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SUZANA STEFANELLO
FISIOLOGIA PÓS-COLHEITA E PROPAGAÇÃO in vitro DE
CULTIVARES DE Solanum sessiliflorum DUNAL
MARINGÁ PARANÁ – BRASIL DEZEMBRO – 2008
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ii
SUZANA STEFANELLO
FISIOLOGIA PÓS-COLHEITA E PROPAGAÇÃO in vitro DE
CULTIVARES DE Solanum sessiliflorum DUNAL
Tese apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento para a obtenção do título de Doutor.
MARINGÁ PARANÁ – BRASIL DEZEMBRO – 2008
iii
Catalogação na Publicação elaborada pela Biblioteca Universitária UNIOESTE/Campus de Toledo. Bibliotecária: Marilene de Fátima Donadel - CRB – 9/924
1. Cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) - Qualidade físico-quimica 2. Solanum sessiliflorum - Fisiologia pós-colheita 3. Solanum sessiliflorum - Propagação in vitro 4. Frutas tropicais I. Scapim, Carlos Alberto, Or. II.T
CDD 20. ed. 634.6 634.04 583.79
Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte.
(A autora)
Stefanello, Suzana
S816f Fisiologia pós-colheita e propagação in vitro de cultivares de Solanum sessiliflorum Dunal / Suzana Stefanello. -- Maringá, PR : [s. n.], 2008 xii ; 117 f.
Orientador: Dr. Carlos Alberto Scapim Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento) - Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Agronomia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento.
1. Cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) - Qualidade físico-quimica 2. Solanum sessiliflorum - Fisiologia pós-colheita 3. Solanum sessiliflorum - Propagação in vitro 4. Frutas tropicais I. Scapim, Carlos Alberto, Or. II.T
iv
Aos meus pais, Nelci e Anésia, e meus irmãos, Moisés, Raquel e Catarina, grandes
incentivadores deste sonho.
v
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Maringá, pela possibilidade de realização do
curso de Doutorado em Genética e Melhoramento.
Ao professor doutor Carlos Alberto Scapim, pela orientação, pela confiança
e pelas valiosas sugestões.
Aos professores co-orientadores, doutora Maria Celeste Gonçalves Vidigal
e doutora Maria de Fátima Pires da Silva Machado, pela colaboração.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento pelos valiosos ensinamentos.
Ao Francisco José da Cruz, secretário do Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento, pelo auxílio prestado.
Ao professor doutor Adilson Ricken Schuelter, pela co-orientação, pelo
constante estímulo e incentivo, ensinamentos e exemplo de perseverança.
Ao professor doutor Fernando Luiz Finger, pelas sugestões e por ter aberto
as portas de sua Instituição (UFV) e de seu laboratório para a realização deste
trabalho.
Ao professor doutor Ismar Sebastião Moschetta, pela colaboração na
confecção das lâminas e identificação de estruturas.
À professora doutora Giselda Maria Pereira, pelo valioso auxílio na análise
dos frutos.
À Universidade Paranaense, pela infraestrutura oferecida, e aos seus
funcionários, que das mais diversas maneiras colaboraram para a realização deste
trabalho.
Aos amigos, Lucimar, Suzymeire, Izabel, Paulo, Débora, Maria do Socorro,
Juliana e Vaníria, pelo auxílio nos momento difíceis.
À tia Lia e tia Vera, pela hospedagem.
Aos alunos e amigos do Programa de Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento, pelos momentos maravilhosos que passamos juntos.
vi
À Andressa, Jaqueline, Juliane e Patrícia, pela contribuição na execução das
análises laboratoriais.
Ao Senhor Wilson e Dona Keiko, meus pais número dois, pelo apoio
constante.
Ao Júnior, meu companheiro e amigo, pelo apoio, incentivo e paciência nos
momentos de ausência.
A todos os amigos que, embora não citados, foram importantes durante o
trajeto percorrido.
... se nada mais fizemos, não foi por falta de vontade, mas por limitação...
(Luiz Francisco Bianchini)
vii
BIOGRAFIA
SUZANA STEFANELLO, filha de Nelci Segatto Stefanello e Anésia Rita
Osmari Stefanello, nasceu em 18 de outubro de 1972, em Faxinal do Soturno,
Estado do Rio Grande do Sul.
Concluiu o Ensino Fundamental na Escola Estadual Padre João Zanella, em
Nova Palma – RS, no ano de 1986. Na escola Estadual Tiradentes da mesma cidade,
em 1989, concluiu o Ensino Médio.
Em janeiro de 1996, diplomou-se em Ciências Biológicas pela
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) em Santa Maria - RS.
Em março de 1998, iniciou o Curso de Mestrado em Recursos Genéticos
Vegetais, na Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC,
recebendo o título de Mestre em 06 de julho de 2000.
Desde fevereiro de 2000, é professora do Curso de Ciências Biológicas da
Universidade Paranaense, Toledo - PR.
Iniciou o curso de Doutorado em Genética e Melhoramento, nesta
Universidade, em março de 2005.
viii
ÍNDICE
RESUMO ....................................................................................................................x
ABSTRACT............................................................................................................. xii
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................4
2.1. O cubiu .............................................................................................................4
2.1.1. Origem e distribuição geográfica...............................................................4
2.1.2. Descrição botânica da espécie ...................................................................4
2.1.3. Condições de cultivo e utilização ..............................................................7
2.2. Fisiologia do amadurecimento e pós-colheita de frutos...................................8
2.2.1. Desenvolvimento de frutos ........................................................................8
2.2.2. Ação do etileno durante o amadurecimento de frutos ...............................9
2.2.3. Demais modificações durante o amadurecimento dos frutos ..................14
2.2.3.1. Coloração ..........................................................................................14
2.2.3.2. Firmeza..............................................................................................15
2.2.3.3. Acidez total titulável (ATT)..............................................................16
2.2.3.4. Sólidos solúveis totais (SST) e relação SST/ATT ............................17
2.3. Propagação de plantas in vitro........................................................................18
2.3.1. Aspectos gerais da cultura de tecidos vegetais ........................................18
2.3.2. Morfogênese ............................................................................................20
2.3.2.1. Embriogênese somática.....................................................................21
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................27
CAPÍTULO I - Amadurecimento de frutos de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal)
tratados com Ethephon..............................................................................................39
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................42
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................44
2.1. Material vegetal e condições de cultivo .........................................................44
2.2. Determinação dos componentes físico-químicos dos frutos ..........................44
2.3. Determinação da atividade respiratória e da produção de etileno..................45
2.4. Análise estatística ...........................................................................................47
ix
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................49
4. CONCLUSÕES.....................................................................................................69
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................70
CAPÍTULO II - Indução de embriogênese somática em cubiu (Solanum
sessiliflorum Dunal): efeito da fonte de explante e de substâncias reguladoras de
crescimento................................................................................................................75
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................79
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................81
2.1. Material vegetal e condições de cultivo .........................................................81
2.2. Determinação do efeito de reguladores de crescimento sobre hipocótilos e/ou
cotilédones.............................................................................................................82
2.3. Determinação do efeito de reguladores de crescimento sobre embriões
zigóticos.................................................................................................................83
2.4. Avaliações citoquímicas e estruturais ............................................................84
2.5. Análise anatômica ..........................................................................................85
2.6. Análise estatística ...........................................................................................85
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................86
3.1. Efeito de reguladores de crescimento sobre hipocótilos e/ou cotilédones .....86
3.2. Efeito de reguladores de crescimento sobre embriões zigóticos....................94
4. CONCLUSÕES...................................................................................................104
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................105
APÊNDICES...........................................................................................................112
x
RESUMO
STEFANELLO, Suzana, D. Sc., Universidade Estadual de Maringá, dezembro de 2008. Fisiologia pós-colheita e propagação in vitro de cultivares de Solanum sessiliflorum Dunal. Professor Orientador: Dr. Carlos Alberto Scapim. Professores Conselheiros: Dr. Adilson Ricken Schuelter, Dra Maria Celeste Gonçalves Vidigal e Dra Maria de Fátima Pires da Silva Machado.
O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma solanácea arbustiva nativa da
região Amazônia que vem despertando interesse de pesquisadores e produtores em
outras regiões do Brasil. O presente trabalho teve como objetivo avaliar alterações
apresentadas por frutos de cubiu durante o amadurecimento pós-colheita após a
aplicação do Ethephon (ácido 2-cloroetilfosfônico), bem como o efeito de diferentes
fontes de explantes e substâncias reguladoras de crescimento sobre a morfogênese
in vitro. Para o estudo das alterações pós-colheita, frutos das variedades Santa Luzia
e Thais no estádio verde-maduro foram coletados, lavados e pulverizados com 1000
mg L-1 de Ethephon e o controle com água, sendo avaliados por um período de 12
dias. Ocorreu perda de firmeza do pericarpo dos frutos com o tempo de
armazenamento pós-colheita, com diminuição do pH, aumento da ATT e perda da
matéria fresca. A aplicação de Ethephon promoveu poucas mudanças na qualidade
interna dos frutos, porém foi eficiente no desverdecimento da casca. O
comportamento da respiração e da produção de etileno aponta para um modelo de
amadurecimento não-climatérico. Para avaliar a morfogênese in vitro, utilizou-se
como explantes hipocótilos e cotilédones obtidos de plântulas, bem como embriões
zigóticos imaturos. O meio de cultura utilizado foi o MS suplementado com
diferentes combinações de ácido naftalenoacético (ANA), ácido
diclorofenoxiacético (2,4-D), Kinetina (KIN) e Thidiazuron (TDZ). Após 30 dias de
cultivo, o percentual de explantes cotiledonares e de hipocótilo com calos foi de
100% para todas as concentrações de ANA testadas (5; 10 e 20 mg L-1). Intensa
proliferação de calos também foi verificada sobre cotilédones cultivados na
presença de 2,4-D (0,5; 1; 2 e 4 mg L-1) combinado com TDZ (0,125; 0,25; 0,5; 1 e
2 mg L-1) e hipocótilos na presença de 2,4-D (5; 10 e 20 mg L-1) e sacarose (15; 30
xi
e 45 g L-1). Entretanto, não ocorreu a indução da rota embriogenética. Por outro
lado, diretamente sobre os cotilédones de embriões zigóticos imaturos cultivados
em meio de cultura MS suplementado com 5 e 10 mg L-1 de 2,4-D foram
observadas estruturas semelhantes a embriões somáticos. A análise anatômica
confirmou que as mesmas são estruturas independentes, com sistema vascular
fechado, evidenciando tratar-se de embriões somáticos. Sobre esses explantes,
formaram-se calos com células que apresentaram forte reação ao carmim acético e
que após subcultivo em meio isento de reguladores de crescimento, originaram
complexos ou massas celulares pró-embriogênicas. Apesar da baixa regeneração e
da produção assincrônica de embriões somáticos, foi possível a indução da rota
embriogenética para a espécie.
Palavras-chave: Solanum sessiliflorum, ácido 2-cloroetilfosfônico, qualidade físico-
química, cultivo in vitro, embriogênese somática, 2,4-D.
xii
ABSTRACT
STEFANELLO, Suzana, D. Sc., Universidade Estadual de Maringá, December 2008. Postharvest physiology and in vitro propagation of Solanum sessiliflorum Dunal cultivars. Adviser: Carlos Alberto Scapim. Committee Members: Dr. Adilson Ricken Schuelter, Dra Maria Celeste Gonçalves Vidigal and Dra Maria de Fátima Pires da Silva Machado.
Cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) is a solanaceous shrub native to the
Amazon region that has been attracting interest from researchers and producers of
other Brazilian regions. This study aimed to evaluate changes of cubiu during
postharvest ripening after Ethephon (2- chloroethylphosphonic acid) application, the
effect of different explant sources and growth regulators on in vitro morphogenesis.
Fruits of varieties Santa Luzia and Thais were collected at the mature-green stage,
washed, sprayed with 1000 mg L-1 Ethephon as well as the control fruits with water
and evaluated for 12 days. There was loss of pericarp firmness with post-harvest
storage time, decrease in pH, increase in ATT and fresh matter loss. Ethephon
promoted a few changes in fruit internal quality, but was efficient in ungreening
fruit peel. Respiration pattern and ethylene production indicate a non-climacteric
ripening. To evaluate the in vitro morphogenesis of S. sessiliflorum Dunal to use
hypocotyl and cotyledon explants from seedlings and immature zygotic embryos
were plated on MS medium supplemented with different combinations of
naphthaleneacetic acid (NAA), dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), Kinetin (KIN)
and Thidiazuron (TDZ). After 30 days, the percentage of cotyledon and hypocotyl
explants with callus was 100% for all the tested NAA concentrations (5; 10 and 20
mg L-1). Intense callus proliferation was also found in cotyledons cultured in 2,4-D
(0,5; 1; 2 and 4 mg L-1) combined with TDZ (0,125; 0,25; 0,5; 1 and 2 mg L-1), and
hypocotyls in 2,4-D (5; 10 and 20 mg L-1) and sucrose (15; 30 and 45 g L-1) but the
embryogenic pathway could not be induced. However, embryo-like structures were
found directly on cotyledons of immature zygotic embryos growing on MS medium
supplemented with 5 and 10 mg L-1 2,4-D. Histological studies confirmed that these
structures were independent with no vascular connections with the parent tissues.
xiii
New callus formation with cells showing strong reaction to carmine acetic were
found on these explants, which after subculture in growth regulator-free medium
originated pro-embryogenic clusters or masses. Results have shown that despite the
low regeneration and asynchronous production, induction of somatic embryogenesis
is possible for S. sessiliflorum Dunal.
Key-words: Solanum sessiliflorum, 2-chloroethyl phosphonic acid, physical-
chemical quality, in vitro culture, somatic embryogenesis, 2,4-D.
1
1. INTRODUÇÃO
O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma solanácea arbustiva nativa da
Amazônia que foi domesticada por populações indígenas. Do ponto de vista
agronômico, apresenta potencialidades para a agroindústria, dada a sua rusticidade e
alta produção de frutos (Silva Filho et al., 1996).
Como a agroindústria busca culturas que possam ser exploradas de
múltiplas formas, o cubiu constitui uma importante matéria-prima capaz de atender
a este requisito. Pelos diversos modos de utilização e alta produção, o cubiu vem
despertando interesse de pesquisadores e produtores em outras regiões do Brasil,
como da Zona da Mata pernambucana (Silva Filho et al., 1996), mineira (Pires et al.,
2006) e também de Santa Catarina, onde a planta apresentou bons resultados e
viabilidade para o plantio em áreas livres de geada (Brancher e Tagliari, 2004).
Pires et al. (2006) verificaram que a composição química de frutos cultivados na
Zona da Mata mineira foi semelhante a de frutos da região amazônica e que houve
boa aceitação pelos consumidores.
Os frutos são bastante nutritivos, apresentando elevados teores de niacina
(Villachica, 1996; Marx et al., 1998) e ferro (Silva Filho et al., 2005), podendo ser
consumidos in natura ou utilizados na fabricação de sucos, doces, geléias, sorvetes
e molhos, na indústria cosmética (Silva Filho et al., 1996) e na medicina popular
como agente hipoglicemiante e hipocolesterolêmico (Silva Filho et al., 2003; Pardo,
2004). Pardo (2004) investigou o efeito do extrato de frutos de cubiu sobre a glicose,
o colesterol e os triglicerídeos de indivíduos adultos, de ambos os sexos, com idade
entre 34 a 68 anos. Os resultados mostraram que a utilização de 40 mL/dia de
extrato durante o período de três dias levou à diminuição do colesterol, dos
triglicerídeos e da glicose no sangue.
Apesar de o cubiu ser uma espécie com inúmeras potencialidades, com
destaque para o valor nutricional e a alta produtividade, são poucos os cultivos para
a produção em larga escala e, em outros locais do país, limitando-se, na maioria das
vezes, ao cultivo de fundo de quintal no interior da Amazônia. Em parte, esta
situação se deve à pouca divulgação das potencialidades da espécie. Por outro lado,
2
é também evidente o escasso conhecimento disponível sobre práticas agrícolas
adequadas, o que restringe o desenvolvimento do cubiu como cultivo (Silva, 2007).
Ainda são escassas as informações a respeito das condições edafo-
climáticas da região sul sobre a qualidade dos frutos, seus constituintes químicos e a
fisiologia do amadurecimento em plantios comerciais, tornando a exploração
comercial bastante limitada. Poucos estudos têm sido realizados no sentido de
esclarecer o processo de amadurecimento dos frutos e não há estudos do
envolvimento do etileno exógeno na maturação.
A propagação do cubiu é normalmente feita por sementes. No entanto, por
ser uma espécie alógama (Storti, 1988; Luz et al., 2008), as plantas apresentam
elevada taxa de heterozigose, resultando em uma mistura de genótipos com
considerável variabilidade no que se refere ao tamanho e a qualidade dos frutos
(Silva Filho, 2002). Além disso, as sementes perdem a viabilidade com extrema
rapidez (Siva Filho, 1998) e a germinação das sementes é dependente das condições
de temperatura e dos substratos específicos usados para o plantio (Lopes e Pereira,
2005). Dessa forma, uma metodologia confiável deve ser estabelecida para fornecer
plantas homogêneas em quantidade suficiente para atender a demanda da produção
agroindustrial e permitir a conservação do germoplasma existente.
Com o desenvolvimento e o aperfeiçoamento dos métodos de cultivo in
vitro, a cultura de tecidos tem se firmado como uma ferramenta cada vez mais
promissora, tanto na produção de plantas com características superiores, quanto nos
programas de melhoramento. A regeneração de plantas pode ocorrer via
organogênese ou embriogênese somática (Santos, 2003).
Protocolos de regeneração in vitro via organogênese já foram testados para
essa espécie (Hendrix et al., 1987; Cordeiro e Mattos, 1991; Boufleuher et al.,
2008), mas baixo número de plantas foram regeneradas. Uma alternativa para a
produção em larga escala de plantas e estudos básicos de fisiologia é a regeneração
via embriogênese somática. Entretanto, não há relatos da obtenção de plantas por
essa via para o cubiu.
Os estudos com cultura de tecidos permitirão, em um primeiro momento,
levantar as condições básicas para a indução da rota embriogenética, elucidando as
3
melhores combinações de reguladores de crescimento e o potencial de diferentes
fontes de explantes, pois a regeneração de plantas por essa via não foi relatada.
Futuramente, com um protocolo estabelecido e reproduzível, os materiais
produzidos in vitro poderão ser utilizados para regenerar plantas transformadas
geneticamente.
Considerado a importância e as potencialidades da espécie, bem como a
carência de informações sobre a fisiologia pós-colheita e de uma metodologia
eficiente para a regeneração das plantas in vitro via embriogênese, o presente
trabalho teve por objetivos:
a) avaliar algumas alterações físico-químicas apresentadas por frutos de
duas variedades de cubiu durante o amadurecimento pós-colheita após a aplicação
de etileno (Ethephon);
b) determinar a taxa respiratória e a produção de etileno pós-colheita de
frutos de duas variedades de cubiu após a aplicação de Ethephon;
c) investigar a possibilidade de propagação da espécie, utilizando a cultura
de tecidos vegetais;
d) avaliar o efeito de diferentes fontes de explantes e substâncias
reguladoras de crescimento sobre a morfogênese in vitro, buscando estabelecer um
protocolo de regeneração de plantas via embriogênese somática;
e) realizar estudos anatômicos dos tecidos precursores da embriogênese
somática.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O cubiu
2.1.1. Origem e distribuição geográfica
O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma Solanaceae nativa da
América Tropical, com provável origem na bacia Amazônica ou nas vertentes
orientais dos Andes do Peru, Equador e Colômbia, sendo encontrado de maneira
natural em locais com 200 a 1000 m de altitude (Wahlen et al., 1981).
Atualmente, pode ser encontrada em toda a Amazônia brasileira, peruana,
equatoriana, colombiana e venezuelana, tanto em condições subespontâneas como
na forma cultivada. É conhecida popularmente como “topiro”, no Peru e Venezuela;
“cocona”, na Colômbia e Venezuela; “tomate de índio e maná”, na Amazônia; e
“orinoco apple” ou “peach-tomato”, nos países de língua inglesa (Silva Filho, 1998;
Oliveira, 1999).
2.1.2. Descrição botânica da espécie
Solanum sessiliflorum Dunal é uma planta arbustiva, de crescimento rápido,
que pode alcançar até 2 m de altura, ereta, muito ramificada, com ciclo anual,
embora possa viver até três anos em condições favoráveis (Silva Filho, 1998). De
acordo com Volpato et al. (2004), o cubiu possui 2n=24 cromossomos, o que é
comparável às demais espécies da seção Lasiocarpa e às espécies diplódes do
genero Solanum.
Suas folhas são grandes (25-45 cm de limbo), largamente ovais, com
pecíolos relativamente mais curtos do que as lâminas da folhas. O caule, as folhas e
os frutos são recobertos por uma grande quantidade de tricomas, muitos deles
estrelados (Villachica, 1996; Silva Filho, 2002).
As flores possuem 4 a 5 cm de diâmetro, situadas em inflorescências curtas
(Villachica, 1996). As inflorescências são formadas por cinco a oito flores (Figura
1a), nas quais se desenvolvem de um a três frutos situados nos ramos entre cada
5
grupo de três folhas (Silva Filho, 1998). Cada planta apresenta em média nove
inflorescências do tipo cimeira monocásica helicoidal. É considerada uma planta
andromonóica e as flores, tanto as hermafroditas como as estaminadas, não possuem
diferenças morfológicas marcantes, a não ser o estilete reduzido e o ovário
rudimentar nas flores estaminadas. A corola é formada por pétalas de coloração
branco-esverdeada, os estames são amarelos (Figura 1b). Na Amazônia, a floração
ocorre durante os meses de setembro a novembro (Storti, 1988), com início 4 ou 5
meses após a germinação (Silva Filho, 2002).
a b
c d
Figura 1 - Aspecto geral da planta de cubiu: a) inflorescência (Foto: Silva Filho, 1998); b) detalhe de uma flor; c) polinizador visitando as flores; d) frutos em diferentes estádios.
O tipo de reprodução sexuada da planta cubiu é ainda discutido entre os
pesquisadores. Pahlen (1977) caracterizou o cubiu como uma planta que se
autofecunda, pois plantas isoladas apresentaram boa produção de frutos, contudo
6
não descartou a ocorrência de polinização cruzada, em função da presença de
abelhas sociais e solitárias visitando as flores.
Estudos da biologia floral de Solanum sessiliflorum var. sessiliflorum
levaram Storti (1988) a considerar o cubiu como uma planta alógama, pois
apresenta características que favorecem a polinização cruzada como presença de
anteras poricidas e floração assincrônica de plantas individuais, forçando o
polinizador a visitar várias flores de uma mesma planta ou em plantas diferentes.
