Dr. Pablo OppezzoDr. Pablo Oppezzo

Expresión de Proteínas

Recombinantes

TecnologTecnologíía del ADN recombinantea del ADN recombinante

Herramientas de la BiotecnologHerramientas de la Biotecnologííaa

La determinaciLa determinacióón de la estructura de doble hn de la estructura de doble héélice del ADN (Premio lice del ADN (Premio NobelNobel de medicina en 1962 James de medicina en 1962 James WatsonWatson y Francis y Francis CrickCrick))

InformaciInformacióón genn genéética es traducida a protetica es traducida a proteíínas, catalizadores nas, catalizadores naturales de las distintas funciones biolnaturales de las distintas funciones biolóógicasgicas

A comienzos de los aA comienzos de los añños 70os 70……

EndonucleasasEndonucleasas de restriccide restriccióón, ADN n, ADN ligasasligasas, ADN , ADN polimerasaspolimerasas……

Para que sirven?

Áreas básicasBiología, CristalografíaBiofísica, Bioquímica, Microbiología, etc

Áreas aplicadas - Salud: Insulina humana recombinante (EEUU en 1982)- Biotecnología Anticuerpos Recombinantes (Rituzimab, Scott 1998)- Agricultura, etc. Resistencia a plagas y herbicidas. (Alcalde et al 2000)

Que son las proteínas recombinantes?

Proteínas producidas artificialmente a partir de genes clonados

Aislamiento de la secuencia génica (ARNm) y traducción de la proteína blanco Introducción en un organismo (Procariota / Eucariota)Expresión y purificación de la proteína blanco

Expresión de proteínas recombinantes. Generalidades

Amplificación por PCR del gen de interés

Obtención del vector de clonado

Digestión de ambos productos con enzimas de restricción

Ligación y transformación en el sistema elegido

Selección clonal del organismo con el vector recombinante

Cultivo del clon e inducción de la expresión proteica

N.I. I. M

Expresión de proteínas recombinantes. Solubles&

Insolubles

Sobreexpresión de la proteína recombinante

Origen heterólogo de la proteína recombinante

P.B

TB Structural Genomics European ConsortiumUnité du Biochimie Structurale (IPP)

(70 %)

105105

655655

Solubilisación de proteínas recombinantes en E. Coli

Optimización de los vectores de expresión

No saturar la maquinaria traduccional bacteriana

Capaz de transportar dos o mas secuencia de ADN recombinante Co-expresión

Posibilidad de utilizar promotores fuertes o débiles (T7 o T5)

Capacidad de exportar la proteína al espacio periplasmico Puentes disulfuros

Distintos orígenes de replicación Elevado número de copias

Con proteínas de fusión Ayudar al plegado de la proteína blanco

Con distintos “tags” Ayudar a la purificación de la proteína blanco

Solubilisación de proteínas recombinantes en E. Coli

Optimización de la cepa huésped

Enzimas implicadas en el sistema redox Generar puentes di-sulfuros en (Origami, Novagen) citosol

Cepas deficientes en proteasas Estabilidad de la proteína (BL21 D3, Novagen) recombinante

Permeasas mutadas (lac permeasa) Sensibles a distintas concentraciones (Tuner, Novagen) del inductor

Suplementadas con codones raros Expresión de proteínas heterólogas(tRNA eucariotas)

La solubilidad de cada proteLa solubilidad de cada proteíína es intrna es intríínseca a nseca a su funcisu funcióón, a su origen y a su n, a su origen y a su microambientemicroambiente

celular celular

El plegamiento proteico sigue siendo un El plegamiento proteico sigue siendo un áárea rea desconocida.desconocida.

