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FOSFORILAÇÃO DA ENZIMA SERINA RACEMASE POR
PROTEÍNA CINASE C REGULA OS NÍVEIS DO
NEUROMODULADOR D-SERINA
Charles Vargas Lopes
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas.
Orientador: Rogério Arena Panizzutti
Rio de Janeiro Março de 2008
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FOSFORILAÇÃO DA ENZIMA SERINA RACEMASE POR PROTEÍNA
CINASE C REGULA OS NÍVEIS DO NEUROMODULADOR D-SERINA
Charles Vargas Lopes
Orientador: Rogério Arena Panizzutti
Tese de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas,
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas.
_______________________________
Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes (PCM - UFRJ)
_______________________________
Prof. Ricardo Augusto de Melo Reis (IBCCF - UFRJ)
_______________________________
Prof. Mário Alberto Cardoso da Silva Neto (IBqM - UFRJ)
_______________________________
Profa. Flávia Carvalho Alcantara Gomes (Revisora e suplente interna; PCM - UFRJ)
_______________________________
Profa. Maria Augusta Arruda (Suplente externa; IBRAG - UERJ)
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Lopes, Charles Vargas Fosforilação da enzima serina racemase por proteína cinase C regula os níveis do neuromodulador D-serina - Lopes, Charles Vargas - Rio de Janeiro: UFRJ/ ICB, 2008. xii, 86f.: il.; 2 cm.
Orientador: Rogério Arena Panizzutti Tese (mestrado) – UFRJ/ Instituto de Ciências Biomédicas/
Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas, 2008. Referências Bibliográficas: f. 67-86 1. serina racemase. 2. proteína cinase C. 3. fosforilação. 4. d-serina.
5. comunicação neuro-glial. I. Panizzutti, Rogério Arena. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, Programa de Ciências Morfológicas. III. Título.
iii
Esta Tese foi realizada no Laboratório de Fronteiras em Neurociências, do Instituto de
Ciências Biomédicas, UFRJ, sob a orientação do Professor Rogério Arena Panizzutti, com
auxílios financeiros da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio de Janeiro (FAPERJ), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB) e do Committee for
Aid and Education in Neurochemistry (CAEN) of the International Society for
Neurochemistry.
iv
“A dúvida é o princípio da sabedoria”.
(Aristóteles)
v
Agradecimentos
A Deus e minha amada família.
Ao meu pai, Edson Taveira Lopes, por seus sucintos, porém sábios conselhos de
vida.
À minha mãe, Maria Isabel Vargas Silva Lopes, pela insistência em me estruturar
como ser humano.
Ao meu segundo pai, Mauro Pestana Chidid, por cuidar de mim como um filho.
Às minhas irmãs Sue Ellen e Cristina pelo exemplo de fibra e superação.
Ao meu orientador, o professor Rogério Arena Panizzutti, pela oportunidade,
ensinamentos e confiança.
À professora Marta Sampaio de Freitas pela indicação para trabalhar com o
professor Rogério.
Ao professor Sérgio Teixeira Ferreira por permitir a utilização da estrutura de seu
laboratório no desenvolvimento deste trabalho.
Às minhas companheiras do dia-a-dia, Caroline e Ingrid, pelo trabalho cuidadoso e
momentos de descontração.
Aos companheiros, companheiras e afins do LDN, Jordano, Adriano, Marcelinho,
Rodrigo, Leozinho, Fábio, Léo, Omar, Paulinho, Bernardo, professor Paulo Alves,
Andrea, Samantha, Ana Paula, Mariangela, Dona Joana, Theresa, Helena, Sofia,
professoras Fernanda e Margareth, pelo excelente ambiente de trabalho e momentos
de lazer.
À doutoranda Suzana Assad Kahn pela interação profissional e amizade.
À professora Flávia Carvalho Alcantara Gomes pelos momentos de discussão junto
ao trabalho, pela revisão da tese e compreensão.
À mestranda Juliana Carvalho pelo apoio de sempre.
À professora Georgia Correa Atella pela ajuda material em experimentos e
discussão deste trabalho durante a defesa do projeto.
Ao professor Jean Christophe Houzel pelo apoio e atenção na manipulação in vivo
deste estudo e pela simpatia.
vi
À professora Maria Augusta Arruda por todo carinho, cuidado e proteção desde o
começo desta carreira.
Aos membros da Banca examinadora, Profs (as). João Menezes, Ricardo Reis,
Mário Neto, Flávia Gomes e Maria Augusta Arruda, por terem aceitado o convite.
Aos diferentes laboratórios do CCS que possibilitaram a continuidade desta tese.
Aos meus amigos do peito Pedro Barcellos e Marcelo Mantuano pela amizade
verdadeira e momentos de felicidade.
À minha namorada Patrícia pela cumplicidade e equilíbrio.
Ao PCM pela chance de desenvolver o mestrado.
À CAPES pelo financiamento da bolsa ao longo do mestrado.
vii
Lista de Abreviaturas
AMPA: ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico
ASC-1: transportador de Alanina-Serina-Cisteína tipo 1
ASCT: transportador tipo alanina-serina-cisteína
ATP: adenosina trifosfato
BIM: bis-indolil-maleimida
DAG: diacilglicerol
DAO: D-aminoácido oxidase
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle’s Medium
DPNH: dinitrofenil-hidrazina
GRIP: proteína que interage com receptor de glutamato / glutamate receptor interacting
protein
GST: glutationa S-transferase
[3H]D-serina: d-serina tritiada
HEK 293: linhagem celular de rim embrionário humano / human embrionary kidney
HPLC: cromatografia líquida de alta resolução / High Performance Liquid
Chromatography
LTP: potenciação de longa duração / long-term potentiation
NMDA: N-metil-D-aspartato
NO: óxido nítrico / nitric oxide
PICK1: proteína que interage com cinase C 1 / protein interacting with C-kinase
PKC: proteína cinase C / protein kinase C
PLP: piridoxal fosfato
PMA: forbol 12-miristato 13-acetato
PS: fosfatidilserina
SR: serina racemase
TCA: ácido tricloroacético
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
viii
Lista de Figuras
Figura 1. Racemização de L-serina em D-serina pela serina racemase. 5
Figura 2. Imunohistoquímica mostrando a distribuição de D-serina, NR2A/B e glicina em diferentes regiões do cérebro.
8
Figura 3. Modelo bidirecional da sinalização de D-serina no cérebro. 12
Figura 4. Diferentes funções da serina racemase (SR) no metabolismo celular da D-serina e possíveis destinos deste aminoácido.
16
Figura 5. Seqüências da serina racemase de diferentes espécies (camundongo, humano e rato) mostrando seis possíveis sítios para fosforilação por PKC.
36
Figura 6. PKC inibe a atividade da serina racemase por fosforilação. 37
Figura 7. PKC proveniente de astrócitos reduz a atividade da serina racemase através de fosforilação.
39
Figura 8. Interação da serina racemase, PKC e PICK1 em astrócitos. 41
Figura 9. Fosforilação da serina racemase por PKC astrocitária diminui a produção de D-serina.
44
Figura 10. Serina racemase, PKC e PICK1 colocalizam em neurônios. 47
Figura 11. Fosforilação da serina racemase por PKC neuronal diminui a produção de D-serina.
50
Figura 12. Interação da serina racemase, PKC e PICK1 in vivo. 53
Figura 13. Regulação da disponibilidade de D-serina por PKC in vivo. 55
Figura 14. PKC regula a atividade da serina racemase. 65
ix
RESUMO
Serina racemase é uma enzima cerebral, que catalisa a conversão de L-serina em
piruvato e D-serina, um co-agonista endógeno de receptores NMDA. Seqüenciamento da
serina racemase mostrou sítios de consenso para fosforilação por proteína cinase C (PKC),
uma serina-treonina cinase que participa de diferentes funções no cérebro, incluindo os
processos de aprendizado, memória e plasticidade sináptica. O presente estudo analisou o
efeito da PKC na regulação da atividade da serina racemase in vitro e in vivo. Utilizando
serina racemase e PKC purificadas, nós observamos diminuição da formação de piruvato e
D-serina pela racemase, e um aumento na fosforilação da serina racemase in vitro. Este
efeito foi confirmado utilizando PKC imunoprecipitada de astrócitos de rato. O tratamento
das culturas de astrócitos e neurônios com PMA, um ativador da PKC, aumentou o grau de
fosforilação da serina racemase e reduziu a concentração de D-serina, enquanto a incubação
com BIM, um inibidor da PKC, induziu efeitos opostos. Para avaliar se estas enzimas
interagem in vitro e in vivo, foi realizada coimunoprecipitação a partir de astrócitos,
neurônios e cérebro de rato. Em todos os casos, nós observamos que a serina racemase e a
PKC coimunoprecipitam com a proteína PICK1, a qual interage com cinase C e direcina as
funções da PKC na célula. Análises por imunocitoquímica mostraram colocalização da
serina racemase, PKC e PICK1 em astrócitos e neurônios. Através de injeções de PMA e
BIM diretamente no córtex frontal de ratos, nós mostramos, in vivo, que PKC regula a
disponibilidade de D-serina e controla o estado de fosforilação da serina racemase. Em
conjunto, os resultados sugerem que a serina racemase é uma molécula alvo para PKC,
regulando ambas atividades, racemase e eliminase. Esta interação pode ser relevante para a
modulação da atividade de receptores NMDA e comunicação neuro-glial.
x
ABSTRACT
Serine racemase is a brain enzyme that catalyzes the conversion of L-serine to
pyruvate and D-serine, an endogenous co-agonist of NMDA receptors. Sequencing of the
serine racemase showed consensus sites for protein kinase C (PKC) phosphorylation, a
serine-threonine kinase that participates in different brain functions, including learning,
memoy and synaptic plasticity process. The present study analyzed the effect of PKC in
regulating serine racemase activity in vitro e in vivo. Utilizing serine racemase and PKC
purified we observed decrease in the formation of pyruvate and D-serine by racemase, and
an increase in the phosphorylation of the serine racemase in vitro. This effect was
confirmed utilizing immunoprecipitated PKC of rat astrocytes. The treatment of astrocyte
and neuronal cultures with PMA, a PKC activator, increased the degree of phosphorylation
of the serine racemase and reduced the D-serine concentration, whereas that incubation
with BIM, a PKC inhibitor, induced opposite effects. To evaluate if these enzymes interact
in vitro and in vivo, was realized coimmunoprecipitation from the astrocytes, neurons and
rat brain. In all cases, we observed that serine racemase and PKC coimmunoprecitates with
PICK1, wich interacts with kinase C and directs the functios of PKC in the cell. Analysis
by immunocytochemistry shown colocalization of the serine racemase, PKC and PICK1 in
astrocytes and neurons. Throught of PMA and BIM injections directly in the frontal cortex
from rats, we showed, in vivo, that PKC regulates the availability of D-serine, and controls
the phosphorylation state of serine racemase. Together, the results suggest that serine
racemase is a target molecule for PKC, controlling both, racemase and eliminase activities.
This interaction can be relevant for the modulation of NMDA receptors activity and neuro-
glial communication.
xi
Sumário
Lista de Abreviaturas viiiLista de Figuras ix Resumo x Abstract xi 1. Introdução 01
1.1- Sinapse tripartida 01 1.2- D-serina 03 1.2.1- D-serina e receptores NMDA 04 1.2.2- D-serina glial 09 1.2.3- D-serina neuronal 10 1.2.4- D-serina e desenvolvimento 11 1.2.5- Transporte de D-serina 13 1.3- Serina racemase 14 1.3.1- Função 14 1.3.2- Distribuição 17 1.3.3- Regulação da atividade 17 1.4- Proteína Cinase C (PKC) 19
1.5- Proteína que Interage com Cinase C 1 (PICK1) 21 2. Objetivo 24 3. Material e Métodos 25
3.1.- Purificação da SR recombinante 25 3.2.- Atividade bifuncional da serina racemase in vitro 26 3.3.- Cultura de astrócitos corticais 27 3.4.- Cultura primária de neurônios corticais 28 3.5.- Síntese de D-serina em cultura de células 28 3.6.- Autoradiografia 29 3.7.- Imunoprecipitação e imunodetecção 29 3.8.- Imunocitoquímica 31 3.9.- Coimunoprecipitação 31 3.10.- Injeção aguda de PMA e BIM no córtex frontal de ratos 32 3.11.- Estatística 34 3.12.- Processamento de imagens 34
4. Resultados 35 4.1.- PKC purificada diminui a atividade da serina racemase in vitro 35 4.2- PKC imunoprecipitada de astrócitos diminui a atividade da serina racemase in vitro 38 4.3.- Serina racemase, PKC e PICK1 interagem em astrócitos 40 4.4.- Fosforilação por PKC regula a atividade da serina racemase astrocítica 43 4.5.- Interação da serina racemase, PKC e PICK1 em neurônios 46 4.6.- PKC modula a atividade da serina racemase neuronal via fosforilação 49 4.7.- Interação da serina racemase, PKC e PICK1 in vivo 52 4.8.- PKC regula a disponibilidade de D-serina in vivo 54
5. Discussão 57 6. Conclusão 66 7. Referências Bibliográficas 67
xii
1 - Introdução
1.1 - Sinapse tripartida
A transmissão de informações químicas entre as células do sistema nervoso nas
sinapses é uma etapa crucial para a neurofisiologia, além de ser o alvo de grande parte das
drogas disponíveis para o tratamento das patologias neuropsiquiátricas. O estudo da
transmissão sináptica enfoca primariamente os neurotransmissores, moléculas sintetizadas e
liberadas por neurônios que medeiam a neurotransmissão na fenda sináptica (Snyder e
Ferris, 2000; Boehning e Snyder, 2003). Entretanto, mais recentemente o estudo de
moléculas moduladoras da comunicação neuronal liberadas pelas células da glia tem
ampliado a compreensão sobre o funcionamento do sistema nervoso, tanto em condições
fisiológicas quanto patológicas. A partir destas descobertas, o conceito clássico de sinapse
que inclui um neurônio pré-sináptico e um neurônio pós-sináptico tem sofrido alterações
com a inclusão de um terceiro elemento: a célula glial (Halassa e cols, 2007).
