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Flávia Regina Greiffo

EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA

INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA CRÔNICA EM

CAMUNDONGOS:

PAPEL DA SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA

Trabalho apresentado à Universidade Nove de Julho como requisito para

obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.

Orientador: Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira

São Paulo, SP

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FLÁVIA REGINA GREIFFO

EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA

INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA CRÔNICA EM

CAMUNDONGOS:

PAPEL DA SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA

Trabalho apresentado à Universidade Nove de Julho como requisito para

obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.

Orientador: Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira

São Paulo, SP

3

Greiffo, Flávia Regina.

Efeitos do treinamento físico aeróbio na inflamação pulmonar alérgica

crônica em camundongos: papel da sinalização purinérgica./ Flávia Regina

Greiffo. 2015.

57 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São

Paulo, 2015.

Orientador (a): Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira.

1. Asma. 2. Exercício. 3. Doenças respiratórias/ reabilitação. 4. Alergia e

imunologia, I. Vieira, Rodolfo de Paula. II. Titulo

CDU 615.8

5

DEDICATÓRIA

Dedico meus estudos à minha mãe Tania e à minha avó Marilia.

6

AGRADECIMENTOS

À minha família e amigos.

Ao professor orientador Rodolfo de Paula Viera, muito obrigada pelas

oportunidades.

À professora e amiga Ana Paula Ligeiro de Oliveira.

Aos demais professores da Universidade Nove de Julho.

À professora Deborah de Camargo Hizume Kunzler - Universidade do Estado de

Santa Catarina.

Ao laboratório de imunologia pulmonar e exercício e Renata, Nicole, Léia e

Vanessa.

Ao professor Milton de Arruda Martins, Fernanda Lapa e Nilsa Damasceno, pela

colaboração neste estudo.

Ao grupo de funcionários da Universidade Nove de Julho, em especial à técnica

Ângela.

À Universidade Nove de Julho, pela concessão da bolsa de estudo.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro

(Processos 2012/23305-9 e 2013/23763-0).

The intellect has little to do on the road to discovery.

There comes a leap in consciousness, call it intuition

or what you will, and the solution comes to you and

you don’t how or why.

—Albert Einstein (1879-1955)

7

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas e siglas

Resumo.................................................................................................................................10

Abstract................................................................................................................................12

Introdução............................................................................................................................14

Asma

Definição

Epidemiologia

Fisiopatologia

Inflamação

Receptor purinégico

P2X7

Exercício e asma

Objetivos..............................................................................................................................24

Objetivo Geral

Objetivos Específicos

8

Metodologia.........................................................................................................................26

Animais e grupos experimentais

Modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica

Modelo de treinamento físico aeróbio de intensidade moderada

Eutanásia dos animais, coleta do soro sanguíneo e níveis de citocinas no soro

sanguíneo

Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e níveis de citocinas no

lavado broncoalveolar (LBA)

Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da

histomorfometria

Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio da

técnica de western blotting


técnica de imunohistoquímica

Avaliação hiperresponsividade brônquica

Resultados............................................................................................................................34

Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e níveis de citocinas no

lavado broncoalveolar (LBA) e soro sanguíneo

9

Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da

histomorfometria


técnica de western blotting


técnica de imunohistoquímica

Avaliação hiperresponsividade brônquica

Discussão..............................................................................................................................52

Considerações finais............................................................................................................56

Referências Bibliográficas..................................................................................................57

Anexos

Anexo I - Aprovação do estudo pelo comite de ética da Universidade Nove de Julho

- UNINOVE

Anexo II - Vieira RP, Silva RA, Oliveira-Junior MC, Greiffo FR, Ligeiro-Oliveira AP, Martins

MA, Carvalho CR. Exercise deactivates leukocytes in asthma. Int J Sports Med. 2014 Jun;35(7):629-

35. doi: 10.1055/s-0033-1358477. Epub 2013 Nov 20.

Anexo III - Oliveira MC Jr, Greiffo FR, Rigonato-Oliveira NC, Custódio RW, Silva VR,

Damaceno-Rodrigues NR, Almeida FM, Albertini R, Lopes-Martins RÁ, de Oliveira LV, de

Carvalho Pde T, Ligeiro de Oliveira AP, Leal EC Jr, Vieira RP. Low level laser therapy reduces

acute lung inflammation in a model of pulmonary and extrapulmonary LPS-induced ARDS. J

Photochem Photobiol B. 2014 May 5;134:57-63. doi:0.1016/j.jphotobiol.2014.03.021. Epub 2014

Apr 4

Anexo IV – Artigo para submeter: Exercise Immunology Review (IF 9.9)

Allergic lung inflammation is reduced by aerobic exercise training: role of purinergic receptor P2X7

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24258470



10

Lista de abreviaturas e siglas

ADP - do inglês, Adenosine Diphosphate

AMP - do inglês, Adenosine Monophosphate

ATP - do inglês, Adenosine Tri-phosphate

ELISA - do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

IL-1 beta – Interleucina 1 beta

IL-5 – Interleucina 5

IL-6 – Interleucina 6

IFN-gama – Interferon gama

LBA – Lavado bronco-alveolar

OVA – Ovalbumina

PBS – do inglês, Phosphate Buferred Saline

TFA – Treinamento Físico Aeróbio

UDP – do inglês, Uridine Diphosphate

UTP – do inglês, Uridine Triphosphate

11

Greiffo FR. Efeitos do treinamento físico aeróbio na inflamação pulmonar alérgica crônica

em camundongos: papel da sinalização purinérgica [dissertação]. São Paulo: Pós

Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho, 2014.

RESUMO

Nos últimos anos um crescente número de estudos tem demonstrado que o

treinamento físico aeróbio (TFA), quando realizado de maneira adequada em termos de

intensidade, duração e freqüência, apresenta inúmeros benefícios para o paciente asmático,

incluindo melhora na qualidade de vida, diminuição dos níveis de ansiedade e depressão,

melhora da ventilação minuto, diminuição do número de crises, diminuição dos níveis de

óxido nítrico exalado, além de diminuir a necessidade diária de corticoesteróides.

