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FÁBIO APARECIDO BARBOSA CABRAL

AVALIAÇÃO DA CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HTLV-1 EM

INDIVÍDUOS ASSINTOMÁTICOS E DESENVOLVENDO A MIELOPATIA

ASSOCIADA AO HTLV-1/PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL

(HAM/TSP)

Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção de Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Orientador: Prof. Dr. Jorge Simão do Rosário Casseb

São Paulo

2010

RESUMO Cabral, F. A. B. Avaliação da carga viral plasmática do HTLV-1 em indivíduos assintomáticos e desenvolvendo a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia

espástica tropical (HAM/TSP). 2010. 60 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. O vírus linfotrópico das células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é um vírus RNA, responsável por algumas patologias como a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma das células T do adulto (ATL) dentre outras. A replicação célula a célula e/ou por expansão clonal de células infectadas induzida pela proteína Tax são as principais vias utilizadas deste modelo viral, tornando difícil sua detecção no estado virêmico. Consequentemente, a carga pró-viral é usada como marcador virológico para monitorar a doença, mas os mecanismos de progressão das patologias associadas ao HTLV-1 ainda não estão bem estabelecidos. Neste estudo, a detecção e a quantificação da carga viral foram executadas, primeiramente, por Reação em cadeia da polimerase (PCR) em Tempo Real onde um total de 150 pacientes infectados pelo HTLV-1, em acompanhamento, no Instituto Emílio Ribas foi recrutado para este estudo, dos quais, 123 são portadores assintomáticos e 27 desenvolveram HAM/TSP. Adicionalmente, 20 amostras de pacientes com HAM/TSP e 20 de portadores assintomáticos foram examinadas por PCR qualitativa para investigar a presença de DNA pró-viral no plasma, dada a maior sensibilidade deste método. Resultados: 150 pacientes foram testados por PCR em tempo real, onde 5 (4%) dos portadores assintomáticos e 7 (26%) daqueles com HAM/TSP apresentaram carga viral plasmática detectável. Portanto, 12 indivíduos (8%) apresentaram positividade para o RNA viral, indicando que este pode ser um estágio de replicação do vírus, especialmente nos casos de HAM/TSP. Nas 40 amostras submetidas ao PCR qualitativa, 7 foram excluídas da análise. Das 33 restantes, 6 (18%) apresentaram positividade no plasma. Em conclusão, foi possível identificar vírions livres de HTLV-1 no plasma, tanto em pessoas assintomáticas quanto em HAM/TSP. A detecção de partículas virais do HTLV-1 no plasma abre novas possibilidades de discussão sobre as estratégias de replicação do vírus e das vias de transmissão, sugerindo maiores investigações para elucidar o assunto.

Palavras-chave: HTLV-1, Mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), Nested PCR, Carga viral plasmática HTLV-1, PCR em tempo

real.

ABSTRACT

Cabral, F. A. B. Evaluation of HTLV-1 plasmatic viral load in asymptomatic and HTLV-1-associated myelopathy/Tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) individuals. 2010. 60 p. Master thesis (Microbiology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.

The human T-cell lymphotropic virus type1 (HTLV-1) is a RNA virus, responsible for some pathologies such as HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and Adult T-cell Leukemia/ Lymphoma (ATL) among others. The cell-to-cell contact and Tax-induced clonal expansion of infected cells are the main ways of this virus replication. Thus the detection of HTLV-1 in a viremic stage is difficult. Consequently, the proviral load is the currently virologic marker for monitoring the diseases, but the mechanisms of progression from those pathologies associated to HTLV-1 aren‟t well established yet. In this study, the detection and quantification of the plasmatic viral load were performed. A total of 150 HTLV-1 infected subjects, from Instituto de Infectologia Emílio Ribas, was recruited, divided in two groups: 123 HTLV-1 asymptomatic carriers and 27 diagnosticated as HAM/TSP and then were assessed by real time PCR. In Addition, 20 samples of HTLV-1 asymptomatic carriers and 20 samples of HAM/TSP patients were screened by Nested PCR to investigate the presence of DNA proviral load in the plasma, given the higher sensibility of this method and 7 were excluded from the analysis. Results: 150 subjects were tested by Real Time PCR and the plasmatic viral load was detected in five HTLV-1 asymptomatic carriers (4%) and seven HAM/TSP patients (26%). Therefore, 12 individuals (8%) presented positivity for viral RNA by real time PCR, suggesting this may be a replication step of this virus. From the 33 samples submitted to Nested PCR, six (18%) presented positivity for HTLV-1 RNA in the plasma. In conclusion, the detection of HTLV-1 free virions in the plasma was possible in both groups, and this fact opens new possibilities of discussion over viral replication strategies as well as transmission pathways, suggesting further investigation for clarifying this matter. Key-words: HTLV-1, HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), Real Time PCR, Nested PCR, HTLV-1 plasmatic viral load.

Fábio A. B. Cabral Dissertação de Mestrado

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1 INTRODUÇÃO

O vírus linfotrópico das células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente

etiológico da HAM/TSP (HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis)

mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical e ATL (Adult T-cell

Leukemia/ Lymphoma) leucemia/ linfoma das células T do adulto (GESSAIN et al.,

1985; OSAME et al., 1986). Atualmente, 10 a 20 milhões de pessoas estão

infectadas pelo HTLV-1, sob risco de desenvolvimento HAM/TSP ou ATL no mundo.

