FACTORES QUE AFECTAN LA PROPORCIÓN DE CONCEPCIÓN RECIBIENDO DE EMBRIONES BOVINOS

Luiz F. Nasser1, Carlos R. Rezende1, Manoel Francisco Sá Filho1, Gabriel A. Bo2 y Pietro S. Baruselli3 1 FIRMASA, Campo Grande - MALO, Brasil 2Instituto de Reproducción Córdoba Animal, Córdoba, Argentina, 3Departamento de Reproducción Animal, FMVZ-USP-SP, Brasil, lfnasser@terra.com.br 1. la introducción Aproximadamente 500.000 embriones bovinos que ellos se transfieren en el promedio sobre del mundo. Brasil es como segundo en el mundo en el traslado vivo en este paisaje, en con 107.717 traslados y en primero en la producción y traslado de embriones en el vitro con 128.914 (IETS, 2004). Este dado demuestra la importancia del Traslado de Embriones (USTED) en el paisaje del biotecnologias aplicado al ganado nacional. Los factores innumerables interfieren en la eficacia de programas de USTED, con la prominencia especial al receptor (el Hechizo, 2001,; Hasler, 2001). Esto porque los programas de usted comercio que ellos le presentan, en general, las proporciones del uso bajas. Normalmente, en mucha recepción tratada con los protocolos tradicionales (el uso del prostaglandina asoció al descubrimiento del estro), se toman sólo 40 a 50de los animales la ventaja de para el inovulação. Siendo considerado una proporción de concepción de 50del total de ventaja tomada de animales, se obtiene sólo 20 a 25de gestaciones al final del tratamiento (el Bó et al., 2002). Esta manera, el incremento del uso tasa y de concepción del receptor es fundamental aumentar al máximo la proporción de embarazo y, con eso, para elevar el zootécnico del retorno y barato del USTED, determinando, además del bezerros/ano más grande numera, reducción de los gastos con las hembras vacías en la bandada. 2. Sincronização de usar recibir Prostaglandina y descubrimiento del rodada Algunos de los problemas principales del sincronização de recibir con similar del prostaglandina (PGF2alfa) ellos son: el) la labor calificó para descubrir el rodada; b) la variación en el tiempo de la administración de PGF2alfa a la ocurrencia del estro (2 a 7 días); c) la presencia de lúteo del cuerpo (el ciclicidade) para contestar al tratamiento; d) la cantidad limitada de recibir descubrió en el rodada (alrededor de 50; y) la Prontitud de un gran número de animales que esperan la viabilidad del sincronização. Esto se aliado la situación a la demanda de un gran número de recibir sincronizada que tomó al desarrollo de nuevas conductas devuelto al aumento de la eficacia de recibir mantuvo para presentar. 3. los programas de traslado de embriones en el tiempo fijo Algunos investigadores (el Tríbulo et al., 2000; El Baruselli et al., 2000b, 2000c y 2001,; El Bó et al., 2002) ellos demostraron que las proporciones del uso son más grandes recibiendo sometió a los protocolos de USTED en el tiempo fijo que en aquéllos tratados con un o dos administraciones de PGF2alfa y el descubrimiento del rodada subsecuente. Como las proporciones de concepción de

tales protocolos es similar el aquéllos obtenidos recibiendo trataron exclusivamente con PGF2alfa, el resultado final es el aumento de las proporciones de embarazo de los programas de USTED en el tiempo fijo, además de la ventaja de ellos haga posible la programación del día del inovulação y de ellos evita el trabajo con el descubrimiento del rodada. El Tríbulo et al. (2000) ellos compararon la eficacia de recibir tratada con 2 administraciones de PGF2alfa (el intervalo de 14 días) con el una de hembras sometido al protocolo proceder describieron: en los 0, los he/she interfirieron un CIDR (Pfizer) juntos a la administración IM de 2 mg de Benzoato de Estradiol y 50 mg de Progesterona; en los 7 los dispositivos estaban jubilados, y se administró 0,150 mg de D-cloprostenol (PGF2alfa); en los 8, aproximadamente 24 horas después de la retirada del usted implanta, se administró 1 mg de Benzoato de Estradiol IM; los 9 fueron considerados el momento del rodada; así, en los 16 el inovulação que" uno-paso" se procedió en el tiempo fijo por el método ningún-quirúrgico. Los inovulação del receptor apenas trataron con PGF2alfa que era los 7 días cumplidos después del descubrimiento del estro. Sólo los portadores de las vacas de lúteos de los cuerpos (CL) 15mm a la evaluación extremista-sonográfica era los inovuladas. Los resultados de ese estudio están en la Mesa 1. Mesa 1. use las Proporciones, de concepción y de embarazo en solas vacas descubiertas en el estro después de dos administraciones de PGF2alfa o transfirió en el tiempo fijo después del tratamiento con CIDR-B y Benzoato de Estradiol. Córdoba, Argentina, 2000.

