 sondas de SNPs que cobrem
todo o genoma e sondas alvo para todas as regiões de importância
citogenética conhecida, incluindo regiões subteloméricas, pericentroméricas
e cromossomos sexuais (www.illumina.com). As reações e análises para esta
plataforma foram realizadas pelo Laboratório de Citogenômica de acordo com
as instruções do fabricante. As lâminas foram escaneadas no iScan Reader e
a análise dos dados foi realizada utilizando o software da Illumina
GenomeStudio versão 2010.1 e o KaryoStudio versão 1.4.3.0 Build 37 (CNV
Plugin V3.0.7.0).
19
3.5. Análise de bioinformática
Os resultados alterados foram avaliados em reações independentes e
comparados aos seguintes bancos de dados para a identificação de quais
CNVs eram benignas e quais eram patogênicas:
• Database of Genomic Variants (DGV -
http://projects.tcag.ca/variation/)
• Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in
Humans Using Ensembl Resources (DECIPHER -
http://decipher.sanger.ac.uk/)
• UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu)
Foram classificadas como benignas as CNVs presentes em amostras
normais consideradas polimórficas, e como potencialmente patogênicas as
que estavam presentes em genes já conhecidos por causar alterações
clínicas. As CNVs que não envolviam genes de função conhecida, mas que
poderiam estar correlacionadas com as alterações, foram consideradas como
VOUS.
Adicionalmente utilizamos o software DAVID (Database for Annotation,
Visualization and Integrated Discovery)48,49 como triagem para verificar se os
genes encontrados participavam em vias do desenvolvimento neurológico, o
que pode auxiliar a explicar o fenótipo.
20
Resultados
21
4. RESULTADOS
O teste de MLPA foi realizado utilizando os kits subteloméricos P036 e
P070 em 118 amostras de DNA, sendo 105 delas de pacientes avaliados com
deficiência intelectual/ atraso de desenvolvimento associados com
malformações congênitas e de 9 pais e irmãos desses pacientes, totalizando
233 testes.
Através da análise dos resultados, foi possível identificar alterações no
número de cópias em 15/105 pacientes (14,28%), sendo 4 do sexo masculino
e 11 do sexo feminino. Em 14 pacientes essas alterações foram detectadas
com ambos os kits (P036 e P070) e em um paciente a alteração foi detectada
apenas pelo kit P070. Houve ainda um paciente (G-202) que apresentou uma
deleção detectada por ambos kits, mas apenas o kit P070 detectou uma
duplicação (Tabela 1).
22
Tabela 1 - Pacientes com alterações subteloméricas encontradas por MLPA utilizando os kits P036 e P070.
Paciente Sexo P036* P070* Genes Envolvidos
G-15 F del 04q35.2 del 04q35.2 TRIML2 e FRG1
G-67 F del 02q37.3 dup 05q35.3
del 02q37.3 dup 05q35.3
CAPN10 e ATG4B GNB2L1
G-68 F del 02q37.3, dup 05q35.3
del 02q37.3 dup 05q35.3
CAPN10 e ATG4B GNB2L1
G-92 F del 04q35.2 dup 05q35.3
del 04q35.2 dup 05q35.3
TRIML2 e FRG1 GNB2L1
G-135 F del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG
G-148 M del 04p16.3 dup 08p23.3
del 04p16.3 dup 08p23.3
PIGG FBXO25
G-158 M del 04q35.2 dup Xq28/Yq12
del 04q35.2 dup Xq28/Yq12
TRIML2 e FRG1 SYBL1
G-190 F del 5p15.3 del 5p15.3 PDCD6 e CCDC127
G-202 F del 04p16.3
del 04p16.3 dup 13q11
PIGG CDC16
G-337 F del 01p36.33 del 01p36.33 TNRFSF4 e TNRFSF18
G-385 F dup 05p15.3 dup 14q32.3
dup 05p15.3 dup 14q32.3
PDCD6 e CCDC127 MTA1
G-408 M Normal del 04q35.2 FRG1 G-436 F del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG G-445 F del 15q11.2 del 15q11.2 ALDH1A3 e TM2D3
G-544 M del Xq28/Yq12 dup 05p15.3
del Xq28/Yq12 dup 05p15.3
SYBL1 PDCD6 e CCDC127
*Vermelho: deleções (del), azul: duplicações(dup)
Entre os pacientes estudados, 7 apresentaram uma deleção
concomitante a uma duplicação, enquanto 7 apresentaram uma deleção
isolada.
Em apenas um paciente (G-385), com cariótipo prévio com presença
de marcador extranumerário, a alteração observada não apresentou deleção,
mas sim duas duplicações em subtelômeros de cromossomos distintos:
5p15.3 e 14q32.3.
Houve prevalência de deleção das regiões subteloméricas de 4p e 4q,
apresentadas por quatro pacientes cada. Dos pacientes que apresentaram
deleção em 4p16.3 e em 4q35.2, metade apresentavam uma duplicação
concomitante em outro cromossomo. As outras regiões que foram
23
encontradas com alteração em mais de um paciente, associadas ou não a
outras alterações, foram 5q35.3, 5p15.3 e 2q37.3 (Fig. 4).
Figura 4. Alterações subteloméricas mais prevalentes detectadas por MLPA utilizando os kits P036 e P070.
A região Xq28 foi encontrada alterada em dois pacientes do sexo
masculino. O paciente G-158 possui cariótipo normal e possui uma duplicação
desta região juntamente com uma deleção em 4q35.2 (Figura 5). Já o paciente
G-544 possui um cariótipo alterado, 45,X,add(5)(p15), com uma deleção em
Xq28 concomitante a uma duplicação em 5p15.3.
24
Figura 5. Resultados do exame de MLPA realizado no paciente G-158 evidenciando uma deleção em 4q e uma duplicação em X/Yp.
Os pais de 4 dos 15 pacientes (G-67 e G-68, G-92 e G-337) que
apresentaram alterações subteloméricas foram testados para ambos os kits,
com resultado normal em sua totalidade. A mãe do paciente G-158, o pai do
paciente G-190 e ambos pais do paciente G-408 foram testados para o kit
P036 e apresentaram resultado normal. Os demais pacientes cujos pais e/ou
outros parentes também foram avaliados pela técnica não apresentaram
alterações.
Selecionamos 7 pacientes com alterações subteloméricas relevantes
representativos do perfil dos resultados obtidos para análise por arrays (G-15,
G-67, G-68, G-92, G-148, G-158, G-385). Utilizando a técnica de array foi
possível confirmar os resultados de MLPA, mensurar a extensão das
alterações e identificar novas alterações genômicas não observadas por
MLPA.
25
Podemos destacar a extensão da deleção de 29 Mb em 4q do paciente
G-15 (Figura 6), a maior encontrada neste estudo. Destacamos também as
duplicações encontradas em 5q no paciente G-92, de 20 Mb e a em 15q
(Figura 7), do paciente G-385, de 33 Mb.
A técnica de array permitiu, outrossim, a identificação de alterações que
não fazem parte do escopo de identificação dos kits subteloméricos utilizados
em 4 pacientes. Além das alterações previamente detectadas por MLPA, o
paciente G-15 apresentou uma duplicação de 378 Kb em 5p15.2, o paciente
G-68 uma deleção de 136 Kb em 12p13.31 e duplicação de 241 Kb em
18q12.1, o paciente G-148 apresentou duplicações de 155 Kb em 12p13.31 e
de 169 kb em 12p11.21 e o paciente G-158 apresentou uma duplicação de
219 Kb em 2p11.2. Os resultados estão detalhados na Tabela 2.
Figura 6. CGH array Agilent 180K do paciente G-92, evidenciando uma deleção de 10,8 Mb em 4q e uma duplicação de 20 Mb em 5q.
26
Figura 7. Resultado do SNP array Illumina da paciente G-68, evidenciando uma deleção de 3,8 Mb em 2q e uma duplicação de 8,5 Mb em 5q.
Tabela 2 - Resultado dos arrays de 7 pacientes detectados com alterações subteloméricas
PACIENTE ALTERAÇÃO CROMOSSOMO TAMANHO START END
G-15* del 4q32.1-q35.2 29.256.942 161.623.467 190.880.409 dup 5p15.2 378.848 13.798.819 14.177.667
G-67* del 2q37.3 3.479.391 239.550.182 243.029.573 dup 5q35.1-q35.3 8.510.666 172.194.873 180.705.539
G-68*
del 2q37.3 3.479.391 239.550.182 243.029.573 dup 5q35.1-q35.3 8.525.955 172.179.584 180.705.539 del 12p13.31 136.743 7.986.563 8.123.306 dup 18q12.1 241.562 27.815.609 28.057.171
G-92# del 4q34.3-q35.2 10.828.597 179.962.284 190.790.881 dup 5q34-q35.3 20.563.537 160.148.716 180.712.253
G-148*
del 4p16.3-p16.1 9.322.625 48.283 9.370.908 dup 8p23.3-p23.1 6.797.232 176.818 6.974.050 dup 12p13.31 155.948 8.023.943 8.179.891 dup 12p11.21 169.245 31.240.334 31.409.579
G-158* del 2p11.2 219.910 90.027.810 90.247.720 del 4q35.1-q35.2 5.059.373 185.821.036 190.880.409 dup Xq27.1-q28 15.415.642 139.513.770 154.929.412
G-385# dup 5p15.33-p13.3 33.396.854 37.692 33.434.546 dup 14q11.2-q12 5.866.093 19.361.358 25.127.451
* Illumina - CytoSNP-12/ # Agilent 180K
27
Nós submetemos os genes presentes nas regiões encontradas
alteradas dos 7 pacientes a uma triagem pelo DAVID. Nosso objetivo foi
identificar se, dentre os genes encontrados deletados ou duplicados, havia
genes relacionados à cognição ou com participação no desenvolvimento
neuronal.
Após essa análise, procuramos no banco de dados do NCBI (do inglês,
National Center for Biotechnology Information) a função desse gene e,
posteriormente, por publicações que abordassem aspectos dos mesmos.
Encontramos uma relação total de 8 genes sugestivos de serem causativos
de alguma característica do fenótipo. Investigamos os 400 pb mais próximos
dos pontos de quebra identificados por oligoarrays em busca de elementos
que pudessem elucidar os mecanismos que causaram as alterações
observadas. No total, foram investigados 38 pontos de quebra, de 19 regiões
diferentes.
A análise revelou 43 elementos repetitivos em 31 pontos de quebra. Os
elementos repetitivos mais comuns foram 17 SINEs (sendo 9 Alu e 8 MIR), 10
LINEs (sendo 5 L1 e 5 L2) e 10 LTR. Também encontramos 6 elementos de
outras categorias, como do tipo DNA, simples e de baixa complexidade.
Nós também encontramos 6 pontos de quebra com diferentes STRs e
2 pontos de quebra com a presença de sequência telomérica (TTAGGG)n. Os
resultados estão detalhados na Tabela 3 e Figura 8.
28
Tabela 3. Elementos encontrados na análise por bioinformática nos pontos de quebra dos pacientes analisados por oligoarrays.