A alta prevalência de infecção por HTLV-1 é encontrada em usuários de drogas e

pacientes com doenças sexualmente transmissíveis e, embora a maioria permaneça

saudável, 2 a 5% podem desenvolver HAM/TSP (PROIETTI et al., 1994; KAPLAN et

al., 1990). Existem outras doenças correlacionadas ao HTLV-1 tais como desordens

inflamatórias em múltiplos órgãos, incluindo miosite, artrite, dermatite, uveíte e

alveolite (HALL et al., 1996).

Aparentemente, a HAM/TSP é a doença mais comum associada ao HTLV-1

no Brasil e se trata de uma doença inflamatória crônica degenerativa do sistema

nervoso central. É caracterizada por dano no axônio e desmielinização, mais

pronunciada na coluna espinal da região médio-toráxica (IWASAKI, 1993). Os

pacientes HAM/TSP montam uma resposta celular e humoral vigorosa ao HTLV-1.

Isto demonstra que a infecção sozinha não é capaz de causar HAM/TSP, mas

fatores adicionais tais como a interação parasita-hospedeiro, a carga proviral, os

haplótipos de HLA como HLA*DR-A2 também são importantes (HOLLSBERG and

HAFLER, 1995; SHIMAMOTO et al., 1996; JACOBSON, 2002). A carga viral em

muitas infecções pode indicar o grau de replicação e, geralmente, determina a

possibilidade de causar dano no hospedeiro em um longo período de incubação. Um

exemplo de progressão de doença por replicação viral tem sido estudado na

imunodeficiência humana causada pelo HIV-1(human immunodeficiency virus type

1), demonstrando que a carga viral plasmática se correlaciona com a progressão da

doença e é um importante marcador no monitoramento da aids (MELLORS et

al.,1997).

Apesar da grande quantidade de dados a respeito do HIV-1 e carga viral na

progressão da aids, poucos estudos têm sido publicados no que se refere à carga


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viral do HTLV-1 e o seu resultado clínico. Uma das maiores dificuldades no estudo

da infecção por HTLV-1 é que este vírus possui um longo tempo de incubação e

menos de 5% dos portadores irão progredir para doenças associadas (KAPLAN et

al., 1990). Estudos prévios demonstraram que a replicação do HTLV-1 está

aumentada em pacientes desenvolvendo HAM/TSP, quando comparada aos

portadores do HTLV-1 assintomáticos (MONTANHEIRO et al., 2005). Entretanto,

este fato ainda não é conclusivo e os mecanismos de desenvolvimento da HAM/TSP

permanecem obscuros. Este estudo teve por objetivo investigar a presença da carga

viral plasmática do HTLV-1, em pacientes assintomáticos e pacientes

desenvolvendo HAM/TSP e avaliar sua importância em resultados clínicos. Os

dados da carga viral plasmática, apresentados neste estudo são provenientes de

pacientes em acompanhamento ambulatorial, no Instituto de Infectologia “Emílio

Ribas”, em São Paulo, Brasil.

1.1 Histórico da descoberta do HTLV

Com base na classificação dos vírus, a família Retroviridae, subfamília

Orthoretrovirinae e ao gênero Deltaretrovírus é caracterizada por possuir duas fitas

simples de RNA, uma enzima com capacidade de retrotranscrever o RNA em DNA

viral e inseri-lo no genoma do hospedeiro, constituindo o pró-vírus (YAO, et al., 2000)

As infecções causadas por estes vírus são antigas no homem. Outros retrovírus

relacionados estão disseminados entre os primatas do velho mundo. O nome PTLV

(vírus linfotrópico das células T de Primatas) tem sido proposto para agrupar vírus

relacionados que têm como hospedeiros primatas humanos (HTLV) e não humanos.

Alguns estudos sugerem que o HTLV tenha emergido do contato entre humanos e

primatas não-humanos infectados. A possibilidade de transmissão zoonótica do

STLV (STLV, vírus linfotrópico das células T de símios) para populações humanas

naturalmente expostas aos primatas, através de atividades como caça, merece

atenção da saúde pública por causa da natureza transmissível e patogênica desses

vírus aos humanos. A homologia do genoma de linhagens do HTLV-1 com linhagens

de STLV pode ser maior que entre HTLV-1 e 2. Os vírus HTLV-1 e 2 se originaram

independentemente e estão relacionados ao STLV-1 e STLV-2, respectivamente

(GOUBAU et al., 1996).


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O HTLV-1 foi isolado, primeiramente, pelo grupo liderado por Robert Gallo, a

partir de células de paciente com leucemia crônica cutânea, de células T. Em 1980,

foi relatado como o primeiro retrovírus humano (POIESZ et al., 1980).

Subsequentemente, foi associado à ATL, descrita no Japão (UCHIYAMA et al.,

1997). Um segundo vírus foi identificado, em 1982, pelo mesmo grupo, em paciente

com leucemia de célula T pilosa, denominado vírus linfotrópico de células T humanas

do tipo 2 (HTLV-2). O vírus HTLV-2 está associado a raros eventos neurológicos

(KALYANARAMAN et al., 1982).

Em 2005, foram descritos dois novos tipos de HTLV, HTLV-3 e HTLV-4 em

populações do sul de Camarões que têm contato com primatas não-humanos

(WOLFE et al., 2005; CALATTINI et al., 2005). Sugere-se que a origem do HTLV-3

seja recente e que seja proveniente do STLV-3. Por sua vez, não foi identificado

nenhum equivalente ao STLV para o HTLV-4, sendo este, filogeneticamente distinto

dos outros HTLVs conhecidos. Ainda não se sabe se os HTLV-3 e 4 podem ser

transmitidos entre seres humanos e se são capazes de desencadear doença em

seus portadores, como ocorre com os outros HTLVs (WOLFE et al., 2005).