Como él puede observarse en la mesa 2, los protocolos que usan el progesterona para USTED en el tiempo fijo presentaron los resultados similar al tratamiento con PGF2alfa, con la ventaja de soltar el descubrimiento del rodada, en las grandes condiciones de respuesta al tratamiento con PGF2alfa. Sin embargo, ese experimento era cumplido en las condiciones del manejo y la pastura argentina, mientras teniendo selección anterior de recibir cíclico simplemente, para que la proporción de uso del PGF2alfa de grupo sea anterior el promedio brasileño. 4. el efecto del área de CL y del plasmática de progesterona de concentración en la proporción de concepción de recibir el taurus de Bos x el indicus de Bos La relación entre la proporción de concepción, el plasmática de progesterona de concentración y el tamaño de CL recibiendo de embrión bovino es objeto de controversias entre los especialistas. Varios investigadores han estado verificando la correlación positiva entre las tales variables. De acuerdo con el Vasconcelos et al. (2001), como más grande el volumen del lúteo del cuerpo, el adulto será la concentración del progesterona, por consiguiente, que la proporción de concepción más grande se obtendrá en vacas inseminadas en el tiempo fijo. Esos descubrimientos están de acuerdo con experimento logrado por nuestro grupo (el Baruselli et al., 2000b) en que se verificó que el área de CL se asocia al plasmática de progesterona de concentración y la proporción de concepción de recibir el indicus de Bos x el taurus de Bos, como demostrado en la Mesa 2.

Mesa 2. la Concentración del progesterona y proporción de concepción según el área del lúteo del cuerpo en los 6 del estral del ciclo recibiendo de embrión bovino (el indicus de Bos x el taurus de Bos).

Estudos demonstram a relação entre a concentração plasmática de progesterona e a taxa de concepção (Binelli et al., 2001; Reis et al., 2004). O aumento das concentrações plasmáticas de progesterona no diestro foi correlacionado com o desenvolvimento embrionário, pelo maior aporte de nutrientes para o lúmen uterino (Geisert et al., 1992), e com sua capacidade de secretar interferonmenosi (Mann et al., 1999; Kerbler et al., 1996; Mann y Lamming, 2001), provocando diminuição da secreção de PGF2alfa pelo endométrio uterino e bloqueio da luteólise (Mann et al., 1995, 1999; Wathes et al., 1998). Esse fenômeno foi associado ao aumento das taxas de concepção (MacMillan et al., 1994; Baruselli et al., 2000a; Santos, 2000). No entanto, alguns pesquisadores não observaram esse efeito (Nogueira et al., 2004; Spell, et al., 2001; Hasler, et al., 1980; Tríbulo et al., 1997).