No sitema nervoso central, a glia está dividida em microglia e macroglia. A microglia
é constituída basicamente por células com elevado poder fagocítico, enquanto a macroglia é
representada, dentre outras células, pelos oligodendrócitos, essenciais para a mielinização
dos axônios, e astrócitos. As células gliais foram originalmente descritas como células não
neuronais que constituem um suporte aderente para os neurônios (Virchow, 1846). No
entanto, desde o fim da década de 80 que o desenvolvimento e a aplicação de novas
técnicas como eletrofisiologia, biologia molecular e microscopia confocal têm mudado a
idéia clássica de que as células gliais, como os astrócitos, fornecem simplesmente suportes
estrutural e metabólico para os neurônios (Perea e Araque, 2002). Em virtude deste avanço,
vários trabalhos têm envolvido os astrócitos em funções cruciais no desenvolvimento e na
1
fisiologia do sistema nervoso central. Os astrócitos desempenham importante papel em
aspectos chave da função neuronal como o suporte trófico (Tsacopoulos e Magistretti,
1996), sobrevivência neuronal (Raff e cols, 1993), diferenciação neuronal (Takeshima e
cols, 1994), migração neuronal (Rakic, 1990), crescimento neurítico (LeRoux e Reh, 1994)
e eficácia sináptica (Stevens e cols, 2007). Os astrócitos contribuem ainda para a
homeostase cerebral por regular a concentração local de íons e de substâncias neuroativas
(Largo e cols, 1996; Bergles e Jahr, 1997).
Vem sendo descrito que os astrócitos participem da formação, manutenção e
reconstituição das sinapses (Allen e Barres, 2005). Dentre os fatores derivados de astrócitos
que estão envolvidos com a sinaptogênese têm-se o colesterol (lipídeo de membrana), as
trombospondinas (proteínas secretadas da matrix extracelular de astrócitos) e o hormônio
estrogênio (Barres e Smith, 2001; Christopherson e cols, 2005; Hu e cols, 2007). E ainda,
recentemente foi demonstrado que o astrócito pode estimular o neurônio a expressar C1q,
uma proteína constituinte do início da cascata do complemento (sistema imune inato), a
qual interfere na função sináptica (Stevens e cols, 2007).
Em roedores, estima-se que os processos de um astrócito façam contato com mais de
100 mil sinapses (Bushong e cols, 2002). Os astrócitos parecem ser importantes na
regulação da transmissão sináptica, onde podem detectar a atividade neuronal e liberar
transmissores químicos que ajudam a controlar a atividade sináptica (Fellin e cols, 2006).
Recentes achados revelam que uma comunicação bidirecional ocorre entre os astrócitos e
os elementos neuronais da sinapse. A liberação de um neurotransmissor a partir do terminal
pré-sináptico que estimula o neurônio pós-sináptico, pode também ativar os astrócitos, que
por sua vez, podem liberar transmissores químicos que estimulam diretamente o neurônio
2
pós-sináptico. Portanto, podemos considerar a sinapse como tripartida (Araque e cols,
1999).
Com sua localização envolvendo as sinapses, os astrócitos têm sido descritos como
participantes da comunicação interneuronal através, principalmente, da liberação de
moduladores, que podem ser chamados gliomoduladores. Os astrócitos podem responder
aos transmissores químicos e à atividade sináptica através da mobilização de Ca2+
intracelular. Esta sinalização de Ca2+ pode induzir a liberação de gliomoduladores. Esta
gliotransmissão pode agir paracrinamente nos próprios astrócitos, através de sinalização por
ondas de Ca2+ inter-astrocítica, ou atuar na sinalização dos neurônios para regular a
excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica (Guthrie e cols, 1999; Fellin e cols, 2004).
Os astrócitos podem liberar vários gliomoduladores incluindo o glutamato (Parpura e
cols, 1994), o ATP (Coco e cols, 2003), o ácido homocistéico (Benz e cols, 2004), o fator
natriurético (Krzan e cols, 2003), o TNF-α (Fator de Necrose Tumoral alfa) (Stellwagen e
Malenka, 2006), a taurina (Mongin e Kimelberg, 2005) e a D-serina (Mothet e cols, 2000).
A D-serina, um D-aminoácido neutro, apresenta-se primeiramente em astrócitos, por ser um
agonista endógeno dos receptores de glutamato do subtipo NMDA (N-Metil-D-Aspartato),
tem recebido grande destaque como um protótipo de gliomodulador (Mothet e cols, 2000).
1.2 - D-serina
Durante muito tempo, os D-aminoácidos estiveram esquecidos por não apresentar
uma conformação considerada biologicamente ativa, embora a existência destas moléculas
tenha se confirmado em bactérias e alguns invertebrados (Corrigan, 1969). Na maioria das
bactérias, os D-aminoácidos são componentes dos peptideoglicanos da parede celular,
conferindo a elas maior resistência contra antibióticos (Roper e cols, 2000). Em mamíferos,
3
o D-aspartato foi o primeiro D-aminoácido identificado na forma livre no cérebro e em
outros tecidos, sendo sugerido um papel regulatório deste aminoácido no processo de
desenvolvimento (Dunlop e cols, 1986). O segundo D-aminoácido descoberto em níveis
consideráveis em mamíferos é a D-serina, sendo que sua concentração chega a
corresponder um terço da serina total livre (Hashimoto e cols, 1992a).
A serina é um dos únicos aminoácidos que tem ambas configurações (L- e D-) em
quantidades significantes em mamíferos. Estes enantiômeros apresentam propriedades
biológicas distintas e esta estereoespecificidade pode ter um aspecto fundamental na
biologia, funcionando como um elemento de seletividade (Snyder e Kim, 2000). A forma
L-serina pode ser obtida da dieta, do 3-fosfoglicerato, da conversão da glicina pela serina
hidroxi-metil-transferase e da degradação de proteínas e fosfolipídeos (De Koning e cols,
2003). Já a D-serina, atuante no sistema nervoso central como co-agonista de receptores
ionotrópicos de glutamato do subtipo NMDA, provém da racemização direta de L-serina
em D-serina pela enzima serina racemase (Wolosker e cols, 1999b) (Figura 1). A outra
enzima que participa do metabolismo da D-serina é a D-aminoácido oxidase (DAO), a qual
degrada especificamente D-aminoácidos neutros (Krebs, 1935).
1.2.1 - D-serina e receptores NMDA
A D-serina atua como ligante exclusivo de receptores NMDA. Os receptores NMDA
são expressos largamente no sistema nervoso central, onde desempenham funções cruciais
na transmissão sináptica excitatória. Estes receptores são complexos transmembrana
heteroméricos (normalmente tetrâmeros com duas subunidades de cada tipo) que podem ser
constituídos por três subunidades: NR1 (constitutiva; com oito variantes alternativas de um
só gene), NR2 (A, B, C e D; codificadas por seis genes separados) e NR3 (A e B; expressas
4
L-serina D-serina
SSeerriinnaa RRaacceemmaassee
Figura 1: Racemização de L-serina em D-serina pela serina racemase.
5
por seis genes independentes). O receptor NMDA necessita da ligação simultânea do
r fisiologicamente os
ria atuar
glutamato (sítio na subunidade NR2) e de um co-agonista (sítio nas subunidades NR1 e
NR3) para sua ativação e subseqüente abertura do canal, permitindo o influxo de cátions,
principalmente cálcio (Dingledine e cols, 1999; Yao e Mayer, 2006).
A glicina foi primeiro descrita como o co-agonista capaz de ativa
receptores NMDA. A ligação da glicina nestes receptores é feita de maneira insensível à
estricnina, um alcalóide que inibe a sinalização nervosa por bloquear o influxo de ânions
cloreto, sendo então a região de ligação denominada “sítio de glicina insensível à
estricnina” (Johnson e Ascher, 1987). Em seguida observou-se que não só a glicina, mas
também a D-serina, é capaz de ativar o referido sítio (Kleckner e Dingledine, 1988).
Comparando seus efeitos, a D-serina mostra três vezes mais potência do que a glicina para
ativar o sítio co-agonista de receptores NMDA do córtex frontal (Matsui e cols, 1995). E
ainda, a D-serina é funcionalmente cem vezes mais efetiva do que a glicina em
potencializar correntes espontâneas mediadas por receptor NMDA em motoneurônios
hipoglossais (Berger e cols, 1998). Vários estudos mostraram que a D-serina e a glicina
apresentam ação semelhante. Por exemplo, concentrações similares de D-serina e glicina
foram capazes de potencializar respostas mediadas por agonistas do receptor NMDA e
aumentar respostas sinápticas mediadas por este receptor (Watanabe e cols, 1992).
Ainda na década de 90 surgiram evidências iniciais de que a D-serina deve
como ligante endógeno de receptores de NMDA. A concentração extracelular de D-serina
mensurada por microdiálise in vivo é similar ou maior que a de glicina em algumas regiões
do cérebro (Hashimoto e cols, 1995). Em mamíferos, enquanto a glicina apresenta
localização proeminente em áreas posteriores do sistema nervoso como o tronco encefálico
e a medula espinhal (Schell e cols, 1997), a D-serina ocorre predominantemente em regiões
6
anteriores do cérebro como o córtex, hipocampo e corpo estriado, em distribuição muito
similar a dos receptores de NMDA (Hashimoto e cols, 1993; Schell e cols, 1997) (Figura
2). A distribuição da D-serina é muito próxima a dos receptores NMDA também quando
vista por microscopia eletrônica na região CA1 do hipocampo (Schell e cols, 1997).
Nos útlimos anos, diversas evidências mostraram que a D-serina endógena é
necessária para a ativação dos receptores de NMDA em diversas regiões do sistema
nervoso. Em culturas de neurônios hipocampais a degradação enzimática específica de D-
serina com a D-aminoácido oxidase reduziu as correntes, espontânea e estimulada por
agonistas, mediadas pelo receptor NMDA (Mothet e cols, 2000). Da mesma forma, a
indução da potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica
relacionada à formação de memória, promovida pelo receptor NMDA, foi diminuída após a
degradação da D-serina pela D-aminoácido oxidase (Yang e cols, 2003). Também foi
observado que a D-serina endógena, e não a glicina, medeia a morte neuronal causada pela
ativação exacerbada do receptor NMDA em fatias organotípicas de hipocampo (Shleper e
cols, 2005). De maneira análoga, um estudo realizado no núcleo supraóptico do hipotálamo
demonstrou que a degradação de D-serina pela D-aminoácido oxidase inibe a resposta
mediada pelo receptor NMDA, enquanto a remoção específica da glicina endógena não
afeta a transmissão destes receptores (Panatier e cols, 2006). Ainda neste trabalho, em ratas
lactantes com reduzida camada astrocítica envolvendo as sinapses, foi observada uma
menor quantidade de D-serina para coativar os receptores NMDA, que se reflete em uma
redução na capacidade do estímulo neuronal em induzir plasticidade sináptica, quando
comparado com as ratas virgens. Nas grávidas, a plasticidade pode ser recuperada com a
administração de D-serina exógena. Logo, o grau de coativação do receptor NMDA por
7
D-serina
Glicina
Ht Ht
HtHt
MB SB HpHp
MEME
CPE CPE
CNV CNV
Figura 2: Imunohistoquímica mostrando a distribuição de D-serina, NR2A/B e glicina em
diferentes regiões do cérebro: amígdala (Am), claustrum (Cl), córtex (Cx), camada
plexiforme externa (CPE), habênula (Hb), hipocampo (Hp), hipotálamo (Ht), ponte medular
(PM), substância nigra (Sn), medula espinhal (ME), substância branca (SB), camada do
nervo vomeronasal (CNV) (adaptado de Schell e cols, 1997).
8
D-serina fornecida pelos astrócitos parece contribuir para a metaplasticidade sináptica
.2.2 - D-serina glial
a primeiramente em astrócitos. O fato dos astrócitos envolverem a
(Panatier e cols, 2006).
1
A D-serina foi descrit
sinapse e a distribuição de D-serina ocorrer em paralela ontogenia com a do receptor
NMDA, sugerem que a D-serina pode ser liberada da glia para ativar receptores NMDA
neuronais. Esta informação propõe um modelo unidirecional, onde a D-serina tende a
seguir um fluxo dos astrócitos para os neurônios. A novidade deste modelo é incumbir a
glia da importante tarefa de regular a atividade neuronal através da liberação de um
transmissor químico, a D-serina (Schell e cols, 1995; Schell e cols, 1997; Wolosker e cols,
1999b). Esta D-serina produzida e liberada pelos astrócitos tem sido importante na ativação
de receptores NMDA presentes em diferentes regiões do cérebro. Através de marcações por
imunohistoquímica, foi observado que tanto a D-serina quanto os receptores NMDA
(NR2A/B) estão concentrados na substância cinzenta do telencéfalo. No córtex cerebral, a
marcação para D-serina está presente em todas as camadas corticais, sendo que mostra
considerável intensidade nos processos astrocíticos presentes ao redor dos vasos
sanguíneos. Esta presença da D-serina no córtex mostra compatibilidade com NR2A/B
principalmente nos lóbulos frontal e parietal. Esta similar localização de D-serina e
NR2A/B também se faz presente na região da amígdala, estando a D-serina nos astrócitos e
o NR2A/B em neurônios piramidais. Já no bulbo olfatório, a marcação para D-serina
apresenta padrão menos intenso, porém mantendo paralela ontogenia com o NR2A/B. E
ainda, por imunohistoquímica e microscopia eletrônica, observaram novamente uma
localização compatível entre a D-serina e o NR2A/B na região CA1 do hipocampo, sendo
9
que a D-serina está distribuída pelo corpo celular e processos dos astrócitos e o NR2A/B
ocorre ao redor da base dos dendritos de neurônios piramidais (Schell e cols, 1997).
