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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
DOUTORADO EM BIOQUÍMICA
Gabriela Salvador Ourique
Estudo in silico da interação da protease NS3-NS2B de diferentes flavivirus
com um inibidor peptídico
Natal 2018
Gabriela Salvador Ourique
Estudo in silico da interação da protease NS3-NS2B de diferentes flavivirus
com um inibidor peptídico
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Bioquímica da da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como exigência parcial para obtenção do título em Doutora em Bioquímica
com área de concentração: Biologia Funcional e Estrutural: Linha de pesquisa: Biofísica
Orientador: Prof. Dr. Eudenilson Lins de Albuquerque Co-Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fuco
NATAL-RN
2018
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Ourique, Gabriela Salvador. Estudo in silico da interação da protease NS3-NS2B dediferentes Flavivirus com um inibidor peptídico / GabrielaSalvador Ourique. - Natal, 2018. 129 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande doNorte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação emBioquímica. Orientador: Prof. Dr. Eudenilson Lins de Albuquerque. Coorientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fuco.
1. Flavivirus - Tese. 2. Protease - Tese. 3. NS3-NS2B - Tese.4. Dengue - Tese. 5. Febre do Nilo Ocidental - Tese. 6. MecânicaQuântica - Tese. I. Albuquerque, Eudenilson Lins de. II. Fuco,Umberto Laino. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 578.833.2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
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Agradecimentos
"Um artista é um consolador e um criador que sabe que durante o ato da criação,
há colaboração. Nós não criamos sozinhos."- Madeleine L'Engle Comigo não poderia
ser diferente. Sem vocês eu não teria conseguido.
Quero agradecer primeiramente a Deus, por tudo que conquistei, por tudo que
suportei e por tudo que eu sou. Quero agradecer a Deus por todas as pessoas que foram
colocadas em meu caminho e que me ajudaram a ir muito mais além;
A minha família
Aos meus pais, que sempre lutaram por mim, que lutaram pra me dar condições
de estudar e chegar onde eu cheguei. Que me deram amor e carinho incondicional. Amo
vocês!
A minha irmã e Cunhado que sempre acreditaram em mim, ficaram do meu
lado, me ajudaram e me deram os melhores conselhos. Vocês me deram o melhor
presente minha sobrinha linda Dani que só precisava de um sorriso para deixar meu dia
muito mais feliz. Amo vocês!
Ao meu incrível marido, amor da minha vida que acredita em mim mais do que
eu, que apoia todos os meus sonhos, me ajudou e me confortou sempre que algo não
deu certo. Amo você!
Tia Geny, Dna Celia, Rafaela, Danilo e Alice, minha nova família que me
acolheram e sempre me deram força e apoio. Muito obrigada
Aos meus orientadores
Eudenilson Lins de Albuquerque, o Sr não é apenas uma das pessoas mais
brilhantes e geniais que eu conheço. Além de ser um modelo de profissional e professor,
o Sr é o melhor Orientador que eu poderia ter. Sou eternamente grata por toda sua
orientação, por toda sua paciência e por todos os ensinamentos que o Sr me passou.
Muito obrigada, sinto muito orgulho do Sr e foi uma verdadeira honra ser sua
orientanda.
Umberto Laino Fuco além de ser uma pessoa de extrema inteligência, é uma
pessoa muito boa. Tenho certeza de que aprendi muito com o sr. E de coração, levarei
esses ensinamentos para a vida. Só não estou levando a receita do Fricassê que até hoje
o sr não passou. Obriga professor, por tudo.
Aos meus colegas de Laboratório
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Jonas que agora é professor Jonas, eu nunca duvidei que você chegasse tão
longe e tem muito mais coisa boa para você conquistar. Você é muito dedicado e
inteligente e está sempre disposto a ajudar as pessoas. Obrigada
Katy, você é a aluna mais brilhante desse laboratório, você é incrivelmente
inteligente e competente. Mas sempre me lembrarei de você pelo seu grande coração de
ouro. Você me ajudou, me aconselhou me ouviu, me acalmou e me ajudou novamente.
Sentirei falta de nossas conversas. E sempre serei grata a você. Você ainda vai muito
longe e eu já sinto muito orgulho de você.
Jessica Vianna, você sempre me ajudou e dividiu os perrengues comigo.
Deixava meus dias tão mais divertidos.
Jaerdyson dividimos muitas risadas nesse laboratório e também dividimos
muitas preocupações. Foi uma jornada para nós dois e garanto que sairemos muito mais
fortes.
Erika Geicianny obrigada pelas melhores conversas, pelas melhores risadas,
pela companhia e pelo apoio.
Stephany Campanelli obrigada por ser sempre tão gentil e simpática comigo, e
por estar sempre disposta a ajudar.
Emmanuel você além de ser muito inteligente é uma pessoa maravilhosa com
um coração lindo. Obrigada por ajudar a tornar o peso do trabalho muito mais fácil.
Aranthya você e uma pessoa incrível e quero que você se lembre sempre
sempre disso. Além de linda por dentro e por fora você é muito divertida e foi ótimo
trabalhar com você.
Washington obrigada por ser tão maravilhoso e tão legal.
Aos professores maravilhosos que eu tive o prazer de conhecer por este
caminho
Adriana Ushoa, Hugo Fernandes, Katya, Kyvia, Juliana Spada e Jacira
vocês são professores incríveis e me ensinaram bem mais do que os assuntos
acadêmicos.
Aos meus amigos
Italo Monteiro, Camila Oliveira, Pedro Gil, Julio Cesar, Gileno e Marta
Cesar, Dom Phelipe e Jean, meu Padrinho Paulo Saldanha pessoas que ficaram
sempre do meu lado, me deram apoio não me deixaram desanimar obrigado meus
amigos, tiveram paciência com minhas ausências. Vocês são os melhores amigos que
alguém poderia desejar e tenho sorte de ter vocês na minha vida.
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A Larry Page e Sergey Brin, os inventores do Google. Nossa como posso
agradecer vocês que tanto me ajudaram durante toda a minha vida acadêmica. De todos
os estudantes do mundo um sincero e fervoroso: Obrigado
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Resumo
Flaviviridae é uma grande família de patógenos virais responsáveis por diversas doenças e elevada taxa de mortalidade em todo mundo. Em destaque, a Dengue (DV), a Zika (ZV), a Febre do Nilo Ocidental (WNV), a Febre Amarela (FA), a Hepatite C (HC) e a Encefalite Japonesa (EJ), são as principais doenças infecciosas provocadas por membros dessa família. A maioria dessas infecções não possui vacinas comercializadas e nem drogas antivirais, sendo o tratamento apenas sintomático e de combate ao inseto vetor. Tais patógenos apresentam um genoma muito semelhante (INFORMAÇÃO SOLTA). Por esse motivo, muitos grupos de pesquisa se dedicam ao estudo de moléculas inibidoras específica da replicação viral. Considerando o avanço das atuais sofisticadas técnicas de modelagem molecular, aliadas aos crescentes trabalhos in vivo e in vitro, pretendemos nesta tese de doutorado estudar a inibição da protease NS3-NS2B de Flavivirus do tipo Dengue e Febre do Nilo Ocidental, destacando as semelhanças e diferenças entre os mecanismos de inibição das proteínas NS3 para cada vírus a partir da ligação de um inibidor eficaz. Especificamente, o inibidor tetrapeptídico Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-H tem sido apresentado na literatura como um potente inibidor da protease NS3 de diversos Flavivirus sendo, pois, uma estratégia inteligente para o tratamento de infeções causadas por esta família viral. Assim sendo, o presente trabalho objetivou estudar as interações do desse ligante junto ao sítio ativo para fornecer uma visão mais clara e aprofundada dessas interações. Para tal desenvolveu-se um estudo in silico, com utilização de cálculos de química quântica, baseada na Teoria do Funcional da Densidade (Density Functional Theory - DFT). A energia de interação de cada aminoácido do sítio de ligação, com o ligante foi calculada com base no método de fragmentação molecular com capas conjugadas (Molecular Fragmentation Method with Conjugated Caps - MFCC). Além da energia, foram determinadas as distâncias, tipos de interações moleculares e grupos atômicos envolvidos. Os resultados parciais para estes Flavivirus demonstraram que o inibidor possui uma boa afinidade com o sítio ativo da protease NS3-NS2B de ambos; sendo, portanto, um bom candidato a tratamento antiviral específico aos Flavivirus. O trabalho também apresentou a lista dos resíduos mais importantes para a ligação inibidor-receptor, i.e., os resíduos de aminoácidos que mais contribuem e os que menos favorecem a esta interação.