Outro estudo por nós realizados com o objetivo de superovular receptoras para a inovulação de embriões em tempo fixo (Baruselli et al., 2000c e 2001) demonstrou relação positiva entre o número de corpos lúteos, a concentração plasmática de progesterona e a taxa de concepção após a transferência de embriões congelados em etilenomenosglicol. Nesse estudo, foram utilizadas 100 novilhas mestiças Bos taurus x Bos indicus mantidas a pasto no município de Botelhos (MG). No grupo Controle (nigual50), inseriumenosse um implante intravaginal contendo 1,9 g de Progesterona (CIDRmenosB, Pfizer), juntamente à administração de 2,0 mg de Benzoato de Estradiol (BE), IM (Estrogin, Farmavet) e de 50 mg de Progesterona, IM (dia 0). No dia 7 pela manhã foram aplicados 500 mg de PGF2alfa (Cloprostenol sódico IM, Ciosin, Coopers), e à tarde os implantes foram retirados. No dia 8 pela manhã administroumenosse 0,5 mg de BE, IM. O grupo superestimulado com eCG (nigual50) recebeu o mesmo protocolo, acrescido da administração de 800 UI de e.C.G., IM (Novormon, Tecnopec) na manhã do dia 5. Para a contagem do número de folículos c 0,8 cm (FG), a avaliação ultramenossonográfica ovariana foi realizada no dia 8 (Controle, nigual25; eCG, nigual24). No dia 15 foram colhidas amostras de sangue para dosagem da concentração plasmática de progesterona (48 animais por grupo), bem como realizadas avaliações ultramenossonográficas (todos animais), para contagem do número de corpos lúteos e classificação das receptoras para inovulação. Os corpos lúteos únicos foram classificados em: CL 1 (área c 2,2 cm2), CL 2 (área 2,19 cm2 e 1,4 cm2) ou CL 3 (área 1,39 cm2 e 1 1,30 cm2). No dia 16, todas as receptoras classificadas como aptas (Controle: nigual17 e eCG: nigual40) foram inovuladas em tempo fixo com um embrião descongelado “one step” (etilenomenosglicol), pelo método nãomenoscirúrgico e pelo mesmo veterinário. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 3 e 4.

Tabela 3. Número médio de CL (T desvio padrão), concentração plasmática de progesterona (P4) (1 dia prévio a TE) e taxas de prenhez em receptoras Bos taurus x Bos indicus tratadas com

dispositivos CIDRmenosB Estradiol/progesterona no Dia 0, com ou sem 800 UI de eCG no Dia 5 e inovuladas em tempo fixo.

Assim, o tratamento com eCG no momento esperado da emergência da nova onda de crescimento folicular foi eficaz na superovulação ou desenvolvimento de um folículo dominante único de maior diâmetro e determinou, além de maior número de corpos lúteos (ou corpo lúteo único maior), maior concentração plasmática de progesterona e maiores taxas de aproveitamento, concepção e prenhez que o tratamento utilizado no grupo controle. Bó et al. (2002) propuseram um protocolo semelhante (Figura 1), e verificaram que a utilização de 400 UI de eCG no momento da emergência da onda de crescimento folicular determinou apenas 2de dupla ovulação em receptoras cruzadas. No entanto, esse tratamento formou corpos lúteos únicos maiores e incrementou a taxa de concepção e de prenhez em receptoras inovuladas com embriões congelados em etileno-glicol, comparado com o grupo controle, que não recebeu eCG (Tabela 5).

Figura 1. Protocolo para TE em tempo fixo em bovinos. O tratamento consiste na inserção de um dispositivo liberador de progesterona juntamente à administração de Benzoato de estradiol (BE) e progesterona (P4) no Dia 0, PGF e 400 UI de eCG no Dia 5, remoção do dispositivo no Dia 8, e BE no Dia 9. O estro não é observado e a TE é realizada no Dia 17 em receptoras com CL 10 mm (Bó et al., 2002).

Tabela 5. Diâmetro do CL (média T desvio padrão; dia prévio a TE) e taxa de prenhez em receptoras tratadas com dispositivos DIV-B estradiol/progesterona no Dia 0, com ou sem 400 UI de eCG administrados no Dia 5 e inovuladas em tempo fixo.

a Diâmetro do CL aferido por ultra-sonografia em receptoras transferidas (CL a 10 mm).bc Médias ou percentagens nas colunas com diferentes sobrescritos diferem significativamente (P-0,02).

