fatores de resistência estruturais
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Pascholati, Sérgio F.
Esalq/USP
LFT - 5755
Controle de Doenças Através
da Indução de Resistência
Uso intensivo de defensivos agrícolas (agrotóxicos) para
o controle de doenças, pragas e plantas invasoras tem
gerado:
- Contaminação de alimentos, solo, água, animais
- Intoxicação de agricultores
- Resistência de patógenos, pragas e plantas invasoras
- Surgimento de doenças iatrogênicas
- Desequilíbrio biológico (ciclagem de nutrientes e matéria orgânica)
- Eliminação de organismos benéficos / redução biodiversidade
(Brasil responsável por 1/5 do consumo mundial de agrotóxicos –
herbicidas / inseticidas / fungicidas)
“Entretanto, a preocupação da sociedade com o
impacto da agricultura no ambiente e a
contaminação da cadeia alimentar com agrotóxicos
está alterando o cenário agrícola, resultando em
mercados de alimentos produzidos sem o uso de
agrotóxicos ou aqueles com selos que garantem que
os agrotóxicos foram utilizados adequadamente”
Morandi & Bettiol, 2009
Controle alternativo*
Controle biológico Indução de resistência
* Não inclui:
- Melhoramento genético clássico para resistência
- Controle químico clássico
(* Visão do Professor e de outros autores)
Controle Biológico – Conceito
“Controle biológico é a redução da soma de inóculo ou atividades determinantes da
doença, provocada por um patógeno, realizada por um ou mais organismos que
não o homem”
(Cook & Baker, 1983)
Definição mais simples e direta:
“Controle biológico é o controle de um microrganismo através de outro
microrganismo”
(Bettiol & Ghini, 1995)
Controle biológico
Uso de qualquer microrganismo para
controlar um patógeno
Efeito direto sobre
o patógeno
Levedura
Bactéria
Levedura
ou
Bactéria
+ Patógeno
Água – Penicillium sp Streptomyces sp – Penicillium sp
Controle biológico*
Mecanismos de ação dos antagonistas:
- Antibiose
- Competição
- Parasitismo
- Predação
- Hipovirulência
- Indução de defesa do hospedeiro
(* Visão de outros autores, mas não do Professor)
Indução de Defesa do Hospedeiro
(Resistência induzida)
Ativação de mecanismos de resistência
latentes em resposta ao tratamento
com agentes bióticos ou abióticos
A ação se dá sobre a planta hospedeira
modificando a sua relação com o patógeno
Resistência induzida
Indutor
Provocador*
Local Sistêmica
*Provocador = desafiador = patógeno (“Challenger”)
Horas / dias
Características importantes:
- Resposta sistêmica
- Resposta inespecífica
Indutor
Resistência
ativada
.
Sinal é transportado
sistemicamente na
planta
C - Tomateiro cv. Hildaris
protegido por
Piriformospora indica
contra Fusarium
oxysporum
(Qiang et al., 2012 MPP 13: 508-518)
Defesa das plantas:
mecanismos estruturais
e bioquímicos ativados
Componentes do triângulo da doença
Ciclo das relações patógeno-hospedeiro (Ciclo da doença)
O desenvolvimento de doenças infecciosas é caracterizado pela
ocorrência de uma série de eventos sucessivos e ordenados.
