Expressão gênica diferencial entre os Expressão gênica diferencial entre os micélios monocariótico e dicariótico de micélios monocariótico e dicariótico de

Moniliophthora perniciosaMoniliophthora perniciosa

Manuscrito submetido a MPMI e aceito com revisão

Johana Rincones, Leandra M. Scarpari, Marcelo F. Carazzolle, Jorge M. C. Mondego, Eduardo F. Formighieri, Joan G. Barau, Gustavo G.L.

Costa, Dirce M. Carraro, Laurival A. Vilas-Boas, Bruno V. de Oliveira, Maricene Sabha, Robson Dias, Júlio M. Cascardo, Ricardo A. Azevedo,

Lyndel W. Meinhardt, and Gonçalo A.G. Pereira

Produção de basidiomas na estação das chuvas

4 a 8 semanas

3 a 6 semanas

Mudança de forma entre 2 a 9 semanas

Basidiósporos causam infecção em 4–6 hMicélio biotrófico formado por hifas primárias,

monocarióticas, intercelulares e sem grampos de conexão.

Micélio saprotrófico, dicariótico, intracelular e com grampos de conexão.

Alterações bioquímicas

Micélio biotrophic-like in vitro

Materiais e Métodos

Biotrófico induzido (BP10 em glicerol +

meristema)

Saprotrófico induzido (CP02 em Fruto ou BP10 em glicerol + meristema)

Saprotrófico controle (CP02 em 1% glicose ou BP10

em 2% glicerol)

RNA total (RNeasy Plant minikit - Qiagen)

A-Sap-CMA-Sap-CME-Sap-CPE-Sap-CP

A-Sap-GlyA-Sap-GlyE-Sap-GluE-Sap-Glu

Bio-CMBio-CM

MicroarraysConfeção dos microarranjos:Confeção dos microarranjos:

2304 clones do genoma em triplicatas(Flexys® Robot Arrayer - Perkin Elmer Life Biosciences)

Marcação e Hibridização:Marcação e Hibridização:1. Bio-CM(Cy3) vs. A-Sap-Gly(Cy5)2. Bio-CM(Cy5) vs. A-Sap-Gly(Cy3)

3. A-Sap-CM(Cy3) vs. A-Sap-Gly(Cy5)4. A-Sap-CM(Cy5) vs. A-Sap-Glyl(Cy3)

Normalização e análises:Normalização e análises:Nonlinear intensity-dependent dye bias (Lowess)Normalização entre réplicas técnicas (Bayesian)

Seleção de genes (p-value < 0.05, fold change ≥ 2.0)Clusterização hierárquica (Green-Black-Red)

Bibliotecas de cDNA

Bibliotecas de cDNA:Bibliotecas de cDNA:Creator SMART® Library construction kit (Clontech)

Seqüenciamento:Seqüenciamento:MegaBACE 1000

Data mining:Data mining:Filtros e clusterização (CAP3)

TrimmingBuscas NCBI NR (BLASTx)

Buscas M. perniciosa genome (BLASTn)Anotação manual (FunCat)

E-Sap-CPE-Sap-CP E-Sap-GluE-Sap-Glu Bio-CMBio-CM

Biblioteca Subtrativa: E-Sap-CP – E-Sap-Glu

PCR Select® (Clontech)

Real-time RT-PCRMicroarrays (19):

RICIN: Ricin_B_lectin CHISV: Chitin synthase class VLIP: Lipase class 3 LACC: Laccase 6 ALOX: Alcohol Oxidase DPP: Dipeptidyl-Peptidase MFS: Sugar transporter MFS PR-1: Pathogenesis Related 1 AROM: Arom polypeptide RAS: H_N_K_Ras_like HMPP: HMPP-kinaseSP-1: Mediator complex subunit CYTCP: Ascorbate peroxidasesMONO: Monooxygenase UEGP: UDP-glucose 4-epimeraseTYR: TyrosinaseSRDK: Signal receiver domainINT: IntegrasePMEVK: Phosphomevalonate kinase