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Abstract
Flaviviridae is a large family of viral pathogens responsible for various diseases
and high mortalities worldwide. Dengue (DV), Zika (ZV), West Nile Virus (WNV),
Yellow Fever (YF), Hepatitis C (HC) and Japanese Encephalitis (JEV) cause important
infectious diseases and are members of this family. Most of these infections does not
have neither commercialized vaccines nor antiviral drugs, and their treatment are still
only symptomatic. Such infections have a very similar genome. Many research groups
are nowadays concentrating their efforts to find a specific inhibitory molecule for some
viral proteins essential for replication. With the advancement of sophisticated molecular
modeling techniques, in conjunction with growing investigations in vivo and in vitro,
we intend in this thesis to study separately the inhibition of the NS3-NS2B protease of
the West Nile Virus as well as the Dengue Virus. The tetrapeptide inhibitor Bz-Nle-
Lys-Arg-Arg-H, with a high inhibition constant, has been presented in the literature as a
potent blockade of the NS3 protease for several Flaviviruses, besides being a smart
strategy for the treatment of infections caused by this viral family. We intend to
investigate the interactions of the ligand with the active site, providing a clearer and
deeper insight of them. For that purpose, an in silico study was developed using
quantum chemistry calculations, based on the Density Functional Theory (DFT). The
interaction energy of each amino acid of the binding site with the linker was
theoretically calculated by means of the Molecular Fragmentation Method with
Conjugated Caps (MFCC) approach. In addition to energy, the distances, types of
molecular interactions and atomic groups involved were also determined. Partial results
for these Flaviviruses fever demonstrated that the inhibitor has a good affinity for the
active site of the NS3-NS2B protease for both viruses, being therefore, a good candidate
for an antiviral treatment specific to Flaviviruses. The work also presented the list of the
most important residues for the inhibitor-receptor binding, i.e., the amino acid residues
that contribute the most and least favoring this interaction.
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
WNV: West Nile Virus – Febre do Nilo Ocidental
DV: Vírus da Dengue
ZV: Vírus da Zika
OMS: Organização Mundial da Saúde
CDC: Center for Disease Control and Prevention - Centro para controle e prevenção de doenças)
DE: Densidade eletrônica
DFT: Density Functional Theory - Teoria do Funcional da Densidade
DNP: Double Numerical Plus Polarization
DTN: Doenças Tropicais Negligenciadas
FHD: Dengue hemorrágica
GGA: Generalized Gradient Approximation - Aproximação do gradiente generalizado
HCV: vírus da hepatite
KI: Constante de inibição
LDA: Local Density Approximation - Aproximação de densidade local
MFCC: Molecular Fractionation with Conjugated Caps - Fracionamento Molecular com Caps conjugados
NO: óxido nítrico
NS3pro: proteína NS3
PDB: Protein Data Bank - Banco de dados de proteínas
RCSB: Research Collaboratory for Structural Bioinformatics - Colaboração de pesquisas para Bioinformática estrutural
RdRp: RNA polimerase RNA dependente
RE: Retículo endoplasmático
RER: Retículo endoplasmático rugoso
TNFs-α: Fatores de necrose tumoral-α WNV:
9
Lista de Imagens
Figura 1: Distribuição mundial dos casos de dengue (DV) no ano de 2012. ................ 18
Figura 2: Distribuição regional do risco de infecção de Dengue (DV) no Brasil em
2011. ............................................................................................................................... 20
Figura 3: Principal agente etiológico da Dengue no mundo, o mosquito Aedes aegypti.
........................................................................................................................................ 21
Figura 4: Exemplar de mosquito do gênero Culex. ....................................................... 22
Figura 5: Distribuição do Febre do Nilo Ocidental (WNV) em uma escala global. Em
amarelo, estão representadas as regiões onde o vírus é endêmico. ................................ 24
Figura 6: Representação do ciclo de vida do vírus da Febre do Nilo Ocidental, com
seus hospedeiros primários e secundários. ..................................................................... 25
Figura 7: Vírus da Febre do Nilo Ocidental. ................................................................. 26
Figura 8: (A) Representação do vírus do WNV com destaque para a bicamada lipídica.
(B) Poli proteína precursora: proteínas estruturais (terracota) e proteínas não-estruturais
(verde acinzentado), UTR: região não traduzida. ........................................................... 27
Figura 9: Processo passo a passo de entrada do vírus na célula hospedeira em 5 etapas.
........................................................................................................................................ 29
Figura 10: Esquema com o ciclo de replicação dos flavivírus. ..................................... 32
Figura 11: Representação planar do Bz-nKRR-H, com destaque para as suas regiões de
atuação. ........................................................................................................................... 36
Figura 12: Integração da biotecnologia no processo de planejamento de fármacos. .... 42
Figura 13: Formaldeído otimizado por técnicas de mecânica molecular (esquerda), e
sua superfície de potencial eletrostático (direita). .......................................................... 45
Figura 14: Representação gráfica para as equações envolvidas no cálculo da energia de
interação entre o resíduo, e o fármaco ou ligante, e através da utilização dos Caps.
sequência e CRFC (sistema completo); CRC (sem a presença do ligante); CFC (com o
ligante, porém sem o resíduo) e CC (apenas os Caps). .................................................. 50
Figura 15: Representação estrutural da serina protease do vírus da dengue NS3-NS2B /
inibidor Bz-nKRR-Hcomplexa (PDBID: 3U1I). A Protease NS3 é destacada em verde,
enquanto o co-fator NS2B em amarelo. A esfera da cavidade de ligação com raio (r)
também é mostrada nesta figura como um círculo azul de linhas pontilhadas em torno
do ligando Bz-nKRR-H. ................................................................................................. 55
10
Figura 16: Energia total de interação em função do raio de bolso de ligação calculado
durante o estudo de convergência considerando diferentes valores de constante
dielétrica: ε = 1 (preto), ε = 2 (vermelho), ε = 10 (azul) e ε = 40. .................................. 56
Figura 17: BIRD mostrando os resíduos mais relevantes que contribuem para a ligação
do ligante. As distâncias mínimas entre cada resíduo e o ligante, bem como as
moléculas de água utilizadas nos cálculos de energia também são mostradas. .............. 58
Figura 18: Imagem detalhada dos resíduos de aminoácidos mais relevantes envolvidos
na ligação do complexo NS2B-NS3pro da serina-protease com o inibidor Bz-nKRR-H
nas regiões (a) i, ii, iii; (b) região iv; (c) região v. As ligações de hidrogênio potenciais
são indicadas por linhas tracejadas. ................................................................................ 61
Figura 19: Visão do sítio da NS3-NS2B em complexo com o inibidor Bz-nKRR-H
(representado na cor magenta). ....................................................................................... 64
Figura 20: Energia de interação total em função do raio da cavidade de ligação
calculado durante o estudo de convergência considerando diferentes valores da
constante dieletrica: ε = 1 (preto), ε = 10 (vermelho), ε = 40 (azul). ............................. 66
Figura 21: As energias de interação e os contatos intermoleculares entre o inibidor Bz-
nKRR-H e aqueles nucleotídeos da protease NS3-NS2B que mais contribuem para
estabilidade da droga em um sítio de ligação com raio de 15Å. O raio onde se localiza
cada resíduo está à direita das barras laterais, as quais descrevem as energias de
interação. Já a região e o átomo da droga mais próximo de cada resíduo identificados à
esquerda das mesmas. ε = 1 (barra listrada), ε = 10 (barra de coloração cinza) e ε = 40
(barra de coloração negra). ............................................................................................. 74
Figura 22: (A) Estrutura química mostrando as principai regiões de interação; (B) mapa
de potencial eletrostático do Bz-nKRR-H em pH fisiológico (variando de 7.2 a 7.4). .. 76
Figura 23: Distância em angstrom (Å) das principais interações intermoleculares –
pontes de hidrogênio– entre o Bz-nKRR-H e os resíduos do NS3-NS2B localizados no
sítio da protease. ............................................................................................................. 79
Figura 24: Interação dos membros da Tríade Catalítica com o ligante. ........................ 81
11
Lista de Tabelas
Tabela 1: Estruturas de raio-X de NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 1. ....................... 68
Tabela 2: Estruturas de raios-X da protease NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 2 ........ 69
Tabela 3: Estruturas de raios-X da protease NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 3 ........ 70
12
Sumário
Resumo ............................................................................................................................. 5
Abstract ............................................................................................................................. 6
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................................... 7
Lista de Imagens ............................................................................................................... 9
Lista de Tabelas .............................................................................................................. 11
Sumário ........................................................................................................................... 12
Capítulo 1: Introdução .................................................................................................... 15
1.1 A Família Flaviviridae .......................................................................................... 15
1.2 O Flavivirus ...................................................................................................... 15
1.3 A Dengue .............................................................................................................. 16
1.4 A Febre do Nilo Ocidental.................................................................................... 22
1.5 Genoma dos Flavivirus ..................................................................................... 25
1.6 Infecção Viral pelos Flavivirus......................................................................... 28
1.7 O Inibidor Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-H .................................................................. 32
Capítulo 2: Objetivos ...................................................................................................... 38
Capítulo 3: Materiais e Métodos .................................................................................... 40
3.1 A Modelagem Molecular ...................................................................................... 40
3.2 A Teoria DFT ................................................................................................... 43
3.3 Obtenções das Estruturas Cristalográficas ........................................................... 46
3.4 Estado de Protonação e Otimização ..................................................................... 47
3.5 Estabelecimento dos limites do Sítio de Ligação ................................................. 48
3.6 Determinação e Cálculo das Energias de Interação.............................................. 48
3.7 Simulação Computacional .................................................................................... 50
Capítulo 4: Resultados e Discussões: O Caso do Vírus da Dengue ............................... 54
4.1 Sítios ativo: a estrutura Fármaco-Receptor .......................................................... 54
4.2 As Energias de Interação ...................................................................................... 55
Capítulo 5: Resultados e Discussões: O Caso do Virus da Febre do Nilo Ocidental ..... 64
5.1 Sítios ativo: estrutura Fármaco-Receptor ............................................................. 64
13
5.2 Gráfico da Convergência e determinação do raio ................................................ 65
5.3 Resíduos energeticamente relevantes: Tabelas e BIRD ....................................... 67
5.4 Mapa de densidade eletrostática ........................................................................... 75
5.5 Estudo dos resíduos receptor-ligante .................................................................... 77
Capítulo 6: Conclusões e Perspectivas ........................................................................... 83
6.1 Conclusão ............................................................................................................. 83
6.2 Perspectivas .......................................................................................................... 85
Referências ..................................................................................................................... 88
Apêndice I..................................................................................................................... 101
Apêndice II ................................................................................................................... 118
14
Capítulo I. Introdução
15
Capítulo 1: Introdução
1.1 A Família Flaviviridae
A família Flaviviridae é uma grande família de patógenos virais responsáveis
por diversas doenças perigosas ao ser humano e por grande mortalidade de animais
selvagens e domésticos (COSTA, 2009; IEMPRIDEE, et al, 2008). A família
Flaviviridae, deriva seu nome da palavra em latim flavis (amarelo), devido ao seu
membro proeminente ser o vírus da febre amarela (BOLLATI, et al, 2009). Acredita-se
ter sido introduzido nas Américas no século 16 através do tráfico de escravos vindos da
África (BOLLATI, et al, 2009; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Essa família de
vírus tem sido um problema global e dinâmico da saúde pública, devido a quantidade de
membros que provocam doenças infecciosas graves. A maioria dos vírus contidos nessa
família podem causar febres hemorrágicas ou doenças neuro-invasivas graves levando a
febres agudas e encefalites fatais (BAHARUDDIN, et al, 2013).
