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1
DANIELA CRISTINA SOARES
ETIOLOGIA DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR NA MESORREGIO DO BAIXO
AMAZONAS, ESTADO DO PAR, BRASIL
Tese de doutoramento apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitrios do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Par
como requisito para a obteno do grau de Doutor (a) em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitrios.
Orientadora: Profa. Dra. Lourdes Maria Garcez dos Santos
Instituto Evandro Chagas
Banca Examinadora: Prof. Dr. Arival Cardoso de Brito
Universidade Federal do Par
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonalves
Universidade Federal do Par
Profa. Dra. Francisca Regina Oliveira Carneiro
Universidade de Estado do Par
Prof. Dr. Haroldo Jos de Matos
Instituto Evandro Chagas
Profa. Dra. Ana Maria Revordo da Silva Ventura (suplente)
Universidade de Estado do Par/ Instituto Evandro Chagas
Belm, 14 de Maro de 2014
2
A todos os pacientes, sujeitos dessa pesquisa, por
doarem parte de si, em um momento de dor e aflio,
acreditando que os esforos para realizao desse trabalho,
somados a tantas outros, podero um dia minimizar o
sofrimento de outras pessoas.
3
4
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos s pessoas e instituies que apoiaram a realizao
deste trabalho. O processo de aprendizado cientfico e pessoal no seria possvel sem essa
colaborao.
Contudo, devo citar minha gradito Dra. Lourdes Maria Garcez, minha orientadora,
que, ao longo desses oito anos de convivncia, fomentou o meu desenvolvivento cientfico no
uso crtico e adequado de ferramentas que contribuam para melhorias em sade pblica.
Agradeo-lhe ainda por me ajudar enfrentar algumas dificuldades inerentes a vida cientfica e
acadmica.
Em Belm, agradeo ao Instituto Evandro Chagas pela estrutura disponibilizada na
Seo de Parasitologia, sobretudo equipe do nosso Laboratrio de Epidemiologia e
Imunologia Aplicada s Leishmanioses, que de poucos se fizeram muitos e somaram para a
realizao desse trabalho. Rosngela Barros e ao Gilberto Rodrigues pelos cuidados com
os isolados de Leishmania e apoio de campo. Rosangela Trindade pelo apoio logstico de
transporte, ora barco e ora avio, no incio do projeto. Ao Anthony Paiva, aluno de iniciao
cientfica, pela contribuio no laboratrio de biologia molecular. Anadeiva Chagas,
Raquel Gonalves, Marcela Maciel e Eliane Trindade pelo ombro amigo e conversas de
incentivo.
Em Belm, meus profundos agradecimentos Secretaria de Estado de Sade Pblica
pela licena concedida nesse ltimo ano de tese e pelo financiamento de participaes em
congresso. Mas, sobretudo, agradeo experincia vivida no controle e vigilncia das
leishmanioses onde tive a companhia inestimvel de Monica Fadul, Simony Guimares,
ngela Santos, Danilo Ananias, Bernardo Cardoso e tantos outros amigos e profissionais que
enfrentam as estradas e rios de nosso Estado para melhorar as condies de sade dos
indivduos acometidos por esses agravos.
Em Juruti, agradeo sensibilidade e apoio da Secretria de Sade Dra. Ana Mrcia
Cunha em permitir a realizao desse trabalho. Em especial aos colegas Germana Santos e
Fbio Cativo do Laboratrio de Endemias.
Em Santarm, agradeo a Secretria de Sade Dra. Helosa Helena Carvalho, ao
diretor do Centro de Controle de Zoonoses Dr. Jorgemar por permitirem que nossa equipe se
integrasse aos demais profissionais que diariamente l assitem pacientes com leishmaniose
tegumentar. A toda equipe tcnica meu muito obrigada!
5
Sou muito grata ao reitor da Universidade do Estado do Par, Prof. Luiz Fernando
Silva, responsvel pelo campus Santarm, e ao diretor do curso de medicina, Prof. Moacir
Boreli, pela receptividade e disponibilio de espao fsico para implantao das tcnicas de
isolamento de Leishmania. Preciso ressaltar meu muito obrigada a participao efetiva e
comprometida das docentes da UEPA Mariana Quiroga, Francimary Leo, Ndia Martins e
Socorro Mota neste trabalho. Agradeo Profa. Ndia seus cuidados de enfermagem com os
pacientes. s mdicas Profa. Mariana e Profa. Francimary pela coleta de bipsias, tratamento
e acompanhamento clnico. biomdica Profa. Socorro pelo empenho nas tentativas de
isolamento de Leishmania e ao discente Jonas Castro pelo interesse e ingresso a pesquisa
cientfica.
No Rio de Janeiro, meus sinceros agradecimentos a Dra. Elisa Cupolillo, responsvel
pelo Laboratrio de Pesquisas em Leishmanioses da Fundao Oswaldo Cruz, e sua equipe
(em especial a Mariana Boit, Barbara Santos e Marcus Tranin) pelo treinamento em
caracterizao e tipagem bioqumica e molecular para Leishmania. Alm das contribuies
cientficas agradeo a convivncia daquele perodo onde todos me proporcionaram liberdade
para integrar a equipe sem restries na conduo dos experimentos dessa tese.
No Rio de Janeiro, fui presenteada por conhecer Ra Paiva, Fernando Messias e
Fernanada Messias, famlia maravilhosa, que me acolheu em seu lar e dividiu comigo os seus
amigos e que desde l so meus amigos tambm. Muito obrigada!
Agradeo ao suporte financeiro concedido pela Fundao Amaznia Paraense de
Amparo Pesquisa e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico.
Obrigada aos membros da banca pelo interesse e disponibilidade.
Agradeo aos meus pais, Elier Soares e Maria Jos Alves Soares, por serem
simplesmente quem so, pelos seus exemplos e pela unio de nossa famlia. Dnia e Elier
Junior, meus irmos e melhores amigos, obrigada tambm!
preciso que eu seja generalista, pois minha memria s vezes me trai! Sintam-se
agredecidos todos aqueles que gentilmente aguentaram meus desabos com problemas de
primers, PCR e culturas contaminadas ou com a minha exagerada euforia no xito dos
ensaios. Saibam que direta ou indiretamente o conselho, o incentivo e a pacincia de vocs me
ajudaram a fazer este trabalho melhor.
E por fim, agradeo aquele sem o qual nada seria fato, Deus!
6
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... 8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS........................................................................... 11
RESUMO............................................................................................................................ 13
ABSTRACT........................................................................................................................ 14
1 INTRODUO.................................................................................................... 15
1.1 EPIDEMIOLOGIA................................................................................................ 16
1.2 AGENTES ETIOLGICOS DE LT..................................................................... 20
1.3 CICLO DE TRANSMISSO DE LT................................................................... 23
1.4 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR: INFECO, IMUNOPATOLOGIA E
DOENA ..............................................................................................................
24
1.5 DIAGNSTICO E TRATAMENTO NA REDE DE ASSISTNCIA DO
SUS.........................................................................................................................
28
1.6 DISTINO EM NVEL DE ESPCIE ............................................................. 32
1.7 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 38
1.8 OBJETIVOS ........................................................................................................ 39
1.8.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 39
1.8.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................... 39
2 MATERIAL E MTODO .................................................................................. 40
2.1 ASPECTOS TICOS ............................................................................................ 40
2.2 DESENHO DO ESTUDO .................................................................................... 40
2.3 PERGUNTAS ....................................................................................................... 40
2.4 REA DO ESTUDO ............................................................................................. 41
2.5 SUJEITOS DA PESQUISA, LOCAL DE ATENDIMENTO E CRITRIOS DE
INCLUSO ............................................................................................................
42
2.6 REALIZAO DE EXAMES ............................................................................ 43
2.7 PROCEDIMENTOS NA ROTINA DO SUS ...................................................... 43
2.7.1 Exame parasitolgico direto ............................................................................... 44
2.7.2 Teste Intradrmico de Montenegro ................................................................... 45
2.7.3 Tratamento e acompanhamento dos pacientes ................................................. 45
2.7.4 Busca ativa de pacientes ...................................................................................... 45
2.8 PROCEDIMENTOS PARA A PESQUISA .......................................................... 46
2.8.1 Coleta e registro de dados ................................................................................... 47
7
2.8.2 Coleta e conservao de material biolgico ...................................................... 47
2.8.3 Obteno de isolados de Leishmania ................................................................. 47
2.8.4 Preparo de massa parasitria ............................................................................. 48
2.8.5 Criopreservao dos isolados de Leishmania .................................................... 48
2.8.6 Caracterizao de Leishmania por eletroforese enzimtica multilocus.......... 48
2.8.7 Clonagem biolgica e infeco de isolados de Leishmania com perfil atpico
em hamsters ..........................................................................................................
49
2.8.8 Ensaios moleculares ............................................................................................. 50
2.8.9 Extrao de DNA de isolados de Leishmania de cepas de referncia e
isolados humanos .................................................................................................
50
2.8.10 Extrao de DNA de fragmento de pele de leso .............................................. 50
2.8.11 Identificao do gnero Leishmania ................................................................... 51
2.8.12 Identificao do subgnero L. (V.) sp. e espcie L. (V.) braziliensis.................. 52
2.8.13 Eletroforese .......................................................................................................... 53
2.8.14 Distino de espcies de Leishmania por PCR-RFLP de hsp70-234 e PCR-
RFLP de ITS 1 .....................................................................................................
53
2.8.15 Plano de anlise estatstica .................................................................................. 53
3 RESULTADOS .................................................................................................... 55
3.1 PADRONIZAO DOS ENSAIOS MOLECULARES....................................... 57
3.2 CARACTERIZAO E TIPAGEM DE Leishmania EM AMOSTRA DE DNA
EXTRADO DE FRAGMENTO DE LESO.......................................................
61
3.3 CONTRIBUIO DA PCR-G6PD NA DEFINIO DO SUBGNERO
Viannia E ESPCIE L. (V.) braziliensis ...............................................................
66
3.4 CARACTERIZAO DE ISOLADOS DE Leishmania POR MLEE ................. 67
3.4.1 Caracterizao por MLEE de isolados de Leishmania com perfil atpico...... 70
3.5 ETIOLOGIA DA LT NA MESORREGIO DO BAIXO AMAZONAS DO
ESTADO DO PAR .............................................................................................
71
3.6 EVOLUO DOS CASOS DE LT ...................................................................... 72
4 DISCUSSO ........................................................................................................ 75
5 CONCLUSES ................................................................................................... 85
REFERNCIAS................................................................................................................. 86
APNDICE I...................................................................................................................... 102
APNDICE II..................................................................................................................... 104
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuio de registros de casos de LT no mundo no perodo de 2005 a
2009................................................................................................................
