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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de Genética

Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - BrasilTelefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Fungos mutualistas x patogênicos:Fungos mutualistas x patogênicos:Genômica estrutural e sua contribuição para o

entendimento das relações fungo-planta

Doutoranda: Léia Cecília de Lima Fávaro

Orientador: Dr. Welington Luiz de Araújo

Discuta, do ponto de vista evolutivo, o fato de que um microrganismo endofítico pode se tornar patogênico.

(Exame de Qualificação)

Fungos mutualistas x patogênicos:Fungos mutualistas x patogênicos:Genômica estrutural e sua contribuição para o

entendimento das relações fungo-planta

Tema do seminário

Análise genômica comparativa: evolução da fitopatogenicidade

SUMÁRIO

Genomas: aspectos gerais Fungos: importância

Considerações / Desafios / Perspectivas

Simbiose entre plantas e fungos Mutualismo X Parasitismo

Genomas: aspectos gerais

O genoma de um organismo representa o complemento total de genes e é portanto, um estoque de informação biológica independente do contexto.

Algumas definições...

Genômica Estrutural

Genômica Funcional

Uma abordagem holística (baseada em sistemas) para estudar o fluxo de informação dentro de uma célula;

Aplicação de métodos de alto processamento e tecnologias automatizadas à biologia, permitindo análise funcional do genoma, proteoma e metaboloma de um organismo.

Transcriptoma

Proteoma

Metaboloma

Contêm informação biológica altamente dependente do

contexto - dinâmica

Talbot (2003)

Genomas completamente seqüenciados Janeiro 2008

Publicados

Fonte: http://www.genomesonline.org

Junho = 819


Projetos de seqüenciamento de genomas Janeiro 2008 – 3520 projetos


Junho = 3823


Projetos de seqüenciamento de acordo com o grupo filogenético - Janeiro 2008



Grupos de eucariotos com projetos genoma Janeiro 2008



Um melhor entendimento da biologia de fungos não somente facilita o uso inteligente dos fungos benéficos, mas também

permite avanços no controle de espécies patogênicas.

van Baarlen et al (2007)

Análise genômica comparativa de todo um

reino eucariótico

Base genética e evolutiva dos

diferentes estilos de vida dos fungos

patogênese mutualismosaprofitismo

Ferramentas de bioinformática e de genômica funcional

microarranjosproteoma

metaboloma

Acúmulo de seqüências genômicas


Fungos: importância

George W. Beadle

Prêmio Nobel em 1958: Beadle, Tatum e Lederberg - Estudos pioneiros com o fungo Neurospora e a bactéria E. coli.

Genética Bioquímica

1941: Teoria

um gene, uma enzimaNeurospora crassa

Organismos Modelo

1996: Primeiro organismo eucariótico a ter o genoma seqüenciado

Levedura -Saccharomyces cereviseae

Cogumelos comestíveis

Controle biológico de insetos praga

Produção de fármacos: penicilina, cefalosporina,

taxol, proteínas heterólogas

Produção de vinhos

Produção de ácidos orgânicos – ácido cítrico

Produção de álcool Indústria


Em contraste aos benefícios... Patógenos de animais e plantas

Antracnose do milho –Colletotrichum graminicola

Mancha preta do Citrus –Guignardia citricarpa

Vassoura de bruxa do cacau-Crinipellis perniciosa

Carvão do milho –Ustilago maydis

Ferrugem asiática na soja -Phakopsora pachyrhizi


Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo

A simbiose entre fungos e plantas é um fenômeno amplamente distribuído na natureza.

O resultado desta interação pode variar

mutualismo - comensalismo - parasitismo

Continuum simbiótico

Na maioria dos casos, a planta hospedeira não sofre danos, e de fato, pode ter vantagem com a colonização pelo fungo. Exemplo: micorrizas e fungos endofíticos

Kogel et al (2006)

Associação micorrízica: Interação mutualística entre fungos e raízes de plantas – mais intensamente estudada.

Ectomicorriza

�Principalmente Basidiomicetos

�Espécies arbóreas - florestas

Douglas fir e Laccaria bicolor.Martin et al (2001, 2008)Reinhardt (2007)

Endomicorriza (Micorriza Arbuscular)

�Filo Zigomicetos

�Ampla ocorrência em todos os ecossistemas

�Surgimento das plantas terrestres (460 m.a.)

�Biotróficos

Brundrett (2001)


Anatomia de uma raiz com micorriza arbuscular. Siqueira et al (2002)

Ipê: sem e com micorriza. Siqueira et al (2002)


mutualismo - comensalismo - parasitismo

Continuum simbiótico

Comensalismo e Mutualismo: Requerem um balanço sofisticado (sob controle genético, fisiológico e ambiental) entre as demandas do fungo e a resposta de defesa da planta.

Se a interação torna-se desbalanceada: os sintomas de doença aparecem ou o fungo é excluído pelas reações de defesa da planta hospedeira.