Recentemente, foi demonstrado pela primeira vez que o TFA apresenta um efeito

antiinflamatório direto sobre as vias aéreas do paciente asmático, uma vez que o TFA

diminuiu o número de eosinófilos no escarro induzido desses pacientes. Entretanto,

inúmeras perguntas e hipóteses foram levantadas sobre os possíveis mecanismos

envolvidos nesse efeito antiinflamatório do TFA na asma. Nesse sentido, um crescente

número de estudos com animais de experimentação em modelos de asma tem sido

publicado, os quais têm revelado possíveis vias de atuação do TFA na asma. Entretanto, até

o momento não existem publicações sobre os efeitos do TFA sobre a via dos receptores

purinérgicos, os quais têm um papel central na fisiopatologia da asma. Portanto, o presente

estudo teve com objetivo avaliar se os efeitos antiinflamatórios do TFA na asma é mediado,

pelo menos em parte, pela inibição da expressão dos receptores purinérgicos, assim como

pela diminuição dos níveis do principal ativador dos receptores purinérgicos, a adenosina

trifosfato (ATP) extracelular. Para isso, foram utilizados 40 camundongos C57Bl/6

12

divididos em 4 grupos experimentais (n=10 / cada) Controle, Exercício, Asma e Asma +

Exercício. O modelo de asma (inflamação pulmonar alérgica crônica) foi induzido por meio

de injeção intra-peritoneal com ovalbumina nos dias 0, 14, 28 e 42 seguidos por inalação

com solução de ovalbumina (1, 3 e 5%) três vezes por semana, a partir do dia 21 até o dia

53 do protocolo experimental. Com o intuito de avaliar o efeito terapêutico do TFA sobre a

inflamação e sobre a via dos receptores purinérgicos, o TFA de baixa intensidade foi

realizado 5x/semana, 60 minutos/sessão, iniciando no dia 27 do protocolo experimental até

o dia 53, quando a inflamação das vias aéreas já estava estabelecida. Vinte e quatro horas

após a última inalação e sessão de treinamento, os animais foram anestesiados,

traqueostomizados, canulados e o lavado broncoalveolar foi coletado e analisado para os

níveis de ATP e também para o número de células totais e contagem diferencial. A

avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 foi realizada no homogenato do

tecido pulmonar por meio da técnica de western blotting, e também nos cortes histológicos

por meio da técnica de imunohistoquímica. Através da técnica de histologia foi

quantificado o número de linfócitos e eosinófilos nas vias aéreas, assim como o

remodelamento brônquico. A hiperresponsividade brônquica das vias aéreas foi avaliada

através do sistema Buxco. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com a literatura,

uma vez que o TFA reduz a inflamação crônica das vias aéreas. Nossos resultados também

sugerem que o TFA atua na via dos receptores purinégicos diminuindo a inflamação

pulmonar.

Descritores: asma, exercício, doenças respiratórias/ reabilitação, alergia e imunologia,

pulmão, inflamação, ATP, receptores purinérgicos, camundongos.

13

Greiffo FR. Effects of Aerobic Physical Training on the Chronic Allergic Pulmonary

Inflammation in Mice: Role of Purinergic [master thesis]. São Paulo: Pós Graduação em

Ciências da Reabilitação, Nove de Julho University, 2014.

ABSTRACT

In the last years, a growing number of studies have demonstrated that the aerobic

physical training (APT), performed in the proper intensity, duration and frequency, display

several benefits to asthmatic patients, including improvement in quality of life, reduction in

the levels of anxiety and depression, improvements in minute ventilation, reduction in the

number of crisis, reduction in the levels of exhaled nitric oxide, beyond reduced daily

needing of corticosteroids. More recently, was demonstrated for the first time that APT

presents a direct anti-inflammatory effect on the airways of asthmatic patient, since that

APT reduced the number of eosinophils in the induced sputum of these patients. However,

several questions and hypothesis were raised up about the possible mechanism involved in

these anti-inflammatory effects of APT for asthma. In this way, a growing number of

experimental studies using models of asthma have been published, revealing possible

mechanism involved of action APT for asthma. On the other hand, until this moment no

study evaluated the effects of APT on the via of purinergic receptors, a family of receptors

that present a central role in the physiopathology of asthma. Therefore, the present study

aim is to evaluate if the anti-inflammatory effects of APT for asthma is mediate, at least

partially, by the inhibition of expression of purinergic receptor P2X7, as well as the

extracellular adenosine triphosphate (ATP). Thus, using 40 C57Bl/6 mice, divided in 4

experimental groups (Control, n = 10), (Exercise, n = 10), (Asthma, n = 10) and (Asthma +

14

Exercise, n = 10). The experimental model of asthma (chronic pulmonary allergic

inflammation) was induced through the intra-peritoneal injection of ovalbumin solution on

days 0, 14, 21 and 42 followed by inhalation of 1%, 3% and 5% ovalbumin, 3x/week, and

beginning on 21st day until the 53rd day of experimental protocol. To evaluate the

therapeutic effects of APT on the inflammation and on the via of purinergic receptors, the

low intensity APT was performed 5x/week, 60 min/session, begining on 27th day of

experimental protocol until the 53rd day, when the airways inflammation is already

established. Twenty-four hours after the last inhalation and training session, mice were

anesthetized, tracheotomized, canuled and the bronchoalveolar lavage was collected and

analyzed for the ATP levels and also the total number of cells as well as the differential

number of cells. The analysis of hyperresponsiveness was performed. The histological

analysis was performed to evaluate and quantify the number of lymphocytes and

eosinophils in the airways wall, and also the airway remodeling. The expression of

purinergic receptor P2X7 in the lung tissue homogenate was performed using western

blotting and also the immunohistochemistry technique.

Keywords: asthma, exercise, respiratory diseases/ rehabilitation, allergy and immunollogy,

lung, inflammation, ATP, purinergic receptors, mice.

15

1. INTRODUÇÃO

1.1 Asma

1.1.1 Definição

A asma é uma doença predominantemente alérgica causada pela inflamação

crônica das vias aéreas a qual resultará em remodelamento brônquico, associados à

ativação de células inflamatórias como eosinófilos, mastócitos, basófilos,

macrófagos e linfócitos 1,2. Os sintomas da asma são conjugados, de uma maneira

geral, por episódios recorrentes de chiados (sibilos), falta de ar, aperto no peito e

tosse derivados da hiperresponsividade brônquica 3. De acordo com Webb et al.,

esta sintomatologia demonstra correlação consistente não somente com a gravidade

da doença, mas também com os níveis aumentados de leucócitos e seus produtos

nos pulmões 1.

1.1.2 Epidemiologia

Na última década, a incidência da asma tem aumentado de maneira significativa,

tornando-se uma das doenças respiratórias mais comuns nos países industrializados

4. Por ano ocorrem cerca de 350 mil internações por asma no Brasil, constituindo-se

ela na quarta causa de hospitalizações pelo Sistema Único de Saúde (2,3% do total)

16

e sendo a terceira causa entre crianças e adultos jovens 5. Na maioria dos casos, a

asma é desencadeada pela exposição alergênica a antígenos como ácaros, pêlos de

animais, baratas, fungos, pólen e produtos químicos, como perfumes e pesticidas.

Todavia, fatores como exposição ao ar frio, inalação de poluentes atmosféricos,

fumaça de cigarro e fatores emocionais podem desencadear uma crise de asma 6.