Através de microscopia eletrônica, foi observado em astrócitos que a D-serina também está
localizada dentro de compartimentos tipo vesículas (Mothet e cols, 2005; Williams e cols,
2006). As células gliais de Müller da retina, assim como a glia de Bergmann, tipo glial
específico do cerebelo, produzem D-serina (Kim e cols, 2005; Stevens e cols, 2003). Nas
células da glia radial, tipo celular progenitor do sistema nervoso central, foi mostrado que a
D-serina está distribuída uniformemente pelo citoplasma, e ainda, observa-se que microglia
também contém D-serina (Williams e cols, 2006). Estudos com células de Schwann
incluem a D-serina como uma molécula importante na transmissão glutamatérgica no
sistema nervoso periférico (Wu e cols, 2004b; Wu e cols, 2005).
1.2.3 - D-serina neuronal
s imunocitoquímicos preliminares mostraram a presença de D-
de camundongos (Dun e cols, 2007).
Por outro lado, estudo
serina em algumas células neuronais, como neurônios piramidais situados no córtex
cerebral (Yasuda e cols, 2001). Recentemente, um estudo em cultura de neurônios mostrou
que a remoção específica da D-serina com uma deaminase causa uma diminuição
significante da morte celular promovida por NMDA, sugerindo que o neurônio também
seja uma importante fonte de D-serina, a qual pode estar envolvida na regulação autócrina
e/ou parácrina do receptor NMDA. No mesmo, é verificado por imunomarcação a presença
de serina racemase em culturas de neurônios e no córtex cerebral (Kartvelishvily e cols,
2006). A D-serina foi descrita também em neurônios do núcleo vestibular de ratos adultos
(Puyal e cols, 2006) e em neurônios da retina (em diferentes estágios de desenvolvimento)
10
A questão referente à importância da fisiologia da D-serina glial e da neuronal está
em aberto (Figura 3). Postulou-se que a D-serina neuronal e a glial possam apresentar
A relação entre a disponibilidade de D-serina e o desenvolvimento também tem sido
valiar o papel da D-serina no desenvolvimento do
glial nas três semanas após o nascimento,
papéis distintos em funções mediadas pelo receptor NMDA em diferentes áreas do cérebro
(Wolosker, 2006). Como visto no núcleo supraóptico do hipotálamo, o fornecimento de D-
serina pela camada astrocítica parece ser essencial para a atividade sináptica mediada por
receptor NMDA e a LTP (Panatier e cols, 2006). Por outro lado, foi observado no núcleo
vestibular de mamíferos que ambas D-serina glial e neuronal podem coexistir em
determinados momentos da vida, assim como terem função preponderante em uma
determinada etapa do desenvolvimento (Puyal e cols, 2006).
1.2.4 - D-serina e desenvolvimento
discutida. Usando o cerebelo para a
sistema nervoso central, foi mostrado que este aminoácido liberado pela glia de Bergmann
ativa o receptor NMDA da célula granular, favorecendo a migração desta célula da camada
granular externa para a camada granular interna, sendo este processo essencial no
desenvolvimento cerebelar (Kim e cols, 2005).
Em ratos, a análise em diferentes estágios de desenvolvimento pós-natal do núcleo
vestibular mostrou níveis elevados de D-serina
relacionados à alta expressão de serina racemase e baixa de D-aminoácido oxidase. Já no
núcleo vestibular maduro, devido ao aumento na expressão da D-aminoácido oxidase, a D-
serina está diminuída e localizada principalmente nos neurônios (corpos e dendritos),
sugerindo que este D-aminoássa ter papéis funcionais distintos dependendo do estágio de
desenvolvimento (Puyal e cols, 2006).
11
Figura 3: Modelo bidirecional da sinalização de D-serina no cérebro. Este esquema propõe
aações parácrina e autócrina da D-serina astrocitária e D-serina neuronal, respectivamente.
Tanto os astrócitos quanto os neurônios expressam serina racemase (SR) e podem converter
D-serina no cérebro. Este esquema propõe
ções parácrina e autócrina da D-serina astrocitária e D-serina neuronal, respectivamente.
Tanto os astrócitos quanto os neurônios expressam serina racemase (SR) e podem converter
L-serina (L-ser) em D-serina (D-ser). Nos astrócitos, a estimulação de receptores
AMPA/cainato promove a liberação de D-serina, a qual pode atuar como coagonista de
receptores NMDA pós-sinápticos. Nos neurônios, a ativação de receptores ionotrópicos de
glutamato e a despolarização da membrana por KCl induzem a liberação de D-serina. Não é
sabido se a D-serina neuronal atua no receptor NMDA sináptico, extrasináptico ou em
ambos. Enquanto nos astrócitos a captação de D-serina pode ser feita por receptores tipo
Asc, nos neurônios os receptores Asc-1 apresentam esta função (adaptado de Wolosker,
2006).
L-serina (L-ser) em D-serina (D-ser). Nos astrócitos, a estimulação de receptores
AMPA/cainato promove a liberação de D-serina, a qual pode atuar como coagonista de
receptores NMDA pós-sinápticos. Nos neurônios, a ativação de receptores ionotrópicos de
glutamato e a despolarização da membrana por KCl induzem a liberação de D-serina. Não é
sabido se a D-serina neuronal atua no receptor NMDA sináptico, extrasináptico ou em
ambos. Enquanto nos astrócitos a captação de D-serina pode ser feita por receptores tipo
Asc, nos neurônios os receptores Asc-1 apresentam esta função (adaptado de Wolosker,
2006).
Astrócito
Transportadortipo Asc
D-Ser
D-Ser
D-Ser
Receptor NMDA
Receptor AMPA/Cainato
Neurônio pré-sináptico
Neurônio pós-sináptico
12
Estudos independentes utilizando fluido cérebro-espinhal de humanos saudáveis
mbém foi demonstrado que no envelhecimento o conteúdo de D-serina diminui
.2.5 - Transporte de D-serina
is pelo transporte de D-serina permanecem parcialmente
(recém nascidos e crianças) e células ganglionares da retina (diferentes estágios de retinas
intactas) de camundongos fortaleceram a idéia de que a concentração de D-serina tende a
diminuir no decorrer do desenvolvimento de vertebrados. No caso dos humanos, os altos
níveis de D-serina presentes no fluido cérebro-espinhal logo após o nascimento estão bem
reduzidos na infância (Fuchs e cols, 2006). De maneira semelhante, nas células
ganglionares da retina foi mostrado, através de técnicas como hibridização in situ e
imunohistoquímica, que os altos níveis de serina racemase e D-serina encontrados em
retinas neonatas estão consideravelmente diminuídos em retinas maduras (Dun e cols,
2007).
Ta
significativamente no hipocampo (Mothet e cols, 2006; Junjaud e cols, 2006). A atividade
sináptica mediada por receptor NMDA e a LTP, antes prejudicada em ratos idosos, pode ser
recuperada administrando D-serina exógena, evidenciando a importância deste modulador
na alteração dos mecanismos sinápticos de aprendizado e memória que ocorrem com o
envelhecimento (Mothet e cols, 2006).
1
Os mecanismos responsáve
definidos. O transporte glial de D-serina pode ser mediado por transportadores de
aminoácidos neutros do tipo alanina-serina-cisteína (ASCT) dependentes de Na+. Estes
transportadores ASCT funcionam como trocadores, possibilitando a captação de D-serina
como conseqüência do efluxo de outros aminoácidos neutros, principalmente a L-serina
(Ribeiro e cols, 2002). Estudos em culturas de astrócitos carregados com D-serina marcada
13
mostraram que o tratamento destas culturas com agonistas de receptores ionotrópicos de
glutamato do tipo não-NMDA induz a liberação de D-serina também de maneira
dependente de Na+ (Schell e cols, 1995; Ribeiro e cols, 2002). Por outro lado, mesmo
concentrações fisiológicas de L-serina são capazes de promover intensa liberação de D-
serina (Ribeiro e cols, 2002). Embora na glia a D-serina majoritária seja encontrada livre no
citoplasma, há indícios de que a liberação deste aminoácido ocorra via vesículas
dependentes de cálcio (Mothet e cols, 2005).
Já em neurônios, foi mostrado que a liberação de D-serina ocorre pela despolarização
.3- Serina Racemase
.3.1- Função
ras evidências da existência de uma racemização de serina no cérebro de
mamíferos vieram com a observação de que a administração sistêmica de L-serina resulta
através de KCl e por estimulação dos receptores ionotrópicos de glutamato (NMDA,
AMPA e Cainato) de maneira dependente de Na+ e Ca2+ (Kartvelishvily e cols, 2006). Este
transporte neuronal de D-serina pode estar associado a um transportador independente de
íons sódio, o ASC-1 (transportador de Alanina-Serina-Cisteína tipo 1). Este transportador
tem alta afinidade para D-serina e foi localizado nos terminais pré-sinápticos, nos dendritos
e corpos neuronais, indicando que os neurônios contribuam para o transporte e controle da
concentração extracelular deste aminoácido (Helboe e cols, 2003; Matsuo e cols, 2004).
Fortalecendo esta idéia, um trabalho recente mostrou que camundongos que não expressam
o transportador ASC-1 apresentam reduzida capacidade de captar [3H]D-serina em regiões
anteriores do cérebro e sinaptossomas do cerebelo (Rutter e cols, 2007).
1
1
As primei
14
em um aumento no conteúdo de D-serina no cérebro, e que [3H] L-serina pode ser
convertida em [3H]D-serina (Dunlop e Neidle, 1997; Takahashi e cols, 1997). Estes
indícios da ocorrência de racemização direta de L- em D-serina no cérebro se confirmaram
com a descoberta da enzima serina racemase (Wolosker e cols, 1999a).
Em mamíferos, esta enzima apresenta na extremidade N-terminal um conservado sítio
de consenso para ligação do cofator piridoxal-5`-fosfato (Wolosker e cols, 1999b, De
a D-serina sendo um produto da reação
Miranda e cols, 2000). A serina racemase, que é encontrada no citoplasma, apresenta peso
molecular aproximado de 37 kDa e é capaz de converter diretamente L-serina em D-serina.
Esta enzima também pode transformar D-serina em L-serina, mas com baixa afinidade
(Wolosker e cols, 1999a,b). Também foi descrito que a serina racemase atua de maneira
bifuncional, ou seja, além da função racemase, pode funcionar como uma eliminase
produzindo piruvato a partir da L-serina (Figura 4). Utilizando uma ferramenta sintética, a
L-serina O-sulfato, foi mostrado que este composto não endógeno funciona melhor como
substrato para a serina racemase do que a L-serina. Partindo deste substrato, a enzima
catalisa intensamente a reação de eliminação, mostrando ser 500 vezes mais rápida que a
racemização fisiológica (Panizzutti e cols, 2001).
Atuando como eliminase, a serina racemase promove eliminação de água do substrato
L-serina para produzir piruvato e amônia. Mesmo
de racemização feita pela serina racemase, este aminoácido pode ainda sofrer eliminação
através da mesma enzima, gerando piruvato e amônia. A aparente contradição referente à
eliminação do D-aminoácido pode ser explicada pelo fato da D-serina produzida pelas
células se acumular no meio extracelular, como mostrado em culturas de células HEK 293
superexpressando serina racemase, de astrócitos primários e de fatias de tecido córtico-
estriatal (Foltyn e cols, 2005).
15
Intracelular Extracelular Receptor NMDA
Transporte para fora do cérebro
L - serina D - serina D-serina
Figura 4: Diferentes funções da serina racemase (SR) no metabolismo celular da D-serina
e possíveis destinos deste aminoácido.
CaptaçãoPiruvato
SR
16
1.3.2- Distribuição
Inicialmente descoberta em astrócitos centrais, a serina racemase apresenta padrão de
aos da D-serina e do receptor NMDA, com elevada expressão em
ade
Além do piridoxal-5`-fosfato, outros compostos celulares podem regular, de maneira
de da serina racemase. Neste sentido, foi mostrado que
distribuição similar
regiões anteriores do cérebro como o hipocampo e corpo caloso (Wolosker e cols, 1999b).
De maneira geral, no sistema nervoso central de vertebrados, além dos astrócitos, a serina
racemase está localizada em microglia (quiescente e ativada) (Wu e cols, 2004a; Wu e cols,
2007), glia de Bergmann (Kim e cols, 2005), células gliais de Müller da retina (Stevens e
cols, 2003), células suporte do epitélio sensorial vestibular (Dememes e cols, 2006) e
neurônios (Kartvelishvily e cols, 2006; Yoshikawa e cols, 2006; Yoshikawa e cols, 2007).
A expressão da serina racemase também foi descrita no sistema nervoso periférico,
mais precisamente em culturas de nervo ciático contendo fibroblastos e células de Schwann
(Wu e cols, 2004b). Há ainda evidências sobre a presença da serina racemase em tecidos
periféricos fora do sistema nervoso. A distribuição do RNA mensageiro desta enzima
revela a existência de transcritos com pelo menos três diferentes tamanhos em tecidos como
coração, músculo esquelético, rim e fígado (De Miranda e cols, 2000; Wolosker e cols,
1999b; Xia e cols, 2004).
1.3.3- Regulação da ativid
positiva ou negativa, a ativida
cátions (Ca2+ e Mg2+) e ATP são cofatores da serina racemase, levando a um aumento na
síntese da D-serina (Cook e cols, 2002; De Miranda e cols, 2002). E ainda, a observação de
que o Mg2+ potencializa a produção de D-serina estimulada por 1 mM de ATP, uma
concentração bem abaixo da encontrada endogenamente (~ 30-40 mM), sugere que o
17
complexo Mg2+-ATP regule fisiologicamente a serina racemase. Interessantemente, na
presença de Mg2+-ATP a serina racemase forma, a partir de L-serina, três moléculas de
piruvato para cada molécula de D-serina (De Miranda e cols, 2002).
Um trabalho recente demonstrou que o óxido nítrico (NO) diminui fisiologicamente a
atividade catalítica da serina racemase. Este efeito na atividade parece envolver o
erina racemase. Utilizando o sistema de duplo-híbrido em levedura, foi
conteúdo de D-serina
mecanismo de S-nitrosilação, o qual interfere na ligação do cofator ATP com a serina
racemase. Observou-se ainda, que a ativação fisiológica do receptor NMDA aumenta a S-
nitrosilação da serina racemase por ativar a enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS).
Com isso, o óxido nítrico formado por estimulação pós-sináptica pode se difundir para
dentro de astrócitos e neurônios da vizinhança para S-nitrosilar a serina racemase (Mustafa
e cols, 2007).