A família Flaviviridae é composta por 3 gêneros: Flavivírus, Hepacivirus e
Pestvirus (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010). Dengue (DV), Febre do Nilo
Ocidental (WNV), Zika (ZV), Febre Amarela (FA), Hepatite C (HC) e Encefalite
Japonesa (EJ) dentre outras, são doenças infecciosas causadas por vírus da família
Flaviviridae. Tais doenças tem uma taxa de mortalidade superior a 30% e, portanto,
estão crescendo cada vez mais no interesse dos grupos de pesquisa em todo mundo
(BAHARUDDIN, et al, 2013; BRECHER et al, 2013).
1.2 O Flavivirus
O gênero Flavivirus é um dos gêneros mais proeminentes dentro da família
Flaviviridae, com mais de 70 vírus classificados nesse gênero (KAUFMANN &
ROSSMANN, 2010). Muitos membros gênero Flavivirus são importantes vetores de
doenças para a humanidade incluindo a Febre Amarela, a Encefalite Japonesa, a Febre
do Nilo Ocidental (WNV), Dengue (DV) e Zika (ZK) vírus (LESCAR, et al, 2008;
YANG, et al, 2011). Tais vírus são responsáveis por epidemias e surtos epidêmicos que
podem levar a morte de milhares de pessoas em todo mundo.
O número de infecções por Flavivirus, especialmente no hemisfério Norte, tem
aumentado muito nesta última década (ROBIN, et al, 2009). A crescente globalização e
16
alterações climáticas são razões pelas quais a distribuição das doenças pode se
modificar de forma drástica e rápida ao redor do mundo. Alterações no patógeno, no
ambiente ou na população de hospedeiros contribuem para a disseminação de novas
doenças, potencialmente àquelas de elevada mortalidade. Há ainda uma série de razões
ambientais, demográficas e ecológicas (como a globalização e a urbanização) para se
acreditar que novos Flavivirus continuarão a surgir nos próximos anos
(BAHARUDDIN et al, 2013; BRECHER et al, 2013).
Muitos membros deste gênero, tais como Dengue, Febre Amarela e Zika (ZK)
dentre outras, são consideradas Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) (NITSCHE
et al, 2011). As doenças tropicais negligenciadas DTNs, são consequências marcantes
do subdesenvolvimento social, resultando da situação das regiões mais pobres e
desfavorecidas do planeta (GUIDO et al, 2010). As DTNs são endêmicas em várias
regiões geográficas importantes, afetando milhões de pessoas e determinando altos
índices de mortalidade em todo mundo, acometendo principalmente idosos e crianças
(GUIDO et al, 2010). Elas estão fortemente presentes no Brasil, causando uma enorme
taxa de infecção e mortes todos os anos. Segundo a Organização Mundial da Saúde
(OMS), por possuírem uma ampla distribuição global estando presentes em
praticamente todos os continentes, as doenças causadas por Flavivírus tornaram-se uma
grave ameaça à saúde pública.
1.3 A Dengue
A Dengue é um importante vírus patógeno pertencente ao gênero Flavivirus
(ARAVAPALLI, et al, 2011; YANG, et al, 2010). O vírus da dengue tem sido
observado a circular na natureza a mais de 200 anos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004;
National Center for Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention
(CDC), 1995).
Evidências mostram que a Dengue foi inicialmente relatada entre crianças do
Sudeste Asiático na década de 1950 e, desde então, se transformou em um grave
problema de saúde pública mundial, sendo uma importante causa de mortalidade entre
adultos e crianças (SINGHI et al, 2007). As epidemias foram primeiramente notificadas
em 1779-1780, na Ásia, África e América do Norte (CDC, 1995). Uma pandemia global
de dengue começou no sudeste asiático após a Segunda Guerra Mundial (TAUIL, 2001
e CDC, 1995) e se intensificou durante os últimos 15 anos (CDC, 1995).
17
Existem 5 sorotipos circulando na natureza, sorotipo I ao V. O vírus da dengue é
endêmico em cerca de 112 países (SINGHI, et al, 2007; TAMBUNAN & PARIKESIT,
2011), sendo a maioria regiões tropicais e subtropicais da Ásia, Oceania, África,
América, a região leste do Mediterrâneo, do sudeste Asiático e do Pacífico ocidental
(LESCAR, et al, 2008; NITSCHE, et al, 2012) como podemos observar na Figura 1.
Grande parte destes países sofreram as primeiras epidemias de dengue em 1779 e 1780
(GEISS, et al, 2009). Na década de 50, a febre hemorrágica da dengue (FHD) foi
descrita, pela primeira vez, nas Filipinas e Tailândia (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2004). No Sudeste Asiático, a epidemia de dengue hemorrágica apareceu pela primeira
vez em 1975 e tornou-se rapidamente uma das principais causas de hospitalização e
morte entre crianças em muitos outros países (CDC, 1995). Após a década de 60, a
circulação do vírus da dengue intensificou-se nas Américas (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2004). A partir de 1963, houve circulação comprovada dos sorotipos 2 e 3 em
vários países. De 1980 em diante, foram notificadas epidemias em várias regiões do
mundo, aumentando consideravelmente a magnitude do problema (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2004).
A prevalência mundial da dengue, cresceu dramaticamente nas últimas décadas.
Mais de 160.000 casos de DV e FHD foram descritos na região do Pacífico Ocidental
(SINGHI et al, 2007). As mudanças demográficas ocorridas nos países
subdesenvolvidos, a partir da década de 60, consistiram em intensos fluxos migratórios
rurais-urbanos, resultando em um aumento descontrolado das cidades (TAUIL, 2001).
Estas, por sua vez, não conseguiram acompanhar o fluxo de migração, e necessidades
básicas como habitação e saneamento básico foram negligenciados, trazendo como
consequência, o fato de que boa parte desta população passou a viver em favelas e
cortiços (TAUIL, 2001). Estima-se que 20 a 25% da população das grandes cidades da
América Latina estejam atualmente nestas condições (TAUIL, 2001).
Tais fatores, ocasionados pela urbanização e crescente deterioração da saúde
pública, aliados ao aumento das viagens internacionais, vieram a acarretar um aumento
dos casos de transmissão e surtos de Dengue ao redor do mundo (GEISS, et al, 2009;
TAUIL, 2001; PODVINEC, et al, 2010 e TAMBUNAN & PARIKESIT, 2011). A
Figura 1 apresenta a distribuição da dengue no mundo no ano de 2012. Este dado
mostra que quase todos os países do hemisfério sul possuem uma grande quantidade de
áreas que não estão apenas em risco, mas possuem uma enorme quantidade de casos
clínicos comprovados. Já existem relatos do vírus ter atingido continentes que antes não
18
eram afetados. Há transmissões relatadas inclusive no Texas, Flórida e Havaí nos
Estados Unidos da América (NITSCHE, et al, 2012). Em setembro de 2010, foram
relatados dois casos de dengue na França (NITSCHE, et al, 2012), mostrando o quão
alarmante e urgente a situação se encontra.