Hospedeiro doente
*
*
*
Fisiologia do Parasitismo
(Fisiologia / bioquímica fitopatológica)
Especialidade dentro da fitopatologia envolvida no
esclarecimento das bases bioquímicas e fisiológicas das
interações hospedeiro-patógeno
Tratado: Die Exantheme der Pflanzen
Franz Unger (1833)
Pedra fundamental
Interação planta
x
microrganismo patogênico
Patógeno x Planta
Reconhecimento
Patógeno x Planta
Defesa
(Cavalcanti et al. 2005)
Patógeno x Planta – complexidade da interação
Patógeno Planta
Ataque
Defesa
“NA NATUREZA RESISTÊNCIA É A
REGRA”
“Capacidade da planta em evitar ou atrasar a
entrada e/ou a subsequente atividade de um
patógeno”
A defesa da planta
Estrutural Estrutural
Química
Parede celular
Cutícula
Parede celular
Química
Local Sistêmica
PASSIVA (Constitutiva)
ATIVA (Induzida)
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
(Fatores de resistência)
1)ESTRUTURAIS (FÍSICOS)
Atraso na penetração do hospedeiro
2) BIOQUÍMICOS
Inibição do crescimento
Condições adversas para a sobrevivência
Resistência
Sistema multicomponente / Resulta de um
número de mecanismos operando de maneira
integrada e coordenada
Resistência
Sistema multicomponente / Resulta de um
número de mecanismos operando de maneira
integrada e coordenada
Para serem efetivos os mecanismos de defesa
devem ocorrer em uma seqüência específica
durante a infecção e a colonização
Nível de resistência
“Soma das contribuições de um número de
mecanismos de resistência (constitutivos /
induzidos)”
Cevada
X
Cochliobolus sativus
(Plant Disease 83(3). 1999)
Fatores de resistência
estruturais
Pré-formados Cutícula
Estômatos
Tricomas
Vasos Condutore
Pós-formados
Papilas
Halos
Lignificação
Camadas de cortiça
Camadas de Abscisão
Tiloses
- DEFESAS (BARREIRAS) CELULARES
- DEFESAS (BARREIRAS) HISTOLÓGICAS
Fatores de resistência estruturais
PÓS-FORMADOS
ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR
ATAQUE DO PATÓGENO
MUDANÇAS MORFOLÓGICAS MUDANÇAS BIOQUÍMICAS
Aumento do fluxo citoplasmático em direção
ao sítio de penetração
Rearranjo do citoesqueleto
Migração do núcleo
Justaposição de materiais componentes da
parede celular
Barreiras estruturais pós-formadas
ATAQUE DO PATÓGENO
MUDANÇAS MORFOLÓGICAS MUDANÇAS BIOQUÍMICAS
Agregação citoplasmática
Halos
Papilas
Lignificação
Agregação citoplasmática
Halos
Papilas
Lignificação
Acúmulo de massa de citoplasma no sítio sob ataque
Resposta rápida
Composição: estruturas celulares do tipo retículo
endoplasmático rugoso e complexo de Golgi
AGREGAÇÃO CITOPLASMÁTICA
AGREGAÇÃO CITOPLASMÁTICA
Polarização celular
Movimentação de diferentes
compostos
Mudança na arquitetura
celular
Movimentação do núcleo
(Schmelzer, E. Trends in Plant Science, v. 7, p. 411-415, 2002)
Phytophthora infestans (batata)
ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR
Agregação citoplasmática
Halos
Papilas
Lignificação
HALOS
Alterações da parede celular no ponto (sítio) de
penetração do patógeno
Região parcialmente degradada / sofre reparos
Após formação do halo pode ocorrer a formação de
papila
HALOS
HALOS
Oidio (trigo, cevada)
(Mishina, G.N. et al., Biology Bulletin, 4: 354-360, 2001)
ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR
Agregação citoplasmática
Halos
Papilas
Lignificação
Conídio
Vesícula de
infecção
Hifa primária
Necrotrófico
Papila
Hifa de
penetração
Apressório
Epiderme
PAPILAS
Papilas
Deposição de material
heterogêneo entre a
membrana plasmática e a
parede celular no sítio de
infecção.
Plant Cell 10(8). 1996.
