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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA
BRUNA ALAYDE TRIDAPALLI CHAVES
FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE
OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER
Itajaí
2013
BRUNA ALAYDE TRIDAPALLI CHAVES
FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE
OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER
Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de farmacêutico pela Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª. Dra. Márcia M. de Souza Co-orientadora: Profª. Dra. Cristiani Bürger
Itajaí (SC)
Junho de 2013
Aos meus pais, Achilles e Solange, por serem esses guerreiros incríveis e servirem
de exemplo para eu continuar seguindo em frente nos momentos difíceis.
Ao meu marido, Edson, pela compreensão e amor cedido em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por me ofertar a dádiva da vida e a
serenidade para buscar meu próprio caminho.
É difícil agradecer todas as pessoas que de algum modo, fizeram ou fazem
parte da minha vida, por isso primeiramente agradeço a todos de coração.
Quero agradecer meus amados pais Achilles e Solange, pela minha
educação, dedicação e por todo amor concedido por eles. Vocês são as pessoas
que mais admiro e mais tenho orgulho na vida.
Ao meu irmão, Vitor Gabriel, essa criança maravilhosa, que me faz aprender
coisas novas sempre e se faz meu incentivo para eu ser uma pessoa cada vez
melhor, para que ele um dia, possa ter como exemplo.
Ao meu marido, Edson, por ser um homem incrível, sempre me apoiando, me
incentivando, me compreendendo em qualquer situação da minha vida.
Agradeço a toda a minha família pelo carinho cedido e pela compreensão das
minhas ausências, em especial minha tia Ana Paula que independente de qualquer
situação sempre esteve e esta ao meu lado me oferecendo muito carinho e ajuda.
A todos os meus amigos que me deram força e me aguentaram durante todo
esse período. Guardo lembranças especiais de cada um.
Aos queridos professores que desempenharam com dedicação as aulas
ministradas, que com certeza, fez a diferença para meu aprendizado e conclusão
deste trabalho.
Com enorme carinho agradeço a professora Márcia Maria de Souza que
aceitou me orientar com total dedicação neste projeto, assim como, agradeço a
minha co-orientadora, professora Cristiani Bürger, pessoa na qual me fez crescer
muito como profissional e como pessoa.
A todos os funcionários e colaboradores da UNIVALI, em especial, Maria
Angélica de Azevedo e Pedro Pablo Perez Neto, que atenciosamente me auxiliaram
nos experimentos.
Agradeço a todos que de forma direta ou indireta, na minha vida pessoal ou
acadêmica, me ajudaram a conquistar mais essa vitória.
Meus sinceros agradecimentos a todos vocês.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse
feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes.”
(Martin Luther King)
FLAVONOIDE MORINA: AVALIAÇÃO IN VITRO DO SISTEMA DE
OXIDAÇÃO E IMPLICAÇÕES DA DOENÇA DE ALZHEIMER
Bruna Alayde TRIDAPALLI CHAVES
Orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria de Souza
Co-orientadora: Profª. Drª. Cristiani Bürger
Defesa em: junho de 2013
Resumo:
A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa, progressiva, de início insidioso com deterioração cognitiva progressiva. As hipóteses mais prováveis para o surgimento da DA, sugerem processos de inflamação e estresse oxidativo oriundos do depósito dos peptídeos β-amiloide e da hiperfosforilação da proteína TAU, culminando na deficiência da neurotransmissão colinérgica. Diversos estudos têm demonstrado o potencial terapêutico dos flavonoides sobre vários aspectos biológicos, principalmente no que diz respeito àquelas relacionadas ao envelhecimento. A morina (MO), composto fenólico obtido de várias espécies vegetais, apresenta potencial protetor do sistema cardiovascular via controle do estresse oxidativo, assim como efeito antiinflamatório, ambos comprovados na literatura. Considerando a relação estresse oxidativo, DA, inflamação e flavonoides, o objetivo do presente estudo foi avaliar, o efeito da MO (v.o) sobre a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), assim como, os níveis de lipoperoxidação em tecido cerebral de animais normais e com DA induzida pela estreptozotocina (STZ). Para tal propósito foram utilizados os cérebros de camundongos tratados com a MO (25, 50 e 100mg/kg, v.o) após os experimentos comportamentais, os quais avaliaram o efeito do tratamento sobre a memória dos mesmos. A avaliação da atividade antioxidante foi realizada através de métodos enzimáticos in vitro. No tecido cerebral dos animais normais tratados com a MO nas diferentes concentrações estudadas, houve uma diminuição da atividade da CAT em relação ao grupo controle. Nestes mesmos animais tratados com MO na concentração de 100 mg/kg, observou-se um aumento expressivo da atividade da SOD. Em adição, o índice de lipoperoxidação diminuiu significativamente nas as concentrações de 50 e 100mg/kg. As atividades das enzimas GR e GPx não apresentaram diferença estatística quando comparados ao grupo controle. Em animais com DA induzida por STZ observou-se aumento da atividade das enzimas GR e GPx nas doses de 50 e 100mg/kg, assim como, houve um aumento da SOD em todas as doses testadas (25, 50 e 100mg/kg). Entretanto, foram observados diminuição da atividade da CAT para todos os grupos tratados, quando comparados com ao grupo controle. Nesses animais, nas doses de 25, 50 e 100mg/kg houve uma diminuição significativa do índice de lipoperoxidação. Os resultados obtidos até o momento permitem sugerir que a MO possui atividade protetora contra o estresse oxidativo gerado em tecido cerebral, principalmente no cérebro de animais com DA induzida pela STZ. Os dados em conjunto corroboram com resultados da literatura sobre a importância dos flavonoides como neuroprotetores e apontam a MO como uma molécula de interesse para a terapêutica da DA.
Palavras-chave: Alzheimer. Estresse oxidativo. Morina. Streptozotocina.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Placa neurítica formada pelo depósito do peptídeo β-
amiloide.......................................................................................
26
Figura 02 Emaranhados neurofibrilares decorrentes do depósito da TAU
hiperfosforilada...........................................................................
27
Figura 03 Estrutura básica dos flavonoides e sistema de
numeração..................................................................................
33
Figura 04 Estrutura do flavonoide morina...................................................
34
Figura 05 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg
v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente no tecido
cerebral dos camundongos normais...........................................
43
Figura 06 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg
v.o) sobre a enzima GR presente no tecido cerebral dos
camundongos normais................................................................
44
Figura 07 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg
v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente no tecido
cerebral dos camundongos normais..........................................
45
Figura 08 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg
v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente no tecido
cerebral dos camundongos normais...........................................
46
Figura 09 Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg
v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de
camundongos normais................................................................
47
Figura 10 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e
100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente em
tecido cerebral dos camundongos DA induzida por
STZ.............................................................................................
48
Figura 11 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e
100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GR presente em
tecido cerebral dos camundongos DA induzida por
STZ.............................................................................................
49
Figura 12 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e
100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente em
tecido cerebral dos camundongos DA induzida por
STZ.............................................................................................
50
Figura 13 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e
100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente em
tecido cerebral dos camundongos DA induzida por
STZ.............................................................................................
51
Figura 14 Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e
100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral
de camundongos DA induzida por STZ.....................................