A interação entre proteínas vem sendo estudada como um fator na regulação da
atividade da s
relatado que a serina racemase se liga à proteína que interage com receptor de glutamato
(GRIP), a qual interage com receptores AMPA de forma a controlar o agrupamento dos
mesmos nas sinapses (Kim e cols, 2005). A interação envolvendo estas proteínas ocorre
entre a parte extrema da porção C-terminal da racemase e o domínio PDZ-6 da GRIP. O
mesmo estudo mostra que a ativação de receptores AMPA (que fosforilados liberam a
GRIP para interagir com a serina racemase) pode levar a um grande aumento da atividade
da serina racemase e da formação de D-serina (Kim e cols, 2005).
Foi mostrado também que uma proteína associada ao complexo de Golgi, a Golga-3,
pode interagir com a serina racemase e regular sua expressão e
(Dumin e cols, 2006). Através de ensaios in vitro e in vivo, foi evidenciado que a
ubiquitilação da serina racemase direciona a mesma para a degradação pelo sistema
18
proteassoma dependente de ubiquitina, sendo este mecanismo modulado pela Golga-3 de
maneira a aumentar significativamente o nível basal e a meia-vida da racemase (Dumin e
cols, 2006).
Além da GRIP, a serina racemase mostrou-se capaz de interagir com o domínio PDZ
de outra proteína, a proteína que interage com cinase C 1 (PICK1) (Fujii e cols, 2006).
A identificação do fenômeno da fosforilação de proteínas, primeiramente descrito no
ntre os principais avanços para entender a regulação de
γ); as
novas - nPKCs (δ, ε, η e θ); e as atípicas - aPKCs (λ e ζ). Estas PKCs apresentam uma
Trabalho recente demonstrou que camundongos com sete dias de vida que não expressam
PICK1 apresentam menos D-serina que os camundongos selvagens. Observou-se ainda,
uma maior produção de D-serina em culturas de células superexpressando PICK1 junto
com a serina racemase (Hikida e cols, 2008).
1.4- Proteína Cinase C (PKC)
início da década de 30, está e
processos celulares. A fosforilação de inúmeras proteínas celulares ocorre pela ação das
proteínas cinases, as quais catalisam a transferência de um grupo fosfato (geralmente do
ATP) para determinados resíduos de aminoácidos presentes na seqüência da molécula alvo.
Esta fosforilação pode ser crucial na alteração da conformação e da função das proteínas
envolvidas. No final da década de 70, pesquisadores japoneses encontraram um novo tipo
de cinase no fígado (Takai e cols, 1977a) e citoplasma cerebral (Inoue e cols, 1977) de ratos
e cerebelo bovino (Takai e cols, 1977b), sendo esta enzima dependente de Ca2+, e por isso
denominada proteína cinase C (PKC) (revisado em Van Der Zee e Douma, 1997).
Em mamíferos, são descritas até o momento 12 isoformas de PKC, das quais 10
divididem-se em três subfamílias: as clássicas ou convencionais - cPKCs (α, βI, βII e
19
região catalítica conservada, que em condição basal parece estar autoinibida por um
domínio pseudosubstrato, além de uma região regulatória com diferentes domínios
modulatórios peculiares a cada subfamília, o que as classificam. As PKCs μ e ν completam
os 12 membros, sendo que ainda não estão inseridas em um grupo específico pelo fato dos
mecanismos regulatórios não estarem completamente estabelecidos (Parker e Murray-Rust,
2004).
A proteína cinase C é composta por uma família de serina/treonina cinases que
apresentam ampla expressão em diferentes tecidos, envolvidas com vários eventos
biológicos como proliferação, diferenciação, sobrevivência, apoptose, angiogênese,
sitídeo (PDK-1). Esta fosforilação inicial da PKC por PDK-1 parece ser seguida de
inflamação e expressão gênica (Mackay e Twelves, 2007). No cérebro, tem sido detectado
alto nível de atividade da PKC e expressão da maioria de suas isoformas (Tanaka e
Nishizuka, 1994). Em células do sistema nervoso central, como neurônios e astrócitos, a
ativação da PKC está associada com o controle de várias funções na comunicação neural
como neurotransmissão, plasticidade sináptica, aprendizado e memória (Alkon e cols,
2005; Kleschevnikov e Routtenberg, 2001; Lan e cols, 2001). Há também dados mostrando
o envolvimento de certas isoformas de PKC com a proliferação e sobrevivência de células
nervosas (Hansel e cols, 2001; Weinreb e cols, 2005). Em contrapartida, alguns estudos
sugerem o papel de determinadas isoformas de PKC na via apoptótica neuronal, tendo este
efeito de particular relevância para doenças neurodegenerativas, onde a morte celular pode
envolver os fenômenos de excitotoxicidade e apoptose (Dempsey e cols, 2000; Maher,
2001).
Logo que sintetizada, a PKC é fosforilada na região catalítica como uma enzima
associada à membrana, fosforilação esta promovida pela cinase-1 dependente de 3-
fosfoino
20
sua autofosforilação e liberação da mesma para o citoplasma da célula. Esta PKC citosólica
mostra-se inativa, mas agora competente cataliticamente para responder aos ativadores
endógenos (Nishizuka, 2001; Parekh e cols, 2000).
Fisiologicamente, as PKCs são influenciadas por diferentes cofatores, sendo que: as
cPKCs são ativadas por Ca2+, fosfatidilserina (PS) e diacilglicerol (DAG); as nPKCs são
moduladas por PS e DAG; as aPKCs são reguladas por PS e fofatidilinositol-3,4,5-
inativa e
oteína periférica de membrana
ue interage com PKC (Staudinger e cols, 1995). Esta proteína encontra-se conservada em
trifosfato; e as PKCs μ e ν podem ser induzidas por DAG e fosfatidilinositol-4,5-difosfato
(Takai e cols, 1979; Battaini, 2001). Esta interação da PKC com seus cofatores permite a
ativação da enzima através da abertura de sua estrutura enovelada, indicando que ocorre
uma diminuição da afinidade do domínio pseudosubstrato pelo sítio catalítico, o qual
exerce sua atividade de fosforilação. Este mecanismo de ativação está relacionado com a
translocação de PKCs para distintas áreas intracelulares e subseqüente fosforilação de
substratos específicos da enzima (Kraft e Anderson, 1983; Amadio e cols, 2006).
O mecanismo de ativação e translocação de cada PKC de um compartimento celular
para outro está correlacionado primeiramente com a interação entre PKC e lipídeos da
membrana plasmática. No entanto, várias proteínas podem interagir com PKCs
ativa, ditando a localização da enzima em diferentes condições funcionais da célula
(Mochly-Rosen e cols, 1995; Jaken, 1996). Dentre estas proteínas envolvidas com a
interação e o direcionamento da PKC para alvos celulares pertinentes tem-se a PICK1
(Jaken e Parker, 2000; Schechtman e Mochly-Rosen, 2001).
1.5- Proteína que Interage com Cinase C 1 (PICK1)
A PICK1 foi descrita inicialmente como sendo uma pr
q
21
várias espécies, incluindo os humanos, onde a PICK1 contém 415 resíduos de aminoácidos.
ão difusa,
, 2004). É
A mesma, apresenta dois domínios estruturais: o domínio PDZ (P95/Dlg/ZO-1), que
participa do controle da interação entre proteínas; e o domínio BAR (Bin/Anfifisina/Rvs),
que regula principalmente o processo de endocitose. Além destes domínios, a PICK1 é
composta de mais três regiões: uma pequena região N-terminal rica em resíduos acídicos e
anterior ao domínio PDZ; uma região de ligação entre os domínios; e uma região C-
terminal caracterizada por um fragmento de resíduos acídicos (Xu e Xia, 2006).
Tem sido mostrada a expressão de PICK1 em diferentes tecidos, principalmente no
cérebro, onde esta proteína pode ser detectada com peso molecular de aproximadamente 55
kDa (Xia e cols, 1999). Na maioria das células, a PICK1 apresenta distribuiç
tendo uma certa predominância ao redor da região perinuclear (Staudinger e cols, 1995; Xia
e cols, 1999; Torres e cols, 2001). Particularmente nos neurônios, a PICK1 está localizada
preferencialmente na região das sinapses (Perez e cols, 2001; Xia e cols, 1999).
A PICK1 tem sido relacionada com as propriedades funcionais de várias proteínas
importantes do sistema nervoso. Pelo fato da PICK1 interagir com a PKC, a mesma pode
regular a fosforilação de padrões moleculares de ligação desta cinase (Dev
descrito que o domínio PDZ da PICK1 interage com regiões específicas na extremidade C-
terminal dos receptores de glutamato dos tipos AMPA, Cainato e metabotrópicos, podendo
regular a fosforilação destes receptores via PKC, de maneira a controlar o agrupamento e a
expressão dos receptores nas sinapses (Hanley e Henley, 2006; Kim e Sheng, 2004; Xia e
cols, 1999).
22
Pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares capazes de regular a atividade da
rina racemase. O controle da função de receptores NMDA é fundamental para vários
rocessos fisiológicos e patológicos no sitema nervoso. Neste sentido, a modulação da
se
p
atividade destes receptores pela D-serina tem recebido grande destaque ultimamente. Além
de apresentar possíveis sítios para fosforilação por PKC, a serina racemase tem sua
atividade regulada devido a interação com PICK1, uma proteína que participa da função da
PKC em determinados compartimentos da célula. Tendo em vista a importância do
contexto a cerca destas moléculas, o desenvolvimento deste trabalho buscou investigar se a
PKC é capaz de modular a atividade da serina racemase, assim como mostrar a participação
da PICK1 no complexo molecular. Este evento biológico, uma vez estando envolvido com
o controle da disponibilidade de D-serina, pode ser relevante para a modulação da atividade
de receptores NMDA e comunicação neuro-glial.
23
2 - Objetivo
Este trabalho teve como objetivo geral avaliar o envolvimento da PKC sobre a
serina racemase, assim como a participação da proteína que interage com
inase C (PICK1) nesta interação.
e fosforilar a serina racemase in vitro e se esta fosforilação
funcional da racemase;
Avaliar, em culturas de astrócitos e de neurônios, se o controle sobre a fosforilação da
entre serina racemase e PKC in vitro e
e da atividade da serina racemase
atividade da
c
2.1 - Objetivos específicos
- Investigar se a PKC é capaz d
interfere sobre a atividade bi
-
serina racemase por PKC regula a produção de D-serina;
- Investigar o envolvimento de PICK1 na interação
in vivo;
- Estudar a regulação por PKC do estado de fosforilação
in vivo.
24
3 - Material e Métodos
.1 - Purificação da serina racemase recombinante
eta da serina racemase de camundongo foi clonada em um vetor
CMV-GST) contendo um promotor do citomegalovírus (CMV) e um gene para a
icum. Células HEK (embrionária de
tampão com excesso de glutationa reduzida (50 mM de Tris-HCl (pH 8), 10 mM de
3
A seqüência compl
(p
glutationa S-transferase (GST) de Schistosoma Japon
rim humano) 293 foram transfectadas com esta construção e puderam expressar
estavelmente serina racemase fusionada a uma cauda de GST. Estas células foram
expandidas em cultura na presença de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino
e geneticina (200 µg/ml). Após atingirem alta confluência, as células foram lisadas em
meio contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 300 de mM cloreto de sódio (NaCl), 1% de
Triton X-100, 0,2 mM fluoreto de fenil-metil-sulfonil (PMSF), 2 mM de ácido etileno-
diamino-tetracético (EDTA) e 30 µM de piridoxal fosfato (PLP). O lisado foi centrifugado
a 26.000 x g por 10 minutos à 4 °C para remover o material insolúvel. O sobrenadante foi
incubado de um dia para o outro sob leve agitação à 4 °C com resina glutationa-agarose
(Sigma, St. Louis, EUA) para ligar na cauda GST da proteína fusionada serina racemase-
GST. Após incubação, a resina foi lavada seis vezes com tampão salina fosfato (PBS)
acrescido com 1% de Triton X-100, 300 mM de NaCl e 30 µM de PLP. Na seqüência, a
resina foi lavada quatro vezes com PBS contendo 30 µM de PLP para remoção do excesso
de sal e detergente. Normalmente, sessenta placas de cultura de 10 cm de diâmetro
confluentes com HEK 293 forneciam um rendimento entre 0,8-1 mg de serina racemase-
GST.
A proteína fusionada serina racemase-GST foi eluída da resina por incubação em
25
glutationa reduzida e 30 µM de PLP). O material resultante da eluíção foi dialisado por
toda noite diante de PBS com 30 µM de PLP. A porção GST foi clivada incubando a
de L-serina, 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 50 µM de
denosina-trifosfato (ATP), 200 µM de fosfatidilserina e 1 mM de cloreto de cálcio
cemase purificada recombinante
proteína fusionada serina racemase-GST com trombina biotinilada por 16 horas à 4 °C em
PBS com 30 µM de PLP. A serina racemase purificada foi obtida após a cauda GST e a
trombina biotinilada serem removidas com as resinas glutationa-agarose e estreptavidina-
agarose, respectivamente. O elevado grau de pureza desta preparação já foi descrito
(Panizzutti e cols, 2001). Em alguns experimentos, a serina racemase-GST foi usada
mostrando resultados similares aos obtidos com a serina racemase purificada como descrito
(De Miranda e cols, 2002).
3.2 - Atividade bifuncional da serina racemase in vitro
Os ensaios cinéticos foram realizados em meio contendo 30 mM de Tris-HCl (pH
7,4), 30 µM de PLP, 10 mM
a
(CaCl2). A reação foi iniciada com a adição de serina ra
(concentração final de 50 μg/ml) na presença ou ausência de PKC purificada (0,3 U/ml)
(Sigma, St. Louis, EUA). Após 1 h à 37 °C a reação foi finalizada por incubação à 100°C
por 5 minutos. Os ensaios usando as preparações de serina racemase-GST e PKC
imunoprecipitada de astrócitos foram realizados nas mesmas condições. No final de todos
os experimento, uma fração do meio de reação foi desproteinizada com 5% ácido
tricloroacético (TCA). Após extrair o TCA por três vezes com uma solução saturada de
éter, as amostras foram derivatizadas com Orto-ftaldialdeído (OPA) e N-tert-
butiloxicarbonil-L-cisteína (Boc-L-Cys) e analisadas por cromatografia líquida de alta
resolução (HPLC) (Shimadzu, Kyoto, Japão) utilizando uma coluna de fase reversa C18
26
(Perkin Elmer, New Orleans, USA) associada a um gradiente crescente de hidrofobicidade.