Figura 1: Distribuição mundial dos casos de dengue (DV) no ano de 2012.
Fonte: http://www.healthmap.org/dengue/pt/ .
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que anualmente
ocorram entre 50 a 100 milhões de novos casos de dengue no mundo (ARAVAPALLI,
et al, 2011; YANG, et al, 2010; LESCAR, et al, 2008), dos quais, cerca de 50.000
evoluem para a dengue hemorrágica (COSTA, 2009; ARAVAPALLI, et al, 2011;
YANG, et al, 2010), provocando mais de 25.000 mortes por ano (ARAVAPALLI, et al,
2011; YANG, et al, 2010 e TOMLINSON & WATOWICH, 2010). Acredita-se que
cerca de 40% da população mundial encontra-se em risco (YAUCH & SHRESTA,
2008; SINGHI et al, 2007), principalmente nas áreas tropicais e subtropicais do globo
(YANG, et al, 2010; LESCAR, et al, 2008), como pode ser observado na Figura 1. A
implementação de sistemas eficazes de vigilância e o desenvolvimento de uma vacina
efetiva são consideradas ações prioritárias pela Organização Mundial da Saúde (SILVA,
2008; TAMBUNAN & PARIKESIT, 2011).
No Brasil, há relatos não comprovados de epidemias em 1916, em São Paulo, e
no ano de 1923, em Niterói (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). A primeira epidemia
clínica documentada laboratorialmente ocorreu no ano de 1981/1982, em Boa Vista
19
(Roraima), causada pelos sorotipos 1 e 4 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). A partir
de 1986, foram registradas epidemias em diversos estados com a introdução do sorotipo
1 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Desde então, as epidemias de dengue vêm
ocorrendo anualmente, tornando-se um problema nacional de saúde pública
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Um total de 1.832.371 casos foram registrados,
resultantes de epidemias de DV-1 e/ou DV-2, que ocorreram em 24 dos 26 estados
brasileiros e no Distrito Federal / Brasília (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). A
introdução dos sorotipos 2 e 3 foi detectada no estado do Rio de Janeiro em 1990 e em
dezembro de 2000 respectivamente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004 e NOGUEIRA,
et al, 2001). Os primeiros casos de FHD foram registrados em 1990 no estado do Rio de
Janeiro, após a introdução do sorotipo 2 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004 e
NOGUEIRA, et al, 2001). Nesse mesmo ano ainda, foram confirmados 274 casos que,
de uma forma geral, não apresentaram manifestações hemorrágicas graves
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
A Figura 2 mostra o grau da intensidade do risco de infecção de dengue em
cada região do Brasil. Pode-se observar que existe risco de infecção em praticamente
todos os estados brasileiros, com exceção dos estados da região Sul do país, cujo risco
não é muito elevado. Também pode-se inferir que o Brasil ainda apresenta risco de
infecções bastante elevado, analisando-se o mapa de maneira geral, principalmente na
região Norte e Nordeste do país. A análise da Figura 2 mostra não só o quanto o Brasil
ainda é um país muito afetado pela doença, como também nos traz a perspectiva do
nosso estado (RN), situado nas áreas de maior risco. A partir destes dados, podemos ter
a real magnitude desta doença em nossa região, indicando que esforços crescentes,
deverão ser feitos para a erradicação da dengue.
20
Figura 2: Distribuição regional do risco de infecção de Dengue (DV) no Brasil em 2011.
Fonte: http://www.dengue.org.br/dengue_mapas.html.
O agente etiológico da dengue é um atrópoda do gênero anófeles
(ARAVAPALLI, et al, 2011, YANG, et al, 2010). Este gênero pertence à família
Culicidae (do latim culex = mosquitos) a qual é responsável por apresentar o maior
número e os mais importantes insetos hematófagos entre todos os Arthropoda (SINGHI,
et al, 2007). O mosquito Aedes aegypti (Figura 3) é o principal transmissor da febre
amarela urbana e da dengue em todo o mundo (SINGHI, et al, 2007). Foi importado da
África para a América durante a colonização e a escravidão, disseminando-se por todo o
mundo, havendo relatos, inclusive, de sua presença nos Estados Unidos (GEISS, et al,
2009). A fêmea do mosquito Aedes aegypti adquire o vírus da dengue após ingerir o
sangue de um indivíduo contaminado durante uma doença febril aguda (fase virêmica)
(SINGHI, et al, 2007). Depois de um período de 8 a 10 dias de incubação extrínseca, o
mosquito contaminado transmite a infecção através da picada injetando os vírus
contidos na saliva (SINGHI, et al, 2007; TAUIL, 2001 e TAMBUNAN & PARIKESIT,
2011). A transmissão ocorre em áreas geograficamente distintas, e em diferentes
altitudes (SINGHI, et al, 2007).
21
Figura 3: Principal agente etiológico da Dengue no mundo, o mosquito Aedes aegypti.
Fonte: http://www.fiocruz.br/ccs/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=1282&sid=9&tpl=printerview.
Os casos de infecção de dengue apresentam um amplo aspecto de sintomas
clínicos (LESCAR, et al, 2008). Após um período de incubação intrínseca, que pode
variar em média de 4 a 7 dias (SINGHI, et al, 2007), uma pessoa picada por um
mosquito infectante, pode ou não apresentar os sintomas, dependendo da cepa do vírus,
idade, estado imunológico e outros fatores (SINGHI, et al, 2007). As crianças
acometidas pela doença precisam necessariamente de um acompanhamento cuidadoso
(SINGHI, et al, 2007). O quadro da dengue clássico (DV) pode ser confundido com
uma gripe forte, sendo caracterizado por febre abrupta e intermitente, cefaleia, dor retro
orbital, dores musculares e articulares, náuseas e vômitos, podendo aparecer exantema
maculopapilar (manchas avermelhadas na pele típicas da dengue) nas extremidades e no
tronco, bem como erupções cutâneas (YAUCH & SHRESTA, 2008; PODVINEC, et al,
2010; GEISS, et al, 2009). De quatro a sete dias após os primeiros sintomas, ocorre um
aumento da permeabilidade vascular (SINGHI, et al, 2007; SILVA, 2008).
Formas severas incluem quadros febris agudos e evoluem com uma queda no
estado geral do indivíduo, seguido de taquicardia, hipotensão, diminuição da perfusão
dos tecidos periféricos e manifestações hemorrágicas com elevada taxa de mortalidade
(COSTA, 2009; LESCAR, et al, 2008). Nesses casos de febre hemorrágica, o maior
número de casos de choque ocorre entre o terceiro e o sétimo dia de doença, geralmente
precedido por dores abdominais (SILVA, 2008). O choque é de curta duração e pode
levar ao óbito em 12 a 24 horas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Três importantes
sistemas do organismo (hematológico, vascular e hepático) estão envolvidos nas
22
alterações patológicas da FHD (febre hemorrágica da dengue) e SCD (síndrome do
choque da dengue) (SILVA, 2008). A disfunção desses sistemas induzida pela infecção
pelo vírus da dengue, tanto direta como indiretamente, causa as manifestações da
FHD/SCD (SILVA, 2008).
1.4 A Febre do Nilo Ocidental
O vírus da Febre do Nilo Ocidental (WNV), em sua forma mais comum de
transmissão, se dá pela picada de mosquitos do gênero Cúlex representado pela Figura
4 (PLETNEV, et al, 2002, PESKO & EBEL 2012), além do risco de contágio por
transfusão sanguínea e de órgãos (CHANCEY, et al, 2015, BLUT &
KRANKHEITSERREGER, 2013). Tal vírus foi primeiramente isolado em 1937 em
Uganda, sendo endêmico da África do Sul (BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013).
O primeiro caso de infecção nos EUA é datado de 1999 (PLETNEV, et al, 2002, BLUT
& KRANKHEITSERREGER, 2013, GAYEN, et al, 2012).
Figura 4: Exemplar de mosquito do gênero Culex.
Fonte: GATHANY (2003)
Desde então há relatos de infecções no México, Caribe, América Central e
Canadá, causando mais de mil mortes anuais (BLUT & KRANKHEITSERREGER,
2013, TOMLINSON & WATOWICH 2008). O WNV foi primeiramente isolado na
América Latina em cavalos na Argentina em 2006 e posteriormente Colômbia.
23
Acredita-se ter vindo da América do Norte através de aves migratórias, uma vez que
aves são hospedeiros naturais do vírus (DIAZ et al, 2008). Desde então, foi constatado a
circular nas Ilhas Cayman (2001); El Salvador, Guatemala e Belize (2003); Colômbia e
Venezuela (2004); Argentina (2005); e Brasil (2002–2013) (VIEIRA et al, 2015).