1.1.3 Fisiopatologia

A primeira etapa para o desenvolvimento do quadro asmático é a sensibilização

a algum antígeno. As células dendríticas, presentes na mucosa brônquica, atuam

como células apresentadoras de antígenos (APC). A interação das células dentríticas

com os linfócitos T auxiliadores resulta na estimulação de linfócitos B, iniciando a

produção de imunoglobulinas E (IgE). Uma vez liberadas na circulação, as

imunoglobulinas ligam-se aos receptores de alta afinidade presentes na superfície

dos mastócitos e em consequência desse processo, a grande maioria dos asmáticos

desenvolve uma fase imediata e uma fase tardia no próximo contato com o alérgeno

7.

A fase imediata se instala rapidamente e caracteriza-se pela obstrução das vias

aéreas como resultado da contração da musculatura lisa. As imunoglobulinas

liberadas na circulação ligam-se aos receptores de alta afinidade presentes nos

mastócitos 8,9 que, uma vez degranulados, liberam mediadores como aminas

vasoativas (histamina e serotonina), proteases, heparina, prostaglandinas,

17

tromboxanos e leucotrienos. Estas substâncias possuem potente atividade

constritora sobre a musculatura lisa das vias aéreas, além de promoverem aumento

da permeabilidade vascular e edema local 10.

A fase tardia ocorre, geralmente, a partir de 3 horas de contato com o alérgeno,

e pode perdurar por vários dias. O processo inflamatório nessa etapa decorre de uma

grande migração leucocitária para as vias aéreas 8,9, contribuindo para a cronicidade

do processo inflamatório por meio do envolvimento de muitos mediadores e

aumento da expressão de moléculas de adesão, com favorecimento da ativação e

migração de macrófagos, basófilos e eosinófilos para o espaço perivascular 10.

Macrófagos alveolares carecem de expressão do receptor de IgE de alta

afinidade. A inflamação alveolar na asma, faz com que os mastócitos alveolares

expressem um fenótipo com alta afinidade de IgE, que caracteriza a asma não

controlada 11. A asma grave é uma condição heterogênea que consistem em

fenótipos de asma eosinofílica. O tratamento com anti-IgE, metotrexato, antibióticos

macrolídeos, antifúngicos e termoplastia brônquica é revisto e recomendações são

feitas. Muitos estudos sugerem que a investigação para fenotipagem de asma grave

irá proporcionar tanto abordagens eficazes em biomarcadores como novas terapias

para a gestão de asma grave 12.

Há evidências que a predisposição genética para o desenvolvimento do

processo asmático é fundamentada através da mediação de imunoglobulinas E (IgE)

em resposta ao alérgeno correspondente, sendo a forma mais comum da doença

representada na infância e na idade adulta 13. Slager e colaboradores ao realizarem

18

uma meta-análise sobre os fatores genéticos para o desenvolvimento da asma

apresentaram que a interação dos genes que induzem a bronconstrição e a exposição

ao meio (alérgenos, tabaco, poluição) determinam a expressão e progressão da

doença 14. No mesmo estudo ao levantarem os dados dos genes suscetíveis à asma

foi relatado um maior índice dos genes característicos na população com etnia

européia do que afriana 14.

1.1.4 Inflamação

As células inflamatórias no processo asmático estão envolvidas no

desenvolvimento da hiperresponsividade bronquica, broncoconstrição, secreção de

muco e remodelamento das vias aéreas, estes processos são ocasionados através da

liberação de mediadores inflamatórios tais quais como quimiocinas, fatores de

crescimento e citocinas inflamatórias 15.

Conroy & Willians em uma revisão de literatura sugerem que quimiocinas

como eotaxinas, proteínas quimiotáticas para monócitos (MCP) e RANTES podem

sinalizar a via dos receptores CCR3 e CCR4 que são expressos em eosinófilos,

basófilos, mastócitos e em subpopulações de linfócitos Th2 16

.

Do ponto de vista imunológico, a asma pode ser definida, de forma geral, por

uma resposta denominada Th2, com liberação de citocinas pró inflamatórias típicas

dessa resposta, como as interleucinas 4 (IL-4), 5 (IL-5) e 13 (IL-13) 17. Apesar da

19

asma ser tradicionalmente descrita como uma doença de vias aéreas, evidências

experimentais têm sugerido que as alterações mecânicas nas áreas adjacentes aos

brônquios, próximas ao parênquima pulmonar, também são importantes nessa

doença 18.

Hizume et al., em um protocolo experimental murino, observaram que animais

asmáticos apresentaram um infiltrado leucocitário significativo na região

compreendida entre a membrana basal e a adventícia nos pulmões, resultando em

uma diminuição substancial da complacência pulmonar desses animais 19. Em um

estudo recente o qual investigaram a expressão do receptor A1-adenosina e seu

mecanismo de ação, em um modelo animal de inflamação aguda induzida por

ovoalbumina, encontraram que os animais com aumento de células inflamatórias

apresentaram concomitante um aumento na hiperresponsividade bronquica 20.

A inflamação na asma, portanto, situada diretamente na via aérea ou em suas

proximidades, pode resultar em episódios recorrentes de chiado, dispnéia, aperto

torácico e tosse. Situações como estas são comumente associados à obstrução ao

fluxo do ar, que é revertida espontaneamente ou após tratamento 21.

1.1.5 Receptor purinérgico

Estudos recentes demonstraram um acúmulo de nucleotídeos,

particularmente de adenosina trifosfato (ATP), nos pulmões de pacientes asmáticos,

e também em animais com inflamação pulmonar alérgica crônica, este acúmulo de

20

nucleotídeos no espaço extracelular ativam receptores purinérgicos (P2r) que

também irão modular a inflamação e o remodelamento na asma 22–24. Os receptores

purinérgicos são receptores transmembranais ionotrópicos P2X (P2X1 – P2X7) ou

metabotrópicos P2Y (P2Y1 – P2Y14; receptores acoplados às proteínas G) e são

expressos em inúmeros tipos celulares, como leucócitos e também sobre células

estruturais, como o epitélio brônquico e o epitélio alveolar 22–25.

Os receptores purinérgicos (P2r) têm emergido como uma potente e

importante família de receptores que modulam a inflamação e o remodelamento na

asma, através da ativação de células do sistema hematopoiético, assim como células

estruturais22–25. Esses receptores são ativados através do acúmulo de

purinas/nucleotídeos (ATP, ADP, AMP, UDP, UTP, etc) no espaço extracelular 22–

25. O acúmulo de nucleotídeos (particularmente de ATP) nos pulmões de pacientes

asmáticos, assim como de animais com inflamação pulmonar alérgica crônica tem

sido demonstrado em muitos estudos 22–25. O acúmulo extracelular de ATP ativa os

receptores purinérgicos, o que resulta na ativação de eosinófilos, linfócitos T,

células dendríticas, células epiteliais brônquicas e células epiteliais alveolares, e por

fim o aumento da inflamação e remodelamento das vias aéreas, e também

hiperresponsividade brônquica 22–25.