Este gradiente durava 37 minutos e se baseia no aumento gradativo das concentrações de
um tampão B (concentração elevada de acetonitrila) em relação a um tampão A (baixa
concentração de acetonitrila). A detecção dos aminoácidos derivatizados foi feita por um
detector de fluorescência com excitação em 344 nm e emissão em 443 nm. Esta técnica tem
alta sensibilidade, podendo detectar e dosar aminoácidos em quantidades picomolares,
inclusive separando os isômeros ópticos (Hashimoto e cols, 1992b). Outra parte do meio de
reação foi usada para quantificar a formação de piruvato via ensaio colorimétrico utilizando
2,4 dinitrofenil-hidrazina (DPNH) como descrito (Katsuki e cols, 1971). As proteínas serina
racemase e/ou PKC inativadas por calor serviram como branco.
3.3 - Cultura de astrócitos corticais
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética desta
instituição e foram feitos de acordo com o Instituto Nacional de Saúde dos EUA para
uidado e manipulação com animais de laboratório. As culturas primárias de astrócitos
de ratos neonatos. Os hemisférios cerebrais foram
c
foram preparadas a partir do encéfalo
dissecados e a meninge cuidadosamente removida. Durante a dissecção, as estruturas foram
mantidas em PBS com 0,6% de glicose. Em seguida, as células foram dissociadas com
pipeta Pasteur. Após decantação dos fragmentos não dissociados, o sobrenadante foi
submetido à centrifugação, em centrífuga clínica, a 2000 x g por 5 minutos. O sobrenadante
foi desprezado e o material depositado ressuspendido e plaqueado em garrafas de cultura
contendo DMEM-F12 com 10% de soro fetal bovino. As garrafas foram mantidas em
estufa à 37 °C e 5% de CO2 e o meio de cultura trocado em dias alternados. Quando as
culturas astrocitárias atingiram semi-confluência, as mesmas foram lavadas com PBS e
27
removidas das garrafas de cultura utilizando-se uma solução de 0,25% de tripsina/EDTA,
centrifugadas, ressuspendidas em meio sem soro e plaqueadas em meio DMEM-F12 com
10% de soro fetal bovino em densidades relativas aos diferente ensaios.
3.4 - Cultura primária de neurônios corticais
Embriões Wistar de 14 dias (E14) foram usados para as culturas. O córtex cerebral foi
dissecada e, após retirada das meninges, os neurônios foram cuidadosamente dissociados
m PBS-glicose, centrifugados e ressuspendidos em meio Neurobasal suplementado com
. Neurônios corticais dissociados foram
)), 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) ou 1 μM de bis-
dolil-maleimida (BIM) sempre na presença de 10 mM de L-serina para maximizar a
eparados em DMSO e L-serina em água.
e
B27 como descrito (De Felice e cols, 2004)
plaqueados em placas de 24 poços tratadas com polilisina e incubados à 37 °C em uma
atmosfera umidificada com 5% de CO2. Todos os experimentos foram realizados após 18
dias em cultura.
3.5 - Síntese de D-serina em cultura de células
Astrócitos e neurônios foram tratados por 24 h com o veículo (0,01% de dimetil-
sulfóxido (DMSO
in
atividade de racemização. PMA e BIM foram pr
Todas as soluções utilizadas nos experimentos com as culturas eram estéreis. Após
incubação, o meio condicionado das células foi coletado e 5% de TCA foi adicionado. Para
analisar D-serina intracelular, após retirada do sobrenadante e lavagem das células por duas
vezes com PBS gelado, 5% de TCA foi colocado diretamente nas células. As amostras
foram então processadas e o conteúdo de D-serina foi monitorado por HPLC.
28
3.6 – Autoradiografia
As reações foram realizadas em meio contendo 30 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 30 µM
e PLP, 10 mM de L-serina, 1 mM de MgCl2, 50 µM de ATP, 200 µM de PS, 1 mM de
aCl2 e 1 μCi de [γ-32P]ATP. A reação foi iniciada com a adição de serina racemase
final de 50 μg/ml) na presença ou ausência de PKC purificada (0,3
PBS
elado e lisadas em meio contendo 50 mM de Tris-Hcl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1,5 mM
-100, 10% de glicerol, inibidores de proteases
d
C
purificada (concentração
U/ml). Após 1 h à 37 °C , o tampão de amostra (0,5 M de Tris-HCl (pH 7.4), 10% de
glicerol, 10% de sódio dodecil-sulfato (SDS), 5% de β-mercaptoetanol e 0,001% de azul de
bromofenol) foi imediatamente adicionado aos diferentes grupos, sendo as amostras
fervidas por 5 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese (100 Volts/2 h) em gel
desnaturante de poliacrilamida (SDS/PAGE 10%). Após separação eletroforética, as
proteínas presentes no gel foram coradas com Coomassie. A fosforilação da serina
racemase por PKC via incorporação de fosfato radioativo oriundo do [γ-32P]ATP foi
observada após a secagem do gel, tendo na seqüência a radioatividade revelada por
exposição em filmes de RX Kodak. PKC inativada por calor foi usada como branco.
3.7 - Imunoprecipitação e imunodetecção
Astrócitos e neurônios corticais foram tratados com veículo (0,01% de DMSO), 100
nM de PMA ou 1 μM de BIM. Após 24 h, as células foram lavadas duas vezes com
g
de MgCl2, 1,5 mM de EDTA, 1% de Triton X
(10 µg/ml de aprotinina, leupeptina e pepstatina), 1 mM de PMSF, 20 mM de NaF, 1mM
de orto-vanadato de sódio (Na3VO4) e 1 mM de ácido ocadáico. Após dosar proteína
29
(Bradford, 1976), os lisados (0,5-1 mg/ml) foram incubados durante a noite à 4 °C com
anticorpo anti-serina racemase policlonal de cabra (1:200, Santa Cruz Biotechnology). No
dia seguinte, o material foi incubado com proteína A/G-agarose (1:20, Santa Cruz
Biotechnology) por 2 h à 4 °C. Na seqüência, a resina foi lavada seis vezes com PBS
contendo 1% de Triton X-100 e 300 mM de NaCl. A resina foi subseqüentemente lavada
três vezes com PBS para remover o excesso de sal e detergente.
Os imunoprecipitados foram submetidos à eletroforese (100 Volts/2 h) em gel
SDS/PAGE (10%) e posteriormente as proteínas presentes no gel foram eletrotransferidas
(250 mA/2 h) para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences). Após a
eletrotransferência, as membranas foram incubadas por no mínimo 1 h em solução de
bloqueio contendo 5% de leite molico e 0,1% de Tween-20 (T-PBS). Após o bloqueio das
membranas, estas foram incubadas durante a noite à 4 °C com anticorpo monoclonal anti-
fosfoserina de camundongo (1:5000, Sigma). Após incubação e posterior lavagem
extensiva com T-PBS, as membranas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora
com o anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (1:10000, Amersham
Biosciences). Após nova lavagem extensiva com T-PBS, as bandas imunoreativas foram
visualizadas usando detecção por quimioluminescência (ECL Plus, Amersham
Biosciences). A mesma membrana de nitrocelulose foi incubada em solução ácida de 0,2 M
de glicina (pH 2,5) por 1h à temperatura ambiente para desfazer as ligações dos anticorpos
presentes nesta membrana. Feito isto, esta membrana foi incubada com anticorpo policlonal
anti-serina racemase de coelho (1:500, purificado por afinidade), servindo de controle para
o nível total de serina racemase. As avaliações densitométrica e quantitativa das bandas
presentes nos filmes de RX foram feitas usando o programa computacional HAWGC
(Holub e Ferreira, 2006). Em todos os experimentos, os resultados foram apresentados
30
como a razão entre a intensidade das bandas para anti-fosfoserina e a imunoreatividade para
serina racemase.
As mesmas etapas foram realizadas para imunoprecipitar PKC de cultura de
astrócitos, porém utilizando anticorpo monoclonal anti-PKC de camundongo (1:200,
Calbiochem).
3.8 - Imunocitoquímica
Astrócitos e neurônios plaqueados em lamínulas foram fixados com paraformaldeído
4% por 20 minutos e permeabilizados com 0,2% de Triton X-100 em PBS por 5 min à
mperatura ambiente. Posteriormente, as células foram bloqueadas com 5% de albumina
ós 30 minutos, as células foram incubadas com os seguintes
0 mM de NaCl, 1,5 mM
te
bovina sérica (BSA). Ap
anticorpos primários: anticorpo monoclonal anti-PKC de camundongo (1:300,
Calbiochem), anticorpo policlonal anti-PICK1 de cabra (1:300, Santa Cruz Biotechnology)
e anticorpo policlonal anti-serina racemase de coelho (1:300, purificado por afinidade) por
12 h à 4 °C. Então, as células foram lavadas com PBS e incubadas com os seguintes
anticorpos secundários específicos (1:1000, Molecular Probes): Alexa 488, Alexa 555 e
Alexa 647 por 1 h à temperatura ambiente. Em todas as imunomarcações, os controles
negativos foram feitos incubando as células somente com os anticorpos secundários. Não
foi observada imunoreatividade na ausência do anticorpo primário. As imagens foram
capturadas através do microscópio confocal Zeiss Meta 510 laser.
3.9 - Coimunoprecipitação
Astrócitos, neurônios ou cérebros de ratos (2-3 meses de vida) foram homogeneizados
em tampão de imunoprecipitação (50 mM de Tris-Hcl (pH 7,4), 15
31
de MgCl2, 1,5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, inibidores de
rotinina, leupeptina e pepstatina) e 1 mM de PMSF. O
ar,
ARKER) e cloridrato de xilazina (5mg/kg, Rompum, BAYER), sendo adicionalmente
ificação da ausência de
proteases (10 µg/ml de ap
homogenato foi centrifugado a 26.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante (1 mg/ml) foi
incubado de um dia para o outro à 4 °C com anticorpos contra serina racemase, PKC ou
PICK1. Após isto, proteína A/G-agarose foi adicionada ao material por 2 h à 4 °C.
Posteriormente, a resina foi lavada seis vezes com PBS contendo 1% de Triton X-100 e 300
mM de NaCl, e três vezes com PBS para remover o excesso de sal e detergente. Os
diferentes imunoprecipitados foram submetidos à eletroforese em gel SDS/PAGE (10%)
seguida de transferência para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences).
Coimunoprecipitação das proteínas foi analisada por imunodetecção dos três
imunoprecipitados com os anticorpos contra serina racemase, PKC ou PICK1. Lisados
incubados com IGg irrelevante seguido de proteína A/G-agarose ou só a proteína A/G-
agarose, nas mesmas condições experimentais anteriores, serviram de controle negativo.
3.10 - Injeção aguda de PMA e BIM no córtex frontal de ratos
Ratos adultos (Wistar), com 300-400 g de peso, foram anestesiados com injeção
intramuscular de Valium (1,5 mg/kg, ROCHE), cloridrato de cetamina (100 mg/kg, Ketal
P
medicados com sulfato de atropina (0,2mg/kg, i.m.). Após ver
reflexos nociceptivos, o animal era colocado em um aparelho estereotáxico (INSIGHT),
cujas barras de ouvido eram untadas com anestésico local (pomada de xilocaina,
AstraZeneca). A temperatura corporal era mantida em 37 oC com uma superfície
termoregulável (INSIGHT) e as freqüências respiratória e cardíaca eram monitoradas
regularmente pelo experimentador, durante todo o procedimento cirúrgico, bem como o
32
nível dos reflexos palpebral (pingando uma gota de salina no olho do animal) e nociceptivo
(pinçando levemente a pata com uma pinça). Quando necessário, doses adicionais de
cloridrato de cetamina eram administradas por via intramuscular. Uma vez induzido um
nível profundo de anestesia, o couro cabeludo era raspado, desinfetado com aplicação de
peróxido de hidrogênio e uma incisão sagital era praticada com bisturi. Após reclinação da
pele, o periósteo era levemente raspado para expor as suturas ósseas que permitem, de
acordo com o atlas estereotáxico do rato (Zilles, 1944), a localização do córtex frontal.
Uma pequena craniotomia (1 mm de diâmetro) era praticada bilateralmente nas
coordenadas (anterior: 3 mm e lateral: 2 mm; em relação ao Bregma). As bordas das
craniotomias eram cuidadosamente limpas com uma cureta dental, e uma micro-incisão era
praticada na dura máter. Em dois hemisférios (igualmente operados), agulha de uma
microseringa Hamilton (Sigma-Aldrich) era inserida 1,5 mm abaixo da superfície cortical e
mantida por 10 minutos antes de injetar alguma solução. Feito isto, 1,5 µl de solução
contendo PMA (1 µM) ou BIM (1 µM) eram injetados em 15 minutos (fluxo: 0,1 µl/min).
A injeção do veículo (0,001% de DMSO) feita no hemisfério oposto do mesmo animal
tratado serviu como controle. Após completar a injeção, a seringa era deixada no lugar por
10 minutos adicionais, e a seguir retirada lentamente. Após 1 hora, o animal, ainda
anestesiado, era sacrificado por inalação de éter e decapitado. Imediatamente, o encéfalo
era retirado da caixa craniana com a ajuda de um saca-bocado e colocado numa matriz de
acrílico para cérebro de rato adulto. Uma fatia coronal de 4 mm de extensão ântero-
posterior, centrada nas coordenadas do sítio de injeção, era separada com uma lâmina. As
metades esquerda e direta eram separadas, as estruturas subcorticais eram rapidamente
removidas com uma espátula. O processo de retirada das amostras demorava
aproximadamente 30 segundos após a decapitação. As amostras de tecido cortical eram
33
colocadas em tampão para imunoprecipitação a 4 °C e o tecido era homogeneizado para
verificar os níveis de D-serina e o estado de fosforilação em resíduos de serina da serina
racemase imunoprecipitada, por procedimentos já mencionados.