18
Figura 2 Epidemiologia da LT no Brasil..................................................................... 19
Figura 3 Registros das formas cutnea e mucosa e co-infeco LT x HIV no Estado
do Par, no perodo de 2007 a 2011...........................................................
20
Figura 4 reas de risco de transmisso de LT e espcies dermotrpicas de
Leishmania no Estado do Par..................................................................
21
Figura 5 Espcies dermotrpicas de Leishmania circulando em pases da Amrica
Latina.............................................................................................................
23
Figura 6 Ciclo de transmisso da LT........................................................................... 25
Figura 7 Expectro clnico da LT. ............................................................................... 28
Figura 8 Polarizao da LT......................................................................................... 29
Figura 9 Diagnstico laboratorial para a LT disponvel na rotina no SUS................. 31
Figura 10 Ensaios bioqumicos de caracterizao e tipagem de Leishmania................ 35
Figura 11 Localizao do gene de ITS e sua subdiviso em regio de ITS 1 e regio
de ITS 2.........................................................................................................
37
Figura 12 Distino de espcies de Leishmania em ensaios de PCR-RFLP de ITS 1
aps digesto enzimtica por HAE III..........................................................
38
Figura 13 Distino de espcies de Leishmania em ensaios de PCR-RFLP de hsp70-
234 aps digesto enzimtica por HAE III e
BstUI..............................................................................................................
39
Figura 14 Municpio de Santarm, Par........................................................................ 42
Figura 15 Municpio de Juruti, Par..............................................................................
Figura 16 Fluxograma do atendimento de rotina nas unidades de sade dos
municpios de Juruti e Santarm e abordagem dos sujeitos da pesquisa......
43
Figura 17 Fluxograma do atendimento de rotina nas unidades de sade dos
municpios de Juruti e Santarm e abordagem dos sujeitos da pesquisa.....
45
Figura 18 PCR-RFLP de ITS 1 aps digesto enzimtica com HAE III....................... 47
Figura 19 PCR-RFLP de hsp70-234 aps digesto enzimtica com BstU I.................. 59
Figura 20 PCR-RFLP de hsp70-234 aps digesto enzimtica com HAE III............... 60
Figura 21 Deteco do DNA de espcies de Leishmania dermotrpicas com uso de
9
diferentes PCRs............................................................................................. 60
Figura 22 Anlise de PCR-RFLP de hsp70-234 de DNA extrado de 112 pacientes
atendidos no CCZ de Santarm e HMFB de Juruti, no perodo de janeiro
de 2010 a dezembro de 2011. .......................................................................
64
Figura 23 PCR-RFLP de hsp70-234 aps digesto enzimtica com HAE III............... 64
Figura 24 PCR-RFLP de hsp70-234 aps digesto enzimtica com BstU I..................
Figura 25 Anlise de PCR-RFLP de ITS 1 de DNA extrado de 112 pacientes
atendidos no CCZ de Santarm e HMFB de Juruti, no perodo de janeiro
de 2010 a dezembro de 2011.........................................................................
65
Figura 26 PCR-RFLP de ITS 1 aps digesto enzimtica com HAE III....................... 65
Figura 27 Anlise de PCR-G6PD de DNA extrado de 112 pacientes atendidos no
CCZ de Santarm e HMFB de Juruti, no perodo de janeiro de 2010 a
dezembro de 2011..........................................................................................
66
Figura 28 Produto de PCR-G6PD espcifico para o subgnero Viannia exceto a
espcie L. (V.) braziliensis revelado em gel de agarose a 2,0%....................
66
Figura 29 Produto de PCR-G6PD espcifico para a espcie L. (V.) braziliensis
revelado em gel de agarose a 2,0%...............................................................
67
Figura 30 Perfil de MLEE obitido com o sistema enzimtico de G6PDH.................... 67
Figura 31 Perfil de MLEE obitido com o sistema enzimtico de 6GPDH.................... 68
Figura 32 Perfil de MLEE obtido com o sistema enzimtico de 6GPDH..................... 69
Figura 33 Proporo da distino de espcies de Leishmania em amostras de
pacientes com LT atendidos nos centros de sade Santarm e Juruti no
perodo de janeiro de 2010 a dezembro de 2011...........................................
71
Figura 34 Proporo da distino de espcies de Leishmania em amostras de
pacientes com LT atendidos nos centros de sade Santarm e Juruti no
perodo de janeiro de 2010 a dezembro de 2011...........................................
72
Figura 35 Epidemiologia molecular da LT na mesorregio do Baixo Amazonas do
Estado do Par, Brasil....................................................................................
72
Figura 36 Destaques dos Perfis clnico-epidemiolgicos de uma srie de 112 casos
de LT atendidos no CCZ de Santarm e HMFB de Juruti, Estado do Par,
de janeiro de 2010 a dezembro de 2011........................................................
73
Figura 37 Taxas de cura e falha teraputica aps trs meses da administrao do
Glucantime (15mg/kg/dia/20 dias) em amostra de 40 indivduos
10
infectados com L (V.) braziliensis (26) e com outras espcies de
Leishmania (17): L. (L.) amazonensis (4), L. (V.) naiffi (3), L. (V.) lainsoni
(1) e L. (V.) shawi (7) e L.(V.) guyanensis (2)..............................................
74
Figura 38 Acompanhamento clnico de pacientes aps trs meses de terapia com
Glucantime (15mg/kg/dia/20 dias).............................................................
75
11
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
A Adenina
C Citosina C graus Celsius ou graus centgrados
CCZ Centro de Controle de Zoonoses
CBC Carcinoma Basocelular
CD Cluster de diferenciao
DMSO Dimetilsufxido
DNA cido desoxirribonuclico
EDTA cido etilenodiaminotetraactico
ELISA ensaio imunoenzimtico
FIOCRUZ Fundao Oswaldo Cruz
G Guanina
G6PD Enzima glicose 6 fosfato desidrogenase
6PGDH 6-fosfo-glucanato desidrogenase
HMFB Hospital Municipal Francisco Barros
Hsp Protena de choque trmico
HIV Vrus da Imunodeficincia Humana IEC Instituto Evandro Chagas
IFI teste de imunofluorescncia indireta
IDRM Intradermorreao de Montenegro
IL Interleucina
ITS Espaador Interno Transcrito
INF Interferon
kDNA DNA do cinetoplasto
Kb Kilo bases
La Leishmania (Leishmania) amazonensis
Lb Leishmania (Viannia) braziliensis
Ls Leishmania (Viannia)shawi
Ln Leishmania (Viannia)naiffi
Ll Leishmania (Viannia)lansoni
Lg Leishmania (Viannia)guyanensis
Lli Leishmania (Viannia)lindenbergi
LCD Leishmaniose Cutnea Difusa
LCL Leishmaniose Cutnea Localizada
LDA Leishmaniose Difusa Anrgica
LMC Leishmaniose Mucocutnea
LT Leishmaniose Tegumentar M Molar
mg Miligrama
ml Mililitro
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal
OMS Organizao Mundial de Sade
pb pares de bases
PBS Soluo Salina Fosfatada
PCR Reao Em Cadeia Da Polimerase
PSG Soluo Salina Glicerolizada
RFLP Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de
Restrio SBF Soro Bovino Fetal
12
SDS Sulfato Duodecil de Sdio
SFM Sistema Fagoctico Mononuclear
SEMSA Secreteria Municipal de Sade
SESPA Secretaria de Estado de Sade Pblica
T Timidina
TA temperatura ambiente
TAE soluo de Tris, Acetato e EDTA
TE soluo Tris e EDTA
TNF Fator de Necrose Tumoral
USSr DNA Subunidade Menor do DNA do Ribossomo
UV Ultravioleta
V/cm Volts/centmetro
g Nanograma
g Micrograma
l Microlitro mM Milimolar
MS Ministrio da Sade
MLEE Multi Locus Enzyme Electrophoresis
NNN Novy, Neal e Nicole
RPM rotaes por minuto
SUS Sistema nico de Sade
STC Soluo Tampo de Corrida
WHO World Health Organization
13
RESUMO
Introduo: No Estado do Par, Brasil o risco de transmisso de Leishmaniose Tegumentar
(LT) aos seres humano alto. Sete espcies patognicas: L. (L.) amazonensis (La), L. (V.)
braziliensis (Lb), L. (V.) guyanensis (Lg), L. (V.) shawi (Ls), L. (V.) lainsoni (Ll), L. (V.)
naiffi (Ln) e L. (V.) lindenbergi (Lli) esto associadas ao amplo espectro clnico de leses na
pele e mucosas. Sabe-se que o sucesso ou falncia terapia depende da relao parasito-
hospedeiro e, portanto a distino de espcies dermotrpicas pode contribuir no melhor
prognstico clnico, protocolos de tramento e aes de controle da doena. Objetivo:
Descrever a etiologia e a resposta ao tratamento ao Glucantime em uma srie de casos de
LT. Materiais e Mtodos: Ensaios de PCR com alvos para os genes da enzima glicose-6-
fosfato desidrogenase (G6PD) e ensaios de PCR-RFLP com marcadores moleculares para
espaadores internos transcritos (ITS 1) e protena de choque trmico (hsp70-234) foram
testados para o DNA de promastigotas das setes cepas de referncia de Leishmania que
circulam na regio. Posteriormente esses ensaios foram aplicados ao DNA extrado de leso
cutnea de pacientes que buscaram atendimento nos centros de sade dos municpios de Juruti
(n = 12; 2010) e Santarm (n = 100; 2009-2011), localizados na mesorregio do Baixo
Amazonas, Par. Neste grupo procedeu-se ao diagnstico laboratorial e tratamento com
Glucantime [15mg/kg/dia/20 dias] com acompanhamento por trs meses, conforme
protocolo do Ministrio da Sade. Comparou-se a taxa de cura entre infectados com Lb e com
outras espcies pelo teste binomial. Acrescentaram-se ensaios de eletroforese multilocus
enzimtica (MLEE) aos isolados de Leishmania obtidos de 19 pacientes. Resultados: A PCR-
G6PD confirmou a presena do subgnero Viannia e espcie Lb. A PCR-RFLP de ITS 1
discriminou isoladamente as espcies Ln, Ll, La enquanto as espcies Lb/Lg e Ls/Lli obtiveral
perfis idnticos. A PCR-RFLP de hsp70-234 distinguiu as espcies Ln, Ll, La, Ls e o pares de
espcies de Lg/Lli e Lb/Lli obtiveram perfil idnticos. Em conjunto ensaios moleculares e
bioqumicos identificaram 46% (52/112) das amostras em nvel de espcie: Lb (61%), Ls
(13%), Ln (6%), Ll (4%), La (8%), Lg (6%). Ensaio de MLEE acrescentou a ocorrncia de
um hbrido de Lg e Lb (2%) para o sistema enzimtico 6PGDH. As demais amostras foram
tipadas em nvel de subgnero Viannia (38%; 42/112) e resultados inconclusivos (16%;
18/112). A taxa de falha teraputica, calculada para 84/112 indivduos (75%) que retornaram
para avaliao, no variou (Z= 0,8452; p-valor = 0,1990; poder 0,05 = 0,2092) entre pacientes
infectados com Lb (25%) e com outras espcies (37,5%). Concluses: H simpatria de seis
espcies e um hbrido de Leishmania na regio. As sondas de ITS 1 e hsp70-234 no so
capazes de distinguir as espcies Lb, Lg e Lli isoladamente. Ensaios de PCR-G6PD so
fundamentais para distino de Lb. As taxas de abandono ao tratamento (25%) e de falha
teraputica (29%) so fatores capazes de influenciar a morbidade por LC e deveriam ser
considerados no combate doena.