Pizzinato (2006) verificou que plantas de cubiu das variedades Santa Luzia
e Thais cobertas com organza não produziram frutos. A organza impediu a visita
das flores pelos agentes polinizadores com as flores, sugerindo que o cubiu seja
uma espécie alógama.
Estudos recentes realizados por Luz et al. (2008) levaram os autores a
concluir que o cubiu é uma planta alógama, devido à ausência de frutos com
sementes produzidos por plantas cultivadas em casa-de-vegetação e cobertas com
organza, a qual impede a ação de polinizadores. Contudo, a evidência de que os
estigmas encontram-se receptivos e os grãos de pólen germinam quando as flores
encontram-se fechadas permite sugerir a possibilidade de ocorrência de
autofecundação.
O principal atrativo das flores para os insetos visitantes é o pólen. A espécie
é polinizada por abelhas (Figura 1c) que vibram durante a visita à flor sendo a
abelha Eulaema nigrita considerada como a polinizadora mais eficiente, pelo seu
comportamento, tamanho e freqüência (Storti, 1988; Luz et al., 2008).
Em uma mesma planta se encontram flores e frutos em diferentes estádios
(Figura 1d) de maturação (Villachica, 1996). Os frutos são do tipo baga, possuem
tamanho variável, polpa ácida (Storti, 1988), podendo apresentar formato redondo,
achatado, cordiforme ou cilíndrico (Silva Filho et al., 1996). A coloração varia entre
verde, quando imaturos; amarelos, quando maduros; e marron-avermelhados, no
estádio mais avançado de maturidade (Silva Filho, 1998).
A produção de frutos inicia aos sete meses após a semeadura (Marx et al.,
1998) e pode ultrapassar 100 toneladas por hectare, dependendo do material
genético e do manejo adotado (Villachica, 1996; Silva Filho et al., 1996). Cada
7
fruto, cuja massa fresca pode variar de 20 a 450g, pode conter numerosas sementes
ovaladas e achatadas (Silva Filho, 1998). Lopes e Pereira (2005) encontraram 978
sementes em frutos de cubiu com menor massa fresca (22,66g) e 2215 sementes
naqueles com maior massa (58,84g).
2.1.3. Condições de cultivo e utilização
As condições ótimas para o cultivo de S. sessiliflorum são temperatura
média entre 18 a 30º C e umidade relativa de 85%, em regiões de clima quente e
úmido. Apesar da necessidade de luz, a espécie pode crescer na sombra, porém,
nesta condição, a produção de frutos é reduzida (Marx et al., 1998). O cubiu
normalmente é propagado por sementes. Geralmente, se realiza a semeadura em
bandejas de isopor e após trinta dias a repicagem das plântulas para recipientes mais
espaçosos, devendo o plantio definitivo ser efetuado entre 40 a 90 dias após a
semeadura. O espaçamento entre as plantas pode variar de acordo com a intensidade
do cultivo, a etnovariedade e o tipo de solo (Silva Filho, 1998). Geralmente, são
empregados espaçamentos de 1 m entre plantas e 1,5 m entre linhas (Silva Filho et
al., 2005).
A produção de frutos inicia aproximadamente sete meses após a semeadura
(Marx et al., 1998), com produção de frutos durante três meses (Silva Filho, 1998).
O rendimento por área depende da etnovariedade cultivada, da fertilidade do solo,
da densidade de plantio e do tipo de manejo (Silva Filho, 1998).
De acordo com Villachica (1996), a espécie possui uma alta diversidade
genética, manifesta na forma, tamanho, cor, pubescência, sabor e aroma dos frutos.
Há plantas que produzem frutos de formato redondo e tamanho pequeno (25 a 40 g),
de forma redonda a alargada e tamanho médio (40 a 100g) e, ainda, outras com
frutos de forma alargada a achatada e tamanho grande (140 a 250 g ou mais). Os
frutos de tamanho grande são preferidos para a fabricação de doces, enquanto os
frutos pequenos são utilizados na produção de sucos.
Os frutos de cubiu são bastante nutritivos, possuindo aroma e sabor
agradáveis. Os teores de fibras, proteínas, sais minerais e vitaminas de sua polpa
permitem as populações tradicionais da Amazônia utilizar o fruto como alimento,
8
medicamento e cosmético (Silva Filho, 1998; Marx et al., 1998; Silva Filho et al.,
2005; Yuyama et al., 2007).
A polpa da placenta é ligeiramente mais ácida e mais saborosa que a polpa
aderida à casca. Devido à baixa relação sólidos/solúveis/acidez (3,5 a 6) o cubiu
apresenta reduzido grau de doçura, por isso o fruto é raramente consumido in
natura, exceto como complemento de bebidas alcoólicas (Silva Filho, 1998).
Como medicamento, o cubiu é utilizado no tratamento da anemia (devido
ao elevador teor de ferro), diabetes, ácido úrico e altos níveis de colesterol (devido
aos elevados teores de niacina) no sangue (Silva Filho et al., 1996; Silva Filho et al.,
2003; Pires et al., 2006). As folhas maceradas são utilizadas pelos índios para evitar
a formação de bolhas na pele no caso de queimaduras (Silva Filho, 2002). Os índios
utilizam o suco puro de cubiu para dar brilho aos cabelos (Silva Filho, 2002) e no
controle de piolhos (Silva Filho et al., 2003).
2.2. Fisiologia do amadurecimento e pós-colheita de frutos
2.2.1. Desenvolvimento de frutos
O fruto é resultante do desenvolvimento do ovário das flores ou
inflorescências das angiospermas, em conseqüência da fecundação do(s) óvulo(s)
nele contido(s). O fruto é a estrutura que representa o último estádio de
desenvolvimento do gineceu fecundado ou partenocárpico, o qual é constituído pelo
pericarpo e pela(s) sementes(s) (Barroso et al., 1999).
O desenvolvimento de um fruto, em função dos processos fisiológicos,
pode ser dividido nas fases de crescimento, maturação, amadurecimento e
senescência. Porém, como muitos processos são comuns entre as fases, há
dificuldades de distinção entre as mesmas (Watada et al., 1984).
O crescimento pode ser definido como a fase de desenvolvimento na qual
ocorre o incremento irreversível nos atributos físicos, com intensa divisão e
alongamento celulares. A maturação é a fase do desenvolvimento onde não há mais
aumento no tamanho e o fruto continua sua ontogenia, mesmo que destacado da
planta-mãe (Watada et al., 1984).
9
O amadurecimento corresponde à fase final da maturação e envolve
diversos processos fisiológicos e bioquímicos que resultam em modificações da
estrutura e da composição química dos frutos (Wills et al., 1998) como redução da
firmeza, degradação e síntese de pigmentos, conversão do amido em açúcares,
alteração na composição e estrutura da parede celular, na atividade enzimática,
diminuição do conteúdo de ácidos orgânicos, dentre outras (Chitarra e Chitarra,
2005). As reações químicas e bioquímicas responsáveis por essas transformações
podem variar entre espécies, cultivares e entre frutos de uma mesma cultivar,
dependendo das condições de produção ou armazenamento (Chitarra e Chitarra,
2005).
Durante o amadurecimento, a composição e as propriedades texturais dos
frutos sofrem alterações. Isto faz com que seja necessário o correto conhecimento
das características de cada fruto, definidas por meio de testes físico-químicos, que
indicam as melhores tecnologias de conservação a serem aplicadas em pós-colheita
(Carmo, 2004). O amadurecimento é uma fase importante do desenvolvimento dos
frutos, pois os tornam palatáveis, comercialmente atrativos e capazes de satisfazer
os pré-requisitos dos consumidores. O período subseqüente é a senescência, durante
a qual há predomínio de processos degradativos (Chitarra e Chitarra, 2005).
Após a colheita, a continuidade dos processos metabólicos é dependente
das reservas acumuladas pelo fruto durante o desenvolvimento. O amadurecimento
é, geralmente, acompanhado pela mobilização de carboidratos e proteínas, sendo
que a intensidade destes processos pode ser regulada pelas condições ambientais
que o fruto é exposto, tais como temperatura e composição gasosa da atmosfera
(Purvis, 1997).
2.2.2. Ação do etileno durante o amadurecimento de frutos
O amadurecimento é regulado por reguladores de crescimento. Essas
substâncias são sintetizadas endogenamente, agem em baixas concentrações e
promovem respostas tanto no local de síntese quanto em locais distantes deste (Taiz
e Zeiger, 2004).
10
Numerosas funções e diversas rotas biossintéticas vegetais são controladas
por cinco grupos de reguladores de crescimento: auxinas, citocininas, giberelinas,
ácido abscísico e etileno (Wills et al., 1998; Taiz e Zeiger, 2004).
O etileno (C2H4) é um hormônio encontrado na natureza na forma gasosa.
Ele controla muitos processos fisiológicos, incluindo o amadurecimento de frutos, a
abscisão, a senescência e as respostas a injúrias e estresses (Saltveit, 1999; Burg,
2004). O etileno pode promover diferentes respostas em função do estádio de
desenvolvimento, das condições ambientais e da espécie ou mesmo da variedade
(Lelièvre et al., 1997).
Os estudos com etileno tiveram grandes avanços em 1979 quando Adams e
Yang descobriram o ACC (ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico) como sendo o
precursor imediato do etileno, possibilitando a descrição da via biossintética (Taiz e
Zeiger, 2004; Bradford, 2008).
A via de biossíntese do etileno compreende a conversão do aminoácido
metionina a S-adenosilmetionina (SAM), que é precursora do ácido 1-
aminociclopropano-1-carboxílico (A CC) e este o precursor imediato do etileno. A
enzima ACC sintetase converte a SAM em ACC e a ACC oxidase transforma o
ACC em etileno (Taiz e Zeiger, 2004; Tian e Lu, 2006; Bradford, 2008) (Figura 2).
Tanto a síntese quanto a atividade destas enzimas são influenciadas por
fatores genéticos e condições ambientais como temperatura e concentrações de O2 e
CO2. As respostas dos tecidos à exposição ao etileno dependem da sensibilidade do
tecido, da concentração de etileno, da composição da atmosfera, da duração da
exposição e da temperatura (Wills et al., 1998).
De acordo com Lelièvre et al. (1997), considerável progresso tem ocorrido
na caracterização dos genes das enzimas biossintéticas chaves do etileno, a ACC
sintase e ACC oxidase, bem como no isolamento de genes envolvidos na via de
transformação do sinal do etileno, particularmente aqueles que codificam os
receptores de etileno (ETR - receptores associados ao retículo endoplasmático).
A transdução de sinais para o etileno tem sido revelada em estudos com
Arabidopsis thaliana, fornecendo importantes informações de como a informação é
recebida e processada nas células vegetais (Bleecker, 1999; Nath et al., 2006; Tian e
11
Lu, 2006). A utilidade do etileno como um sinal depende da habilidade das células-
alvo para receber o estímulo e para traduzir essa informação em respostas físicas
apropriadas para cada tipo de célula (Bleecker, 1999).
Figura 2 – Rota biossintética do etileno e ciclo de Yang (Taiz e Zeiger, 2004).
A ação do etileno é dependente da sua ligação a receptores (Chow e
McCourt, 2006). O etileno liga-se ao receptor, localizado na membrana celular,
formando um complexo ativado que desencadeia um processo de reação em cascata.
Estas reações levam à modificação da expressão gênica, com conseqüentes
respostas fisiológicas e bioquímicas (Lelièvre et al., 1997; Tian e Lu, 2006).
O etileno intervém, em nível molecular, na indução da expressão de
numerosos genes, incluindo aqueles que codificam as enzimas celulases, 1,3-
glucanases, peroxidases e proteínas ligadas à defesa contra patógenos. A expressão
dos genes, durante o amadurecimento, parece ser regulada por meio de dois
caminhos: um etileno-dependente e outro etileno-independente. Genes envolvidos
com a biossíntese de pigmentos, como licopeno, aroma e metabolismo respiratório,
são considerados dependentes da biossíntese de etileno. Entretanto, em algumas
12
espécies, genes que codificam clorofilases e ACC oxidase parecem ser
independentes de etileno (Taiz e Zeiger, 2004).
Os frutos que amadurecem em resposta ao etileno exibem antes da fase de
amadurecimento aumento característico da respiração chamado de climatério (Wills
et al., 1998). Estes frutos também apresentam pico na produção do etileno,
imediatamente antes do aumento da respiração. Por outro lado, os frutos não-
climatéricos não exibem aumento na síntese de etileno e na respiração (Taiz e
Zeiger, 2004).
A síntese de etileno em frutos climatéricos é autocatalítica, isto é, o etileno
atua na regulação das enzimas envolvidas na sua biossíntese e pequenas
concentrações (0,1 a 1 µL L-1), geralmente, são suficientes para desencadear a
resposta fisiológica (Lelièvre et al., 1997).
A classificação dos frutos em climatéricos e não-climatéricos pode ser feita
também se baseando na resposta ao tratamento com etileno (Wills et al., 1998). A
aplicação de etileno em frutos climatéricos induz os mesmos a produzir etileno
adicional. Quando frutos climatéricos e não-maduros são tratados com etileno, o
início do climatério é acelerado. No entanto, quando frutos não-climatéricos, como
frutos cítricos e uvas, são tratados da mesma forma, a magnitude do aumento
respiratório acontece em função da concentração do etileno, porém, o tratamento
não desencadeia a produção endógena do etileno nem acelera o amadurecimento
(Taiz e Zeiger, 2004), sendo este processo considerado como independente do
etileno (Lelièvre et al., 1997).
Segundo Lelièvre et al. (1997), aumentos na taxa respiratória e na síntese
de etileno têm sido observados em alguns frutos não-climatéricos tratados com
etileno, porém, ao suprimir-se o etileno, tanto a síntese de etileno quanto a taxa
respiratória voltaram aos padrões basais.
O comportamento da taxa respiratória dos frutos auxilia na determinação
do climatério, além de possibilitar o conhecimento da composição dos gases dentro
de embalagens durante o armazenamento (Song et al., 2002), permitindo a tomada
de decisões e buscando prolongar sua vida pós-colheita.
13
Várias substâncias são capazes de liberar etileno nos tecidos vegetais e
destas a mais utilizada e efetiva é o ácido 2-cloroetil-fosfônico, conhecido
comercialmente como Ethrel, Ethephon ou CEPA. As respostas dos tecidos
dependerão da espécie ou cultivar, da dosagem do produto e das condições de
tratamento (aspersão ou imersão), da temperatura de armazenamento, da utilização
de embalagens ou da atmosfera modificada, dentre outras (Yah et al., 1998;
Cerqueira-Pereira et al., 2007).
O etileno tem sido usado com sucesso para antecipar e uniformizar o
amadurecimento pós-colheita de frutos. Em frutos climatéricos, como em
Mangifera indica cv Kent (Yah et al., 1998), o Ethephon geralmente provoca
mudanças externas, acelerando o amarelecimento da casca bem como mudanças na
qualidade interna. Por outro lado, frutos não-climatéricos, como Fortunella
margarita Swingle (Mota et al., 1997), Citrus sinensis cv ‘Baianinha’ e ‘Hamlin’
(Domingues et al., 2001) e cv Pêra (Nascimento et al., 2006), limões ‘siciliano’
(Jacomino et al., 2003), Ananas comosus cv. Pérola (Santana et al., 2004), quando
submetidos a tratamentos com Ethephon, mostram, na maioria dos casos, apenas
desverdecimento ou mudança da cor da casca, resultando na degradação da clorofila
e, em menor grau, na síntese e/ou aparecimento de carotenóides.
Algumas unidades de beneficiamento de frutas cítricas aplicam etileno no
interior de câmaras frias, utilizam-se do processo de desverdecimento para atingir a
coloração ideal de comercialização, inclusive com o benefício de antecipar o
período de distribuição nos mercados, sendo um processo pouco oneroso para o
distribuidor (Nascimento et al., 2006).
Segundo Hernández et al. (2004), o comportamento da curva da
intensidade respiratória dos frutos de cubiu coletados e armazenados a 15 ºC seguiu
o padrão típico de frutos não-climatéricos. Entretanto, observou-se leves
incrementos do 9º o 16º dia, os quais foram atribuídos ao início do processo de
degradação dos frutos. A intensidade respiratória aumentou notavelmente a partir do
19º dia como conseqüência da alta atividade metabólica desencadeada pelos
14
processos de senescência e degradação. Porém, não há relatos sobre a síntese de
etileno nem sobre o efeito da aplicação de etileno sobre o amadurecimento em cubiu.
2.2.3. Demais modificações durante o amadurecimento dos frutos
O amadurecimento de frutos corresponde a uma série de transformações
bioquímicas, fisiológicas e estruturais que o tornam apto para ser consumido
(Lelièvre et al., 1997). Tais mudanças incluem a mudança de coloração, o
amaciamento do fruto devido à quebra enzimática da parede celular, a hidrólise do
amido, o acúmulo de açúcares, o desaparecimento de ácidos orgânicos e compostos
fenólicos, dentre outros (Taiz e Zeiger, 2004).
2.2.3.1. Coloração
Durante o amadurecimento, a maioria dos frutos apresenta mudança de
coloração. A mudança de coloração é um dos primeiros sinais perceptíveis do início
da maturação (Wills et al., 1998). A cor da casca dos frutos é um dos principais
atributos que o consumidor utiliza para avaliar a qualidade dos frutos, preferindo-se
os mais coloridos que são, geralmente, associados a elevados teores de açúcares e
reduzida acidez (Fioravanço et al., 2007).
Em frutos climatéricos, uma das modificações observadas durante o
processo de amadurecimento, em resposta ao aumento na produção de etileno, é a
mudança na coloração da casca (Wills et al., 1998). Em frutos não-climatéricos,
sugere-se que alguns aspectos do amadurecimento como a diferenciação da cor da
casca dos frutos pode requerer etileno (Chervin et al., 2004). A mudança da cor
ocorre geralmente devido a degradação de pigmentos clorofílicos, pelo aumento da
atividade das clorofilases e pela síntese de outros pigmentos (Wills et al., 1998).
A aplicação de etileno intensifica a cor da epiderme de grande parte dos
frutos. Em frutos cítricos e não-climatéricos como kunquat (Fortunella margarita
Swingle) (Mota et al., 1997) é comum observar o desverdecimento da casca após
tratamento com Ethephon, o qual promove a degradação da clorofila, sem alteração
nas características organolépticas físico-químicas. Em certos frutos, entre os quais a
15
ameixa cv. Reubennel (Fioravanço et al., 2007) e o limão ‘siciliano’ (Jacomino et
al., 2003), essa mudança é importante, pois mostra a possibilidade de antecipar a
colheita e a comercialização e, conseqüentemente, a obtenção de melhores preços
no início da safra (cultivares precoces).
A mudança de coloração pode ser avaliada por meio de métodos sensoriais
ou subjetivos, os quais se baseiam na intensidade e nas variações da cor perceptíveis
ao olho humano, estabelecendo-se uma escala de coloração da casca ou da polpa. A
determinação também pode ser feita de maneira objetiva, ou seja, através de
equipamentos capazes de quantificar a luz refletida do produto, sendo este método o
mais confiável (Chitarra e Chitarra, 2005). As leituras dos valores podem ser
sistematizadas, adotando-se uma relação matemática entre os componentes da cor
(L, C, Hº), utilizando um colorímetro (Francis, 1980; Shewfelt et al., 1988;
McGuire, 1992). Este aparelho mede a luz refletida usando as coordenadas
cartesianas L, a e b, das quais se obtém unidades ou pontos de uniformidade visual
aproximada de um sólido de cor.
A coloração em frutos de cubiu varia entre verde, quando imaturo; amarelo,
quando maduro; e marrom-avermelhado no estádio mais avançado de maturidade
(Silva Filho, 1998). Segundo Silva Filho (2002), frutos com coloração amarela
estão no ponto ideal de maturação para consumo in natura e em outros
aproveitamentos na agroindústria. A perda da cor verde é conseqüência da
degradação da clorofila, a qual mascara pigmentos como carotenos e xantofilas
(Hernández et al., 2004).
2.2.3.2. Firmeza
A diminuição da firmeza durante o amadurecimento, ou seja, o
amaciamento do fruto após a mudança de cor é a transformação mais evidente que
ocorre durante a maturação e o amadurecimento. Além da importância do ponto de
vista econômico, pois afeta a qualidade do fruto, a firmeza tem efeito na resistência
ao transporte, na conservação e no ataque a microrganismos (Awad, 1993).
A perda de firmeza da polpa com a maturação, muitas vezes, ocorre devido
à perda de água dos tecidos e, conseqüente, diminuição da pressão de turgescência
16
das células, quando os frutos são mantidos em ambiente com baixa umidade relativa
do ar, aliados à ação enzimática na lamela média e parede celular, muitas vezes
estimuladas pelo etileno (Awad, 1993).
O declínio da firmeza geralmente coincide com a dissolução da lamela
média, resultando na redução da adesão intercelular, despolimerização e
solubilização da hemicelulose e polissacarídeos pécticos da parede celular
(Brummell e Harpster, 2001; Saladié et al., 2007). Esses eventos são acompanhados
pelo aumento da expressão de numerosas enzimas degradantes da parede celular
como hidrolases, transglicosilases e liases (Harker et al., 1997; Brummell, 2006).
Vários autores relatam que a perda de firmeza pelos frutos está relacionada com o
aumento na atividade das enzimas poligalacturonases, celulases e β-galactosidases
(Serrano et al., 2001).
As substâncias pécticas são so principais componentes químicos dos
tecidos responsáveis pelas mudanças de textura dos frutos. As pectinas são
constituídas por uma cadeia linear de ácidos poligalacturônicos, unidos por ligações
α 1-4 de ácido galacturônico. Quando os grupos carboxílicos ácidos encontram-se
ligados ao cálcio, formam o pectato de cálcio, o qual é insolúvel e chamado
protopectina, sendo comum em frutos imaturos. Ocorrendo o amadurecimento,
ocorre a liberação do cálcio, a solubilização da protopectina das paredes celulares
por ação enzimática, procovando a modificação da textura (Chitarra e Chitarra,
2005).
2.2.3.3. Acidez total titulável (ATT)
A acidez em frutos é atribuída, basicamente, aos ácidos orgânicos que estão
dissolvidos nos vacúolos das células, tanto na forma livre quanto combinada com
sais. O teor de ácidos orgânicos, com algumas exceções, diminui com a maturação
dos frutos, em decorrência da sua utilização como substrato no processo respiratório
ou de sua conversão em açúcares (Chitarra e Chitarra, 2005).
O ácido orgânico predominante nos frutos de cubiu é o ácido cítrico (Silva
Filho, 1998). A acidez elevada dos frutos de cubiu contribui para o sabor do fruto e
17
permite um fator de diluição elevado na formulação de sucos e, conseqüentemente,
maior rendimento industrial para esta finalidade (Silva Filho, 2002).