Quanto à forma, os vírus HTLV-1 e HTLV-2 são classificados como retrovírus

do tipo C, compartilhando aspectos estruturais e biológicos entre si. Apresentam

similaridade de 65% em suas sequências de nucleotídeos. Este fato justifica a

elevada taxa de reações cruzadas, observadas com soros de pacientes infectados

por um tipo de HTLV, quando colocados para reagir com extratos do outro tipo viral

(SODROSKI et al., 1992).

A variabilidade genética observada entre as amostras, tanto do HTLV-1 quanto

do HTLV-2, tem levado à descrição de subtipos e as análises filogenéticas mostram

as relações evolutivas entre eles. O HTLV-1 é classificado em 7 subtipos (A-G). O

subtipo A (cosmopolita) é o mais disseminado e encontrado em muitas populações e

áreas geográficas e compreende cinco grupos moleculares, o japonês, o

transcontinental, o do Norte da África, do Oeste da África e Negros (Peru) Parece

não existir relação entre subtipo viral e doença causada pelo vírus, sendo a

variabilidade genética do HTLV-1 muito mais dependente da sua origem geográfica.

(MIURA et al.,1994; VAN DOOREN et al.,2004).

As formas de transmissão do HTLV-1 são as mesmas que o HIV utiliza,

porém, menos eficiente devido à necessidade de células infectadas para a

transmissão. Entre as formas mais comuns, encontramos: a via transplacentária e/ou


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por leite materno, da mãe infectada para o filho (HINO et al., 1985; HIRATA et al.,

1992; WIKTOR et al., 1993; NOVOA et al., 1999), por transmissão sexual (CHEN et

al., 1998; KAPLAN et al., 1996), transfusão de sangue e/ou hemoderivados e pelo

uso de drogas injetáveis em grupo (UDI) (MANNS e BLATTNER, 1991).

1.2 Epidemiologia da infecção

Durante a história natural do HTLV-1, o desenvolvimento da doença pode

começar após, aproximadamente, 30 a 40 anos de infecção levando a doenças

crônicas e progressivas, como a HAM/TSP e a ATL. Diferentemente, o HIV-1 leva a

uma imunossupressão celular (células T CD4+) que culmina com a progressão da

síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) ao final de 10 anos, na maioria dos

pacientes infectados. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que,

atualmente no mundo, mais de 33 milhões de pessoas estejam contaminadas pelo

HIV-1 (WHO/AIDS, 2008) Segundo o Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde

do Brasil, mais de 720 mil pessoas estão infectadas no Brasil (BOLETIM, 2008).

As retroviroses são importantes causas de morbidade e mortalidade humana,

tornando-se pandemias nas últimas duas décadas. Devido ao seu caráter de

persistência viral, as retroviroses podem existir no hospedeiro na forma silenciosa

durante várias décadas. As retroviroses humanas mais importantes são causadas

pelo HIV-1 e pelo HTLV-1 (DINIZ et al.,1996). O HTLV-1 apresenta uma distribuição

mundial, com características macro e micro-epidemiológicas bastante específicas. A

primeira área endêmica identificada para o vírus HTLV-1 foi o Sudeste e Sul do

Japão (Kyushu, Shikoku e nas ilhas da cadeia Ryushu), onde a prevalência entre

homens doadores de sangue foi de 1,4% e para mulheres de 2,2% (HINUMA et al.,

1986; KAJIYAMA et al., 1986).

O Caribe também é um foco endêmico apresentando grande parte dos

pacientes ATL (EDLICH, 2000; BLATTNER et al., 1982). Áreas adjacentes da

América do Sul, como Venezuela, Guianas e Suriname, e algumas da América

Central, como Panamá e Honduras, também são focos da infecção pelo HTLV-1.

Ainda, vários países da África, como Costa do Marfim, Gana, Nigéria, Zaire, Quênia

e Tanzânia, apresentam elevadas taxas de soropositividade para o HTLV-1.

No Brasil, o HTLV-1 pode ser encontrado em todo o território, e é provável que

este vírus tenha vindo por uma das seguintes vias: o HTLV fazia parte da população


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ameríndia nativa, que veio da Ásia, e/ou pelo tráfico de escravos africanos

(OLIVEIRA et al., 1996). Devido à relativa prevalência encontrada em banco de

sangue, de indivíduos soropositivos para o HTLV-1, em 19 de novembro de 1993

entrou em vigor a Portaria 1376, que estabelece a triagem obrigatória em Bancos de

Sangue no Brasil. A prevalência média entre doadores de banco de sangue é de

cerca de 0,46% no país (GALVÃO et al., 1994).

Apesar de vários estudos terem sido realizados sobre a coinfecção entre

indivíduos portadores de HIV-1 e HTLV-1, pouco se sabe do papel das citocinas e da

replicação de cada vírus. Durante a coinfecção, é sugerido um aumento da

progressão para aids, bem como uma maior possibilidade para o desenvolvimento da

HAM/TSP (BARTHOLOMEW et al., 1987; HARRISON et al., 1997).

Calcula-se que, mundialmente, de 10 a 20 milhões de pessoas estejam

contaminadas pelo HTLV-1. Isto implica uma expansão gradativa do vírus em novos

indivíduos. Apesar da baixa capacidade de desenvolvimento da doença nos

portadores (<5%), a incidência da HAM/TSP e/ou ATL deve ser um problema de

saúde pública, devido ao elevado número de pessoas infectadas. Além disso, há

possibilidade de que 8-10% dos pacientes desenvolvam HAM/TSP quando

apresentarem coinfecção pelo HIV-1 ou outras viroses (EDLICH et al., 2000).