Palavras chave: Leishmaniose tegumentar, PCR, RFLP.
14
ABSTRACT
Introduction: In the State of Par, Brazil the risk of Tegumentary Leismaniasis (TL)
transmission to human is high. Seven pathogenic species: L. (L.) amazonensis (La), L. (V.)
braziliensis (Lb), L. (V.) guyanensis (Lg), L. (V.) shawi (Ls), L. (V.) lainsoni ( Ll), L. (V.)
naiffi (Ln) and L. (V.) lindenbergi (Lli) are associated with a wide clinical spectrum of lesions
on the skin and mucous membranes. We know that the success or failure of therapy depends
on the host-parasite relationship and therefore the distinction of dermotrophic species can
contribute to the better clinical outcome of treatment protocols and actions to control the
disease. Objective: To describe the etiology and treatment response to Glucantime in a
number of cases of TL. Materials and Methods: Test for PCR targets for gene of the enzyme
glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and PCR-RFLP assays with molecular markers
for internal transcribed spacers (ITS 1) and heat shock protein (hsp70-234) were tested for
seven DNA promastigotes of Leishmania reference strains circulating in the region.
Subsequently, these tests were applied to DNA extracted from skin lesions of patients seeking
care at health centers in the municipalities of Juruti (n = 12; 2010) and Santarm ( n = 100;
2009-2011), located in the middle region of the lower Amazon, for this group proceeded to
laboratory diagnosis and treatment Glucantime [15mg/kg/dia/20 days ] with monitoring for
three months, according to the protocol of the Ministry of Health compared the cure rate
among infected with Lb and with other species by one-sided binomial test. Assays were added
multilocus enzyme electrophoresis (MLEE ) to Leishmania isolates obtained from 19 patients.
Results: The PCR - G6PD confirmed the presence of the subgenus Viannia species and Lb.
The PCR - RFLP of ITS 1 discriminated the isolation Ln, Ll, La species while Lb / Lg and Ls
/ Lli species had identical profiles . The PCR - RFLP of hsp70 distinguished the Ln -234 , Ll ,
La , Ls and pairs of species Lg / Lb Lli and / Lli species had identical profile. Together
molecular and biochemical assays identified 46% (52/ 112) of samples to species: Lb ( 61%),
Ls ( 13%), Ln (6%) , Ll (4%) , La ( 8%) , Lg ( 6%). Assay added MLEE the occurrence of a
hybrid Lg and Lb (2 %) for the enzyme system 6PGDH . The remaining samples were typed
at the level of subgenus Viannia (38 %, 42/112) and inconclusive results (16 %, 18/112). The
rate of treatment failure, calculated for 84/112 patients (75 %) who returned for evaluation did
not change (Z = 0.8452, p - value = 0.1990, power = 0.05 0.2092) among patients infected LB
(25%) and other species (37.5%). Conclusions: probes ITS 1 and hsp70-234 are not able to
distinguish Lb, and Lg, Lli species separately. G6PD-PCR assays are important for distinction
of Lb. Dropout rates to treatment (25%) and treatment failure (29%) are factors influencing
morbidity by LC and should be considered in combating the disease.
Key words: tegumentary leishmaniasis, PCR, RFLP.
15
1 INTRODUO
A Leishmaniose Tegumentar (LT) uma doena de pele e mucosas que acomete
milhares de pessoas em regies tropicais e subtropicais do mundo (Lainson et al., 1992; 1994).
Pases da America Central e Amrica do Sul concentram a maior diversidade de parasitos do
gnero Leishmania, subgneros Viannia e Leishmania, agentes etiolgicos da doena (Lainson,
2010). No Brasil o Estado do Par, rea de bioma predominante de floresta amaznica, sete
espcies dermotrpicas alternam o ciclo de vida entre uma srie de mamferos silvestres e
dpteros da famlia Psychodidae (Brasil, 2010). Entre as espcies patognicas L. (V.)
braziliensis e L. (L.) amazonensis destacam-se por estarem associadas respectivamente
leishmaniose cutneo-mucosa (LCM)/leishmaniose mucosa (LM) e leishmaniose difusa
anrgica (LDA), consideradas formas graves de LT (Silveiraa et al., 2009). Nesses casos
freqente a falha teraputica, deformaes estticas e estigma psicossocial ao indivduo
acometido (Gontijo & Carvalho., 2003). As demais espcies patognicas: L. (V.) guyanensis, L.
(V.) lainsoni, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) linderbengi causam a forma mais branda da
doena caracterizada por leso localizada nica ou mltipla (Silveira et al., 2002; 2004).
Aplicaes de ensaios moleculares em diferentes reas de ocorrncia simpatrica de
espcies de Leishmania so constantemente aperfeioados e apontados como ferramentas
futuras de substituio tcnica de referncia de eletroforese enzimtica multilocus (MLEE) e
anticorpos monoclonais para caracterizao e tipagem do parasito em nvel de espcie
(Schnian et al., 2010). A despeito de serem as tcnicas padres-ouro, esses ensaios,
demandam grandes esforos operacionais para o isolamento e cultivo do parasito dificultando
sua aplicao na rotina (Schnian et al., 2011).
Apesar de promissor o estudo em nvel molecular laborioso, pois no genoma do
parasito h poucas regies polimrficas, capazes de distinguir todas as espcies de Leishmania,
particulamente das agrupadas no subgnero Viannia, e quando possvel, variaes
intraespecficas e interespecficas ocorrem em parasitos que circulam dentro de uma mesma
rea ou diferentes reas geogrficas modificando a acurcia das tcnicas empregadas na
caracterizao e tipagem inicialmente padronizadas com isolados e posteriormente em amostras
clnicas (Peacock et al., 2007; Tsukayama et al., 2009; Lymbery & Thompson, 2012).
Alvos moleculares para os genes da enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD),
Espaadores Internos Trancritos - ITS (do ingls: Internal Transcribed Spacer), do DNA da
subunidade menor do ribossomo USSrDNA (do ingls: Small Subunit Ribossomo),
protenas de choque trmico - hsp (do ingls: heat schok protein) tm apresentado
16
sensibilidade e especificidade satisfatrias em anlise de amostras clnicas, fato no passvel
de ocorrer nos testes convencionais ao ponto de definir a taxonomia e permitir estudos de
diversidade gentica dos parasitos do gnero Leishmania (Castilho et al., 2003; Cupolilloa et
al., 1995; Shnian et al., 2003; Garcia et al., 2004; 2007).
A distino de Leishmania em nvel de espcie fundamental para elucidar a
freqncia e distribuio associadas as formas graves de LT, proporcionar melhor prognstico
clnico, adequaes aos protocolos de tratamento e gerar subsdios aos programas de vigilncia
e controle da doena a fim de minimizar os danos a sade humana (Goto & Lindoso, 2010).
1.1 EPIDEMIOLOGIA
A LT endmica em 88 pases onde se estima que um milho de indivduos possam
adoecer por ano (WHO, 2010). Os registros de casos da doena so mais frequentes em regies
tropicais e subtropicais do mundo (WHO, 2010). Cerca de um tero de casos ocorrem nos
pases das bacia do Mediterrneo, sia Ocidental, sia Central e Oriente Mdio, tidos como
pases pertencentes ao Velho Mundo, e nas Amricas, os denominados pases do Novo
Mundo (Alavar et al., 2012). Nas Amricas os registros de LT so mais expressivos nos
pases da Amrica do Sul dentre os quais o Brasil, a Colmbia e o Peru se destacam (Alavar et
al., 2012; Karagiannis-Voules et al., 2013).
17
Figura 1 Distribuio de registros de casos de LT no mundo no perodo de 2005 a 2009.
Fonte: http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx.
O Brasil possui seis biomas terrestres constitudos por ecossistemas de fauna e flora
que ultrapassam os limites geopolticos definidos pelas cinco Regies nas quais os estados
esto agrupados (Figura 2a e 2b). No Brasil h registros de casos de LT nos 26 Estados e no
Distrito Federal, capital do pas (Figura 2c). So descritas 37 reas onde o risco de transmisso
da doena intenso, denominadas de circuitos de produo de casos de LT (Figura 2b). A
Regio Norte do pas, composta por sete Estados onde o bioma de floresta amaznica,
apresenta as maiores taxas de deteco de casos de LT (Figura 2c).
http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx
18
Regio Sigla Estado
Taxa de deteco
(100.000 hab.) Regio Sigla Estado
Taxa de deteco
(100.000 hab.)
Norte AC Acre 119.69 Centro-Oeste MT Mato Grosso 60.36
AM Amazonas 65.44 MS Mato Grosso do Sul 3.80
AP Amap 79.76 GO Gais 5.23
PA Par 47.42 DF Distrito Federal 1.36
RO Rondnia 44.61 Sudeste ES Espirito Santo 3.47
RR Roraima 49.28 MG Minas Gerais 8.90
TO Tocantins 29.42 RJ Rio de Janeiro 0.41
Nordeste AL Alagoas 1.12 SP So Paulo 0.60
BA Bahia 26.55 Sul PR Paran 2.96
CE Cear 9.54 RS Rio Grande do Sul 0.01
MA Maranho 41.77 SC Santa Catarina 0.11
PB Paraba 0.69
PE Pernambuco 4.90
PI Piau 5.55
RN Rio Grande do Norte 0.22
SE Sergipe 0.34
Circuitos de produo
de casos de LT no Brasil
no perodo de 2008 a
2010.
BA
C
Figura 2 Epidemiologia da LT no Brasil. A: Mapa do Brasil com a distribuio dos biomas
da Amaznia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlntica, Pampa e Pantanal. B: Circuitos de produo
de casos de LT no Brasil. C: Taxa de deteco de LT nos estados brasileiros. Fonte: A-
http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/noticia_visualiza.php?id_noticia=169; B e
C: ENSP/2012.