No Brasil, o primeiro caso reconhecido e documentado de Febre do Nilo
Ocidental foi em agosto de 2014, no município de Aroeiras do Itaim, Piauí (VIEIRA et
al, 2015). O paciente, um trabalhador de 52 anos, foi internado com encefalite aguda e
paralisia facial bilateral, além dos demais sintomas comuns a essa enfermidade tais
como: febre com calafrios, dor de cabeça, dor no pescoço, vômitos, diarréia, dor
abdominal, convulsão seguida de estado sonolento (VIEIRA et al, 2015). Há dados na
literatura que mostram evidências sorológicas que o vírus da Febre do Nilo Ocidental
circula no Brasil desde 2009, em equinos e aves na região do Pantanal, Mato Grosso do
Sul, confirmado em 2014 no trabalho de Corrêa e colaboradores (VIEIRA et al, 2015).
Até o momento, não existem vacinas aprovadas e comercializadas para febre do
Nilo Ocidental, sendo a forma de prevenção restrita ao combate do inseto vetor
(PLETNEV, et al, 2002, CHANCEY, et al, 2015, BLUT & KRANKHEITSERREGER,
2013, GAYEN., et al, 2012). Existem dois sorotipos conhecidos: o sorotipo 1 é
endêmico da América do Norte, Europa, África, Ásia e Austrália; e o sorotipo 2
endêmico da África e Madagascar (CHANCEY, et al, 2015, DONADIEU et al,2013).
Nos Estados Unidos entre 1999 e 2008, foram relatados 28.961 casos de infecção, com
1.131 mortes (PESKO & EBEL, 2012), número esse que subiu para 37.088 casos no
período de 1999 a 2012, sendo 16.196 classificados como doença neuro-invasiva com
1.549 mortes (AMANNA & SLIFKA, 2014). O caráter urgente em se encontrar uma
forma de combate eficiente, tem deixado a pesquisa de drogas terapêuticas antivirais no
cerne das atenções mundial (GAYEN., et al, 2012). A Figura 5 abaixo mostra as
regiões do mundo afetadas por infecções do vírus Febre do Nilo Ocidental (REISEN,
2013).
24
Figura 5: Distribuição do Febre do Nilo Ocidental (WNV) em uma escala global. Em amarelo, estão representadas as regiões onde o vírus é endêmico.
FONTE: REISEN, 2007
A maioria dos casos de infecção (cerca de 80%) é assintomática (CHANCEY, et
al, 2015, BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013, AMANNA & SLIFKA, 2014). A
sintomatologia começa após um período de incubação de 2 a 14 dias e é caracterizada
por febre, mialgias acompanhadas com artralgias, dor de cabeça, fadiga, problemas
gastrointestinais, erupção maculopapular ou linfadenopatia e inflamação nos linfonodos
(CHANCEY, et al, 2015, BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013, AMANNA &
SLIFKA, 2014). Cerca de 20% dos casos sintomáticos dessa doença progridem para as
versões mais severas que inclui: meningite, encefalite, manifestações oculares,
inflamação do sistema nervoso e degeneração neuronal, podendo ser seguido de estado
de coma e morte (BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013, BLUT &
KRANKHEITSERREGER, 2013, AMANNA & SLIFKA, 2014). Em alguns casos mais
severos, podem ocorrer graves danos neurológicos acompanhados de desordem
cognitiva (PLETNEV, et al, 2002, BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013,
DONADIEU et al, 2013). O ciclo do WNV não se restringe ao homem: existem relatos
da infecção por WNV causar a morte de muitas aves, cavalos e outros animais
domésticos (ver Figura 6) (BLUT & KRANKHEITSERREGER, 2013, BLUT &
KRANKHEITSERREGER, 2013, EKONOMIUK et al, 2009).
25
Figura 6: Representação do ciclo de vida do vírus da Febre do Nilo Ocidental, com seus hospedeiros primários e secundários.
Fonte: https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions
1.5 Genoma dos Flavivirus
A Figura 7 abaixo traz o vírus da Febre do Nilo Ocidental (WNV). Com
diâmetro de aproximadamente 50 nm, os Flavivirus apresentam um núcleocapsídeo
envolto por uma bicamada lipídica (derivada do hospedeiro) que circunda o RNA viral,
como destacado na Figura 8 (A) (CHOI, et al 2015, HEINZ & STIASNY 2012). Esta
família possui um genoma de RNA simples e polaridade positiva (+SSRNA) de cerca
de 11Kb (AUBRY NOUGAIREDE & LAMBALLERIE 2015; CHOI et al 2015). A
estrutura cap presente no RNA genômico do vírus desempenha um papel fundamental,
atuando como um RNAm eucariótico, não só para iniciar o processo de tradução, como
também para proteger o RNA viral da degradação por exonucleases celulares (CHOI,
et al 2015, BRECHER, et al, 2013). O RNA viral é composto de regiões -5' e -3' (UTR),
não traduzidas abrigando várias estruturas terciárias evolutivas conservadas do RNA,
que desempenham papéis importantes na replicação do RNA viral (CHOI, et al 2015,
BRECHER, et al, 2013; LUO VASUDEVAN & LESCAR 2015).
26
Figura 7: Vírus da Febre do Nilo Ocidental.
Fonte: KAUFMANN,. et al. (2006).
O RNA forma uma única sequência que é traduzida em uma única poliproteína
(BAHARUDDIN, et al, 2013, BRECHER, et al, 2013). Por ser um vírus pequeno e
simples, é de se esperar que a maioria de suas proteínas não estruturais sejam
multifuncionais. A replicação do genoma ocorre nas membranas intracelulares
(BAHARUDDIN, et al, 2013; CHOI, et al 2015). O RNA mensageiro genômico do
vírus, codifica 3 proteínas estruturais encontradas no vírion maduro (C, proteína do
capsídeo PrM; proteína de maturação da membrana; E, envelope) e 7 não estruturais,
isto é, que não fazem parte da arquitetura do vírus (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,
NS4B e NS5) (AUBRY NOUGAIREDE & LAMBALLERIE 2015; CHOI, et al 2015).
A Figura 8 (B) abaixo mostra a poli proteína viral com suas proteínas estruturais e não
estruturais.
27
Figura 8: (A) Representação do vírus do WNV com destaque para a bicamada lipídica. (B) Poli proteína precursora: proteínas estruturais (terracota) e proteínas não-estruturais (verde acinzentado), UTR: região não traduzida.
B
Fonte: KAUFMANN & ROSSMANN, 2010; GEISS, et al, 2009.
As proteínas não estruturais participam da replicação do RNA, da montagem
viral e modulação da resposta imune inata do hospedeiro, como NS2A, NS4A e NS5
BRECHER, et al, 2013). NS1 é uma glicoproteína grande que atua na síntese negativa
da fita de RNA (BRECHER, et al, 2013). A proteína não estrutural NS2A, está
envolvida com a produção de membranas durante a montagem e/ou liberação da
partícula viral infecciosa dos flavivirus (BRECHER, et al, 2013).
28
A proteína NS2B atua como um co-fator necessário à atividade da protease NS3.
A protease NS3, é uma grande proteína multifuncional da família das serino proteases
com atividade de RTPase (5’-RNA trifosfatase), NTPase (nucleosídeo trifosfatase) e
helicase (BRECHER, et al, 2013; BAHARUDDIN, et al.,2013). A proteína NS4, é uma
proteína integral de membrana que participa de rearranjos membranais necessários para
o complexo de replicação viral, bem como atua na própria síntese de RNA (BRECHER,
et al, 2013). Esta proteína também está envolvida na modulação da resposta imune do
hospedeiro, inibindo o iterferon tipo I (BRECHER, et al, 2013). A proteína não
estrutural NS5 é considerada a maior proteína do gênero Flavivirus e possui várias
atividades enzimáticas importantes, sendo classificada como uma RNA polimerase
RNA dependente (RdRp), N-7 guanina e 2’-O ribose metiltransferase e RNA
guaniltransferase (GTase) (BRECHER, et al, 2013, BAHARUDDIN, et al, ;2013).
1.6 Infecção Viral pelos Flavivirus
A maioria dos flavivírus é transmitido pela picada do inseto vetor contaminado
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004; TAMBUNAN & PARIKESIT, 2011). O mosquito
se infecta ao ingerir sangue de um indivíduo durante o período de viremia (cerca de 5
dias) e pode transmitir a doença para um hospedeiro susceptível depois de um período
de incubação de 8 a 12 dias (SILVA, 2008). Pode-se destacar que, uma vez infectado, o
mosquito transmite o vírus pelo resto de sua vida (SILVA, 2008). A quantidade de vírus
no sangue é crucial para o sucesso da infecção (SILVA, 2008). Humanos são infectados
quando mosquitos fêmeas que possuem o vírus e, durante o hematofagismo, depositam
os vírus na derme ou inoculam com a saliva as partículas virais durante a espolia do
sangue do indivíduo (YAUCH & SHRESTA, 2008; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
O primeiro passo para o processo da infecção viral a nível celular, é o
reconhecimento e a ligação do vírus ao receptor específico de superfície da célula
hospedeira (PERERA, et al, 2008; KAUFMANN & ROSSMANN, 2010)
esquematizados na Figura 9 (A). As proteínas estruturais além de formarem a partícula
viral, também participam da fusão do vírus com as células hospedeiras (BRECHER,
ZHANG & LI, 2013). As primeiras células infectadas incluem monócitos, macrófagos e
células dendríticas da pele (BRECHER, et al, 2013).