3.11 - Estatística
Todos os valores nas figuras deste estudo indicaram médias ± erro padrão. A
determinação da significância estatística foi fornecida pela análise da variância (ANOVA),
guida pelo teste de comparação múltipla de Dunnet.
dobe Photoshop CS para melhor
isualização das bandas imunoreativas.
se
3.12 – Processamento de imagens
De uma maneira geral, os filmes contendo as imunodetecções de diferentes proteínas
foram trabalhados no programa computacional A
v
34
4. Resultados
.1 - PKC purificada diminui a atividade da serina racemase in vitro
A análise da seqüência da serina racemase indicou seis possíveis sítios de consenso
o por PKC (Figura 5), similares aos sítios de consenso presentes em outros
lvos moleculares desta cinase (Kishimoto e cols, 1985; Plewczynski e cols, 2005). Para
s cinéticos foram
4
para fosforilaçã
a
mostrar se a PKC poderia fosforilar a serina racemase in vitro, ensaio
realizados com ambas proteínas purificadas em meio de reação contendo ativadores
específicos das mesmas. Nós observamos que a PKC inibe significativamente a atividade
de racemização da serina racemase, resultando em uma menor produção de D-serina
(Figura 6A). A PKC também inibiu significativamente a atividade de eliminação da serina
racemase, resultando em uma menor formação de piruvato (Figura 6B). As reduções de D-
serina e piruvato foram associadas a um aumento na fosforilação da serina racemase por
PKC via incorporação de fosfato radioativo oriundo do [γ-32P]ATP, como mostrado por
autoradiografia (Figura 6C).
35
M
TK
igura 5: Seqüências da serina racemase de diferentes espécies (camundongo, humano e
rato) mostrando seis possíveis sítios para fosforilação por PKC. Destes sítios, dois são para
sforilação em resíduos de treonina (verde) e quatro, bem conservados entre as espécies,
o para fosforilação em resíduos de serina (laranja).
rina racemase - Mus musculus (camundongo)CAQYCISFADVEKAHINIQDSIHLTPVLTSSILNQIAGRNLFFKCELFQKTGSFKIRGALNAIRGLIPDTPEEKPKAVVTHS
LTYAAKLEGIPAYIVVPQTAPNCKKLAIQAYGASIVYCDPSDESREKVTQRIMQETEGILVHPNQEPAVIAGQGIALEVLNQVPLVDALVVPVGGGGMVAGIAITIKALKPSVKVYAAEPSNADDCYQSKLKGELTPNLHPPETIADG SSIGLNTWPIIRDLVDDVFTVTEDEIKYATQLVWGRMKLLIEPTAGVALAAVLSQHFQTVSPEVKNVCIVLSGGNVDLTSNWVGQAERPAPYQTVSV
rina racemase - Homo sapiens (humano)CAQYCISFADVEKAHINIRDSIHLTPVLTSSILNQLTGRNLFFKCELFQKTGSFKIRGALNAVRSLVPDALERKPKAVVTHS
SGNHGQALTYAAKLEGIPAYIVVPQTAPDCKKLAIQAYGASIVYCEPSDESRENVAKRVTEETEGIMVHPNQEPAVIAGQGTALEVLNQVPLVDALVVPVGGGGMLAGIAITVKALKPSVKVYAAEPSNADDCYQSKLKGKLMPNLYPPETIADGVSSIGLNWPIIRDLVDDIFTVTEDEIKCATQLVWERMKLLIEPTAGVGVAAVLSQHFQTVSPEVKNICIVLSGGNVDLTSSITWVKQAE
RPASYQSVSV
Serina racemase - Rattus norvegicus (rato)CAQYCISFADVEKAHLNIQDSVHLTPVLTSSILNQIAGRNLFFSFKIRGALNAIRGLIPDTLEGKPKAVVTHSS
GQALTYAAKLEGIPAYIVVPQTAPNCKKLAIQAYGASIVYSEPSDESRENVAQRIIQETEGILVHPNQEPAVIAGQGTIALEVLNQVPLVDALVVPVGGGGMVAGIAITIKTLKPSVKVYAAEPSNADDCYQSKLKGELTPNLHPPETIADGVSSIGLNTW
IRDLVDDVFTVTEDEIKYATQLVWERMKLLIEPTAGVGLAAVLSQHFQTVSPEVKNICIVLSGGNVDLTSLSWVKQAERP
Se
SGNHGQA
L
SeM
IT
MGNH
PIAP
F
fo
sã
36
igura 6: PKC inibe a atividade da serina racemase por fosforilação. Atividade
ifuncional da serina racemase (SR) recombinante purificada (50 μg/ml) foi avaliada na
presença ou ausência da PKC purificada (0,3 U/ml) à 37 oC por 1 h. Os resultados foram
representados como percentual em relação ao controle (serina racemase). PKC inativada
por calor foi usada como controle negativo. Serina racemase inativada por calor foi usada
F
b
como branco. (A) Produção de D-serina foi monitorada por HPLC. (B) Formação de
piruvato foi quantificada via ensaio colorimétrico usando 2,4 DPNH. As barras nos gráficos
representam a média ± erro padrão de três experimentos independentes, cada um realizado
em duplicata com três diferentes preparações da racemase. * Diferença estatística em
relação ao controle com P < 0,01. (C) Fosforilação da serina racemase por PKC (SR +
PKC) via incorporação de fosfato radioativo oriundo do [γ-32P]ATP, como mostrado por
autoradiografia. A autofosforilação da PKC (SR + PKC, PKC) também foi observada. Em
diferentes grupos, a PKC inativada por calor foi usada tanto como controle negativo (SR +
PKC inativa) quanto como branco (PKC). Experimento representativo.
Racemização
SR SR+PKC SR+PKC inativa0
50
100D
-ser
ina
(% d
o co
ntro
le)
*
AAEliminação
50
0SR SR+PKC SR+PKC inativa
100
Piru
vato
(%
do
cont
role
)
*
BB
CC
AutoradiografiaSR+
PKC
SR+
PKC inativa
SR
PKC
SR PKC
37,1 kDa
82,2 kDa
64,2 kDa
48,8 kDa
25,9 kDa
115,5 kDa
AutoradiografiaSR+
PKC
SR+
PKC inativa
181,1 kDa
SR
PKC
SR PKC
37,1 kDa
82,2 kDa
64,2 kDa
48,8 kDa
25,9 kDa
115,5 kDa
181,1 kDa
SR
PKC
SR
PKC
SR PKC
37,1 kDa
82,2 kDa
64,2 kDa
48,8 kDa
25,9 kDa
115,5 kDa
181,1 kDa
37,1 kDa
82,2 kDa
64,2 kDa
48,8 kDa
25,9 kDa
115,5 kDa
181,1 kDa
37
4.2 - PKC imunoprecipitada de astrócitos diminui a atividade da serina racemase in
vitro
Para confirmar os resultados obtidos usando a PKC purificada comercial, nós
nalisamos a atividade bifuncional da serina racemase na presença de PKC
atividades, racemase e eliminase, da serina racemase (Figuras 7A e 7B). Análises
a
imunoprecipitada de cultura de astrócitos. Nós mostramos que a PKC de astrócitos reduz
ambas
por imunodetecção mostraram que a PKC inibe a serina racemase concomitantemente a um
aumento no grau de fosforilação da racemase em resíduos de serina (Figura 7C).
38
reparações da serina racemase fusionada a uma cauda de GST (SR-GST, concentração
nal de 50 μg/ml) na presença ou ausência PKC imunoprecipitada (PKCip) de astrócitos à
7 oC por 1 h. Os resultados foram representados como percentual em relação ao controle
(serina racemase). PKCip inativada por calor foi usada como controle negativo. Serina
cemase inativada por calor foi usada como branco. (A) Formação de D-serina foi
WB : P-ser
Figura 7. PKC proveniente de astrócitos reduz a atividade da serina racemase através
de fosforilação. Atividade da enzima serina racemase (SR) foi determinada a partir de
p
fi
3
ra
monitorada por HPLC. (B) Produção de piruvato foi quantificada via ensaio colorimétrico
usando 2,4 DPNH. As barras nos gráficos representam a médias ± erro padrão de quatro
experimentos independentes, cada um realizado em duplicata com quatro diferentes
preparações da racemase. * Diferença estatística em relação ao controle com P < 0,01. (C)
Fosforilação da serina racemase (SR-GST + PKCip) em resíduos de serina como mostrado
por imunodetecção (WB) usando anticorpo anti-fosfoserina (P-ser). Em diferentes grupos, a
PKCip inativada por calor foi usada tanto como controle negativo (SR-GST + PKCip
inativa) quanto como branco (PKCip inativa). Experimento representativo.
64 kDa
SR-GST
PKCip
PKCip inativa
+ -
- -
- +
++
++
--
- -
+ +
+ +
--
++
--
CC
SR-GST
PKCip
PKCip inativa
+ -
- -
- +
++
++
--
++
++
--
- -
+ +
+ +
- -
+ +
+ +
--
++
--
--
++
--
CC
Racemização
SR SR+PKCip SR+PKCip inativa 0
50
100
se (%
do
con
*
AAEliminação
D-
rina
trole
)
50
100
Piru
vato
(%
do
cont
role
)
*
BB
0SR SR+PKCip SR+PKCip inativa
39
4.3 - Serina racemase, PKC e PICK1 interagem em astrócitos
A PICK1 apresenta elevada expressão no cérebro, onde modula várias funções da
PKC (Xia e cols, 1999), além de interagir diretamente com a serina racemase (Fujii e cols,
2006). Entretanto, a interação entre PKC e serina racemase, assim como a formação de um
complexo molecular envolvendo a serina racemase, PKC e PICK1, ainda não foi mostrado
em nenhum modelo experimental. Com isso, nós fomos avaliar se as proteínas serina
racemase, PKC e PICK1 teriam uma distribuição similar em culturas de astrócitos. Análises
imunocitoquímicas por microscopia confocal evidenciaram um padrão de marcação
semelhante destas proteínas, que culminou na colocalização das mesmas (Figura 8A). Para
confirmar e fortalecer esta interação que ocorre em astrócitos, nós fomos avaliar este evento
através do ensaio de coimunoprecipitação. Nós observamos que a imunoprecipitação da
serina racemase, PKC ou PICK1 acarreta a precipitação das outras duas proteínas,
mostrando que estas três proteínas podem interagir e formar um complexo molecular nestas
células.(Figura 8B).
40
A
DAPI SR PICK1aa cc
PKC Colocalização
dd
GFAP
ffee
bb
A
64,2 kDa
82,2 kDa
IP: SR IP: PKC IP: PICK1 IGg resina
WB: PKC
BB
aa ccbb eedd
11
Figura 8. Interação da serina racemase, PKC e PICK1 em astrócitos. (A) Análises de
unomarcação para serina racemase, PICK1 e PKC foram realizadas em culturas de
icroscopia confocal. (a) DAPI. (b) serina racemase. (c)
im
astrócitos e visualizadas por m
48,8 kDa
37,1 kDa
WB: PICK1
WB: SR
22
33
41
PICK1. (d) PKC. (e) Setas indicando algumas áreas nas quais a serina racemase, PKC e
ICK1 colocalizam em astrócitos. (f) Presença de células positivas para GFAP, um
arcador de astrócitos maduros. (B) As proteínas serina racemase (SR) (a), PKC (b) ou
ICK1 (c) foram imunoprecipitadas (IP) a partir de homogenato de cultura de astrócitos
sando anticorpos específicos. Imunodetecção (WB) da PCK (1), PICK1 (2) e serina
P
m
P
u
racemase (3) revelou que ocorre coimunoprecipitação destas proteínas. A
imunoprecipitação de cada proteína também foi demonstrada. Os controles negativos foram
feitos com uma IGg irrelevante (d) ou somente a resina (e).
42
4.4 - Fosforilação por PKC regula a atividade da serina racemase astrocitária
ara observar se a PKC regula os níveis de D-serina produzida pela serina racemase, nós
atamos culturas de astrócitos com 100 nM de PMA, um ativador de PKC, ou 1 μM de
IM, um inibidor de PKC, em meio sem soro. Análise do meio extracelular por HPLC
dicou que o PMA diminui a produção de D-serina pelas células, enquanto o BIM aumenta
produção de D-serina pelas células (Figura 9A). Já a D-serina intracelular aumentou
gnificativamente na presença do BIM, mas a aparente diminuição com o PMA não teve
o PMA
P
tr
B
in
a
si
significância estatística (Figura 9B). Análises por imunodetecção mostraram que
aumenta o nível basal de fosforilação em resíduos de serina da serina racemase
imunoprecipitada, enquanto o BIM promove efeito oposto (Figura 9C). Com estes
resultados nós sugerimos que a PKC regule fisiologicamente a atividade da serina racemase
astrocitária por controlar o estado de fosforilação desta racemase.
43
Figura 9. Fosforilação da serina racemase por PKC astrocitária diminui a produção
de D-serina. Culturas de astrócitos foram tratadas com veículo (0,01% de DMSO), PMA
(100 nM) ou BIM (1 μM) e L-serina (10 mM) por 24 h. Os resultados foram representados
omo percentual em relação ao controle (veículo). (A) D-serina extracelular monitorada por
PLC. As barras nos gráficos representam as médias ± erro padrão de cinco experimentos
independentes, cada um realizado em duplicata. * Diferença estatística em relação ao
(B) D-serina intracelular monitorada por HPLC. As barras nos
ráficos representam as médias ± erro padrão das médias de dois experimentos
dependentes, cada um realizado em duplicata. * Diferença estatística em relação ao
anti-fosfoserina para retirada deste anticorpo, o controle de carregamento foi feito com
c
H
controle com P < 0,01.
g
in
controle com P < 0,01. (C) Fosforilação da serina racemase imunoprecipitada (IP) em
resíduos de serina como mostrado por imunodetecção (WB) usando anticorpo anti-
fosfoserina (P-ser). Após tratamento com glicina ácida da mesma membrana marcada com
Veículo PMA BIM0
50
100
150
200Racemização
nac
(% d
o co
ntro
le)
*
*
AAD
-ser
i e
xtra
elul
ar
Veículo PMA BIM0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
SR fo
sfor
ilada
(P-s
er/S
R)
**
**
WB : SR
WB : P-ser
IP : SR Veículo PMA BIM
37 kDa
37 kDa
CC
Racemização
35030025020015010050
400
D-s
erin
a in
trac
elul
ar(%
do
cont
role
)
*BB
0Veículo PMA BIM
44
marcação com anticorpo anti-serina racemase (SR). Experimento representativo. As barras
nos gráficos abaixo representam as médias ± erro padrão da razão entre imunoreatividade
relativa para fosfoserina e intensidades das bandas para serina racemase de três
experimentos diferentes. * Diferença estatística em relação ao controle com P < 0,05.