Durante o amadurecimento da maior parte dos frutos, há diminuição da
acidez e conseqüentemente aumento do pH (Chitarra e Chitarra, 2005). Segundo
Hernández et al. (2004), devido ao padrão respiratório não-climatérico, frutos de
cubiu armazenados a 15 ºC durante 24 dias apresentaram variação mínima na ATT,
com pequeno aumento até o 10º dia e posterior diminuição, com conseqüente
elevação do pH.
2.2.3.4. Sólidos solúveis totais (SST) e relação SST/ATT
Os sólidos solúveis indicam a quantidade de sólidos que se encontram
dissolvidos na polpa ou suco dos frutos. São constituídos principalmente por
açúcares e ácidos, sendo variáveis de acordo com a espécie, a cultivar, o estádio de
maturação e o clima (Chitarra e Chiatarra, 2005).
O teor de sólidos solúveis é característica de interesse para frutos
comercializados in natura, pois o mercado consumidor prefere frutos doces
(Chitarra e Chitarra, 2005).
Segundo Silva Filho (2002), o teor de STT em frutos de cubiu varia de 5 a
8 ºBrix. Porém, as condições ambientais onde as plantas são cultivadas podem
interferir neste valor, bem como se o amadurecimento ocorre na planta ou fora dela
(Silva Filho et al., 1996). Frutos de cubiu da variedade Santa Luzia cultivados no
estado do Espírito Santo atingiram o amadurecimento na planta e sua máxima
qualidade de consumo aos 90 dias após a antese, quando apresentavam casca com
coloração laranja intensa brilhante e 3,9 ºBrix (Souza et al., 2008).
Segundo Hernández et al. (2004), a cor, a firmeza e o teor de sólidos
solúveis totais constituem índices de colheita apropriados para o cubiu, ao contrário
das dimensões físicas como peso fresco e diâmetro as quais podem ser afetadas
pelas condições externas.
Jacomino et al. (2003) não verificaram efeito de tratamentos com Ethephon
sobre o teor de sólidos solúveis totais, acidez total titulável, perda de matéria fresca
18
e percentagem de suco de frutos não-climatéricos de limões ‘siciliano’ armazenados
a 10 ºC.
A relação SST/ATT é utilizada para avaliar o sabor, sendo mais
representativa que a medida isolada de cada caráter. A relação SST/ATT é baixa em
frutos de cubiu, o que confirma o seu reduzido grau de doçura (Silva Filho, 2002).
2.3. Propagação de plantas in vitro
2.3.1. Aspectos gerais da cultura de tecidos vegetais
A cultura de tecidos vegetais, por definição, é o conjunto de técnicas
biotecnológicas que emprega o princípio da totipotencialidade, isto é, a capacidade
de gerar uma planta pluricelular completa a partir de uma célula diferenciada
(Santos, 2003). A regeneração de plantas por meio da cultura de tecidos baseia-se
no princípio da totipotência, proposto pelo fisiologista Haberlandt, que, em 1902,
enunciou que cada célula vegetal possuía o potencial genético para regenerar uma
planta inteira (Santos, 2003).
A produção comercial de plantas in vitro é uma prática bastante utilizada
em diversos países do mundo, inclusive o Brasil. Esta técnica apresenta importância
prática e potencial na agroindústria de espécies frutíferas, ornamentais, florestais e
olerícolas. Por meio desse método é possível produzir plantas uniformes, sadias e
em curto espaço de tempo e sob condições controladas de temperatura (Lee et al.,
1995; Kerbauy, 1997). Nesse contexto, a cultura de tecidos tem sido empregada
para diferentes fins, dentre eles em auxílio a programas de melhoramento genético,
na propagação de plantas cultivadas livres de vírus, bem como na produção em
larga escala de plantas para fins comerciais (Torres et al., 1998).
De maneira geral, o cultivo in vitro de plantas é influenciado pelo meio
nutritivo, tipos e condições fisiológicas dos explantes, genótipos, condições de
cultivo, tipo e concentração de reguladores (George, 1993).
A seleção e o desenvolvimento de um meio de cultura é fundamental para
qualquer trabalho com cultura de tecidos de plantas. Dentre os componentes
essenciais de meio de cultivo estão água, sais inorgânicos, vitaminas, fontes de
19
carbono e os reguladores de crescimento (Cohen, 1995). O meio de cultura mais
utilizado para a indução da morfogênese in vitro tem sido o meio de MS (Murashige
e Skoog, 1962). A escolha do explante é de fundamental importância para a indução
de morfogênese, devido às diferentes respostas dos tecidos frente às combinações
hormonais e condições de cultivo in vitro. Geralmente, durante o desenvolvimento
de protocolos de regeneração e/ou estabelecimento de culturas in vitro, vários
ensaios são conduzidos inicialmente no sentido de determinar a melhor fonte de
explantes e combinações hormonais (Venkataiah et al., 2003).
Para o sucesso da propagação in vitro, é necessária a seleção de explantes
adequados, estabelecendo-se condições de desinfestação e cultura, o
estabelecimento das condições físicas e fisiológicas de desenvolvimento dos
explantes (Grattapaglia e Machado, 1998).
A morfogênese e o crescimento são regulados pela interação e balanço
entre os hormônios vegetais ou substâncias reguladoras de crescimento, adicionados
ao meio de cultura e pelos níveis endógenos produzidos nas células cultivadas in
vitro. A concentração ideal dos reguladores depende dos padrões de absorção,
translocação e metabolismo na planta. Desta forma, as concentrações efetivas de
cada regulador podem variar e precisam ser ajustadas de acordo com o tipo de
tecido ou órgão, do método de cultivo e do estádio da cultura (George, 1993).
Os hormônios vegetais são reguladores químicos de ocorrência natural que
produzem respostas metabólicas e fisiológicas, sendo efetivos em pequenas
quantidades e que, provavelmente, são os mais importantes mediadores na
transdução de sinais. O mesmo hormônio pode ocasionar respostas diferentes em
tecidos diferentes ou em diferentes fases de desenvolvimento de um mesmo tecido
(Taiz e Zeiger, 2004). Eles exercem ação por meio do reconhecimento de receptores
específicos em células responsivas, traduzindo sinais hormonais em eventos
bioquímicos e fisiológicos (Guerra et al., 1999). Para o cultivo in vitro, os
hormônios vegetais mais importantes são as auxinas e as citocininas, seguidos pelo
ácido giberélico e ácido abscísico (George, 1993).
20
2.3.2. Morfogênese
O processo de desenvolvimento de uma planta refere-se ao crescimento
integrado das várias partes do corpo vegetal, envolvendo basicamente os processos
de divisão, expansão e diferenciação celular que culminam na formação de tecidos e
órgãos. Segundo Kerbauy (1999) e Peres (2002), a formação de novos órgãos in
vitro (morfogênese) resulta da interação dos processos de competência celular,
indução, determinação e diferenciação celular, os quais são influenciados e
determinados principalmente pela presença dos hormônios vegetais e agem como
sinais químicos para regular os processos de crescimento e morfogênese (Coenen e
Lomax, 1997).
As respostas morfogenéticas podem ocorrer via duas rotas de regeneração:
organogênese (regeneração de brotos e raízes) e embriogênese (regeneração de
plantas a partir de embriões somáticos) (Grattapaglia e Machado, 1998). Neste
contexto, várias espécies silvestres e cultivadas apresentam protocolo regenerativo,
sendo em sua maioria por organogênese, incluindo as espécies da família
Solanaceae como tomate (Fári et al., 2000), berinjela (Picoli et al., 2002) e o próprio
cubiu (Hendrix et al., 1987; Cordeiro e Mattos, 1991; Grunvald, 2004; Boufleuher
et al., 2008).
A organogênese refere-se à formação de estruturas monopolares como
raízes, folhas, brotos a partir de explantes ou de calos cultivados in vitro (Andrade,
2002; Carvalho e Vidal, 2003). A organogênese normalmente envolve a
regeneração de gemas a partir de grupos de células meristemáticas.
Se o explante já possuir células meristemáticas ou embriogênicas, ocorrerá
organogênese direta e embriogênese direta, respectivamente. Quando há
necessidade de desdiferenciação do explante, com a formação de calo prévio ao
estabelecimento das células competentes, ocorrerá organogênese ou embriogênese
indireta (Peres, 2002).
Ao longo do desenvolvimento embrionário iniciado a partir da fertilização, as
células vegetais seguem caminhos e diversificam suas características estruturais e
funcionais, a fim de que tecidos e órgãos sejam formados. Esse processo, chamado
21
diferenciação celular, envolve mudanças altamente coordenadas que estão sob o
controle de mecanismos genéticos e ambientais (Santos, 2003).
No decorrer da via ontogenética, as células vão se tornando especializadas,
ou seja, há a canalização do desenvolvimento que leva à incapacidade progressiva
de alterar a programação genética conhecida como determinação celular (Kerbauy,
1999).
O conceito de determinação está diretamente relacionado com o de
competência celular, que é a capacidade da célula responder a sinais químicos ou
físicos específicos e direcionar o seu destino. Quanto mais determinada é uma
célula, menor é sua competência de responder a sinais externos e mais forte deverá
ser o mensageiro químico para que a célula tenha o seu destino alterado. Para que
ocorra a regeneração de plantas é necessário que o corra a desdiferenciação das
células (Santos, 2003). A desdiferenciação, que é mediada por substâncias
reguladoras de crescimento, leva as células a um estado novamente indiferenciado e,
portanto, capazes de mudar para diferentes vias ontogenéticas, ocorrendo uma
desprogramação fisiológica com reprogramação gênica (Sultan, 2000).
2.3.2.1. Embriogênese somática
A embriogênese somática é o processo por meio do qual células isoladas ou
um pequeno grupo de células somáticas dão origem a estruturas embrionárias
bipolares, sem conexão vascular com o tecido materno (Vicient e Martinez, 1998),
num processo morfogenético que se aproxima da seqüência de eventos
representativos da embriogênese zigótica (Tautorus et al., 1991; Zimmerman, 1993),
apresentando estádios de desenvolvimento embrionário similares (Vicient e
Martínez , 1998).
A embriogênese somática apresenta as seguintes vantagens e aplicações
sobre a organogênese: possibilita a obtenção de uma grande quantidade de
propágulos (embriões somáticos); permite um alto grau de automação do sistema,
com a possibilidade de baixar o custo efetivo da produção de plântulas em larga
escala; permite a produção dos propágulos de forma sincronizada (otimizando o
sistema); possibilita o armazenamento dos propágulos por um longo período por
22
meio da criopreservação; auxilia na produção de sementes sintéticas; utilização de
culturas para o isolamento e fusão de protoplastos e, ainda, utilização das culturas
para a transformação genética (Guerra et al., 1999).
Para a regeneração de plantas via embriogênese somática são empregados
pelo menos dois diferentes meios de cultura: o primeiro é otimizado visando à
indução da embriogênese somática, enquanto o segundo meio de cultura objetiva
permitir o desenvolvimento dos embriões somáticos. As condições que favorecem a
primeira fase geralmente inibem a segunda. Os meios de cultura contendo altas
concentrações de sais, como o MS, por exemplo, são os mais indicados para a
formação de embriões somáticos (Guerra et al., 1999; von Arnold et al., 2002).
A embriogênese somática pode ser dividida em quatro etapas: 1) a indução
em meios de cultura com auxinas (mais freqüentes) e citocininas (menos freqüentes);
2) a multiplicação em meios contendo baixas concentrações de auxina; 3) a
maturação na presença de ABA e/ou agentes osmóticos e; 4) a germinação em
meios de cultura geralmente isentos de reguladores (Guerra et al., 1999; von Arnold
et al., 2002).
De acordo com Guerra et al. (1999), culturas induzidas com uma
substância com forte atividade auxínica podem provocar a formação de complexos
ou massas celulares pró-embriogênicas, as quais por processos de embriogênese
repetitiva, representados por fenômenos de clivagem ou gemação, resultam em
ciclos repetitivos de divisões celulares que geram, nas angiospermas, embriões
somáticos globulares (Figura 3, Ciclo A). Estádios iniciais de embriogênese
somática são reconhecíveis por células que apresentam conteúdo citoplasmático
denso e ausência geral de vacuolização (Emons, 1994). A remoção ou diminuição
drástica dos níveis de auxina exógena induz ao desenvolvimento contínuo dos
embriões pré-globulares e progressão para os demais estádios de embriogênese
(Guerra et al., 1999; von Arnold et al., 2002).
Após a indução, a estratégia é interromper os ciclos repetitivos de divisão
celular e fornecer estímulos fisiológicos, bioquímicos e ambientais para promover a
diferenciação celular, desenvolvimento e conversão dos embriões somáticos. Estes
pró-embriões são estimulados a seguir o desenvolvimento normal pela retirada das
23
auxinas do meio de cultura, pela adição de ABA, citocininas e agentes que
provoquem estresse osmótico e o fornecimento de estímulos ambientais. O ciclo de
maturação gera embriões somáticos que podem ser convertidos à plântulas ou então
serem encapsulados para a obtenção de sementes sintéticas (Figura 3, Ciclo B)
(Guerra et al., 1999).
2,4-D
Embriogênese Repetitiva
Ciclo A
Maturação Ciclo B
Indução
Clivagem/ Gemação
Explante
Inibição à gemação
Maturação de Embriões
Semente sintética
Regeneração de Plântulas
Estabelecimento ex vitro
Conversão
Planta matriz
Reguladores +
Escuro
Cultura Embriogênica
Suspensão celular
-Pré-maturação - ABA
-Fontes de C -Agentes osmóticos
Pré-germinação
Figura 3 - Ciclos da embriogênese somática e a seqüência de eventos celulares da desdifenciação e diferenciação (Adaptado de Guerra et al., 1999).
Citocinina
Fonte de Carbono
24
As auxinas são consideradas essenciais na indução do processo (Fehér et
al., 2002). Em condições in vitro, a embriogênese somática ocorre em explantes
cujas células são determinadas ou pré-embriogênicas, ou o processo se inicia com a
diferenciação de células, que se tornam competentes, e são determinadas para a
embriogênese (Fehér et al., 2003). As células que necessitam de um estímulo para
tornarem-se embriogênicas são denominadas “competentes para a embriogênese”
(Guerra et al., 1999).
A expressão da embriogênese somática segue dois padrões. O primeiro
corresponde à embriogênese somática direta na qual os embriões originam-se
diretamente do tecido do explante. Neste caso, o explante possui células pré-
embriogênicas determinadas, ou seja, células com alta competência para formar
embriões somáticos. Este padrão é comum em explantes provenientes de órgãos
reprodutivos como embriões zigóticos imaturos, inflorescências, cotilédones, dentre
outros. Nos tecidos reprodutivos, os genes responsáveis pelo desenvolvimento
embrionário estão mais ativos que nos demais tecidos da planta (Guerra et al., 1999;
Jiménez, 2005).
O segundo padrão corresponde à embriogênese somática indireta, condição
em que as células do explante não possuem competência para formar embriões.
Desta forma, vários ciclos celulares antecedem a indução das células embriogênicas.
Neste caso, as células do explante são chamadas de “células induzidas à
determinação embriogenética”, uma vez que a cultura adquire potencial
embriogênico devido às condições in vitro. Os vários ciclos celulares são, em geral,
induzidos por altas concentrações de auxinas, que resultam na formação de um calo.
De acordo com Guerra et al. (1999), a embriogênese indireta é característica de
explantes provenientes de tecidos mais diferenciados, os quais precisam sofrer
desdiferenciação antes de adquirirem competência para a rota embriogenética.
Uma vez formadas, as células pré-embriogênicas determinadas e as células
induzidas à determinação embriogenética são funcionalmente equivalentes e passam
a ser descritas como células embriogênicas (Parrot et al., 1991).
As células embriogênicas apresentam características que as distinguem das
demais células vegetais não embriogênicas. Morfologicamente, as células
25
embriogênicas caracterizam-se pelo pequeno tamanho (20-30 µm), formato
isodiamétrico, citoplasma denso (Emons, 1994; Fehér et al., 2003; Stefanello et al.,
2005), parede celular delgada, núcleo grande e nucléolos visíveis (Guerra et al.,
1999; Ribas, 1999).
A presença de proteínas de reserva, grãos de amido e lipídios são outras
características das células com competência embriogenética (Merkle et al., 1995;
Ribas, 1999; Cangahuala-Inocente, 2002; Stefanello et al., 2005). Estas
macromoléculas fornecem energia para a intensa atividade mitótica e metabólica
observada durante o desenvolvimento dos embriões somáticos. Ao contrário, as
células não embriogênicas são maiores, apresentam formas variadas, espaços
intercelulares e menor quantidade de substâncias de reserva (Emons, 1994; Ribas,
1999). Além das características morfológicas, as células embriogênicas reagem
fortemente ao corante carmim acético, indicando a presença de glicoproteínas
associadas à rota embriogenética (Gupta e Durzan, 1987; Flores, 2006).
De acordo com Jiménez (2001), a embriogênese somática apresenta como
principal vantagem a multiplicação em larga escala de embriões, através de ciclos
repetitivos de divisão celular. Esta característica tem sido explorada para diversas
finalidades produção de hídridos somáticos, transformação genética, produção de
metabólitos in vitro, constituindo, também, uma estratégia para estudos básicos
relacionados com a fisiologia do desenvolvimento do embrião.
As metodologias para induzir embriogênese somática têm sido descritas
para muitas espécies de interesse econômico, em que os protocolos utilizados
envolvem mudanças no meio de cultura, estabelecimento de diferentes tipos e
concentrações de reguladores de conhecimento e outras condições de cultura (Titon
et al., 2007).
Em espécies da família Solanaceae há alguns relatos sobre a obtenção de
plantas por meio da embriogênese somática. Picoli et al. (2000) produziram alta
taxa de embriões somáticos (100%) a partir de cotilédones de berinjela (Solanum
melongera) cultivados em meio de cultura MS suplementado com diferentes
concentrações (2,5; 5,0; 7,5 e 10 mg L-1) de ácido naftalenoacético (ANA).
26
Jayasrre et al. (2001) obtiveram a indução de embriogênese somática em
batata (Solanum tuberosum) a partir de folhas. Calos nodulares formados em meio
de cultura MS, suplementado com 2,4-D combinado com BAP (benzilaminopurina)
e após transferidos para meio de cultura MS contendo Zeatina e BAP resultaram na
indução de um grande número de embriões somáticos diretamente do centros
meristemáticos produzidos no tecido nodular. A maturação ocorreu nestes mesmos
meios de cultura, porém a conversão foi observada em meios isentos de reguladores
de crescimento vegetais.
Lopez-Puc et al. (2006) observaram a formação de embriões somáticos
diretamente sobre embriões zigóticos de Capsicum chinense em meio de cultura MS
suplementado com 2 mg L-1 de 2,4-D, com maturação dos embriões somáticos na
presença de ácido abscísico e germinação dos embriões com ácido giberélico.
Um protocolo de regeneração foi desenvolvido para Capsicum annuum L. a
partir de embriões zigóticos imaturos via embriogênese somática direta em meio de
cultura MS suplementado com 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético), água de coco e
alta concentração de sacarose (Harini e Sita, 1993). A germinação dos embriões
ocorreu em meio de cultura suplementado com 1 mg L-1 de ácido giberélico.
Chandel e Katiyar (2000) obtiveram embriões somáticos a partir de folhas de
Lycopersicon esculentum Mill. utilizando Kinetina e ANA.
Problemas durante as etapas de desenvolvimento, maturação, germinação e
conversão dos embriões são comuns. De modo geral, as falhas na formação de
plantas ocorrem devido à presença de anormalidades nos embriões como, por
exemplo, a falta de desenvolvimento completo dos meristemas (Ribas, 1999),
variações no número de cotilédones e efeito residual das auxinas (Parrot et al.,
1991).
27
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39
CAPÍTULO I
Amadurecimento de frutos de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) tratados
com Ethephon
RESUMO
Solanum sessiliflorum é uma solanácea nativa da Amazônia que apresenta
potencialidades para a agroindústria, dada a rusticidade e a alta produção de frutos.
A utilização adequada dos frutos é dependente do entendimento da fisiologia do
amadurecimento ainda desconhecido. Questões fundamentais da fisiologia pós-
colheita, como comportamento respiratório e a produção de etileno, foram pouco
exploradas. Estudos envolvendo a utilização de produtos que liberam etileno como
o Ethephon (ácido 2-cloroetilfosfônico) são essenciais para definir o ponto de
colheita e as técnicas de armazenamento para prolongar a vida pós-colheita de
frutos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade pós-colheita de
frutos de cubiu (Solanum sessiliflorum) durante o amadurecimento após o
tratamento com Ethephon. Frutos das variedades Santa Luzia e Thais no estádio
verde-maduro foram coletados, lavados e pulverizados até o completo molhamento
com 1000 mg L-1 de Ethephon e o controle com água. A cada três dias, durante 12
dias foram realizadas análises da firmeza do pericarpo, pH, teor de sólidos solúveis
totais, acidez total titulável (ATT), umidade e cinzas. Foi avaliada a liberação de
C02 e etileno diariamente durante 12 dias, conjuntamente com a perda de matéria
fresca e evolução da cor, a cada três dias, durante 12 dias, sempre no mesmo grupo
de frutos. Foi empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado. Os
dados foram submetidos à análise de variância e análise de regressão. Ocorreu perda
de firmeza do pericarpo dos frutos com o tempo de armazenamento pós-colheita,
com diminuição do pH, aumento da ATT e perda da matéria fresca. A aplicação de
Ethephon promoveu poucas mudanças na qualidade interna dos frutos, porém foi
eficiente no desverdecimento da casca, o que pode ser verificado pelos menores
valores do ângulo de cor e maiores da cromaticidade e luminosidade. O
40
comportamento da respiração e da produção de etileno apontam para um modelo de
amadurecimento não-climatérico.
Palavras-chave: Solanum sessiliflorum, ácido 2-cloroetilfosfônico, qualidade
físico-química, etileno.
41
Postharvest ripening of Ethephon-treated cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) fruits
ABSTRACT
Solanum sessiliflorum is a Solanaceae native from the Amazon region that has great
potential for agroindustry due to its rusticity and high yields. Cubiu utilization is,
however, dependent on understanding its physiology. Information on cubiu’s
postharvest physiology is still quite limited. Fundamental questions regarding the
postharvest physiology such as ethylene production and respiratory behavior have
been not been investigated. Studies involving the use of products that liberate
ethylene like Ethephon (2-chloroethyl phosphonic acid) are essential to determine
the stage if fruit at harvest and storage techniques to prolong the postharvest life.
