GeneXpert MTB/RIFGeneXpert MTB/RIF

GeneXpert MTB/RIF

• teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)

• permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB)

• baseado na técnica de PCR em tempo real

Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)

• Um das principais ferramentas de biologia molecular

• Desenvolvida por Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química

Importância dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) na síntese de DNA

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

5’3’

3’5’

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

3’5’

5’3’

94ºC

PCRMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

3’5’

5’3’5’

5’

Melting94 oC

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

30x

3’5’

5’3’

94ºC

94ºC

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

30x

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

30x

5’

5’

5’

5’

94ºC

94ºC

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

30x

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragmentos de tamanho definido

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnelamento

50 oC

Extensão72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

T e m p o

30x

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Mais Ciclos = Mais DNANúmero de ciclos

0 10 15 20 25 30

30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas

Amplificação

Permite aumentar a quantidade Permite aumentar a quantidade de uma determinada amostrade uma determinada amostra

Pode aumentar a quantidade Pode aumentar a quantidade de um contaminantede um contaminante

DNA polimerase de DNA polimerase de E. coliE. coli

DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável

Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)

extensãoextensão desnaturaçãodesnaturaçãoanelamentoanelamento

Breve Histórico

• O primeiro termociclador foi desenvolvidona Cetus Corp. – Mr Cycle• Projetado para que a DNA polimerasepudesse ser adicionada a cada ciclo

Yellowstone National Park

DNA Polimerase Termoestável

• 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

• Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo a primeira DNA polimerase termoestável

Taq DNA polimerase (1976)

Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC

Kary Mullis

Prêmio Nobel de Química em 1993

1. Template (molde) (1–500 ng).2. Primers (0.05–1.0 μM).3. Mg2+ (0.5–5 mM).4. dNTP (20–200 μM cada).5. 1× PCR buffer 6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).

Componentes de uma reação de PCRComponentes de uma reação de PCR

PCR “padrão”PCR “padrão”

Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA

- Clonagem gênica

- Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...)

- Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética,

confirmação de transfecção)

CURVA DE PCRCURVA DE PCR

GeneXpertGeneXpert(Cepheid)(Cepheid)

GeneXpertGeneXpert(Cepheid)(Cepheid)

GeneXpert MTB/RIFGeneXpert MTB/RIF

GeneXpert MTB/RIFGeneXpert MTB/RIF

Avaliação dos módulosAvaliação dos módulos

Avaliação dos módulosAvaliação dos módulos

Preparação da amostraPreparação da amostra

Preparação da amostraPreparação da amostra

Cartucho GeneXpert MTB/RIFCartucho GeneXpert MTB/RIF

Cartucho GeneXpert MTB/RIFCartucho GeneXpert MTB/RIF

Identificação do Cartucho GeneXpert MTB/RIFIdentificação do Cartucho GeneXpert MTB/RIF

Manual Automática

OPÇÕES DE UTILZAÇÃOOPÇÕES DE UTILZAÇÃO

Cancelamento de teste(s)Cancelamento de teste(s)

Resultado – Amostra 1Resultado – Amostra 1

Resultado – Amostra 1Resultado – Amostra 1

Resultado – Amostra 2Resultado – Amostra 2

Resultado – Amostra 2Resultado – Amostra 2

Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

• Métodos bacteriológicos . Métodos Moleculares

-Baciloscopia -24hs - Fita Hain 3 dias ou mais

(baciloscopia positiva +)

-Cultivo – MGIT – 10 dias

- Genexpert -2hrs

- Sólido – 30 dias

- Teste de Sensibilidade

- MGIT -15 dias

- Método das Proporções 28 a 42 dias

Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

Vantagens e Desvantagens

-Bacteriológico - Moleculares(Genexpert) - Mais barato - Mais caro (baciloscopia) - TSA Mais demorado (MGIT) - Mais rápido Rif resit - Outras drogas (INH, etc.) - Só para Rif - Bacilos vivos - Bacilos Vivos e “mortos” - Cultivar para TSA confirmatório e outras drogas (quantidade de escarro) - Triagem - Três códons relacionados a resistência a RIF - Não detecta em amostras extra-pulmonares - Não detecata MNT