Na regio norte o estado do Par, com dimenso de 1.247.689,515 Km, populao de
7,7 milhes de habitantes, formado por seis mesorregies que albergam seus 143 municpios
notifica uma mdia de 3.646 casos da forma cutnea e 101 casos da forma mucosa de LT no
perodo de 2007 a 2011 (Figura 3). Os registros de co-infeco LT e HIV tem mdia de 20
casos anuais para o mesmo perodo (SINAN/SESPA/2012).
http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/noticia_visualiza.php?id_noticia=169
19
4602
4193
3062
2513
3861
9389
98103
123
3119 13 18 17
0
50
100
150
200
250
300
0
1000
2000
3000
4000
5000
2007 2008 2009 2010 2011
les
o m
uco
sa x
Co
infe
c
o H
IV
N. d
e c
aso
s d
e L
T
Anos
N. de casos LM COINF
Figura 3 Registros das formas cutnea e mucosa e co-infeco LT x HIV no Estado do Par,
no perodo de 2007 a 2011. Fonte: SINAN/SESPA/2012.
A despeito do destaque de dois principais circuitos de produo de casos de LT no
estado do Par (Figura 2b circuito nmero 4 e 16) a transmisso da doena endmica em
praticamente todo o estado. No perodo de 2010 a 2012, 38 municpios foram classificados
como rea de muito alto risco e 56 de alto risco para a ocorrncia do agravo apesar da curva de
tendncia indicar um decrscimo no registro de casos da doena no Estado do Par (Figura 4).
A mesorregio do Baixo Amazonas do Estado do Par constituda por um total de
14 municpios agrupados na microrregio de Almerim (Almerim e Porto de Moz),
microrregio de bidos (Faro, Juruti, bidos, Oriximin e Terra Santa) e microrregio de
Santarm (Alenquer, Belterra, Curu, Moju dos Campos, Monte Alegre, Placas, Prainha e
Santarm) uma das reas prioritrias para aes de vigilncia e controle de LT no Par.
Dentre os municpios pertencentes mesorregio do Baixo Amazonas o municpio
de Santarm se destaca por possuir um servio de sade de referncia onde os indivduos
acometidos por LT so assistidos para o diagnstico e tratamento da doena. Este centro de
sade atende tambm a demanda dos demais municpios da mesorregio do Baixo Amazonas
(Figura 4).
20
Mesorregio do Baixo Amazonas
L. (V.) guyanensis
L. (V.) shawi
L. (V.) braziliensis
L. (V.) naiffi
L. (V.) lansoni
L. (V.) lindenbergi
Espcies dermotropicas de Leishmania
L. (L.) amazonensis
1- Almerim2- Alenquer
3- Belterra4- Curu5- Faro6- Juruti7- Monte Alegre8- bidos
10- Placas11- Prainha12- Porto de Moz
14- Terra santa13- Santarm
9- Oriximin
Figura 4 reas de risco de transmisso de LT e espcies dermotropicas de Leishmania no
Estado do Par. A: Diviso do Estado do Par em mesorregies. B: Risco de transmisso da
LT no Estado do Par. C: Espcies de Leishmania identificadas nos municpios pertencentes
mesorregio do Baixo Amazonas do Estado do Par. Fonte: A- Google; B-
SINAN/SESPA/2012; C- Garcez et al., 2010; Bacha et al., 2011; Jennings, 2003.
1.2 AGENTES ETIOLGICOS DE LT
A LT causada por Leishmania, micro-organismo eucarioto unicelular, pertencente ao
sub-reino Protozoa, filo Sarcomastigophora, ordem Kinetoplastida, famlia
Trypanosomatidae, gnero Leishmania, Ross, 1903. Esse parasito dimrfico, possui duas
formas evolutivas, a amastigota intracelular encontrada em clulas do Sistema Fagoctico
Mononuclear (SFM) do hospedeiro vertebrado (mamferos silvestres e acidentalmente seres
humanos), e a promastigota flagelada, encontrada no trato intestinal do inseto vetor, dpteros
da famlia Psychodidade, e em meios de cultura (Grimaldi et al., 1989).
A forma amastigota possui formato esfrico a ovode. Possui um ncleo esfrico
localizado em um dos lados, um cinetoplasto em forma de basto, geralmente prximo ao
ncleo, e um flagelo interno rudimentar. A forma promastigota alongada, com aspecto
A B
C
http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Amastigota&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Sistema_fagoc%C3%ADtico_mononuclear&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Sistema_fagoc%C3%ADtico_mononuclear&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Promastigota&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Vetor_(epidemiologia)http://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleohttp://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Cinetoplasto&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Flagelo
21
fusiforme ou piriforme, com um flagelo livre na regio anterior. O ncleo esfrico e
geralmente se situa na regio central da clula, mas pode variar de posio. O cinetoplasto
afina na regio anterior (Lainson & Shaw, 1978).
Leishmania possui genoma haplode com cerca de 36 cromossomos e 8.273 genes
dependendo da espcie (Kazemi, 2011). No ncleo h sequncias de DNA codificantes e no
codificantes denominados de xon e ntrons respectivamente (Shlomai, 2004). O DNA
extranuclear presente no cinetoplasto (kDNA), organela que agrupa protozorios na ordem
Kinetoplastida, composto de uma rede de molculas circulares, as quais so divididas em
maxicrculos extremamente homogneos, com cerca de 20-35 kb de no mximo 50 cpias, e o
minicrculos, caracterizados por sequncia heterogneas e em abundncia na clula (Stuart et
al., 2008; Ampuero et al., 2009).
A caracterizao em nvel de espcie atualmente considera a combinao de critrios
bioqumicos e moleculares a despeito de anteriormente terem sido baseadas em parmetros
eco-biolgicos como a reproduo de formas promastigotas nas pores do intestino do vetor,
distribuio geogrfica e manifestaes clnicas (Shnian et al., 2010).
Os subgneros Leishmania, SafJanova, 1982 e Viannia, Lainson & Shaw, 1987
agrupam cerca de 20 espcies patognicas (Lainson, 2010). Quatro espcies so consideradas
de importncia mdica em pases do Velho Mundo: Leishmania (L.) major, Leishmania (L.)
tropica, Leishmania (L.) killick e Leishmania (L.) aethiopica. Outras quatorze so agentes
etiolgicos de LT nos pases do Novo Mundo (Figura 5).
Nos pases da Amrica Latina encontrada a maior diversidade de espcies
dermotrpicas com destaque ao Brasil onde o Estado do Par registra a circulao de sete
espcies patognicas: Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania
(V.) lainsoni, Leishmania (V.) shawi, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) lindenbergi e
Leishmania (L.) amazonensis (Grimaldi et al., 1989; Silveira et al., 2002). H ainda o registro
de L. (V.) utinguensis, mas que at o momento no foi associada a casos humanos de LT (Braga
et al., 2003).
Estudos de Jennings (2003), Bacha et al (2011) e Garcez et al (2010) destacam a
ampla circulao de espcies do subgnero Viannia nos municpios que compem a
mesorregio do Baixo Amazonas do Estado do Par (Figura 2). Estudos de Jennings (2003)
destacaram a simpatria de quatro das sete espcies causadoras de LT ocorrendo somente no
municpio de Santarm: L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) lainsoni e L. (V.) shawi.
Mais tarde Bacha et al, (2011) identificaram a circulao de L. (L.) amazonensis em Santarm.
Portanto so cinco espcies patognicas circulando em uma nica rea.
22
L. (L.) amazonensis
L. (L.) mexicana
L. (L.) pifanoi
L. (L.) venezuelensis
L. (L.) garnhami
L. (V.) guyanensis
L. (V.) shawi
L. (V.) braziliensis
L. (V.) naiffi
L. (V.) lansoni
L. (V.) lindenbergi
L. (V.) panamensis
L. (V.) peruviana
L. (V.) colombiensis
L. (V.) panamensis
* L. (V.) braziliensis/L. (V.) venuzuelensis
# L. (V.) braziliensis/L. (V.) peruviana
L. (V.) panamensis/L. (V.) guyanensis
L. (V.) braziliensis/L. (V.) panamensis
L. (V.) lansoni/L. (V.) naiffi
Brasil
Demais pases da Amrica Latina
Espcies dermotropicas de Leishmania
Hbridos de Leishmania
*
#
Figura 5 Espcies dermotrpicas de Leishmania circulando em pases da Amrica Latina.
Fonte: Report f a meeting of the World Health Organization (WHO) Expert Committee on the
Control of leishmaniases, Geneva, 22-26 March 2010.
A princpio, acredidava-se que a elevada diversidade de espcies de Leishmania e a
alta variabilidade gentica dentro de cada grupo de espcies eram resultado da expanso
clonal ocorrida durante a reproduo assexuada do parasito (Cupolillo et al., 1997, 1998,
2003). Atualmente, experimentos j demonstraram a ocorrncia de reproduo sexuada
gerando recombinao gentica e consequente formao de espcie hbrida de Leishmania, ou
seja, espcie com marcadores genticos de duas espcies (Sadlova et al., 2011; Rogers et al.,
2014). Sabe-se que esta ocorrncia limitada na natureza e ocorre dado o elevado nmero de
espcies de vetores e reservatrios silvestres que sustentam o ciclo zoontico permitindo que
um vetor realize o repasto sanguneo adquirindo duas ou mais espcies de parasitos e que
trocas genticas sejam geradas (Coelho et al., 2012).
So conhecidos hbridos de Leishmania causando LT em cinco pases da Amrica
Latina (Davies et al., 2000). Na Venezuela foi identificado hbrido de L. (V.) braziliensis/L.
23
(V.) venuzuelensis, no Peru de L. (V.) braziliensis/L. (V.) peruviana, no Equador de L. (V.)
panamensis/L. (V.) guyanensis, na Nicargua e Equador de L. (V.) braziliensis/L. (V.)
panamensis e no Brasil mais precisamente no Estado do Acre hibrdo de L. (V.) lansoni/L.
(V.) naiffi (Lainson, 2010; Tojal da Silva et al., 2006).
1.3 CICLO DE TRANSMISSO DE LT
Vetores e reservatrios silvestres de parasitos do gnero Leishmania so encontrados
na floresta e, por isso, inicialmente a transmisso de LT aos seres humanos ocorre
acidentalmente (Lainson & Shaw, 1978). No entanto diferentes padres epidemiolgicos de
transmisso so formados dados ocupao do homem nos diferentes espaos originando a
adaptao de vetores e reservatrios prximas as reas de convvio humano como o ciclo de
transmisso em reas de colonizao recente ou peridomsticas (Marzochi & Marzochi,
1997).