The objective of the present work was to evaluate postharvest quality of cubiu
(Solanum sessiliflorum) fruits during ripening after Ethephon treatment. Fruits of
varieties Santa Luzia and Thais, were collected at green-mature stage, washed and
sprayed until run off with Ethephon (0 e 1000 mg L-1). Every three days, during 12
days, the following analyses were performed; pericarp firmness, pH, total soluble
solid content, total titratable acidity (ATT), water content and ashes. C02 and
ethylene was evaluated daily evaluated for 12 days, and the loss of fresh matter and
color evolution, every three days, during 12 days, always the same fruit group. The
experiment was arranged in a complete randomized design. Data were examined by
analysis of variance and regression analysis. There was loss of pericarp firmness
with time of postharvest storage, with decrease in pH, increase in ATT and loss of
fresh matter. Ethephon promoted small changes in internal quality of fruits, whereas
it was efficient for degreening the fruit peel, which can be verified by the lower
color angles and higher chromaticity and brightness. Respirations rates and ethylene
production suggest thar cubiu has non-climateric behavior.
Key words: Solanum sessiliflorum, 2-chloroethyl phosphonic acid, physical-
chemical quality, ethylene.
42
1. INTRODUÇÃO
O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma solanácea arbustiva nativa da
Amazônia também conhecida como maná, topiro ou tomate de índio, a qual foi
domesticada pelas populações indígenas. A espécie é encontrada naturalmente na
Amazônia brasileira, peruana, equatoriana, colombiana e venezuelana (Silva Filho,
1998). A planta apresenta potencialidades para a agroindústria moderna, dada a sua
rusticidade e alta produção de frutos. Os frutos são de tamanho variável, sub-
globosos a ovóides, do tipo baga, vermelho-alaranjados quando maduros, de polpa
ácida com numerosas sementes achatadas (Storti, 1988), variando entre 30 a 400 g
(Marx et al., 1998).
Os frutos possuem elevados teores de niacina (Villachica, 1996; Marx et
al., 1998) e ferro (Silva Filho et al., 2005), sendo utilizados in natura ou nas mais
diversas formas, como em sucos, doces, geléias, sorvetes, molhos, cosméticos
(Pahlen, 1977; Silva Filho et al., 1999); e na medicina popular como agente
hipoglicemiante e hipocolesterolêmico (Silva Filho et al., 2003; Pardo, 2004).
Na Amazônia, a floração ocorre durante os meses de setembro a novembro
(Storti, 1988), com início 4 ou 5 meses após a germinação (Silva Filho, 2002). A
produção de frutos inicia 7 meses após a semeadura (Marx et al., 1998; Silva Filho
et al., 1999) e dependendo do genótipo produz 100 toneladas de frutos por hectare
(Villachica, 1996).
Nos últimos anos tem ocorrido crescente valorização do fruto no mercado
brasileiro (Silva Filho et al., 2005) e a planta tem sido levada para outras regiões,
incluindo a zona da mata pernambucana e algumas localidades da região sudeste
(Pires et al., 2006) e sul (Brancher e Tagliari, 2004). Porém, o efeito das condições
edafo-climáticas da região na qualidade dos frutos, nos constituintes químicos, no
tamanho e na massa dos frutos ainda são pouco conhecidos, tornando a exploração
comercial bastante limitada.
Silva Filho (2002) relatou grande variabilidade genética para forma,
tamanho, conteúdo de sólidos solúveis e produção de frutos de cubiu em populações
naturais da Amazônia. Hernández et al. (2004) relataram que frutos da Amazônia
43
Colombiana apresentaram período de vida útil de 19 dias após a colheita a 15ºC e
padrão respiratório semelhante ao de frutos não-climatéricos. Porém, ainda há falta
de conhecimento sobre as características fisiológicas dos frutos, como a produção
de etileno, a sensibilidade ao etileno exógeno e seu efeito sobre as características
químicas de frutos durante o amadurecimento pós-colheita.
Estudos envolvendo a utilização de produtos que liberam etileno, como o
Ethephon, são úteis para distinguir frutos climatéricos e não-climatéricos, sendo
essencial para definir o ponto de colheita e técnicas de manipulação e
armazenamento que possam ser usadas para prolongar a vida pós-colheita
(Archbold e Pomper, 2003). Além disso, frutos não-climatéricos, não exibem
aumento na produção de etileno e na taxa de respiração, mas podem ser sensíveis ao
regulador de crescimento durante a fase pós-colheita (Lelièvre et al., 1997).
Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as mudanças físico-
químicas e fisiológicas durante o amadurecimento de frutos de duas cultivares de
Solanum sessiliflorum após o tratamento com Ethephon.
44
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material vegetal e condições de cultivo
Foram colhidos frutos verde-maduros de plantas de cubiu das variedades
Santa Luzia e Thais cultivadas na área experimental da Universidade Paranaense
(UNIPAR), Toledo, PR (para determinação dos componentes físico-químicos) e da
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG (para quantificação de gases)
no ano agrícola 2006/2007.
A semeadura foi realizada em bandejas de poliestireno com 128 células,
contendo substrato para produção de mudas. Quarenta e cinco dias após a
semeadura, foi efetuada a repicagem das plântulas para sacos plásticos com
capacidade para 1 kg de mistura contendo solo: areia:esterco, na proporção 3:2:1.
Decorridos 150 dias, realizou-se o transplantio das mudas para condições de campo,
em covas de 0,2 x 0,2 m de largura por 0,2 m de profundidade. O espaçamento
utilizado foi de 1 m entre plantas e 1,5 m entre fileiras. A adubação de plantio
consistiu na aplicação de 1 kg de composto orgânico (esterco curtido de gado), 400g
do fertilizante Yorin e 50 g de NPK (08-20-20) por cova. Aos 15 dias após o
transplante, foi realizada a adubação de cobertura com 10 g de uréia por cova,
repetindo-se essa prática em intervalos de 15 dias até o momento em que as plantas
iniciaram o florescimento.
2.2. Determinação dos componentes físico-químicos dos frutos
Os frutos de ambas as variedades foram coletados no estádio verde-maduro
quando atingiram o máximo crescimento e sem alteração de cor visível. Os mesmos
foram acondicionados em bandejas e transportados para o Laboratório de
Biotecnologia, da Universidade Paranaense, Toledo, PR, onde foram imediatamente
lavados em água corrente e, em seguida, em solução de hipoclorito de sódio (0,5%
de cloro ativo). Posteriormente, foram realizadas três lavagens com água destilada.
Em seguida, os frutos foram pulverizados até o completo molhamento com água
destilada (controle) ou com Ethephon (1000 mg L-1). Após a secagem sobre papel
45
toalha, os frutos foram colocados sobre as bancadas do laboratório, para que
pudessem amadurecer em temperatura média de 24 ± 3ºC.
A avaliação das características físicas do comprimento, diâmetro, massa
total, massa da polpa (epiderme dos lóculos, suco e sementes) e diâmetro do
pericarpo (polpa aderida a casca) foi realizada nos frutos de ambas as variedades no
estádio verde-maduro. As avaliações da firmeza do pericarpo e das características
químicas da polpa como pH, teor de sólidos solúveis totais (SST), acidez total
titulável (ATT), razão SST/ATT, umidade e cinzas foram realizadas em intervalos
de três dias durante 12 dias de armazenamento.
A firmeza foi estimada pelo amaciamento do pericarpo, em um ponto da
região mediana de cada fruto, utilizando-se a técnica não destrutiva de aplanação,
descrita por Calbo e Nery (1995). Os dados obtidos foram transformados em
unidades de força (MPa).
O teor de SST e o pH foram determinados por leitura direta em soluções de
polpa homogeneizada, em refratômetro (expressos em ºBrix) e em potenciômetro
previamente calibrado com os padrões de pH 4 e 7, respectivamente.
A ATT foi determinada em 10g da polpa trituradas com 90mL de água
destilada, tituladas rapidamente e sob agitação com solução de 0,01N de NaOH,
utilizando a fenolftaleína 1% como indicador. Os resultados foram expressos em g
de ácido cítrico por 100 g de amostra.
O teor de umidade da polpa (%) foi determinado por meio da perda de
massa da amostra aquecida a 105 ±1ºC, até a massa tornar-se constante. Estas
amostras foram incineradas em mufla a 550ºC e utilizadas na determinação do teor
de cinzas (% de resíduo mineral fixo). As análises da ATT, razão SST/ATT,
umidade e cinzas foram realizadas segundo metodologia da AOAC (1990).
2.3. Determinação da atividade respiratória e da produção de etileno
Foram coletados frutos de cubiu das variedades Santa Luzia e Thais no
estádio verde-maduro, os quais foram acondicionados em caixas e transportados até
46
o Laboratório de Pós-colheita do Departamento de Fitotecnia da Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa, MG.
No laboratório, depois de selecionados, os frutos sadios foram lavados,
primeiramente, em água corrente e em seguida, com solução de hipoclorito de sódio
(0,5% de cloro ativo). Em seguida, foi realizada a tríplice lavagem dos frutos em
água destilada.
Os frutos permaneceram sobre as bancadas do laboratório, sobre papel
toalha durante uma hora para secagem, e em seguida, foram submetidos a
pulverização até o completo molhamento com Ethephon (1000 mg L-1) e o controle
com água. Após a secagem, os frutos permaneceram à temperatura de 24ºC para o
acompanhamento do amadurecimento.
Foram realizadas análises de perda de matéria fresca e evolução da cor, a
cada três dias, durante 12 dias, sempre no mesmo grupo de frutos. A perda da
matéria fresca foi avaliada pesando-se cada fruto em balança semi-analítica. Os
resultados foram expressos em porcentagem, considerando-se a diferença entre a
massa inicial e o obtido a cada intervalo de tempo de amostragem.
A evolução da cor da casca durante o amadurecimento foi avaliada em
todos os frutos, tratados ou não com Ethephon. Para isso, foi utilizado um
colorímetro da Minolta (sistema L*, a*, b*), modelo CR-300, realizando-se três
leituras por fruto, em diferentes pontos da região equatorial, a partir dos parâmetros
luminosidade (L), cromaticidade (C) e cor da casca expressa em ângulo da cor (Hº).
O parâmetro L varia do claro ao escuro, sendo o valor 100 correspondente
à cor branca e o valor 0 (zero) à cor preta. O parâmetro C define a intensidade da
cor, assumindo valores próximos a 0 (zero) para cores neutras (cinza) e ao redor de
60 para cores vívidas. O aumento da luminosidade indica aumento no brilho da
casca durante a maturação, enquanto o aumento da cromaticidade representa cor
mais saturada e intensa. O ângulo de cor Hº expressa as diferenças de coloração da
casca, em que valores próximos a 110 correspondem a cor verde e próximos a 70 a
vermelha (McGuire, 1992).
A atividade respiratória e a produção de etileno foram determinadas a cada
24 horas, durante 12 dias. A atividade respiratória foi determinada pela
47
quantificação da produção de CO2 dos frutos. Os frutos foram colocados,
individualmente, em frascos com capacidade de 590 mL, os quais foram
hermeticamente fechados. Após 30 e 90 minutos, respectivamente, foram retiradas
amostras de 1 mL da atmosfera interna dos frascos com o auxílio de seringa, para a
quantificação do CO2 e etileno liberados. As amostras foram injetadas em aparelho
de cromatografia gasosa (Shimadzu GC-14B) com coluna Porapak Q de 1,60 m de
comprimento. As temperaturas da coluna e do injetor foram 50°C e 100°C,
respectivamente. Para análise de CO2, foi utilizado um detector de condutividade
térmica a 140°C e corrente de 85 A. Foi realizada a detecção de etileno por meio de
detector de ionização de chama a 150°C. A taxa respiratória foi expressa em mg de
CO2 kg-1h-1 e a taxa de liberação de etileno em µL kg-1h-1.
2.4. Análise estatística
A avaliação das características físicas das variedades Santa Luzia e Thais
foi feita utilizando-se o delineamento inteiramente casualizado, com trinta
repetições. A unidade experimental constou de um fruto de cada variedade e os
dados foram submetidos à análise de variância.
O delineamento inteiramente casualizado, no esquema fatorial 2 x 2 x 5 (2
variedades, 2 concentrações de Ethephon e 5 períodos de avaliação), portanto, com
20 tratamentos foi utilizado para as demais caracterizações,. A unidade
experimental foi composta por três frutos de cada variedade, os quais constituíram a
unidade experimental. Os dados foram submetidos à análise de variância e de
regressão.
Para a análise da atividade respiratória e produção de etileno, foi utilizado
o delineamento inteiramente casualizado, organizado em esquema de parcelas
subdivididas com esquema fatorial na parcela principal (parcela: combinações de
variedade e Ethephon) e na subparcela o fator tempo, com três repetições. A
unidade experimental constou de três frutos para cada combinação de tratamento.
Os dados foram submetidos à análise de variância. Não foram possíveis os ajustes
de modelos matemáticos para estabelecer uma relação funcional entre as variáveis
48
dependentes (etileno e CO2) e a variável independente (dias após a colheita). Dessa
forma, optou-se pela estatística descritiva e desvio padrão.
Todas as análises foram efetuadas com auxílio do programa computacional
SISVAR (Ferreira, 2000).
49
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram observadas diferenças significativas (p<0,05) entre as duas
variedades de cubiu para as características físicas, exceto para a espessura do
pericarpo (Quadro 1, Apêndice Quadro 1A). Os frutos da variedade Santa Luzia
apresentaram formato ovalado (5,8 e 3,9 cm), com maior massa média (53,4 g) e
menor massa da polpa (18,2 g). Entretanto, os da variedade Thais apresentaram
formato alongado (6,3 e 3,9 cm) com menor massa média (47,3g) e maior massa da
polpa (28,9g).
Quadro 1 - Valores médios obtidos para as características físicas de frutos de Solanum sessiliflorum Dunal para as variedades Santa Luzia e Thais
Características Santa Luzia Thais CV (%) Comprimento (cm) 5,8 b 6,3 a 6,6
Diâmetro (cm) 3,9 a 3,7 b 7,3 Massa fresca total (g) 53,4 a 47,3 b 15,8
Espessura do pericarpo (cm) 0,5 a 0,5 a 19,2 Massa da polpa (g) 18,2 b 28,9 a 49,5
Médias seguidas da mesma letra, na linha, não diferem entre si pelo teste F, a 5% de probabilidade. Os dados representam a média de 30 repetições. CV = Coeficiente de Variação.
Estudos realizados por Silva Filho et al. (2005), buscando caracterizar e
avaliar o potencial de 28 diferentes etnovariedades de cubiu cultivadas em
condições da Amazônia, evidenciaram que as plantas produziram frutos com massa
fresca variando de 18,5 a 301g. De acordo com Silva Filho (2002), frutos pequenos,
com pericarpo menos espesso, semelhantes aos das variedades Santa Luzia e Thais,
são mais empregados para a produção de suco, por possuírem maior proporção de
polpa (epiderme dos lóculos, suco e sementes). Os frutos grandes, por outro lado,
por possuírem o pericarpo mais espesso são mais empregados nas indústrias de
doces e compotas.
Houve diferença significativa (p�0,05) para a interação variedades,
concentração de Ethephon e tempo de armazenamento para todas as variáveis-
resposta. Ttodos os desdobramentos foram realizados.
50
Ocorreu perda de firmeza do pericarpo dos frutos de cubiu em função do
tempo de armazenamento pós-colheita, de forma exponencial, em todas as
combinações de variedades e concentrações de Ethephon, sendo mais acentuada nos
três primeiros dias e estabilizando a partir deste período (Figura 1).
Outro resultado obtido é que não foram verificadas diferenças
significativas (p>0,05) entre as variedades para cada combinação de tempo e
Ethephon, exceto na primeira avaliação realizada no tempo zero (Quadro 2,
Apêndice Quadro 2A). A maior firmeza inicial dos frutos da variedade Santa Luzia
sugere maior resistência à pressão e ao transporte. Os frutos da variedade Santa
Luzia também apresentaram maior queda inicial do que os frutos de Thais.
Também não foram observadas diferenças significativas na firmeza dos
frutos com a aplicação de Ethephon, para cada combinação de tempo e variedade
(Quadro 3, Apêndice Quadro 2A). O declínio da firmeza tem sido atribuído,
principalmente, à hidrólise de polissacarídeos da parede celular e à degradação
enzimática de componentes pécticos da lamela média (Chitarra e Chitarra, 2005).
Em trabalhos realizados por Hernández et al. (2004), por outro lado, não
foram observadas alterações marcantes na firmeza dos frutos de cubiu ao longo de
25 dias de armazenamento, porém os mesmos foram mantidos a 15ºC e com 80% de
umidade relativa.
Os teores de SST não variaram em função do tempo de armazenamento
pós-colheita, exceto nos frutos da variedade Santa Luzia tratados com Ethephon, os
quais tiveram pequena variação na forma da curva quadrática (Figura 1), com ponto
máximo de 6,8 dias e resposta máxima de SST de 3,97 ºBrix. Além disso, foram
verificadas diferenças significativas entre as variedades apenas no tempo zero
(Quadro 2).
Quando se avaliou o efeito das concentrações de Ethephon (Quadro 3,
Apêndice 2A), verificou-se que os frutos da variedade Thais não tratados (controle)
diferiram significativamente dos tratados (1000 mg L-1) apenas no 12º dia de
armazenamento, apresentando os maiores valores médios de SST (4,43 ºBrix).
Dessa forma, o Ethephon promoveu poucas mudanças significativas no teor de SST
51
durante o amadurecimento e as variações nos teores podem ser atribuídas à variação
natural que ocorre nos teores dos diferentes frutos.
Figura 1 - Firmeza do pericarpo e teor de Sólidos Solúveis Totais (SST) de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
Os valores médios dos SST foram inferiores aos obtidos em outros trabalhos
com frutos de cubiu, entretanto, deve ser considerado que nesse trabalho o
amadurecimento aconteceu fora da planta-mãe.
61,03176,0ˆ
83,03586,0ˆ
87,05186,0ˆ
82,04074,0ˆ
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0 3 6 9 12
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64,027328,01178,0ˆ
95,058537,01428,0ˆ
98,056244,00962,0ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
-
-
-
-
rey
rey
rey
rey
x
x
x
x-------SLC
SLE
THC
THE
SLC
SLE
THC
THE
61,03176,0ˆ
83,03586,0ˆ
87,05186,0ˆ
82,04074,0ˆ
21127,04
21785,03
21,02
21,01
==
==
==
==
-
-
-
-
rey
rey
rey
rey
x
x
x
x
61,03176,0ˆ
,035,0ˆ
87051,0ˆ
,4,0ˆ
21127,04
21785,03
2102
2101
==
==
==
==
-
-
-
rey
rey
rey
ry
x
x
x
x
61,03176,0ˆ
,035,0ˆ
87051,0ˆ
,4,0ˆ
21127,04
21785,03
2102
2101
==
==
==
==
-
-
-
rey
rey
rey
ry
x
x
x
x
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
SST
(o B
rix)
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
SST
(o B
rix)
-------
82,3ˆ07,4ˆ
43
====
yyyy
82,3ˆ07,4ˆ
43
====
yyyy
85,001366,01854,0340,3ˆ
78,3ˆ22
2
1=-+=
==
rxxy
yy
85,001366,01854,0340,3ˆ
78,3ˆ22
2
1=-+=
==
rxxy
yy
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 3 6 9 12
Firm
eza
(MPa
)
Dias após a colheita
69,024374,01454,0ˆ
64,027328,01178,0ˆ
95,058537,01428,0ˆ
98,056244,00962,0ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
-
-
-
-
rey
rey
rey
rey
x
x
x
x
69,024374,01454,0ˆ
64,027328,01178,0ˆ
95,058537,01428,0ˆ
98,056244,00962,0ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
-
-
-
-
rey
rey
rey
rey
x
x
x
x-------SLC
SLE
THC
THE
SLC
SLE
THC
THE
52
Quadro 2 - Valores médios para as características firmeza do pericarpo (FP), sólidos solúveis totais (SST), pH, acidez total titulável (ATT), relação SST/ATT (S/A), umidade (Um) e cinzas (Cz), das variedades Santa Luzia (SL) e Thais (TH) em função do tempo (0, 3, 6, 9 e 12 dias) e Ethephon (0 e 1000 mg L-1)
0 3 6 9 12
0 1000 0 1000 0 1000 0 1000 0 1000
FP SL 0,66 a 0,72 a 0,15 a 0,27 a 0,13 a 0,12 a 0,06 a 0,12 a 0,07 a 0,09 a
(MPa) TH 0,38 b 0,38 b 0,29 a 0,28 a 0,06 a 0,08 a 0,08 a 0,14 a 0,05 a 0,10 a
SST SL 3,68 a 3,38 b 3,57 a 3,65 a 3,74 a 4,11 a 4,03 a 3,83 a 3,89 a 3,62 a
(ºBrix) TH 4,10 a 4,10 a 3,68 a 3,60 a 4,01 a 3,94 a 4,13 a 3,70 a 4,43 a 3,78 a
pH SL 3,72 a 3,68 a 3,59 a 3,40 a 3,49 a 3,33 a 3,53 a 3,34 a 3,41 a 3,15 a
TH 3,68 a 3,68 a 3,61 a 3,57 a 3,59 a 3,37 a 3,24 b 3,29 a 3,23 a 3,18 a
ATT SL 1,29 a 1,42 a 1,42 a 2,09 a 1,95 a 2,07 a 1,75 b 2,05 a 2,11 a 2,05 a
(g/100g) TH 1,48 a 1,48 a 1,68 a 2,10 a 1,97 a 2,04 a 2,28 a 2,27 a 2,29 a 2,14 a
S/A SL 3,24 a 2,50 a 2,82 a 1,92 a 1,93 a 1,99 a 2,40 a 1,89 a 1,92 a 1,80 a
TH 3,22 a 3,22 a 2,52 a 1,89 a 2,25 a 1,98 a 1,82 a 1,68 a 1,96 a 1,81 a
Um SL 92,18 a 93,03 a 91,35 a 91,57 a 91,44 a 90,55 a 91,25 a 91,22 a 91,71 a 90,96 a
(%) TH 90,35 a 90,35 a 90,39 a 91,11 a 91,19 a 90,16 a 90,79 a 90,94 a 90,82 a 90,56 a
Cz SL 1,78 a 1,59 a 1,62 a 1,56 a 1,44 a 1,51 a 1,61 a 1,37 a 1,83 a 1,16 a
(%) TH 2,01 a 2,01 a 1,52 a 1,88 a 1,51 a 1,73 a 1,38 a 1,42 a 1,51 a 1,67 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, comparando as variedades, para cada combinação de tempo e de Ethephon, não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade.