Mediadores inflamatórios e moléculas de adesão permeiam o tráfego de

reação alérgica-inflamatória pulmonar 26, modelos experimentais de asma têm

demonstrado uma maior expressão celular das moléculas de adesão VCAM-1 na

região perivascular de animais com inflamação pulmonar alérgica 27. Vanderstocken

et al., em um estudo realizado com camundongos deficientes em receptores

21

purinérgicos P2Y2 [P2Y2(-)], demonstrou que, quando submetidos à inflamação

pulmonar alérgica crônica, os animais P2Y2(-) mostraram níveis de VCAM-1

solúveis abolidos, com visível diminuição do infiltrado leucocitário 28.

Vieira e colaboradores ao estudarem a especificidade do receptor

purinérgico do tipo P2Y6 em um modelo agudo e crônico de asma induzida por

OVA e por ácaro doméstico (HDM) apresentaram que a expressão de P2Y6 nas

células epiteliais da via áerea é regulada durante a inflamação, tanto aguda como

crônica 24. Os resultados também constataram que o bloqueio ou a deficiencia de

P2Y6 na estrutura das células reduz as características principais da asma 24. Assim

como Vieira e colaboradores outros estudos apontam que o estudo a partir dos

receptores purinérgicos é uma hipóstese de elucidação e tratamento para asma 24,29.

Sumamente em uma revisao de literatura Idzko e colaboradores defendem

que as condições inflamatórias estão associados com a liberação extracelular de

nucleotídeos, exclusivamente o ATP 30. No compartimento extracelular a molécula

de ATP funciona como uma molécula de sinalização através da ativação de

receptores purinérgicos (P2r)30. Uma discussão baseada na via da sinalização dos

receptores P2R em doenças inflamatórias ou infecciosas o estudo verificou que os

receptores purinérgicos atuam nas respostas inflamatórias em doenças pulmonares

30.

22

1.1.6 P2X7

O receptor prurinérgico do tipo P2X7 é altamente ativado pelo acúmulo de

quantidades elevadas de ATP no espaço extracelular e está envolvido com a

inflamação aguda e a inflamação crônica na fisiopatologia da asma 22,25,31. P2X7

pode ser expressado em muitos tipos celulares, como mastócitos neutrófilos,

eosinófilos, monócitos, macrófagos, células B, células T, células dentíticas e

também em células estruturais, por exemplo céluals epitelias das vias aéreas,

pneumócitos tipo II, células endoteliais, fibroblastos e células musculares lisas 30.

Neste contexto o receptor purinérgico do tipo P2X7 pode regular vários aspectos

relacionados da resposta imune inata e adaptativa 30.

Manthei e colaboradores ao estudarem a função do receptor P2X7 nas

amostras de sangue total de neonatos com alto risco para desenvolvimento da asma

sugerem que a funcionalidade do receptor está relacionada com o risco e gravidade

da doenca 32.

O principal papel do P2X7 na resposta imunológica contra tumores e

patógenos está relacionado a polarização de células T efetoras especificas do

antígeno por células dentríticas, a qual contribui para a indução e manutenção da

inflamação crônica 30. A sinalização da expressão do receptor P2X7 está presente na

fase de sensibilização de doenças alérgicas, tal como a asma 30.

A inibição dos receptores purinérgicos resulta em diminuição da inflamação

das vias aéreas na asma 22,33. Vieira et al. em estudo com camundongos verficou que

23

o treinamento físico aeróbio diminui a expressão do receptor P2X7 pelas células do

epitélio brônquico de camundongos em modelo experimental de asma 6.

1.2 Exerício e asma

O controle da asma é primariamente farmacológico, porém o treinamento

físico aeróbio (TFA) pode se constituir em um complemento importante no

tratamento da doença. O TFA resulta no aumento das capacidades respiratória e

ventilatória, além de propiciar atenuação da sintomatologia do quadro asmático 34–

36.

Em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica em murinos,

o treinamento aeróbio de intensidade moderada induziu a redução do número de

células polimorfo e mononucleares no lavado broncoalveolar, além de diminuição

da infiltração leucocitária, produção de citocinas, expressão de moléculas de adesão

e remodelamento estrutural dos pulmões 37. Observou-se também que o treinamento

aeróbio diminuiu a ativação do fator de transcrição NF-kB nos pulmões destes

animais 37.

Vieira e colaboradores, em um estudo realizado com camundongos,

utilizaram um modelo experimental de inflamação pulmonar crônica, o qual foi

constatado que tanto o treinamento aeróbio de baixa intensidade quanto de

moderada intensidade diminuíram substancialmente o infiltrado eosinofílico na

parede das vias aéreas e a densidade das células positivas para IL-4 e IL-5. Os

24

grupos submetidos ao treinamento físico aeróbio apresentaram redução significativa

na deposição de colágeno e fibras elásticas nas paredes das vias aéreas, no

espessamento da musculatura lisa e no índice de broncoconstrição. Os resultados

demonstraram que o treinamento físico aeróbio também induziu um aumento na

expressão de células positivas para IL-10, uma citocina reconhecida por suas

características regulatórias e anti-inflamatórias 38.

Evidências na literatura demonstraram que a inibição dos receptores

purinérgicos é capaz de inibir a secreção da potente citocina pró-inflamatória IL-

1beta, além de aumentar a produção da citocina antiinflamatória IL-10 39,40. Existem

ainda inúmeros estudos demonstrando que a IL-10 apresenta importantes efeitos

antiinflamatórios na asma 41–43.

Apesar de todo o conhecimento atual sobre a imunopatologia da asma, o

efeito terapêutico do TFA sobre a inflamação não está compreendido na sua

totalidade, devido à sua complexidade e interatividade imunológica. Nesta esfera a

interação do TFA com a via dos receptores purinérgicos torna-se uma importante

via de atuação. Sendo assim, os modelos experimentais de asma induzida com

ovoalbumina (OVA) constituem-se em uma boa alternativa para investigação dos

mecanismos e progressão da doença. Este modelo reproduz características

específicas da asma, e desta forma, representam uma importante ferramenta para a

pesquisa da fisiopatologia, bem como para a elucidação dos mecanismos de ação do

TFA.