Mamferos silvestres de diferentes ordens incluindo roedores, marsupiais e edentados
podem albergar o parasito (Lainson & Shaw, 1992; Lainson et al., 1994). Os vetores, dpteros
fmeas da famlia Psychodidae, conhecidos como flebotomneos adquirem Leishmania ao se
alimentarem do sangue desses animais. No trato digestivo do vetor a forma evolutiva
amastigota exterioriza o flagelo e passa a ser denominada de forma evolutiva promastigota
onde se multiplica por diviso binria (Lainson & Shaw, 1987). Em outro repasto sanguneo,
o vetor poder picar um hospedeiro vertebrado susceptvel (mamferos silvestres e/ou seres
humanos) e regurgitar as leishmnias no canal aberto para suco de sangue (Figura 6).
A fauna dos gneros Phebotomus e Lutzomyia agrupam importantes espcies vetoras
no Velho Mundo e Novo Mundo respectivamente (Young & Duncan, 1994). Trata-se de
insetos pequenos com no mximo 0,5 cm de comprimento, de cor castanho, pernas longas e
delgadas, corpo densamente piloso, vo saltitante e mantm as asas eretas em repouso (Brasil,
2010). Machos e fmeas so discriminados pela morfologia da genitlia (Young & Duncan,
1994).
24
Figura 6 Ciclo de transmisso da LT. A: Febotmo regurgitando formas promastigotas em
um hospedeiro vertebrado e clulas desse hospedeiro fagocitando o parasito que passa a forma
amastigota. B: Formas promastigotas. C: formas amastigotas intracitoplasmtica (Fonte: A-
Google; B e C: Silveira et al., 1997).
1.4 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR: INFECO, IMUNOPATOLOGIA E DOENA
A inoculao de formas promastigostas metacclicas de Leishmania durante o repasto
sanguneo do vetor na pele de seres humanos promove a ativao de resposta imunolgica
inata. Clulas do SFM, neutrfilos, macrfagos, clulas dentrticas e de Langerhans, migram
para o local da picada do vetor para fagocitar as leishmnias (Brasil, 2010). No ambiente
intracelular as formas promastigostas metacclicas passam forma amastigota em razo de se
encontrarem no interior de fagossomos (Grimald et al., 1982). Nos fagossomos os parasitos
produzem substncias como o gp63, o lipofosfoglicano e a fosfatase cida com objetivo de
degradar enzimas lisossmicas, inibir a gerao de metabolitos oxidativos e bloquear a
produo de radicais de oxignio respectivamente (Brasil, 2010). Tais substncias modulam a
resposta imune inata e evitam a gerao da resposta imune adquirida necessria ao estmulo
A B
C
25
de clulas efetoras como os linfcitos T do tipo CD4+ e CD8+ garantindo a multiplicao do
parasito por diviso binria (Campos et al., 2008).
A presena de interleucina IL-12 essencial para diferenciar linfcitos T do tipo
CD4+ virgem (Th0) em linfcitos T CD4+ com perfil Th1 (Awasthi et al., 2004). Cellas com
esse perfil so capazes de se ligar s clulas do SFM via MHC de classe II e promover a
produo de interferon- (IFN- ) e Fator de Necrose Tumoral (TNF-) no interior de clulas
do SFM induzindo a morte dos parasitos (Pereira-Carvalho et al., 2013). No entanto quando
ocorre diferenciao de clulas T CD4+ com perfil Th2, dadas s produes de interleucinas
IL-4, IL-5, IL-10, origina-se a produo de anticorpos, ou seja, uma resposta imunolgica no
efetiva infeco por Leishmania (Oliveira et al., 2014). Linfcitos T do tipo CD8+
desencadeam efeitos leishmanicidas atravs da produo IFN- (Dantas et al., 2013).
comum ocorrncia de leses localizadas nicas ou mltiplas (Figura 7), limitada
ao local da picada do vetor, com apresentao clnica de ppula que com o tempo ulcera
(Grimald et al., 1982).
Leses clssicas tm bordas elevadas, presena de eritema e fundo granuloso
denominada de Leishmaniose Cutnea Localizada-LCL e so causadas por qualquer espcie
de Leishmania (Lainson et al., 1994). H de se considerar leses atpicas (Figura 7) de
aspectos impetigide, liquenide, tuberculide ou lupide, nodular, vegetante e ectimatide
sendo descritas como LT (Guimares et al., 2009).
Em alguns casos possvel que LCL sejam auto-resolutivas (Grimald et al., 1982).
No entanto, mesmo quando presente a resposta imune celular mediada por linfcitos T CD4+
com perfil Th1 e linfcitos T CD8+ frequente a resistncia do parasito persistindo a LCL
(Silveira et al., 2005). Sem interveno medicamentosa adequada o processo inflamatrio
agrava com as infeces secundrias por fungos e bactrias promovendo destruio de tecido
e o aumento gradativo da leso cutnea (Guenin-Mace et al., 2014).
A cura clnica em decorrncia de um tratamento correto ou auto-resoluo da ferida
leishmanitica (LCL) no garante a total destruio dos parasitos e por isso, cerca de 5% de
casos de LCL, mesmo depois cinco anos de tratamento recorrem com leses nas mucosas do
nariz, da boca e/ou da garganta (Figura 8) denominada de Leishmaniose Mucosa-LM
(Pereira-Carvalho et al., 2013). Contudo, a LCL pode ser acompanhada de uma leso mucosa,
ou vice-versa, sendo, portanto, classificada como Leishmaniose Cutnea Mucosa-LCM
(Silveirac et al., 2009). A partir de uma leso inicial de LCL tambm pode surgir,
abruptamente, inmeras leses acneiformes, papulosas e ulceradas denominada de
Leishmaniose Disseminada-LD (Machado et al., 2011).
26
O espectro clnico de LM, LCM e LD est associado frequentemente espcie L.
(V.) braziliensis que pode ser transmitida por diferentes vetores dependendo da rea
geogrfica (Ishikawa et al., 2002). Na Amaznia, em particular, se destacam os vetores
Lutzomyia (Psychodopygus) wellcomei e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus (Fraiha et al.,
1971; Souza et al., 1996. O primeiro altamente antropoflico e realiza repasto sanguneo
mesmo durante o dia (Fraiha, 1983).
Em indivduos anrgicos, ou seja, aqueles com resposta imunolgica celular do tipo
CD4+ com perfil Th2 ocorrem disseminao hematognica do parasito dada a ausncia de
resposta efetiva capaz de promover a destruio dos parasitos (Silveira et al., 2005). Nesses
indivduos as leses apresentam-se em placas infiltradas, ndulos e tuberculos que no
ulceram como na LCL, LM, LMC e LD, com aparecimento de leses em vrias partes do
corpo que reincidem mesmo aps o tratamento especfico (Silveirab, 2009). A esse caso
clnico denomina-se de Leishmaniose Difusa Anrgica-LCD onde a ausncia de resposta
imunolgica efetiva (Figura 8) permite que as clulas do SFM permaneam repletas de
parasitos vacuolizados nos tecidos da derme e da hipoderme (Brasil, 2010).
No Brasil os registros de LCD se concentram nas reas de bioma de floresta
amaznica onde a casustica de aproximadamente 60 casos (Silveirab, 2009). A espcie L.
(L.) amazonensis o agente etiolgico responsvel e a esse atribudo o papel de contribuir
na modulao do sistema imunolgico do indivduo ao plo anrgico (Silveira et al., 2008). A
transmisso feita por Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomia olmeca nociva, vetores pouco
antropoflicos com preferncia reas de vrzeas (Lainson & Shaw, 1968). Os relatos clnicos
frequentemente discorrem sobre falhas teraputicas aos protocolos de tratamento
preconizados pelo Ministrio da Sade (MS), desfigurao e perda de membros semelhante ao
que ocorre na hansenase Virchowiana (Brasil, 2010). A literatura descreve um caso LCD
onde a cura clnica foi alcanada com a associao de tratamento convencional e imunoterapia
em um indivduo com 24 anos de doena (Silveira & Mayrink, 1997).
O amplo espectro clnico da LT decorre principalmente de fatores inerentes relao
parasito-hospedeiro como virulncia da espcie infectante e resposta imunolgica (Reiner &
Locks-Ley, 1995). Em indivduo imunocompetente infectado com L. (V.) braziliensis, por
exemplo, os nveis de IFN- e IL-10 produzidos so equilibrados e por isso as leses cutneas
so limitadas. Mas, na LM e/ou LCM os nveis de IFN- e TNF- so altos enquanto de IL-
10 os nveis so baixos potencializando a destruio das membranas (Gomes-Silva et al.,
2007). Em indivduos imunodeprimidos dada infeco pelo vrus da imunodeficincia humana
- HIV os nveis de produo de IFN- e IL-10 produzida em resposta a estimulao com
27
antignios de Leishmania tem se mostrado significativamente menores, ou seja, h uma
resposta imunolgica com tendncia ao plo anrgico e, talvez, por isso, seja comum nos
casos de co-infeco Leishmania-HIV quadros clnicos semelhantes a LCD (Rodrigues et al.,
2011). No Brasil e tambm na ndia leses difusas e disseminadas indicador clnico da co-
infeco leishmania x HIV (Khandelwal et al., 2011; Brasil, 2004).
No obstante a saliva do vetor introduzida durante o repasto sanguneo possui
propriedades imunomodulatrias a exemplo do maxidilan, um potente vasodilatador, capazes
de induzir maior ou menor suscetibilidade infeco por Leishmania (Morris et al., 2001;
Carregaro et al., 2013). H ainda hiptese de que a infeco por Leishmania seja um fator
predisponente ao carcinoma basocelular (CBC), tumor maligno da pele (Asilian et al., 2012).
Relatos clnicos j evidenciaram a identificao de LCL e CBC numa mesma leso (Morsy et
al., 1992).
A B
C D E
Figura 7 Espectro clnico da LT. A: Leso clssica de LT com bordas elevadas e fundo
granuloso. B: Leso de LT aps infeco secundria. C, D e E: Leses atpicas de LT com
apresentaes verrucosa, crostosa e lupode respectivamente. Fonte: A- Lourdes Garcez; B-
Godinho, 11 Centro Regional de Sade do Par, 2011; C, D e E- Guimares et al., 2006.
28
Polo hiperrgico
Subgnero Viannia
Espcie de Leishmania
Resposta Imunolgica+
Subgnero Leishmania
Polo anrgico
Leishmaniose difusa Leishmaniose mucosa
Figura 8 Polarizao da LT. Fonte: adaptado de Atlas de LT diagnstico clnico
diferencial (Brasil, 2006).
1.5 DIAGNSTICO E TRATAMENTO NA REDE DE ASSISTNCIA DO SUS
A suspeio clnica de LT ocorre quando o paciente apresenta lcera cutnea, com
fundo granuloso e bordas infiltradas em moldura ou ainda quando apresenta lcera na mucosa
nasal, com ou sem perfurao ou perda do septo nasal, podendo atingir lbios e boca (Brasil,
2010). Um apoio a suspeio clnica a investigao epidemiolgica que visa identificar se o
paciente de rea onde a transmisso de LT endmica ou se realizou atividades laborais ou
recreativas em contato com a floresta (Brasil, 2010).