Em países da África, cerca de 0,8% dos indivíduos infectados pelo HIV-1

estariam coinfectados pelo HTLV-1 (VANDAMME et al., 1994). Já no Caribe, onde o

HTLV-1 é endêmico, apresentando 2,4% de soropositividade na população geral, um

estudo com 100 homossexuais masculinos mostrou que 15% apresentavam

anticorpos anti-HTLV-1, dos quais, 40% eram portadores do HIV e 6% apresentavam

a coinfecção HIV/HTLV-1 (BLATTNER, 1982; BARTHOLOMEW et al., 1987). O

seguimento longitudinal desses pacientes revelou que indivíduos assintomáticos

coinfectados pelo HIV e HTLV-1 apresentavam progressão mais rápida para aids,

estatisticamente significante quando comparados com aqueles indivíduos infectados

somente pelo HIV-1 (BARTHOLOMEW et al., 1987).

No Brasil, foi observado que, em São Paulo – SP, 10% dos pacientes vivendo

com aids estavam infectados pelo HTLV-1/2 (CORTES et al., 1989).

Semelhantemente, em Salvador - BA, com 20% (DOURADO et al., 2003), no Rio de

Janeiro 9% (GUIMARÃES et al., 2001) e em alguns destes estudos os indivíduos

infectados apresentavam contagem de células T CD4+ maior que os coinfectados


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pelo HIV-1 exclusivamente (HARRISON e SCHECHTER 1997; CASSEB et al.,

1997).

1.3 Estrutura da partícula viral

O HTLV possui uma estrutura morfológica semelhante à de outros retrovírus.

O vírus consiste de um envelope, um núcleocapsídeo em um nucleóide. A sua

morfologia é de esférica a pleomórfica, medindo de 80 a 100 nm de diâmetro. As

projeções da superfície são constituídas de pequenas espículas que, estão

densamente dispersas cobrindo uniformemente a superfície viral (FRANCHINI et al.,

1995). Pode-se observar que a glicoproteína viral externa (gp46) projeta-se na

superfície viral sob a forma de 72 espículas que se ancoram nas demais estruturas

virais por meio da glicoproteína transmembrânica (gp21) (SCHUPBACH et al., 1989).

O cerne é esférico e o nucleóide concêntrico. O envelope é composto de uma

proteína de superfície (SU) extracelular e uma proteína transmembrana (TM) que

atravessa essa estrutura e ancora a SU. Junto à membrana do envelope se encontra

a proteína matriz (MA), a proteína Gag que está adicionada a um ácido graxo e na

região aminoterminal apresenta uma modificação característica de muitas proteínas

que se situam na face interna da membrana celular. O capsídeo (CA), de simetria

icosaédrica, é composto principalmente pelas proteínas codificadas pelo gene gag e

constitui o cerne da partícula viral. Esta estrutura abriga, em seu interior, o genoma

viral composto de duas fitas de RNA diméricas de senso positivo, às quais estão

associadas a varias pequenas proteínas básicas, chamadas de proteínas do

nucleocapsídeo (NC). Outras proteínas também estão presentes no interior do CA,

como a transcriptase reversa (TR) e a Integrase (IN), essenciais no processo de

integração do DNA proviral no genoma da célula hospedeira (GOFF et al., 2001).

Caracteristicamente, como todos os retrovírus do tipo C, as partículas virais de

HTLV-1 e HTLV-2 podem ser visualizadas pela ultramicroscopia, sendo liberadas

através de fenômenos de brotamento junto à membrana plasmática da célula

infectada. Ao contrário da infecção pelo HIV, não são detectadas partículas virais

livres de HTLV-1/2 no sangue ou em outros fluidos biológicos de indivíduos

infectados, acreditando-se, assim, que as partículas virais sejam exclusivamente

associadas aos linfócitos infectados (IGAKURA et al., 2003).


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A análise molecular do provírus do HTLV-1 revela que o mesmo é constituído

por 9032 nucleotídeos, apresentando nas porções finais uma região chamada de

terminação longa de repetição (LTR). Os genes reguladores apresentam uma

sequência de 1585 nucleotídeos, localizada entre a porção final 3' do precursor do

gene env e o LTR, chamada região X. Nesta região são codificados: um mRNA

policistrônico e três proteínas chamadas de Tax (p40x), Rex (p27) e p21 (GREENE

et al., 1986).

As estruturas do envelope, do core e da transcriptase reversa do HTLV-1 são

codificadas por genes denominados env, gag e pol, respectivamente. A região gag

compreende os nucleotídeos 802 a 2019 do genoma viral. Esta região, quando

codificada, dá origem à proteína da matriz de 19 kDa (p19), à proteína do capsídeo

de 24 kDa (p24) e à proteína do nucleocapsídeo de 15 kDa (p15) (DELAMARRE et

al., 1996 ).

O gene pol, localizado na posição 3' do gene gag, entre os nucleotídeos 2497 a

5187, codifica uma proteína de 296 nucleotídeos, chamada transcriptase reversa,

fundamental para a transcrição do RNA viral em DNA e sua incorporação no genoma

da célula hospedeira, além da RNAse, da endonuclease e da protease. A protease é

codificada pela sequência de nucleotídeos que compreende a parte 3‟ da região gag

e a parte 5‟ da região pol. Assim, a síntese da protease é feita como parte do

precursor poliprotéico gag, acompanhado por desvio de leitura ribossomal. A

protease é responsável pelo processamento dos produtos gag e pela sua própria

clivagem, para gerar a molécula de protease madura (LE BLANC, et. al., 2002).