ID Posição do ponto de quebra TTAGGG? Elementos Repetitivos
STRs? Tipo Subtipo (n)*
G-15
chr4:161,623,267-161,623,667 Não SINE AluSx (2)
Sim LINE L2a (1) LTR MLT1A0
chr4:190,880,209-190,880,609 Não SINE MIRb (1) Sim
chr5:13,798,619-13,799,019 Não SINE AluSx (1)
Sim Simples (TTTA)n (1)
chr5:14,177,467-14,177,867 Não - - Não
G-67
chr2:239,549,982-239,550,382 Não SINE MIRc (1) Não
chr2:243,029,373-243,029,773 Não
LINE L1MC4a(1)
Não LTR MER4c (1)
Low comp. G-rich (1)
chr5:172,194,673-172,195,073 Não - - Não
chr5:180,705,339-180,705,739 Não LTR MSTB-int Não
G-68
chr2:239,549,982-239,550,382 Não SINE MIRc (1) Não
chr2:243,029,373-243,029,773 Não
LINE L1MC4a(1)
Não LTR MER4c (1)
Low comp. G-rich (1)
chr5:172,179,384-172,179,784 Não
SINE MIR (1)
Sim LINE L2b (1)
Simples (TG)n (1)
chr5:180,705,339-180,705,739 Não LTR MSTB-int Não
chr12:7,986,363-7,986,763 Não SINE AluSx (1) Não
chr12:8,123,106-8,123,506 Não SINE AluSx (1) Não
chr18:27,815,409-27,815,809 Não LTR MER41C (1)
Não LTR33
chr18:28,056,971-28,057,371 Não SINE AluJr (1)
Não Simple (TA)n (1)
G-92
chr4:179,962,084-179,962,484 Não - - Não
chr4:190,790,681-190,791,081 Não LINE L2c (1) Não
chr5:160,148,516-160,148,916 Não SINE MIR (1) Não
chr5:180,712,053-180,712,453 Não SINE AluSx (1) Sim
29
ID Posição do ponto de quebra TTAGGG? Elementos Repetitivos
STRs? Tipo Subtipo (n)*
G-148
chr4:48,083-48,483 Não LTR MER67C (1) Não
chr4:9,370,708-9,371,108 Não DNA MER5B (1) Não
chr8:176,618-177,018 Não SINE AluSx (1) Não
chr8:6,973,850-6,974,250 Não - - Não
chr12:8,023,743-8,024,143 Não - - Não
chr12:8,179,691-8,180,091 Sim SINE AluY (1) Não
chr12:31,240,134-31,240,534 Não LINE L2b (1) Não
chr12:31,409,379-31,409,779 Não SINE AluJb (2)
Não LINE L1 (1)
G-158
ch2:89,827,810-90,227,720 Não LINE L1MA9 (1) Não
chr2:90,247,520-90,247,920 Não LTR LTR48B (1) Não
chr4:185,820,836-185,821,236 Não - - Não
chr4:190,880,209-190,880,609 Não SINE MIRb (1) Sim
chrX:139,513,970-139,513,570 Não SINE MIRb (1) Não
chrX:154,929,212-154,929,612 Não LINE L1MEf (1) Não
G-385
chr5:37,492-37,892 Não SINE MIRb Não
chr5:33,434,346-33,434,746 Não DNA MER45A Não
chr14:25,127,251-25,127,651 Não SINE Alu
Não LTR LTR16D2
chr14:19,361,158-19,361,558 Não - - Não
* quantidade das alterações indicadas
Figura 8. Elementos repetitivos encontrados próximos aos pontos de quebra. A quarta coluna representa outras categorias desses elementos: do tipo DNA, simples e baixa complexidade.
30
Os resultados de todos os testes moleculares realizados nesse estudo
estão compilados na figura 9, para melhor compreensão e acurácia na análise
dos dados foi utilizado o programa circus plot. As principais características
clínicas de cada um dos pacientes que apresentaram alterações de CNV
estão listados na tabela 4.
Figura 9. Mapa citogenômico contendo todas alterações encontradas. Os diagramas circulares externos representam respectivos cromossomos com suas bandas. Os losangos em laranja referem-se à localização dos pontos de quebra indicados pelos testes com oligoarrays. A faixa cinza, mais externa, representa os arrays de cinco pacientes pela plataforma Illumina - CytoSNP-12, sendo cada barra referente à posição de cada sonda encontrada: em verde estão as deleções em homozigose, em laranja as deleções em heterozigose, em roxo as duplicações em homozigose e em rosa as deleções em heterozigose. A faixa amarela representa os arrays de dois pacientes pela plataforma Agilent 180K, sendo cada barra referente a cada sonda encontrada: em azul as duplicações e em vermelho as deleções. Por fim, a faixa verde refere-se aos testes de MLPA dos quinze pacientes com alterações, cada círculo correspondente a uma região alterada: em azul as duplicações e em vermelho as deleções.
31
Características/Pacientes G-15 G-67 G-68 G-92 G-135 G-148 G-158 G-190 G-202 G-337 G-385 G-408 G-436 G-445 G-544 TOTAL Dismorfismos faciais x x x x x x x x x x x x x x 14 Malf. Cardíacas x x x x x 5 Hérnia Inguinal x x 2 Deficiência Auditiva x x 2 Malf. estruturais Cerebrais x 1 Malf. do crânio x 1 Baixa estatura x x x x 4 Microcefalia x x x 3 Malf. de membros x x x x 4 Assimetria de membros x 1 Restrição de articulação x 1 Malf. geniturinarias x x x x x x 6 Convulsão x x x x x x 6 Hipotonia axial x 1 Alterações de fâmeros x x 2 Alterações oftalmológicas x 1
Tabela 4. Resumo das principais características clínicas dos pacientes que apresentaram resultado anormal no MLPA, além da DI.
32
Discussão
33
5. DISCUSSÃO
O estudo citogenético clássico por bandamento G, de pacientes
portadores de deficiência intelectual/ atraso no desenvolvimento concomitante
a malformações congênitas, é capaz de identificar apenas uma pequena
porcentagem das alterações devido sua baixa resolução. Com a introdução
de novas técnicas moleculares, como o MLPA, essa taxa de detecção pode
dar um grande salto, principalmente devido ao reduzido tamanho de suas
sondas e por sua maior sensibilidade50.
O teste FISH é considerado padrão ouro para a identificação de
rearranjos genômicos. Entretanto, como suas sondas hibridam num alvo
específico do genoma, é necessária uma suspeita clínica para se realizar o
teste, sendo este um fator limitante da técnica. Outra desvantagem da FISH,
em relação ao MLPA, é o tamanho de suas sondas, podendo não identificar
pequenas alterações presentes51.
O fato das sondas de MLPA variarem de apenas 50 – 70 nt de extensão
e serem elas próprias amplificadas por PCR, e não os próprios genes, reflete
na análise dos dados gerados e na identificação de alterações. As alterações
encontradas podem ser maiores e se estender por uma quantidade maior de
genes do que aquele em que a sonda hibrida. Neste caso é possível que
outros genes, talvez também deletados ou duplicados no paciente, sejam os
responsáveis ou colaborem para o fenótipo observado. Por esse motivo, em
determinados casos, não podemos afirmar que a alteração encontrada seja
responsável, sozinha, por todas as características fenotípicas encontradas.
Da mesma forma, caso haja uma diferença de apenas um nucleotídeo
na região alvo da sonda, não haverá hibridação. Portanto, há também a
possibilidade que a deleção observada na análise dos dados seja menor do
que a que realmente existe, ou que esta alteração não seja sequer uma
deleção, mas uma inserção de uma ou mais bases, mutações pontuais entre
outras. Entretanto, estas alterações podem acarretar numa perda de função
do gene, gerando uma patogenicidade.
34
O MLPA, capaz de mapear mais de 50 loci numa única reação, é
relativamente rápido, de fácil interpretação dos resultados e com um custo
muito inferior em relação às estas técnicas. Além disso, o teste dispensa a
necessidade de cultivo celular e preparação de lâminas. Estes fatos tornam o
MLPA uma técnica com um excelente custo benefício quando pretende-se
avaliar regiões específicas do genoma como, por exemplo, os subtelômeros,
em uma grande quantidade de pacientes4.
As regiões subteloméricas são enriquecidas em genes e, por
possuírem sequências repetitivas, estão mais sujeitas a rearranjos em relação
a outras regiões do genoma humano. Esses rearranjos podem resultar em
efeitos fenotípicos diversos, como malformações congênitas, deficiência
intelectual, problemas de comportamento e crescimento anormal. Portanto,
presume-se que a investigação dessas regiões em pacientes portadores de
DI/ADNPM associadas com malformações congênitas seja capaz de
identificar alterações que não foram encontradas através da utilização de
técnicas citogenéticas convencionais. A utilização independente de dois kits
subteloméricos distintos em cada caso, é sugerida pelo fabricante com o
objetivo de confirmar o resultado obtido. Este fato eliminaria a necessidade da
realização da FISH para o diagnóstico51.
A análise de pacientes portadores de deficiência intelectual associada
a malformações congênitas através da técnica de MLPA, utilizando os kits
subteloméricos P036 e P070, obteve sucesso ao identificar CNVs em 15/105
pacientes que estavam sem diagnóstico clínico concluído, perfazendo um total
de 14,28%. A taxa de detecção de alterações subteloméricas de pacientes
portadores de DI/ADNPM isolada, varia de 3% a 6%. Nosso estudo mostra
uma taxa superior, provavelmente devido ao fato de nosso estudo incluir a
associação de ambas anormalidades como fator de inclusão, o que pode
elevar a taxa de detecção a mais de 10%52,53.
As alterações mais encontradas em nossa análise por MLPA foram as
deleções, presentes em 14/15 pacientes. Dos 14 pacientes que apresentavam
deleção, metade deles a apresentaram de maneira isolada, e a outra metade
35
apresentavam uma duplicação concomitante. Esse resultado sugere que as
deleções sejam responsáveis, em geral, por uma manifestação fenotípica
mais grave nos indivíduos portadores, provavelmente devido a possível
haploinsuficiência de muitos genes em determinados tipos de células.
Foi possível a realização do teste com oligoarrays em 7 dos 15
pacientes que apresentaram CNVs subteloméricas. Optamos por selecionar
pacientes com alterações em 4q e 4p, as irmãs com as mesmas alterações
(G-67 e G-68) e o único paciente com duplicações e sem deleções,
representativas de todo o estudo. Isso possibilitou a confirmação e
mensuração da extensão das alterações identificadas pelo MLPA. A
realização do teste por array também proporcionou a identificação de algumas
alterações que não estão contempladas nos kits P070 e P036 de MLPA.
Esse resultado mostrou a eficiência da utilização de dois kits de MLPA
para identificar alterações subteloméricas, uma vez que todas as alterações
foram confirmadas pelo método de array que abrange as sondas incluídas em
ambos os kits.
5.1. CNVs no cromossomo 4
A alteração mais prevalente em nosso estudo foi a deleção dos
subtelômeros de 4p e de 4q. As sondas dos kits utilizados têm como alvo
segmentos dos genes PIGG, localizado em 4p16.3, e TRIML2 e FRG1,
localizados em 4q35.2.
Independentemente de haver alterações concomitantes em dois dos
quatro pacientes, a avaliação realizada nos bancos de dados disponíveis,
relevou que a prevalência da deleção de 4p16.3 é comumente encontrada em
diversos estudos de alterações subteloméricas em pacientes com DI/ADNPM.
Entretanto, não encontramos dados referentes à frequência desta alteração
em pacientes portadores DI/ADNPM concomitante com MC.
O gene PIGG (phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis), já foi
relatado em casos de malformações congênitas e deficiência intelectual.
36
Apesar de haver associação deste gene com a síndrome de Wolf-Hirschhorn,
há casos em que os portadores desta síndrome não apresentam deleção de
PIGG. Entretanto, a identificação por MLPA utilizando os kits subteloméricos
não permite a visualização da extensão da deleção. Deste modo, nossos
pacientes podem possuir uma deleção em 4p16.3 que envolva os genes
WHSC1 e/ou NELFA (WHSC2), ambos ~1,5 Mb distantes de PIGG, prováveis
responsáveis da síndrome de Wolf-Hirschhorn (Fig. 2A)54. Apesar de haver
casos em que pacientes com DI/ADNPM associados a malformações
congênitas possuam deleção em PIGG mas não em WHSC1 e NELFA, todos
nossos quatro pacientes apresentam fenótipo compatível com a síndrome de
Wolf-Hirschhorn.