Após a ligação do vírus ao receptor específico, as proteínas do envelope
glicoproteico (proteína E) que formam a cápsula, se ligam a receptores de superfície
29
celular (Figura 9 B) promovendo a internalização do vírus (Figura 9 C) através do
processo de endocitose (PERERA, KHALIQ, KUHN, 2008; YAUCH & SHRESTA,
2008; LESCAR, et al, 2008) dependente de clatrina (KAUFMANN & ROSSMANN,
2010 e GEISS, et al, 2009, BRECHER, et al, 2013). A internalização se dá devido a
acidificação (Ph baixo) do compartimento endossomal que desencadeia rearranjos
estruturais nas glicoproteínas virais (COSTA, 2009; LESCAR, et al, 2008, BRECHER,
ZHANG & LI, 2013), representado esquematicamente pela Figura 9 D. Tais rearranjos,
acabam por ocasionar a fusão do envelope viral com a membrana endossomal liberando
o nucpleocapsídeo e RNA genômico para o citoplasma (COSTA, 2009; PERERA, et al,
2008; KAUFMANN & ROSSMANN, 2010, BRECHER, et al, 2013) (Figura 9 E). A
Figura 9 abaixo nos dá uma visão do processo de ligação do vírus aos receptores
específicos da célula, bem como a internalização do genoma na célula hospedeira.
Figura 9: Processo passo a passo de entrada do vírus na célula hospedeira em 5 etapas.
Fonte: KAUFMANN & ROSSMANN, 2010.
30
Dentro da célula infectada, o RNA viral genômico serve como RNAmensageiro
(RNAm) e assim pode ser diretamente traduzido como uma única estrutura de leitura
aberta pela maquinaria de tradução da célula hospedeira, uma poliproteína precursora de
cerca de 370 kDa (BAHARUDDIN, et al, 2013; BRECHER, et al, 2013). Esta
poliproteína, é glicosilada por glicosiltransferases recrutadas da célula hospedeira
(KAUFMANN & ROSSMANN, 2010, BRECHER, et al, 2013, BAHARUDDIN, et al,
2013), sendo clivada por uma ação conjunta de proteínas celulares e de proteases virais
(KAUFMANN & ROSSMANN 2010, ASSENBERG, et al, 2009). A poliproteína é
então, traduzida em 3 proteínas estruturais (C, prM e E) e 7 não estruturais (NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010,
BAHARUDDIN, et al.,2013, BRECHER, et al, 2013). As proteínas não estruturais
estão envolvidas em diferentes funções do ciclo de replicação viral (síntese e replicação
do RNA e morfogênese) (BAHARUDDIN, et al, 2013, BRECHER, et al, 2013). Já as
proteínas estruturais tornam-se parte do vírus maduro infeccioso (BAHARUDDIN, et
al,2013, BRECHER, et al, 2013).
As proteínas não estruturais virais NS3 e NS5, possuem como função principal
reunir proteínas virais em conjunto com proteínas da célula hospedeira para formar o
complexo de replicação (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010). A replicação realiza-se
em estruturas da membrana modificada dos derivados do Retículo endoplasmático (RE)
(GEISS, et al, 2009). Uma cópia negativa sem cap, que atua como molde para a síntese
dos RNAs progênitos do genoma viral é inicialmente gerada pela proteína NS5 (a partir
da terminação 3') (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010; GEISS, et al, 2009).
Posteriormente, um grande número de RNAs genômicos com caps são sintetizados para
fornecer um modelo para a tradução e a produção de polipeptídeos, bem como para o
acondicionamento dos virions (GEISS, et al, 2009, BAHARUDDIN, et al, 2013,
BRECHER, et al, 2013).
Os RNAs recém-sintetizados do capsídeo são envolvidos pelas glicoproteínas
prM e E para montar partículas virais imaturas que irão brotar do retículo
endoplasmático (RE) (PERERA, et al, 2008; KAUFMANN & ROSSMANN, 2010). As
proteínas estruturais C, prM e E, juntamente com uma cópia única do RNA genômico
compõe o virion imaturo do flavivirus (GEISS, et al, 2009). A montagem do vírus no
RE segue etapas bem definidas. Na primeira etapa ocorre a síntese da proteína C
(SAMPATH & PADMANABHAN, 2009). Posteriormente, ocorre a heterodimerização
das proteínas E e prM, seguido do envelopamento do nucleocapsídeo que ocorre no
31
lúmen do RE, gerando a partícula viral imatura (SAMPATH & PADMANABHAN,
2009). O brotar do retículo endoplasmático, é também responsável pelo ganho do
envelope lipídico que é derivado do hospedeiro (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010 e
SILVA, 2008). Estas partículas virais imaturas são transportadas através da via de
secreção para o aparelho do Complexo de Golgi (PERERA, et al, 2008; KAUFMANN
& ROSSMANN, 2010; GEISS, et al, 2009).
No ambiente de baixo pH do complexo trans-golgi, uma furina medeia a
clivagem de prM para unidades M de maturação (PERERA, et al, 2008; KAUFMANN
& ROSSMANN, 2010, SAMPATH & PADMANABHAN, 2009 BRECHER, et al,
2013). A clivagem proteolítica, libera o fragmento pr com o N-terminal glicosilado que
é ancorado à membrana M e permanece associado ao vírus (KAUFMANN &
ROSSMANN, 2010, BRECHER, et al, 2013). A maturação também é acompanhada por
rearranjos estruturais significativos na cápsula glicoproteica (PERERA, et al, 2008;
SAMPATH & PADMANABHAN, 2009, BRECHER, et al, 2013).
Durante a maturação, a proteína E passa por uma reorganização posicional
(KAUFMANN & ROSSMANN, 2010). O peptídeo pr é lançado do vírion durante a
exocitose da progênie (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010). A remoção de pr (ligada
de forma covalente), prepara as partículas virais para o estado estrutural maduro, onde a
partícula viral madura encontra-se pronta para os baixos pHs desencadeados por eventos
futuros de fusão (entrada na próxima célula) (KAUFMANN & ROSSMANN, 2010,
BRECHER, et al, 2013). Após a maturação, as partículas do vírus migram ao longo da
superfície das células nativas até acharem poços revestidos por clatrina que auxiliam na
entrada dos vírus (PERERA, et al, 2008). No esquema apresentado pela Figura 10
abaixo, pode-se observar de forma resumida, todo o processo de infecção celular.
32
Figura 10: Esquema com o ciclo de replicação dos flavivírus.
Fonte: SAMPATH & PADMANABHAN, 2009.
1.7 O Inibidor Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-H
Os vírus são conhecidos por se beneficiarem de curtos tempos de geração e as
altas taxas de evolução com finalidade de escapar das reações de defesa do hospedeiro,
bem como desenvolver resistência contra moléculas terapêuticas (PODVINEC, et al,
2010). Ou seja, fármacos eficientes devem permanecerem eficazes contra os diferentes
sorotipos e mutações comuns aos vírus (PODVINEC, et al, 2010). A ativação ou
inibição de um receptor induzido por fármacos frequentemente tem impacto duradouro
sobre a responsividade subsequente do receptor da ligação do fármaco (GUIDO,
ANDRICOPULO, OLIVA, 2010). Drogas que visam à inibição poderiam agir de 3
maneiras (SAMPATH & PADMANABHAN, 2009):
33
1. inibindo a atividade ATPase, interferindo com a ligação de ATP ou mesmo a
hidrólise,
2. impedindo a ligação de ácidos nucleicos;
3. impedindo a translocação da helicase.
Devido a essa propriedade, muitos inibidores peptídicos têm sido sugeridos com
finalidade de inibir proteases virais importantes (EKONOMIUK et al, 2009, LIM &
SHI, 2013).
As proteínas virais, estruturais e não estruturais têm sido investigadas cada vez
mais como alvos terapêuticos (BAHARUDDIN, et al, 2013, BRECHER, et al, 2013).
Atualmente tem se investigado a participação das proteínas não estruturais na replicação
e montagem viral. Pesquisadores estão visando proteínas não estruturais, (BRECHER,
et al, 2013, BAHARUDDIN, et al, 2013) chaves para a replicação viral, como alvos
para o desenvolvimento de drogas terapêuticas (BAHARUDDIN, et al, 2013). Além de
possuírem uma grande importância no processo de reprodução viral, essas proteínas são
únicas aos Flavivirus fazendo com que a molécula utilizada como fármaco seja
altamente específica e reduzindo, assim o risco de toxicidade e efeitos colaterais
(BRECHER, et al, 2013, BAHARUDDIN, et al, 2013).