52
LISTA DE ABREVIATURAS
A - Beta amiloide
AChE - Acetilcolinesterase
APP - Proteína precursora da amiloide
ATP - Trifosfato de Adenosina
BuChE - Butirilcolinesterase
BHT - Di-terc-butil metil fenol
CAT - Catalase
CHAT - Acetiltransferase
DA - Doença de Alzheimer
D-GAL - D-Galactose
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
FDA - Food and Drug Administration
GPx - Glutationa peroxidase
GR - Glutationa redutase
GSH - Glutationa reduzida
GSSG - Glutationa oxidada
I.C.V - Intracerebroventricular
MDA - Malondialdeído
Medicare - Programa Nacional de Seguro Social
MO - Morina
NaCl - Cloreto de sódio
NADP+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidado
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NFT- Novelos neurofibrilares
NMDA - N-metil D-Aspartato
O2 - Oxigênio
EROS - Espécies reativas de oxigênio
SNC - Sistema nervoso central
SOD - superóxido dismutase
STZ - Estreptozotocina
TAU - Proteína TAU
TBARS - Substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico
v.o - Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21
2.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 21
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 21
3 EMBASAMENTO TEÓRICO .................................................................................. 23
3.1 Doença de Alzheimer .......................................................................................... 23
3.1.1 Caracterização e sintomas da doença ............................................................. 23
3.1.2 Epidemiologia ................................................................................................... 24
3.1.3 Achados patológicos do Alzheimer .................................................................. 25
3.1.4 Tratamento atual da doença de Alzheimer ....................................................... 28
3.2 A administração I.C.V de estreptozotocina como modelo animal ........................ 29
3.3 Relação estresse oxidativo e a doença de Alzheimer ......................................... 30
3.4 Flavonoides ......................................................................................................... 32
3.5 Do flavonoide em estudo: Morina ........................................................................ 34
4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 37
4.1 Materiais .............................................................................................................. 37
4.1.1 Reagentes ........................................................................................................ 37
4.1.2 Equipamentos ................................................................................................. 37
4.2 Animais................................................................................................................ 38
4.3 Ensaios bioquímicos: “Testes in vitro” ................................................................. 38
4.3.1 Preparo dos animais para os testes “in vitro” .................................................. 38
4.3.2 Preparo das amostras de tecido cerebral ....................................................... 39
4.3.3 Medida de sistemas e produtos oxidativos ..................................................... 40
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 43
5.1 Medidas de sistemas e produtos oxidativos ........................................................ 43
5.1.1 Tratamento agudo com o flavonoide morina em animais normais ................... 43
5.1.2 Tratamento subcrônico com o flavonoide morina em animais DA induzida por
estreptozotocina ........................................................................................................ 47
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 53
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 59
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61
ANEXO A – Parecer comitê de ética ......................................................................... 69
19
1 INTRODUÇÃO
A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa
devastadora que afeta mais de 25 milhões de pessoas em todo o mundo
(CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010). É responsável por cerca de 50-60% do
número total de casos de demência em pessoas acima de 65 anos (SHIMMYO et al.,
2008).
A DA é considerada um dos principais problemas de saúde devido ao enorme
impacto causado ao indivíduo, famílias, sistema de saúde e à sociedade como um
todo, uma vez que, a metade dos pacientes é internada em instituições médicas
necessitando cuidados especiais (LUZARDO; GORINI; SILVA, 2009).
A doença torna-se clinicamente aparente como um comprometimento
elevado e insidioso da função intelectual, com alterações no humor e no
comportamento. Mais tarde, ocorre desorientação progressiva, perda de memória e
afasia, sintomas esses que indicam severa disfunção cortical. Nos próximos 5 a 10
anos, o paciente torna-se profundamente incapacitado, mudo e imóvel devido à
progressão do processo neurodegenerativo em áreas cerebrais medianas
(ROBBINS et al., 2008).
A genética e os estudos clínicos sugerem que a geração de oligômeros
peptídeo da proteína precursora amiloide (APP) é o evento inicial da DA. A forma de
peptídeo oligomérica Aβ desencadeia uma série de eventos secundários, incluindo a
hiperfosforilação da proteína TAU, a formação de emaranhados neurofibrilares,
degeneração sináptica, lesão oxidativa, ativação astrocitária, desmielinização,
ativação da cascata de apoptose das células, morte neuronal, e os déficits de
transmissores, como por exemplo, a acetilcolina (ACh). Estes eventos resultam em
perda da função neuronal e dano sináptico, com subsequente comprometimento da
memória, da coordenação motora e do raciocínio, além de perda da capacidade
cognitiva (SALLOWAY et al., 2008).
Modelos farmacológicos que nos permitem mimetizar situações
comportamentais e fisiológicas que ocorrem em pacientes com DA são essenciais
para o estudo de substâncias com efeitos sobre esta patologia (WEI et al., 2005).
Um dos modelos descritos com uma metodologia apropriada contempla a indução
da DA através da administração intracerebroventricular (I.C.V) de estreptozotocina
20
(STZ), uma vez que, esta droga induz a processos bioquímicos similares aqueles
encontrados em pacientes com DA, como, anormalidades no metabolismo da
glicose, deficiência do sistema colinérgico, hiperfosforilação da proteína TAU e
injúria oxidativa (GEROZISSIS, 2008; PINTON et al., 2010).
A importância da associação entre o estresse oxidativo e o envelhecimento
está relacionada com a constante produção de radicais livres por organismos vivos,
a qual é controlada através da produção endógena de enzimas antioxidantes e, pelo
consumo de antioxidantes exógenos não enzimáticos como os flavonoides e as
vitaminas C, E (SALLOWAY et al., 2008). Dentre as enzimas que têm papel
antioxidante destacam-se a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a
glutationa peroxidase (GPx), que se apresentam diminuídas no Sistema Nervoso
Central (SNC) durante o processo de envelhecimento (FURIAN, 2009).
No entanto, o uso de antioxidantes não é reconhecido como alternativa
terapêutica, pois faltam dados científicos que demonstrem efetivamente que o
emprego de tais substâncias é seguro e eficiente (WOLFE, 2006). Uma vez que os
flavonoides são encontrados em muitos alimentos de origem vegetal, fazendo
inclusive parte da dieta humana e, são potentes antioxidantes, torna-se interessante
a investigação dos efeitos desses compostos polifenólicos, na prevenção e
tratamento de diversas doenças relacionadas ao envelhecimento. Ao longo dos
anos, os flavonoides vêm merecendo a atenção dos pesquisadores como potenciais
candidatos a medicamentos de várias patologias do SNC cuja terapêutica ainda é
ineficiente, destacando-se nesse contexto a DA (LOPEZ et al., 2006).
Dentro da classe dos flavonoides destaca-se a morina (2’,3,4’,5,7-
pentahidroxiflavona), composto com atividade biológica antioxidante já comprovada
(ZHANG et al., 2009). Estudos anteriores realizados em nossos laboratórios
demonstraram que o composto exerce significativos efeitos sobre a memória de
animais normais e com DA induzida por diferentes mecanismos (SERRÃO et al.,
2011).
Diante do exposto anteriormente, a proposta do presente estudo foi
aprofundar a investigação sobre os efeitos da morina, avaliando seus efeitos sobre o
sistema de oxidação cerebral dos animais que foram submetidos aos modelos
comportamentais de memória, procurando relacionar dessa forma, os efeitos
facilitatórios sobre a memória dos animais com a propriedade antioxidante.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estudar o efeito do flavonoide morina sobre o processo de estresse oxidativo
causado pela Doença de Alzheimer, induzida quimicamente em camundongos.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar o efeito agudo da morina sobre atividade de enzimas antioxidantes
(superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase) e
níveis de peroxidação lipídica em tecido cerebral de animais normais;
- Avaliar o efeito subcrônico da morina sobre atividade de enzimas antioxidantes
(superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase) e
níveis de peroxidação lipídica em tecido cerebral de animais com doença de
Alzheimer induzido por Estreptozotocina;
- Estabelecer a relação entre os efeitos nootrópicos da morina (facilitador da
memória em testes comportamentais anteriores) com a sua capacidade de
aumentar a atividade do sistema antioxidante cerebral e diminuição da
peroxidação lipídica.
22
23
3 EMBASAMENTO TEÓRICO
3.1 Doença de Alzheimer
3.1.1 Caracterização e sintomas da doença
A DA foi descrita inicialmente pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer
em 1907. Alzheimer descreveu a doença como uma patologia neurodegenerativa
frequentemente associada à idade, apresentando manifestações cognitivas e
neuropsiquiátricas, alterações de comportamento e incapacidade de atividades
rotineiras (HEBERT et al., 2010).
Trata-se de uma doença progressiva caracterizada por início insidioso com
deterioração da memória, deterioração cognitiva progressiva, surgimento de
sintomas neuropsiquiátricos e distúrbios comportamentais. Além disso, no paciente
com Alzheimer há comprometimento das atividades da vida diária, e perda da função
independente (SALLOWAY et al. ,2008).
O processo degenerativo progressivo das funções psicomotoras e cognitivas,
dura entre 8,5-10 anos, desde o aparecimento dos primeiros sintomas clínicos até a
morte. As regiões cerebrais associadas às funções mentais superiores,
particularmente o córtex frontal e o hipocampo, são aquelas mais comprometidas
pelas alterações bioquímicas decorrentes de DA (MACHADO et al., 2009). A doença
é marcada por uma perda de neurônios colinérgicos inicialmente na região do
hipocampo, bem como diminuição da memória, até a progressão para a completa
demência (AKAISHI et al., 2008).
A fase inicial da DA é descrita por muitos pesquisadores como uma
diminuição suave da cognição. Esta fase é intermediária entre o estado normal do
indivíduo e a etapa avançada da DA. Pacientes neste estado inicial apresentam um
declínio na cognição, porém, nenhum sinal de demência. As atividades de vivência
diárias não são afetadas, entretanto ocorrem brandas perdas de memória (MORRIS,
2005; CADDELL; CLARE, 2010).