25

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar se os efeitos antiinflamatórios do TFA em um modelo experimental

de asma são mediados por alterações nos níveis de ATP extracelular e também por

alterações na expressão do receptore purinérgico P2X7.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos do TFA em um modelo experimental de asma nas

seguintes variáveis:

Inflamação alérgica crônica das vias aéreas;

Hiperresponsividade brônquica;

Níveis de ATP extracelular no lavado broncoalveolar (BAL);

Níveis de citocinas pelas células inflamatórias no lavado

broncoalveolar (LBA);

Níveis de citocinas pelas células inflamatórias no soro

sanguíneo;

Expressão do receptor purinérgico P2X7, no homogenato do

tecido pulmonar por meio da técnica de western blotting;

26

Expressão do receptor purinérgico P2X7 nos cortes

histológicos dos pulmões por meio da técnica de imunohistoquímica.

27

3. METODOLOGIA

3.1 Animais e grupos experimentais

Os animais foram obtidos do biotério de criação da Universidade Nove de

Julho e mantidos em condições controladas de humidade (50%-60%), luminosidade

(12h claro/12 h escuro) e temperatura (22°C - 25°C) no biotério de experimentação

da Universidade Nove de Julho.

Foram utilizados 40 Camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade,

pesando aproximadamente 20 gramas, os quais foram distribuídos aleatoriamente

nos seguintes grupos experimentais (n= 4x10 animais em cada grupo):

1.Controle (Con – não sensibilizado e não treinado), 2. Exercício (Exe – não

sensibilizado e treinado), 3. OVA (OVA – sensibilizado com OVA e não treinado),

4. OVA+Exe (OVA+Exe – sensibilizado com OVA e treinado).

3.2 Animais Modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica

Os animais foram sensibilizados com injeção intraperitoneal de 20ug de

Ovalbumina OVA (Salto, MG, Brasil) nos dias 0, 14, 28 e 42. A partir do dia 21 os

animais foram submetidos a desafios inalatórios com solução de 1% (duas semanas)

28

3% (duas semanas) e 5% (uma semana) de OVA, 30 minutos por sessão, 3 vezes

por semana durante 5 semanas.

3.3 Modelo de treinamento físico aeróbio de intensidade moderada

Os animais foram adaptados em esteira ergométrica para camundongos

(Imbramed, RS, Brasil) durante 3 dias (0,5km/h) por 15 minutos. Os animais foram

treinados a uma intensidade moderada, correspondendo a 60% da máxima

velocidade alcançada no teste de esforço. O treinamento de intensidade moderada

foi realizado durante 4 semanas, 5 vezes por semana, 1 hora por sessão de

treinamento.

3.4 Eutanásia dos animais e coleta do soro sanguíneo

Os experimentos foram realizados 24 horas após o último desafio com

alérgeno (OVA) e última sessão de treinamento, e após anestesia dos animais com

quetamina e xilazina (100mg/kg e 10mg/kg, respectivamente). Em seguida, foi

realizada incisão cirúrgica na linha mediana do abdômen do animal e coletada uma

amostra de sangue da artéria aorta abdominal. As amostras foram centrifugadas

(6000 rpm, a 4ºC, por 10 minutos). O soro resultante foi aliquotado e armazenado a

-20 ºC para análise das citocinas IL-1 beta, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-gama. A técnica

29

imunoenzimática – ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) foi utilizada

para esse fim.

3.5 Avaliação da inflamação pulmonar e dos níveis de ATP e nível de citocinas

no lavado broncoalveolar (LBA)

Após anestesia e traqueostomia, os animais foram canulados e os pulmões

foram lavados com 3 x 1 ml de PBS. Cem microlitros do volume do lavado

recuperado foi imediatamente utilizado para quantificação dos níveis de ATP

através de técnica de quimioluminescência. O restante foi centrifugado a 1200 rpm a

4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi armazenado a -70°C para possíveis análises

posteriores. O botão celular foi ressuspendido em 1 ml de PBS e a determinação do

número de células totais no LBA foi realizada por meio de contagem na Câmara de

Neubauer (5-8, 20). Alíquotas do material ressuspendido foram utilizadas para

preparação de lâminas de cytospin as quais foram coradas com May-Grunwald-

Giemsa (onde 100 células foram contadas para a determinação da contagem

diferencial) (5-8, 20).

Para análise da expressão de citocinas IL-1 beta, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-

gama no LBA foi realizada a técnica imunoenzimática – ELISA (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay).

30

3.6 Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da

histomorfometria

Com o intuito de avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a

proporção de volume de fibras colágenas e elásticas na parede das vias aéreas, o

pulmão esquerdo foi coletado e armazenado em formol 10% por 24 horas, seguindo

das passagens em álcool os pulmões foram armazenados em parafina para posterior

corte no micrótomo, por meio da técnica clássica de histologia. As lâminas foram

coradas com o corante Picrossírius para detecção das fibras de colágeno e com

resorcina e fucsina com oxidação para detecção das fibras elásticas. A análise

quantitativa da proporção de volume de fibras de colágeno e elástica na parede das

vias aéreas foi realizada através da técnica morfométrica.

3.7 Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio

da técnica de western blotting

A avaliação da expressão do receptore P2X7 no homogenato dos pulmões

foi realizada com o intuito de avaliar se os efeitos antiinflamatórios

desencadeados pelo treinamento aeróbio no modelo de asma é resultante de

31

um efeito do treinamento aeróbio sobre a expressão do receptor purinérgico

P2X7.

A avaliação da expressão deste receptor foi realizada através da técnica de

Western Blotting. O pulmão direito foi coletado 24horas após o último desafio com

alérgeno (OVA) e último teste físico e homogenizados em 1 ml de solução para o

lysis celular (RIPA Lysis

Buffer, Santa Cruz, EUA) contendo inibidores de proteases e fosfatases e

incubadas por 30 minutos em gelo, para a extração das proteínas. Após esse período

de incubação o material obtido da quebra celular foi centrifugado a 13300 rpm a

4°C e o conteúdo protéico (sobrenadante) foi coletado e imediatamente armazenado

a -70°C. A quantificação de proteínas foi realizada pelo método de BCA (BCA

Pierce Thermo Scientific, EUA). Cinqüenta microgramas de proteína foram

carregadas em um gel de poliacrilamida 10% e então transferidas para uma

membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com os seguintes anticorpos

primários: anti-P2X7 e revelada através do sistema com quimiluminescência. A

avaliação densitométrica das bandas foi realizada utilizando-se o software Image J

(NIH, EUA).


da técnica de imunohistoquímica

32

Para avaliação da imunolocalização das células alvo da sinalização

purinérgica no modelo experimental de asma, assim como dos efeitos do TFA no

modelo experimental de asma o pulmão esquerdo foi coletado e armazenado em

formol 10% por 24 horas, seguindo das passagens em álcool os pulmões foram

armazenados em parafina para posterior corte no micrótomo, por meio da técnica

clássica de histologia. Lâminas previamente preparadas com 3-aminopropil-trietoxi-

silano (Silane-Sigma) foram utilizadas para fixação dos cortes. Para a realização da

técnica de imunohistoquímica os cortes histológicos foram inicialmente

desparafinados e hidratados. Em seguida, foram submetidos aos procedimentos

descritos abaixo:

Etapa 1 – Recuperação Antigênica: por meio de alta temperatura, utilizando

a panela à vapor por 40 minutos, seguidos de descanso de 20 minutos em

temperatura ambiente. Após esse período, as lâminas foram lavadas em água

corrente, água destilada e TBS.