ESTs (16):GABAT: GABA TransporterGOX: Glyoxal OxidasePP: Pathogenicity ProteinCUT: Copper TransporterTRNAL: ASP tRNA LigasePROH: ProhibitinSTOM: StomatinTHAU: ThaumatinKP4: KP4 ToxinFDH: Formate DehydrogenaseMnSOD: Mn Superoxide DismutaseCOX: Cytochrome OxidaseCERAT: CeratoplataninGLYP: Glycerol PermeaseNHBIO: No Hits BiotrophicNHSAP: No Hits Saprotrophic

Normalizadores: GPDH, ACT, 60S

Microarrays: 1131 clones com sinais de hibridização consistentes para as triplicatas. 189 clones diferencialmente expressos entre os dois tipos de micélio

XX X X

Discussão• 1131 clones analisados por microarray

• 1534 ESTs analisados

• ~20% dos 12.000 genes de M. perniciosa

• Real-time RT-PCR validou o uso de estratégias complementares, e confirmou dois genes novos

• Biotrófico mostra alto metabolismo, mas pouco crescimento: Cross-talk molecular?

• Apoplasto é pobre em nutrientes solúveis. Nutrição efetiva do patógeno é pré-requisito para infecção bem sucedida (Ferreira et al. 2007).

Metabolismo de fontes de carbono

• Micélio saprotrófico: transporte de hexoses, ciclo de Krebs, ciclo das pentoses-fosfato e ciclo do malato

• Micélio biotrófico: degradação de lipídios, proteínas, celulose, pectina e alcóols.

• Uso de fontes de carbono alternativas e a baixa taxa de crescimento do biotrófico caracterizam uma possível CCR no biotrófico (Divon e Fluhr, 2007)

• CCR: Similar ao “diauxic shift”. Reprogramação metabólica que pode levar à mudança de fase (biotrófico muda para saprotrófico quando crescido em açucar).

Metabolismo de fontes de nitrogênio

• Micélio biotrófico crescido em 0,5% extrato de levedura:– Amino ácido permeases – GABA shunt– tRNA ligases– AROM: síntese de amino ácido aromáticos

• NCR: reprogramação metabólica (via AREA). Expressão de fatores de patogenicidade e a mudança de fase no hemibiotrófico Colletotrichum lindemuthianum (Dufresne et al. 2000)

Fatores de patogenicidade• Glucuronyl hydrolase; degradação da parede celular

• Glyoxal oxidase 1: oxidação de aldeídos de cadeia curta (Ustilago maydis)

• Chitin synthase, classe V: proteção (Ustilago maydis)

• RICIN aglutinina: colonização do apoplasto

• Ceratoplatanina: toxina de Ceratocystis sp., causa necrose do cacau.

Metabolismo mitocondrial• Biotrófico mostra menor taxa de crescimento:

– ngr1: regulação do crescimento de levedura mediante aceleração da degradação mitocondrial

• Saprotrófico em cacau mostra maior taxa de crescimento do que em glicose:– Indução de citocromos, genes envolvidos em

regeneração de NADH, ribosomos mitocondriais e proteção a estresse oxidativo

Elementos transponíveis• Regulação diferencial destes elementos dependendo

do tipo de micélio• Possível relação com a geração de variabilidade

genética neste fungo homotálico.

Proteínas antifúngicas• Thaumatina-like: proteína de sabor doce, quando

produzida por plantas tem efeito antifúngico• KP4: killer protein produzida micoviruses. Linhagens

de fungos que possuem o virus são resistentes.• Possívelemente envolvidas em impedir a colonização

do cacaueiro por fungos competidores• Caso a KP4 possa inibir o crescimento de outras

linhagens de M. perniciosa, ajudaria a manter homozigose

Modelo• A fase biotrófica mostra pouco crescimento devido a

baixa disponibilidade de nutrientes no apoplasto e ao controle do metabolismo mitocondrial

• Os sintomas da doença são causados mediante a ativação de genes de patogenicidade controlados por condições de CCR e NCR

• Estes fatores eventualmente causam a morte do tecido e a liberação de nutrientes solúveis no apoplasto

• A disponibilidade de nutrientes induz a mudança de fase

• Poderiamos induzir uma mudança de fase pela disponibilidade de nutrientes? Edvaldo!