A progressão da doença acarreta em tornar o paciente completamente
dependente de cuidadores. A linguagem fica reduzida a simples falas ou palavras.
As tarefas diárias são comprometidas devido à apatia, cansaço e depressão, o que
24
leva à perda da mobilidade e até mesmo da capacidade de se alimentarem sozinhos
(MORRIS, 2005). Devido a diversas complicações, inúmeras patologias oportunistas
acabam por levar o paciente a óbito (FORLENZA, 2005).
Evidências epidemiológica e ciência básica sugerem uma possível
fisiopatologia compartilhada entre diabetes mellitus tipo 2 e doença de Alzheimer.
Essa hipótese tem sido descrita como o diabetes tipo 3 (AKTER ET al., 2011).
Pesquisadores reconheceram uma alteração na função do receptor de insulina, o
qual induz um estado de estresse oxidativo, podendo ser relacionado com a
patogênese da DA. (DE LA MONTE; WANDS, 2006).
Estudos utilizando a tomografia por emissão de pósitrons têm consistentemente
documentado diminuição do metabolismo da glicose cerebral em pacientes
moderadamente e severamente dementes quando comparados com indivíduos
normais pareados por idade, e estudos recentes têm mostrado a utilização da
glicose prejudicada em áreas de associação neocorticais do cérebro de pacientes
com leve déficit cognitivo, um precursor para a DA (MARTINS et al., 2008).
Outros estudos ainda, demonstraram que pacientes com DA exibiram um
maior aumento nos níveis de glicose no sangue após a administração periférica de
glicose do que os controles, apoiando a hipótese de uma disfunção sistêmica na
regulação da glicose na DA (VOSS; PALLER, 2008). Os déficits no metabolismo da
glicose pode também potencializar a morte das células neuronais produzidos por
outros processos patológicos como, por exemplo, níveis elevados de agregados do
peptídeo β-amiloide, resultante do metabolismo anormal da proteína precursora do
amiloide (APP), processo comum em pacientes com DA, que por sua vez pode ser
influenciado pela predisposição genética (AKTER ET al., 2011).
Todas essas manifestações são temporais e ocorrem com a progressão da
doença resultando na neurodegeneração progressiva do sistema nervoso central.
3.1.2 Epidemiologia
A DA constitui aproximadamente 70% de todos os casos de demência. A
prevalência também aumenta exponencialmente com a idade. Para pessoas entre
as idades de 65 e 69, 70 e 74, 75 e 79, 80 e 84, 85 e mais velhas a incidência da
25
doença de Alzheimer tem sido estimada em 0,6%, 1,0%, 2,0%, 3,3% e 8,4%,
respectivamente (CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010).
A doença afeta cerca de 25 milhões de pessoas em todo o mundo. Nos EUA,
a prevalência foi estimada em 5 milhões em 2007 e, em 2050, está projetada para
13 milhões só nos EUA (SERENIKI; VITAL, 2008). Estima-se que mais de 1 milhão
de pessoas são afetadas pela doença no Brasil (TATSCH et al., 2006). Cerca de 7%
da população brasileira com mais de 65 anos são acometidos pela DA. O ministério
da Saúde aponta que os gastos com esta patologia chegam a R$ 129 milhões
apenas em medicamentos (BRASIL, 2010).
Globalmente, o número de adultos mais velhos está projetado para aumentar
ainda mais dramaticamente, mais do que dobrando a soma de 420 milhões em 2000
para 973 milhões em 2030. Levando-se em consideração o fato de que a idade
avançada é o principal fator de risco para a DA, não se pode subestimar o problema.
Esta doença representará muito em termos de custo financeiro e humano. Com
efeito, o custo de vida útil prevista de pessoas com DA foi estimado em US $
174.000. Em 2005, o Medicare (sistema de seguros de saúde gerido pelo governo
dos Estados Unidos da América e destinado às pessoas de idade igual ou maior que
65 anos ou que verifiquem certos critérios de rendimento) gastou 91 bilhões de
dólares americanos para cuidados de saúde para pessoas com DA, sendo 21
bilhões dólares associados aos serviços de cuidados de longa duração. Os encargos
em planos de saúde de pessoas com DA foi estimado em mais de US $ 4000 por
pessoa por ano (CASTELLANI; ROLSTON; SMITH, 2010).
3.1.3 Achados patológicos do Alzheimer
Muitas hipóteses têm sido propostas na tentativa de explicar a patologia da
DA, incluindo o depósito dos peptídeos β-amiloide, hiperfosforilação da proteína
TAU, deficiência da acetilcolina, inflamação e estresse oxidativo (HARDY; SELKOE,
2002).
As características histopatológicas presentes no parênquima cerebral de
pacientes portadores da DA incluem depósitos fibrilares amiloidais localizados nas
paredes dos vasos sangüíneos, associados a uma variedade de diferentes tipos de
placas senis também denominadas de placas neuríticas, assim como, acúmulo de
26
filamentos anormais da proteína TAU. Consequente a isso há a formação de novelos
neurofibrilares (NFT), perda neuronal e sináptica, ativação da glia e inflamação
(SERENIKI; VITAL, 2008).
Nos achados histopatológicos, a placa neurítica (Fig. 01) em particular, têm
sido apontados como o mais relevante, e, muitas vezes em destaque (CASTELLANI;
ROLSTON; SMITH, 2010).
Figura 01: Placa neurítica formada pelo depósito do peptídeo β-amiloide.
Fonte: Castellani; Rolston; Smith, 2010.
As placas neuríticas são acúmulos extracelulares com cerca de 2mm de
diâmetro, resultantes do metabolismo anormal da proteína precursora do amiloide
(APP), levando à formação de agregados do peptídeo β-amiloide 1-40 e 1-42. Outro
achado histopatológico, os emaranhados neurofibrilares (fig. 02) são inclusões
intracelulares filamentosas encontradas no córtex cerebral e estruturas do lobo
temporal como o hipocampo e amígdala. São constituídos pela deposição de uma
forma insolúvel de uma proteína normalmente solúvel (TAU), formando-se a partir do
27
colapso do citoesqueleto neuronal, decorrente da hiperfosforilação desta proteína
(FORLENZA, 2005; NIZZARI et al., 2012). A TAU é uma fosfoproteína constituinte
da família das proteínas associadas à microtúbulos, estando altamente expressa no
cérebro, essencialmente em neurônios (PARIHAR; HEMNANI, 2004).
Figura 02: Emaranhados neurofibrilares decorrentes do depósito da TAU hiperfosforilada.
Fonte: Castellani; Rolston; Smith, 2010.
Baseadas nesses marcadores neuropatológicos, duas hipóteses principais
foram propostas, a fim de explicar a etiologia da doença. De acordo com a hipótese
da cascata amiloidal, a neurodegeneração da DA inicia-se com a clivagem
proteolítica da proteína precursora amiloide (APP) e resulta na produção, agregação
e deposição da substância β- amiloide (Aβ) e placas senis. De acordo com a
hipótese colinérgica, a disfunção do sistema colinérgico é suficiente para produzir
uma deficiência de memória em modelos animais, a qual é semelhante à DA.
Cérebros de pacientes portadores da DA mostraram degeneração dos neurônios
colinérgicos, ocorrendo também uma redução dos marcadores colinérgicos e uma
28
diminuição da colina acetiltransferase e da acetilcolinesterase (SERENIKI; VITAL,
2008).
3.1.4 Tratamento atual da doença de Alzheimer
Grandes esforços têm sido realizados para a compreensão e tratamento da
DA, entretanto, a terapia atual está longe de ser satisfatória. De fato, embora o
tratamento realizado através da administração de inibidores da enzima AChE tenha
consistentemente demonstrado eficácia sintomática e redução na progressão da
patologia, esses medicamentos produziram algum tipo de melhora em
aproximadamente 30-40% dos pacientes portadores da DA leve a moderada
(GRANIC et al., 2010).
Os inibidores da AChE (tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina) alteram
a função colinérgica central ao inibir as enzimas que degradam a acetilcolina (AChE
e BuChE), aumentando, assim, a capacidade da acetilcolina de estimular os
receptores nicotínicos e muscarínicos cerebrais. Desde a introdução desses
medicamentos na prática clínica, os inibidores da AChE constituem o tratamento
sintomático de escolha para a DA (SERENIKI; VITAL, 2008). Estes fármacos
apresentam uma terapêutica paliativa e limitada, porque apenas melhoram os
déficits de memória no estágio inicial da doença, uma vez que não interrompem o
processo neurodegenerativo (EPIS et al., 2010).