Os valores médios dos SST foram inferiores aos obtidos em outros
trabalhos com frutos de cubiu. Silva Filho et al. (1989) analisaram doze introduções
de cubiu provenientes de diferentes partes da Amazônia e cultivadas em Manaus e
encontraram frutos com 4,5 a 6 ºBrix. Em torno de 70% das plantas de populações
naturais de cubiu da Amazônia cultivadas no Estado de Pernambuco por Silva Filho
et al. (1996) apresentaram 6 ºBrix, havendo inclusive uma população oriunda de
Borba (AM) que registrou 7 ºBrix, o maior nível de SST encontrado para a espécie
quando cultivada no Brasil. Os autores sugerem que as condições ambientais onde
foi conduzido o experimento favoreceram a expressão de genes que controlam este
caráter.
53
Quadro 3 - Valores médios para as características firmeza do pericarpo (FP), sólidos solúveis totais (SST), pH, acidez total titulável (ATT), relação SST/ATT (S/A), umidade (Um) e cinzas (Cz), na presença (1000 mg L-1) ou não de Ethephon em função das variedades Santa Luzia (SL) e Thais (TH) e do tempo (0, 3, 6, 9 e 12 dias)
0 3 6 9 12
SL TH SL TH SL TH SL TH SL TH
FP 0 0,66 a 0,38 a 0,15 a 0,29 a 0,13 a 0,06 a 0,06 a 0,08 a 0,07 a 0,05 a
(MPa) 1000 0,72 a 0,38 a 0,27 a 0,28 a 0,12 a 0,08 a 0,12 a 0,14 a 0,09 a 0,10 a
SST 0 3,68 a 4,10 a 3,57 a 3,68 a 3,74 a 4,01 a 4,03 a 4,13 a 3,89 a 4,43 a
(ºBrix) 1000 3,38 a 4,10 a 3,65 a 3,60 a 4,11 a 3,94 a 3,83 a 3,70 a 3,62 a 3,78 b
pH 0 3,72 a 3,68 a 3,59 a 3,61 a 3,49 a 3,59 a 3,53 a 3,24 a 3,41 a 3,23 a
1000 3,68 a 3,68 a 3,40 a 3,57 a 3,33 a 3,37 a 3,34 a 3,29 a 3,15 a 3,18 a
ATT 0 1,29 a 1,48 a 1,48 b 1,68 a 1,95 a 1,97 a 1,75 a 2,28 a 2,11 a 2,29 a
(g/100g) 1000 1,42 a 1,48 a 2,09 a 2,10 a 2,07 a 2,04 a 2,05 a 2,27 a 2,05 a 2,14 a
S/A 0 3,24 a 3,22 a 2,82 a 2,52 a 1,93 a 2,25 a 2,40 a 1,82 a 1,92 a 1,96 a
1000 2,50 a 3,22 a 1,92 b 1,89 a 1,99 a 1,98 a 1,89 a 1,68 a 1,80 a 1,81 a
Um 0 92,18 a 90,35 a 91,35 a 90,39 a 91,44 a 91,19 a 91,25 a 90,79 a 91,71 a 90,82 a
(%) 1000 93,03 a 90,35 a 91,57 a 91,11 a 90,55 a 90,16 a 91,22 a 90,94 a 90,96 a 90,56 a
Cz 0 1,78 a 2,01 a 1,62 a 1,52 a 1,44 a 1,51 a 1,61 a 1,38 a 1,83 a 1,51 a
(%) 1000 1,59 a 2,01 a 1,56 a 1,88 a 1,51 a 1,73 a 1,37 a 1,42 a 1,16 b 1,67 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, comparando os tratamentos com Ethephon, para cada combinação de tempo e variedade, não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade.
Hernández et al. (2004) relataram que frutos de cubiu cultivados na
Amazônia Colombiana e armazenados a 15 ºC apresentaram oscilações nos SST ao
longo de 24 dias de armazenamento. Nos primeiros 6 dias, os frutos apresentaram 7
ºBrix, aumentando para 8 ºBrix aos 9 dias, tornando a diminuir para 7 ºBrix aos 12
dias, voltando a aumentar e decaindo para 7 ºBrix ao final de 24 dias. Segundo os
autores, frutos não-climatéricos como o cubiu não acumulam amido, utilizando os
acúcares solúveis.
Domingues et al. (2001) verificaram que a imersão de frutos não-
climatéricos como os de laranja (Citrus sinensis) cultivar Baianinha por 5 minutos
em solução contendo 1000 mg L-1 de Ethephon não proporcionou aumento
significativo no teor de SST. De modo similar, Santana et al. (2004) não
evidenciaram efeito significativo da imersão rápida (10 minutos) dos frutos de
54
abacaxi Pérola em solução com 1000 mg L-1 de Ethephon no teor de SST. Frutos
não-climatéricos de Solanum muricatum Ait. apresentaram aumento no teor de SST
durante o amadurecimento dos frutos na planta. Entretanto, quando o
amadurecimento ocorreu fora da planta, alterações relativamente pequenas foram
observadas (Ahumada e Cantwell, 1996). Por outro lado, Oliveira Júnior et al.
(2004), analisando as alterações pós-colheita da fruta-de-lobo (Solanum lycocarpum
St. Hil.) durante o amadurecimento, verificaram aumento do teor de SST ao longo
de 20 dias de armazenamento em temperatura média de 22ºC.
O pH apresentou decréscimo linear em função do tempo após a colheita em
todas as combinações de variedades e de Ethephon, enquanto o teor médio de ATT
apresentou acréscimo linear em ambas as variedades não tratadas com Ethephon e
acréscimo exponencial quando tratadas com Ethephon, sendo mais acentuado nos
três primeiros dias (Figura 2). Os frutos da variedade Thais apresentaram maiores
teores de ATT, embora diferenças significativas entre as variedades somente
tenham sido observadas no 9º dia de armazenamento. Estas diferenças também
observadas neste período para o pH, tendo a variedade Thais apresentado menores
valores médios (Quadro 2). Os frutos da variedade Santa Luzia, que foram tratados
com Ethephon, diferiram dos não tratados com relação à ATT apenas no 3º dia de
armazenamento e quanto ao pH não foi detectada diferença quanto a pulverização
dos frutos com Ethephon (Quadro 3, Apêndice 2A).
Os resultados obtidos foram similares aos relatados por Hernández et al.
(2004), os quais demonstraram que frutos de cubiu apresentaram aumento da ATT
até o 10º dia de armazenamento a 15ºC, havendo após este período diminuição da
ATT e aumento do pH até o período de observação de 25 dias.
55
Figura 2 - Valor do pH e Acidez Total Titulável (ATT) de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle ; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
A ATT dos frutos após 12 dias de armazenamento a temperatura ambiente,
independentemente do tratamento ou não com Ethephon e da variedade, variou de
2,1 a 2,3 g de ácido cítrico/100g de polpa. Estes valores foram superiores à média
(1,47) obtida por Silva Filho et al. (1999) em frutos de 24 etnovariedades da
Amazônia brasileira, peruana e colombiana, coletados maduros, com coloração
amarela e amadurecidos na planta. Segundo Silva Filho (2002), o cubiu é
considerado um fruto ácido e a acidez elevada contribui para o sabor do fruto,
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
pH
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
pH
-------
-------
86,00375,0603,3ˆ
85,00222,0683,3ˆ2
2
21
=-=
=-=
rxy
rxy
86,00375,0603,3ˆ
85,00222,0683,3ˆ2
2
21
=-=
=-=
rxy
rxy
98,00428,0674,3ˆ
85,00423,0723,3ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
98,00428,0674,3ˆ
85,00423,0723,3ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
1
1,4
1,8
2,2
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
AT
T (g
/100
g)
1
1,4
1,8
2,2
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
AT
T (g
/100
g)
66,06639,0146,2ˆ
95,00741,0497,1ˆ
99,06511,0074,2ˆ
81,00655,0307,1ˆ
24
23
22
21
=-=
=+=
=-=
=+=
-
-
rey
rxy
rey
rxy
x
x
66,06639,0146,2ˆ
95,00741,0497,1ˆ
99,06511,0074,2ˆ
81,00655,0307,1ˆ
24
23
22
21
=-=
=+=
=-=
=+=
-
-
rey
rxy
rey
rxy
x
x-------
SLC
SLE
THC
THE
SLC
SLE
THC
THE
56
permitindo um fator de diluição elevado na formulação de sucos e,
conseqüentemente, contribuindo em seu rendimento industrial para esta finalidade.
Apesar de ter ocorrido elevação da acidez e diminuição do pH com a
maturação, contrariando as observações da maioria dos frutos, elas foram de
pequena magnitude. Alterações pós-colheita similares foram observadas por
Oliveira Júnior et al. (2004) durante o amadurecimento de frutos de fruta-de-lobo
(Solanum lycocarpum St. Hil.), no qual a ATT aumentou e o pH diminuiu ao longo
de 18 dias de armazenamento em temperatura média de 22 ºC, sem o tratamento
com Ethephon.
Neres et al. (2004) observaram aumento linear do teor de ATT ao longo de
15 dias de armazenamento a 25ºC de frutos de jiló (Solanum gilo Raddi), indicando
que os ácidos orgânicos não são a principal fonte de energia, no período de
observação, para a respiração durante o processo de maturação, como pode ocorrer
em alguns frutos. Lima et al. (2003) também observaram aumento linear da ATT e
diminuição do pH de frutos de graviola (Annona muricata L.) colhidos na
maturidade fisiológica e armazenados a 23,4ºC por um período de seis dias. Os
autores do trabalho atribuíram este acúmulo, possivelmente, à reduzida utilização
dos ácidos orgânicos nas vias oxidativas normais. Lombardi et al. (2000) atribuíram
o aumento da acidez de pêras da cultivar Shinsseiki (Pyrus pirifolia) à elevada
desidratação sofrida pelos frutos, ocasionando maior concentração de ácido málico
no suco celular.
González et al. (2004), por outro lado, observaram decréscimo na ATT de
caquis após 8 dias de armazenamento a 25 ºC previamente imersos em solução com
500 mg L-1 de Ethephon (2 minutos), entretanto, não foram observados efeitos
significativos da aplicação do Ethephon. Frutos não-climatéricos de tangerineiras
ponkan (Citrus reticulata Blanco) também apresentaram tendência de queda na
acidez paralela ao aumento no pH com o decorrer de 20 dias de armazenamento sob
temperatura ambiente de 20 ºC, com ligeiro aumento no teor de SST (Lima et al.,
1999).
A razão SST/ATT diminuiu de forma linear em função do tempo de
armazenamento pós-colheita, exceto para a variedade Santa Luzia tratada com
57
Ethephon, a qual se manteve estável (Figura 3). Não foram observadas diferenças
significativas entre as variedades para as combinações de Ethephon e tempo
(Quadro 2). A variedade Santa Luzia diferiu da variedade Thais quanto ao
tratamento com Ethephon apenas no 3º dia de avaliação (Quadro 3, Apêndice
Quadro 3A).
Santana et al. (2004) relataram que frutos de abacaxi, embora não-
climatéricos, apresentaram alterações relevantes nas suas propriedades químicas e
físico-químicas na fase pós-colheita. A acidez da polpa aumentou com o avanço do
período de armazenamento para frutos tratados com Ethephon e frutos testemunha,
resultando na redução progressiva da relação SST/ATT.
A diminuição na razão SST/ATT pode ser atribuída ao aumento da ATT ao
longo do amadurecimento fora da planta. A relação brix/acidez (SST/ATT) em
frutos de cubiu é baixa, confirmando seu baixo grau de doçura e sua pequena
utilização para o consumo in natura, conforme relatos de Silva Filho (2002).
A umidade não variou em função do tempo de armazenamento pós-colheita
em nenhuma combinação de variedades e Ethephon (Figura 3). Tendo por base os
resultados obtidos nesse trabalho, não existem evidências de diferenças
significativas (p>0,05) entres as variedades para as combinações de tempo e
Ethephon (Quadro 2), bem como com a aplicação de Ethephon para as combinações
de tempo e variedade (Quadro 3, Apêndice Quadro 3A). As variedades de cubiu
analisadas apresentaram elevados teores de umidade, com variação de 90,2 a 93 %.
Esses resultados evidenciaram que o fruto é suculento, corroborando com os
estudos realizados por Silva Filho (2002) e Yuyama et al. (2007), cujas variações
foram de 86,7 a 93,5% e 88,4 a 92,1%, respectivamente.
58
Figura 3 - Razão Sólidos Solúveis Totais (SST) e Acidez Total Titulável (ATT) e umidade de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
A percentagem média de cinzas apresentou decréscimo linear em função do
tempo de armazenamento, exceto em frutos da variedade Santa Luzia não tratados
com Ethephon (Figura 4). Não foram detectadas diferenças entre as variedades para
as combinações de tempo e concentrações de Ethephon (Quadro 2).
0
1
2
3
4
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
SST
/ATT
0
1
2
3
4
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
SST
/ATT
02,2ˆ71,01024,0076,3ˆ
2
21
===-=
yyrxy
02,2ˆ71,01024,0076,3ˆ
2
21
===-=
yyrxy
58,01007,0718,2ˆ
85,01073,0998,2ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
58,01007,0718,2ˆ
85,01073,0998,2ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
62,90ˆ71,90ˆ28,91ˆ58,91ˆ
4321
========
yyyyyyyy
62,90ˆ71,90ˆ28,91ˆ58,91ˆ
4321
========
yyyyyyyy--------
--------
89
90
91
92
93
94
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Um
idad
e (%
)
89
90
91
92
93
94
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Um
idad
e (%
)
62,90ˆ71,90ˆ28,91ˆ58,91ˆ
4321
========
yyyyyyyy
62,90ˆ71,90ˆ28,91ˆ58,91ˆ
4321
========
yyyyyyyy--------
SLC
SLE
THC
THE
SLCSLE
THC
THE
59
Figura 4 - Cinzas e perda da matéria fresca de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
Foi verificado que os frutos da variedade Santa Luzia não tratados com
Ethephon (Quadro 3, Apêndice Quadro 3A) diferiram significativamente dos
tratados com 1000mg L-1 de Ethephon apenas no 12º dia de armazenamento, porém
as maiores percentagens foram obtidas em frutos não tratados (1,83%). As cinzas
em alimentos referem-se ao resíduo inorgânico remanescente da queima da matéria
orgânica (Chitarra e Chitarra, 2005) e se tornam importantes quando há
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Cin
zas (
%)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Cin
zas (
%)
99,06819,11947,38ˆ98,04881,14893,37ˆ
94,07925 ,19547,42ˆ93,02720,19540,37ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
99,06819,11947,38ˆ98,04881,14893,37ˆ
94,07925 ,19547,42ˆ93,02720,19540,37ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
0
4
8
12
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Perd
a de
mat
éria
fres
ca (%
)
0
4
8
12
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Perd
a de
mat
éria
fres
ca (%
)
99,06819,1195,38ˆ
98,04881,1489,37ˆ
94,07925 ,1951,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
99,06819,1195,38ˆ
98,04881,1489,37ˆ
94,07925 ,1951,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
24
23
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy--------
--------88,00348,0646,1ˆ
65,1ˆ2
2
1=-=
==
rxy
yy
88,00348,0646,1ˆ
65,1ˆ2
2
1=-=
==
rxy
yy
65,00378,0970,1ˆ
54,00374,0811,1ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
65,00378,0970,1ˆ
54,00374,0811,1ˆ2
4
23
=-=
=-=
rxy
rxy
SLC
SLE
THC
THE
SLC
SLE
THC
THE
60
determinação dos minerais presentes nos frutos, o que não foi avaliado neste
trabalho.
Houve aumento linear para a perda de matéria fresca em razão do tempo de
avaliação em todas as combinações de variedades e de Ethephon (Figura 4).
Entretanto, as variedades não diferiram entre si (p>0,05) para as combinações de
tempo e Ethephon (Quadro 4, Apêndice Quadro 3 A). Frutos da variedade Santa
Luzia tratados com Ethephon apresentaram as maiores percentagens de perda ao
longo do tempo de armazenamento (Figura 4), mas somente foi encontrada
diferença significativa no 12º dia (Quadro 5), chegando a 11% de perda a partir da
massa inicial.
Quadro 4 - Valores médios para as características perda de matéria fresca (PMF), luminosidade (L), cromaticidade (C), ângulo de cor (Hº), das variedades Santa Luzia (SL) e Thais (TH) em função do tempo (0, 3, 6, 9 e 12 dias) e do Ethephon (0 e 1000 mg L-1)
0 3 6 9 12
0 1000 0 1000 0 1000 0 1000 0 1000
PMF SL 0 a 0 a 2,28 a 2,63 a 4,10 a 4,66 a 5,40 a 7,40 a 7,20 a 11,06 a
(%) TH 0 a 0 a 3,38 a 2,31 a 4,03 a 4,30 a 5,87 a 6,28 a 7,83 a 8,12 a
L SL 39,37 a 41,70 a 41,72 a 47,51 a 43,28 a 56,80 a 48,52 a 60,40 a 55,05 a 62,14 a
TH 38,55 a 38,25 a 40,79 a 42,49 b 46,18 a 49,09 b 50,60 a 53,72 b 55,96 a 57,87 a
C SL 25,67 a 28,96 a 28,47 a 37,29 a 32,36 a 54,22 a 41,82 a 63,49 a 55,13 a 66,78 a
TH 24,17 a 24,83 a 30,07 a 26,79 a 44,66 a 36,42 b 53,79 a 46,11 b 63,85 a 57,58 a
Hº SL 111,8 a 112,61 a 111,67a 105,02 a 103,3 a 86,74 a 92,75 a 76,49 a 80,47 a 75,38 a
TH 109,37 a 112,83 a 110,41a 105,73 a 98,98 a 89,00 a 86,07 a 79,13 a 74,35 a 68,30 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, comparando as variedades, para cada combinação de tempo e de Ethephon, não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade.
As análises da evolução da cor evidenciaram que a luminosidade (L) e a
cromaticidade (C) aumentaram linearmente com o tempo de armazenamento em
todas as combinações de variedades e concentrações de Ethephon (Figura 5), sendo
observadas diferenças entre as variedades no 3º, 6º e 9º dia de observação, com
valores de L superiores em frutos da variedade Santa Luzia e no 6º e 9º dia para os
valores de C (Quadro 4, Apêndice Quadro 4A). Também foram observadas
61
diferenças significativas com relação ao tratamento ou não com Ethephon
(Apêndice Quadro 4A) e maiores valores de L e C foram obtidos em frutos da
variedade Santa Luzia tratados com 1000 mg L-1 de Ethephon a partir do 3º dia de
observação (Quadro 5, Figura 5), quando estavam com 50 % da superfície do
pericarpo amarela.
Quadro 5 - Valores médios para as características perda de matéria fresca (PMF), luminosidade (L), cromaticidade (C), ângulo de cor (Hº), de acordo com o Ethephon (0 e 1000 mg L-1) em função das variedades Santa Luzia (SL) e Thais (TH) e do tempo (0, 3, 6, 9 e 12 dias)
0 3 6 9 12
SL TH SL TH SL TH SL TH SL TH
PMF 0 0 a 0 a 2,28 a 3,38 a 4,10 a 4,03 a 5,40 a 5,87 a 7,20 a 7,83
(%) 1000 0 a 0 a 2,63 a 2,31 a 4,66 a 4,30 a 7,40 a 6,28 a 11,06 b 8,12
L 0 39,37 a 38,55 a 41,72 b 40,79 a 43,28 b 46,18 a 48,52 b 50,60 a 55,05 b 55,96 a
1000 41,70 a 38,25 a 47,51 a 42,49 a 56,80 a 49,09 a 60,40 a 53,72 a 62,14 a 57,87 a
C 0 25,67 a 24,83 a 28,47 b 26,79 a 32,36 b 36,42 b 41,82 b 46,11 a 55,13 b 57,58 a
1000 28,96 a 24,17 a 37,29 a 30,07 a 54,22 a 44,66 a 63,49 a 53,79 a 66,78 a 63,85 a
Hº 0 111,80 a 109,37 a 111,67 b 110,41 a 103,31 b 98,98 b 92,75 a 86,07 a 80,47 a 74,35 a
1000 112,61 a 112,83 a 105,02 a 105,73 a 86,74 a 89,00 a 76,49 a 79,13 a 75,38 a 68,30 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, comparando os tratamentos com Ethephon, para cada combinação de tempo e variedade, não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade.
Frutos verdes de cubiu apresentaram menor luminosidade (em torno de 40)
e cromaticidade (próximo de 25), enquanto frutos com 12 dias de maturação pós-
colheita e com coloração amarelo-avermelhada apresentaram maior luminosidade
(próximo de 60) e cromaticidade (em torno de 60), sendo afetados pelo tratamento
com Ethephon, o qual antecipou a mudança de coloração, que também ocorreu nos
frutos não tratados, mas de forma mais lenta (Figura 5).
62
Figura 5 - Luminosidade (L) e Cromaticidade (C) de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
O ângulo de cor da casca (Hº) diminuiu de forma linear nos frutos de
ambas as variedades tratados com Ethephon. Entretanto, apresentou ajuste
quadrático naqueles não tratados com Ethephon durante o armazenamento pós-
colheita, com ponto máximo de 0,5 dias para a variedade Santa Luzia e de 1,3 dias
para a variedade Thais (Figura 6). Não foram observadas diferenças entre as
variedades (Quadro 4) e, de maneira geral, os maiores valores médios foram
observados em frutos não tratados com Ethephon, diferindo no 3º dia para a
30
40
50
60
70
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
L
--------
20
30
40
50
60
70
80
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
C
--------
99,06819,1195,38ˆ 24 =+= rxy 99,06819,1195,38ˆ 24 =+= rxy
99,04363,3691,224ˆ96,08374,2384,213ˆ
95,03947,3781,29ˆ
91,04090,2235,22ˆ
2
2
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
99,04363,3691,224ˆ96,08374,2384,213ˆ
95,03947,3781,29ˆ
91,04090,2235,22ˆ
2
2
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
98,04881,1489,37ˆ
94,07925,1955,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
23
22
21
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
98,04881,1489,37ˆ
94,07925,1955,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
23
22
21
=+=
=+=
= +=
rxy
rxy
rxy
30
40
50
60
70
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
L
30
40
50
60
70
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
L
--------
20
30
40
50
60
70
80
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
C
20
30
40
50
60
70
80
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
C
--------
99,06819,1195,38ˆ 24 =+= rxy 99,06819,1195,38ˆ 24 =+= rxy
99,04363,3691,224ˆ96,08374,2384,213ˆ
95,03947,3781,29ˆ
91,04090,2235,22ˆ
2
2
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
99,04363,3691,224ˆ96,08374,2384,213ˆ
95,03947,3781,29ˆ
91,04090,2235,22ˆ
2
2
22
21
=+=
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
rxy
98,04881,1489,37ˆ
94,07925,1955,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
23
22
21
=+=
=+=
=+=
rxy
rxy
rxy
98,04881,1489,37ˆ
94,07925,1955,42ˆ
93,02720,1954,37ˆ
23
22
21
=+=
=+=
= +=
rxy
rxy
rxySLC
SLE
THC
THE
SLC
SLE
THC
SLC
63
variedade Santa Luzia e no 6º dia de observação para ambas as variedades (Quadro
5).