SolubilizaciSolubilizacióónn de protede proteíínas recombinantes nas recombinantes enen E. E. ColiColi

No existen recetas No existen recetas mmáágicasgicas……

51 35 5 cond15 cepas 10 vectores cultivo30 % 750

pruebas

Temperaturas de Cultivo

D.O. de inducción

x 3

x 2

SolubilizaciSolubilizacióónn de protede proteíínas recombinantes nas recombinantes enen E. E. ColiColi

TecnologTecnologíía roba robóóticatica

Probar la mayor cantidad de condiciones de Probar la mayor cantidad de condiciones de expresiexpresióón posibles en el menor n posibles en el menor tiempotiempo……

SolubilizaciSolubilizacióónn de protede proteíínas recombinantes nas recombinantes enen E. E. ColiColi

SolubilizaciSolubilizacióónn de protede proteíínas y plataformas nas y plataformas robrobóóticasticas

Thomas Acton et al; Methods in Enzimology 2005

SolubilizaciSolubilizacióónn de protede proteíínas y plataformas nas y plataformas robrobóóticasticas

Vincintelli et al ; Proteins Science 2004

SolubilizaciSolubilizacióónn de de proteproteíínas nas

recombinantes en recombinantes en UruguayUruguay

1 = HMS174 (DE3)  Mutación en RecA. Estabilización de ciertos genes tóxicos

2 = Rosetta (DE3)  RNAt de mamíferos 

3 = Origami Derivada de K‐12 ( formación de  ptes disulfuros)

4 = Rosetta‐Gami (DE3)  IPTG sensible + ptes disulfuros + RNAt mamíferos

5 = Tuner (DE3) Sensible a distintas concentraciones de IPTG 

6 = DH5 ‐ α Vectores de expresión con  promotores del tipo T5

Células Competentes

Vectores de expresión y cepas

1 - 6

T5 Sin Histag

pFP 1400

A

1 - 51 - 51 - 51 - 51 - 51 - 51 - 61 - 61 - 6Cepas

T5 fusion malE

T5 fusion GST

T7 Fusion NUS

T7 Fusion

Trx

T7 + C-terminal

T7 + N-terminal

T5++ + N-term

T5 + C-terminal

T5 + N-terminal

Promotoresy « tags »

pMAL-c2E o pMAL-p2E

pGEX- 4T-2pET-43.1apET-32apET-21d o

pET-29apET- 28apTrcHispQE-TrisystempQE-30Vectores

JIHGFEDCB

Digestión del cDNA recombinante y del vector de expresión

Ligación y transformación

Inoculación del minicultivo ON

Inoculación del cultivo bacteriano con el minicultivo ON.

Inducción con IPTG y expresión ON

Evaluación de la solubilidad por SDS-PAGE y/oWestern Blot

MetodologMetodologííaa

SDS-PAGE

Western Blot

8 vectores diferentes

6 cepas distintas de E. Coli

Condiciones de induction:* 2 Abs (600 DO) diferentes* 2 concentraciones de IPTG diferentes

2 condiciones de temperatura distintas

Total de 176 condiciones diferentes

Evaluación en 7 días de:

Test de solubilidad de una proteína recombinante en la plataforma robótica TECAN

En 7 días y manual 42 condiciones diferentes

G = Bloque calienteH = Bloque de vacíoI = PCR 1 ‐ 2 – 3 y 4 = Hotel de placas I = Limpieza de agujas II = Reserva de buffer 

A = Termoshaker 1B = Termoshaker 2 C = Termoshaker 3D = Termoshaker 4E y F = E‐ Page System

-Hoteles- 3 4

I

AA

B

CC

D

EE

F G

H

J

PCR

II

K

H

1 2

Gracias…Institut Pasteur Paris ‐ FranciaUnidad de Bioquímica Estructural Dr Pedro Alzari, Dr Frederic Roussel

Institut Pasteur MontevideoUnidad de Proteínas RecombinantesCecilia Abreu, Agustín Correa y Florencia Palacios

TECAN Paris ‐ FranciaIng. Henry Tibeau

Institut Pasteur Paris ‐ FranciaPlataforma PF 6 Dr Ahmed Haouz