Determinadas pesquisas levaram a constatação de que uma alta estimulação
glutamatérgica causava danos cerebrais aos pacientes comprometidos pela DA. Em
virtude disso, o FDA aprovou a utilização da memantina (Ebix®, Heimer®, Akatinol®)
em 2003 (ARRIETA, 2006). O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório
do cérebro. Uma alta estimulação glutaminérgica pode resultar em prejuízo neuronal,
fenômeno que tem sido denominado excitotoxicidade. A memantina é a primeira de
uma nova classe de fármacos para os estágios moderado a grave da DA. É um
fármaco antagonista, não-competitivo, voltagem-dependente do receptor N-metil-D-
aspartato (NMDA), que bloqueia os efeitos patológicos decorrentes dos níveis
elevados de glutamato (ARAÚJO; PONDE, 2006).
29
Diversos distúrbios neuropsiquiátricos são observados concomitantemente ao
quadro, se fazendo necessário o uso de ansiolíticos e antidepressivos com o
objetivo de melhora do quadro geral do doente (EPIS et al., 2010).
Estudos farmacológicos visando à investigação de substâncias com potencial
sobre a DA, necessitam de modelos que possam induzir modificações neurológicas
semelhantes as que ocorrem na patologia (ANNAHÁZI et al., 2007). Dessa forma
estudos continuam sendo realizados no sentido de buscar novos compostos com
mais efetividade do que os existentes e/ou apresentando menos efeitos colaterais
(MORRIS, 2005).
3.2 A administração I.C.V de estreptozotocina como modelo animal
Muitos modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para o
estudo da DA. A DA é uma patologia que apresenta anormalidades no metabolismo
da glicose, onde ocorre uma redução de sua utilização, bem como alterações na
metabolização do fosfato energético adenosina trifosfato (ATP). Em adição, os
distúrbios no metabolismo energético estão intrinsecamente associados a um
aumento de estresse oxidativo, o qual pode ser resultado de oxidação de
biomoléculas, e início de excitotoxicitade neuronal culminando em apoptose e
necrose (TOTA et al., 2010).
Um modelo de demência esporádica do tipo Alzheimer foi estabelecido por
Sharma e Gupta em 2003 com uma injeção I.C.V bilateral de STZ. A STZ é uma
substância diabetogénica que disturbios prolongados da memória e do metabolismo
cerebral, se injectada no SNC em uma dose sub-diabetogénica. Como modelo
farmacológico, a administração I.C.V. de STZ tem sido descrito como uma
metodologia apropriada para causar DA, uma vez que proporciona uma progressiva
deterioração da memória e redução da glicose e metabolismo energético cerebral,
os quais são característicos na doença (AWASTHI et al., 2010).
Os danos relacionados à STZ abrangem a inibição da síntese de ATP e
acetilcoezima A (acetil-CoA), que resulta numa deficiência do sistema colinérgico.
Associado a estas ações verifica-se também uma redução da atividade das
acetiltransferases (AChT) no hipocampo e um aumento na ação das AChE no
cérebro de ratos (GEROZISSIS, 2008). Recentemente, foi demonstrado que STZ
30
também aumenta a produção e atividade de citocinas inflamatórias, tais como
interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1 (IL-1). Estas citocinas inflamatórias e o estresse
oxidativo grave decorrente da disfunção mitocondrial e aumenta o risco de apoptose
de células no cérebro, particularmente no hipocampo (JAVED et al, 2012).
A administração da STZ possibilita uma dessensibilização dos receptores
neuronais da insulina e redução da atividade das enzimas glicolíticas, causando
redução da energia cerebral, e, levando a uma disfunção cognitiva pela inibição da
síntese de ATP. Além disso, a redução da glicose cerebral a níveis críticos, afeta o
sistema colinérgico, pois ocorre um decréscimo na síntese de acetilcolina, devido à
diminuição da concentração de acetil-CoA, que é um derivado de glicose (SHARMA;
SINGH; SINGH, 2008; SHOHAM et al., 2007). A glicose é metabolizada em produtos
energéticos, e, é transformada em fonte de energia para o cérebro. Por este motivo,
interrupções no metabolismo energético afetam criticamente as funções cerebrais,
além de síntese proteica e processos celulares e moleculares básicos (SPITALER;
GRAIER, 2002).
Ishrat e colaboradores (2006) demonstraram ainda, que a administração
I.C.V. de STZ reduz a atividade da acetiltransferase (ChAT) no hipocampo, fator que
acarreta em uma deficiência de transmissão colinérgica, a qual é determinante na
redução da memória dos animais.
3.3 Relação estresse oxidativo e a doença de Alzheimer
A relação entre estresse oxidativo e doenças neurodegenerativas tem sido
profundamente questionada e estudada nos últimos anos (JOVANOVIĆ, 2012).
Atualmente, devido ao aumento da expectativa de vida da população, existe um
crescente interesse no estudo de doenças neurodegenerativas como a DA. Uma
vertente destes estudos demonstram que o estresse oxidativo possui um papel
importante e pode até mesmo desencadear o processo de neurodegeneração.
(BARBOSA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2006). Ele tem sido avaliado como uma das
vias cruciais na patogênese de diversas doenças, incluindo desordens
neurodegenerativas, câncer e isquemia (LI; MA; LIU, 2007). Uma vez que, os
neurônios são particularmente susceptíveis a EROS, o estresse oxidativo é
31
apontado como uma das fontes das várias alterações patológicas que ocorrem na
DA (GLADE, 2010).
O estresse oxidativo é definido como a situação na qual a formação de
espécies reativas de oxigênio (EROS) excede significativamente a capacidade de
defesa antioxidante e de reparo do organismo, tendo como consequência o aumento
de danos a biomoléculas (DNA, lipídios, proteínas) (WANG et al., 2006).
Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória excede a
capacidade limite, podem ocorrer reações que sobrecarregam a capacidade de
extinção dos radicais livres, servindo de gatilho para uma produção exacerbada de
EROS (KING; SHARPLEU; HIRST, 2009). Diversos estudos demostram que déficits
de memória são consequência de desequilíbrios entre EROS e a capacidade
antioxidante disponível no cérebro. Sendo os neurônios extremamente suscetíveis a
EROS, o estresse oxidativo é apontado como uma das fontes das várias alterações
patológicas que ocorrem na DA, pois oxidam macromoléculas biológicas levando a
distúrbios homeostásicos que podem resultar na morte celular (ANNAHÁZI et al.,
2007). Além disso, o acúmulo de proteínas oxidadas no cérebro potencializa a
neurodegeneração e diminui as funções cognitivas (AMES, 2006; CORBETTA;
PATEL; SHULMAN, 2008; LI et al., 2007).
Considera-se que o SNC é mais susceptível as EROS devido a inúmeros
fatores. O principal fator é seu alto consumo de O2, sendo responsável por 20% do
consumo total de O2 corporal, apesar de seu peso corresponder a 2% do peso
corporal. Além disso, outros fatores contribuem para tornar o cérebro mais
vulnerável às reações de oxidação, tais como as altas concentrações de lipídeos
poli-insaturados, deficiência de mecanismos protetores antioxidantes, baixa atividade
de enzimas antioxidantes e sua localização nas células gliais fazem com que os
neurônios fiquem menos protegidos contra as espécies reativas geradas no cérebro
(FURIAN, 2009).
As EROS são necessárias pra o funcionamento normal do organismo e são
continuamente produzidas e neutralizadas pelo sistema de defesa antioxidante.
Entretanto quando as EROS são produzidas em altas concentrações, ou quando as
defesas antioxidantes são deficientes, elas podem causar prejuízo na função celular,
apoptose e necrose caracterizando o estresse oxidativo (FURIAN, 2009). Esse
desequilíbrio entre a produção celular de espécies reativas e as defesas
32
antioxidantes pode representar um mecanismo fundamental para o desenvolvimento
de algumas patologias, principalmente no SNC (ANSARI; SCHEFF, 2010).
Marcadores de estresse oxidativo são detectados em concentrações
aumentadas em tecidos de pacientes e em animais com modelo de DA, além de
apresentarem níveis alterados da expressão de enzimas antioxidantes
(RAMASSAMY, 2006).