Os primeiros frutos a mudar de coloração foram os tratados com Ethephon
a partir do 3º dia de armazenamento em ambas as variedades, intensificando-se no
6º dia de armazenamento, quando apresentaram de 75 a 100 % da superfície da
casca amarela (Hº com valores em torno de 90). Após 12 dias de amadurecimento
pós-colheita, os frutos tratados com Ethephon de ambas as variedades apresentaram
coloração amarelo-avermelhada.
Figura 6 - Ângulo de cor da casca de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1).
A aplicação de Ethephon promoveu poucas mudanças na qualidade interna
dos frutos de cubiu, porém foi eficiente na aceleração da mudança da cor da casca, o
que pode ser verificado pelos menores valores do ângulo de cor e maiores valores
da cromaticidade e luminosidade nos frutos tratados com 1000 mg L-1, mostrando
que o etileno promoveu a degradação da clorofila. Segundo Hernández et al. (2004),
a perda da cor verde dos frutos de cubiu é conseqüência da degradação da clorofila
e aparecimento de pigmentos como carotenos e xantofilas que se encontram
mascarados.
99,08548,31253,114ˆ
98,02145,05718,08526,110ˆ2
4
223
=-=
=--=
rxy
rxxy
99,08548,31253,114ˆ
98,02145,05718,08526,110ˆ2
4
223
=-=
=--=
rxy
rxxy
93,04334,38493,111ˆ
99,02102,01970,05313,112ˆ2
2
221
=-=
=--=
rxy
rxxy
93,04334,38493,111ˆ
99,02102,01970,05313,112ˆ2
2
221
=-=
=--=
rxy
rxxy
60
70
80
90
100
110
120
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Hº
60
70
80
90
100
110
120
0 3 6 9 12
Dias após a colheita
Hº
-------
93,04334 ,3849,111ˆ
99,021018,01970,0531,112ˆ2
2
221
=-=
=--=
rxy
rxxy
93,04334 ,3849,111ˆ
99,021018,01970,0531,112ˆ2
2
221
=-=
=--=
rxy
rxxy
99,08548,3125,114ˆ
98,021452,05718,0853,110ˆ2
4
223
=-=
=--=
rxy
rxxy
99,08548,3125,114ˆ
98,021452,05718,0853,110ˆ2
4
223
=-=
=--=
rxy
rxxy
SLC
SLE
THC
THE
64
De modo similar, Domingues et al. (2001) concluíram que a aplicação pós-
colheita de Ethephon (1000 mg L-1) em laranjas-doces precoces acelerou a mudança
de coloração da casca, sem, entretanto, alterar a qualidade interna dos frutos. A
diminuição significativa no teor de clorofila da casca foi verificada três dias após o
tratamento com Ethephon. A imersão rápida (10 segundos) dos frutos de abacaxi
‘Pérola’, logo após a colheita, em soluções de Ethephon, nas concentrações de 500 a
2.000 mg L-1 também determinou amarelecimento mais rápido e uniforme da casca
dos frutos, praticamente sem alterar a qualidade interna dos frutos (Santana et al.,
2004). Os autores sugerem que o Ethephon penetra muito superficialmente (poucos
milímetros) na casca do fruto, em grande parte não atingindo a sua polpa, além de
não promover a produção endógena de etileno no abacaxi.
A atividade respiratória pós-colheita do cubiu sofreu pequenas variações
até o 4º dia após a colheita, em ambas as variedades e tratamentos com Ethephon
(Figura 7). Neste período, não houve diferenças significativas entre as variedades
para cada combinação de tempo e Ethephon e tratamentos com Ethephon para cada
combinação de variedade e tempo, o mesmo ocorrendo com a liberação de etileno
pelo Ethephon (Quadro 6).
A partir do 5º dia observou-se rápido aumento na atividade respiratória em
todas as combinações de variedades e Ethephon (Figura 7), tendo os frutos da
variedade Santa Luzia e Thais tratados com Ethephon apresentado diferenças
significativas na taxa respiratória, o que se repetiu do 8º ao 10º dia após a colheita
(Quadro 6).
O padrão respiratório obtido concorda com estudos anteriores conduzidos
por Hernández et al. (2004) os quais sugerem que a curva de intensidade
respiratória do cubiu segue o padrão típico dos frutos não-climatéricos. Os autores
atribuíram os pequenos incrementos na liberação de CO2 ao início dos processos de
degradação do fruto, incrementos estes, de pequena magnitude (em torno de 2 mg
kg-1h-1) que ocorreram durante o 9º e 16º dia de armazenamento a 15 ºC e 80% de
umidade relativa.
65
Figura 7 - Taxa respiratória (CO2) e produção de etileno de frutos de cubiu durante o armazenamento por 12 dias. SLC = Santa Luzia controle; SLE = Santa Luzia com Ethephon (1000 mg L-1); THC = Thais controle; THE = Thais com Ethephon (1000 mg L-1). A seta indica o período onde os frutos apresentaram 100% de coloração amarela.
Os frutos de cubiu que receberam a aplicação de Ethephon apresentaram
pequenas variações não significativas (p>0,05) na produção de etileno até o 7º dia
(Figura 7, Quadro 6), porém após este período, frutos da variedade Santa Luzia
tratados com Ethephon exibiram aumento significativo na produção de etileno.
Porém, este aumento não parece estar relacionado ao climatério, pois coincidiu com
5
15
25
35
45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias após a colheita
CO 2
(mg
k-1
h-1)
5
15
25
35
45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias após a colheita
CO 2
(mg
k-1
h-1)
SLC
SLE
THC
THE
--------
SLC
SLE
THC
THE
--------
0
20
40
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias após a colheita
Etil
eno
(µL
kg
-1h
-1)
-------- SLC
SLE
THC
THE
66
o aparecimento de podridão na base dos frutos, causada por microrganismos, o qual
possivelmente acelerou o processo de senescência e degradação. A baixa ação do
etileno é mais uma evidência para a natureza não-climatérica dos frutos de cubiu.
Segundo Jacomino et al. (2003), altas concentrações de etileno, associadas
ao longo tempo de exposição, podem predispor os frutos à incidência de podridão,
conforme observado com frutos de limão siciliano. A aplicação de Ethephon pode
ter efeito tóxico sobre os frutos. Os danos físicos aceleram a perda de água,
conduzem à contaminação por fungos nas superfícies danificadas e aumentam a
taxa respiratória.
Embora frutos não-climatéricos apresentem baixa produção de etileno isso
não implica que não haja interferência do etileno sobre a maturação e alguns
aspectos como a diferenciação da cor da casca podem requerer etileno (Nath et al.,
2006). Goldschmidt (1997) afirma que o etileno, mesmo em baixa concentração em
frutos não-climatéricos, está envolvido em eventos associados à maturação, dentre
eles o aumento da atividade das clorofilases e conseqüente degradação da clorofila.
Frutos que apresentem pericarpo rígido como os de cubiu podem reduzir a
penetração de gases e a perda de água. Santana et al. (2004) verificaram que a
utilização do Ethephon acelerou o amarelecimento de frutos do abacaxi cv. Pérola,
sem afetar a firmeza da casca nem os principais atributos (firmeza, coloração,
translucidez, teores de sólidos solúveis totais e de acidez total e a relação entre esses
teores) da polpa. Para os autores, o Ethephon penetrou muito superficialmente
(poucos milímetros) na cutícula ou casca de fruto, em grande parte não atingindo a
sua polpa, além de não promover a produção endógena de etileno.
Os autores do referido trabalho também verificaram que o modo de
aplicação determinou efeitos significativos sobre alguns atributos dos frutos de
abacaxi. Os tratamentos por pulverização pré-colheita conferiram, em média, menor
firmeza à casca dos frutos aos cinco e onze dias de armazenamento, quando
comparados aos tratamentos por imersão rápida (10 segundos) dos frutos em
Ethephon (500 a 2000 mg L-1).
67
Quadro 6 - Valores médios obtidos para a taxa respiratória (C02) e produção de etileno de frutos de cubiu durante 12 dias de armazenamento em função do Ethephon (0 e 1000 mg L-1), das variedades Santa Luzia (SL) e Thais (TH) e do tempo (0 a 12 dias)
Tempo C02 (mg kg-1h-1) Etileno (µL kg-1h-1)
(dias) 0 1000 0 1000
0 SL 26,45 a A 22,74 a A 0,51 a A 0,52 a A
TH 20,55 a A 20,53 a A 0,51 a A 0,56 a A
1 SL 18,83 a A 21,87 a A 0,68 a A 5,71 a A
TH 18,80 a A 22,13 a A 0,59 a A 5,45 a A
2 SL 15,80 a A 20,10 a A 0,62 a A 2,99 a A
TH 16,93 a A 17,82 a A 0,52 a A 2,99 a A
3 SL 15,60 a A 17,11 a A 0,34 a A 2,11 a A
TH 15,92 a A 17,12 a A 0,21 a A 2,26 a A
4 SL 17,09 a A 21,21 a A 0,32 a A 2,71 a A
TH 16,98 a A 17,50 a A 0,28 a A 3,01 a A
5 SL 30,41 a B 36,71 a A 0,32 a A 4,58 a A
TH 30,21 a A 33,33 a A 0,31 a A 3,57 a A
6 SL 14,87 a A 19,09 a A 0,37 a A 4,83 a A
TH 13,67 a B 21,28 a A 0,34 a A 4,39 a A
7 SL 18,21 a A 19,35 a A 2,12 a A 11,14 a A
TH 10,88 b A 13,55 a A 0,88 a A 4,10 a A
8 SL 13,81 a B 23,25 a A 3,07 a B 28,09 a A
TH 16,39 a A 20,02 a A 3,32 a A 14,69 a A
9 SL 17,27 a B 32, 04 a A 3,03 a B 30,48 a A
TH 18,60 a A 21,09 b A 6,27 a A 18,51 a A
10 SL 18,40 a B 28,05 a A 7,80 a B 45,80 a A
TH 18,89 a A 18,46 b A 19,00 a A 23,40 a A
11 SL 19,53 a A 24,05 a A 12,96 a B 61,12 a A
TH 19,17 a A 15,83 b A 31,73 a A 28,30 b A
12 SL 17,77 b A 19,26 a A 13,37 a B 83,78 a A
TH 24,20 a A 18,18 a B 35,58 a A 30,53 b A
Médias seguidas da mesma letra minúscula, na coluna, e maiúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade.
68
O modo de aplicação do Ethephon por aspersão e com tempo reduzido de
exposição pode ter influenciado nas respostas dos frutos de cubiu. Novos estudos
aumentando o tempo e forma de exposição e/ou o número de aplicações podem
auxiliar na elucidação e comprovação destes resultados.
69
4. CONCLUSÕES
A variedade Santa Luzia apresentou maior firmeza no período inicial após
a colheita, evidenciando que a mesma resiste mais ao transporte.
A pulverização dos frutos de cubiu com 1000 mg L-1 de Ethephon
promoveu alterações na cor da casca dos frutos não alterando a intensidade
respiratória e a produção de etileno, havendo somente diminuição do ângulo de cor
e aumento da cromaticidade e da luminosidade, confirmando a fisiologia de
amadurecimento não-climatérica.
Em função da pequena alteração da qualidade interna durante o
amadurecimento pós-colheita, os frutos podem ser colhidos no estádio verde-
maduro e utilizados na agroindústria.
70
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
CAPÍTULO II
Indução de embriogênese somática em cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal):
efeito da fonte de explante e de substâncias reguladoras de crescimento
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de reguladores de crescimento
e fontes de explante sobre a morfogênese in vitro de S. sessiliflorum Dunal,
buscando o estabelecimento de um protocolo para a embriogênese somática da
espécie. Como explantes, foram utilizados hipocótilos e cotilédones obtidos de
plântulas germinadas in vitro, bem como embriões zigóticos imaturos. O meio de
cultura utilizado foi o MS suplementado com diferentes combinações de ácido
naftalenoacético (ANA), ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), Kinetina (KIN),
Thidiazuron (TDZ) e o cultivo inicial dos explantes ocorreu na ausência de luz. A
formação de calos iniciou uma semana após a inoculação em todos os explantes.
Após 30 dias de cultivo, o percentual de explantes cotiledonares e de hipocótilo
com calos foi o mesmo (100%) para todas a concentrações de ANA testadas (5; 10 e
20 mg L-1), independentemente da suplementação ou não do meio de cultura com
KIN (1 mg L-1). Intensa proliferação de calos também foi verificada sobre
cotilédones cultivados na presença de 2,4-D (0,5; 1; 2 e 4 mg L-1) combinado com
TDZ (0,125; 0,25; 0,5; 1 e 2 mg L-1) e hipocótilos na presença de 2,4-D (5; 10 e 20
mg L-1) e sacarose (15; 30 e 45 g L-1). Mesmo após alguns subcultivos dos calos em
meio isento de reguladores de crescimento, não ocorreu a indução da rota
embriogenética. Por outro lado, diretamente sobre os cotilédones de embriões
zigóticos imaturos cultivados em meio de cultura MS suplementado com 5 e 10 mg
L-1 de 2,4-D foram observadas estruturas semelhantes a embriões somáticos em
diferentes estádios de desenvolvimento. Pela análise anatômica, detectou-se
estruturas independentes, com sistema vascular fechado, evidenciando tratar-se de
embriões somáticos. Na superfície desses embriões, formaram-se calos com células
que apresentaram forte reação ao carmim acético e que, após subcultivo em meio
isento de reguladores de crescimento, originaram complexos ou massas celulares
76
pró-embriogênicas. Estes complexos eram regiões de aparência friável, que sob
condições adequadas desenvolveram embriões em sua superfície. O isolamento
dessas regiões e transferência para meio de cultura MS sem reguladores de
crescimento permitiu o avanço dos pró-embriões para o estádio globular e
cordiforme. Apesar do baixo número de regenerantes e da produção assincrônica de
embriões somáticos, foi possível a indução da rota embriogenética para a espécie.
77
Somatic embryogenesis in cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal): effect
of explant sources and growth regulators
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of growth regulators
and explant sources on in vitro morphogenesis of S. sessiliflorum Dunal in order to
develop a protocol for somatic embryogenesis in the species. Hypocotyl and
cotyledon explants from in vitro germinated seedlings and immature zygotic
embryos were plated on MS medium supplemented with different combinations of
naphthaleneacetic acid (NAA), dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), Kinetin (KIN)
and Thidiazuron (TDZ), in the dark. Callus formation started in all tested explants a
week post inoculation. After 30 days, the percentage of cotyledon and hypocotyl
explants with callus was the same (100%) for all the tested NAA concentrations (5;
10 and 20 mg L-1), independently of supplementing the culture medium with KIN (1
mg L-1). Intense callus proliferation was also found in cotyledons cultured in 2,4-D
(0,5; 1; 2 and 4 mg L-1) combined with TDZ (0,125; 0,25; 0,5; 1 and 2 mg L-1), and
hypocotyls in 2,4-D (5; 10 and 20 mg L-1) and sucrose (15; 30 and 45 g L-1). Even
after several callus subcultures in growth regulator-free medium, the embryogenic
pathway could not be induced. However, embryo-like structures at various
developmental stages were found directly on cotyledons of immature zygotic
embryos growing on MS medium supplemented with 5 and 10 mg L-1 2,4-D.
Histological studies confirmed that these structures were independent with no
vascular connections with the parent tissues. New callus formation with cells
showing strong reaction to carmine acetic were found on these explantss, which
after subculture in growth regulator-free medium originated pro-embryogenic
clusters or masses. These clusters were regions of friable appearance that under
appropriate conditions developed embryos on their surfaces. The isolation of these
regions and transfer to MS medium without growth regulators allowed the
differentiation of pro-embryonic masses into globular and heart-shaped embryos.
78
Results have shown that despite the low regeneration and asynchronous production,
induction of somatic embryogenesis is possible for S. sessiliflorum Dunal.
79
1. INTRODUÇÃO
O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma solanácea nativa da
Amazônia que possui potencialidades para a agroindústria e elevada produtividade
de frutos (Silva Filho, 1998), os quais podem ser consumidos in natura, utilizados
no preparo de diversos alimentos (Silva Filho, 2002), como fitoterápicos (Silva
Filho et al., 2003) e, também, na fabricação de cosméticos (Silva Filho, 1998).
Apesar de ser de fácil cultivo no seu ambiente de origem, a germinação é
desuniforme e as sementes perdem sua viabilidade com extrema rapidez (Silva
Filho et al., 2005). Considerando-se estas dificuldades, torna-se fundamental o
desenvolvimento de estratégias alternativas, que tenham como propósito a
propagação clonal em larga escala de genótipos superiores quanto às qualidades
agronômicas, além de servir para proteger o germoplasma existente. Neste sentido,
diversas estratégias biotecnológicas têm se constituído em novas ferramentas
incluindo a cultura de células e tecidos vegetais e, mais recentemente, a engenharia
genética (Oksman-Caldentey e Inzé, 2004).
A aplicação dessas técnicas depende de fatores associados à indução e ao
controle da morfogênese em duas rotas de regeneração: a organogênese e a
embriogênese somática (Santos, 2003). A organogênese refere-se à formação de
estruturas monopolares como raízes, folhas, brotos a partir de explantes ou de calos
cultivados in vitro (Andrade, 2002). A embriogênese somática é o processo por
meio do qual células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão
origem a estruturas embrionárias bipolares, sem conexão vascular com o tecido
materno (von Arnold et al., 2002), num processo morfogenético que se aproxima da
seqüência de eventos representativos da embriogênese zigótica (Vicient e Martínez,
1998).
A embriogênese somática constitui uma importante ferramenta para a
propagação clonal em larga escala, além de ser um método importante para a
transformação genética, produção de sementes sintéticas e estudos básicos de
fisiologia (Guerra et al., 1999; Vicient e Martínez, 1998; Jiménez, 2005). A
produção de plantas a partir de embriões formados in vitro, a alta fidelidade
80
genética das plantas e a elevada taxa de multiplicação tornam este modelo
morfogenético superior ao processo de regeneração via organogênese (Parrot et al.,
1991; Merkle, 1995).
Protocolos de regeneração in vitro via organogênese para esta espécie já
foram testados (Hendrix et al., 1987; Cordeiro e Mattos, 1991; Boufleuher et al.,
2008), porém com baixo número de plantas regeneradas. Uma alternativa para a
produção em larga escala de plantas e estudos básicos de fisiologia é a regeneração
via embriogênese somática. Entretanto, não há relatos da obtenção de plantas por
essa via para o cubiu, apesar das tentativas realizadas por Viganó (2006) e Viganó
et al. (2007).
Os referidos autores investigaram o efeito de ANA e 2,4-D e diferentes
fontes de explantes na indução de respostas morfogenéticas in vitro para a espécie.
Na presença de baixas concentrações destes reguladores, bem como na sua ausência
houve intensa formação de raízes sobre os explantes (folhas cotiledonares,
hipocótilo e folhas jovens) e em concentrações superiores ocorreu a indução de
calos sobre os explantes. Os calos produzidos eram branco-translúcidos, com
aspecto friável, porém não ocorreu a indução da rota embriogenética. A interação
com citocininas e outras fontes de explantes como embriões zigóticos não foram
testadas.
A formação de embriões somáticos depende de diversos fatores, dentre os
quais destacam-se o genótipo da planta, os explantes utilizados e o tipo, a
concentração e o tempo de exposição aos reguladores de crescimento adicionados
ao meio nutritivo (George, 1993; Jiménez, 2005). Dentre os reguladores de
crescimento, as auxinas são consideradas essenciais na indução do processo de
embriogênese somática (Fehér et al., 2002), pois são responsáveis pelo
estabelecimento da polaridade celular, essencial para a formação dos embriões
(Parrot et al., 1991).
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de reguladores de
crescimento e de fontes de explantes sobre a morfogênese in vitro de S.
sessiliflorum Dunal, buscando o estabelecimento de um protocolo para a
embriogênese somática da espécie.
81
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material vegetal e condições de cultivo
Os testes laboratoriais foram conduzidos no Laboratório de Biotecnologia e
Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Paranaense, Campus Toledo, Toledo,
PR.
Hipocótilos e cotilédones excisados de plântulas, bem como embriões
zigóticos imaturos (EZ) de S. sessiliflorum variedade Santa Luzia foram utilizados
como explantes.
Os hipocótilos e os cotilédones foram obtidos de plântulas resultantes da
germinação de sementes in vitro em meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962)
com metade da concentração de sais, sacarose (30 g L-1), agar (6,5 g L-1) e com 20
dias de cultivo.
Os EZ foram extraídos de sementes de plantas matrizes coletadas de frutos
verdes (em torno de 80 dias após a antese). Os frutos foram inicialmente lavados em
água corrente e, em seguida, manipulados em câmara de fluxo laminar, onde foram
desinfestados com solução de álcool 70% por 2 minutos e hipoclorito de sódio
(NaOCl) 1% por 20 minutos, sendo então lavados por três vezes em água destilada
e autoclavada. A extração dos EZ foi realizada com o auxílio de bisturi e a
visualização em estereomicroscópio.
Todos os explantes foram inoculados em placas de Petri (100 x 15 mm)
contendo 20 mL de meio de cultura basal. As culturas foram mantidas em sala de
crescimento, na ausência de luz, com temperatura de 25 ± 2 ºC. Para os subcultivos
que foram realizados na presença de luz, utilizou-se fotoperíodo de 16 horas, com
irradiância de aproximadamente 40 µmol m-2 s-1.
O meio de cultura basal utilizado foi baseado na formulação salina e
vitaminas do meio MS, suplementado com sacarose (30 g L-1) e agar (6,5 g L-1). O
pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem.
82
2.2. Determinação do efeito de reguladores de crescimento sobre hipocótilos e/ou cotilédones
a. Experimento com ANA e KIN
Segmentos de hipocótilo (1 cm) e cotilédones inteiros foram seccionados
com bisturi de plântulas obtidas de sementes germinadas in vitro e inoculados, em
posição horizontal, em placas de Petri contendo meio de cultura basal MS
suplementado com ANA (0; 5; 10 e 20 mg L-1) e KIN (0 e 1 mg L-1).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, consistindo
num fatorial (duas fontes de explantes e oito combinações de reguladores),
totalizando 16 tratamentos, com três repetições por tratamento. A unidade
experimental consistiu de uma placa de Petri com 10 explantes, totalizando 30
explantes por tratamento.