Foi possível a análise por oligoarrays no paciente G-148, que revelou
a deleção encontrada em 4p era de aproximadamente 9 Mb, seis vezes maior
do que a inferida por MLPA. A triagem por DAVID revelou a presença 8 genes
ligados diretamente ao desenvolvimento ou manutenção do sistema nervoso,
como diferenciação, desenvolvimento e projeção neuronal e ligação e
receptor de neurotransmissores. A análise da função dos genes deletados no
paciente G-148 revelou 8 genes com participação no sistema neurológico.
Entre eles podemos destacar dois genes bem descritos. O gene CRMP1 é
conhecido por codificar cinco fosfoproteínas que são altamente expressas no
desenvolvimento do sistema nervoso central e tem um papel importante no
crescimento dos neuritos55 e o gene SORCS2 é altamente expresso no
desenvolvimento do sistema nervoso central de murinos56. É possível que as
alterações encontradas em 4p e 8p tenham decorrido devido a uma
translocação desequilibrada entre essas regiões, uma vez que estas
translocações são comuns57. Esses resultados, juntamente com relatos de
outros pacientes com deleções similares com DI/ADNPM, sugerem que uma
alteração de dosagem desses genes podem ser os responsáveis pelo fenótipo
observado.
Alterações subteloméricas em 4q já foram descritas como causativas
de DI/ADNPM e MC14. O gene TRIML2 possui função desconhecida e o gene
FRG1 encontra-se deletado em pacientes com distrofia muscular
37
facioscapulohumeral (DMF), entretanto nossos pacientes não apresentam
fenótipo compatível com esta síndrome. A consulta aos bancos de dados
também apresenta relatos de desequilíbrio desses genes em pacientes com
deficiência intelectual e malformações congênitas. Ambos genes encontram-
se separados por ~1.9 Mb, sendo que, entre eles, há uma quantidade bem
menor de genes em relação à região subtelomérica de 4p ( Fig. 10). Deste
modo, a opção por utilizar dois kits distintos de MLPA conferiu a vantagem de
tornar possível uma estimativa da extensão mínima da deleção presente nos
casos em que houve identificação de deleção por ambos kits (G-15, G-92 e
G-158).
Figura 10. Esquema representativo do cromossomo 4 mostrando os principais genes contidos nos subtelômeros. A. Distância e densidade de genes existentes entre os genes PIGG,WHSC1 e NELFA no braço p. B. Detalhe da região e distância existente entre os genes TRIML2 e FRG1.
Os testes com oligoarrays realizados nos pacientes G-15, G-92 e G-
158, revelaram que o tamanho da deleção em 4q encontrada era de,
respectivamente, 29 Mb, 10 Mb e 5 Mb. Isso significa que a quantidade de
genes afetados era muito superior à identificada por MLPA. Encontramos, na
38
triagem por DAVID dos genes desses três pacientes, um total de sete genes
diretamente relacionados com o desenvolvimento e/ou função do sistema
neurológico. Dois desses genes estão deletados em todos pacientes. Entre
estes genes destacamos o HELT, que foi descrito como expresso em
progenitores neuronais não diferenciados no desenvolvimento do
mesencéfalo e diencéfalo58,59.
O paciente G-408 possui a deleção apenas em FRG1, mas não em
TRIML2. Este paciente apresentou um fenótipo mais brando do que outros
com uma deleção mais extensa. Este fato sugere uma influência do tamanho
da deleção no fenótipo apresentado.
O paciente G-92 apresentou, além da deleção subtelomérica em 4q,
uma duplicação subtelomérica em 5q, com extensão de 20 Mb. A triagem por
DAVID revelou 15 genes diretamente ligados a processos neurológicos. A
análise dos pais da paciente permitiu-nos constatar que se tratava de uma
alteração de novo. Este fato, juntamente com a análise dos genes envolvidos,
sugerem que as alterações observadas são as responsáveis pelo fenótipo da
paciente. Entretanto, é necessário um conhecimento maior sobre a atuação
destes genes no desenvolvimento humano para inferir qual o papel dos
mesmos no desenvolvimento das anomalias fenotípicas apresentadas.
Esses resultados confirmam que os subtelômeros do cromossomo 4
carregam genes relevantes responsáveis por DI/ADNPM e MC e a eficiência
da técnica de MLPA em detectá-los. Estes dados fazem deste cromossomo
um alvo para próximas investigações e pode conduzir à descoberta de
marcadores biológicos para kits de diagnóstico para prognóstico e
aconselhamento dos pacientes. Alterações desprezadas no cariótipo por
bandamento G, como translocações consideradas equilibradas, podem
influenciar diretamente no fenótipo do portador ou da sua prole. Isto enfatiza
a necessidade de uma atenção especial para estas regiões e sua importância
na procura de alterações que elucidem um fenótipo alterado.
Apesar de encontrarmos nos subtelômeros do cromossomo 4 em
nossos pacientes apenas deleções, nossa análise realizada junto aos bancos
39
de dados revelou diversos pacientes em que estas regiões encontram-se
duplicadas e associadas a alterações fenotípicas. Estes resultados justificam
ainda mais uma maior atenção às referidas regiões.
5.2. Demais CNVs
Uma paciente apresentou deleção na região subtelomérica de 1p. A
deleção dessa região acarreta na síndrome de 1p36, caracterizada por
caracterizada por fácies típico e deficiência intelectual de gravidade variável,
podendo também compreender malformações cerebrais, cardíacas e
esqueléticas60. Sendo o fenótipo compatível com o da literatura, a análise por
MLPA do DNA dos pais resultando normal para as regiões estudadas, a
alteração observada no paciente foi considerada causativa do fenótipo.
As pacientes G-67 e G-68 são irmãs, com cariótipo normal, e ambas
apresentaram as mesmas CNVs, sugerindo que essas alterações teriam sido
herdadas de um dos genitores. Entretanto, a análise do material genético
destes pelos mesmos kits não apresentaram alteração no número de cópias.
Portanto a alteração observada foi considerada causativa do fenótipo. A
análise subsequente por array, permitiu a delimitação da extensão das
alterações encontradas por MLPA e além de revelar alterações em outros dois
cromossomos. A investigação da função dos genes encontrados com número
de cópias alterados nos forneceu pistas sobre a importância de alguns deles
nessas alterações. A baixa expressão do gene OTOS (deletado nas
pacientes)61 e mutações nos genes MARVELD2 e POU4F3 (duplicado nas
pacientes), já foram relatados ser causadores de surdez62,63. Inferimos que
provavelmente o gene OTOS seja o responsável por essa característica, visto
que a deleção de um dos alelos pode levar a uma baixa expressão e acarretar
na perda de audição. Mutações nonsense no gene DIAPH1 causam
microcefalia em humanos Ercan-Sencicek64 e há um relato no DECIPHER de
um paciente com microcefalia com duplicação numa região que inclui esse
gene, sendo indicativo que a duplicação do gene DIAPH1 encontrada seja
responsável pela microcefalia observada nas pacientes.
40
É provável que um rearranjo cromossômico equilibrado envolvendo o
braço longo dos cromossomos 2 e 5 de um dos genitores das pacientes G-67
e G-68, impossível de ser detectado tanto por MLPA quanto por oligoarrays,
tenha causado as CNVs observadas nos probandos.
A paciente G-385, portadora de um cromossomo marcador
extranumerário, foi a única a não apresentar deleções, mas duplicações. O
cariótipo da mãe resultou em 46,XX,t(5;14)(p15;q22) e do pai não apresentou
alterações. A análise por MLPA identificou que a paciente possuía material
adicional de 5p e 14q. Portanto, concluímos que o marcador observado é
proveniente da translocação entre os cromossomos 5 e 14 materna. A análise
por array subsequente definiu o tamanho da duplicação de 5p em 33,3 Mb e
a de 14q em aproximadamente 5,8 Mb. Por meio da triagem por DAVID,
identificamos 14 genes com participação na formação ou manutenção do
sistema nervoso, presentes nessas duas regiões. Entre esses genes,
podemos destacar o CTNND2, localizado no braço curto do cromossomo 5,
que já foi relatado como potencial causador de deficiência intelectual quando
em homozigose65. Também encontramos diversos casos no DECIPHER de
pacientes com deficiência intelectual e malformações congênitas com
duplicações que envolviam essa região.
Sugerimos que o material adicional observado em 5p no cariótipo do
paciente G-544, seja uma parte duplicação do próprio cromossomo 5 e outra
parte cromossomo Y translocado com uma deleção em Yq, visto que o
material de Yp está normal em relação ao número de cópias e o paciente é
do sexo masculino e não apresenta malformações geniturinárias.
Apesar da possibilidade de alguns genes identificados apresentarem
indícios da origem de determinada característica do fenótipo, sugerimos que
o conjunto das alterações encontradas seja o responsável pelo perfil
fenotípico observado em cada paciente. A interação entre as diferentes
dosagens de diferentes genes podem acarretar em diferenças de expressão
gênica em amplas proporções, quando comparadas a um padrão de
expressão de um indivíduo fenotipicamente normal. Todo esse padrão de
41
expressão alterado pode, então, ser o responsável por um fenótipo anormal
encontrado. Portanto, em se tratando de CNVs, não é sempre possível
identificar um gene como responsável, mas sim um conjunto de alterações
que resultem em malformações congênitas e deficiência intelectual.
Os mecanismos de NHEJ ou MMEJ, por serem advindos de uma
quebra na dupla fita e posterior junção das mesmas, justifica uma perda de
material genético, mas não uma duplicação dos mesmos. Portanto, os casos
em que há apenas deleção simples e não há duplicação, são sugestivos de
serem decorrentes de um destes mecanismos.
O mecanismo de NAHR implica numa recorrência dessas CNVs,
mediadas principalmente por LCRs. Apesar do alto número de alterações
encontradas em 4p sugerirem uma participação dessas repetições na
formação das deleções encontradas, foi demonstrado por Zollino et al57, que
não há participação de LCR nas alterações envolvendo 4p nessa região.
Os mecanismo FoSTeS ou MMBIR podem acarretar em duplicações e
deleções concomitantes, pois utilizam como molde segmentos que podem
estar localizados em outras regiões do genoma. Portanto, os casos que
apresentam esses rearranjos complexos, podem ser decorrentes de um
destes tipos de mecanismo. Alinhamentos incorretos durante a replicação
devido às sequências repetitivas nestes loci podem acarretar MMBIR e gerar
rearranjos complexos dup/del observados em 6 dos 7 pacientes cujo material
genético foi submetido à análise por oligoarrays.
Além disso, características da arquitetura genômica, como sequências
motivos, conformações não-B e elementos repetitivos podem aumentar a
susceptibilidade a quebras ou promover tanto alterações recorrentes como
não-recorrentes42.
5.3. Detecção das CNVs
Pela técnica de MLPA foi possível identificar alterações que passaram
despercebidas pelo cariótipo por bandamento G, além de elucidar os casos
em que o cariótipo não foi capaz de definir com precisão.
42
Seu relativo baixo custo aliado com sua praticidade, rapidez,
sensibilidade e precisão, faz com que esta técnica se torne uma excelente
opção para detecção de CNVs submicroscópicas. Além disso, o MLPA pode
ser utilizada como alternativa em casos de falha de cultura celular, o que
impediria a realização do cariótipo.