Diante da suspeita clnica-epidemiolgica de LT a confirmao do caso pode se d
atravs da realizao do exame parasitolgico direto (Herwaldt, 1999). Trata-se de
procedimento simples onde a coleta de material biolgico ocorre por meio da escarificao da
borda da leso seguindo por sua disteno em lmina e colorao por Giemsa (Figura 9) para
pesquisa de formas amastigotas de Leishmania ao microscpio ptico (Brasil, 2010). A
pesquisa do parasito pode ser realizada tambm atravs de exame histopatolgico, mas nesse
caso, a obteno de material biolgico se d pela retirada de fragmento de pele da borda da
leso por bipsia seguida de sua fixao em formol 10% e parafina. Em seguida so
29
realizados cortes teciduais com auxlio de micrtomo e colorao pela tcnica de
hematoxilina-eosina para pesquisa de Leishmania ao microscpio ptico (Herwaldt, 1999).
No entanto, alguns fatores podem interferir na sensibilidade desse mtodo de
diagnstico como o tempo de evoluo da doena, principalmente quando h o envolvimento
das espcies do subgnero Viannia, dada a escassez de parasitos na leso, tornando muitas
vezes exaustivo o mtodo e exigindo grande habilidade do microscopista (Ramirez et al.,
2000; Ampuero et al., 2009).
H outros mtodos de diagnstico parasitolgico como a inoculao de material
biolgico de paciente em animais de laboratrio, de preferncia hamsters (Mesocricetus
auratus) ou a inoculao direta do material em meio de cultura bifsico como gar-sangue de
Novy e Neal modificado por Nicolle NNN para tentativa de isolamento de formas
promastigotas de Leishmania. Contudo, os mtodos de isolamento exigem facilidade
laboratorial e pessoal treinado, por isso esto disponveis apenas em Centros de Referncia
para o diagnstico e tratamento da LT (Gontijo & Carvalho, 2003). Outras desvantagens
desses mtodos de pesquisa indireta do parasito so o longo tempo de excecuo (meses) e o
risco de contaminao (Fagundes et al., 2010).
Outro mtodo de apoio ao diagnstico da LT usado na rotina do SUS o Teste
Intradrmico de Montenegro (Weigle et al., 1991). Neste teste, inoculada intradermicamente
uma pequena quantidade de antgeno do parasito na pele do paciente (Figura 9) e a reao
cutnea, mediada por clulas T, quando presente medida 48 a 72 aps a aplicao do
antgeno. Se a endurao na pele for 5 mm considerada positiva. Trata-se de um mtodo
indireto, cuja positividade indica sensibilidade ao antgeno de Leishmania e permite concluir
que houve exposio do indivduo ao parasito, mas no esclarece se recente ou passada (Brasil,
2010). Em indivduos infectados com leishmnias do subgnero Viannia comum formao
de endurao extensa e ausncia de endurao em indivduos infectados com leishmnias do
subgnero Leishmania (Weigle et al., 1991; Silveira et al., 2004).
30
A B
CD
Figura 9 Diagnstico laboratorial para a LT disponvel na rotina no SUS. A- escarificao da
borda da leso. B- Formas amastigotas indicadas pelas setas confirmando o diagnstico de LT.
C- aplicao do IDRM. D- Leitura da IDRM aps 48 horas. Fonte: A e C prprias; B -
Godinho, 11 Centro Regional de Sade do Par, 2011; D- Lourdes Garcez.
O Ministrio da Sade do Brasil, em consonncia com a OMS, preconiza o antimonial
pentavalente (antimoniato de N-metil-glucamina), anfotericina B (na apresentao
desoxicolato e lipossomal) e pentamidina para o tratamento de LT (Brasil, 2010; 2004). Todos
os frmacos so de administrao parenteral com ajustes de dose e perodo conforme a forma
clnica de LT (Quadro 1).
O antimonial pentavalente foi introduzido no tratamento da LT pelo mdico paraense
Gaspar Vianna (Vianna, 1912). Trata-se de um pro-frmaco que tem sua formulao de Sb+5
reduzida a Sb+3
no fgado (Ashutosh & Goyal, 2007). Aps o metabolismo de primeira
passagem heptica a droga se deposita na pele, nas mucosas e tecidos do fgado, do corao e
dos rins. A elevada quantidade de antimnio que fica concentrada nos tecido o principal fator
associado ao efeito leishmanicida e consequentemente tambm toxicidade e efeitos adversos
(Lima et al., 2009). Esse medicamento indicado para o tratamento de todas as formas clnicas
de LT, incluindo casos de co-infeco Leishmania-HIV (Brasil, 2004). So tratados com droga
de 2 escolha, co pentamidina e anfotericina B, nefropatas, cardiopatas e gestantes (Brasil,
2010).
31
Quadro 1: Esquema teraputico de 1 escolha para o tratamento das diferentes formas de
LT.
Forma Clnica Dose Tempo de durao
Leishmaniose Cutnea 10 - 20mg/Sb+5/kg/dia
(Recomenda-se 15mg/Sb+5/
kg/dia)
20 dias
Leishmaniose Difusa 20mg/Sb+5/kg/dia 20 dias
Leishmaniose Mucosa 20mg/Sb+5/kg/dia 30 dias
Fonte: Ministrio da Sade, 2004 e 2010.
O critrio de cura clnico, ou seja, definido pelo aspecto de re-epitelizao das
leses, regresso total da infiltrao e eritema at 12 semanas aps a concluso do esquema
teraputico com o antimonial. Quando isso no ocorre o esquema teraputico pode ser
repetido por mais uma vez. Caso, aps a repetio do segundo esquema de tratamento com o
antimonial pentavalente ocorra falha teraputica ou recidiva da leso so administrados a
anfotericina B ou pentamidina, medicamentos de segunda linha (Brasil, 2010).
Todos os tratamentos para LT geram morbidade que comprometem o estado de sade
geral dos doentes como cefaleia, mialgia, nuseas, etc (Modabber et al., 2006). Por isso,
recomenda-se o ampanhamento laboratorial antes e durante todo o tratamento, com avaliaes
das transaminases, fosfatase alcalina, uria, creatinina e do eletrocardiograma (Brasil, 2010).
Contudo, dada procedncia de casos na maioria das vezes de reas rurais ou de acessos
remotos pacientes podem no aderir ao tratamento, principalmente em decorrncia do elevado
nmero de injees gerando frequentes abandonos de tratamento (Balan-Fouce et al., 1998).
Como consequncias das desistncias h o risco de formas graves de LT e resistncia aos
medicamentos disponveis para o tratamento (Ashutosh & Goyal, 2007).
Terapias de uso tpico tm sido testadas para o tratamento da LT como a aplicao
intralesional de Glucantime, o uso de pomada/creme a base de anfotericina B, aplicao de
laser, crioterapia e termoterapia na busca por melhores alternativas de tratamento (Alavi-Naini
et al., 2012; Valencia et al., 2013).
32
Na impossibilidade de interrupo do ciclo dessa zoonose por meio da vacinao at o
momento, a principal medida de controle o diagnstico e tratamento precoce dos casos, a fim
de minimizar a morbidade e seqelas da doena (Dumonteli, 2007).
Em razo disso o registro de confirmao de LT deve ser feito na base de dados do
Sistema de Informao de Agravo de Notificao (SINAN) com o objetivo de direcionar o
trabalho da equipe de vigilncia epidemiolgica que consiste principalmente na educao em
sade e busca ativa de casos suspeitos para a oferta de tratamento (Brasil, 2010).
Estudos j demostraram que fatores como o nmero de leses, tempo de doena e a
espcie de Leishmania influenciam na resposta ao tratamento conforme a rea geogrfica
(Lucas et al, 2008; Schriefer et al, 2004; 2009; Calvopina et al., 2006 ). Como nenhum dos
mtodos de diagnsticos laboratoriais usados na rotina do SUS permitem a identificao das
espcies de Leishmania responsveis pelo amplo espetro clnico da doena se tem investidos
em pesquisas que proporcionem ampliar o conhecimento da epidemiologia da doena a fim de
se estabelecer melhores protocolos de tratamento e medidas de controle (Arevalo et al., 2007;
Romero et al., 2001).
1.6 DISTINO EM NVEL DE ESPCIE
A OMS estabelece como mtodos de referncia para a caracterizao em nvel de
espcies critrios bioqumicos determinados por meio das tcnicas de anticorpos monoclonais
e anlise eletrofortica de isoenzimas (do ingls: Multi Locus Enzyme Electrophoresis-
MLEE).
Poucos centros de pesquisas cientifcas dispem do painel de anticorpos monoclonais
para caracterizao de Leishmania dada a interupo de sua produo. Embora esta tcnica j
tenha sido amplamente empregada nos estudos epidemiolgicos e taxonmicos a reatividade
aos antgenos espcie-especficos do parasito apresenta variaes dentro de uma mesma
espcie dependendo de suas origens geogrficas (McMahon-Pratt et al., 1981).
Para estudos na Amaznia, Shaw et al., (1989), porps o emprego de vinte e trs
anticorpos monoclonais para definir espcie de Leishmania (B2, B5, B11, B12, B13, B18,
B19, M2, T3, D13, M11, M12, CO1, CO2, CO3, L1, WIC, N2, N3, LA2, WH1, WA2, V1)
atravs da Reao de Imunofluorescncia Indireta RFI. Nesse teste lminas so impregnadas
com formas promastigotas do parasito, adicionando-se em seguida os anticorpos monoclonais
e o sistema biotina/avidina para favorecer a conjugao do complexo antgeno-anticorpo com
substncia fluorescente para leitura em microscpio com luz fluorescente (Figura 10). Os
33
anticorpos monoclonais da srie B e N reagem com os antgenos das espcies pertencentes ao
subgnero Viannia. Entre esses, h anticorpos espcie-especficos como, por exemplo, B18
para L. (V.) braziliensis, B19 para L. (V.) guyanensis e N3 para L. (V.) naiffi. Os anticorpos da
srie M, D, W e V so especficos para as espcies do subgnero Leishmania e os da srie L1
para os demais tripanossomatdeos.
Atualmente a anlise por MLEE a mais empregada para a tipagem e caracterizao
em nvel de espcie de Leishmania (WHO, 2010). A partir da aplicao da massa parasitria
em matriz de gel submetida a potencial eltrico possvel verificar a migrao de enzimas. A
visualizao da reao enzima-substrato feita por meio de solues especficas que
permitem detectar a presena ou ausncia de enzimas secretadas pelo parasito (Figura 10).