Trabalho recente foi realizado pelo nosso grupo de pesquisa (Marques et al., 2003) para verificar os efeitos do eCG (administrado no momento da retirada de implantes intravaginais de progesterona) e do Benzoato de Estradiol (24 h após a retirada do implante) em vacas lactantes (60 dias pós-parto) meio sangue Nelore x Angus. Os animais foram tratados com BE (2 mg) no dia 0 e com implante intravaginal de progesterona (CIDR) por 8 dias, sendo aplicado D-cloprostenol (150 g) no momento da retirada do implante (dia 8). Após a retirada dos implantes, os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 1 – não recebeu eCG nem BE; Grupo 2 – recebeu eCG no dia 8 (retirada do implante) e não receberam BE; Grupo 3 – não recebeu eCG e receberam o BE no dia 9 (24h após retirada do implante); Grupo 4 – receberam eCG no dia 8 e receberam BE no dia 9.Na tabela 6 pode-se evidenciar o efeito do eCG no aumento das concentrações plasmáticas de progesterona 12 dias após o tratamento. Observou-se que os animais que receberam eCG apresentaram maiores concentrações plasmáticas de P4 (8,6 a 0,9 vs 4,5 0,7 ng/ml; P - 0,05). O tratamento com BE não influenciou as concentrações plasmáticas de P4. No entanto, verificou-se aumento na taxa de ovulação com o uso de BE (54,2 vs 80,8 P - 0,05). O eCG aumentou a taxa de ovulação (60,0 vs 76,0, entretanto não se verificou diferença significativa (P 0,05). O BE mostrou-se eficaz na sincronização da ovulação (Teste de Bartlett, Pigual0,01) e na antecipação do momento da ovulação (com BE igual 69,4 m 2,0 vs sem BE igual 86,3 4,8 h; P - 0,05). Já, o tratamento com eCG foi menos eficiente que BE na sincronização da ovulação (Teste de Bartlett, Pigual0,59). Com a antecipação da ovulação no grupo BE, verificou-se que os folículos pré-ovulatórios apresentaram menor diâmetro em relação ao grupo que não recebeu o BE (11,72 o 0,25 vs 13,83 0 0,41 mm; P - 0,05).

Tabela 6 – Efeitos do uso de eCG em vacas Brangus lactantes tratadas com implante vaginal de progesterona. São Manuel – SP, 2002.

Na seqüência dos experimentos, Reis (2004) comparou diferentes doses de eCG (400 vs 500 vs 600 UI) administradas no Dia 5 ou no Dia 8 do tratamento com dispositivo intravaginal de progesterona (DIBp ). Foram utilizadas 600 receptoras nulíparas Bos indicus x Bos taurus mantidas a pasto no Brasil Central. Os resultados estão demonstrados na tabela 7.

Tabela 7. Número de CL, taxas de aproveitamento, de concepção, de prenhez de embriões PIV em receptoras.tratadas com dispositivos intravaginais de progesterona (DIBt ) no Dia 0 e com diferentes doses de eCG (Novormond ) no Dia 5 ou no Dia 8 do tratamento. Fazenda Sonho Real, Campo Grande – MS, 2004.

Não foi verificado efeito da dose de eCG sobre a eficiência dos protocolos empregados. No entanto, quando se analisou o efeito do dia da aplicação do eCG (D5 vs D8), observou-se diferença estatisticamente significativa (Tabela 8). Receptoras tratadas com eCG no Dia 5 apresentaram maiores taxas de aproveitamento, de concepção e de prenhez. O número de CL e a concentração plasmática de progesterona conforme o grupo experimental estão descritos na Tabela 8.

Tabela 8. Número de CL e concentração plasmática de progesterona em receptoras tratadas com dispositivos intravaginais de progesterona (DIBd ) no Dia 0 e com eCG (Novormon) ) no Dia 5 ou no Dia 8 do tratamento. Campo Grande – MS, 2004.

Com o objetivo de analisar o efeito da administração de Progesterona (IM) e de Benzoato de Estradiol (IM) no momento da inserção dos dispositivos intravaginal de progesterona (DIBE ), nosso grupo de pesquisa (Nasser et al., 2004) comparou receptoras tratadas com 50 mg de Progesterona 2 mg de Benzoato de Estradiol com receptoras que receberam apenas 2 mg de Benzoato de Estradiol no Dia 0. Também, comparou-se o efeito da administração de 400 UI de eCG no Dia 5 ou no Dia 8. Nesse experimento utilizou-se 300 receptoras nulíparas Bos indicus x Bos taurus. Verificou-se que a administração de Progesterona (IM) no momento da inserção do dispositivo intravaginal não apresentou efeito positivo na eficiência dos protocolos. No entanto, o dia de aplicação do eCG (D5 vs D8) influenciou na eficiência dos protocolos (Tabela 9). Receptoras tratadas no Dia 5 apresentaram tendência de melhores taxas de prenhez (Pigual0,1).