A utilização de oligoarrays foi importante não apenas para confirmar,
como também para definir a extensão das alterações. Com isso, foi possível
identificar que dois pacientes (G-92 e G-158), diagnosticados previamente
com cariótipo normal, possuíam alterações suficientemente extensas para
detecção por visualização microscópica por citogenética convencional. Este
fato sugere que o cariótipo prévio não foi realizado com a acurácia necessária
ou que translocações entre bandas parecidas
Com a estratégia utilizada, à partir da utilização de apenas dois kits, foi
possível elevar significativamente a quantidade de alterações detectadas e,
principalmente, demonstrar a importância das regiões subteloméricas na
etiologia de DI/ADNPM associada a MC. Adicionalmente, o presente estudo
evidenciou que a técnica de MLPA pode ser utilizada como triagem, sendo
que à partir desta análise é possível selecionar os pacientes mais indicados
para avaliação por oligoarrays, de acordo com a necessidade. Por fim, a
análise por arrays não apenas permitiu a mensuração das alterações
encontradas, como também possibilitou uma correlação mais refinada do
genótipo ao fenótipo.
43
Conclusões
44
6. CONCLUSÕES
• Verificamos que a técnica de MLPA, utilizada para identificação de CNVs
em regiões subteloméricas de pacientes com DI/ADNPM associada a MC,
por meio dos kits P036 e P070, foi eficiente em identificar alterações em
15 pacientes, correspondente a 14,28% do total de avaliados.
• A análise subsequente em 7 pacientes com CNVs relevantes para o
estudo confirmou o resultado obtido por MLPA, revelou a extensão destas
alterações e também encontrou alterações em loci não subteloméricos.
• Por meio dos testes moleculares, foi possível, em todos pacientes,
identificar alterações no número de cópias gênicas sugestivas de serem
causadoras do fenótipo encontrado. Adicionalmente, foi possível
identificar prováveis genes responsáveis por algumas características
fenotípicas específicas.
• As sequências repetitivas presentes nas regiões subteloméricas, como
sequências teloméricas (TTAGGG)n, os elementos repetitivos e as STRs
são provavelmente as responsáveis pelas alterações de CNVs
encontradas. Os mecanismos de FoSTeS, MMBIR, NHEJ, MMEJ e NAHR
podem ser decorrentes dessa arquitetura subtelomérica.
45
Anexos
46
ANEXO A
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP
MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
_______________________________________________________________
DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL
1. NOME DO PACIENTE: .......................................................................................... .........................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ............................................................ SEXO : .M □ F □ DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO .......................................................... Nº ................. APTO: ........... BAIRRO: ..................................................................... CIDADE ....................... CEP:.................................... TELEFONE: DDD (..........) ....................................
2.RESPONSÁVEL LEGAL .................................................................................... NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ........................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE :.....................................SEXO: M □ F □
DATA NASCIMENTO.: ....../......./......
ENDEREÇO: ................................................................................................. Nº ............... APTO: ..............
BAIRRO: .................................................................................. CIDADE: .....................................................
CEP: .............................................. TELEFONE: DDD (............)..................................................................
____________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: “Estudo das variações no número de cópias (CNVs) das regiões subteloméricas em portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual”
PESQUISADORA: Dra. Chong Ae Kim
47
CARGO/FUNÇÃO: Chefe da unidade de Genética do Instituto da Criança do HC-FMUSP
INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 40054
UNIDADE DO HCFMUSP: Unidade de Genética do Instituto da Criança do HC-FMUSP
2. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:
RISCO MÍNIMO □ RISCO MÉDIO □
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR □
3. DURAÇÃO DA PESQUISA: 24 meses
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP
1 – Este projeto de pesquisa é importante para ajudar a definir o diagnóstico da
doença do seu filho(a) que possui atraso no desenvolvimento e/ou malformações.
Em algumas doenças genéticas, como no caso do seu filho, o diagnóstico só é
possível com exames mais complexos que procuram pequenas alterações de ganho
ou de perda de material genético para explicar a doença de seu filho(a). Assim, seu
filho ao participar deste projeto, usando nova técnica de exame possibilitará seu
esclarecimento diagnóstico ajudando a prevenir possíveis casos nas irmandades e
seus familiares.
2 - Será realizada uma entrevista com os pais ou responsáveis, incluindo a história da família, um exame físico no filho(a) e serão tiradas fotografias dos pacientes para podermos guardar com mais precisão as características do rosto, do corpo, das mãos e pés que podem mudar com os anos e são muito úteis para a discussão entre os médicos que estão tentando fazer o diagnóstico da doença. Serão ainda pedidos (caso o paciente não tenha realizado) exames de imagem como raio-X do esqueleto, ultrassonografia de abdome, ecocardiograma, tomografia ou ressonância do crânio se pertinentes para a investigação do paciente. Esses exames procurarão
48
malformações em vários órgãos internos do corpo. Também será necessário um exame de sangue para procurar pequenas alterações no material genético da criança
que poderiam explicar os problemas de saúde do paciente.
3 – Será colhida uma amostra 5 mL de sangue da veia do braço que é suficiente para diferentes exames de sangue relacionados a essa pesquisa. No caso de algum dos exames apresentar um resultado alterado, solicitaremos aos pais que retornem para explicação do resultado e para discutir se será necessário ou não uma investigação adicional com novos exames da criança e possivelmente dos pais. Em alguns casos outros familiares, como por exemplo, os avós ou irmãos, também poderão fazer parte do estudo para estabelecimento do diagnóstico e conclusão do padrão de hereditariedade que possibilitará a realização do aconselhamento genético de forma acurada. Guardaremos uma amostra do material genético para sempre que possível
procurar mais alterações neste material, o que poderia explicar a doença.
4 – O desconforto associado ao exame de sangue consiste apenas daquele relacionado à coleta. Punção Venosa: após punção venosa (“tirar sangue”) o local pode ficar um pouco dolorido. Também pode ocorrer a formação de um pequeno hematoma (“roxo”) que pode persistir por alguns dias; porém o mesmo se desfaz sem
a necessidade de medicamentos.
5 – O estudo trará como benefício para o seu filho(a) a possibilidade do diagnóstico. Além disso, permite também saber se a doença vem da família ou não e, portanto,
se esta doença pode repetir em outros filhos(as) do casal.
6 – Não existem outros exames alternativos disponíveis no SUS para a pesquisa das
pequenas alterações no material genético relacionado aos problemas do seu filho.
7 – Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. A principal investigadora é a Dra. Chong Ae Kim que pode ser encontrada na Unidade de Genética do Instituto da Criança, endereço Av. Dr. Enéas Carvalho de Aguiar, 647, 7º andar. Telefone (11) 3069-8671. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel: 3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20, FAX: 3069-6442
ramal 26 – E-mail: [email protected]
49
8 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de tratamento
do seu filho(a) na Instituição.
9 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes, não sendo divulgada a identificação de nenhum
paciente.
10 – É garantido o direito de ser mantido atualizado sobre os resultados parciais das
pesquisas.
11 – Despesas e compensações: não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há
compensação financeira relacionada à sua participação.
12 – A pesquisadora (Dra. Chong Ae Kim) se compromete a utilizar os dados e o
material coletado para esta pesquisa e será armazenado para posterior investigação
por métodos ainda não disponíveis.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li
ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo “Estudo das variações no
número de cópias (CNVs) das regiões subteloméricas em portadores de
malformações congênitas e deficiência intelectual”.
Eu discuti com a Dra. Chong Ae Kim sobre a minha decisão em participar
nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes.
Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho
garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo
voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a
qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou
perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento
neste Serviço.
50
Assinatura do paciente/representante legal
Data / /
Assinatura da testemunha
Data / /
para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou
portadores de deficiência auditiva ou visual.
(Somente para o responsável do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e
Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo.
Assinatura do responsável pelo estudo Data / /
51
ANEXO B
52
Referências
53
7. REFERÊNCIAS
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Apêndice
Subtelomeric CNVs: prevalence of 4p/4q deletions in patients with congenital anomalies and developmental disabilities
Novo-Filho GM 1, 2, Montenegro MM 1, 2, Zanardo EA 1, 2, Dutra RL 1, 2, Dias AT 1, Piazzon FB 1, Costa TVMM 1, Nascimento AM 1, 2, Kim CA 2, *Kulikowski LD1
1 Department of Pathology, Cytogenomics Laboratory, LIM 03, Universidade de São Paulo, Brazil 2 Department of Pediatrics, Instituto da Criança, LIM 36, Universidade de São Paulo, Brazil
Gil Monteiro Novo Filho - [email protected] MSc. Marília Moreira Montenegro - [email protected] Évelin Aline Zanardo - [email protected] MSc. Roberta Lelis Dutra - [email protected] Alexandre Torchio Dias - [email protected] Flavia Balbo Piazzon - [email protected] MSc. Thaís Virgína Moura Machado da Costa - [email protected] Amom Mendes Nascimento - [email protected] PhD. Chong Ae Kim - [email protected] *PhD. Leslie Domenici Kulikowski - [email protected]
*Corresponding author: Leslie Domenici kulikowskiAddress: Cytogenomics Lab, Department of Pathology, Universidade de São Paulo Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 155, 2º andar, bloco 12, sala 7 São Paulo, SP, Brazil - Phone/fax: +55 11 26619506 E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Background: The most prevalent structural variations in the human genome are copy number variations (CNVs), which can affect the transcription rates, sequence, structure and function of genes. CNVs appear predominantly in the subtelomeric regions, and the variable sizes of 4p/4p CNVs have recently been associated with several different psychiatric findings, developmental delay and mental retardation. Methods: We analyzed 105 unrelated patients with congenital anomalies and developmental disabilities using a combination of MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) subtelomeric specific kits (P036 /P070). We additionally performed arrays (Illumina - CytoSNP-12 and Agilent 180K) in 4 patients in order to delineate the breakpoints and to assess the unbalanced genes by DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery). Results: We found abnormal subtelomeric CNVs in 15 patients (14.3%), including eight patients with subtelomeric deletions at the 4p/4q chromosome (53.3%). Additional genomic changes were observed at 1p36, 2q37.3, 5p15.3, 5q35.3, 8p23.3, 13q11, 14q32.3, 15q11.2 and Xq28/Yq12. All these imbalances had already been reported in patients with multiple congenital anomalies, psychiatric findings and developmental delays, suggesting that these changes are pathogenic. Our MLPA results indicated the prevalence of independent deletions in 4p/4q, involving the PIGG, TRIML2 and FRG1 genes. Further, array and DAVID analysis have identified 15 unbalanced genes that contribute to neurological development and/or function, among them CRMP1,
SORCS2, SLC25A4 and HELT. Conclusion: Cytogenomic characterization of additional cases with distal deletions should help clarify the role of subtelomeric CNVs in neurologic diseases.
KEY WORDS: Subtelomeric CNVs, developmental disabilities, 4p/4q deletion, MLPA, arrays
BACKGROUND Genomic variations are a frequent cause of miscarriage, congenital anomalies and developmental delay [1, 2]. Copy number variations (CNVs) are the most prevalent type of structural variation in the human genome and can affect the transcription rates, sequence, structure and function of genes. They appear predominantly in the subtelomeric regions, which include repetitive sequences and are therefore more susceptible to chromosomal rearrangements.Previous studies have shown that CNVs associated with intellectual disability (ID) and congenital anomalies (CA) are significantly enriched in genes whose mouse orthologous produce a nervous system phenotype when disrupted [3-10]. The ID and CA prevalence in the general population is approximately 4%. An individual is considered to be a carrier of an ID if he/she has a QI<70. However, because it is impossible to reliably measure QI in children under five years, the thermo developmental disability (DD) is used to identify these children [3, 4]. The incidence of DD approaches 1-3%, and several studies have described the pathogenic subtelomeric imbalances in DD/ID and CA patients, with rates varying between 2.4% to 4.4% [5-8]. Although chromosomal analysis is a standard procedure patients with unexplained diagnoses (including DD/ID and multiple congenital anomalies), evaluating these alterations using MLPA strategy enables one to access all the subtelomeres at a relatively low-cost and in a rapid single reaction [9-11]. Microarray-based tests are still more powerful, allowing the assessment of the entire genome in searching of CNVs [12]. In this report, we applied a combination of MLPA subtelomeric kits and arrays to detect the subtelomeric regions associated with DD/CA phenotypes. Unexpectedly, we were also able to determine the prevalence of 4p/4q deletions.