Etapa 2 – Bloqueio e Incubação com Anticorpo Primário: O bloqueio da

peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada (H2O2) 10V 3% (3x5

minutos). Em seguida os cortes foram lavados em água corrente, água destilada e

TBS. O anticorpo primário P2X7 diluído em BSA na proporção de 1:300, o qual foi

aplicado sobre os cortes de tecido. A incubação foi realizada à 4°C, “overnight”.

Etapa 3 – Incubação com o Anticorpo Secundário e Complexo: As lâminas

foram lavadas em TBS e com o anticorpo secundário, anti-rabbit por 30 minutos a

33

37°C. Em seguida as lâminas foram lavadas em TBS e incubadas com o complexo

por 30 minutos a 37°C.

Etapa 4 – Revelação: seguiu-se com a lavagem das lâminas em TBS e

revelação pelo cromógeno 3,3-diaminobenzedine (DAB).

Etapa 5 – Contra-coloração e Montagem das lâminas: As lâminas foram

lavadas abundantemente em água e Hematoxilina de Harris. Em seguida, as mesmas

foram lavadas em água corrente, desidratadas, diafanizadas e montadas com resina

para microscopia.

A análise foi realizada por meio da fotografia de 5 vias aéreas/animal com a

marcação específica do anticorpo escolhido – Image Pro Plus Software 4.0.

3.8 Avaliação hiperresponsividade brônquica

Para a avaliação da hiperresponsividade brônquica foi utilizado o sistema

Buxco, onde foi avaliado o Penh (índice de hiperresponsividade brônquica), que

leva em conta o tempo inspiratório e expiratório, conforme previamente descrito

(21). O agente broncoconstritor que foi utilizado para a realização da curva dose-

resposta foi a metacolina, conforme previamente descrito.

34

Ressalto que a da hiperresponsividade brônquica foi realizada em

colaboração com o prof. Dr. Milton de Arruda Martins, da Faculdade de Medicina

da USP.

3.9 Análise estatística

Os dados foram analisados através do software SigmaStat 3.1 (Califórnia,

EUA). A distribuição da normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de

Kolmogorov-Smirnov. Os dados com distribuição paramétrica foram submetidos ao

teste One-way ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls para comparação

entre os grupos. Os dados com distribuição não paramétrica foram submetidos ao

teste One-way ANOVA on Ranks seguido pelo teste de Dunn’s para a comparação

entre os grupos. Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). Os

gráficos foram elaborados utilizando-se o software GraphPad Prism 3.1 (Califórnia,

EUA).

35

4. RESULTADOS

4.1 Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e nível de citocinas no

lavado broncoalveolar (LBA) e soro sanguíneo

O protocolo experimental deste estudo sugere que o treinamento físico

aeróbio resultou em diminuição do conteúdo celular obtido do LBA. O grupo OVA

apresentou um aumento do número total de células, bem como de eosinófilos,

linfócitos, neutrófilos e macrófagos quando comparado aos demais grupos. O

treinamento físico aeróbio, por sua vez, atenuou significativamente tanto o número

total como a contagem diferencial de células (p<0,05) (Figuras 1 a 5). Os dados

abaixo ilustram os efeitos antiinflamtórios locais e sistêmicos via treinamento físico

aeróbio, uma vez que o grupo OVA+Exe apresentou dados inflamatórios

signicantemente diminuidos em relação ao grupo OVA.

Os resultados abaixo sugerem que os efeitos antiinflamatórios do exercício

físico podem ser mediados pela diminuição do influxo de células inflamatórias para

os pulmões, e que o treinamento físico aeróbio atuou potencialmente a inflamação

nos pulmões dos animais dos animais do grupo OVA.

36

Controle Exe OVA OVA+Exe0

10

20

30

40

***

*C

élu

las T

ota

is L

BA

(x10

6/m

L)

Figura 1. Efeitos do TFA sobre o número total de células no LBA. Os valores estão

expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.

***p<0,001 quando comparado ao grupo controle; *p<0,05 quando comparado ao

grupo OVA.


5

10

15

20

**

**

Macró

fag

os L

BA

(x10

6/m

L)

Figura 2. Efeitos do TFA sobre o número macrófagos no LBA. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. **p<0,05 quando

comparado aos demais grupos.

37

Controle Exe OVA OVA+Exe0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5***

**N

eu

tró

filo

s L

BA

(X

10

6/m

L)

Figura 3. Efeitos do TFA sobre o número neutrófilos no LBA. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. ***p<0,001 quando

comparado ao grupo controle; **p<0,05 quando comparado ao grupo OVA.


2

4

6***

**

Lin

fócit

os L

BA

(x10

6/m

L)

Figura 4. Efeitos do TFA sobre o número linfócitos no LBA. Os valores estão expressos



38


5

10

15

***

###E

osin

ófi

los n

o L

BA

(x10

6/m

L)

Figura 5. Efeitos do TFA sobre o número eosinófilos no LBA. Os valores estão expressos


comparado aos demais grupos; ###p<0,001 quando comparado ao grupo OVA.

Ao verificar os níveis de ATP no lavado broncoalveolar o grupo OVA

apresentou estatiscamente aumentado quando comparado com os demais grupos, o

treinamento físico aeróbio, per se, dimunui os níveis de ATP no lavado broncoalveolar

(Figura 6). O treinamento físico aeróbio modificou os níveis de adenosina trifosfato no

lavado broncoalveolar, uma vez que o grupo OVA apresentou um aumento de mais de

100 vezes e o treinamento físico aeróbio dimuniu os níveis para os valores controle.

39

Controle Exe OVA OVA+Exe

0

50

100

150

200**

AT

P L

AB

(n

mo

l/m

L)

Figura 6. Efeitos do TFA sobre os níveis de ATP no LBA. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão **p<0,01 quando

comparado ao demais grupos.