45
4.5 - Interação da serina racemase, PKC e PICK1 em neurônios
Os neurônios expressam serina racemase (Kartvelishvily e cols, 2006). A expressão
e PKC e PICK1 também foi descrita em neurônios (Tanaka and Nishizuka, 1994; Xia et
l, 1999). No entanto, assim como nos astrócitos, não há relatos sobre a interação em
onjunto destas três proteínas. Então, novamente nós fizemos análises imunocitoquímicas
tilizando microscopia confocal e observamos que a serina racemase, PKC e PICK1
olocalizam em neurônios (Figura 10A). Nós confirmamos esta interação entre as
roteínas através de ensaios de coimunoprecipitação, onde mostramos que a
recipitação das outras
d
a
c
u
c
p
imunoprecipitação da serina racemase, PKC ou PICK1 acarreta a p
duas proteínas, mostrando que estas três proteínas podem interagir e formar um complexo
molecular também em neurônios (Figura 10B).
46
AA
DAPI SRPKC
PICK1 Colocalização β-tubulina III20 μm
dd
ccbb
ffee
aa
64,2 kDa
82,2 kDa
48,8 kDa
37,1 kDa
IP: SR IP: PKC IP: PICK1 IGg Resina
WB: PKC
WB: PICK1
WB: SR
BB
11
22
33
aa ccbb eedd
47
Figura 10. Serina racemase, PKC e PICK1 colocalizam em neurônios. (A) Análises de
unomarcação tripla foram realizadas em culturas de neurônios através de microscopia
confocal. Para tripla marcação, anticorpo policlonal anti-serina racemase de coelho foi
sado junto com anticorpo monoclonal anti-PKC de camundongo e anticorpo policlonal
nti-PICK1 de cabra. (a) DAPI. (b) PKC. (c) serina racemase. (d) PICK1. (e) Setas
dicando áreas nas quais a serina racemase, PKC e PICK1 colocalizam em neurônios. (f)
resença de células positivas para β-tubulina III, um marcador de neurônios. (B) As
roteínas serina racemase (SR) (a), PKC (b) ou PICK1 (c) foram imunoprecipitadas (IP) a
artir de homogenato de cultura de neurônios usando anticorpos específicos.
im
u
a
in
P
p
p
Imunodetecção (WB) da PCK (1), PICK1 (2) e serina racemase (3) revelou que ocorre
coimunoprecipitação destas proteínas. A imunoprecipitação de cada proteína também foi
demonstrada. Os controles negativos foram feitos com uma IGg irrelevante (d) ou somente
a resina (e).
48
4.6 - PKC modula a atividade da serina racemase neuronal via fosforilação
Sendo a serina racemase expressa pelos neurônios (Kartvelishvily e cols, 2006), nós
vestigamos a regulação da serina racemase neuronal por PKC. Para isso, nós tratamos
ulturas de neurônios com 100 nM de PMA, um ativador de PKC, ou 1 μM de BIM, um
ibidor de PKC, em meio sem soro. Análise do meio extracelular por HPLC indicou que o
MA diminui a produção de D-serina pelos neurônios, enquanto o BIM aumenta a
rodução de D-serina pelas células (Figura 11A). Já a D-serina intracelular aumentou
A não teve
in
c
in
P
p
significativamente na presença do BIM, mas a aparente diminuição com o PM
significância estatística (Figura 11B). Análises por imunodetecção mostraram que o PMA
aumentar o nível basal de fosforilação em resíduos de serina da serina racemase
imunoprecipitada, enquanto o BIM promove efeito oposto (Figura 11C). Os controles
foram tratados com a mesma concentração de DMSO (veículo de ambos PMA e BIM).
Com estes resultados nós sugerimos que a PKC também regule fisiologicamente a atividade
da serina racemase neuronal por controlar o estado de fosforilação desta racemase.
49
Figura 11. Fosforilação da serina racemase por PKC neuronal diminui a produção de D-
erina. Culturas de neurônios foram tratadas com veículo (0,01% de DMSO), PMA (100
M) ou BIM (1 μM) e L-serina (10 mM) por 24 h. Os resultados foram representados como
ercentual em relação ao controle (veículo). (A) D-serina extracelular monitorada por
HPLC. As barras nos gráficos representam as médias ± erro padrão de três experimentos
dependentes, cada um realizado em duplicata. * Diferença estatística em relação ao
ontrole com P < 0,01. (B) D-serina intracelular monitorada por HPLC. As barras nos
ráficos representam as médias ± erro padrão das médias de dois experimentos
tes, cada um realizado em duplicata. * Diferença estatística em relação ao
s
n
p
in
c
g
independen
Veículo PMA BIM0
50
100
Racemização
setr
ar(%
do
cont
role
)
*
*AA
D-
rina
exac
elul
Veículo PMA BIM0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
SR fo
sfor
ilada
(P-s
er/S
R)
**
**
IP : SR
WB : SR
WB : P-ser
Veículo PMA BIM
37 kDa
37 kDa
CC
Racemização
150
Veículo PMA BIM0
50
100
200
D-s
erin
a in
trac
(% d
o co
ntro
le)
BB
*
elul
ar
50
controle com P < 0,01. (C) Fosforilação da serina racemase imunoprecipitada (IP) em
resíduos de serina como mostrado por imunodetecção (WB) usando anticorpo anti-
fosfoserina (P-ser). Após tratamento com glicina ácida da mesma membrana marcada com
anti-fosfoserina para retirada deste anticorpo, o controle de carregamento foi feito com
marcação com anticorpo anti-serina racemase (SR). Experimento representativo. As barras
nos gráficos abaixo representam as médias ± erro padrão da razão entre imunoreatividade
relativa para fosfoserina e intensidades das bandas para serina racemase de três
experimentos diferentes. * Diferença estatística em relação ao controle com P < 0,05.
51
4.7 - Interação da serina racemase, PKC e PICK1 in vivo
Para estudar a interação envolvendo a serina racemase, PKC e PICK1 in vivo, nós
nalisamos por imunodetecção os imunoprecipitados de cada uma destas proteínas,
riundos de homogenatos de cérebro de rato. Através do ensaio de coimunoprecipitação,
ssim como em astrócitos e neurônios in vitro, nós observamos que a serina racemase, PKC
PICK1 também precipitam juntas in vivo, indicando que a interação destas três proteínas
ossa ter uma importância fisiológica (Figura 12).
a
o
a
e
p
52
IP: PKC IP: PICK1IP: SR
Rac 645 kDa _36 kDa _
55 kDa _
45 kDa _
97 kDa _
66 kDa _ WB: PKC
WB: PICK1
WB: SR
aa ccbb
11
22
33
Figura 12. Interação da serina racemase, PKC e PICK1 in vivo. Os diferentes imunoprecipitados
e cérebro de rato foram analisados por imunodetecção, mostrando a coimunoprecipitação. As
proteínas PKC (a), serina racemase (SR) (b) ou PICK1 (c) foram imunoprecipitadas (IP) a
usando anticorpos específicos. Imunodetecção
B) da PCK (1), PICK1 (2) e serina racemase (3) revelou que ocorre
oimunoprecipitação destas proteínas. A imunoprecipitação de cada proteína também foi
onstrada. A rac 6 (linhagem que superexpressa serina racemase) serviu como controle
munodetecção da serina racemase. Os controles negativos foram feitos com
ma IGg irrelevante (dado não mostrado).
d
partir de homogenato de cérebro de rato
(W
c
dem
positivo para a iu
53
4.8 - PKC regula a disponibilidade de D-serina in vivo
Para estudar a regulação da produção de D-serina por PKC in vivo, nós injetamos, em
um dos hemisférios cerebrais de ratos, PMA, um ativador de PKC, ou BIM, um inibidor de
KC, diretamente no córtex frontal. A injeção do veículo (DMSO) de ambos, PMA e BIM,
a mesma concentração foi usada como controle. Análises por HPLC mostraram que o
MA diminui a concentração de D-serina presente nos homogenatos desta região, enquanto
BIM aumenta o conteúdo de D-serina na mesma região do cérebro do animal (Figura
racemase imunoprecipitada do
P
n
P
o
13A). Avaliando o grau de fosforilação da serina
homogenato deste tecido, nós observamos que o PMA aumenta a fosforilação basal da
racemase em resíduos de serina, enquanto o BIM diminui esta fosforilação (Figura 13B).
Estes resultados sugerem que a PKC regule in vivo a atividade fisiológica da serina
racemase no córtex frontal por controlar o estado de fosforilação desta racemase.
54
Homogenato de córtexfrontal de rato
Veículo PMA Veículo BIM0
25
150
125
100
75
50
Animal 2Animal 1
D-s
erin
a(%
do
cont
role
)
Veículo PMA Veículo BIM0.0
0.5
1.0
1.5
Animal 1 Animal 2
SR fo
sfor
ilada
(P-s
er/S
R)
IP: SRWB: P-ser
WB: SR
BB
AA
37 kDa
37 kDa
55
Figura 13. Regulação da disponibilidade de D-serina por PKC in vivo. PMA (animal 1)
u BIM (animal 2), ambos 1 µM, foram injetados diretamente no córtex frontal de ratos.
pós 1 h, parte do tecido do córtex frontal foi dissecada e homogeneizada em tampão para
unoprecipitação. (A) Parte do homogenato foi tratada com 5% de TCA para posterior
nálise dos níveis de D-serina por HPLC. A injeção com o veículo (0,001 % de DMSO) no
órtex frontal do hemisfério oposto ao tratado com PMA ou BIM no mesmo animal serviu
omo controle. (B) Outra parte deste homogenato foi usada para imunoprecipitar (IP) a
rina racemase (SR) utilizando anticorpo específico. O estado de fosforilação desta serina
cemase imunoprecipitada foi avaliado por imunodetecção (WB) usando anticorpo anti-
o
A
im
a
c
c
se
ra
fosfoserina (P-ser). Após tratamento com glicina ácida da mesma membrana marcada com
anti-fosfoserina para retirada deste anticorpo, o controle de carregamento foi feito com
anticorpo anti-serina racemase. O gráfico representa a razão entre a imunoreatividade
relativa para fosfoserina e intensidades das bandas para serina racemase.
56
5. Discussão
No sistema nervoso, tem sido mostrado que a interação entre proteínas controla
iversos eventos biológicos (Kim e Sheng, 2004). Neste trabalho, nós demonstramos que a
rina racemase tem sua capacidade de formar D-serina reduzida como decorrência da
teração com a PKC.
Um dos mecanismos que regula a atividade de uma enzima é a fosforilação. Nós
ue a PKC regula negativamente a atividade da serina racemase e fosforila a
cemase. Observamos que a serina racemase possui seis sítios consenso para fosforilação
serina racemase após a fosforilação induzida por PKC.
trócitos e neurônios, nós mostramos que o PMA
(ativador de PKC) diminui o nível extracelular de D-serina e aumenta a fosforilação basal
d
se
in
observamos q
ra
por PKC, dentre eles quatro em resíduos de serina e dois em resíduos de treonina. Além da
imunodetecção com anticorpo contra resíduos de serina fosforilados, nós também
realizamos ensaios autoradiográficos que permitiram visualizar a incorporação de fosfato
radioativo na estrutura da
Considerando a autoradiografia, não podemos descartar que os resíduos de treonina
presentes na serina racemase também sejam fosforilados por PKC, podendo também
participar da regulação desta racemase.
Nosso estudo demonstra que a regulação da atividade da serina racemase através de
fosforilação mediada por PKC parece controlar a disponibilidade de D-serina. Utilizando a
serina racemase recombinante, nós mostramos que ambas PKCs, purificada e
imunoprecipitada de astrócitos, são capazes de inibir a atividade bifuncional da serina
racemase. Usando anticorpo anti-fosfoserina nós observamos que a fosforilação da serina
racemase em resíduos de serina ocorre de forma concomitante a uma queda na produção de
piruvato e D-serina. Em culturas de as
57
da serina racemase em resíduos de serina, enquanto o BIM (inibidor de PKC) apresenta
efeitos opostos. Evidenciamos também que a serina racemase e a PKC interagem nestas
culturas e em encéfalo de ratos adultos. Nosso resultado in vivo mostra que a regulação da
atividade da serina racemase por PKC parece controlar a disponibilidade de D-serina no
córtex frontal de ratos. Assim como nas culturas, ocorre uma diminuição e um aumento do
conteúdo de D-serina proporcionados pelo PMA e pelo BIM, respectivamente. Todas estas
evidências sugerem que o controle dos níveis de D-serina parece estar correlacionado com
a regulação da atividade da serina racemase via fosforilação por PKC. Analogamente, a
fosforilação em resíduos de serina de receptores cinase acoplados à proteína G também
promove uma diminuição da atividade enzimática destas proteínas (Horner e cols, 2005).
Observamos tanto em astrócitos como em neurônios que enquanto o inibidor da PKC
(BIM) aumenta os níveis de D-serina intra e extracelulares, o ativador da PKC (PMA)
diminui a concentração de D-serina extracelular, mas não a de D-serina intracelular. Uma
possibilidade é que o PMA esteja interferindo no transporte celular de D-serina.
Interessantemente, a ativação da PKC por PMA em linhagens celulares de mamíferos que
expressam diferentes transportadores de aminoácidos, foi capaz de inibir a função dos
sistemas sensível e insensível à leucina (Rotmann e cols, 2007). Além disso, a ativação da
PKC α (alfa) por PMA mostrou associação com a redistribuição de transportadores de
glutamato neuronais, como o transportador de aminoácidos excitatórios 1 (EAAC1),
podendo assim influenciar na atividade destes transportadores (González e cols, 2003).