METHODS We investigated a cohort of 105 DD/CA patients (52 male and 53 female), all of whom had previously exhibited normal GTG banding results, or considered insufficient to diagnosis. We used a combination of independent P036 and P070 MLPA subtelomeric kits (MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands). The MLPA reactions were performed according to the manufacturer’s protocol. The Research Ethics Committee of HCFMUSP approved this study, and consent was obtained from the parents of the patients (CAPPesq nº 0718/11). The DNA extraction was performed from blood samples of the patients using the QIAamp DNA Blood Midi Kit (250) (QIAGEN, Valencia, California) according to the manufacturer instructions. We analyzed the results using the software GeneMarker® (Softgenetics, LLC, State College, PA - www.softgenetics.com). The results were considered abnormal when relative peaks were observed whose size was smaller than 0.75 (deletion) or larger than 1.25 (duplicate samples relative to normal). From the results obtained by MLPA technique, we selected four patients that presented subtelomeric deletions on chromosome 4 to array evaluations (Illumina - CytoSNP-12 and Agilent 180K), according to the manufacturer instructions, in order to measure the extent of the genomic alterations. All abnormalresults were analyzed using independent tests and compared to the following databanks of both pathogenic and benign CNVs: the Database of Genomic Variants (DGV - http://projects.tcag.ca/variation/), the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (DECIPHER - http://decipher.sanger.ac.uk/) and the UCSC
Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu). Lastly, we analyzed the genes that were with changes in copy number by DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)( http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)[13, 14], in order to assess the involvement of these genes in the development and/or function of the nervous system.
RESULTS The combined analysis using MLPA kits identified subtelomeric CNVs in 15/105 patients (14.3%). Eight patients presented subtelomeric deletions at the 4p/4q chromosome (53.3%) (Figure 1a); additional genomic changes were located at 1p36, 2q37.3, 5p15.3, 5q35.3, 8p23.3, 13q11, 14q32.3, 15q11.2 and Xq28/Yq12 (Table I). All these imbalances had already been reported in patients with multiple congenital anomalies and developmental delays, suggesting that these changes are pathogenic ( Figure 1). We performed array in order to measure the extent of these alterations in four cases (G-15, G-92, G-148 and G-158). The analysis corroborates the previous results and also revealed imbalances in other loci that MLPA was unable to detect (Table II). We assessed the deleted genes that were found in 4p and 4q by DAVID. In the case G-148, array revealed 133 genes deleted in the short arm of chromosome 4 and eight of them are directed related with neurological development and/or function (Table III). In other three cases with 4q deletions, the array analyses revealed different CNVs. Eight of 111 genes found in patient G-15, five of 51 genes in patient G-92 and three of 26 genes in patient G-158 were also found to be directed related with neurological development and/or function (Table IV), in a total of seven genes (Table IV). Among these seven genes, two were present in all three patients (SLC25A4 and HELT).
DISCUSSION Using MLPA by two independent MLPA kits that target the same regions, we were able to assess and confirm the subtelomere CNVs of all the chromosomes rapidly and economically relative to other techniques, such as CGH-array [15]. And unexpectedly, we were also able to determine that more than half of our patients had deletions in the 4p/4q subtelomeric regions, suggesting that genes within these regions are associated with DD/ID and CA. The distal short arm of chromosome 4 was first mapped mainly because was associated to two genetic disorders: Huntington´s Chorea caused by the HTT gene, and Wolf-Hirschhorn syndrome (WHS- OMIM 194190). Deletion of the short arm of chromosome 4, detected by classical karyotype, was linked with distinctive clinical phenotype (WHS Syndrome) in 1965 by Wolf et al., and recent pathogenic CNVs, including deletions and duplications, have been recognized in the same region. WHS is usually attributed to the loss of multiple genes in the critical 4p16.3 region that are relevant for normal development, including WHSC1, LETM1, and MSX1 genes, although many of their specific functions are unclear. The 4p probes of both the P036 and P070 kits comprise different regions within the 4p16.3 region that covers the gene PIGG. This gene encodes a protein responsible for the transfer of ethanolamine phosphate to the GPI second mannose, and genomic deletions in this region also have been described in several patients with DD/ID and CA. Although associations have been observed between the PIGG gene and Wolf-Hirschhorn syndrome, the literature shows some cases in which WHS patients do not present a deletion of the PIGG gene [22]. Most of our WHS patients have a 4p16.3 deletion that covers the critical WHS region, which is approximately 1.5 Mb away from the PIGGgene, and involves the WHSC1 and NELFA genes (Figure 1) [16]. Four of the study patients presented a clinical phenotype compatible with WHS and a deletion that included only the PIGG gene. One of the patients has an 8p23.3 duplication concomitant to a 4p16.3 deletion. This rearrangement was most likely the consequence of an apparent balanced translocation between the 4p and 8p chromosomes, which is a common cause of the deletion observed in WHS patients.
However, a variety of clinical presentations have also been reported in patients with 4q deletions detected by classical cytogenetic. The lack of molecular characterization of the deletion sizes and deleted genes challenges the genotype-phenotype correlation. The genes TRIML2 and FRG1 are deleted in 3 of the patients. The function of the TRIML2 gene remains unknown, and the FRG1 gene is associated withfacioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) however, our patients did not present a phenotype that was compatible with this syndrome (Figure 1). Array analysis allowed to determine the extent of deletions found in one case with 4p subtelomeric deletion (G-148) and in three cases with 4q subtelomeric deletion (G-15, G-92 and G-158). DAVID analysis of these results was helpful to provide the possibility to detect whether the deleted genes were related with neurological development and/or function. Furthermore, it allowed us to identify the role of these genes in the neurological system. Array analysis of patient G-148 revealed 133 genes deleted in the short arm of chromosome 4 and eight of them are genes that play role in the neurological system. CRMP1 gene is known to code 5 phosphoproteins that are highly expressed in the development of the nervous system [17] and SORCS2 was found to be highly expressed in the murine central nervous system development [18]. Regarding the three cases with 4q deletion, we found a total of seven genes direct related with neurological development and/or function. Two of these, SLC25A4 andHELT, are deleted in all three patients. HELT gene was described to be expressed in undifferentiated neural progenitors in the developing mesencephalon and diencephalon [19, 20]. These data could suggest the importance of these genes in the neurological system and even though the haploinsufficiency of these genes remains unclear, the phenotype observed in patients with deletions in this region would confirm that these genes are relevant in the neurological development. The incidence of 4p/4q imbalances in this study is higher compared with the literature but it could be attributed due to the accuracy of using two MLPA kits. Both kits were applied in all patients and parents to exclude the possibility of polymorphisms. And although our findingsinclude only deletions in 4p/4q regions, the data bank analysis revealed several ID patients with duplications are present in the similar regions. CONCLUSIONS Furthermore, genomic characterization of additional cases with 4p/4q imbalances associated with epigenetic factors should help clarify the role of CNVs in patient withdevelopmental disability and neurological diseases. LIST OF ABBREVIATIONS CA: Congenital Anomalies; CNV: Copy Number Variations; DAVID: Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery; DD: Developmental Delay; DECIPHER: Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources; DGV: Database of Genomic Variants; FSHD: Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy; ID: Intellectual Disability; MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification; WHS: Wolf-Hirschhorn syndrome. COMPETING INTERESTS The author´s declare that they have no competing interests. AUTHOR´S CONTRIBUTION GMNF wrote the paper, GMNF and MMM performed molecular studies. ATD, AMN and performed classical cytogenetic analysis and prepared the samples. FBP and CAK performed the clinical evaluation. EAZ, RLD and TVMMC analyzed the MLPA results. LDK designed and coordinated the study. All authors read and approved the final manuscript.
ACKNOWLEDGMENTS The authors thank the patients and their families, as well as FAPESP for financial support. FINANCIAL SUPPORT This study was supported by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - nº 53105/9). REFERENCES 1. Nielsen J, Wohlert M: Chromosome abnormalities found among 34,910 newborn
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TABLES Table I. Patients who presented subtelomeric deletion in chromosome 4 detected by MLPA kits P036 and P070
ID Sex P036 P070 Genes Involved G-135 F del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG G-436 F del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG G-148 M del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG
dup 08p23.3 dup 08p23.3 FBXO25 G-202 F del 04p16.3 del 04p16.3 PIGG
dup 13q11 CDC16 G-15 F del 04q35.2 del 04q35.2 TRIML2 and FRG1
G-408 M - del 04q35.2 FRG1 G-92 F del 04q35.2 del 04q35.2 TRIML2 and FRG1
dup 05q35.3 dup 05q35.3 GNB2L1 G-158 M del 04q35.2 del 04q35.2 TRIML2 and FRG1
dup Xq28 dup Xq28 SYBL1
Table II. Genomic alterations found by arrays. ID ALTERATION CHROMOSOME SIZE (bp) PLATAFORM
G-15 del 4q32.1-q35.2 29.256.942 Illumina - CytoSNP-12
dup 5p15.2 378.848 G-92 del 4q34.3-q35.2 10.828.597 Agilent 180K
dup 5q34-q35.3 20.563.537 G-148 del 4p16.3-p16.1 9.322.625
Illumina - CytoSNP-12 dup 8p23.3-p23.1 6.797.232 dup 12p13.31 155.948 dup 12p11.21 169.245
G-158 del 2p11.2 219.910 Illumina - CytoSNP-12 del 4q35.1-q35.2 5.059.373
dup Xq27.1-q28 15.415.642 Table III. Genes found deleted by array analysis in 4p that play roles in the development or function of nervous system
Gene Role in: ADRA2C neuron projection CPLX1 neurotransmitter transport
neurological system process CRMP1 neuron projection HTT
neuron differentiation regulation of neurological system process regulation of neuron apoptosis negative regulation of neuron apoptosis neuron development neurological system process neuron projection
PDE6B neurological system process SORCS2 neuropeptide signaling pathway
neuropeptide binding neurotransmitter receptor activity neurotransmitter binding
SPON neuron differentiation neuron projection development neuron development neuron projection morphogenesis
WFS1 regulation of neuron apoptosis negative regulation of neuron apoptosis neuron projection
Table IV. Genes found deleted by array analysis in 4q that play roles in the development or function of nervous system Gene Role in: CASP3 neurological system process
neuron apoptosis CYP4V2 neurological system process
Figure 1. Circos plots illustrating the chromosome and CNV alterations. Chromosome ideograms are shown in the outer-most ring of the circos plot. The triangles represent the alterations found by MLPA, blue means deletion and red means duplication. The area in green are the regions contemplate by arrays. The other rectangles mean the array results, from outside to inside: 1 and 2 - homozygotic deletions; 3 and 4- hemizygotic deletions; 5 and 6- duplications.
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Mol Genet GenomicsDOI 10.1007/s00438-014-0876-7
REVIEW
Complex structural rearrangement features suggesting chromoanagenesis mechanism in a case of 1p36 deletion syndrome
Évelin Aline Zanardo · Flavia Balbo Piazzon · Roberta Lelis Dutra · Alexandre Torchio Dias · Marília Moreira Montenegro · Gil Monteiro Novo-Filho · Thaís Virgínia Moura Machado Costa · Amom Mendes Nascimento · Chong Ae Kim · Leslie Domenici Kulikowski
Received: 8 October 2013 / Accepted: 2 June 2014 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014
duplication interspaced by normal sequences. We also sug-gest that chromoanagenesis could be a possible mechanism involved in the repair and stabilization of this rearrangement.