A p12 é uma proteína de 12 kDa, codificada pelo gene ORF I (Open Region

Frame) do genoma do HTLV-1. Ela pode interagir com as cadeias e do receptor

para IL-2 (CD25). É possível que esta ligação altere a sinalização deste receptor, o

que poderia ocasionar alterações na via de sinalização por CD25, sem a

necessidade da presença desta citocina no meio extracelular. De fato, a contínua

ativação da via de sinalização por CD25 está correlacionada com a independência

de IL-2 das células T, transformadas pelo HTLV-1 em cultura in vitro (FRANCHINI et

al., 1995; JOHNSON et al., 2001).

A Tax e a Rex são proteínas com funções regulatórias do genoma viral, sendo

que ambas são codificadas pela região X do HTLV-1. O gene rex, responsável pela

codificação da proteína p27rex (que é reguladora pós-transcricional da síntese de

proteínas estruturais do vírus), também atua na estabilização de RNAs mensageiros,


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parcialmente processados e utiliza o sistema celular (CRM-1) para exportá-los do

núcleo ao citoplasma. Com esses processamentos alternativos, Rex favorece o

acúmulo de proteínas estruturais e enzimáticas em detrimento das proteínas

regulatórias balanceando a atividade de Tax (YOUNIS e GREEN, 2005). Um dado

importante, que talvez tenha implicações clínicas, é o fato da proteína Rex do HTLV-

1 poder exercer as funções da proteína Rev no HIV-1, até mesmo substituindo-a.

Porém, a Rev do HIV-1 não consegue substituir a Rex no sistema HTLV-1 (GREENE

et al., 1990; JOHNSON et al., 2001).

A Tax é uma fosfoproteína nuclear de 40 kDa com 353 resíduos de aminoácido,

localizada entre a região U3 e a LTR (BEIMLING e MOELLING, 1992; PACA-

UCCARALERTKUN et al., 1994) e regula, indiretamente, a transcrição do genoma

proviral, ao interagir com fatores de transcrição celular e induz sua ligação a sítios

específicos na LTR do HTLV-1, ativando sua transcrição. Ao interagir com proteínas

regulatórias celulares, a Tax pode induzir, indiretamente, a expressão de genes

celulares (FRANCHINI et al., 1995; FERREIRA et al., 1997). O gene tax codifica a

proteína p40tax, transativadora da região U3 do segmento LTR do genoma viral e

também de genes da célula infectada, tais como os que codificam a cadeia do

receptor da IL-2 (CD25), a própria IL-2, a IL-1, a IL-3, a IL-6, a TGF- , fator de

crescimento de granulócitos (GM-CSF), a c-fos, a c-sis, a c-myc, a proteína

relacionada ao paratormônio, entre outros (GREENE et al., 1986; BALLARD et al.,

1988; GREENE et al., 1989). A atividade transativadora de genes celulares, da

proteína p40tax, ocorre por vias intracelulares que envolvem fatores de transcrição

como NF-kB e SRF (LANOIX et al., 1994; SUZUKI et al., 1993). O gene que codifica

a cadeia da polimerase , uma enzima envolvida no reparo do DNA, foi único gene,

descrito até o momento, cuja transcrição foi inibida pela Tax (FRANCHINI et al.,

1995; FERREIRA et al., 1997; JOHNSON et al., 2001).

O gene env, localizado na região 5180 a 6647, é responsável pela codificação

das glicoproteínas externas do envelope (a precursora gp61/68 e sua derivada gp46)

e da proteína transmembrana (gp21). O gene env contém uma sequência de

nucleotídeos que é clivada no início do processo de maturação viral. Um domínio

amino-terminal corresponde a uma glicoproteína externa gp68 que é clivada na

região carboxi-terminal, resultando em uma proteína transmembrana com 21 kDa e

outra externa de 46 kDa (DELAMARRE et al., 1996).


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As gp46 e gp68 têm importante papel na entrada do vírus HTLV-1 na célula

alvo e também na indução da produção de anticorpos neutralizantes contra este

vírus. A LTR do HTLV-1 apresenta 754 nucleotídeos, responsáveis pelos sinais

iniciais e terminais da transcrição, assim como pela integração do genoma retroviral

ao DNA da célula hospedeira. As sequências que, imediatamente, flanqueiam o LTR

têm importante papel, no início da síntese do DNA proviral a partir do RNA genômico

(HASELTINE et al., 1985).

1.4 Ciclo de replicação viral

O ciclo de replicação viral do HTLV-1 é típico dos retrovírus (Figura 1). A

primeira etapa do ciclo, na adsorção do vírus, ocorre pela ligação da porção amino-

terminal da SU ou domínio de ligação (RBD) ao receptor da membrana celular

GLUT-1, um transportador de glicose. A subunidade TM apresenta um importante

papel durante a fusão da membrana que culmina com a introdução do cerne no

citoplasma da célula infectada. A retrotranscrição do genoma viral de RNA para

DNA, pela enzima TR, usando como iniciador o tRNApro ocorrerá dentro do cerne

viral. Um passo importante para que a integração do genoma possa ocorrer é a

entrada do DNA viral no núcleo da célula hospedeira. A proteína IN é responsável

pela inserção do DNA viral no cromossomo do hospedeiro formando o pró-vírus

(MANEL et al., 2004).