Tabela 9. Taxas de aproveitamento, de concepção e de prenhez de embriões PIV em receptoras tratadas com dispositivos intravaginais de progesterona (DIBt ) e Benzoato de Estradiol (BE; IM) associado ou não à Progesterona (IM) no dia 0 e com a administração de eCG no dia 5 ou no dia 8. Campo Grande – MS, 2003.

Ab, ef Médias nas colunas com letras sobrescritas diferentes diferem estatisticamente (P - 0,05).cd Médias nas colunas com letras sobrescritas diferentes diferem estatisticamente (P igual 0,1)

5. Aplicação da sincronização do estro e da ovulação de receptoras de embriões para transferência em tempo fixo em escala comercial. A aplicação comercial dos protocolos de sincronização do estro e da ovulação para inovulação em tempo fixo em bovinos tem sido amplamente utilizada por profissionais da área no Brasil. Neste sentido foram analisados dados obtidos de uma central de receptoras (Firmasa, Campo Grande, MS, Brasil) na qual foram realizadas 5277 inovulações, durante o período de setembro de 2003 a abril de 2004. Todas as receptoras foram sincronizadas pelo mesmo protocolo de sincronização, utilizando implante intravaginal de progesterona e 2,0 mg de benzoato de estradiol no Dia 0, eCG (400 UI) e PGF2α no dia 5, retirada do implante de P4 no Dia 8 e no Dia 9, 1,0 mg de benzoato de estradiol (Figura 1). Vale ressaltar que todos os embriões transferidos foram produzidos in vitro. No momento da transferência dos embriões as receptoras foram avaliadas por ultra-sonografia obtendo o número de corpus lúteo ou o diâmetro do corpo lúteo único. O diagnóstico de gestação e a sexagem fetal foram realizados aos 30 dias e aos 60 dias após a transferência dos embriões, respectivamente. A taxa de prenhez aos 30 e aos 60 dias foram de 49,1(2592/5277) e de 42,16 (2225/5277). Pode-se observar um decréscimo nas taxas de prenhez quando se utilizou receptora que apresentavam o diâmetro do CL único de 16mm (38,1 107/281) em relação aos animais que apresentaram um corpo lúteo de 18mm (46,3 270/583), 20mm (47,0 597/1272) ou 22mm (51,4b; 920/1790). Também foi observado um efeito do estágio de desenvolvimento embrionário sobre as taxa de prenhez das receptoras. As receptoras que receberam um blastocisto em eclosão promovem taxas de prenhez (60,6a; 40/66) semelhantes às obtidas a partir da transferência de blastocistos (46,5abc;

787/1693) ou blastocistos expandidos (52,2ab; 1284/2460), no entanto maiores taxas do que mórulas (34,5c; 48/139) ou blastocistos iniciais (42,0 bc; 431/1026) ou blastocistos eclodidos (37,1bc; 13/35).

6- Protocolo de sincronização com Cipionato de Estradiol como indutor de ovulação.

Com o objetivo de facilitar o manejo diminuindo a quantidade de vezes em que as receptoras têm que vir para o curral para o tratamento de sincronização, nosso grupo de pesquisa empregou um novo protocolo de sincronização onde foi utilizado o Cipionato de Estradiol (ECP) como indutor de ovulação. Embora a dose de ECP recomendada para indução de cio seja de 3 a 5 mg, a dose empregada para indução de ovulação em programas de IATF é de 0,5 mg de ECP (Ambrose et al., 2005). O Cipionato de Estradiol, tem como característica uma meia vida mais longa que o BE e o 17 β Estradiol , portanto a dosagem recomendada poderia levar a altas concentrações de estradiol por um período prolongado interferindo com a ovulação e transporte dos espermatozóides (Vynckier et al., 1990). O ECP na dosagem de 0,5 mg já foi demonstrado ser tão eficiente em induzir a ovulação quanto ao pLH e ao GnRH, e aliado ao seu baixo custo vem sendo pesquisado para ser empregado em protocolos de IATF (Ambrose et al., 2005).

Para os protocolos de TETF algumas modificações foram feitas levando em consideração os resultados obtidos com o protocolo descrito anteriormente. A proposta inicial foi de diminuir o protocolo de sincronização de quatro para dois dias de tratamento, diminuindo em 50 o manejo no curral. Para tanto, o eCG que se mostrou eficaz quando aplicado no Dia 5 do protocolo para superovulação passou para o Dia 8, dia da retirada do implante de P4 e da aplicação do ECP, com a função de produzir um Corpo Lúteo único de diâmetro maior e com maior capacidade de produzir progesterona .