A avaliação da percentagem de explantes com indução de calos, aspecto
dos calos (textura e coloração), formação de raízes e presença de estruturas
embriogênicas foi realizada após 30 dias e 60 dias. Após este período, os calos
passaram por dois subcultivos, cada um de 30 dias, em meio de cultura basal isento
de reguladores, sendo metade deles mantidos no escuro e metade transferidos para
fotoperíodo de 16 horas de luz, realizando-se avaliações visuais do desenvolvimento.
b. Experimento com 2,4-D e TDZ
Segmentos de hipocótilo (1 cm) obtidos de plântulas foram inoculados, em
posição horizontal, em placas de Petri contendo meio de cultura basal MS
suplementado com cinco concentrações de 2,4-D (0; 0,5; 1; 2 e 4 mg L-1) e seis
concentrações de TDZ (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 e 2 mg L-1), totalizando 30
tratamentos.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com trinta (30)
tratamentos e quatro repetições por tratamento. A unidade experimental consistiu de
uma placa de Petri com 10 explantes, totalizando 40 explantes por tratamento.
A avaliação do experimento foi realizada após 30 dias, avaliando-se a
percentagem de explantes com calos, raízes, aspecto dos calos (textura e coloração)
e a presença de estruturas embriogênicas.
83
Os calos originados em hipocótilos foram transferidos para três meios de
cultura distintos, mantendo o meio basal MS completo, sendo um deles o mesmo
meio de indução, outro com metade da concentração de reguladores e o outro o
meio MS destituído de reguladores de crescimento. As culturas permaneceram no
escuro por 30 dias quando foram realizadas novas observações. Após este período,
todos os calos foram transferidos para o meio de cultura basal destituído de
reguladores de crescimento, permanecendo no escuro e sendo avaliados após 30 e
60 dias.
c. Experimento com 2,4-D e sacarose
Segmentos de hipocótilo (1 cm e ± 0,16g) foram seccionados de plântulas e
inoculados, em posição horizontal, em placas de Petri contendo meio de cultura MS
suplementado com cinco concentrações de 2,4-D (0; 2,5; 5; 10 e 20 mg L-1) e três
concentrações de sacarose (15; 30 e 45 g L-1), totalizando 15 tratamentos.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 15
tratamentos e quatro repetições por tratamento. A unidade experimental consistiu de
uma placa de Petri com 10 explantes, totalizando 40 explantes por tratamento
mantidos no escuro.
A avaliação do experimento foi realizada após 30 dias, avaliando-se a
percentagem de explantes com indução de calos, raízes, massa fresca de calos e
presença de estruturas embriogênicas.
Após 30 dias, os calos regenerados foram subcultivados no mesmo meio de
cultura, onde permaneceram 60 dias no escuro, quando foram novamente avaliados.
2.3. Determinação do efeito de reguladores de crescimento sobre embriões
zigóticos
a. Experimento com ANA e KIN
Embriões zigóticos foram utilizados como explantes para avaliar o efeito de
diferentes níveis de ANA e KIN na indução a embriogênese somática.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, testando-se a
adição do ANA (0; 2,5; 5 e 10 mg L-1) combinado com KIN (0 e 1 mg L-1) ao meio
84
de cultura basal, acrescido de caseína hidrolisada (100 mg L-1), totalizando oito
tratamentos. Cada unidade experimental foi constituída de dez EZ dispostos em
uma placa de Petri, com quatro repetições.
Os dados referentes à percentagem de explantes com calos, presença de
raízes e presença de estruturas embriogênicas foram coletados por um período de 30
e 60 dias após a inoculação. Decorridos 60 dias de cultivo, os materiais foram
transferidos para o meio de cultura MS isento de reguladores de crescimento onde
permaneceram por 30 dias, sendo novamente avaliados.
b. Experimento com 2,4-D e KIN
Embriões zigóticos foram utilizados para avaliar o efeito de diferentes
níveis de 2,4-D e KIN na indução a embriogênese somática.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, testando-se a
adição do 2,4-D (0; 2,5; 5 e 10 mg L-1) combinado com KIN (0 e 0,1 mg L-1) ao
meio de cultura basal acrescidor de caseína hidrolisada (100 mg L-1), totalizando
oito tratamentos. Cada unidade experimental foi constituída de dez EZ dispostos em
uma placa de Petri, com quatro repetições.
Os dados referentes à percentagem de explantes com calos, formação de
raízes, porcentagem de explantes com embriões somáticos (ES) e número de ES por
rexplante foram coletados por um período de 30, 45, 60 e 75 dias após a inoculação.
Após este período, os materiais foram transferidos para o meio de cultura MS isento
de reguladores de crescimento onde permaneceram por mais 90 dias, em condições
de luminosidade, sendo subcultivados a cada 30 dias quando eram realizadas
avaliações visuais do desenvolvimento.
2.4. Avaliações citoquímicas e estruturais
As células dos calos foram caracterizadas por meio de análises
citoquímicas. Para isto, utilizou-se a dupla coloração com azul de Evans (0,1%) e
carmim acético (2%) (Durzan, 1988). Em microscópio óptico foram observados e
identificados os aspectos relevantes, realizando-se o registro fotográfico.
85
2.5. Análise anatômica
Os estudos anatômicos foram realizados no Laboratório de Botânica do
Departamento de Biologia da UEM, utilizando-se material fixado. Com o intuito de
confirmar a expressão embriogenética, após 45 dias de cultivo no meio de indução
com 2,4-D, os materiais representativos foram fixados em solução de F.A.A. 50
(Johansen, 1940) e sua conservação feita em etanol 70% (Jensen, 1962). Esses
materiais foram destinados à preparação de lâminas permanentes, sendo incluídos
em 2-hidroxietilmeta-acrilato (historresina-Leica), segundo a técnica de Gerrits
(1991) e as indicações do fabricante.
Os blocos foram seccionados em micrótomo de rotação com 7 a 10 µm de
espessura e corados com azul de toluidina (O'Brien et al., 1964). As lâminas foram
montadas com resina sintética (Permount). As fotomicrografias foram obtidas em
microscópio fotônico Olympus BX50, com auxílio de câmera digital Canon Power
Shot A95 e captura de imagem pelo programa Zoom Browser EX.
2.6. Análise estatística
Os dados referentes à fonte de explantes e reguladores de crecimento foram
avaliados por meio de estatística descritiva, utilizando os valores da média e do
desvio padrão.
86
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Efeito de reguladores de crescimento sobre hipocótilos e/ou cotilédones
a. Experimento com ANA e KIN
A formação de calos iniciou uma semana após a inoculação em ambos os
explantes testados, sendo visualizada, inicialmente, nas regiões seccionadas. Na
avaliação realizada aos 30 dias após a inoculação, 100% dos explantes (hipocótilos
e cotilédones) de todos os tratamentos formaram calos, com exceção dos
tratamentos sem suplementação com reguladores de crescimento, onde não ocorreu
a formação de calos. O percentual de explantes com calos foi o mesmo (100%) para
todas as concentrações de ANA testadas (5; 10 e 20 mg L-1), independentemente da
suplementação ou não do meio de cultura com KIN (1 mg L-1). Na avaliação
realizada aos 60 dias, verificou-se a formação de calos também sobre 40% dos
explantes cultivados em meio de cultura suplementada apenas com ANA.
Nos hipocótilos, os calos formaram-se sobre toda a superfície (Figura 1a),
ocorrendo também o surgimento de pequenas raízes adventícias sobre os explantes
(Figura 1b) e aumento do percentual de explantes com raízes com o tempo de
cultivo (Quadro 1). Os calos obtidos apresentaram aspecto semifriável-filamentoso,
com coloração amarelo-pálida.
Na maior parte dos explantes cotiledonares também ocorreu a calogênese
sobre toda a superfície dos mesmos após 30 dias de cultivo in vitro (Figura 1c).
Dois tipos de calos formaram-se sobre os explantes: um semifriável branco-
amarelado, porém com aspecto filamentoso e outro semicompacto, com a mesma
coloração, formado próximo à região seccionada, composto por agrupamentos de
células menores, aparentemente mais organizadas. Ocorreu intensa proliferação de
raízes nos explantes cotiledonares (Figura 1d), inoculados em meio de cultura isento
de reguladores de crescimento, atingindo 100% dos explantes aos 60 dias de cultivo
(Quadro 1).
87
Quadro 1 - Percentual médio de explantes com indução de raízes a partir de hipocótilos (HIP) e cotilédones (COT) de S. sessiliflorum Dunal cultivados em meio MS suplementado com ANA (0; 5; 10 e 20 mg L-1) e KIN (0 e 1 mg L-1) aos 30 e 60 dias após a inoculação
SEM KIN COM KIN ANA (mg L-1) ANA (mg L-1)
0 5 10 20 0 5 10 20 HIP 30 33,3±5,8 13,3± 5,8 10 16,7± 5,8 10 ± 0 10 ± 0 23,3±11,5 23,3±20,8 60 33,3±5,8 30 ± 10 56,7±5,8 60 ± 10 23,3±15,5 26,7±11,5 46,7±30,6 56,7±15,3
COT 30 83,3±28,9 10 0 0 6,7 ± 5,8 3,3±5,8 0 0 60 100 16,67 ±5,8 0 0 20 ± 0 20±17,3 0 0
a b
SF
c d
SC
Figura 1 - Respostas morfogenéticas de S. sessiliflorum após 30 dias: a) formação de calo em hipocótilo (10 mg L-1 de ANA); b) formação de calo e raiz (seta) em hipocótilo (5 mg L-1 de ANA); c) calo semifriável (SF) e calo semicompacto (SC) em cotilédone; d) raízes formadas na região do pecíolo da folha cotiledonar em meio de cultura isento de reguladores. Barra: 2,5mm.
88
Com a elevação nas concentrações do ANA, verificou-se aumento no
percentual de raízes formadas sobre os hipocótilos. Sobre os explantes cotiledonares
a rizogênese ocorreu em meios de cultura isentos de reguladores de crescimento ou
suplementados com 5 mg L-1 de ANA e foi ausente quando suplementados com 10
e 20 mg L-1 de ANA (Quadro 1). A elevada rizogênese na ausência de reguladores
indica que esses materiais possuem elevado conteúdo endógeno de auxinas, as quais
são responsáveis pela indução de raízes (Taiz e Zeiger, 2004).
Ao se subcultivar os calos provenientes de ambos os explantes em meio de
cultura isento de reguladores de crescimento e transferí-los para condições de luz,
ocorreu escurecimento gradual destes, não havendo crescimento dos mesmos ou
diferenciação de embriões. Os calos subcultivados no escuro apresentaram menor
escurecimento, mantendo a mesma textura, não sendo observadas estruturas
embriogênicas visíveis sobre nenhum deles. Isto é um indicativo da sensibilidade
desses materiais a luz, com provável liberação de compostos fenólicos (Grattapaglia
e Machado, 1998).
Os resultados obtidos com esse experimento diferem dos relatados por
Picoli et al. (2000) que induziram a formação de embriões somáticos sobre
cotilédones de berinjela (Solanum melongera) cultivados em meio de cultura MS
suplementado com diferentes concentrações de ANA (2,5; 5,0; 7,5 e 10 mg L-1). Os
autores também verificaram que a calogênese diminuiu linearmente com a
concentração de ANA, porém a indução da rota embriogenética ocorreu em todos os
tratamentos.
O efeito de auxinas (ANA, 2,4-D) e citocininas (BAP e KIN) na
regeneração in vitro de Solanum tuberosum, a partir de explantes foliares, foi
investigada por Shirin et al. (2007). Os autores verificaram que a maior
percentagem de explantes com calos (30%) foi obtida na presença de 1,5 mg L-1 de
ANA e 1 mg L-1 de BAP e que o 2,4-D (3 mg L-1) foi mais eficiente na indução de
calos que posteriormente induziram a rota organogenética.
b. Experimento com 2,4-D e TDZ
89
Quando se avaliou o efeito do 2,4-D e do TDZ na regeneração a partir de
hipocótilos, foi verificado que a proliferação de calos apresentou percentual variável
e superior a 50% sobre os explantes cultivados em meio de cultura MS na ausência
de 2,4-D e na presença de diferentes concentrações de TDZ após 30 dias de cultivo
in vitro (Quadro 2). Os calos apresentaram-se semifriáveis, porém mais translúcidos
e de aspecto aquoso quando comparados aos formados sobre hipocótilos e
cotilédones cultivados na presença do ANA e descritos anteriormente.
Quadro 2 – Percentual médio de explantes que induziram calos a partir de hipocótilos de S. sessiliflorum, cultivados em meio MS suplementado com 2,4-D (0; 0,5; 1 e 2 mg L-1) e TDZ (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 e 2 mg L-1) após 30 dias de cultivo
TDZ (mg L-1)
0 0,125 0,25 0,5 1 2
0 0 78,25±6,5 66± 15,9 53,5±27,89 50,25±10,21 65,75±11,93
0,5 100 100 100 100 100 100
1 100 100 100 100 100 100
2 100 100 100 100 100 100
2,4-D
(mg L-1)
4 100 100 100 100 100 100
Nas menores concentrações de TDZ (0,125; 0,25 e 0,5 mg L-1) e na ausência
de 2,4-D além da formação de alôs também ocorreu a formação de brotações
adventícias nas extremidades dos explantes via organogênese direta (Figura 2a). Os
resultados obtidos diferem dos relatados por Furtado et al. (2007) onde apenas calos
foram induzidos sobre hipocótilo de Arachis hipogaea, não ocorrendo a formação
de brotos na presença de TDZ.
Na presença de 2,4-D, independente da concentração testada e da
suplementação ou não com diferentes concentrações de TDZ, foi observada a
formação de calos sobre 100% dos explantes (Quadro 2), tanto na extremidade
(Figura 2b) quanto sobre todo o explante (Figura 2c). Nos tratamentos com maiores
concentrações de 2,4-D (2 e 4 mg L-1), os calos eram compactos, com formato
arredondado, surgindo na superfície dos hipocótilos (Figura 2d, 2e).
90
A percentagem de explantes, no qual ocorreu a indução de raízes
adventícias, variou, porém na maior parte dos tratamentos foi baixa, exceto nos
explantes cultivados na ausência de reguladores (Quadro 3). Neste período, não foi
observada a presença de estruturas embriogênicas sobre os explantes.
Quadro 3 – Porcentual médio de explantes onde ocorreu a indução de raízes a partir de hipocótilos de S. sessiliflorum, cultivados em meio MS suplementado com 2,4-D (0; 0,5; 1; 2 e 4 mg L-1) e TDZ (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1 e 2 mg L-1) após 30 dias de cultivo
TDZ (mg L-1)
0 0,125 0,25 0,5 1 2
0 70,75±35,3 0 0 3,25±6,5 0 3,25±6,5
0,5 9,5±19 56,75±23,93 22±21,27 9,5±12,01 0 0
1 6,25±12,5 31,75±37,5 6,5±7,5 22±15,89 3,25±6,5 0
2 0 25,25±22,82 22,25±18,94 3,25±6,5 3,25±6,5 0
2,4-D
(mg L-1)
4 0 3,25±6,5 0 9,5±19 0 6,25±12,5
A manutenção nos meios de cultura da mesma concentração de TDZ (na
ausência de 2,4-D) durante o subcultivo levou as brotações a apresentarem
malformações. Por outro lado, a sua redução à metade ou sua retirada do meio de
cultura permitiu a proliferação e o alongamento das brotações (Figura 2 f).
A transferência dos calos regenerados nos demais tratamentos indutores,
com diferentes combinações de 2,4-D e TDZ para meios de cultura de subcultivo
com a mesma concentração de reguladores de crescimento, sua redução ou sua
ausência, primeiramente, na obscuridade (30 dias) e, posteriormente, em condições
de luminosidade (60 dias) permitiu que os mesmos proliferassem, porém não
ocorreu a indução da rota embriogenética.
91
Figura 2 - Respostas morfogenéticas in vitro de hipocótilos: a) formação de brotos (0,125 mg L-1 TDZ); b) calos semifriáveis nas extremidades (0,5 mg L-1 2,4-D); c) calos semifriáveis sobre o explante (0,5 mg L-1 2,4-D + 0,5 mg L-1 TDZ); d) calos compactos (4 mg L-1 2,4-D); e) calos compactos (4 mg L-1 2,4-D + 2 mg L-1 TDZ); f) brotações formadas após 60 dias de cultivo (0,125 mg L-1 de TDZ). Barra: 0,25 mm.
a b
c d
e f
92
Nas condições experimentais aqui testadas não ocorreu a indução da rota
embriogenética na presença TDZ. Os resultados obtidos nesse trabalho não
concordam com o que foi relatado por Panaia et al. (2004) e Jiménez (2005),
segundo os quais o TDZ está sendo considerado uma alternativa na regeneração de
embriões diretamente sobre explantes com tecidos diferenciados.
Entretanto, o cultivo dos explantes na presença de TDZ levou à formação
de brotações, o que concorda com os relatos de Huetteman e Preece (1993),
segundo os quais o TDZ é uma potente citocinina que pode estimular a formação de
calos e brotos adventícios. Segundo Cid (2000), as citocininas são fundamentais na
multibrotação de gemas axilares ou apicais de plantas lenhosas ou herbáceas, sendo
o TDZ bastante efetivo neste propósito. Segundo Howell et al. (2003), citocininas
como o TDZ promovem o aumento das divisões celulares e o desenvolvimento de
brotos.
c. Experimento com 2,4-D e sacarose
O percentual de calos formados sobre explantes de hipocótilos cultivados
em meio de cultura suplementado com concentrações de 2,4-D superiores (5; 10 e
20 mg L-1) as testadas anteriormente em combinação com diferentes concentrações
de sacarose (15; 30 e 45 g L-1) é apresentado na Quadro 4. Com exceção do
tratamento com ausência do 2,4-D, no qual não houve proliferação de calos, nos
demais tratamentos mais de 90% dos explantes formaram calos. Não foi observada
a formação de raízes sobre os explantes.
Quadro 4 - Percentual médio de explantes com indução de calos a partir de hipocótilos de S. sessiliflorum cultivados em meio MS suplementado com 2,4-D (0; 2,5; 5;10 e 20 mg L-1) e sacarose (15; 30 e 45 g L-1) após 30 dias de cultivo 2,4-D (mg L-1)
0 2,5 5 10 20
Sacarose 15 0 93,3 ± 5,77 92,5 ± 5 97,5 ± 5 95 ± 10
(g L-1) 30 0 100 96,7 ± 5,77 97,5 ± 5 97,5 ± 5
45 0 97,5 ± 5 92,5 ± 9,57 95 ± 10 100
93
Com relação ao incremento da massa fresca dos calos in vitro, os maiores
valores foram obtidos quando os hipocótilos foram cultivados em meio de cultura
MS, suplementado com 30 g L-1 de sacarose na presença de 2,5 e 5 mg L-1 de 2,4-D
(Quadro 5). Os menores valores foram alcançados no tratamento com 20 mg L-1 de
2,4-D. Mesmo após dois subcultivos de 30 dias no mesmo meio de cultura de
indução, não ocorreu a indução da rota embriogenética.
Esses resultados corroboram com os relatados por Sousa et al. (2007) nos
quais observou-se que, com o incremento da concentração de sacarose no meio de
cultura, houve tendência de redução no acúmulo de massa fresca nos calos
formados sobre explantes de segmento nodal de Catharanthus roseus (L.) Don,
independente do balanço dos reguladores de crescimento (BAP e AIB).
Quadro 5 – Massa fresca de calos regenerados a partir de hipocótilos de S. sessiliflorum cultivados em meio MS suplementado com 2,4-D (0; 2,5; 5; 10 e 20 mg L-1) e sacarose (15; 30 e 45 g L-1) após 30 dias de cultivo. Massa do hipocótilo na inoculação: ± 0,16g
2,4-D (mg L-1)
0 2,5 5 10 20
Sacarose 15 - 0,96 ± 0,27 0,98 ± 0,46 0,95 ± 0,17 0,5 ± 0,03
(g L-1) 30 - 1,54 ± 0,19 1,8 ± 0,13 1,02 ± 0,28 0,48 ± 0,07
45 - 1,41 ± 0,37 1,07 ± 0,14 0,89 ± 0,31 0,64 ± 0,07
No presente trabalho, o aumento da concentração de sacarose no meio de
cultura não levou à indução de embriões sobre os explantes. Porém, tem sido relado
que a concentração de sacarose influencia nos processos de iniciação e
diferenciação dos embriões somáticos em algumas espécies. Sabe-se também que a
sacarose, utilizada nos meios de cultura como fonte de carbono, funciona como um
agente osmótico, influenciando no desenvolvimento de embriões somáticos. O
aumento da osmolaridade parece estar relacionado com a transição do ciclo
celular/diferenciação (Guerra et al., 1999). Alguns autores relatam que, assim como
os hormônios, os açúcares são essenciais durante o processo da diferenciação
celular (Paiva Neto e Otoni, 2003) e há evidencias de que haja uma sinalização
94
específica pela sacarose durante a transcrição e tradução de mRNA em plantas,
incluindo a indução de genes, produção de proteínas, expressão e repressão de
genes (Coruzzi e Zhou, 2001).
3.2. Efeito de reguladores de crescimento sobre embriões zigóticos
a. Experimento com ANA e KIN
Os EZ imaturos inoculados em meio de cultura MS sem a suplementação
de ANA, independentemente da concentração de KIN, germinaram e formaram
plântulas completas a partir do 5º dia de cultivo, não ocorrendo proliferação de
calos no período de avaliação (Quadro 6).
A formação de calos ocorreu por volta do 7º dia de cultivo, principalmente
na região do eixo hipocótilo-radicular, sendo manifestada após a abertura dos
cotilédones e um pequeno alongamento do hipocótilo.
Quadro 6 – Porcentual médio de indução de calos a partir de EZ de S. sessiliflorum Dunal cultivados em meio MS suplementado com ANA (0; 5; 10 e 20 mg L-1) e KIN (0 e 1 mg L-1) 30 dias após a inoculação ANA (mg L-1)
0 5 10 20
0 0 85 ± 5,77 72,5 ± 9,57 47,5 ± 9,57
KIN
(mg L-1) 1 0 47,5 ± 9,57 50 ± 8,16 75 ± 5,77
O percentual médio de indução de calos a partir de EZ variou em função
das concentrações de KIN e ANA. Com o aumento das concentrações de ANA e na
ausência de KIN, ocorreu diminuição da proliferação de calos. O inverso foi
constatado na presença de 1 mg L-1 de KIN onde foi observado aumento na
proporção de calos formados (Quadro 6). Isso revela que a presença de KIN exerce
influência no crescimento de tecido caloso em explantes de cubiu.