O processo de integração do pró-vírus marca o final da fase precoce do ciclo

de multiplicação do vírus e inicia a fase tardia que é mediada por enzimas do

hospedeiro. Ocorre então, a síntese de RNA viral utilizando o DNA pró-viral como

molde. A síntese do RNA viral leva à formação de um longo transcrito primário, que

é processado para formar os mRNAs e RNA genômico. As proteínas são

sintetizadas no ribossomo a partir dos mRNAs e algumas são processadas pós-

traducionalmente. O genoma RNA é empacotado devido à presença de sequências

específicas na terminação 5‟, denominadas sequências de empacotamento ou

regiões Psi. A partícula viral madura contém um RNA dimérico que é altamente

condensado em uma estrutura estável, compactamente enovelada. Um aspecto

importante na etapa de empacotamento é a incorporação do tRNA junto com o

genoma para servir de iniciador para a síntese da fita negativa de DNA. O

processamento dos precursores Gag e Gag-Pro-Pol está ligado à montagem e


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brotamento, e é controlado de forma que os precursores não são clivados até a

montagem da partícula viral. A maturação é um processo complexo, necessário para

a formação da partícula infecciosa, onde ocorre o processamento proteolítico das

proteínas do CA, obtendo-se finalmente a partícula viral madura, pronta para infectar

novas células (GOFF, et al., 2001; MANEL, et al., 2004).

Figura 1 – Replicação do HTLV-1. A entrada do vírus se dá pelo receptor celular (GLUT-1) que se liga à proteína de superfície viral (SU). Após a perda do capsídeo, o genoma viral é convertido a DNA pela TR e inserido no genoma celular na forma de pró-vírus

FONTE: Adaptado de © 2009 QIAGEN.


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1.5 Resposta Imune ao HTLV-1

O HTLV-1 infecta preferencialmente células linfóides T periféricas,

predominantemente linfócitos TCD4+ de memória (CD45RO+) e linfócitos T CD8+,

observando-se inicialmente um padrão policlonal de integração viral. As células

infectadas podem ser imortalizadas e transformadas pelo vírus in vitro, tornando-se

capazes de proliferar independentemente do estímulo de IL-2 exógena na cultura

(CANN and CHEN, 1996; CHEN et al., 1998). O HTLV é transmitido célula a célula

utilizando uma “sinapse viral” induzida, ou seja, o vírus induz eventos de polarização

das células e facilita a junção das células infectadas com as não infectadas,

facilitando a passagem viral (IGAKURA et al., 2003; BANGHAM, 2003). Manel et al.

(2005) mostraram alta acumulação de GLUT-1 nessas áreas de sinapse, facilitando a

fusão viral. Um fato interessante abordado por estes pesquisadores é que em

neonatos há aumento homeostático da citocina IL-7, que induz significativamente a

expressão de GLUT-1. Esse fato aumentaria não só a disponibilidade do receptor,

mas também da atividade metabólica celular, cruciais para a propagação viral após a

transmissão materno-infantil do HTLV-1 (Figura 2). Para assimilarmos o meio de

transmissão e os problemas que os retrovírus podem trazer para a sociedade, faz-se

necessário compreender a resposta imune antiviral e entender alguns mecanismos,

estratégias e habilidade das partículas virais e suas funções. Uma das primeiras

dificuldades da resposta imune do hospedeiro aos vírus, é sua variabilidade

antigênica, devido à baixa fidelidade do RNA durante a replicação viral, levando ao

surgimento de mutações. Assim, muitas viroses conseguem neutralizar os anticorpos

específicos e se transformam em potentes microrganismos (ALCAMI e

KOSZINOWSKI, 2000).


28

Figura 2 – Modelo de replicação célula a célula. A figura ilustra o contato célula a célula

para criar a sinapse virológica. Nota-se a participação do antígeno 1 de função

associada ao linfócito (LFA1), e da molécula de adesão(ICAM1). Tax contribui

para a formação do centro de organização de microtúbulos (MTOC).

FONTE: Adaptado de Matsuoka e Jeang, 2007.

Os interferons (INF) são a primeira linha de defesa contra agentes virais, sendo

as principais proteínas que protegem as células contra a infecção viral. Os INF

apresentam uma grande generalização e estão envolvidos na interação intracelular

restrita à replicação viral, na sinalização celular em presença do patógeno e no alvo

da resposta imune adaptativa (GRANDVAUX et al., 2002). Grande parte das viroses

são bloqueadas pelo INF na resposta transcripcional e na quinase Janus (JAK), nos

caminhos de ativação e transdução de sinais (STAT) e por caminhos efetores que

levam as células a entrarem em estado antiviral, limitando a replicação viral

(ALCAMI e KOSZINOWSKI, 2000).

A sinalização que ocorre nas infecções virais pode ser mediada pela interação

direta do vírus com o receptor celular, o que pode ser ilustrado pela sinalização dos

receptores da quimiocina CXCR4, quando encontram a glicoproteína do envelope

gp120 do HIV-1. Em outro modelo de infecção viral, o poxvírus utiliza o receptor da

quimiocina CCR5 e o vírus demonstrou ser independente da capacidade de

sinalização da CCR5 (GRANDVAUX et al., 2002).


29

Os indivíduos com HAM/TSP apresentam diversos parâmetros imunológicos

alterados quando comparados aos indivíduos infectados assintomáticos. Dentre os

mais relevantes, destacam-se os elevados títulos de anticorpos específicos para

antígenos do HTLV-1, tanto no soro quanto no líquido cefalorraquidiano, a carga pró-

viral elevada, o aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nas regiões

afetadas da medula espinal, o aumento da capacidade migratória dos leucócitos

circulantes e o aumento percentual de linfócitos T-CD8+ ativados específicos para o

HTLV-1 (NAGAI et al., 2001).