Recentemente, nosso grupo demonstrou a possibilidade do emprego deste protocolo reduzido para utilização em TETF (Rezende et al., 2005). Neste experimento, a PGF2α foi administrada de duas formas, bem como se utilizou duas dosagens de eCG. A PGF2α foi aplicada na sua dose total no Dia 8 , dia da retirada do implante de progesterona ou divididas em ½ dose de PGF2α no Dia 0, dia do implante de Progesterona e do benzoato de estradiol e a outra ½ dose de PGF2α, na retirada do implante de progesterona junto das aplicações do ECP (0,5 mg) e de eCG com 300 ou 400 UI. Os resultados da taxa de aproveitamento, de concepção, de prenhez e o número de CL por receptora estão apresentados na Tabela 10.

Tabela 10. Taxas de aproveitamento, de concepção, de prenhez e número de CL por receptora de embriões PIV em receptoras tratadas com dispositivos intravaginais de progesterona e Benzoato de Estradiol (BE; IM) associado ou não à ½ dose de PGF2 α (IM) no dia 0 e com a administração de ECP (0,5 mg)e eCG (300 ou 400 UI) no dia 8. Campo Grande – MS, 2005.

Neste experimento, não foi verificado efeito da adição da PGF2 α no Dia 0 (p 0,05) e que a administração de 300 UI de eCG apresentou eficácia semelhante ao tratamento com 400 UI (p 0,05), e nos permitiu concluir que é possível empregar este protocolo para sincronização de receptoras, obtendo índices semelhantes aos apresentados pelos protocolos anteriormente descritos.A aplicação comercial em larga escala deste protocolo foi avaliada durante o período de setembro de 2004 a abril de 2005 onde foram analisadas 1634 inovulações em uma central de receptoras (Firmasa, Campo Grande, MS, Brasil) utilizando embriões produzidos in vitro em receptoras sincronizadas com o mesmo protocolo. No momento da transferência dos embriões as receptoras foram avaliadas por ultra-sonografia obtendo o número de CL ou o diâmetro do CL único. O diagnóstico de gestação e a sexagem fetal foram realizados aos 30 dias e aos 60 dias após a transferência dos embriões, respectivamente.Conforme os dados obtidos com o protocolo anterior pode-se observar um decréscimo na taxa de prenhez quando se utilizou receptora que apresentavam CL de 16 mm (30,8 a) em relação aos animais que apresentaram um CL de 18 mm (49,6 b ), 20 mm (46,2 b ), 22 mm (49,8 b ) ou de 1 CL (51,3 b ). A taxa de mortalidade embrionária também foi semelhante entre os protocolos, ficando ao redor de 15 A incorporação do Cipionato de Estradiol no protocolo de superovulacao das receptoras foi testado durante a estação de transferência do ano 2006/2007. O protocolo empregado foi o descrito abaixo:Dia 0 - Implante de progesterona 2,0 mg de Benzoato de EstradiolDia 5 - 500 UI de eCG ProstaglandinaDia 8 - Retirado do implante de progesterona e 0,5 mg de Cipionato de estradiol Dia 17 - TETFOs resultados obtidos com este protocolo analisados em 3.556 transferências não diferiram dos anos anteriores, perfazendo uma média geral de 46,2 de concepção com uma taxa de mortalidade embrionária ao redor de 12

Segundo Gabriel Bo, existem outros fatores que podem afetar as porcentagens de prenhez dentro de um programa de TETF (tabela 11).

Tabela 11. Fatores que podem afetar a porcentagem de prenhez em receptoras sincronizadas para TETF.

Diante dos resultados até aqui expostos, fica evidente que é possível aumentar a taxa de aproveitamento, de concepção e de prenhez em receptoras de embriões com o emprego de fármacos para a sincronização da ovulação para utilização da transferência de embriões em tempo fixo, ficando a critério do técnico e facilidade de manejo o protocolo de sincronização a ser empregado e que o antecedente reprodutivo das receptoras em questão é uma das variáveis que podem influenciar no resultado final.

Referências Bibliográficas

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