Por este motivo, existem diversas linhas de pesquisa que buscam aumentar o
artesanal antioxidante a nível cerebral, visando uma longevidade cognitiva,
impedindo que patologias neurodegenerativas como a DA venham a afetar cérebros
mais susceptíveis, como é o caso dos idosos (GLADE, 2010).
Sendo assim, a descoberta de novas substâncias com ação antioxidante tem
despertado interesse na pesquisa para o tratamento de patologias relacionadas à
formação de radicais livres.
3.4 Flavonoides
A investigação dos flavonóides (fig. 03), compostos polifenólicos considerados
antioxidantes, para prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas tem
sido realizada de forma constante (KUMAR, KHANUM, 2012). Estes compostos são
encontrados em quase todos os alimentos vegetais e é uma das principais fontes de
compostos bioativos da dieta humana. Mais de 8.000 polifenóis são conhecidos e
mais de 2.000 são encontrados em plantas, pois são essenciais para a sua
pigmentação, crescimento, reprodução e resistência a patógenos (MARQUES,
2004).
Os flavonoides (descobertos pelo bioquímico Alberto Gyorgi) possuem
propriedades antioxidantes (ALVES et al., 2007) e antiinflamatórias (COUTINHO;
MUZITANO; COSTA, 2009), podendo atuar de diferentes formas para a contribuição
da integridade do tecido neuronal: inibindo a atividade de enzimas como a
monoamina-oxidase, que contribuem para a geração de radicais livres no cérebro e
no corpo (CORREIA DA SILVA; SOUZA; PINTO, 2013; DAVID; BARREIROS;
ANDRE; 2006).
A atividade antioxidante dos flavonoides é conhecida e estudada por diversos
grupos de pesquisa (AGATI et al., 2012). Esta atividade está relacionada à
33
quantidade de grupamentos hidroxila que os compostos possuem. Flavonoides com
3 a 6 hidroxilas possuem os efeitos mais evidenciados, sendo a posição C3
responsável pela potência da ação antioxidante (WANG et al., 2006). De modo geral,
quanto maior o número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e
elétrons. Flavonoides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por
exemplo, a 5-hidroxiflavona tem atividade não-detectável. Entre os flavonoides
diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no
anel B. Os flavonoides com múltiplas hidroxilas como a quercetina, miricetina,
luteolina e morina possuem forte atividade antioxidante quando comparados ao α-
tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno (CORREIA DA SILVA, SOUZA, PINTO, 2013;
YANG et al., 2001).
Figura 03: Estrutura básica dos flavonoides e sistema de numeração.
O
A
B
C2
35
7
1'
3'
5'
Fonte: Trueba, 2003.
Diversos estudos (MARQUES, 2004; FURIAN, 2009; ANSARI; SCHEFF,
2010; WILLIAMS, SPENCER 2012) comprovam que os flavonoides têm
demonstrado efeitos promissores no tratamento de patologias neurodegenerativas,
como as doenças de Parkinson e Alzheimer. Vários trabalhos relatam que os
compostos polifenólicos podem proteger os neurônios de substâncias tóxicas,
exercendo efeitos benéficos às células devido ao seu potencial antioxidante, além da
modulação de diferentes vias como as cascatas de sinais intracelulares, processos
antiapoptóticos, ou, síntese e degradação dos peptídeos amilóides (RAMASSAMY,
2006; ZHONG et al.,2011). Indicam ainda, a capacidade dos flavonoides em facilitar
34
a modulação intracelular da cascata bioquímica das proteínas que, além de estar
envolvida no processo de formação da memória, são responsáveis pela
sobrevivência e morte neuronal durante o desenvolvimento e envelhecimento do
sistema nervoso central, bem como por doenças neurodegenerativas (VIEGAS et al.,
2004).
3.5 Do flavonoide em estudo: Morina
A morina (2’,3,4’,5,7-pentahidroxiflavona) (fig. 04) é um flavonoide encontrado
em várias espécies vegetais de uso medicinal ou não, como por exemplo na
Chlorophora tinctoria, Prunus dulcis Raphanus sativus L., Lepidium sativum L.,
Caylusea abyssinica além de outras espécies de plantas da família moraceae (XIE et
al., 2006; DE MARTINO et al., 2012; TAMIRU; ENGIDAWORK; ASRES, 2012).
Figura 04: Estrutura do flavonoide morina.
OOH
OH O
OHOH
OH
Fonte: Marques, 2004.
Este flavonoide tem sido amplamente estudado, pois parece ter efeito ativo no
metabolismo fisiológico e bioquímico tendo principalmente ação protetora no sistema
cardiovascular (MARQUES, 2004), antiinflamatória (WANG et al., 2006),
hipouricemica (MO et al., 2007), atividade antialérgica (KIM et al., 2009), inibição da
oxidação de LDL (LIAN et al., 2008), além do efeito antioxidante (ZHANG et al.,
2009). A morina (devido a sua estrutura molecular) apresenta um grande potencial
35
antioxidante por ser um composto com múltiplas hidroxilas, sobretudo na posição
C3, responsável pela potência da ação antioxidante. O composto também possui
efeito inibitório sobre a enzima β-secretase in vitro, impedindo a formação da
proteína β-amiloide, presentes na DA (SHIMMYO et al., 2008).
Uma vez que na DA, a sua terapêutica atual é paliativa e limitada, e os agentes
anticolinesterásicos (única linha de tratamento) promoverem efeitos colaterais
significativos, muitas são as apostas em moléculas para futuros medicamentos anti-
DA. Os flavonoides por sua vez, exercem uma série de propriedades, principalmente
a atividade antioxidante, uma característica que os fazem alvos de pesquisa para a
busca de um composto com mais efetividade ou de melhor adaptação ao paciente
dos que já existentes no mercado.
36
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Reagentes
Para os ensaios bioquímicos foram necessários os seguintes reagentes:
Ácido tiobarbitúrico 0,67%
Água destilada
Agua Mili-Q
Azida sódica 100mM
Azul de Comassie G
BHT
EDTA 5mM e 1.5mM
Epinefrina 60mM
Glutationa oxidada
Glutationa peroxidase
Glutationa redutase
Glutationa reduzida
Inibidor de protease 1%
Morina (SIGMA, USA)
NADPH 0,15 mM
Peróxido de hidrogênio 30mM
Tampão fosfato de potássio monobásico 50mM e 150mM, pH 7,0
Tampão glicina 50mM
4.1.2 Equipamentos
Utilizou-se nos ensaios bioquímicos os seguintes equipamentos:
Alicate bico chato n. 6
Balança analítica (Bioprecisa®)
Bisturi
38
Centrífuga (CENTRIFUGER® 5418R)
Espátulas
Espectrofotômetro (SHIMADZU®- UV/Vis 1620)
Guilhotina (INSIGHT ®)
Homogeinizador de tecidos tipo potter (MARCONI-5421)
Micropipetas (TRAUSFEIPETTE®)
pHmetro (MARCONI ®)
Sonicador (BRONSON®)
Material cirúrgico
4.2 Animais
Para os ensaios foram utilizados camundongos fêmeos obtidos no Biotério
Central da UNIVALI, os quais foram mantidos a 22-27C com livre acesso a água e
comida, em ciclo claro/escuro 12/12 horas. Os ensaios foram realizados segundo os
princípios éticos de Boas Normas de Experimentação, após o projeto ser analisado e
aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa (CEP) da instituição com o parecer
339/09. Foram utilizados os cérebros de animais normais e com DA induzida por
STZ, oriundos de experimentos comportamentais e de memória.
4.3 Ensaios bioquímicos: “Testes in vitro”
4.3.1 Preparo dos animais para os testes “in vitro”
No primeiro momento, foram feitos dois experimentos in vivo. Animais
normais (sem indução de DA) e animais com DA induzida, foram separados em
grupos distintos (n=10). O primeiro grupo, os animais normais, foi tratado com
morina (nas doses de 25, 50 e 100mg/kg) e veículo de forma aguda, v.o, sendo
posteriormente submetidos aos ensaios comportamentais e de memória.
39
As doses foram escolhidas de acordo com ensaios farmacológicos realizados
com o composto avaliando a atividade antinociceptiva e com dados da literatura
(HOLZEMANN , 2012- dados não publicados).
O segundo experimento foi realizado com animais com DA induzida pela
administração I.C.V da STZ em doses subdiabetogênicas (duas infusões de
2,5mg/ml - 2µl em um intervalo de 48h). Os grupos (n=10) receberam uma solução
de morina por v.o (uma vez ao dia) nas doses de 25, 50 e 100mg/kg por vinte e um
dias e veículo (salina). Após a indução da DA e a realização dos ensaios
farmacológicos comportamentais que foram conduzidos pelas acadêmicas Stefany
Andrade Serrão e Carla Jane Weber, os animais foram sacrificados e os tecidos
cerebrais foram imediatamente estocados a -20 C para uso posterior (LU et al.,
2007).