As figuras 7 a 11 representam os níveis de IL-1beta, IL-5, IL-6, IL-10 e

IFN-gamma (respectivamente) obtidos do lavado broncoalveolar. A exposição à

OVA aumentou os níveis de IL-5 quando comparam-se os grupos OVA e Controle

(p<0,05), mas diminuiu no grupo OVA+Exe quando comparado ao grupo OVA

(p<0,05) (Figura 8). Ao analisar os níveis de IL-1beta, IL-6, IL-10 e IFN-gamma, os

grupos não apresentaram diferença estatisticamente significativa (Figura 7 e -11).

40

Control Exe OVA OVA+Exe0

100

200

300

400

IL-1

beta

LB

A (

pg

/mL

)

Figura 7. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-1beta no LBA. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.


20

40

60

*

**

IL-5

LB

A(p

g/m

L)

Figura 8. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-5 no LBA. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05, quando


41


50

100

150

IL-6

LB

A (

pg

/mL

)




50

100

150

200

IL-1

0 L

AB

(p

g/m

L)



42


20

40

60

80

IFN

-g L

BA

(p

g/m

L)

Figura 11. Efeitos do TFA sobre os níveis de IFN-gamma no LBA. Os valores estão


Na análise da expressão da citocinas IL-1beta, IL-5 e IL-6 no soro sanguíneo

os grupos não apresentaram diferença significante (Figura 12-14). Ao analisar a

expressão de IL-10 no soro todos os grupos apresentaram um aumento significativo

ao serem comparados com o grupo controle (p<0.05) (Figura 15). Simultaneamente,

existe diferença estatística na expressão de IFN-gamma quando os grupos são

comparados ao grupo exercício (p<0,05) (Figura 16).

43


500

1000

1500

2000

2500

IL-1

beta

So

ro (

pg

/mL

)

Figura 12. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-1beta no soro. Os valores estão expressos



200

400

600

800

IL-5

So

ro (

pg

/mL

)

Figura 13. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-5 no soro. Os valores estão expressos


44


1000

2000

3000

IL-6

So

ro (

pg

/mL

)




500

1000

1500

****

**

IL-1

0 S

oro

(p

g/m

L)


como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão **p<0,05, quando

comparado ao grupo controle.

45


100

200

300

* * *

IFN

-gam

ma S

oro

(p

g/m

L)

Figura 16. Efeitos do TFA sobre os níveis de IFN-g no soro. Os valores estão expressos

como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05, quando

comparado ao grupo exercício.

4.2 Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da

histomorfometria

Ao avaliar a porcentagem de fibras colágenas nas vias aéreas de

camundongos, observa-se que a OVA é capaz de proporcionar um aumento da

expressao de colágeno e o treinamento físico aeróbio por sua vez é capaz de reduzir

a expressão de fibras colágenas em camundongos do grupo OVA+Exe (p<0,05)

(Figura 17). Porém, o treinamento físico aeróbio nao apresentou o mesmo efeito

sobre a proporção de volume de fibras elásticas (Figuras 18).

46


20

40

60***

Fib

ras c

olá

gen

as(%

)

Figura 17. Efeitos do TFA sobre a proporção de volume de fibras colágenas. Os valores

estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05

quando comparado ao grupo OVA+Exe; **p<0,01 quando comparado aos grupos Controle

e Exe.


5

10

15

20

25

Fib

ras e

lásti

cas

- m

m2

Figura 18. Efeitos do TFA sobre a proporção de volume de fibras colágenas. Os valores

estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.

47


da técnica de western blotting

O treinamento físico aeróbio não modificou a expressão do receptor

purinérgico P2X7. Através da técnica clássica de western blotting foi possível

verificar que os animais do grupo OVA não apresentaram um aumento da expressão

de P2X7 (Figura 19). Neste estudo não foi possível verificar o efeito positivo do

receptor purinérgico P2X7 através da técnica de western blotting, o qual foi inibido

nos grupos.

Figura 19. Efeitos do TFA sobre na expressão de P2X7 no homogenato de pulmão.


da técnica de imunohistoquímica

Ao quantificar a expressão do receptor purinergico P2X7 abserva-se que o

grupo OVA apresenta um aumento quando é comparado aos grupos Controle e

Cont. Exe OVA OVA+Exe

48

grupo OVA+Exe (p<0,05) (Figura 20). Na figura 21 este fenomeno é ilustrado e

pode-se observar que na fotomiografia referente ao grupo OVA a expressão de

P2X7 é mais evidente do que nos demais grupos (Figura 21).


5

10

15

20

*P

2X

7 E

pit

éli

o B

ron

qu

ico

(%

)

Figura 20. Efeitos do TFA sobre a expressao do receptor purinérgico P2X7 no pulmão. Os

valores estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão

*p<0,05 quando comparado aos grupos Controle e OVA+Exe.

49

Figura 21. Efeitos do TFA sobre na expressão de P2X7 no pulmão. A – Controle; B –

Exercício; C – OVA; D – OVA+Exe.

4.4 Avaliação hiperresponsividade brônquica

A avaliação da hiperresponsividade pulmonar foi realizada através da

pletismografia de corpo inteiro (Buxco) a doses crescentes de metacolina (agente

constritor) – 6,25 a 50 mg/mL. Nos graficos 21 a 24 o indice de hiperreponsividade

não é diferente entre os grupos, entretanto, ao utilizar concentrações mais elevadas

A B

C D

50

do agente constritor (metacolina) o grupo OVA apresentou um aumento estatísco

em comparação aos demais grupos (p<0,05) (Figuras 25 e 26).


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Pen

h (

Baseli

ne)

Figura 21. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão



0.0

0.5

1.0

1.5

Pen

h (

PB

S)



51


0.0

0.5

1.0

1.5

Pen

h (

6,2

5 M

Ch

)




0.0

0.5

1.0

1.5

Pen

h (

12,5

MC

h)



52


0

1

2

3

4

*

Pen

h (

25 M

Ch

)


expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. *p<0,05

quando comparado aos demais grupos.


0

2

4

6

**

Pen

h (

50 M

Ch

)


expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. **p<0,01

quando comparado aos demais grupos.

53

5. DISCUSSÃO

O treinamento físico aeróbio tem atuado com uma importante ferramenta

para o controle da inflamação, estudo recente de Viera e colaboradores, em um

modelo experimental de asma, evidenciou a dimunuição de leucócitos no espaço

peribrônquico, bem como a diminuição de citocinas Th 2, moléculas de adesão

(ICAM-1 Intracellular Adhesion Molecule, e VCAM-1 Vascular Adhesion

Molecule) e espécies reativas de oxigenio (GP91phox and 3-nitrotyrosine) dos animais

asmáticos que praticaram exercício por 4 semanas 44.