Na maior parte dos explantes, a formação de calos in vitro ocorre apenas na
presença de auxinas. As auxinas são capazes de iniciar a divisão celular e controlar
os processos de crescimento e alongamento celular (George, 1993). Porém, em
95
algumas espécies, a formação de calos é influenciada também pelas citocininas (Lu,
1993). Gamborg (1982) citado por Brunetta et al. (2006) relatou que é possível o
estabelecimento de uma cultura de calo a partir de qualquer planta e da maioria de
suas partes, empregando um meio nutritivo, acrescido de auxinas e citocininas.
Os calos formados apresentavam coloração esbranquiçada e aspecto
esponjoso, porém, mesmo após o subcultivo de 30 dias em meio isento de
reguladores, não ocorreu a indução da rota embriogenética.
b. Experimento com 2,4-D e KIN
O cultivo de EZ imaturos de S. sessiliflorum em meios de cultura
suplementado com 2,4-D, na ausência ou na presença de KIN, por um período de 30
dias, resultou na proliferação de calos sobre os mesmos (Quadro 7). Nos
tratamentos sem a suplementação com 2,4-D, tanto na presença quanto na ausência
de KIN (0,1 mg L-1), ocorreu a germinação de 100% dos EZ, a qual iniciou em
torno de uma semana após a inoculação.
A reação calogênica ocorreu principalmente na região do eixo hipocótilo-
radicular, sendo manifestada por volta do 7º dia de cultivo, após a abertura dos
cotilédones e um pequeno alongamento do hipocótilo (Figura 3a). Na avaliação
realizada aos 30 dias, observou-se o surgimento de pequenas protuberâncias,
principalmente sobre as folhas cotiledonares dos EZ inoculados nos meios de
cultura com as maiores concentrações (5 e 10 mg L-1) de 2,4-D (Figura 3b).
Quadro 7 - Percentual médio de calos formados sobre os embriões zigóticos inoculados em meio de cultura MS com 2,4-D (0; 2,5; 5 e 10 mg L-1) e KIN (0 e 0,1 mg L-1) aos 30, 45, 60 e 75 dias de cultivo
SEM KIN COM KIN 2,4-D (mg L-1) 2,4-D (mg L-1) Dias 0 2,5 5 10 0 2,5 5 10 30 0 100 75 ± 31,1 62,5 ± 9,6 0 95 ± 5,77 85 ± 10 70 ± 20 45 0 100 75 ± 31,1 62,5 ± 9,6 0 95 ± 5,77 87 ± 5 72,5 ± 15 60 0 100 87,5 ± 15 62,5 ± 9,6 0 100 95 ± 5,8 72,5 ± 15 75 0 100 87,5 ± 15 62,5 ± 9,6 0 100 95 ± 5,8 72,5 ± 15
96
Figura 3 – Formação de estruturas similares a embriões somáticos em S. sessiliflorum: a) calo formado na região do eixo hipocótilo-radicular (seta); b) protuberâncias formadas sobre folhas cotiledonares de EZ após 30 dias de cultivo (10 mg L-1 de 2,4-D); c) estruturas globulares (G) e cordiformes (C) formadas após 45 dias; d) formação de calos sobre as estruturas após 60 dias de cultivo. Barra: 25 mm
Todos os explantes inoculados em meio de cultura suplementado com 2,5
mg L-1 de 2,4-D e isento de KIN formaram calo após 30 dias de cultivo, tendo
ocorrido o mesmo com os explantes inoculados nesse mesmo meio, porém com a
suplementação com KIN após 60 dias de cultivo (Quadro 7). Com o aumento da
concentração de 2,4-D ocorreu diminuição no percentual de calos formados sobre
os explantes, sendo superior nos meios sem a suplementação com KIN ao longo do
tempo de avaliação.
Na avaliação realizada aos 45 dias de cultivo, foram observadas as
primeiras estruturas similares a embriões somáticos (ES) em S. sessiliflorum.
Inicialmente, verificou-se a formação de estruturas globulares, de coloração branca
a b
c d
G C
97
a amarelo-palha, diretamente sobre a epiderme adaxial dos cotilédones dos EZ
cultivados em meio de cultura MS, suplementado com 5 e 10 mg L-1 de 2,4-D na
ausência de KIN, e 10 mg L-1 de 2,4-D na presença de KIN (0,1 mg L-1). A maior
parte dos ES regenerados apresentava formato globular e formato de “coração”,
assemelhando-se aos ES nos estádios globular e cordiforme (Figura 3c).
Neste período, o maior percentual de explantes que apresentaram estruturas
similares a embriões foi encontrado no tratamento com 10 mg L-1 de 2,4-D na
ausência de KIN, sendo este também o tratamento onde foi verificado o maior
número de ES por explante. A manutenção dos explantes no meio de cultura até 75
dias permitiu um incremento no número de embriões neste e nos demais
tratamentos onde houve indução (Quadro 8).
O estudo anatômico realizado com as estruturas similares a ES observadas
nos tratamentos com 2,4-D mostrou tratar-se de estruturas independentes, sugerindo
a presença de um sistema vascular fechado (Figura 4), indicando que as mesmas são
de embriões somáticos.
Transcorridos 60 dias de cultivo nos mesmos meios de cultura, não ocorreu
a progressão para outros estádios ontogenéticos como torpedo e cotiledonar. Sobre
estas estruturas e nas regiões próximas, houve a proliferação de calos (Figura 3d).
Para evitar essa formação indesejável de calos sobre os embriões, sugere-se o
cultivo por menor tempo na presença de auxina e a transferência para meios de
cultura suplementados com ácido abscísico ou sem a presença de reguladores de
crescimento.
Apesar de benéfica para a indução da embriogênese somática, a exposição
a concentrações excessivas ou tratamentos prolongados com reguladores de
crescimento pode resultar em desenvolvimento diferente do desejado. Caligari e
Shohet (1993) citados por Guerra et al. (1999) sugerem que a manutenção das
culturas embriogênicas por tempo prolongado em meio com 2,4-D causa variações
genéticas que afetam o potencial embriogênico. Segundo Jiménez (2005), uma vez
que o 2,4-D é reduzido ou removido do meio de cultura, os níveis endógenos de
AIA (ácido indolacético) são reduzidos, permitindo o estabelecimento do gradiente
98
polar de auxina. O contínuo crescimento em meio contendo esse regulador não
permite a redução nos níveis endógenos de auxina.
Quadro 8 - Percentual médio de explantes com estruturas embriogênicas e número de embriões por explante obtidos em meio de cultura MS com 2,4-D (0; 2,5; 5 e 10 mg L-1) e KIN (0 e 0,1 mg L-1) aos 30, 45, 60 e 75 dias de cultivo Explantes com estruturas embriogênicas SEM KIN COM KIN 2,4-D (mg L-1) 2,4-D (mg L-1) Dias 0 2.5 5 10 0 2.5 5 10 30 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 5 ± 10 22,5 ± 9,6 0 0 0 15 ± 5,78 60 0 7,5 ± 9,57 12,5 ± 15 25 ± 12,91 0 0 0 22,5 ± 9,57 75 0 7,5 ± 9,57 22,5 ± 15 35 ± 12,91 0 0 12,5 ± 12,6 22,5 ± 9,57
Embriões por explante 30 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 0,75 ± 1,5 7,25 ± 5,56 0 0 0 3,25 ±
2,22 60 0 2,7 ± 3,8 3,75 ± 5,68 7,75 ± 5,06 0 0 0 5,5 ±
2,89 75 0 2,7 ± 3,8 6,5 ± 5,45 11 ± 2,16 0 0 4 ± 6,68 7,5 ±
1,29
Na maior parte das espécies estudadas em que a adição de reguladores é
necessária para induzir a embriogênese somática, auxinas e citocininas têm sido
essenciais na indução de respostas embriogênicas, provavelmente porque elas
participam na regulação do ciclo e da divisão celular (Fehér et al., 2003; Jiménez,
2005; Stefanello et al., 2005). As auxinas promovem a desdiferenciação celular,
com reativação de divisões celulares por meio da coordenação da expressão de
genes e modificações pós-transcricionais de proteínas regulatórias envolvidas no
controle do ciclo celular (Dudits et al., 1995) e essa resposta pode depender da fonte
de explante usado no experimento (Zimmerman, 1993).
Assim como no presente trabalho, a indução da rota embriogenética a partir
de EZ cultivados na presença de 2,4-D tem sido relatada por vários autores. Lopez-
Puc et al. (2006) observaram a formação de ES diretamente sobre EZ de Capsicum
chinense em meio de cultura MS suplementado com 2 mg L-1 de 2,4-D. Dentre as
auxinas, o 2,4-D tem sido a mais utilizada (Jiménez, 2005). Gaj (2004) mencionou
99
que em mais de 65% dos protocolos obtidos, o 2,4-D foi empregado sozinho ou em
combinação com outro regulador de crescimento.
Figura 4 – Corte transversal de embrião somático de S. sessiliflorum: a-b) presença de sistema vascular fechado (10 mg L-1 de 2,4-D), barra: 300 µm; c) detalhe da diferenciação de célula xilemática do tecido vascular (seta), barra: 35 µm.
Ao final de 75 dias de cultivo, dois tipos de calos surgiram sobre os
explantes: um com aspecto filamentoso, de coloração mais escura formado,
geralmente, sobre os EZ cultivados na presença de 2,5 mg L-1 de 2,4-D e outro,
friável, de textura granulosa e coloração mais clara, formado sobre os EZ cultivados
com 5 e 10 mg L-1 de 2,4-D. Ambos foram transferidos para condições de
luminosidade e cultivados em meio de cultura isento de reguladores por 90 dias,
sendo subcultivados a cada 30 dias.
Após o primeiro subcultivo, foi realizada a avaliação citoquímica dos calos,
utilizando a dupla coloração com azul de Evans e carmim acético. A avaliação
citoquímica dos calos de aspecto filamentoso (Figura 5a) revelou que os mesmos
eram constituídos por células alongadas, com citoplasma pouco denso, não reagindo
100
com o carmim acético e não apresentando estruturas globulares pró-embriogênicas
típicas de culturas embriogênicas (Figura 5b).
Calos de Caesalpinia echinata Lam. regenerados a partir de folíolos jovens
também apresentaram aspecto filamentoso e não mostraram-se embriogênicos
(Pessotti et al., 2007). De acordo com Cid (1992), estas culturas embriogênicas
filamentosas são constituídas por elementos diferenciados como fibras e
esclereídeos, indicando que estas porções dos calos não se desdiferenciaram e. por
isso, não são embriogênicas. Estruturas similares foram observadas em culturas de
inflorescências jovens de Cynodon dactylon que produziram calos não
embriogênicos, com aspecto não organizado, não compactado e possuindo células
longas e tubulares na sua superfície (Chaudhury e Qu, 2000).
Os calos friáveis e de textura granulosa (Figura 5c) formados sobre os
embriões zigóticos de cubiu apresentaram células pequenas, isodiamétricas, as quais
reagiram fortemente com o carmim acético (Figura 5d) que, segundo Durzan (1988),
é um indicativo da presença de glicoproteínas associadas à rota embriogenética.
De acordo com Jong et al. (1993), células tipicamente embriogenéticas são
isodiamétricas, pequenas (20 a 30 µm), com citoplasma denso e alta capacidade de
divisão celular, características estas também definidas por Yeung (1995).
Após 150 dias de cultivo in vitro, foi possível observar a formação de
complexos ou massas celulares pró-embriogênicas (Figura 5e) em 7,5% dos calos
cultivados em meio suplementado com 10 mg L-1 de 2,4-D e 0,1 mg L-1 de KIN.
Estes complexos são regiões de aparência friável que, quando sob condições
adequadas. desenvolvem embriões em sua superfície. O isolamento dessas regiões e
transferência para meio de cultura MS sem reguladores de crescimento permitiu o
avanço dos pró-embriões para o estádio globular e cordiforme após o período de 30
dias de cultivo (Figura 5f).
Resultados similares foram obtidos por Carvalho et al. (2004) que
relataram a obtenção do padrão indireto de embriogênese para Diospyros kaki,
induzido inicialmente pela formação de uma massa celular pró-embriogênica, com
ES desenvolvidos em sua superfície. Os ES de Diospyros kaki desenvolveram-se
101
sobre EZ cultivados por 150 dias em meio de cultura MS, suplementado com 2,21
mg L-1 de 2,4-D e 0,43 mg L-1 de KIN.
Figura 5 - a) Calo filamentoso (2,5 mg L-1 de 2,4-D), barra: 1 mm ; b) células com características não embriogenéticas, barra: 30 µm; c) calo friável (10 mg L-1 de 2,4-D), barra: 1 mm; d) células com reação ao carmim acético 2%, barra: 30 µm; e) complexos celulares pró-embriogênicos (CCPE) formados em meio com 2,4-D (10 mg L-1) e KIN (0,1 mg L-1) após 150 dias de cultivo, barra: 0.5 mm; f) ES cordiforme (C) após 180 dias de cultivo, barra 1 mm.
a b
c d
e f
CCPE C
102
Maciel et al. (2003) também obtiveram a indução da rota embriogenética
de forma indireta a partir de explantes foliares jovens de Coffea arabica L. cv.
Obatã cultivados em meio de indução suplementado com caseína hidrolisada (100
mg L-1), na presença de 2,4-D e KIN. A combinação entre 4 mg L-1 de 2,4-D e 2 mg
L-1 de KIN favoreceu a indução de calos primários mistos. Além disso, maior
freqüência de calos embriogênicos friáveis ocorreu na presença de BAP (8 mg L-1),
associado ou não ao 2,4-D, e maior número de embriões por explante foram obtidos
quando utilizou-se sacarose (30 g L-1) e BAP (3 mg L-1).
Pessotti et al. (2007) verificaram que folíolos jovens de Caesalpinia
echinata Lam. inoculados em meio de cultura enriquecido com 2,4-D (5, 10 e 20
mg L-1) formaram calos. A transferência para meio sem regulador estimulou a
formação de massas celulares pró-embriogências em 95% dos calos. A permanência
prolongada dos calos em meio sem regulador não permitiu a conversão das massas
pró-embriogênicas em ES. Entretanto, segundo Guerra et al. (1999), a transferência
das culturas com características embriogênicas para um meio de cultura com
concentrações reduzidas de auxina ou sem reguladores de crescimento é geralmente
necessária para a produção de ES.
No presente trabalho, a indução da embriogênese somática direta e indireta
foi relatada apenas quando EZ foram empregados como explantes. O uso de EZ
para a iniciação de culturas embriogênicas apresenta algumas vantagens em relação
às demais fontes de explantes. Uma delas refere-se à rápida obtenção de resposta.
Assim, EZ podem ser uma excelente fonte de explantes para a condução de
trabalhos, visando estudos relacionados à fisiologia da embriogênese somática.
Por se constituírem de células com características meristemáticas, tecidos
imaturos como os EZ são embriogenéticos por natureza, necessitando de menos
estímulos exógenos contidos nos meios de cultura do que outros tipos de explantes
(Litz e Gray, 1995). Por outro lado, células de tecidos maduros são heterogêneas
quanto à especialização e se diferenciam lentamente, havendo necessidade de re-
determinação que ocorre pela via indireta, com a indução de calos ou massas
embriogênicas (Williams e Maheswaran, 1986).
103
O uso de EZ como fonte de explantes de espécies com polinização cruzada
pode ser considerada uma limitação, pois os EZ representam um genótipo
desconhecido. Litz e Gray (1995) ressaltam que com poucas exceções, as plantas
que crescem a partir de sementes representam recombinantes meióticos de dois
parentais e, assim, eles não podem ser geneticamente idênticos. Entretanto, o
controle da polinização é uma estratégia que pode minimizar o efeito da fecundação
cruzada.
A determinação de um protocolo eficiente para a propagação clonal via
embriogênese somática é um procedimento complexo que envolve a elucidação dos
fatores que afetam as várias fases do desenvolvimento embrionário. Este estudo
apresentou as primeiras respostas quanto à indução de células embriogenéticas a
partir de massas pró-embriogênicas e indução da embriogênese a partir de EZ
cultivados na presença de 2,4-D. Porém, a sincronização do desenvolvimento ainda
não foi alcançada e houve baixa freqüência de regeneração.
O presente estudo é importante e pode servir de embasamento para outros
experimentos com tecidos somáticos. As próximas investigações científicas deverão
caminhar para os aspectos que abordem as modificações das condições para
promover a maturação dos embriões somáticos, com a manipulação de substâncias
reguladoras de crescimento em meio à cultura que poderão contribuir para a
superação desses obstáculos e a obtenção de um protocolo eficiente de
embriogênese somática para S. sessiliflorum. A sincronização do desenvolvimento e
a maturação de ES são pontos fundamentais definidos para a utilização comercial
desta tecnologia, com alto potencial para a produção massal de culturas
embriogenéticas (Burns e Wetzstein, 1997).
104
4. CONCLUSÕES
O tipo de explante e os reguladores de crescimento utilizados para iniciar o
cultivo in vitro influenciaram na freqüência de indução de calos, embriões
somáticos e demais respostas morfogenéticas. Sobre explantes de segmentos de
hipocótilo e folhas cotilédones cultivados em meio de cultura MS suplementado
com ANA, KIN, 2,4-D e TDZ formaram-se calos, porém não ocorreu a indução da
rota embriogenética.
Este estudo apresentou as primeiras respostas quanto à indução de células
embriogenéticas a partir de massas pró-embriogênicas e a indução da embriogênese
direta a partir de EZ cultivados na presença de 2,4-D (5 e 10 mg L-1). A
suplementação do meio de cultura com KIN não incrementou a regeneração de
embriões somáticos. Outros experimentos devem ser realizados no sentido de
elucidar a maturação dos embriões somáticos, com a manipulação de substâncias
reguladoras de crescimento no meio de cultura que poderão contribuir para a
conversão dos embriões em plântulas.
105
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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112
APÊNDICES
113
Quadro 1A - Resumo da análise da variância para o comprimento (cm), diâmetro (cm), peso total (g), espessura do pericarpo (cm) e peso do conteúdo placentário (g) dos frutos de cubiu.
Fontes de GL Quadrados Médios
variação Comprimento
(cm)
Diâmetro
(cm)
Massa total
(g)
Espessura
(cm)
Massa da polpa
(g)
Variedades (V) 1 3,128167 ** 1,048082 ** 584,625735 ** 0,002407 ns 1719,81188 **
Erro 58 0,157743 0,079935 63,399364 0,008399 136,393201
Total 59
Média geral 6,054 3,8501667 50,44 0,48 23,57
CV (%) 6,56 7,34 15,79 19,2 49,55
** P<0,01; * P<0,05; ns = não significativo P>0,05
114
Quadro 2A - Resumo da análise da variância para a firmeza (MPa), sólidos solúveis totais (SST) (ºBrix), pH e acidez total titulável (ATT) (g/100g).
Fontes de Quadrados Médios
Variação GL Firmeza
(MPa)
SST
(ºBrix)
ATT
(g/100g)
pH
Variedades (V) 1 0,04374 ns 0,586082 * 0,363482 * 0,006615 ns
Ethephon (E) 1 0,020167 ns 0,360375 ns 0,339002 * 0,187042 *
Tempo (T) 4 0,446473 ** 0,224098 ns 1,035110 ** 0,356422 **
V x E 1 0,003527 ns 0,127882 ns 0,110082 ns 0,054602 ns
V X T 4 0,065973 ** 0,194832 ns 0,058498 ns 0,035794 ns
E x T 4 0,001350 ns 0,179892 ns 0,175152 ns 0,014029 ns
V x E x T 4 0,003493 ns 0,064448 ns 0,009307 ns 0,011214 ns
Erro 40 0,014502 0,129010 0,072633 0,027852
Total 59
Média geral 0,21 3,85 1,89 3,45
CV (%) 56,54 9,33 14,21 4,83
** P<0,01; * P<0,05; ns = não significativo P>0,05
115
Quadro 3A - Resumo da análise da variância para a razão SST/ATT, umidade (%), cinzas (%) e perda de matéria fresca (%)
Fontes de Quadrados Médios
Variação GL SST/ATT
Umidade
(%)
Cinzas
(%)
Perda de matéria fresca
(%)
Variedades (V) 1 0,000882 ns 11,068215 ns 0,216000 ns 1,040167 ns
Ethephon (E) 1 1,737402 * 0,161202 ns 0,012907 ns 6,706727 ns
Tempo (T) 4 2,731111 ** 0,669103 ns 0,276554 * 129,106063 **
V x E 1 0,151002 ns 0,004335 ns 0,518940 * 7,058940 ns
V X T 4 0,245902 ns 1,913936 ns 0,062429 ns 0,976846 ns
E x T 4 0,211889 ns 1,155439 ns 0,093544 ns 2,885356 ns
V x E x T 4 0,123781 ns 0,238789 ns 0,054486 ns 1,480486 ns
Erro 40 0,263785 3,149787 0,073140 5,314585
Total 59
Média geral 2,24 91,09 1,60 4,34
CV (%) 22,95 1,95 16,85 53,10
** P<0,01; * P<0,05; ns = não significativo P>0,05
116
Quadro 4A - Resumo da análise da variância para a luminosidade, cromaticidade e ângulo de cor da casca.
Fontes de Quadrados Médios
Variação GL Luminosidade Cromaticidade Ângulo
Variedades (V) 1 79,074240 ** 100,647402 * 73,062735 ns
Ethephon (E) 1 374,400240 ** 1272,269402 ** 692,716282 **
Tempo (T) 4 658,104088 ** 2486,844861 ** 2987,064132 **
V x E 1 146,765760 ** 270,895002 ** 57,330375 ns
V X T 4 0,654686 ns 6,826481 ns 19,247177 ns
E x T 4 25,688678 * 102,272306 ** 110,667132 **
V x E x T 4 8,291289 ns 17,924956 ns 12,279633 ns
Erro 40 6,996720 22,663450 21,668880
Total 59
Média geral 48,50 42,13 94,52
CV (%) 5,45 11,30 4,92
** P<0,01; * P<0,05; ns = não significativo P>0,05
117
Quadro 5A - Resumo da análise da variância para os caracteres CO2 (mg kg-1 h-1) e etileno (µL kg-1 h-1)
Fontes de Quadrados Médios
Variação GL CO2 Etileno
Variedades (V) 1 149,092212 ns 449,284145 ns
Ethephon (E) 1 336,938719 ns 4535,038667 *
V x E 1 117,546296 ns 2214,845472 ns
Erro 8 73,758295 738,158788
Tempo (T) 12 225,080134 ** 2214,147996 **
V X T 12 21,700565 ** 63,190426 ns
E x T 12 29,977357 ** 334,162911 *
V x E x T 12 19,377799 ** 435,680700 **
Erro 96 7,849424 144,812271
Total 155 155
Média geral 20,13 10,98
CV 1 (%) 42,6 247,47
CV 2 (%) 13,9 109,61
** P<0,01; * P<0,05; ns = não significativo P>0,05
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