Quando presentes em homozigose (A1A1) ou heterozigose (A1A2) o produto da reao
visualizado no gel pela formao de banda nica ou banda dupla respectivamente, ou ainda,
formao de bandas triplas quando h co-dominncia (Aa). Contudo, a interpretao do perfil
de mobilidade eletrofortico deve considerar se h mais de um locus codificando a enzima, se
est presente em mais de um alelo neste locus ou se passa por efeito ps-transcricional
dependo de cada espcie de Leishmania (Richardson et al., 1986).
Cupolillo et al (1994) descreveu o perfil de mobilidade eletrofortico de 18 enzimas
para caracterizar espcies dermotrpicas de ocorrncia no Novo Mundo. Em estudo
subsequente, Cupolillo et al (1995b), destacou as enzimas 6PGDH (6 fosfo glucanato
desigrogenase) e G6PD (Glicose 6 fosfato desidrogenase) como sendo capazes de separar
diferentes grupos ou espcies de Leishmania dado o elevado polimorfismo presente nos
alelos.
Apesar de a anlise eletrofortica e anticorpos monoclonais serem consideradas
tcnicas padro-ouro para a caracterizao e tipagem de espcies de Leishmania sua avaliao
detecta apenas os produtos dos genes, ou seja, uma anlise do fentipo e, portanto mutaes
silenciosas que podem estar relacionadas a variaes inter ou intra-especficas das espcies
que podem fazer relao com o amplo espectro clnico da doena e/ou insucesso da terapia
passam despercebidas (Zemanov et al., 2007). Contudo, h de se considerar as dificuldades
de cultivo de algumas espcies, o tempo prolongado para o isolamento, o risco de
contaminao, o elevado custo e a necessidade de tcnicos treinados (Shnian et al., 2010).
34
Figura 10 Ensaios bioqumicos de caracterizao e tipagem de Leishmania. A- Ensaio de
anticorpos monoclonais evidenciado a reao positiva de antgeno do parasito com o
monoclonal B19. B- Anlise isoenzimtica mostrando o perfil de mobilidade eletrofortico de
diferentes isolados de Leishmania aps reao com substrado de enzima 6GPDH. Fonte: A e
B prprias.
No entanto, a partir da elucidao da estrutura do cido Desoxiribonucleco DNA,
por Watson e Crick em 1953, e a posterior compreenso dos mecanismos de replicao,
transcrio e traduo do material gentico tcnicas de biologia molecular foram
desenvolvidas, a exemplo, da Reao em Cadeia da Polimerase PCR (do ingls: Polymerase
Chain Reaction), PCRRFLP (do ingls: Restriction Fragment Length Polymorphism
Polymerase Chain Reaction) e sequenciamento para anlise do material gentico a fim de se
definir a etiologia, verificar variaes genticas entre populaes de uma mesma espcie
(gentica de populaes) ou descrever a organizao evolucionria (Lymbery & Thompson,
2012; Bauls et al., 1999; Singh, 1997).
A PCR permite amplificar milhares de cpias de uma dada sequncia de nucleotdeos
a partir de uma nica cpia de DNA presente em diferentes materiais biolgicos, tecido,
sangue, saliva, urina, sem necessidade de isolar o micro-organismo (Reithinger & Dujardin,
2007).
uma tcnica mais rpida, barata e segura frente s tcnicas convencionais de
caracterizao e tipagem de agente etiolgico. Sua sensibilidade e especificidade esto
relacionadas, respectivamente, ao nmero de cpias da sequncia de DNA na clula e do
desenho dos oligonucleotdeos, marcadores moleculares, utilizados na reao (Tsukayama et
al., 2009; Traub et al., 2005; Neitzke-Abreu et al., 2013).
Nas investigaes de alvos moleculares passveis de serem aplicados em estudos de
biologia molecular para Leishmania se destacam o DNA extranuclear presente no cinetoplasto
(kDNA), o DNA da SSUr, O DNA nuclear (mini-exon), globulina, ITS e o DNA de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Replica%C3%A7%C3%A3ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Transcri%C3%A7%C3%A3o_(gen%C3%A9tica)http://pt.wikipedia.org/wiki/Tradu%C3%A7%C3%A3o_(gen%C3%A9tica)
35
protenas de hsp dado o elevado nmero de seus genes e por variaes nas bases pricas e
pirimdicas serem capazes de discriminar Leishmania de outros microorganismos nas reaes
de PCR (Fleter-Winter & Shaw, 2004; Reithinger & and Dujardin, 2007; Roelfsema et al.,
2010).
Apesar da existncia de cpia nica do gene da enzima G6PD na clula a utilizao
de oligunocleotdeos descritos por Castilho et al, (2003) so aplicados com sucesso em
estudos de epidemiologia molecular discriminando os subgneros Leishmania do Viannia e a
espcie L. (V.) braziliensis. A identificao de L. (V.) braziliensis tem particular interesse,
pois de ampla distribuio geografica e est comumente associada aos casos de difcil
resoluo, quando se observam reativao da leso (recidiva cutis) aps o tratamento alm de
estar associadas s formas desfigurantes da LT (Schrief et al., 2004; 2009; Silveira et al.,
2004).
Os ensaios de PCR com os oligonucleotdeos direcionados a amplificao de
fragmentos dos genes mencionados acima so altamente sensveis (87% a 100%), exceto para
G6PD (40%), mas limitado na distino de espcies (Tojal da Silva et al., 2006). No
entanto, quando o produto de PCR com alvos moleculares para genes de ITS, hsp, kDNA, por
exemplo, so submetidos digesto por endonucleases de restrio, enzimas bacterianas
capazes de clivar regies determinadas do DNA amplificado, so gerados perfis de bandas
distintos cuja anlise permite identificao em nvel de espcie (Bensoussan et al., 2006;
Rotureaua et al., 2006). Denomina-se a esse processo de PCR-RFLP.
A tcnica de PCR-RFLP tem apresentando altos nveis de concordncia com os
resultados fornecidos nas anlises por MLEE e sequenciamento e, portanto sido muito
utilizada em anlises de diversidade gentica, por ser mais rpida e econmica (Da Graa et
al., 2012; Garcia et al., 2005).
Os ITS tem sido os principais marcadores moleculares aplicados nos ensaios de
PCR-RFLP em organismos de populaes estreitamente relacionadas como os parasitos do
gnero Leishmania, pois so altamente conservados em nvel de gnero, mas vriavl em
nvel de espcies (Cupolillo et al., 1995a).
H duas regies de ITS, a ITS1 de 300 a 350 pares de bases (pb) e a ITS2 de 700 a
750pb, localizados entre os genes 18S e 28S das unidades ribossomais que so intercaladas
pelo gene 5,8S presente no genoma nuclear (El Tai et al., 2000; 2001). A elevada
sensibilidade nos ensaios de PCR de ITS dada s sequncias de matrizes em tandem em
diferentes cromossomos do parasito (Cupolillo et al., 1995a).
36
El Tai et al (2000; 2001) descreveu os oligonucleotdeos LITSR/L5.8S e
LITSR/L5.8SR, capazes de distinguir a regio de ITS1 da regio de ITS2, respectivamente,
nos ensaios de PCR (Figura 11). Schnian et al (2003) aplicou aos produtos de PCR-ITS1
enzimas de restries capazes de evideciar perfis de bandas distintos para as principais
espcies de Leishmania de importncia mdica no mundo (Figura 12). Estudos subsequentes,
em pases da America Latina, mostraram a distino das espcies L. (V.) shawi, L. (V.)
amazonensis, L. (V.) lansoni e L. (V.) naiffi e perfil de bandas idnticos para L. (V.)
braziliensis/L. (V.) guyanensis por PCR-RFLP de ITS1 (Cupolillo et al., 1995b; Tojal da Silva
et al., 2006; Buitrago et al., 2011). Em 2012, Da Graa et al, revelou que produto de PCR-
RFLP de ITS1 aplicado em gel de poliacrilamida de alta resoluo pode distinguir, com
discreta diferena, L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis.
Estudos de Almeida et al (2011) descreveram variaes na sequncia de DNA para a
regio de ITS 2, amplificado pelos oligonucleotdeos LGITSF2 e LGITSR2, de trs
importantes espcies dermotropicas, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.)
amazonensis. No entanto, a PCR-RFLP desse amplicon distinguiu apenas L. (V.) guyanensis
das demais espcies do subgnero Viannia.
Figura 11 Localizao do gene de ITS e sua subdiviso em regio de ITS 1 e regio de ITS
2. Fonte: El tai et al., 2000.
37
Figura 12 Distino de espcies de Leishmania em ensaios de PCR-RFLP de ITS 1 aps
digesto enzimtica por HAE III em gel de poliacrilamida a 12,5% corado pela prata. La= L. (L.) amazonensis; Lb= L. (V.) braziliensis; Ln= L. (V.) naiffi; Ll= L. (V.) lansoni; Ls= L. (V.) shawi;
Lg= L. (V.) guyanensis; Li = L. (L.)infantum chagasi. Fonte: Da Graa et al., 2012.
Outros importantes marcadores para estudos de epidemiologia molecular de
Leishmania so a famlia das hsp, pois so molculas abundantes na clula, principalmente
em condies de estresse celular, e importantes no enovelamento e transporte de protenas
(Folgueira et al, 2007). A resposta de choque trmico um mecanismo homeosttico que
protege as clulas dos efeitos deletrios do estresse ambiental, como calor (Folgueira &
Requena, 2007). , portanto, essencial para a interao do parasito com seu hospedeiro
(Cuervo et al., 2009).
Garcia et al (2004, 2007) validou ensaios de PCR-RFLP para o gene hsp70
utilizando oligonucleotdeos que amplificava 1400 pb. Silva et al (2010) submeteu a esse
ensaio seis cepas de Leishmania de ocorrncia no Brasil onde foram obtidos perfis de bandas
diferentes para cepas de L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) lansoni e L. (L.)
amazonenis.
Mais tarde, Da Graa et al (2012), desenhou quatro pares de oligonucleotedos para a
regio interna aos descritos por Garcia et al (2004) a fim de tornar as reaes mais especficas
(Figura 13). Os oligonucleotdeos desenhados para o ensaio hsp70C, de aproximadamente 234
pb, apresentou melhores resultados de sensibilidade e quando submetidos a digesto por
endonucleases geraram um conjunto de perfis de bandas distintos para seis espcie de
Leishmania de ocorrncia simpatrica na Amaznia.
Os produtos de PCR de hsp70C digeridos com a endonuclease Hae III gerou perfis
idnticos para L. (V.) lainsoni e L. (V.) shawi, bem como para L. (V.) braziliensis e L. (V.)
naiffi, enquanto que L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis apresentaram perfis nicos.
38
Enquanto os produtos de PCR de hsp70C digeridos com endonuclease BstU I diferencia L.
(V.) naiffi de L. (V.) braziliensis e L. (V.) shawi de L. (V.) lainsoni (Da Graa et al., 2012).