A análise das características intrínsecas encontradas em portadores de

HAM/TSP sugere que fatores distintos possam estar envolvidos no estabelecimento

da mielopatia. Alguns autores acreditam na existência de reatividade cruzada entre

os componentes autólogos e antígenos do HTLV, sugerindo a ocorrência de

fenômenos auto-imunes no desenvolvimento da lesão medular. Um dos prováveis

mecanismos propostos para essa reatividade cruzada seria a produção de

anticorpos por meio de um fenômeno denominado mimetismo molecular, onde

ocorrem semelhanças estruturais entre proteínas virais e componentes autólogos,

como já observado entre a proteína viral Gag e a enzima transaldolase presente em

oligodendrócitos (BANKI et al., 1994). Outro mecanismo capaz de induzir

reatividade cruzada seria a perda da tolerância periférica de linfócitos T auto-reativos

através de um processo auto-imune, ocasionado durante a seleção negativa de

linfócitos T imaturos no timo (ABBAS, 1998).

1.6 Patogênese

A HAM/TSP é definida como uma doença que apresenta um quadro clínico

progressivo e leva à cronicidade, usualmente de início insidioso, que acomete de 1 a

5% dos portadores e está associada a um grau variável de disfunções esfincterianas

e sensitivas. Seu predomínio aparece nas regiões tropicais e subtropicais,

respondendo por cerca de 40% a 60% das mielopatias de origem indeterminada

(GESSAIN e GOUT, 1992; OSAME, 1992). O curso clínico da doença pode levar

décadas, com um pico observado entre a 4ª e 5ª década de vida, sendo que, as

mulheres são mais acometidas que os homens numa relação de 2:1. Estima-se que

aproximadamente 5% dos pacientes pode desenvolver HAM/TSP em um curso

clínico que pode demorar décadas (UCHIYAMA et al., 1997).


30

Apesar da HAM/TSP ser uma doença de baixa letalidade, a possibilidade de

levar à incapacidade permanente a torna um sério problema de saúde pública e,

estudos para avaliar quais os fatores envolvidos são importantes. Outras

características neurológicas são encontradas na HAM/TSP, como contrações e

fraqueza dos membros inferiores, distúrbios urinários e perturbações sensoriais

torácicas (GESSAIN et al., 1985; OSAME et al., 1986).

Do ponto de vista patológico, existe o comprometimento da medula torácica,

com espessamento leptomeníngeo e atrofia medular em diferentes graus. Os

achados histopatológicos incluem infiltração linfocitária perivascular,

desmielinização, degeneração axonial e gliose. A intensidade da reação inflamatória

está relacionada com a duração da doença (GESSAIN et al., 1992; IWASAKI et al.,

1993). Progressivamente, ocorre uma degeneração da substância branca,

particularmente do trato córtico-espinhal lateral, com pouco envolvimento da

substância cinzenta. Segundo Iwasaki et al. (1993) e Yoshioka et al.(1993), os casos

mais avançados são de longa duração e o processo de degeneração predomina

sobre a inflamação. Há grande discussão no que se refere ao acometimento neuro-

degenerativo, principalmente na região lombar, uma possível explicação para este

fato é que há uma grande perivascularização, propiciando um intenso processo de

fluxo de células do sistema imune nessa área da coluna vertebral (JOHNSON et al.,

2001).

Acredita-se que a integração do genoma HTLV-1 está presente em 3% a 15%

nas células mononucleares (CMN) de pacientes com HAM/TSP. Foi encontrada uma

elevada relação de linfócitos T CD4+/CD8+ ativados com altos níveis de expressão

do haplótipo DR do HLA na maioria desses pacientes. Estes dados concordam com

a idéia de que a carga viral de HTLV-1 é importante para o aparecimento dos

sintomas neurológicos (GESSAIN et al., 1992; NAGAI et al., 1998; MANNS et al.,

1999).

Existem três hipóteses principais para tentar explicar a patogênese da

HAM/TSP: citotoxicidade direta, auto-imunidade e dano circundante. A primeira

hipótese pressupõe que o HTLV-1 infecta as células da glia in vivo, as quais

apresentariam antígenos virais em sua superfície celular. Os CTLs específicos

circundantes atravessariam a barreira hemato-encefálica, e encontrariam a célula

infectada, causando sua morte por liberação de citocinas. A segunda hipótese

presume que um antígeno próprio na célula da glia é similar ao antígeno viral.


31

Células T CD4+ encontrariam esse antígeno viral na periferia e ao atravessar a

barreira hemato-encefálica, confundiriam a célula da glia com uma célula infectada

disparando uma resposta auto-imune com a consequente morte da célula glial

(HOLLSBERG e HAFLER, 1995). Na terceira hipótese, células T CD4+ infectadas

com HTLV-1 e linfócitos T CD8+ específicos anti-HTLV-1 migrariam através da

barreira hemato-encefálica, se encontrariam no sistema nervoso central e, assim, as

células da glia seriam destruídas pelas citocinas liberadas pelos CTLs contra as

células T CD4+ infectadas (SHIMAMOTO et al., 1996). Poucas evidências suportam

a primeira hipótese, mas as duas últimas podem estar presentes no curso da

patogênese da HAM/TSP (JACOBSON et al., 2002; OSAME et al., 2002; LEVIN et

al., 1998).