4.3.2 Preparo das amostras de tecido cerebral
Para os estudos bioquímicos, animais foram sacrificados por decapitação,
utilizando guilhotina. Os cérebros foram dissecados e perfundidos com tampão
fosfato de potássio 50mM (pH 7,0) em baixa temperatura. Os cérebros foram
homogeneizados em tampão fosfato de potássio 50mM (pH 7,0) contendo uma
mistura de inibidor de protease a 1%, utilizando-se um homogenizador de tecidos do
tipo Potter em 1200rpm. Após, os homogenatos foram submetidos a sonicagem em
4 tempos de 30 segundos com intervalos de 30 segundos utilizando sonicador
Bronson (em banho de gelo). As amostras dos tecidos cerebrais foram aliquotadas
em eppendorfs e centrifugadas à 12.000g por 10min em temperatura de 4ºC. O
sobrenadante foi coletado e estocado em temperatura de -20C para determinação
da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) catalase (CAT), glutationa
peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) além do malondialdeído (MDA) e
proteínas totais (LU et al., 2007).
40
4.3.3 Medida de sistemas e produtos oxidativos
4.3.3.1 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD)
A atividade da SOD foi medida de acordo com o método proposto por McCord
e Fridowich (1969). Em uma cubeta foi pipetado 1mL de tampão glicina com 40µL de
amostra e zerado o equipamento. Em seguida foi adicionado 17µL de epinefrina e
sua absorbância foi lida em espectrofotômetro em um comprimento de onda de
480nm. A atividade da SOD foi calculada usando o coeficiente de extinção molar de
40mM-1cm-1 (MCCORD; FRIDOWICG, 1969 apud LU et al., 2007)
4.3.3.2 Determinação da atividade da Catalase (CAT)
A atividade da CAT foi verificada através do método de Aebi (1984). O meio
de reação consistiu em 0,65 mL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,0) e 50L de
amostra. A reação foi iniciada pela adição de 0,3mL peróxido de hidrogênio 30mM. A
decomposição de peróxido de hidrogênio foi monitorada em espectrofotômetro em
um comprimento de onda de 240nm a 25ºC. A atividade da CAT foi calculada
usando o coeficiente de extinção molar de 0,04mM-1cm-1 (AEBI, 1984 apud LU et al.,
2007).
4.3.3.3 Determinação da atividade da Glutationa Redutase (GR)
A atividade da GR foi realizada através do método de Misono e Ohta (1986),
modificado por Lu e colaboradores (2007) onde se verifica a diminuição na
absorbância em 340nm do NADPH. Em uma cubeta foi pipetado 750L do sistema
(tampão fosfato de potássio monobásico 150mM pH 7,0, EDTA 1,5mM e NADPH
0,15mM), 100L de água destilada com 50L de amostra e lido em
espectrofotômetro durante 2 minutos em um comprimento de onda de 340nm.
Obtendo dessa forma o D1. Na mesma cubeta foi adicionado 50L do substrato
(glutationa oxidada 20mM) e lido durante 2 minutos em 340nm. Obtendo-se assim o
41
D2. A atividade da GR foi calculada (D2-D1=D) onde o valor de D foi utilizado no
cálculo em que o coeficiente de extinção molar utilizado foi 0,04mM-1cm-1 (MISONO;
OHTA, 1986 apud LU et al., 2007).
4.3.3.4 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)
A atividade da GPx foi determinada pelo método de Paglia e Valentine (1967).
A azida sódica foi usada como substrato. O ensaio da redução enzimática do
peróxido de hidrogênio por GPx consiste no consumo da glutationa reduzida (GSH)
em que é restaurada para glutationa oxidada GSSG em uma reação enzimática
acoplada por GR. GR reduz GSSG para GSH usando NADPH como agente redutor.
A diminuição da absorbância em 340nm é devido ao consumo de NADPH. A
atividade da GPx foi calculada usando o coeficiente de extinção molar de 6.22mM-
1cm-1. Uma unidade de GPX foi definida como a quantidade de enzima que catalisou
a oxidação de 1.0 M de NADPH para NADP+ por minuto a 25ºC (PAGLIA;
VALENTINE, 1967 apud LU et al., 2007).
4.3.3.5 Determinação dos níveis de Malondialdeído (MDA)
A concentração de MDA foi determinada pelo método de Uchiyama e Mihara
(1978) conforme descrito por Lu et al., (2007). 1000L de amostra foram misturados
com 300L de ácido tiobarbitúrico (0,67%) seguido pela adição de 4L de BHT (di-
terc-butil metil fenol). A mistura foi incubada em banho-maria a 95ºC durante 15
minutos e em seguida colocadas em banho de gelo por 5 minutos. Após, as
amostras foram passadas para eppendorfs e centrifugadas a 1000g por 10 minutos.
A absorção do complexo colorido foi lida em 530nm (UCHIYAMA; MIHARA, 1978
apud LU et al., 2007;).
42
4.3.3.6 Determinação de proteínas (Método de Bradford)
A quantificação de proteínas totais em homogeneizado de cérebros de
camundongos foi determinada utilizando-se o método de Bradford (1976). A partir da
diluição das amostras (1:15) foi preparado sistema (50L de amostra diluída, 950L
de água destilada e 2,5mL de azul de comassie G). Foi deixado o sistema em
repouso durante 10 minutos. Na sequência foi lido em espectrofotômetro em um
comprimento de onda de 595nm. O branco foi realizado com 1000L de água
destilada e 2,5mL do azul de comassie G (BRADFORD, 1976).
O resultado deste método, de quantificação de proteínas totais, é utilizado
apenas no cálculo para obtenção dos resultados numéricos das atividades
enzimáticas, não sendo desta forma, reportado como um resultado isolado.
43
5 RESULTADOS
5.1 Medidas de sistemas e produtos oxidativos
5.1.1 Tratamento agudo com o flavonoide morina em animais normais
5.1.1.1 Efeito da morina sobre a atividade da enzima superóxido dismutase
(SOD)
A atividade da SOD está representada na Figura 05 e os resultados nos
permitem verificar que o tratamento com a morina na dose de 100mg/Kg foi capaz
de aumentar de modo significativo a sua ação enzimática. O aumento observado foi
de 166,11% em relação ao grupo controle.
Apesar de as doses de 25 e 50mg/kg terem induzido um aumento expressivo
de 57,95% e 128,52% respectivamente, as análises estatísticas mostraram que não
houve diferença em relação ao grupo controle.
Figura 05: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente no tecido cerebral dos camundongos normais .
C 25 50 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6**Controle
Morina
Tratamento (mg/kg)
SO
D
( M
O2
-./h
/mg
pro
teín
a)
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
44
5.1.1.2 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa redutase (GR)
A figura 06 demonstra que o tratamento agudo com a morina (em nenhuma
das doses utilizadas) não foi capaz de modificar a atividade da enzima GR em tecido
cerebral de animais normais quando comparado com o controle.
Figura 06: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o.) sobre a enzima GR presente no tecido cerebral dos camundongos normais.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Controle Morina
Tratamentos (mg/kg)
C 25 50 100
GR
( m
ol
NA
DP
H/
h/m
g p
rote
ína)
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.1.3 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase
(GPx)
Um perfil farmacológico semelhante ao anterior foi obtido com relação à
atividade da GPx (fig. 07). O tratamento agudo com a morina (em nenhuma das
doses utilizadas) modificou a atividade da enzima, uma vez que os valores de
atividade enzimática encontraram-se significativamente equivalentes aos animais
controles.
45
Figura 07: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a enzima GPx presente no tecido cerebral dos camundongos normais.
Controle 25 50 1000
10
20
30
40 Veículo Morina
Tratamento (mg/kg, v.o.)
GP
x
(U/m
gN
AD
+p
rote
ína)
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.1.4 Efeito da morina sobre a atividade da enzima catalase (CAT)
A figura 08 demonstra que o tratamento agudo com a morina promoveu uma
diminuição significativa da atividade da CAT. Esta redução foi de 40,76% para a
dose de 25mg/kg em relação ao grupo controle. Para a dose de 50mg/kg a redução
foi de 33,53% e para dose de 100mg/kg a atividade foi reduzida em 29,02%.
