NORMAS ISO PARA DETERMINACIONES MICROBIOLÓGICAS DE AGUAS

Directiva Europea 98/83/CE

Relativa a la calidad de las aguas

destinadas al consumo humano

ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los siguientes principios se dan ya sea como

referencia, en los casos en que se da un método

CEN/ISO, o como guía, en espera de la posible

adopción futura de nuevos métodos internacionales

CEN/ISO.

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESPECIFICADOS

• Bacterias coliformes y Escherichia coli UNE-EN ISO 9308-1: 2001

• Enterococos UNE-EN ISO 7899-2: 2001

• Pseudomonas aeruginosa prEN ISO 12780

• Enumeración de microorganismos cultivables a 22ºC y 37ºC UNE-EN ISO 6222: 1999

• Clostridium perfringens (incluidas las esporas) método descrito en la Directiva.

ISO 7899-2: ENTEROCOCOS INTESTINALESFILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN:• Aguas de bebida• Piscinas• Aguas desinfectadas

EXCEPCIONES: Alto contenido en materia en suspensión y microorganismos interferentes

DEFINICIÓN: Bacterias capaces de reducir el TTC a 362ºC e hidrolizar esculina a 440,5ºC

INTRODUCCIÓN

MEDIOS DE CULTIVO: Slanetz y Bartley Bilis Esculina agar: confirmación 100%

Grandes volúmenes de agua con bajo contenido de enterococos

prEN - ISO 12780: PSEUDOMONAS AERUGINOSAFILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN:• Aguas embotelladas• Piscinas• Aguas de red

DEFINICIÓN: Microorganismos capaces de crecer con cetrimida a 362ºC y: - Producen piocianina o - Oxidasa +, Fluorescentes a 360nm y amonio de acetamida

MEDIOS DE CULTIVO: Cetrimida-NalidixicoKing’s BCaldo acetamida

Confirmación: subcultivo

ISO 6222: RECUENTO DE MICROORGANISMOSCULTIVABLES

CAMPO DE APLICACIÓN: Indicado para medir la eficacia

operativa del proceso de tratamiento del agua de red.

DEFINICIÓN: Todas las bacterias aerobias, levaduras y

hongos capaces de formar colonias en el medio especificado

bajo las condiciones descritas

MEDIO DE CULTIVO y MÉTODO: ¿ADECUADOS?

Agar extracto de levadura

Siembra en profundidad: 36 2ºC; 444 horas

22 2ºC; 682 horas

DIRECTIVA: 22ºC Y 37ºC, NORMA 222ºC Y 362ºC

Confirmación mediante examen y, la aportación de

evidencias objetivas que demuestren

el cumplimiento de ciertos requisitos para

el uso específico previsto

(ISO 17025)

VALIDACIÓN DE MÉTODOS: DEFINICIÓN

ISO 9308-1: COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLIFILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN: Método poco selectivo específicopara bacterias lesionadas.

• Aguas de bebida desinfectadas• Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano

DOS MÉTODOS: Estándar para coliformes y E.coli Rápido para E.coli

DEFINICIONES: - Bacterias Lactosa +: Capaces de crecer en medio lactosado selectivo diferencial a 362ºC y producir ácido- Coliformes: Lactosa + que son oxidasa -- E.coli: 1.- Coliformes que producen indol del triptófano a 440,5ºC 2.- Bacterias resistentes a la bilis que producen indol del triptófano a 44 0,5ºC

FILTRACIÓN: 100 ml ó 250 ml

Lactosa TTC-Tergitol362ºC, 213 h ó 444h

Alternativa: otra membrana440,5ºC, 213 h

TSA: Triptona-soja-agar362ºC 4-5 h

TBA: Triptona-Bilis-Agar44±0,5ºC 19-20 h

Confirmación del 100%Indol

Alternativa: Doble capa

Lactosa +: colonias amarillas

Agar no selectivo: 362ºC, 212 h

Oxidasa Indol de triptófano44±0,5ºC , 213 h

10 colonias

ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENSFILTRACIÓN DE MEMBRANA

ANTECEDENTES

¿QUÉ MÉTODO DESARROLLAR PARA LA NUEVA NORMA?

ESTUDIO COMPARATIVOAlemania 60 laboratorios

• El TSC (Triptona-Sulfito-cicloserina) recupera 15% más que m-CP• El m-CP resulta afectado por el tipo y lote de membranas• El revelado del m-CP resulta tóxico para bacterias y personas• El TSC resulta afectado por la frescura del medio(1 día)• Las pruebas de confirmación con mayores índices de S y E:

•Nitratos: +•Movilidad : -•Lactosa: +•Gelatinasa: +

ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENSFILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN:• Todo tipo de aguas que no contengan materiasparticuladas o coloidales

DEFINICIÓN:Presuntivos: colonias negras a marrón-amarillas en

TSC a 44±1ºC Confirmadas: Presuntivas inmóviles, reducen nitratos

fermentan lactosa y licúan gelatina

DIRECTIVA: incluidas esporas, NORMA: pasteurización

MÉTODO: Pasteurización a 60 ±2ºC, 15 min

Los Estados miembros podrán emplear métodos

alternativos: Art.7. 5: Siempre que se demuestre que

los resultados son al menos tan fiables como los de

referencia. Se facilitará a la Comisión toda

la información del método y su equivalencia

ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS

ISO 17994: “Criterios para el establecimiento

de la equivalencia entre métodos microbiológicos”

Dos métodos son equivalentes, cuando la diferencia

relativa media de sus recuentos confirmados no

difiere significativamente de cero y tanto el límite

inferior como el superior del intervalo de confianza

al 95% de la media no superan un nivel máximo de

desviación aceptable D (10)

BLnALnRD 100%

n

ixi

nX

1

1

1

1

2

n

xxi

S

n

i

n

SXIC 2%95

EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

— D 0 D LI LS

y

NO DIFERENTES

— D 0 DLS < < LI ó

DIFERENTES

INDIFERENTES: Estadísticamentediferentes, pero la diferencia es tan pequeña queno tiene significación microbiológica

EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

— D 0 LS < < LI y

ó

D0< LI y LS <

NO CONCLUYENTE

— D 0LI < y < LS

ó

D0

yLI < < LS

EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

Método propio Método de referencia

Muestra 1 89 112Muestra 2 82 58Muestra 3 123 137Muestra 4 87 82Muestra 5 109 103Muestra 6 84 117Muestra 7 65 66Muestra 8 111 70Muestra 9 92 93Muestra 10 115 111

Media = 2,63Desviación estándar = 23,76Límite inferior del IC95% = -12,39Límite superior del IC 95% = 17,66

Conclusión: Resultados son no concluyentes,

LI<0 y LS>+D,

Se requiere un número mayor de muestras

n=C.S2= 0,1600x23,762= 90 muestras

VALIDACIÓN - REVALIDACIÓNCONTROL DE CALIDAD MÉTODOS CUANTITATIVOS

• INTERNO:

- Positivo: Mat. Referencia en matriz neg. (Recuperación)

- Negativo: Mat. Referencia en matriz neg. (Selectividad)

- Control de replicados: tres (Precisión y límites de

recuento)

- Ident. de colonias diana y no-diana: (Tasa de

confirmación)

• EXTERNO: Muestras con diferentes niveles (Recuperación)