Além de possuir características líticas, as CTL, ou outras células

mononucleares, são fontes importantes de mediadores pós-inflamatórios solúveis

que podem contribuir, significativamente, para a patogênese da HAM/TSP (HANON

et al., 2000). Estudos revelam que a infecção pelo HTLV-1 aumenta a secreção de

IL-6 em cultura de células da microglia, em humanos, mas não apresentaram

estímulo para a liberação de IL-1 em monócitos ou células da microglia. Assim, TNF-

e IL-6 têm sido implicados no processo inflamatório de desmielinização e gliose,

sendo proposto que células da microglia humana e monócitos infectados e ativados

pelo HTLV-1 poderiam ter um papel na patogênese da HAM/TSP (NAGAI et al.,

1998).

Além da indução de IL-2 e CD25, na HAM/TSP, há fatores genéticos que

podem conferir um aumento na resposta imune contra o HTLV-1. Por exemplo,

foram encontrados haplótipos de HLA específicos em 70% dos pacientes japoneses

com HAM/TSP, mas não em indivíduos com ATL. Os linfócitos de sangue periférico

que apresentam este haplótipo (HLA-A*02+) exibem uma resposta imune elevada

contra o antígeno do HTLV-1, considerando que os haplótipos associados à ATL

apresentam baixa resposta (JEFFERY et al., 1999).

1.7 Carga Pró-viral do HTLV-1

A carga pró-viral no HTLV-1 é, na maioria das vezes, quantificada em células

mononucleares do sangue periférico, e é caracteristicamente alta quando


32

comparada à infecção por outros vírus. Apesar dos valores variarem de um indivíduo

para outro, a média da carga pró-viral num paciente assintomático é

significativamente mais baixa que em pacientes com ATL (HISHIZAWA et al., 2004),

HAM/TSP ou outras doenças de caráter inflamatório, entretanto existam

sobreposições de valores entre assintomáticos e sintomáticos. A importância da

carga pró-viral é ressaltada no desenvolvimento da uveíte e artrite reumatóide

(YAKOVA et al., 2005).

No contexto da ATL, uma condição associada à carga pró-viral aumentada

pode ser considerada um estágio intermediário, e é frequentemente complicada por

infecções oportunistas, como estrongiloidíase ou micose. Apesar disso, fatores

genéticos dos hospedeiros também devem contribuir para a replicação do vírus in

vivo, tornando o monitoramento da carga pró-viral um fator importante para

determinação da susceptibilidade e resistência ao vírus (NAGAI et al., 1998).

Outros estudos ainda comparam a carga pró-viral e a transmissão sexual

tanto no que se aplica ao tempo de relação quanto à variação da probabilidade de

transmissão associados à carga pró-viral elevada (ROUCOUX et al., 2005).

Apesar da sua aplicação na comparação de diferentes estágios de

desenvolvimento de doenças associadas ao HTLV-1, a carga pró-viral representa

um modelo de monitoramento clínico de difícil interpretação para algumas patologias

ou na correlação com o prognóstico. Por exemplo, em alguns pacientes foram

observadas alterações na carga pró-viral sem nenhum grau de comprometimento

motor (TAKENOUCHI et al., 2004), podendo ocorrer também, uma grande flutuação

da carga pró-viral durante tratamento com corticoesteróides ou drogas antiretrovirais

(MATSUZAKI et al., 2001; TAKENOUCHI et al., 2004; TAYLOR et al., 1999) e a

correlação da carga pró-viral no líquido cefalorraquidiano tende a ser mais coerente

em relação ao sangue periférico (TAKENOUCHI et al., 2003; LEZIN et al., 2005).

Diante dos resultados das pesquisas ao longo dos anos, foi proposto um

modelo de evolução da carga pró-viral do HTLV-1 na patogênese da HAM/TSP

(GRANT et al., 2002). Durante a infecção primária, a carga pró-viral do sangue

periférico seria alta, com um pico momentâneo, seguido por uma queda que se

manteria equilibrada sobre o período de latência clínica. Dependendo da efetividade

da resposta imune do hospedeiro em manter essa carga equilibrada o portador se

manteria assintomático. Se a carga pró-viral sair do equilíbrio e aumentar

continuamente, o portador poderá desenvolver HAM/TSP. Após a instalação da


33

doença, a carga pró-viral alcançaria um novo platô, mantendo-se relativamente

estável ao longo da doença. A invasão da medula óssea por células infectadas pelo

HTLV, e o aumento contínuo da população infectada neste compartimento

corresponderia à progressão em direção à HAM/TSP (BANGHAM et al., 2003).

Devido à ausência de estudos que investigam a presença de carga viral

plasmática do HTLV-1 em pacientes assintomáticos e/ou com HAM/TSP, o impacto

da carga viral plasmática sobre os resultados clínicos, em face à outros marcadores

permanece desconhecido. Portanto, a análise da carga viral plasmática nos

pacientes infectados pelo HTLV-1 pode indicar a possibilidade do HTLV-1

apresentar um estado virêmico e, consequentemente, contribuir com o melhor

esclarecimento dos mecanismos de progressão da infecção, bem como prover

informações importantes sobre o prognóstico dos pacientes infectados com HTLV-1.


50

6 CONCLUSÕES

1. Foi detectada a presença do HTLV-1 no plasma de indivíduos vivendo com

HTLV-1.

2. A carga viral plasmática não possui distribuição homogênea entre indivíduos

assintomáticos ou mesmo nos indivíduos desenvolvendo HAM/TSP.

3. A carga viral, pelo presente trabalho e aplicando as metodologias de amplificação

aqui apresentadas, não demonstrou ser marcador eficiente de progressão de

doença, principalmente pelo fato de ocorrer disparidade entre a significância

apresentada no PCR em Tempo Real e na Nested PCR.


51

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