Neste estudo, foi observado que o treinamento físico aeróbio realizado por 1

hora diária num período de 4 semanas é capaz de diminuir o número de células

totais e diferencias no lavado broncoalveolar bem como os níveis de ATP no lavado

broncoalveolar, diminuir os níveis de citocinas Th2 (IL-5) no lavado broncoalveolar

e aumentar os níveis de IL-10, um citocina pró-inflamátoria, no soro. A expressão

do receptor purinérgico P2X7 nos animais inflamados também demostrou um

aumento significativo quando comparado com os outros grupos. O remodelamento

das vias aéreas no grupo OVA também mostrou um aumento significativo quando

comparado aos demais grupos. Nos resultados de hipperesponsividade brônquica

com altas doses do agente constritor pode-se observar um aumento estatisticamente

significativo no grupo OVA quando comparado aos grupos Controle, Exe e

OVA+Exe. Estes dados sugerem que o treinamento físico eoróbio tem um efeito

imunomodulador sobre a inflamação e que a via dos receptores purinérgicos pode

elucidar os questionamentos da inflamação nos modelos experimentais de asma.

54

Idzko e coloboradores descrevem a importância da via dos receptores

purinéricos, e que o receptor purinérgico P2X7 tem grande relevancia na

fisiopatologia dos processos inflamatotórios cronicos 30. Um estudo já descreve a

importancia da via dos receptores purinérgicos na asma e que a expressão de P2X7

está diretamente relacionada com a inflamação, macrófagos alveolares e eosínófilos

no sangue humano 22. No presente estudo o aumento do conteúdo celular obtido no

LBA e aumento dos níveis de IL-5 pode ser explicado, em parte, pelos resultados de

P2X7. Os dados de P2X7 deste estudo podem sugerir, assim como Müller e

colaboradores, que a sinalização purinérgica tem grande envolvimento na asma e

pode atuar como uma importante via farmacológica. Os estudos acima citados

descrevem que a via dos receptores purinérgicos é ativado pelo acúmulo de ATP no

espaço perivascular 22,30, os resulatdos deste estudo corroboram com o descrito na

literatura, e enfatiza a sinalização purinérgica nos modelos experimentais de asma.

Estudos do grupo de Viera mostram que a IL-10 tem um papel importante

no treinamento físico aeróbio, uma vez que seus estudos mostram um aumento nos

níveis de IL-10 no grupo exercício 6,38,44. A IL-10 é capaz de inibir a apresentação

do antígeno pelos monócitos/macrófagos, abolindo respostas proliferativas e com

consequente queda dos níveis de citocinas pelos linfócitos T 44. Os dados referentes

a IL-10 não mostraram-se diferentes nos grupos de treinamento físico aeróbio,

porém os níveis de IL-5 mostraram-se diferentes. O que sugere que mesmo a IL-10

não aprensentando aumento entre os grupos, o treinamento físico aeróbio

apresentou suas características imunomodulatórias encontradas na literatura.

55

Evidências têm emergido para aclarar aspectos da resposta mecânica

broncoconstritora em modelos experimentais. Uma hipótese a ser considerada,

basicamente, ao influxo de células inflamatórias. As características histopatológicas

do processo inflamatório da asma consistem em um aumento da permeabilidade

vascular, formação de exsudato (edema) e um grande afluxo de mastócitos,

macrófagos, neutrófilos, linfócitos (principalmente do subtipo CD4+) e,

predominantemente, eosinófilos, do compartimento intra para o extravascular, com

hipersecreção de muco e descamação da superfície epitelial 46,47. De acordo com

Barnes, estas alterações epiteliais promovem maior sensibilidade e reatividade da

superfície de vias aéreas aos agentes constritores, que, somadas ao espessamento da

membrana basal, podem contribuir para o aumento da rigidez da parede de vias

aéreas, resultando em uma resposta de maior intensidade nos parâmetros de

mecânica respiratória avaliados na asma 47.

Estudos pós-mortem demonstram que a camada de músculo liso das vias

aéreas de pacientes asmáticos está aumentada, podendo resultar em

hiperresponsividade brônquica se a contratilidade das células permanecer constante

47. Porém, tal espessamento é atribuído, em parte, a deposição da matrix extracelular

ao redor das células do músculo liso, podendo atuar inversamente ao encurtamento

celular 48.

Os dados de fibras colágenas e hiperresponsividade brônquica deste estudo

são esclarecidos de acordo com a literatura descrita, sugere-se que os a dimuniuição

das fibras colágenas estão relacionadas com o aumento da hiperresponsividade

brônquica.

56

A asma é uma doença inflamatória crônica crônica das vias aéreas e muitos

estudos demostram que as células inflamatórias tanto no processo inflamatório,

como no processo de remodelamento, e ambos estão associados a obstrução

brônquica 48. Pastva e colaboradores publicaram os primeiros resultados do efeito

imunomodulador do treinamento físico aeróbio, uma vez que reduziu a inflamação

alergica das vias aéreas em um modela experimental em camundongos 50.

Recentemente Silva e colaboradores em ao estudarem o efeito do

treinamento físico aeróbio sobre a via dos glicocorticóides em um modelo

experimental de asma (OVA), mostrou que os animais treinados apresentaram um

aumento nos receptores de glicorticóides, bem como citocinas pró-inflamatórias,

tais como IL-10 e IL-1ra e reduziu a e expressão de mediatores inflamatórios (NF-

κB, IL-4, IL-5, TGF-β, RANTES, VEGF, ICAM-1, VCAM-1) 51. Estudos como de

Silva e colaboradores, sugerem que o tratamento da asma não exclusivamente

farmacológico, bem como neste estudo o treinamento físico aeróbio atuou como

uma ferramenta de tratamento para a inflamação crônica das vias aéreas.

57

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo descreve dados de um modelo experimental de inflamação

pulmonar alérgica e sugere que a via dos receptores purinérgicos tem importância

em processos inflamatórios, tais como a asma. Os modelos experimentais

reproduzem características específicas da asma, e desta forma, representam uma

importante ferramenta para a pesquisa de sua fisiopatologia, bem como para a

prescrição segura de exercícios por profissionais da área de saúde. A via do receptor

purinégico P2X7 pode elucidar a atuação do treinamento físico aeróbio na asma, o

qual é estudado e com grande benefício para pacientes asmáticos. Neste sentido,

sugerimos que o treinamento físico aeróbio reduz o fenótipo da asma, reduz os

níveis de ATP no lavado broncoalveolar e reduz a exopressão de P2X7 no pulmão

de camundongos com inflamação pulmonar alérgica.

58

Referências Bibliográficas

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IL-3, IL-4 and IL-5 regulate airways hyperreactivity. J. Immunol. 165, 108–113

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474 (2006).

6. Vieira, R. P. et al. Airway epithelium mediates the anti-inflammatory effects of

exercise on asthma. Respir. Physiol. Neurobiol. 175, 383–9 (2011).

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