Interações microrganismo-planta

Doença é exceção

Considerada como um status desbalanceado

da simbiose

Kogel et al (2006)


Triângulo da doença. Interações compatíveis entre um patógeno e o hospedeiro somente resultam em doença se as condições ambientaisforem favoráveis. van Baarlen et al (2007)


Mutações em genes únicos: Mudanças no estilo de vida do fungo

patogênico para mutualista ou

mutualista para patogênico

Para ilustrar como esta relação é complexa:

A colonização de diferentes hospedeiros pode fazer com que um fungo adote estilos de vida contrastantes.


Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a Nonpathogenic, Endophytic Mutualist

Stanley Freeman and Rusty J. RodriguezDepartment of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521

Science 2 April 1993: Vol. 260. no. 5104, pp. 75 - 78

Fungo ascomiceto Colletotrichum magna – antracnose em cucurbitáceas (melancia) - hemibiotrófico

Obtenção de mutantes (UV) – um mutante não patogênico (path-1)

Objetivos: Analisar a genética envolvida na patogenicidade e na especificidade ao hospedeiro.


Seedlings melancia após 10 dias da inoculação (selvagem, mutante, mutante + selvagem)

Path-1: compatível para incompatível -Reconhecimento do patógeno pela planta ?

Monitoramento da colonização do selvagem e path-1. Atraso na colonização.

Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a Nonpathogenic, Endophytic MutualistStanley Freeman and Rusty J. Rodriguez

Department of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521






E a gama de hospedeiros do mutante é igual à do selvagem?

Mutante path-1 protege seedlings de melancia contra o

patógeno Fusarium oxysporum f. sp. niveum


Esporulação, Adesão dos conídios, Formação de apressório, Infecção e Gama de hospedeiros

Mutante não patogênico path-1: = Tipo

selvagem




Um patógeno pode expressar estilos de vida simbiótico não patogênico

Reavaliação da função dos fungos na estrutura e dinâmica de comunidades vegetais

Um fungo fitopatogênico pode ser modificado por mutação para crescer como um endofítico não patogênico (um único gene)

A genética envolvida na patogenicidade e na especificidade ao hospedeiro é diferente.


Fungo endofítico Epichloe festucae e Lolium perenne (gramínea )

Objetivos: Screening de mutantes - busca de genes simbióticos

�Crescimento �Tolerância stress biótico

Isolaram um mutante que alterou a interação:

mutualística parasítica

gene NoxA: NADPH oxidase


Análise citoquímica: produção de ROS foi reduzida no mutante

Expressão de PR proteínas em

Lolium colonizadas com selvagem e mutante noxA


�Mudança de mutualismo para parasitismo pela mutação em um único gene do fungo.

�Nova função para ROS na regulação da interação mutualista.

�Mecanismo da simbiose:

Produção de ROS pelo gene noxA de Epichloe in plantaregula negativamente o desenvolvimento e ramificação das hifas, prevenindo a colonização excessiva do tecido vegetal.


O que faz um fungo ser patogênico? �No reino Fungi, a capacidade de causar doenças em plantas parece ter originado múltiplas vezes durante a evolução. Berbee (2001)


�fenótipo complexo �diversidade na biologia de desenvolvimento e tipos de sintomas

Capacidade de causar doença:

Cada espécie patogênica tem evoluído uma maneira especial para invadir as plantas e causar doença.

Uma vez dentro da planta, três estratégias de colonização são empregadas (para o crescimento e desenvolvimento):


necrotrofia biotrofia hemibiotrofia

http://www.phi-base.org/

Sumário do número de espécies e genes envolvidos na patogenicidade

Winnenburget al (2008)

Identificação de genes envolvidos na patogenicidade:

vias, proteínas e genes do processo patogênico

Alvos no fungo para controle químico(fungicidas ou drogas antifúngicas)

Alvos no hospedeiro podem ser modificados para reduzir sua susceptibilidade ao patógeno (plantas geneticamente modificadas)



Diferenças entre patógenos e não

patógenos ao nível genômico

Disponibilidade de seqüências genômicas

É possível identificar mecanismos moleculares comuns associados com

espécies de fungos que causam doenças em plantas?


Genomas de fungos e oomicetos fitopatogênicos disponíveis publicamente

Soanes et al (2007)


Published June 4, 2008

Background - Introdução

Fungos e oomicetos patogênicos: diversidade de doenças e desafio para o desenvolvimento de estratégias de controle duráveis.

Principal objetivo da pesquisa atual: identificar mecanismos moleculares necessários para patogênese em várias espécies.


Estudar um gene de cada vez:

�Processos governados por muitos genes (haustório)

�Patógenos biotróficos (não cultivados)

Comparação de genomas de fungos patogênicos e não patogênicos

Esforços para identificação de determinantes de patogenicidade:

Somente para poucos fungos fitopatogênicos (modelo)

Mutação – deleção gene alvo Alteração do fenótipo

Background - Introdução


�Comparação de 36 genomas de espécies diferentes (34 fungos e 2 oomicetos)

�Identificação de grupos de genes ortólogos

�Identificação de famílias de proteínas (Pfam)

(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)

�Análise comparativa de ascomicetos

fitopatogênicos e saprófitos

�Identificação de proteínas secretadas (secretoma) (SignalP 3.0/WoLF PSORT)


Agrupamento de seqüências: Todas as proteínas preditas de 36 espécies foram agrupadas por MCL (Markov ChainClustering).