Vários trabalhos têm sido realizados, nos quais, há uma preferência por
proteases RdRp como alvos ao desenvolvimento de drogas farmacêuticas, cuja
abordagem se concentra em inibir o mecanismo de replicação viral (BAHARUDDIN, et
al, 2013; LUO VASUDEVAN LESCAR 2015). O fato destas enzimas desempenharem
um papel crítico na replicação viral torna a inibição delas uma estratégia bastante eficaz
para diminuir e enfraquecer o quadro patológico da infecção (BAHARUDDIN, et
al.,2013; BARRIL & LUQUE 2012). Ainda há muito a ser investigado no caráter da
eficácia e toxicidade desses inibidores, contudo, o conhecimento prévio e aprofundado
estrutural do sítio ativo é fundamental para o desenvolvimento de um fármaco
específico para flavivírus (BAHARUDDIN, et al, 2013, BYRD, et al. 2013).
Antivirais previamente desenhados contra flavivírus, tem primariamente focado
na inibição da replicação viral (PERERA, et al, 2008 e BOLLATI, et al, 2009). As
proteases representam uma classe de enzimas com importantes papéis em processos
fisiológicos. Elas constituem um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento
de novos compostos farmacêuticos (BAHARUDDIN, et al, 2013, BRECHER, et al,
2013). Como foi visto nos tópicos anteriores, a atividade da protease NS3 é essencial
34
para a replicação viral e a sua inibição deve ser considerada como uma estratégia de
intervenção para o tratamento de infecções causadas por flavivírus (YANG, et al, 2010;
GAULTON, et al, 2011 e BOLLATI, et al, 2009).
A protease NS3 em complexo com seu co-fator NS2B, é uma das proteases mais
estudadas no desenvolvimento de uma molécula inibidora (EKONOMIUK et al, 2009).
Esta protease é altamente conservada entre os Flavivirus, possui uma tríade catalítica
clássica composta de His-Asp-Ser (Histidina-Ácido aspártico-Serina) que está
localizada numa fenda entre duas estruturas β-barris (BAHARUDDIN, et al, 2013,
DIAMOND, 2009). Estudos estruturais revelaram uma preferência por resíduos de
arginina ou lisina nas interações eletrostática (EKONOMIUK et al, 2009, LIM & SHI,
2013), seguidos por uma pequena cadeia de aminoácidos laterais com uma Gly, Ala ou
Ser do sítio de clivagem (COSTA, 2009; IEMPRIDEE, et al, 2008). Inibidores de NS3-
NS2B visam conter um elemento de reconhecimento peptil altamente carregado de
caráter dibásico nas posições que favoreçam tais interações eletrostáticas
(ARAVAPALLI, et al, 2012). Os aminoácidos preferidos nessas posições são a arginina
e a lisina, indicando o papel eletrostático na interação com inibidor da protease
(KNEHANS, et al, 2011). A preferência da protease por ligações peptídicas,
envolvendo resíduos básicos pode ser a base do desenvolvimento de inibidores seletivos
para esta enzima (KNEHANS, et al, 2011; GAULTON, et al, 2011; NITSCHE, et al,
2012). Uma estratégia usada comumente por inibidores de NS3-NS2B, envolve
moléculas covalentes que competem com o substrato pelo sítio catalítico. Estes
fármacos são chamados de fármacos inibidores por competição.
É conhecido que após a adição de um substrato, a parte C-terminal de NS2B
sofre uma dramática mudança conformacional causada pela estabilização do β-grampo
que é inserido no sítio ativo (ASSENBERG, et al, 2009). É possível que a conformação
não produtiva do buraco oxi-anion seja energeticamente favorecida na ausência do
substrato, apenas adquirindo a conformação ativa na presença do substrato (ALESHIN,
et al, 2007), sendo o domínio C-terminal, desordenado na ausência do inibidor (simula
o substrato), tornando-se este, ordenado através da ligação com o fármaco (SILVA,
2008). Estudos da estrutura tridimensional de NS3-NS2B, sugerem que com a ligação
de um inibidor ao centro ativo, NS3-NS2B adotam uma conformação “aberta” ou
“fechada” dependendo da presença do substrato (KOKPOL, et al, 2009; KNEHANS, et
al, 2011). Na conformação “fechada”, os envoltórios em torno dos peptídeos NS3-
NS2B agem como um cinto, e o C-terminal da fita de NS2B está associado com a
35
estrutura β-barril da porção C-terminal de NS3pro ajudando a compor o local de ligação
do substrato (BOLLATI, et al, 2009 e KNEHANS, et al, 2011). Nessa conformação, a
região hidrofílica interage fortemente com NS3pro, com as porções N e C terminais de
NS2B formando duas hélices hidrofóbicas que atuam como âncoras na membrana
(BOLLATI, et al, 2009). Na conformação “aberta”, em contraste, a cadeia C terminal β-
fita de NS2B está dissociada de NS3pro (BOLLATI, et al, 2009 e KNEHANS, et al,
2011). Estudos anteriores mostraram que a região da protease NS2B de Febre do Nilo
Ocidental (WNV), adota uma conformação muito semelhante a mesma protease do
dengue (DV), sendo muitas das interações da proteína-ligante são conservadas,
demonstrando uma alta similaridade do sítio ativo da protease de WNV e DV (NOBLE,
et al, 2012).
Esforços na descoberta de drogas até agora renderam vários inibidores peptídeos
e pequenas moléculas com atividades inibitórias (KNEHANS, et al, 2011). Inibidores
de aldeído tri e tetra-peptídicos têm sido relatados a inibir proteases de WNV e DV
(KNEHANS, et al, 2011). Inibidores de aldeído tripeptídeo apresentam uma alta
afinidade com a protease NS3 (SCHÜLLER, et al, 2011). Um forte candidato com
atividade inibitória comprovada, e que apresenta estrutura tridimensional cristalizada
disponível é o composto tetrapéptido benzoil-norleucina-lisina-arginina-arginina-
aldeído (Bz-Nle-Arg-Arg-Lys-H) (EKONOMIUK et al, 2009). O mesmo composto,
também foi apresentado a inibir a protease NS3 de DV no trabalho de Noble e
colaboradores (2012) e por Erbel et al, (2006). O inibidor Bz-NLe-Lys-Arg-Arg-H foi
relatado na literatura por possuir uma alta seletividade dentre os inibidores estudados
para a protease de WNV e DV, sabe-se que as proteases destes vírus possuem uma alta
similaridade (50%) (KOKPOL, et al, 2009; KNEHANS, et al, 2011 e ERBEL, et al,
2006). A Figura 11 abaixo, mostra o inibidor peptídico escolhido para este estudo
dividido por regiões para melhor entendimento da estrutura.
36
Figura 11: Representação planar do Bz-nKRR-H, com destaque para as suas regiões de atuação.
Fonte: OURIQUE, et al, 2017
A escolha do inibidor BZ-nKRR-H, deve-se ao fato do mesmo apresentar um
comportamento inibidor satisfatório (Ki de 5,8 μM) para NS3-NS2B de Dengue tipo II,
comprovado por vários dados presentes na literatura. Estudos realizados anteriormente
com a molécula inibidora Bz-nKRR-H, demonstraram que o resíduo da junção de
clivagem é separado por uma distância maior que 20 Å do sítio ativo, impedindo, assim,
a possibilidade do mecanismo de autoclivagem mais comum a NS3-NS2B
(CHOKSUPMANEE, et al, 2012). Trabalhos da literatura já demonstraram a presença
de uma ligação covalente estabelecida entre o inibidor aldeído Bz-nKRR-H e a Serina,
membro da tríade catalítica (Ser135), acarretando uma elevação na afinidade entre o
fármaco e o receptor (NITSCHE, et al, 2012 e NOBLE, et al, 2011). O caráter inibitório
comprovado experimentalmente foi somado ao fato da molécula inibidora possuir PDB
(Protein Data Bank) do complexo fármaco-receptor (NS3-NS2B + ligante) apresentada
no trabalho de Erbel e colaboradores (2006). O PDB da estrutura ativa do complexo
NS3-NS2B ligado ao peptídeo substrato Bz-nKRR-H, utilizado neste trabalho, possui a
entrada Protein Data Bank 2FP7 e resolução de 1.68 Å para WNV (ERBEL et al, 2006).
37
Capítulo II. Objetivos
38
Capítulo 2: Objetivos
O presente trabalho focou calculou in silico a energia de interação envolvida na
ligação do complexo ligante-receptor (Flavivirus DV e WNF - inibidor peptídico Bz-
nKRR-H) atraves de cálculos quânticos e da metodologia do MFCC (Molecular
Fractionation with Conjugated Caps - Fracionamento Molecular com Caps Conjugados)
na aproximação GGA (Generalized Gradient Approximation - Aproximação do
Gradiente Generalizado) atraves do modelo DFT (Density Functional Theory - Teoria
do Funcional da Densidade) - ver Capítulo 3 para detalhes da metodologia e metodos
empregados.