Keywords Complex structural rearrangement · Chromoanagenesis · 1p36 syndrome · Copy number variation · Cytogenomic techniques
Introduction
The human genome can be modulated by several muta-tional mechanisms that occasionally result in structural var-iation and thus congenital alterations and disease (Kloost-erman et al. 2011; Sobreira et al. 2011). Some genome rearrangements are caused by the erroneous repair of DNA double-strand breaks (DSBs), generating deletions,
Abstract Genome rearrangements are caused by the erro-neous repair of DNA double-strand breaks, leading to several alterations that result in loss or gain of the structural genomic of a dosage-sensitive genes. However, the mechanisms that promote the complexity of rearrangements of congenital or developmental defects in human disease are unclear. The investigation of complex genomic abnormalities could help to elucidate the mechanisms and causes for the formation and facilitate the understanding of congenital or develop-mental defects in human disease. We here report one case of a patient with atypical clinical features of the 1p36 syn-drome and the use of cytogenomic techniques to character-ize the genomic alterations. Analysis by multiplex ligation-dependent probe amplification and array revealed a complex rearrangement in the 1p36.3 region with deletions and
Communicated by S. Hohmann.
É. A. Zanardo · F. B. Piazzon · R. L. Dutra · A. T. Dias · M. M. Montenegro · G. M. Novo-Filho · T. V. M. M. Costa · A. M. Nascimento · L. D. Kulikowski (*) Department of Pathology, Laboratório de Citogenômica, LIM 03, Universidade de São Paulo, Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 155, 2° floor, block 12, Cerqueira César, São Paulo, SP CEP: 05403-000, Brazile-mail: [email protected]
É. A. Zanardo e-mail: [email protected]
F. B. Piazzon e-mail: [email protected]
R. L. Dutra e-mail: [email protected]
A. T. Dias e-mail: [email protected]
M. M. Montenegro e-mail: [email protected]
G. M. Novo-Filho e-mail: [email protected]
T. V. M. M. Costa e-mail: [email protected]
A. M. Nascimento e-mail: [email protected]
É. A. Zanardo · R. L. Dutra · M. M. Montenegro · G. M. Novo-Filho · A. M. Nascimento · C. A. Kim · L. D. Kulikowski Department of Pediatrics, Instituto da Criança, LIM 36, Universidade de São Paulo, Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 647, 5° floor, Cerqueira César, São Paulo, SP CEP: 05403-000, Brazile-mail: [email protected]
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duplications, inversions, and translocations (Holland and Cleveland 2012).
One of the most common subtelomeric microdele-tion syndromes, the monosomy 1p36 syndrome (OMIM 607872), is characterized by a variety of chromosomal rearrangements (terminal deletions, interstitial deletions, derivative chromosomes, and complex rearrangements) (Heilstedt et al. 2003; Gajecka et al. 2007; Giannikou et al. 2012) and consequently phenotypic complexity because it is very difficult to correlate the set of different alterations found in a single patient with the clinical phenotype (Chen et al. 2008). Therefore, many patients with 1p36 deletion syndrome associated with variable phenotype have sev-eral rearrangements, most likely with cryptic complex alterations.
The development of cytogenomic techniques, such as high-density arrays and next-generation sequencing tech-nologies (Kloosterman et al. 2011; Chiang et al. 2012), has allowed the detection of complex genomic rearrangements (CGR) and cryptic breakpoints. Thus, many CGR detected to date might actually be more complex than initially thought (Zhang et al. 2009; Quinlan and Hall 2012).
In some studies, CGR in the 1p36 region were detected ranging from 6.7 to 12.5 % (Shaffer et al. 2006; Gajecka et al. 2007). Although the understanding of the genetic architecture of chromosomal alterations has recently expanded with hypotheses about the mechanisms for the formation of such CGR, many of which involve some degree of homology (Colnaghi et al. 2011; Chiang et al. 2012), these mechanisms have remained elusive.
Different mechanisms were suggested to explain the formation of such rearrangements, one of them is the NHEJ repair resulting in end-to-end fusion with little or no sequences of homology in the breakpoints or the microho-mology-dependent BIR when a single end of a DSB invades a DNA duplex at any chromosome location, based on few nucleotides of homology (D’Angelo et al. 2009; Hastings et al. 2009). Recently, several authors have described a novel class of genomic rearrangement in which numerous copy number alterations and multiple breakpoints concen-trated on a single chromosome or region are apparently acquired in one single catastrophic event (Stephens et al. 2011; Holland and Cleveland 2012). According to Kloost-erman and colleagues, this catastrophic event may generate structural variation in the germline that results in congenital defects; regardless, the mechanisms behind these cataclys-mic genome disruptions are unknown (Kloosterman et al. 2011; Liu et al. 2011; Maher and Wilson 2012).
The investigation of complex genomic abnormalities could help to elucidate the mechanisms and causes for the formation and facilitate the understanding of congenital or developmental defects in human disease. Thus, we here
report one case of a patient with some clinical features of the 1p36 syndrome and the use of cytogenomic techniques to characterize the size and breakpoint of the alterations. We also consider the mechanisms underlying the forma-tion of the complex rearrangements to better understand the phenotypic variability.
Clinical/case report
The patient is the second child of healthy parents. She was born pre-term at 36 5/7 weeks of gestation. At birth, she weighed 2.175 kg; her head circumference was 33 cm, and length was 45 cm. In her first evaluation she presented growth retardation, hypertrichosis, hypotonia, hypothyroid-ism, and seizures. Notable findings on physical examina-tion included a prominent forehead, epicanthus, ocular hypertelorism, low-set ears, anteverted nares, ogival palate, delayed dentition, fifth finger clinodactyly of the hands, and overlapping of the third to the second toe. She pre-sents some atypical findings as hypertrichosis, synophrys, prominent supra orbital ridges, straight eyebrows, long and prominent philtrum and a deep sacral pit. The Brainstem electric response audiometry (BERA) test showed sensori-neural hearing loss. The echocardiogram at 1 month of age revealed stenosis of the left pulmonary artery, with signifi-cant hemodynamic effects; the patient underwent surgical correction at 6 months, with a good outcome.
Methods
Cytogenetic analysis
To identify numerical and structural chromosomal abnor-malities, metaphase chromosomes from the patient and her parents were obtained from peripheral blood lymphocyte samples, and GTG banding was performed using standard procedures. Twenty metaphases at 550-chromosome band resolution (≥5 Mb) were analyzed and classified according to International System for Human Cytogenetic Nomencla-ture 2013 (ISCN) guidelines.
Molecular analysis
Genomic DNA from the patient and her parents was iso-lated from 3 mL of peripheral whole blood using a com-mercially available DNA isolation kit (QIAamp DNA Mini Kit) (Qiagen) in accordance with the manufacturer’s instructions. The quality and quantity of the DNA samples were determined using a NanoVue Plus Spectrophotometer (GE Healthcare Life Sciences).
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MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
The genomic DNA of the proband and her parents were screened with three MLPA kits: one for the most com-mon microdeletion/microduplication syndromes-SALSA P064 Mental Retardation 1, which includes the probes TNFRSF18, TNFRSF4, SCNN1D, GNB1, SKI, PANK4 (FLJ10782), TP73 for the 1p36 region; and two for sub-telomeric imbalances-ALSA P036 Human Telomere, which includes the probe TNFRSF4 for the 1p subtelomere and P070 Human Telomere with the probe TNFRSF18 for the same subtelomere (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) (Fig. 1c).
The steps of DNA denaturation, hybridization of MLPA probes, ligation, and PCR reactions were performed according to the manufacturer’s instructions, as described in Schouten et al. (2002). The separation of amplification products by electrophoresis was performed using an ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®), and the data were analyzed using GeneMarker® software, version 1.6 (www.softgenetics.com-Softgenetics, LLC, State Col-lege, PA, USA).
The peak area of each fragment was compared to that of a control sample, and the results were considered abnormal when the relative peak height ratio was below 0.75 (dele-tion) or above 1.25 (duplication). The details of the regions detected by each kit can be found at www.mlpa.com.
SNP array analysis
The SNP array of the patient was performed using the Affy-metrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (1.8 million genetic markers), which contains 906,600 single-nucleotide polymorphism probes (SNPs) and over 946,000 probes for
the detection of copy number variations, with a median physical inter-marker distance of 680 bp (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). The manufacturer’s recommended protocol (http://media.affymetrix.com/support/ downloads/manuals) was followed.
The data were analyzed using Affymetrix Chromosome Analysis Suite (ChAS) Software, version 1.2 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA). The genomic positions are given as mapped to the GRCh37/hg19 genome build.
Real-time PCR
Regions of DNA normal copy number identified by SNP array were confirmed using the StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied-Biosystems) and the DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (Thermo Scientific, Lituania). The amplification mixtures (20 μL) contained DyNAmo™ ColorFlash master mix (1X), ROX™ (1X), 0.37 μM of each forward and reverse primer, and 20 ng of template DNA, and final volume was adjusted with ster-ile water. The PCR cycling conditions were as follows: 10 min at 95 °C, 40 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min, and the dissociation curve was realized at 60–95 °C. The primer sequences are shown in Table 1. Each assay included a no-template control, a normal control DNA used as a calibrator (evaluated previously by SNP-array and without any copy number change), the test sample DNA, and the albumin gene as endogenous control (them all in triplicate).
The results were expressed as the threshold cycle (Ct). We compared the Cts means to determine the differences and thus to relate the copy numbers in the region studied of the test sample with the normal control: Quantification target (test sample) = target (Ct)/endogenous control (Ct);
Fig. 1 Results of MLPA technique. In (a) are the probes presents in the 1p36 region by the P064 kit. In gray are the probes considered deleted and indicated by the red arrow is the probe TP73 considered normal. In (b) is the graphic of the MLPA reaction with all probes used in the P064 kit, and those that are between green lines are the probes that no show copy number variation and those below the green line (below 0.5 ratio) correspond to deletion and they are all in the 1p36 region. And the figure (c) show all probes evaluated in the region 1p36 by the P036, P070 and P064 kits
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Quantification target (normal control) = target (Ct)/endog-enous control (Ct). If the result of the comparison between the test sample with the normal control is similar, then we suggest both samples have the same number of copies, but if the result of the test sample is half or twice of the nor-mal control, a deletion or a duplication, respectively, is suggested.
Results
Cytogenetic and molecular cytogenetic analysis
GTG band analysis showed a normal karyotype in the child and her parents. To confirm the suspected diagnosis of 1p36 syndrome, we initially performed MLPA that revealed nor-mal results for both parents and an unexpected result for the probando.
The MLPA assay using the P070 and P036 kits with subtelomeric probes showed deletions of the TNFRSF4 and TNFRSF18 probes at 1p36.33, whereas the P064 kit revealed an atypical deletion of all probes investigated in the region 1p36, except the TP73 probe, presenting a nor-mal copy number (Fig. 1). Subsequently, to better deline-ate the deletion detected by the MLPA, a genomic analysis by SNP array was performed, which showed multiple copy number changes involving a single chromosome region, including normal genomic regions intercalated with regions deleted (~1.9 and ~1 Mb) and duplicated (~0.2 Mb).
We observed a normal copy subtelomeric sequence, followed by a deletion (~1.9 Mb—564,620–2,456,203),
followed by a normal copy sequence (~17 kb), followed by another deletion (~1 Mb—2,473,257–3,446,813), followed by a normal copy sequence (~27 kb), and followed by a duplication (~0.2 Mb—3,474,630–3,641,681) at the 1p36 region (Figs. 2, 3) (Table 2).
The normal copy sequences were confirmed by Real-time PCR, of which the comparison of the quantification target in the test sample and normal control were similar for the both normal regions (17 and 27 kb) (Tables 3, 4).
