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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIROCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO – IBCCFCIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOFÍSICA

FISIOLOGIA CELULAR – CFF223

Autofagia• Autofagia é induzida por sinais extracelulares e intracelulares.

• Este processo dinâmico envolve a formação e fusão de membranas, incluindo a formação autofagossomo, fusão autofagossomo-lisossomo, e degradação do conteúdo intra-autofagossomal por hidrolases lisossomais.

(Tanida, I., 2011)

Formação do autofagossomo• Iniciação• Maturação• Fusão autofagossomo-lisossomo (vacúolo autofágico degradativo)• Degradação – enzimas hidrolíticas lisossomais

(Tanida, I., 2011)

Conjugação do LC3

(Keiji, T., Yoshinori, O., 2011)

Beclin 1

•Beclin 1 interage com Bcl-2 e Bcl-xL para inibir a autofagia.

•As análises sequencial, estrutural e funcional revelaram que Beclin 1 contém um domínio BH3, que é responsável pela sua ligação com Bcl-2 e Bcl-xL.

•Acredita-se que vários membros pró-apoptóticos da família Bcl-2, incluindo o Bax, Bak e Bad, promovem a autofagia por interromper, competitivamente, a interação entre Beclin e Bcl-2/Bcl-xL.

Estaurosporina induz autofagia seguida por apoptose

•Número de autofagossomas foi aumentado em 3 h e reduzido a 12 h. •Aumento progressivo da LC3-II em 3-12 h e depois houve uma redução em 18 horas.•Bafilomycina A1 (BA1) - redução da formação de autofagossoma e dos níveis de LC3-II.


•O desaparecimento de autofagossomas e níveis reduzidos de LC3-II foram correlacionados com um aumento da apoptose.

•As características apoptóticas foram evidentes como observado pela coloração de anexina V/PI

Beclin 1 é clivada pela caspase-3 nos sítios 124 e 149 de aa

•Produtos clivados da Beclin 1 começaram a ser mostrados em 3 h após o tratamento com estaurosporina.

•Ao mesmo tempo, a ativação da caspase-3 foi detectável.

•A clivagem podia ser completamente inibida em células que superexpressam Bcl-2


•A análise da sequência revelou que Beclin 1 tem dois sítios típicos de clivagem pela caspase nas posições 124 e 149.

•Os 2 dois produtos de clivagem podem ser completamente inibidos por z-VAD-fmk.


•Substituição, isoladamente ou em conjunto, asparaginas por alaninas nas posições 124 e 149 da Beclin 1.

•Caspase-3 ativada foi capaz de clivar qualquer dos D124A e D149A, mas não para D124/149A

•Expressão de tipo selvagem e mutante duplo D124/149A em células HeLa tratadas com STS

Mutantes Beclin 1 inibem autofagia celular

•A formação de autofagossomas foi aumentada nas células que expressavam Beclin 1 selvagem em resposta à fome.

•O nº de autofagossomas foi reduzido nas células que expressavam os outros mutantes.


•A formação de autofagossomas foi aumentada nas células que expressavam Beclin 1 selvagem em resposta à estaurosporina.

•O nº de autofagossomas foi reduzido nas células que expressavam os outros mutantes.


•Grande parte do LC3-I foi convertido para LC3-II nas células que expressam o tipo selvagem Beclin 1, mas muito menos nas células expressando o mutante não-clivável D1-149 ou D150-450.

•As células que superexpressam Bcl-2 foi utilizada como controle negativo.

Mutantes Beclin 1 aumentam a sensibilidade à morte celular

•A ativação de caspase e da morte celular foram aumentadas nas células que expressam as formas truncadas de Beclin 1 quando comparadas com as das células Beclin 1 selvagem após tratamento com estaurosporina

A clivagem de Beclin 1 perturba a sua interação com Bcl-2

•A interação foi quase completamente interrompida, uma vez que se dá início a apoptose durante o tratamento com STS.

•Na presença de z-VAD-fmk, a dissociação Beclin 1/Bcl-2 foi amplamente bloqueada.

•Embora D150-450 interaja a fracamente com Bcl-2, a interação entre a proteína Bcl-2 e D1-149 não foi observada.

•O mutante duplo não-clivável exibiu uma capacidade reduzida para interagir com Bcl-2

Os efeitos da Beclin 1 e seus mutantes na autofagia e apoptose em células Beclin KD

•A formação do autofagossomo sob estimulação de estaurosporina foi reduzida em células Beclin 1 KD, que podem ser restaurados pela reintrodução de Beclin 1 selvagem.


•Beclin 1 KD apresentou um nível reduzido de LC3-II. •A mudança de LC3-I a LC3-II pode ser recuperada por expressar um RNAi de Beclin 1 selvagem nas células.•O mutante não clivável e D1-149, mas não D150-450, também aumentou ligeiramente o nível LC3-II


• wt Beclin 1 inibiu a morte celular enquanto que o mutante não-clivável aumentou a sensibilidade à estaurosporina. •D150-450 foi capaz de aumentar significativamente a morte de células na presença ou ausência de estaurosporina

Discussão•Autofagia é uma das primeiras respostas de sobrevivência na apoptose de células competentes.

•Existem 2 locais de clivagem da caspase-3 ao lado do domínio BH3 em Beclin 1.

•Surpreendentemente, descobrimos que o produto N-terminal da Beclin 1 clivada (D150-450) por si só é suficiente para induzir a morte celular independente de qualquer estimulação apoptótica.

•Os resultados oferecem novas perspectivas para a compreensão da interação de autofagia e apoptose.

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