PAPILAS
PAPILAS
Formação: pode iniciar antes da penetração do fungo
e continuar após
Composição: calose, lignina, derivados fenólicos,
silício, suberina, celulose
Função:
barreira contra penetração de fungos (lignificação)
dificulta troca de metabolitos (hospedeiro x
patógeno)
mecanismo de reparo
Blumeria graminis f. sp. hordei (cevada)
(Rudolf Heitefuss. Naturwissenschaften, 88, 273-283, 2001)
Interação Compatível Interação Incompatível
C - conídio
H - hifa
PA - papila
ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR
Agregação citoplasmática
Halos
Papilas
Lignificação
LIGNIFICAÇÃO
Ocorre: citoplasma em degeneração / depósitos extracelulares / paredes
celulares
Lignina: componente da parede celular
Importante: lamela média, paredes
Lignificação Fenilalanina
amônia-liase
(PAL)
Peroxidase
Polímero tridimensional =
unidades de fenil propano
Polimerização - oxidação de
hidroxilas dos grupos fenólicos
pela peroxidase
Lignificação Resistência mecânica
Barreira contra movimento de nutrientes
(Hospedeiro Patógeno)
Barreira contra movimento de toxinas /
enzimas (Patógeno Hospedeiro)
Precursores: tóxicos, lignificação do
patógeno (intercelular)
LIGNIFICAÇÃO
Tubo lignífero
Acúmulo lignina
Lignificação Xanthomonas campestris pv. campestris (repolho)
(Gay, P.A. & Tuzun, S. Canadian Journal of Botany 78: 1144–1149, 2000)
PB e S – Suscetíveis
C – Parcialmente resistentes
GC e H - Resistentes Hidatódios
LIGNIFICAÇÃO
Lignificação (atividade peroxidase)
Xanthomonas campestris pv. campestris (repolho)
(Gay, P.A. & Tuzun, S. Canadian Journal of Botany 78: 1144–1149, 2000)
Controle Inoculado
ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) HISTOLÓGICA
Camadas de Cortiça
Camada de Abscisão
Tilose
Camadas de Cortiça
Camada de Abscisão
Tilose
CAMADAS DE CORTIÇA
Podem ser formadas em resposta: - Injúria Mecânica - Presença de patógenos
CAMADAS DE CORTIÇA
Manchas / lesões locais - fungos / bactérias
Morangueiro X
Mycosphaerella fragariae
Maçã X
Venturia inaequalis
Mancha de micosferela Sarna da macieira
Camada de células suberosas (suberina – polímero insolúvel associado com ceras solúveis) Tecido morto
- Impede invasão
- Impede fluxo de nutrientes
- Impede fluxo metabolitos tóxicos (patógeno planta)
CAMADAS DE CORTIÇA
Camada de Cortiça
Tecido sadio
Felogênio
Tecido doente
Folha com mancha
Epiderme Micélio
Camada de Cortiça
CAMADAS DE CORTIÇA
Formação de camada de cortiça em tubérculo de batata após infecção com Rhizoctonia sp
Grão amido
Camadas de Cortiça
Camada de Abscisão
Tilose
CAMADA DE ABSCISÃO
Podem ser formadas:
- Processo natural - Presença de patógeno
Poda
Fenologia
Colheita
Abscisão do órgão
Camada de abscisão
Camadas de
células
separadas por
dissolução da
lamela média
CAMADA DE ABSCISÃO
Abscisão de folhas, frutos e/ou flores
Interação Patógeno X Hospedeiro
- Sítios de Infecção
- Camadas de células separadas por
dissolução da lamela média
- Enzimas celulolíticas e pectinolíticas
- Proteção do hospedeiro
- Invasão sistêmica
- Metabólitos tóxicos
CAMADA DE ABSCISÃO
Zona de abscisão
Zona de lignificação
Tecido doente Tecido sadio
Células sadias suberizadas
Camadas de
células
separadas por
dissolução da
lamela média
Pessegueiro X
Cladosporium carpophilum
Ameixeira X
Xanthomonas campestris pv. ipruni
Perfurações (Shot hole)
CAMADA DE ABSCISÃO
Camadas de Cortiça
Camada de Abscisão
Tiloses
TILOSES
Vasos lenhosos (xilema)
Situações de estresse, envelhecimento e invasão
por patógenos vasculares
TILOSES
- Células parenquimáticas (xilema) emitem
porções do protoplasma para o interior dos
elementos condutores
TILOSES
- Processo de hipertrofia
- Crescimento em tamanho e número
- Obstrução parcial ou total dos vasos
- Invasão sistêmica
* Acúmulo de terpenóides fungitóxicos
- Transporte de água
TILOSES
Xilema
Tiloses
Fatores de resistência
bioquímicos
ATAQUE DO PATÓGENO
MUDANÇAS BIOQUÍMICAS MUDANÇAS MORFOLÓGICAS
Bioquímicos Inibição do crescimento
Condições adversas para a sobrevivência
Pré-formados
- Fenóis
- Alcalóides
- Lactonas insaturadas
- Glicosídeos fenólicos
- Glicosídeos cianogênicos
- Fototoxinas
- Proteínas / peptídeos antimicrobianos
Pós-formados
- Fitoalexinas
- Espécies reativas de oxigênio
- Quitinases
- -1,3-glucanases
- Proteínas-RP
- Peptídeos antimicrobianos
SUBSTÂNCIAS PRÉ- E PÓS-FORMADAS x RESISTÊNCIA
Presentes em concentracões adequadas nas partes