Discussion
The main clinical features of 1p36 syndrome include devel-opmental delay, mental retardation, hypotonia, seizures, cardiac defects, microcephaly, hearing impairment and dis-tinct dysmorphic features (Gajecka et al. 2007; Chen et al. 2008; Fitzgibbon et al. 2008; Giannikou et al. 2012). How-ever, the overlapping of variable clinical findings may have contributed to a low ascertainment rate of the alterations in some patients. In these cases, the diagnosis was most likely completed using low-resolution techniques, such as cytoge-netic or fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis only, and the evaluation of the patient as having or not hav-ing a deletion, without considering possible CGR, map breakpoints, or phenotype correlation with actual changes. Consequently, such alterations have been under-diagnosed (Gajecka et al. 2007; Fitzgibbon et al. 2008).
The clinical features in the 1p36 syndrome are hetero-geneous and not all patients exhibit the same characteris-tics. The patient evaluated in this study has clinical features
Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR reactions
Region Forward primer Reverse primer Localization
17 kb normal region GGCTCTCGTCTTTAGGGGTG TGGAAAGGGCCGAGGATTTC Chr1: 2,467,205–2,467,280
27 kb normal region ATGTGCTCGTCAGTGGAGTG AACTGTGGCTCAACTCTGGG Chr1: 3,468,632–3,468,725
Fig. 2 Results of SNP array technique. The red regions correspond to deletions of ~1.9 and ~1 Mb; and the blue region corresponding to duplication of 0.2 Mb
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present in most of patients with the 1p36 syndrome; how-ever, she does not have all of the features described in this syndrome. Furthermore, she has some atypical features, as hypertrichosis, synophrys, prominent supra orbital ridges, straight eyebrows, long and prominent philtrum and a deep sacral pit. This clinical variability could be explained by complex alterations in the 1p36 region. To date some cases
of CGR described were associated with an abnormal phe-notype. These patients with CGR at the 1p36 region pre-sent deleted sequences followed by duplicated sequences or deleted sequence between two duplicated sequences (Chen et al. 2008; D’Angelo et al. 2009).
The identification of cryptic complex changes is pos-sible using advanced cytogenomic techniques, which have expanded the understanding of the genetic architecture of human chromosomal rearrangements and the variety of clinical phenotypes (Fitzgibbon et al. 2008). The array technology is a high-throughput method used to detect small copy number changes within the genome and to define with accuracy the breakpoints of rearrangements (Chen et al. 2008; Fitzgibbon et al. 2008; Giannikou et al. 2012).
Liu and collaborators described 17 cases with CGR pat-terns by array comparative genomic hybridization of differ-ent chromosomes and correlated the rearrangements with the standard of catastrophic changes described recently in cancer (Liu et al. 2011).
On investigation of the patient, two deletions of less than 2 Mb and one duplication of approximately 167 kb, sepa-rated by a normal region of 17 and 27 kb, were detected (Figs. 2, 3). This pattern of alteration shares similarities with a phenomenon termed chromoanagenesis (chromo for chromosomes and anagenesis for rebirth) in which the mechanism termed chromothripsis (from Greek chromo for chromosomes and thripsis for shattering) can occur via a single event, generating a cellular crisis in which distinct chromosome or chromosomal regions become fragmented into many parts that are then pieced together incorrectly.
Fig. 3 Scheme of alterations present in the patient evaluated in this study by the SNP-array technique. The blue rectangles represent no copy number change and they are considered normal (Nml); the red rectangles represent the deleted segments and the green represents
the duplicated segments. The dotted rectangles refer to the location of the MLPA probes, all of which are located in the largest rectangle, with the exception of TP73 probe that is located immediately after the duplicated region viewed in the array
Table 2 Details of the genomic localization (start and end) and size of the copy number in the 1p36 region by SNP array
According the UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps), DECIPHER (https://decipher.sanger.ac.uk/) and DGV Database of Genomic Variants- (http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)
Genome Start End Size
Normal 0 564,620 564,620 bp
Deletion 564,620 2,456,203 1,891,584 bp
Normal 2,456,203 2,473,257 17,055 bp
Deletion 2,473,257 3,446,813 973,557 bp
Normal 3,446,813 3,474,630 27,818 bp
Duplication 3,474,630 3,641,681 167,052 bp
Table 3 Quantitative real-time PCR results
Region Ct mean of test sample
Ct mean of normal control
17 kb normal region ~24.34 ~23.67
27 kb normal region ~22.87 ~23.91
Endogenous control ~19.70 ~19.76
Table 4 Comparison of the Ct mean between the target and endogenous control for the 17 and 27 kb normal region
Region Quantification target (test sample)
Quantification target (normal control)
Difference of the quantification target
17 kb normal region ~1.24 ~1.20 ~0.04
27 kb normal region ~1.16 ~1.21 ~0.05
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Alternatively, the mechanism termed chromoanasynthesis (chromo for chromosomes and anasynthesis for reconsti-tution), produced by serial microhomology-mediated tem-plate switching during DNA replication, can occur (Liu et al. 2011; Stephens et al. 2011; Forment et al. 2012; Hol-land and Cleveland 2012).
Chromothripsis occurs after several DSBs concentrated in a region of the genome, with the many pieces randomly reassembled by NHEJ (non-homologous end joining) in a way that does not necessarily relate to their original order or orientation (Stephens et al. 2011; Forment et al. 2012). This mechanism generates complex rearrangements formed by the incorrect ligation of ends with little or no sequence of homology and the insertion of some nucleotides, with the further loss of some fragments to generate deletions (Kloosterman et al. 2011; Holland and Cleveland 2012).
The other mechanism that can be involved in the forma-tion of complex rearrangements is chromoanasynthesis, which is generally involved in constitutional rearrange-ments that show complexity, microhomology at break-points, and occasionally the fusions of distant sequences and is indicative of a DNA replication-based mechanism as the causative agent, including fork stalling and tem-plate switching (FoSTeS) and/or microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) (Zhang et al. 2009; Liu et al. 2011; Chiang et al. 2012; Holland and Cleveland 2012).
FoSTeS occurs when the DNA replication forks stall due to a DNA lesion or an error, allowing the replication fork to invade another fork through an area of microhomology. This process may repeat multiple times, leading to serial tem-plate switching before the completion of DNA synthesis on the original template. Although the new template strand is placed in physical proximity to the original replication fork, they may be separated by large stretches of DNA sequences and can be on the same or different chromosomes. This pro-cess can generate deletions, duplications, triplications, and insertions, and the orientation and complexity of the erro-neously synthesized fragments depend on the direction of the initial invasion and of the serial engagement of FoSTeS (Zhang et al. 2009; Colnaghi et al. 2011; Forment et al. 2012; Holland and Cleveland 2012).
The second mechanism involved in chromoanasynthesis is MMBIR, which is initiated when a replication fork col-lapses after encountering a nick/single or DSBs. The end of the DNA DSBs then invades a DNA sequence with micro-homology and establishes a replication fork. This event can be repeated in adjacent regions, resulting in CGR, with replication eventually continuing to the end of the chromo-some (Colnaghi et al. 2011; Holland and Cleveland 2012).
Although chromoanasynthesis involving the replication-based mechanism FoSTeS and MMBIR is the most likely explanation for the generation of constitutional complex
rearrangements in patients with congenital or develop-mental abnormalities, chromosome shattering by chromo-thripsis and replaced together by NHEJ is also involved in some germline cases, depending on the breakpoint fea-tures and the complexity of the alterations (Holland and Cleveland 2012; Maher and Wilson 2012). Kloosterman analyzed multiple rearrangements in patients with con-genital abnormalities and associated with non-homologous mechanisms of break repair, and the breakpoint junctions exhibited microhomology, a lack of homology, or small insertions and deletions (Kloosterman et al. 2011). In con-trast, Liu observed similarity with a replicative process, such as FoSTeS or MMBIR, in small template insertions and microhomology at the breakpoint junctions of rear-rangements (Liu et al. 2011). Based on our analysis of the patient in this study, we suggest that the most likely mechanism involved in complex rearrangements could be FoSTeS/MMBIR associated with chromoanasynthesis, due to the pattern of alterations, with deletions and duplica-tions separated by normal sequences without more complex changes, such as triplication, or involvement with another chromosomal region or chromosome. The understanding of these mechanisms may provide insight regarding genomic syndromes, such as how and why rearrangements occur and the clinical consequences. Independently of the under-lying mechanism, the genome of patients with atypical features should be better investigated using advanced tech-niques to correlate the alterations with the phenotype and to improve the diagnosis and clinical ascertainment. Thus, analysis of additional cases using next generation sequenc-ing may yield information as to whether FoSTeS/MMBIR associated with chromoanasynthesis are the mechanism most appropriate for the formation of the CGR.
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CASE REPORT Open Access
Discrepant outcomes in two Brazilian patientswith Bloom syndrome and Wilms’ tumor: twocase reportsMarilia Borges Moreira1,2,3*, Caio Robledo DC Quaio1, Aline Cristina Zandoná-Teixeira1, Gil Monteiro Novo-Filho1,Evelin Aline Zanardo1, Leslie Domenici Kulikowski2 and Chong Ae Kim1
Abstract
Introduction: Bloom syndrome is a rare, autosomal recessive, chromosomal instability disorder caused bymutations in the BLM gene that increase the risk of developing neoplasias, particularly lymphomas and leukemias,at an early age.
Case presentation: Case 1 was a 10-year-old Brazilian girl, the third child of a non-consanguineous non-Jewishfamily, who was born at 36 weeks of gestation and presented with severe intrauterine growth restriction. She hadBloom syndrome and was diagnosed with a unilateral Wilms’ tumor at the age of 3.5 years. She responded well tooncological treatment and has remained disease-free for the last 17 years. Case 2 was a 2-year-old Brazilian girl bornto non-Jewish first-degree cousins. Her gestation was marked by intrauterine growth restriction. She had Bloomsyndrome; a unilateral stage II Wilms’ tumor was diagnosed at the age of 4 years after the evaluation of a suddenonset abdominal mass. Surgical removal, neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy were not sufficient tocontrol the neoplasia. The tumor recurred after 8 months and she died from clinical complications.
Conclusion: Our study reports the importance of rapid diagnostics and clinical follow-up of these patients.
Keywords: Bloom syndrome, Cancer risk, Chromosomal instability, Sister chromatid exchange, Wilms’ tumor
IntroductionBloom syndrome (BS; Online Mendelian Inheritance inMan database, number 210900) [1] is a rare, autosomalrecessive, chromosomal instability disorder [2] caused bymutations in the BLM gene, which encodes a productnecessary for the maintenance of genomic stability [3].The prominent clinical features associated with BS in-clude severe growth deficiency (pre- and postnatal), sun-sensitive facial erythema, immunological deficiency anda remarkably increased risk of developing neoplasias ofvarious types at a younger age than expected in the gen-eral population; the neoplasias are the main cause ofdeath among affected individuals [4,5].
Among the 265 cases of BS reported in the Bloom’sSyndrome Registry (which includes 222 families), 122developed some type of neoplasia during their lives; leu-kemias, lymphomas and carcinomas were common, butseveral other cancers have been reported [4,5]. Thesepatients all present a remarkably increased frequency ofsister chromatid exchange (SCE). The cancer predispos-ition in patients with BS can be attributed to excessivechromosomal breakage and homologous recombinationevents that lead to spontaneous mutations in the somaticcells and defective damage response functionality [6].Wilms’ tumor (WT) is the most common pediatric
solid cancer; it has been estimated to occur in 1:10,000children below the age of 15 years and was once consid-ered a rare event among patients with BS [7]. Neverthe-less, six patients with BS who developed this tumor havebeen described previously in the literature [8-11].Here we report the cases of two new unrelated Brazilian
patients diagnosed with BS who developed WT.