46
Figura 08: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a enzima CAT presente em tecido cerebral de camundongos normais.
Controle 25 50 1000
250
500 Veículo Morina
* ** **
Tratamento (mg/kg, v.o.)
Cata
lase
(um
olH
20
2/h
/mg
pro
teín
a)
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05), ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.1.5 Efeito da morina sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)
Na figura 09 é possível observar que os normais que receberam a morina v.o
houve uma diminuição significativa dos níveis de peroxidação em 23,46% e 32,77%
respectivamente, o que indica que a morina nas doses administradas (50 e
100mg/kg) foi capaz de reduzir o grau de peroxidação lipídica, sendo efetiva na
proteção do tecido cerebral em relação ao grupo controle.
47
Figura 09: Efeito da administração aguda da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de camundongos normais.
Controle 25 50 1000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Veículo Morina
* ** **
**
Tratamento (mg/kg, v.o.)
TB
AR
S (
um
ol)
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.2 Tratamento subcrônico com o flavonoide morina em animais DA induzida
por estreptozotocina
5.1.2.1 Efeito da morina sobre a atividade da enzima superóxido dismutase
(SOD)
A figura 10 demonstra que o tratamento subcrônico dos animais com a morina
aumentou a atividade da SOD. Verifica-se que esse efeito foi obtido em todas as
doses utilizadas no tratamento. É possível verificar que das doses de 25, 50 e
100mg/Kg houve um aumento na atividade da enzima de 30%, 60% e 90%
respectivamente quando comparados com os animais controle, tratados apenas com
salina.
48
Figura 10: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima SOD presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.
Controle 25 50 1000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
******
***
Tratamento (mg/kg, v.o.)
SO
D
µM
ol O
2-
/ h
/mg
pro
teín
a
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.2.2 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa redutase (GR)
A atividade da GR está representada na figura 11, onde é possível verificar
que o tratamento com a morina nos animais DA induzida por STZ promoveu
aumento da atividade da enzima de modo bastante pronunciado.
Os animais que receberam tratamento com o flavonoide administrado nas
doses de 50 e 100mg/Kg tiveram aumento significativo ação da enzima GR em 3,6%
e 24,7% respectivamente.
49
Figura 11: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GR presente em cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.
Controle 25 50 1000
6
12
Veiculo Morina
**
***
Tratamento (mg/kg, v.o.)
GR µ
Mo
l N
AD
PH
/ h
/m
g p
rote
ína
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01), *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.2.3 Efeito da morina sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase
(GPx)
Com relação aos efeitos da morina sobre a GPx, observou-se que o
tratamento subcrônico com a morina em animais com DA induzida por STZ também
promoveu aumento estatístico da atividade da enzima nas doses de 50 e 100mg/Kg
podendo ser observado na figura 12. As percentagens de aumento da atividade
enzimática foram calculadas em 28,91% e 34,63%.
50
Figura 12: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima GPx presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.
Controle 25 50 1000
10
20
30
40 Veiculo Morina
*** ***
Tratamento (mg/kg, v.o.)
GP
x
µM
ol N
AD
+/
h
/m
g p
rote
ína
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.2.4 Efeito da morina sobre a atividade da enzima catalase (CAT)
Analisando o efeito do composto em estudo sobre a atividade da enzima CAT
(fig. 13), observou-se que o tratamento crônico com a morina promoveu uma
diminuição da atividade da enzima nas doses de 25, 50 e 100mg/kg, com
percentagens de atividade calculadas em 15,55%, 34,22% e 46,56%
respectivamente.
51
Figura 13: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre a atividade da enzima CAT presente em tecido cerebral dos camundongos DA induzida por STZ.
Controle 25 50 1000
200
400
600
800
Veiculo Morina
***
******
Tratamento (mg/kg, v.o.)
CA
T µ
Mo
l H
2O
2 /
h
/mg
pro
teín
a
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
5.1.2.5 Efeito da morina sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)
Finalmente ao analisarmos o efeito do tratamento subcrônico da morina sobre
os níveis de peroxidação lipídica no cérebro dos animais com DA induzida por STZ
(fig. 18), verificou-se e que nas três doses testadas (25, 50 e 100mg/kg) houve uma
diminuição significativa dos níveis de peroxidação lipídica com percentagens de em
17,33%, 53,71% e 69, 85% respectivamente em relação ao grupo controle.
52
Figura 14: Efeito da administração subcrônica da morina (25, 50 e 100mg/Kg v.o) sobre os níveis de TBARS em tecido cerebral de camundongos DA induzida por STZ.
Controle 25 50 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Veiculo Morina
***
***
***
Tratamento (mg/kg, v.o.)
TE
BA
RS
Nota: Cada barra representa a média de 5 experimentos seguida pelos respectivos E.P.Ms. Os asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001). Os dados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett.
53
5 DISCUSSÃO
Os Produtos naturais estão ganhando popularidade como potenciais agentes
terapêutico, e, as plantas como representantes desse grupo, vem sendo testadas
para diferentes atividades biológicas, segundo dados etnofarmacológicos (YANG et
al., 2012). Os compostos fenólicos, resultantes do metabolismo secundário das
plantas têm sido apontados como eliminadores de radicais livres, agentes redutores,
e supressores da formação de oxigénio-singuleto (CORREIA DA SILVA, SOUZA,
PINTO, 2013). Fenóis e flavonóides são os principais componentes fitoquímico que
contribuem para a atividade antioxidante de plantas. Estes compostos são altamente
eficazes como sequestradores de radicais livres e parecem exercer menos efeitos
adversos em comparação com antioxidantes sintéticos (AGATI et al., 2012). Como
reportado anteriormente, a presença do grupo OH livre dos compostos fenólicos é
responsável principalmente pela atividade antioxidante dos mesmos (YANG et al.,
2001).
A morina (2’,3,4’,5,7-pentahidroxiflavona), é um composto fenólico com
atividade biológica antioxidante já comprovada em ensaios in vitro (ZHANG et al.,
2009). Estudos anteriores realizados em nossos laboratórios demonstraram que o
composto exerce significativos efeitos sobre a memória de animais normais e com
DA induzida por diferentes mecanismos (SERRÃO et al., 2011). Além disso,
estudos desenvolvidos em nossos laboratórios demonstraram que o composto
exerce pronunciado efeito antinociceptivo em modelos de dor aguda e inflamatória
(GONÇALVES, 2011- dados não publicados). Somam-se também como
propriedades farmacológica desse composto, a atividade antiinflamatória (CHEN et
al., 2012; LIU; LIN; 2013), cardioprotetora (POGULA et al., 2012), hepatoprotetora
(SHANKARI et al., 2010) dentre outras. Com relação a efeitos centrais da morina e
um possível efeito neuroprotetor em processos neurodegenerativos, foi verificado
recentemente, que o composto inibe a fosforilação da proteína TAU (GONG et al.,
2011) e tem efeito antiamiloidogenico (ONO et al., 2012), sendo então uma
molécula interessante com potencial anti-Alzheimer. Além disso, Zhang e
colaboradores (2010) verificaram que o composto exerce efeito neuroprotetor em
modelos in vivo e in vitro da doença de Parkinson. Considerando os resultados
nootrópicos do composto e seus efeitos como antiinflamatório e antioxidante em
54
tecidos periféricos, o presente estudo, investigou os efeitos antioxidantes do
composto em tecido cerebral de animais com DA induzida quimicamente (POGULA
et al., 2012),
Como relatado anteriormente, a DA é atualmente a desordem
neurodegenerativa com maior numero de casos diagnosticados no mundo (RAFII;
AUSEN, 2009). Considerando que a DA apresenta disfunções oxidativas importantes
já relatadas na literatura (AGOSTINHO; CUNHA; OLIVEIRA, 2010), foi escolhido o
modelo da STZ, o qual possibilita a indução de dano oxidativo nos animais, para a
avaliação da atividade da morina, Esse modelo tem sido bem aceito pela
comunidade científica devido à mimetização de vários aspectos patológicos da DA,
como, progressiva deterioração da memória, redução do metabolismo da glicose e
energia cerebral, indução de estresse oxidativo e promoção de disfunção colinérgica
(AWASTHI, 2010; PINTON et al., 2010). A diminuição da utilização cerebral da
glicose, e, os déficits no metabolismo energético representam anormalidades
encontradas em estágios iniciais de deficiência cognitiva, como é apontado em
diversos casos de DA (JEE et al., 2008).