348.787 proteínas

Um total de 282.061 proteínas preditas foram agrupadas em

23.724 clusters

Cada cluster representando um grupo de genes ortólogos putativos

http://www.e-fungi.org.uk

Resultados


Não existem fatores de patogenicidade conservados em e específicos à todas as espécies de

fitopatógenos.

As diferenças são devidas à expansão de certas famílias de genes nos genomas de espécies fitopatogênicas associadas com funções necessárias

para a patogênese

Resultados

�fitopatogênicos X não patogênicos: genômica comparativa


Resultados

�Vias de metabolismo secundário:�Proteases e peptidases:�Enzimas degradadoras de parede celular:�NLPs: disparam respostas de defesa, necrose e morte celular em plantas, podem agir como fatores de virulência�Catabolismo de compostos tóxicos:

Famílias de proteínas que foram pelo menos duas vezes mais comuns nos proteomas de fitopatógenos do que nos saprófitos:

�fitopatogênicos X não patogênicos: genômica comparativa


Resultados

�Análise comparativa do secretoma de fitopatógenos e não patógenos

Em bactérias e oomicetos: proteínas secretadas (efetores) são importantes para estabelecer a infecção da planta, desarmando as defesas e subvertendo os processos celulares para as necessidades dos patógenos invasores.

%Porcentagem do proteoma total que é secretada em cada fungo (predição)


Resultados

�Análise comparativa do secretoma de fitopatógenos e não patógenos

Famílias de proteínas que foram exclusivas ou pelo menos duas vezes mais comuns no secretoma de fitopatógenos do que nos saprófitos:

Potenciais efetores em fungos:• Proteases secretadas• Fatores de transcrição• Proteínas envolvidas em rearranjos do citoesqueleto• Interações proteína-proteína• Isochorisimatases secretadas específicas de patógenos:podem suprimir as defesas dependente de ácido salicílico da planta

Genes efetores são alvo direto das forças evolutivas que dirigem a coevolução(arms race) entre patógeno e hospedeiro, pois seus fenótipos se estendem às células e tecidos da planta (seleção positiva – taxa evolutiva acelerada)


Conclusões

Embora a evolução da fitopatogenicidade tenha acontecido várias vezes e os estilos de vida destes fungos sejam diversos, as comparações genômicas permitem:

� Apontar novas famílias de genes que podem ter funções na virulência de fitopatógenos, permitindo sua seleção para estudos funcionais;

� Identificar mecanismos patogênicos conservados e inovações e adaptações patogênicas linhagem-específicas;

� Revelar onde eventos de transferência gênica horizontal contribuíram para aquisição de novas funções associadas à virulência

Como aplicar a riqueza de informações obtidas a partir dos estudos genômicos para melhorar a produção vegetal?

Desafios e Perspectivas:


A descoberta de genes efetores de fungos que tem importante contribuição para virulência pode permitir a identificação dos melhores genes R a serem utilizados.

Efetores podem permitir a identificação dos processos que são perturbados na planta hospedeira, permitindo a modificação destes alvos para insensibilidade, ou

Utilização dos genes alvo na planta como marcadores QTL para o melhoramento vegetal.

Bent & Mackey (2007)

Análise genômica comparativa: estudos evolutivos

Duplicação e perda de genes: inovação funcional

Os princípios que governam estes processos não são entendidos

Acúmulo de genomas: reconstrução da história de duplicação e perdas de genes entre espécies

Estudos de duplicação e perda de genes: resolução de ortologia e paralogia (difícil)

Sistema computacional (SYNERGY)

Resolução da história evolutiva de todos os genes de 17 genomas de fungos ascomicetos (300 milhões de

anos de evolução)



Reconstrução dos eventos evolutivos

Aparecimento

Duplicação

Perda

Patógenos de plantas: História evolutiva complexa

�Transferência Horizontal

�Expansão e perda de genes de metabolismo secundário

�Expansão e perda de genes de receptores celulares

Soanes et al (2007)


Criação das ferramentas de análise: extensão deste tipo de análise para outros organismos (plantas e animais)

Duplicação e perda de genes:

é altamente limitada pelas propriedades funcionais e padrões

de interação dos genes.

Genes relacionados à estress exibem mais duplicações, enquanto genes relacionados ao crescimento mostram

seleção contra tais mudanças.

Destino funcional de genes duplicados:

raramente divergem quanto a função bioquimica, mas divergem com

relação ao controle regulatório.

Considerações / Desafios / Perspectivas

Acúmulo de seqüências genômicas de fungos:

Resposta da planta à colonização por fungos mutualistas e patogênicos:

padrões comuns nos primeiros estágios de

infecção

www.plantcell.org/cgi/content/full/tpc.105.035410/DC1

Surgimento de novas linhas de pesquisa: análise in silico –biologia de sistemas

OBRIGADA!

fungos mutualistas x patogênicos - esalq.usp.br · no reino fungi, a capacidade de causar doenças...

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