invadidas
Forma acessível ao patógeno
Mudancas na [substância]
Mudancas na expresão da doenca
Bioquímicos Inibição do crescimento
Condições adversas para a sobrevivência
Pré-formados
- Fenóis
- Alcalóides
- Lactonas insaturadas
- Glicosídeos fenólicos
- Glicosídeos cianogênicos
- Fototoxinas
- Proteínas / peptídeos antimicrobianos
Pós-formados
- Fitoalexinas
- Espécies reativas de oxigênio
- Quitinases
- -1,3-glucanases
- Proteínas-RP
- Peptídeos antimicrobianos
Espécies reativas de oxigênio (EAOs)
Interação de um patógeno com a célula da planta hospedeira
Espécies (re) ativas de oxigênio (EAOs)
(Reactive oxygen species (ROS)
Reconhecimento
elicitor-receptor
Membrana plasmática
célula vegetal
Explosão oxidativa
(rápida geração e
acúmulo de EAOs)
EAOs disparam
peroxidação de lipídeos na
membrana e
a indução de outras
respostas de defesa
Peroxidação
lipídeos
ativa cascata de
sinalização
do ácido
jasmônico
Síntese de
proteínas de defesa
e fitoalexinas
Queima ou explosão oxidativa
(Oxidative burst)
- Um dos fenômenos mais estudados em relação à interação planta-
patógeno (1983 – primeiro relato EAOs x defesa vegetal)
- Produção de moléculas de H2O2, ânion superóxido (O2-) e radicais
hidroxila livres (OH-)
- Substâncias citotóxicas / causam danos oxidativos em lipídeos,
enzimas e ácidos nucleicos podem causar morte celular
(RH)
Espécies reativas de oxigênio
- Podem estar envolvidas na resposta de defesa contra patógenos
- Induzem a síntese de fitoalexinas, participam na síntese de lignina
e etileno, ativam genes de resistência
- Exibem atividade antimicrobiana direta
- Inibição da produção de EAOs favorece a compatibilidade
Reconhecimento
Defesa
Funções das EAO’s na planta
• Efeito tóxico direto do H2O2 ao patógeno
(antifúngico e antibacteriano)
O H2O2 a 0,1 mM inibiu completamente o crescimento de E.
carotovora e mais de 95% do crescimento de P. infestans
(Wu et al. 1995)
Erwinia carotovora sp. carotovora Phytophthora infestans
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
Bioquímicos pós-formados
FITOALEXINAS
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
Bioquímicos pós-formados
Fitoalexinas
Compostos antimicrobianos de
baixa massa molecular,
sintetizados pelas plantas, que
acumulam em células vegetais em
resposta à infecção microbiana.
Síntese de fitoalexinas
• Modelo hipotético para a síntese de fitoalexinas
(Côté, 1995)
SAÍDA DE ELETRÓLITOS
Kievitone (fitoalexina)
Triton X-100 (detergente)
X
Rhizoctonia solani
Fitoalexinas x resistência
• Atividade antifúngica de duas cumarinas de girassol no
crescimento Sclerotinia sclerotiorum
Aiapina
Escopoletina
URDANGARIN et al., 1999
Mecanismos de Defesa
Fitoalexinas
22 horas
30 horas
45 horas
Apressório
Sorgo
X
Colletotrichum
sublineolum
(Ralph L. Nicholson)
Concentração
fitoalexinas
150 mM
9 uM inibe
C. graminicola
in vitro
PROTEÍNAS RELACIONADAS A PATOGÊNESE
(PR-proteins)
“Proteínas-RP” = proteínas induzidas no
hospedeiro após a infecção com patógenos
(podem compreender 10% das proteínas solúveis da folha)
PROTEÍNAS RELACIONADAS A PATOGÊNESE
(PR-proteins)
1970 – folhas de fumo exibindo reação de hipersensibilidade
ao TMV – 10 proteínas isoladas
1993 – 33 proteínas isoladas / 31 caracterizadas / 25
encaixavam nos 5 grupos existentes
2007 – 17 grupos com sub-grupos
(centenas de proteínas isoladas / caracterizadas)
“Proteínas-RP” = proteínas induzidas no
hospedeiro após a infecção com patógenos
(podem compreender 10% das proteínas solúveis da folha)
Características
Características
PR básicas
PR ácidas
Classificação das “Proteínas-RP”
Classificadas em 17 famílias de acordo com:
- Massa molecular
- Composição de amino-ácidos
- Reações serológicas
Exemplos de mecanismos de ação
PR-2
PR-3, PR-4, PR-
8, PR-11
PR-5
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA - Bioquímicos pós-formados
-1,3-glucanases e quitinases
(a) - -1,3 e -1,6-glucanas
(b) - Retículo glicoproteico
(c) - Proteína
(d) - Microfibrilas de quitina (e) - Plasmalema
Mecanismos de Defesa - Quitinases e B-1,3-Glucanases
Célula vegetal Lamela média
Ação antifúngica
• Inibição de Phytophthora infestans em tomate
(Niderman et al., 1995)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)
- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução
- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)
- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução
- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)
- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução
- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas
Proteínas ligantes de quitina (PLQs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Proteínas com sequência conservada de aminoácidos (“chitin-binding domain” – 30 a 43 aa)
- Atividade antifúngica – ligam-se a quitina (altera polaridade celular / inibindo crescimento)
- Induzíveis: algumas incluídas nas “Proteínas-RP “ -
(Proteínas relacionadas a patogênese) – família PR-4
Proteínas ligantes de quitina (PLQs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Proteínas com sequência conservada de aminoácidos (“chitin-binding domain” – 30 a 43 aa)
- Atividade antifúngica – ligam-se a quitina (altera polaridade celular / inibindo crescimento)
- Induzíveis: algumas incluídas nas “Proteínas-RP “ -
(Proteínas relacionadas a patogênese) – família PR-4
Heveina (4,7 kDa / rica
cisteína) - seringueira
Acúmulo induzido por injúria
em folhas e tronco
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)
- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução
- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas
Tioninas
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Peptídeos (5 kDa) ricos em cisteína e aminoácidos básicos
- Encontradas em folhas e sementes
- Podem ser constitutivas ou induzidas por patógenos (Família PR-13)
- Tóxicas a fungos, bactérias, células vegetais e animais (formam canais iônicos
nas membranas celulares)
Tioninas
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Peptídeos (5 kDa) ricos em cisteína e aminoácidos básicos
- Encontradas em folhas e sementes
- Podem ser constitutivas ou induzidas por patógenos (Família PR-13)
- Tóxicas a fungos, bactérias, células vegetais e animais (formam canais iônicos
nas membranas celulares)
Plantas de arroz
Transformadas com gene
codificador para tionina Não-transformadas
Resistentes a
Burkholderia plantarii
Mortas pelo
patógeno
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)
- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução
- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas
Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Inibidores de proteases: 10 a 90 kDa / apresentam especificidade quanto a classe de
protease inibida (serino proteases, aspártico proteases, metalo proteases, cisteíno
proteases)
- Comum a presença de IPs em sementes / tubérculos: atuam como agentes regulatórios
de proteases endógenas e/ou como mecanismo de proteção contra proteases de insetos
e/ou patógenos
- Inibidores de tripsina (trigo sarraceno) inibiram in vitro proteases de Botrytis cinerea
Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Inibidores de proteases: 10 a 90 kDa / apresentam especificidade quanto a classe de
protease inibida (serino proteases, aspártico proteases, metalo proteases, cisteíno
proteases)
- Comum a presença de IPs em sementes / tubérculos: atuam como agentes regulatórios
de proteases endógenas e/ou como mecanismo de proteção contra proteases de insetos
e/ou patógenos
- Inibidores de tripsina (trigo sarraceno) inibiram in vitro proteases de Botrytis cinerea
Superexpressão heteróloga de
genes IP de Nicotiana alata em
fumo transgênico
Aumento da resistência
contra B. cinerea
Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Inibidores de poligalacturonases: proteínas com domínios ricos em leucina
- Contribuem na resistência das plantas:
a) Pela inibição das poligalacturonases
b) Prolongando a vida de oligômeros (10-13 resíduos de galacturonato)
eliciadores da defesa (HR, lignificação, fitoalexinas)
Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)
Proteínas e peptídeos antimicrobianos
- Inibidores de poligalacturonases: proteínas com domínios ricos em leucina
- Contribuem na resistência das plantas:
a) Pela inibição das poligalacturonases
b) Prolongando a vida de oligômeros (10-13 resíduos de galacturonato)
eliciadores da defesa (HR, lignificação, fitoalexinas)
Tomateiro / videira
superexpressando o gene pgip
de pereira
Aumento na atividade
inibitória de PIPG
Diminuição na
suscetibilidade a
Botrytis cinerea
Patógeno x Planta – defesa é o foco da indução de
resistência
Patógeno Planta
Ataque
Defesa