Figura 13 Distino de espcies de Leishmania em ensaios de PCR-RFLP de hsp70-234
aps digesto enzimtica por HAE III e BstUI em gel de poliacrilamida a 12,5% corado pela
prata. La= L. (L.) amazonensis; Lb= L. (V.) braziliensis; Ln= L. (V.) naiffi; Ll= L. (V.) lansoni; Ls= L.
(V.) shawi; Lg= L. (V.) guyanensis; Li = L. (L.)infantum. Fonte: Da Graa et al., 2012.
1.7 JUSTIFICATIVA
H pouco tempo a caracterizao e tipagem de espcies de Leishmania era realizada
por mtodos bioqumicos, onde o isolamento do parasito imprescindvel. Atualmente,
tcnicas de biologia molecular com marcadores moleculares especficos so colocadas como
preferenciais aos mtodos convencionais para tipagem em nvel de espcie de Leishmania,
pois apresentam resultados compatveis e podem ser realizadas a partir de amostras clnicas.
As tcnicas de PCR-G6PD, PCR-RFLP de ITS 1 e PCR-RFLP de hsp70 quando
realizadas a partir do DNA extrado de leso, seriam capazes de distinguir seis espcies de
importncia mdica, mas ainda no foram aplicadas em conjunto para o diagnstico etiolgico
de pacientes no Estado do Par. Tambm desconhecido o poder discriminatrio desses
ensaios na identificao de L. (V.) lindenbergi, a 7 espcie patognica descrita no Par.
39
Considerando a relevncia epidemiolgica da LT como problema de sade pblica
na messoregio do Baixo Amazonas do Par dada e a diversidade de espcies de Leishmania
relatado no Estado, buscou-se conhecer a etiologia de LT nessa regio que um polo de
desenvolvimento no Par.
1.8 OBJETIVOS
1.8.1 Objetivo geral
Descrever a etiologia da leishmaniose tegumentar em uma srie de casos novos na
Regio do Baixo Amazonas, Estado do Par, Brasil.
1.8.2 Objetivos especficos
Identificar, por meio de PCRs com diferentes oligonucleotdeos, as espcies de
Leishmania em amostras de pele de pacientes atendidos em centros de sade da
mesorregio do Baixo Amazonas, Par;
Testar a sensibilidade de novos oligonucleotideos baseados no gene hsp70 para a
identificao de subgneros e/ou espcies de Leishmania;
Investigar possveis associaes entre agente etiolgico e resposta ao tratamento aps
uma srie do antimonial;
40
2 MATERIAL E MTODO
2.1 ASPECTOS TICOS
Este estudo foi aprovado pelo Comit de tica e Pesquisa com Seres Humanos do
Instituto Evandro Chagas cujo registro consta sob o nmero CAAE 0030.0.072.000-09.
Participaram do estudo apenas os pacientes que concordaram e se declaram cientes aps
receber informaes sobre o projeto por meio do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido. Todos os pacientes que participaram da pesquisa receberam diagnstico,
tratamento e acompanhamento conforme recomendaes do Ministrio da Sade do Brasil.
Este projeto de pesquisa foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico (Processo N 483597/2009-0) e Tecnolgico e Fundao Paraense de Amparo
Pesquisa (ICAAF N 234/2009).
2.2 DESENHO DO ESTUDO
Tratou-se de um estudo hbrido onde a descrio da etiologia de uma srie de casos
novos de LT, estudo transversal, atendidos nas unidades de sade dos municpios de Juruti e
Santarm, Par, no perodo de janeiro de 2010 a dezembro de 2011. Esses pacientes foram
acompanhados, por um estudo longitudinal, por um perodo de trs meses para investigar
possveis associaes entre subgnero ou espcie de Leishmania com o grau de epitelizao
da leso aps uma srie de glucantime.
2.3 PERGUNTAS
Este projeto de pesquisa se prope a responder trs perguntas: 1- Quais espcies de
Leishmania esto associadas aos casos novos de leishmaniose cutnea na regio do Baixo
Amazonas? 2- Qual a sensibilidade da nova PCR baseada em uma pequena sequncia (234pb)
do gene hsp70-234 para identificar o gnero Leishmania? Uma PCR-RFLP deste produto
produziria padres de bandas espcie-especficos? 3- H associao entre subgnero ou espcie
de Leishmania e resposta ao tratamento com uma srie do antimonial?
41
2.4 REA DO ESTUDO
Os municpios de Juruti e Santarm (Figuras 14 e 15), escolhidos como reas para o
estudo, localizam-se na Mesorregio do Baixo Amazonas. As caractersticas climticas e
geogrficas so semelhantes para a rea de abrangncia dos dois municpios. O espao
geogrfico possui reas de vrzeas e planaltos. A temperatura mdia anual varia de 25 a
28C, com umidade relativa mdia do ar de 86%. A precipitao fluvial maior no chamado
perodo de "inverno", que ocorre de dezembro a maio. Nos meses de junho a novembro ocorre
o perodo mais seco, correspondendo ao "vero" regional.
O municpio de Santarm (2 24" 52" S e 54 42" 36" W) dista cerca de 800 km das
metrpoles da Amaznia (Manaus e Belm), possui oito distritos com 474 comunidades rurais
das quais 267 localizam-se nas regies dos rios e vrzeas, e 207 esto na zona do planalto. A
rea urbana possui 48 bairros. No ano de 2012, a estimativa populacional do IBGE foi de
284.401 habitantes, na extenso de 22.887,080 Km. Santarm o terceiro municpio mais
populoso e o mais importante centro econmico do Estado. Atualmente a economia de
Santarm est assentada nos setores de comrcio e servios, no ecoturismo, nas indstrias de
beneficiamento (madeira, movelarias, agroindstrias, beneficiamento de peixe etc.) e no setor
agropecurio.
Figura 14 Municpio de Santarm, Par. A: Limites geogrficos de Santarm (Fonte:
Laboratrio de Geoprocessamento do Instituto Evandro Chagas). B: Imagem panormica do
municpio de Santarm, Estado do Par, Brasil (Fonte: Google imagens).
O municpio de Juruti, situado a 200 Km de Santarm na margem direita do rio
Amazonas pertence a Microrregio de bidos e tem como limites: ao norte Oriximin e bidos, a
http://pt.wikipedia.org/wiki/Invernohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ver%C3%A3ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Amaz%C3%B4niahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Manaushttp://pt.wikipedia.org/wiki/Bel%C3%A9mhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Economiahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Com%C3%A9rciohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Servi%C3%A7ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ecoturismohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ind%C3%BAstriahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Madeirahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agroind%C3%BAstriahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Peixehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agropecu%C3%A1ria
42
leste bidos e Santarm, ao sul Aveiro, a oeste o Estado do Amazonas e Faro. A sede municipal
tem as seguintes coordenadas geogrficas: 020909S e 56 0542W Gr. A populao, no ano de
2012, era de 47.123 habitantes em uma rea de 8.303, 966 Km2. Possui 178 comunidades rurais
registradas. At o ano de 2005 a economia era baseada na agricultura e pesca, mas com a
instalao da mineradora Alcoa/Omnia Minrios Ltda no municpio no ano de 2005 a economia
passou a girar em torno da explorao da reserva de bauxita. Em decorrncia da explorao de
bauxita foram construdos uma ferrovia e um porto na cidade.
Figura 15 Municpio de Juruti, Par. A: Limites geogrficos de Juruti (Fonte: Laboratrio de
Geoprocessamento do Instituto Evandro Chagas). B: Imagem panormica do municpio de
Juruti, Estado do Par, Brasil (Fonte: Google imagens).
2.5 SUJEITOS DA PESQUISA, LOCAL DE ATENDIMENTO E CRITRIOS DE INCLUSO
Foram convidados a participar da pesquisa os pacientes que buscaram
espontaneamente ou foram referenciados ao Servio de Dermatologia do Centro de Controle
Zoonoses do municpio de Santarm no perodo de janeiro de 2010 a dezembro de 2011.
No municpio de Juruti o atendimento de LT foi realizado apenas no ano de 2010
quando duas expedies cientficas do IEC, com durao de quinze dias cada, ocorreram no
Hospital Municipal Francisco Barros.
Foram includos adultos e crianas ( 6 anos) com suspeita clnica-epidemiolgica
e/ou confirmao clnica-laboratorial de LT, portadores de uma ou mais leses primrias de
pelo menos duas semanas de existncia e aqueles sem tratamento prvio para LT. Foram
excludos indivduos menores de seis anos, os portadores de leses mucosas, mulheres
grvidas, contraindicao de tratamento ao antimonial pentavalente e os que no quiserem
participar da pesquisa.
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2.6 REALIZAO DE EXAMES
Exames de rotina para o diagnstico da LT (ver item 2.7) e coleta de amostras de
fragmento de pele foram realizados pela equipe mdica e tcnica das unidades de sade dos
municpios de Juruti e Santarm. Os exames de rotina subsidiaram o tratamento dos doentes.
Em Santarm, o fragmento de pele era encaminhado ao Laboratrio de
Microbiologia do campus da UEPA Santarm para a tentativa de obteno de isolado de
Leishmania. L uma biomdica foi treinada pela doutoranda sobre os procedimentos de
inoculao em meio de cultura NNN e envio de amostra ao Laboratrio de Epidemiologia e
Imunologia Aplicada as Leishmanioses da Seo de Parasitologia do Instituto Evandro
Chagas.
Em Juruti, a doutoranda participou das duas expedies cientficas e realizou os
procedimentos de tentativa de isolamento no Laboratrio da Secretaria Municipal de Sade.
No Laboratrio de Epidemiologia e Imunologia Aplicada as Leishmanioses foram
realizadas pela doutorana a criogenia dos isolados de Leishmania, as extraes de DNA de
fragmento de leso e os ensaios moleculares de PCR e PCR-RFLP.
A identificao por eletroforese de isoenzimas dos isolados de Leishmania de
pacientes foi obtida durante treinamento proporcionado doutoranda no Laboratrio de
Pesquisas em Leishmanioses da Fundao Oswaldo Cruz/Rio de Janeiro.
2.7 PROCEDIMENTOS NA ROTINA DO SUS
Todos os sujeitos da pesquisa foram atendidos conforme o protocolo do SUS que
inclui a realizao do exame parasitolgico direto e teste de Montenegro como mtodos de
diagnstico laboratorial. Os casos confirmados de LT por critrio clnico-epidemiolgico ou
clnico-laboratorial receberam tratamento e foram registrados na base de dados do SINAN
utilizando formulrio padro do Ministrio da Sade para subsidiar imediatamente as aes de
vigilncia e controle da doena (Brasil, 2010).
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Unidade Bsica de Sade
Confirmao de LT
Investigao de caso suspeito de LT
Laboratorial Clnico-epidemiolgico
Lmina IDRM
Notificao no SINAN
Tratamento
Acompanhamento
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