No estudo realizado anteriormente por Serrão e colaboradores (2011), a
indução de DA foi realizada com a STZ, causando nos animais um visível déficit de
memória no teste da esquiva inibitória. Entretanto, o déficit cognitivo causado pela
infusão I.C.V de STZ foi revertido pela administração da Morina, sendo o efeito da
dose máxima do composto utilizada durante os experimentos (100 mg/kg), superior
ao fármaco de referência Galantamina.
No presente estudo foi verificada a hipótese de que a melhora no
desempenho dos animais nos testes de memória referenciados por Serrão e
colaboradores (2011), pode ter relação com um aumento nas defesas antioxidantes
do organismo dos mesmos submetidos ao tratamento com a morina. Para
verificação dessa hipótese, realizou-se a mensuração da atividade das enzimas
antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR no tecido cerebral desses animais. Além da
verificação do nível de peroxidação lipídica através do teste do malondialdeído
(MDA).
Em processos oxidativos, a SOD é uma enzima que catalisa a dismutação do
superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Assim sendo, constitui uma
importante defesa antioxidante em quase todas as células do organismo expostas
ao oxigênio. A função da SOD é impedir reações prejudiciais do superóxido aos
55
tecidos do organismo. O superóxido, formado quando o oxigênio é reduzido por um
elétron e é uma das principais espécies reativas de oxigênio, pois tem a capacidade
de reagir com alvos celulares sensíveis e críticos (TORSDOTTIR et al., 2010). Além
disso, o peróxido de hidrogênio formado pela ação da SOD é uma espécie oxidativa
altamente nociva para o organismo. Nossos resultados demonstraram que a Morina
produziu aumento da atividade da SOD tanto em animais normais quanto em
animais com DA induzida, sugerindo que o composto exibe capacidade de impedir a
formação de superóxido de hidrogênio e suas ações deletérias sobre o tecido
nervoso.
Outra enzima deste sistema, a CAT, é responsável pela conversão do
peróxido de hidrogênio em produtos menos reativos para o organismo. A CAT
rapidamente catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio
(VLASITS et al., 2010). Entretanto, a ineficiência na degradação deste composto,
provoca a criação de outros radicais livres.
O peróxido de hidrogênio tem a capacidade de produzir um radical livre
extremamente poderoso e tóxico através da reação de Fenton. Ao reagir-se peróxido
de hidrogênio com o íon Ferro (Fe2+) ocorre a produção do radical livre hidroxila
(OH•), o qual tem uma alta capacidade oxidativa e não possui sistema enzimático
para sua eliminação (MORIWAKI; OSBORNE; PHILLIP, 2008). Em nosso estudo, ao
contrário do esperado, o tratamento dos animais normais e com DA induzida com a
morina, produziu diminuição da atividade da CAT de forma dose-dependente. Num
primeiro momento, pensou-se em erro experimental. Entretanto a hipótese foi
descartada, uma vez que os grupos experimentais são bastante homogêneos e o
procedimento foi repetido com outros tratamentos havendo semelhança de
resultados no sentido de diminuição da atividade enzimática. Resultados
semelhantes foram obtidos por Justino e colaboradores (2010) avaliando os efeitos
da quercetina sobre o sistema de oxidação em cérebro de animais com DA induzida
pela D-galactose. Os autores sugerem que a conversão do peróxido de hidrogênio
em produtos menos reativos para o organismo deve ter ocorrido por vias alternativas
as quais ainda são desconhecidas.
A eliminação de todo o peróxido de hidrogênio formado durante o estresse
oxidativo é extremamente importante. Para isso, existe outro sistema enzimático que
constitui defesa antioxidante em nosso organismo. Este sistema é constituído pelas
enzimas GPx e GR. A GPx utiliza a glutationa reduzida, que deve ser oxidada para o
56
reduzir o peróxido de hidrogênio. A GR tem por objetivo final a restauração da
glutationa reduzida com auxílio do NADPH, fornecendo este produto para o
funcionamento da GPx (SHANMUGAM et al., 2011). Com relação a esses sistema,
foi observado em nossos experimentos que a morina não foi capaz de promover o
aumento da atividade tanto da GPx quanto da GR em animais normais, porém esse
efeito foi observado de forma dose-dependente em animais com DA induzida por
STZ, sugerindo que o estresse oxidativo provocado pela STZ, pode ser revertido
após o tratamento com o composto.
Outro fator mensurável relacionado a danos oxidativos pode ser investigado
analisando-se o grau de oxidação de lipídios. Este processo, denominado
peroxidação lipídica, ocorre quando radicais livres retiram elétrons dos lipídios das
membranas celulares, desestabilizando-as. A avaliação deste processo pode ser
realizada através da quantificação do produto final desta peroxidação, o MDA. Esta
determinação ocorre através da quantificação de MDA que reage com o ácido
tiobarbitúrico (TBARS). Quanto maior a concentração de TBARS, maior o grau de
destruição de membranas (CATALÁ, 2006). No presente estudo, o tratamento dos
animais normais com o composto produziu diminuição da concentração de TBARS
de forma significativa. Entretanto, um efeito muito mais significativo e dose-
dependente foi observado em animais com DA induzida por STZ, sugerindo o efeitos
preventivo do composto com relação a diminuição da peroxidação lipídica.
A administração da STZ nos animais causou alterações na capacidade
cognitiva e antioxidante como avaliado nos resultados atuais e nos resultados de
Costa e colaboradores (2010). Os danos oxidativos neuronais, em animais com DA
induzida por STZ, são consistentes com trabalhos anteriores que utilizaram a mesma
metodologia (ISHRAT et al., 2009a; ISHRAT et al., 2009b; TAHIROVIC et al., 2007).
Ishrat e colaboradores (2009a) realizaram tratamento com Selênio, em
animais que apresentavam DA induzida por STZ, e, verificaram uma melhora na
memória dos mesmos, além de um aumento na atividade antioxidante. Ishrat e
colaboradores (2009 b), também investigaram a ação da Curcumina sobre os déficits
de memoria induzidas pela DA, e, ressaltaram que o mecanismo de ação deste
composto estaria relacionado com sua capacidade de inibir o estresse oxidativo.
Hong e colaboradores (2004) avaliaram a atividade do tocoferol em animais
com DA induzida por STZ, demonstrando que o composto promove um aumento na
atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx nesses animais.
57
Os resultados deste estudo condizem com aqueles reportados por Awasthi e
colaboradores (2010) e Tota e colaboradores (2010), os quais respectivamente
investigaram a ação neuroprotetora da curcumina e quercetina. Esses e outros
autores enfatizam a capacidade antioxidante dos flavonoides, como o principal fator
de neuroproteção. Ambos os grupos avaliaram o efeito desses flavonoides
utilizando o mesmo modelo de indução de DA, por nós utilizado. Nestes estudos,
animais tratados com tais compostos, tiveram efeito antioxidante aumentando devido
ao aumento da expressão da atividade das enzimas pertencentes ao sistema de
oxidação, bem como, tiveram uma redução no nível de TBARS da mesma forma que
os animais tratados com a morina, demonstrando a proteção que estes compostos
realizam sobre o SNC. Além disso, em todos os trabalhos onde foi verificado o efeito
neuroprotetor, os compostos produziram também efeito nootrópico revertendo os
déficits cognitivos oriundos dos agentes causadores da DA nos animais. De uma
forma geral, nossos resultados corroboram com os demais da literatura no que tange
ao potencial dos flavonoides como agentes com potencial terapêutico em processo
neurodegenerativos, tanto centrais como periféricos.
58
59
6 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos permitem sugerir que a morina possui atividade
protetora contra o estresse oxidativo gerado em tecido cerebral, principalmente no
cérebro de animais com DA induzida pela STZ;
Os resultados indicam que a morina aparenta exibir efeito indutor positivo
sobre as enzimas de defesa antioxidantes testadas em animas normais e DA
induzida pela STZ, principalmente sobre a SOD;
Os resultados sugerem ser esse um dos mecanismos pelos quais a
morina reverteu o déficit cognitivo observado nesses animais quando avaliados no
teste da esquiva inibitória.
Os animais tratados com a morina v.o, tanto os normais quanto os com
DA induzida, apresentaram diminuição do valor de TBARS, o que sugere um efeito
protetor devido à redução do nível de lipoperoxidação.
Outros experimentos são necessários para investigar os mecanismos pelos
quais a morina promove o efeito protetor do SNC, a fim de apontá-lo como suposto
candidato ao tratamento alternativo da doença em questão.
60
61
REFERÊNCIAS
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ANEXO A – Parecer comitê de ética