Neste sentido, utilizando co-culturas de astrócitos e neurônios e células C6
superexpressando o transportador de glutamato subtipo 1 (GLT-1), foi mostrado que a
ativação da PKC com PMA causa redistribuição e redução da expressão destes receptores,
podendo isto interferir no transporte de glutamato (Kalandadze e cols, 2002). Considerando
58
as evidências, é possível que no nosso caso o PMA possa interferir também com o
transporte de D-serina através da membrana plasmática.
É importante ressaltar que o BIM inibe todas as isoformas de PKC por bloquear o
sítio para ligação de ATP destas cinases. Já o PMA, que atua mimetizando o efeito do
diacilglicerol na célula, não ativa todas as isoformas de PKC, e sim, as clássicas e novas.
De uma maneira geral, todas as isoformas de PKC são expressas no sistema nervoso central
e desempenham importante papel na regulação de funções neuronais (Tanaka e Nishizuka,
1994). Estas isoformas de PKC mostram propriedades enzimáticas distintas, expressão
diferencial nos tecidos e localização intracelular específica. Cada isoforma de PKC pode
mediar diferentes processos biológicos na célula. No córtex cerebral, região estudada em
nosso trabalho, predomina a presença das isoformas clássicas de PKC, seguida das novas e
atípicas, respectivamente (Nishizuka, 1992; Hasegawa e cols, 2006). Dentre as PKCs
clássicas, a PKC α tem chamado bastante atenção por participar de importantes funções na
sinalização neuro-glial relacionadas a interação entre proteínas (Lu e Ziff, 2005). O
anticorpo que nós utilizamos para os experimentos de imunoprecipitação, imunodetecção e
imunofluorescência apresenta especificidade para um epítopo conservado entre as PKCs
clássicas. Portanto, torna-se necessário que novas abordagens sejam realizadas para
investigar o envolvimento de isoformas específicas de PKC.
A hipofunção de receptores NMDA pode apresentar envolvimento em patologias
neuropsiquiátricas. Evidências sugerem que a esquizofrenia esteja relacionada com a
hipofunção do sistema neurotransmissor glutamatérgico em regiões anteriores do cérebro e
na área límbica (Goff e Coyle, 2001). Estudo com camundongos transgênicos com baixa
expressão de receptor NMDA mostra que estes animais exibem comportamento semelhante
à esquizofrenia, que é revertido por drogas anti-esquizofrenia (Mohn e cols, 1999). Foi
59
mostrado que pacientes esquizofrênicos apresentam níveis séricos de D-serina menores do
que pacientes saudáveis (Hashimoto e cols, 2003). Similarmente, a análise do fluido
mensageiro para PICK1 no córtex occipital (Dracheva e cols, 2005). Por
cerebroespinhal de pacientes esquizofrênicos evidenciou uma redução dos níveis de D-
serina quando comparada aos pacientes saudáveis (Hashimoto e cols, 2005; Bendikov e
cols, 2007). Na esquizofrenia, tem sido evidenciada uma hiperatividade da sinalização por
PKC tanto no sangue (plaquetas) quanto no SNC (cérebros de biópsia e pós-morto) (Wang
e Friedman, 1996; Coull e cols, 2000; Mcnamara e cols, 2006). Nós mostramos que a
ativação da PKC reduz os níveis de D-serina in vitro e in vivo. Nosso resultado mostra
ainda que esta regulação está associada a um aumento da fosforilação basal em resíduos de
serina da serina racemase. Desta maneira, a fosforilação da racemase mediada por PKC
pode também ter papel na hipofunção de receptores NMDA na esquizofrenia. Neste
sentido, estudos adicionais serão necessários para elucidar esta relação e potencial
envolvimento.
Além do envolvimento da PKC na esquizofrenia, tem sido estudada a participação da
PICK1 nesta doença (Staudinger e cols, 1995). O gene da PICK1 está localizado no
cromossomo 22q13.1, o qual é um locus genético que freqüentemente tem ligação com a
esquizofrenia. De fato, há indícios sobre a existência de três regiões polimórficas no gene
da PICK1 que estão fortemente associadas com a doença em questão (Moises e cols, 2002;
Hong e cols, 2004; Dracheva e cols, 2005). Um estudo comparando pacientes
esquizofrênicos idosos com pacientes considerados normais não mostra diferença nos
níveis de RNA
outro lado, recentemente foi mostrado que a presença da PICK1 aumenta os níveis de D-
serina (Hikida e cols, 2008). Nossos resultados mostram que a PICK1 interage com a serina
60
racemase e a PKC in vitro e in vivo, podendo estar envolvida com a fosforilação da serina
racemase por PKC.
A serina racemase pode se ligar à PICK1 (Fujii e cols, 2006). É sugerido que a PICK1
atue como uma chaperona que direciona a PKC para seus alvos na célula (Staudinger e
cols, 1995; Staudinger e cols, 1997). Este mecanismo é bem exemplificado em um trabalho
que mostra o papel chave da PICK1 em carregar a PKCα até os receptores AMPA, onde a
cinase é capaz de fosforilar a serina 880 destes receptores de maneira a controlar o tráfego
celular dos mesmos (Lu e Ziff, 2005). Nós mostramos, por microscopia confocal e
coimunoprecipitação, a interação da PICK1 com ambas proteínas, serina racemase e PKC.
vista que nós observamos uma regulação
Este complexo molecular pode ter importância na regulação da serina racemase, podendo
assim influenciar na alteração dos níveis do neuromodulador D-serina e conseqüentemente
na ativação de receptores NMDA.
Em contraste, foi mostrado que a PICK1 pode aumentar os níveis de D-serina por
interagir com a serina racemase (Hikida e cols, 2008). Este trabalho mostrou que
camundongos transgênicos que não expressam PICK1 com uma semana de vida
apresentam menos D-serina que os camundongos selvagens. Esta diferença nos níveis de
D-serina não ocorre entre os camundongos adultos. Observou-se ainda, uma maior
produção de D-serina em cultura de linhagem que superexpressa ambas PICK1 e serina
racemase (Hikida e cols, 2008). Tendo em
negativa da serina racemase por PKC, torna-se aparentemente contraditório pensar que a
PICK1 esteja trabalhando no sentido de direcionar a PKC para fosforilar a serina racemase.
No entanto, estas proteínas podem ter uma função diferenciada dentro de uma relação
espacial e/ou temporal. Há a possibilidade destas proteínas agirem em momentos distintos
em um mesmo complexo compartimentalizado. Por outro lado, a PICK1 além de direcionar
61
a PKC para os padrões moleculares desta cinase, também pode estar atuando como alvo da
PKC no complexo molecular, podendo esta fosforilação acarretar diferentes destinos da
PICK1, até mesmo a degradação na via do proteassoma. No entanto, outras abordagens
experimentais terão que ser realizadas para melhor entender a funcionalidade deste
complexo protéico formado pela SR/PKC/PICK1.
Há indícios de que a D-serina possa participar na neuroinflamação e na
excitotoxicidade, contribuindo para doenças neurodegenerativas como a doença de
Alzheimer e a esclerose lateral amiotrófica (Wu e cols, 2004a; Wu e cols, 2007; Sasabe e
cols, 2007). Foi mostrado um aumento da expressão da serina racemase no hipocampo de
pacientes com doença de Alzheimer (Wu e cols, 2004a). O mesmo grupo mostrou que tanto
o peptídeo beta amilóide (principal componente das placas neuríticas presentes na doença
de Alzheimer) quanto a proteína precursora amilóide secretada (sAPP) pode estimular, in
vitro, a síntese e a liberação pela microglia de níveis neurotóxicos de D-serina (Wu e cols,
2004a; Wu e cols, 2007). Estes resultados in vitro reforçam a observação de que ocorre um
aumento de D-serina no fluido cérebro-espinhal de pacientes com doença de Alzheimer
(Fisher e cols, 1998). A PKC por sua vez apresenta atividade diminuída em extratos de
hipocampo e córtex (temporal e frontal) de pacientes com Alzheimer (Wang e cols, 1994).
Tem-se ainda que no córtex temporal de cérebros com Alzheimer ocorre uma diminuição,
em ambas expressão e atividade, de determinadas isoformas de PKC (Matsushima e cols,
1996). Os referidos achados fortalecem a idéia de que o aumento da disponibilidade de D-
serina e a diminuição da sinalização mediada por PKC podem estar relacionados com o
processo de neurodegeneração envolvido com a doenca de Alzheimer. Nós demonstramos
que a diminuição da atividade da PKC leva a um aumento dos níveis de D-serina in vitro e
in vivo. Nosso resultado mostra ainda que esta regulação é acompanhada por uma redução
62
da fosforilação basal em resíduos de serina da racemase. Desta forma, este mecanismo de
fosforilação da serina racemase controlado pela PKC pode ter relevância na hiperfunção de
receptores NMDA relacionada à doença de Alzheimer.
Em um modelo de camundongos com esclerose lateral amiotrófica, foi mostrado que
os neurônios da medula espinhal destes camundongos apresentam maior vulnerabilidade
em relação à D-serina do que os neurônios de camundongos controle (Sasabe e cols, 2007).
Foi observado ainda, que na medula espinhal destes camundongos com a doença ocorre
uma elevação da expressão de serina racemase e um aumento de D-serina pela glia. Um
aumento de D-serina também foi evidenciado na medula espinhal de pacientes com caso
familiar de esclerose lateral amiotrófica esporádica. Esta elevação na concentração de D-
serina aumenta a toxicidade dos motoneurônios induzida por glutamato via receptores
NMDA (Sasabe e cols, 2007). Também utilizando pacientes com esclerose lateral
amiotrófica esporádica, a análise imunohistoquímica aponta para uma redução na
quantidade de PKC em neurônios motores espinhais (Nagao e cols, 1998). Como
mencionado, os efeitos que observamos com a inibição da PKC relacionam o aumento dos
níveis de D-serina com a redução da fosforilação basal da serina racemase. Portanto, tendo
em vista que a atividade da serina racemase parece controlar a disponibilidade de D-serina,
torna-se importante investir em estudos que busquem avaliar o estado de fosforilação da
serina racemase nas doenças neurodegenerativas.
Neste trabalho, nós propomos que a serina racemase seja um alvo molecular para a
PKC. Esta interação controla a disponibilidade do neuromodulador D-serina através,
aparentemente, da fosforilação da serina racemase pela PKC. Esta regulação dos níveis
endógenos de D-serina no cérebro pode ter importância na modulação da neurotransmissão
63
glutamatérgica via receptores NMDA e na sinalização molecular envolvida com diferentes
distúrbios neuropsiquiátricos (Figura 14).
64
Figura 14: PKC regula a atividade da serina racemase. Esquema do complexo molecular
SR/PKC/PICK1 propondo um possível mecanismo de regulação da atividade da serina
racemase (SR) via fosforilação mediada por PKC. (A) Suposta condição fisiológica, onde a
PKC controlaria o estado de fosforilação basal da serina racemase e a disponibilidade de D-
serina para ativar os receptores NMDA. (B) Aumento da atividade da PKC acarretaria em um
aumento na fosforilação da serina racemase e diminuição dos níveis de D-serina provocando
hipofunção de receptores NMDA. (C) Redução da atividade da PKC provocaria uma
diminuição na fosforilação da serina racemase e aumento dos níveis de D-serina que pode
culminar na hiperfunção de receptores NMDA.
SRSRSRSRPKC
PICK1P
P
P P
L-serina
D-serina
Ativação de receptoresAtivação de receptoresNMDANMDA
Condição fisiológica
SRSRSRSRPKC
PICK1P
P
P P
L-serina
D-serina
HipofunçãoHipofunção de receptoresde receptoresNMDANMDA
P
P
P P
Sinalização por PKC
Sinalização por PKC
SRSRSRSRPKC
PICK1
PL-serina
Extracelular
Célula
Intracelular
AA
CC
BB
Fosforilação
Hiperfunção de receptoresHiperfunção de receptoresNMDANMDA
D-serina
65
6. Conclusões
o presente estudo, sugerimos que:
In vitro, a PKC modula negativamente a atividade bifuncional da SR recombinante;
A diminuição desta atividade ocorre concomitantemente a um aumento no grau de
a racemase em resíduos de serina;
A atividade das PKCs astrocitária e neuronal controla a disponibilidade de D-serina;
ICK1 interagem em ambas culturas de astrócitos e
neurônios;
N
fosforilação d
As proteínas SR, PKC e P
SR, PKC e PICK1 interagem in vivo;
A disponibilidade de D-serina parece ser regula por PKC in vivo.
66
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Anexo
Aumento da atividade da D-aminoácido oxidase (DAAO) cerebral na esquizofrenia.
Uma das linhas de pesquisa do nosso grupo visa estudar parâmetros relacionados ao
metabolismo de D-serina. Neste sentido, temos desenvolvido trabalhos no intuito de
elucidar fatores e condições que possam interferir com a atividade tanto da enzima que
sintetiza D-serina, a serina racemase, quanto da enzima que degrada D-serina, a D-
aminoácido oxidase.
Durante o mestrado, além de estudar mecanismos moleculares envolvidos com a
regulação da atividade serina racemase, tive a oportunidade de ajudar o grupo em outras
frentes. Um dos projetos que participei era desenvolvido pela aluna Caroline Madeira e
tinha como objetivo avaliar se a atividade da D-aminoácido oxidade estaria alterada na
esquizofrenia.
Nós demonstramos um aumento na atividade de degradação de D-aminoácidos no
córtex cerebral de pacientes esquizofrênicos. O aumento da atividade pode ser responsável
pela diminuição de D-serina extracelular local, contribuindo para a hipofunção de
receptores NMDA que ocorre na esquizofrenia. Este é o primeiro estudo que avalia
diretamente a atividade da D-aminoácido oxidase no tecido de cérebro postmortem de
pacientes esquizofrênicos.
Este trabalho foi aceito recentemente para publicação na revista Schizophrenia Research.
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