* Correspondence: [email protected] Unit, Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade deMedicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil2Department of Pathology, Cytogenomic Laboratory – LIM03 – Hospital dasClínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo,SP, BrazilFull list of author information is available at the end of the article
JOURNAL OF MEDICALCASE REPORTS
© 2013 Moreira et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an open access article distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, andreproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Moreira et al. Journal of Medical Case Reports 2013, 7:284http://www.jmedicalcasereports.com/content/7/1/284
Case presentationCase 1A 10-year-old Brazilian girl, the third child of a non-consanguineous, non-Jewish family, was born at 36 weeksof gestation and was marked by severe intrauterine growthrestriction. After resolving the clinical complications ofher extreme low birth weight (BW) of 1500g, she was dis-charged from the hospital; however, despite presentingnormal cognitive development during the first year of herlife, a remarkable, refractory failure to thrive was noted.She had recurrent diarrhea and upper and lower respira-tory tract infections by the age of 1 year and requiredprophylactic antibiotics. A WT was diagnosed in her leftkidney after evaluating an abdominal mass at the age of3.5 years. She underwent surgical removal of the mass andneoadjuvant chemotherapy (unknown regimen).The first genetic evaluation occurred at age 10 when a
physical examination revealed features characteristic ofBS, including facial features (elongated face, prominentnose, prominent ears, malar hypoplasia, and thin uppervermilion), microcephaly, nose telangiectasias, hypomela-notic macules in her upper limbs and clinodactyly of herbilateral fifth fingers. Her anthropometric measurementswere all below the fifth percentile (weight (W) 15.9kg,height (H) 116cm, and occipital-frontal circumference(OFC) 46cm; Centers for Disease Control and Preventiongrowth charts, National Center for Health Statistics,USA), and she had developed learning disabilities.A cytogenetic test was performed to examine the
frequency of SCE using bromodeoxyuridine (BrdU) inlymphocyte cultures. The results demonstrated an in-creased frequency of SCE, with an average of 48.5 SCEper cell (Figure 1A). The G-band karyotype was normal(46, XX).She responded well to oncological treatment and has
remained disease-free for the last 17 years. Currently, atthe age of 21, all of her anthropometric measurementscontinue to be below the standards for the normal popu-lation (H: 140cm; W: 26.4kg; and OFC: 47cm).
Case 2The gestation of a 2-year-old Brazilian girl, who wasborn to non-Jewish first-degree cousins, was marked byintrauterine growth restriction. Vaginal delivery occurredat term with no complications. The neonate had a lowBW of 2060g, microcephaly (OFC: 30.5cm) and a nor-mal length (45.5cm); her anthropometric measurementswere all below the fifth percentile. A physical examinationat the age of 2 years revealed a short stature (78cm), lowW (8.1kg), and microcephaly (OFC: 45cm); her anthropo-metric measurements were all below the fifth percentile.Features characteristic of BS, including facial features (long,narrow face; telangiectasic erythema involving her nose,malar and oral regions; prominent nose; and retrognathia),
café-au-lait macules throughout her body, diffuse hypome-lanotic macules, and bilateral fifth finger clinodactyly, wereidentified. Recurrent upper respiratory tract infectionswere common, but she had not experienced any serious in-fection or required prophylactic antibiotic use.A stage II unilateral WT was diagnosed at the age of 4
years after the evaluation of a sudden onset abdominalmass. Surgical removal, neoadjuvant chemotherapy andradiotherapy were not sufficient to control the neoplasia.The tumor recurred after 8 months, and the patient diedfrom clinical complications.A cytogenetic test was performed to examine the fre-
quency of SCE using BrdU in lymphocyte cultures. Theresults demonstrated an increased frequency of SCE,with an average of 49.5 SCE per cell (Figure 1B). The G-band karyotype was normal (46, XX).
DiscussionWe described two Brazilian patients affected by BS whoeach developed a WT at a young age. These two cases,along with the other six described in the literature(Table 1) [8-11], increase the estimated frequency of WTin individuals with BS to at least 3%, a 300-fold increasein the risk relative to the general pediatric population.BS is caused by mutations in the BLM gene, whose
product is a 1417-amino acid protein that belongs to theRecQL helicase group and plays important roles in repli-cation, recombination and cellular repair. Upon alteration,BLM loses its function and causes genomic instability andan increased rate of spontaneous mutations in somaticcells, primarily by SCE [3]. Cytogenetic analyses of cases 1and 2 have demonstrated an increase in the frequency ofexchange between sister chromatids, which is pathogno-monic for BS and confirmed the diagnosis of BS [12]. Un-equal crossing-over has probably played a major role inthe evolution of various genes and heterochromatin. Hy-permutability and the hyperrecombinability of somaticcells leads to an increased chance of homozygous tumorsuppressor genes and/or oncogenes being affected and,consequently, increases the rate of the development of awide variety of neoplasias at an early age [5,8]. In somecases, retinoblastoma and WT are associated with thehomozygosity of a chromosome segment resulting from amitotic crossover. Similarly, the high incidence of cancerin BS may be caused by a mitotic crossover that leads tohomozygosity or the amplification of oncogenes.The literature [13] describes that two events lead to
the formation of WT. First, the child inherits one gen-omic alteration, and a second event occurs in the childthat would be caused easily in BS because of the highrate of genomic exchanges. Nevertheless, if recombin-ation in BS occurs as a defect in the repair machinery,maybe there is another mechanism that may contributeto the formation of tumors and cancer.
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New technological advances in array-based genomicsrevealed the contribution of structural alterations in thehuman genome to several different diseases, includingcancer (both solid and hematologic tumors) [14]. In fact,certain copy number variations (CNVs) potentially com-promise fundamental processes controlling genomic sta-bility, including deoxyribonucleic acid (DNA) replicationand the DNA damage response, and have been reportedto be associated with the response to chemotherapy,
which affects the disease prognosis [12]. From a clinicalperspective, CNVs might interfere in the DNA damageresponse and create a permissive environment for theacquisition of additional pathogenic alterations, such asan individual’s predisposition to cancer [15].Furthermore, recently, Stephens and colleagues recently
described a novel mechanism of genomic rearrangementin cancer cells, termed ‘chromothripsis’, that associates spe-cific CNVs and their contribution to cancer development.
Figure 1 The picture demonstrates the manifold increase of sister chromatid exchange in Case 1 (A) and Case 2 (B). The arrowsexemplify some points of sister chromatid exchange. The lymphocyte cultures were treated with bromodeoxyuridine and staining withHoechst 33258-Giemsa.
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Chromothripsis arises through chromosome breakage andinaccurate reassembly, produces highly complex derivativechromosomes, and causes oncogene amplification. A disas-ter of this magnitude could possibly affect both WT allelesbecause patients with BS demonstrate susceptibility forbreaks in the genome [16].In our study, both patients developed WT before 4
years of age; however, despite both patients undergoingsurgical removal of the mass and chemotherapy, thetreatment results were different. The patient describedin case 2 (stage II WT) had a fatal outcome after the re-currence of the disease, but the patient described in case1 has remained disease-free after 17 years of follow-up.All reported cases of WT in patients with BS in the lit-erature and the two cases described here occurred in pa-tients aged 8 years or less.WT has been previously reported in six cases of BS in
the literature [8-11]. The age at which WT was diag-nosed ranged from 5 months to 8 years. Two of thesecases were diagnosed at early stages (stages I and II) andhad apparently been cured by nephrectomy and chemo-therapy. Although patients with BS develop cancer atearly ages, the age of onset of WT is the same in litera-ture reports of patients without previous medical histor-ies who are under the age of 15 years and in patientswith BS [17].Thus, the frequency of WT in patients with BS is con-
siderable. Clinicians need to be more aware of this fact,particularly because the occurrence of WT in patientswith BS was once presumed to be rare. This frequencysummed with the frequencies of other solid tumors inpatients with BS increases the overall frequency of solidtumors to approximately 12% [5]. Unfortunately, insuffi-cient attention is given to this group of tumors in pa-tients with BS.Beckwith–Wiedemann syndrome is a prototype gen-
etic disease with an increased risk of the development ofearly onset solid cancers, mainly WT and hepatoblastoma,with a total estimated lifelong risk for solid tumors of
7.5% [18]. This increased risk has prompted specialists toseriously consider solid tumor surveillance because sur-veillance has been demonstrated to reduce treatment-related morbidity. Renal ultrasonography is currently theoptimal surveillance modality and is accessible, is non-invasive and has minor risks [19]. However, this methodmay have unfavorable consequences because false positiveresults may lead to unnecessary investigations and surgicalprocedures.Although the evidence does not show benefits for
leukemia screening in patients with BS because earlytreatment does not improve clinical outcomes, surveil-lance for solid tumors may have significant advantagesand improve survival [9,10]. In addition, the frequencyof solid tumors in patients with BS is approximately thesame as that for patients with Beckwith–Wiedemannsyndrome, and a screening program has been demon-strated to be feasible in the latter patients. Thus, we sug-gest that ultrasound be performed as a regular methodof surveillance for the early detection of solid tumors inindividuals with BS because the early detection of thesetumors may have clinical benefits. The frequency of thistype of screening must be individualized, but the perform-ance of an ultrasound examination at least every 6 monthsis advisable based on the vast experience with Beckwith–Wiedemann syndrome reported in the literature.Cytogenetic analyses for SCE are the gold standard
method for the diagnosis of BS. Cytogenetic analysis isconsidered a fast and low-cost method to confirm thediagnosis of BS, and this methodology can be imple-mented in routine and diagnostic laboratories. Regard-less, other molecular studies will also be conducted inliving patients.
ConclusionsBS is a rare, autosomal recessive, chromosomal instabil-ity disorder with remarkably increased risk for develop-ing neoplasias at a young age. The neoplasias representthe main cause of death among affected individuals.Awareness of the high frequency of solid tumors amongpatients affected by this disorder must be raised becausethese individuals may benefit from individualized screen-ing for solid tumors, including WT.
ConsentWritten informed consent was obtained from the pa-tients’ legal guardians for the publication of this manu-script and the accompanying images. Copies of thewritten consents are available for review by the Editor-in-Chief of this journal.
Competing interestsThe authors’ declare that they have no competing interests.
Table 1 Patients affected by Bloom syndrome associatedwith Wilms’ tumor
Ashkenazim Consanguinity Age at diagnosisof WT
References
1 No No 3.5y Our patient
2 No Yes 4y Our patient
3 Yes No 8y [8]
4 No No 5m [8]
5 No No 22m [8]
6 No No 4y [9]
7 Not mentioned Not mentioned 3y [10]
8 No No 3.5y [11]
Abbreviations: m months, WT Wilms’ tumor, y years.
Moreira et al. Journal of Medical Case Reports 2013, 7:284http://www.jmedicalcasereports.com/content/7/1/284
Authors’ contributionsMBM performed cytogenetic studies and wrote the paper. CRDCQ and CAKcollected the patients’ clinical data. ACZT, GMNF and EAZ performed thecytogenetic studies. LDK and CAK coordinated the study and helped draftthe manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
AcknowledgementsThe authors thank the patients and their families, as well as Coordenação deAperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior for financial support.
Author details1Genetics Unit, Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade deMedicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil. 2Department ofPathology, Cytogenomic Laboratory – LIM03 – Hospital das Clínicas daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.3Unidade de Genética do Instituto da Criança, HC – FMUSP, Av. Dr. EnéasCarvalho de Aguiar, 647, CEP: 05403-000, São Paulo, SP, Brazil.
Received: 12 March 2013 Accepted: 21 October 2013Published: 30 December 2013
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doi:10.1186/1752-1947-7-284Cite this article as: Moreira et al.: Discrepant outcomes in two Brazilianpatients with Bloom syndrome and Wilms’ tumor: two case reports.Journal of Medical Case Reports 2013 7:284.
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Moreira et al. Journal of Medical Case Reports 2013, 7:284http://www.jmedicalcasereports.com/content/7/1/284