O principal objetivo e descrever energeticamente as interações existentes entre
o complexo da protease NS3-NS2B dos Flavivirus Dengue (DV) e Febre do Nilo
Ocidental (WNV) com o inibidor escolhido, o peptídeo benzoyl-norleucine-Lys-Arg-
Arg-aldehyde (Bz-nKRR-H). Posteriormente, são comparados e os seus aspectos
energeticos principais discutidos.
Para atingirmos esta meta, fez-se necessário realizar os seguintes objetivos
específicos:
• Determinar o raio de convergência de estabilização dos sistemas NS3-NS2B com o
inibidor peptídico Bz-nKRR-H;
• Calcular as energias de interação individuais entre os resíduos da protease NS3-
NS2B em conjunto com o inibidor Bz-nKRR-H;
• Identificar os aminoácidos de relevância energética;
• Quantificar a distância de interação entre os aminoácidos e diferentes regiões do
fármaco;
• Identificar as regiões mais relevantes do inibidor em sua ligação com a protease
NS3-NS2B;
• Caracterizar as principais forças intermoleculares presentes na interação da protease
NS3-NS2B com o inibidor peptídico Bz-nKRR-H;
39
Capítulo III. Materiais e
Métodos
40
Capítulo 3: Materiais e Métodos
Neste estudo, utilizou-se cálculos ab initio aplicando o método de
Fracionamento Molecular com Caps Conjugados (MFCC), no âmbito do DFT, para a
avaliação das energias de interação entre o peptídeo BznKRR-H e os resíduos da
protease NS3-NS2B. Os resultados revelaram a força da interação do fármaco com cada
resíduo no sítio de ligação, bem como o comportamento da energia de interação. Vamos
iniciar este capítulo descrevendo sucintamente esses métodos de Química Quântica.
3.1 A Modelagem Molecular
A aplicação de métodos computacionais no estudo e no planejamento de
compostos bioativos tem se tornado uma prática cada vez mais comum aos
pesquisadores envolvidos neste tipo de pesquisa (HADAD, et al, 2011, COSTA, et al,
2012 e FRAZÃO, et al, 2012). De um modo geral, todo o tipo de modelos teóricos
utilizados aos conceitos de átomo e molécula objetivando a descrição da estrutura e
propriedades de interesse em Química, pode ser classificado como Modelagem
Molecular. A ação das moléculas bioativas é um fenômeno bastante complexo, mas um
dos paradigmas da Química Farmacêutica é que essas moléculas têm seus efeitos
associados a interações e a reações químicas com estruturas macromoleculares presentes
nos sistemas vivos, como as proteínas, por exemplo, (SILVA, et al, 2012 e SILVA, et
al, 2013).
O processo de desenvolvimento de moléculas bioativas, devido à sua
complexidade, envolve necessariamente o trabalho de uma equipe multidisciplinar, em
uma constante troca de informações com grupos de síntese química e avaliação da
atividade destes compostos (BARRIL & LUQUE, 2012). A Química Medicinal, devido
a seu caráter multidisciplinar, engloba áreas como a farmacologia, a bioquímica, a
química orgânica e a química computacional, dentre outras, na busca do
desenvolvimento e descoberta de novos fármacos (VERLI & BARREIRO, 2005).
A pesquisa em descoberta e desenvolvimento de fármacos é complexo, longo e
de alto custo, tendo suas raízes profundamente ligadas às inovações científicas e
tecnológicas (GUIDO et al. 2011). Contudo, demonstrações de contribuições práticas
feitas pela modelagem biomolecular têm levado a um grande crescimento dessa área
(ALBUQUERQUE, et al, 2013 e OLIVEIRA, et al, 2014). Concomitantemente, os
41
avanços expressivos da Química e da Biologia, bem como a melhor compreensão de
vias bioquímicas, alvos moleculares e de mecanismos que levam ao aparecimento e
desenvolvimento de doenças, tornaram possível a descoberta crescente de novas
substâncias terapêuticas (GUIDO et al 2011 e VERLI & BARREIRO, 2005).
Diante desse cenário, as ferramentas biotecnológicas associadas aos métodos de
Química Medicinal ganham papel de destaque no desenvolvimento de novas moléculas
com atividade biológica. O design computacional de drogas tornou-se então, uma
ferramenta indispensável na indústria farmacêutica e acadêmica, nas últimas décadas
(LILL & DANIELSON, 2010).
Sabe-se que a complementaridade química entre os grupos funcionais presentes
no ligante e nos resíduos do sítio ativo, modulam a afinidade da ligação através de uma
variedade de interações intermoleculares (BARRIL & LUQUE, 2012). O conhecimento
das estruturas de alvos macromoleculares ou de complexos do tipo ligante-receptor
permite a aplicação de estratégias de planejamento de fármacos baseado na estrutura do
receptor (MOTA, et al, 2016). De fato, Ferramentas assistidas por computador
contribuem para um entendimento mais aprofundado de alvos biomoleculares
adequados para o fim da fase pré-clínica (BARRIL & LUQUE, 2012). A Modelagem e
Simulação de métodos moleculares estão gradativamente fazendo contribuições cada
vez mais importantes e muitas vezes exclusivamente detalhadas para o estudo da
estrutura e função de macromoléculas biológicas. As aplicações incluem:
• estudos de enovelamento de proteínas e mudanças conformacionais,
• associação de proteínas com pequenas moléculas ou outras proteínas,
• desenho de drogas baseado na estrutura do sítio ativo,
• avaliações sobre a eficácia do agente terapêutico no alvo,
• estudos aprofundados das propriedades físico-químicas que garantem uma
biodistribuição adequada,
• cálculos de energias de ligação para ligantes,
• a modelagem da dinâmica de canais iônicos,
• transporte através das membranas e
• modelagem e análise de mecanismos enzimáticos
Um método de modelagem deve ser capaz de fornecer um resultado de confiança
em um tempo razoável (OLIVEIRA, et al, 2017). Grandes quantidades de pesquisas têm
sido desenvolvidas, com atuação principalmente na área da Genômica, Proteômica e da
42
Biologia Estrutural. Tais esforços têm sido desprendidos no âmbito de facilitar o
desenvolvimento de ferramentas computacionais para aumentar a descoberta de novas
drogas, bem como prover a aplicabilidade na área da Nanotecnologia (BARRIL &
LUQUE, 2012). Com o aumento do poder dos hardwares dos computadores, que vem
ocorrendo nas últimas décadas, e a elaboração de algoritmos sofisticados desenvolvidos
para captar a complexidade dos princípios físico-químicos que estão envolvido nas
atividades de drogas de finalidade terapêutica, tem se obtido uma implementação sólida
e eficaz das ferramentas computacionais (SILVA, et al, 2017).
Figura 12: Integração da biotecnologia no processo de planejamento de fármacos.
Fonte: GUIDO, ANDRICOPULO, OLIVA, 2010.
Este desenvolvimento nas técnicas computacionais, aliados a evolução das
técnicas de Cristalografia de Raios-X e Ressonância Magnética Nuclear,
proporcionaram um aumento significativo no número de alvos moleculares com
estruturas 3D (tridimensionais) disponíveis no Banco de Dados de Proteínas (Protein
Data Bank - PDB) (GUIDO, et al 2010; BARRIL & LUQUE, 2012 e RUSSO, 2006). A
elucidação das estruturas tridimensionais através de técnicas experimentais possibilitou
a obtenção de parâmetros estruturais, como comprimentos e ângulos de ligação, e
43
também a definição de propriedades atômicas como o raio de van der Waals (BARRIL
& LUQUE, 2012). Métodos de Química Quântica (por exemplo, cálculos ab initio e a
Teoria do Funcional da Densidade Orbitais ou Moleculares), podem ser utilizados para
estudar reações em sistemas não-periódicos e moleculares contendo dezenas de átomos
(NETO, et al, 2017 e TAVARES, et al, 2018).
3.2 A Teoria DFT
A Mecânica Quântica utiliza equações fundamentais para calcular as
propriedades de uma molécula, a partir das interações entre os seus elétrons e núcleos
(DIRAC, 1930). Em 1925, o físico austríaco Erwin Schrödinger, propôs a famosa
equação de Schrödinger que foi um dos grandes marcos da Mecânica Quântica
(SCHRÖDINGER, et al, 1926) Esta equação determina a função de onda quântica de
um sistema, seja ele um átomo, uma molécula ou um sólido, contendo toda a
informação necessária para determinar o estado do sistema (DIRAC, 1925, BORN &
HEISENBERG, 1925 e BORN; HEISENBERG; JORDAN 1926). O estudo da síntese
de compostos orgânicos pela via computacional é baseado em modelos de dinâmica
molecular que fornecem soluções aproximadas para a equação de Schrödinger
independente do tempo (RAPAPORT, 2004). Embora esses modelos forneçam
excelentes aproximações para a função de onda, o tempo de processamento requerido
para a simulação de processos reativos envolvendo sistemas de alto peso molecular, se
torna extremamente elevado sendo em muitos casos, inviável (KOCH &
HOLTHAUSEN, 2001 e SLATER, 1965).
Em 1964, o norte-americano também de origem austríaca Walter Kohn, publicou
juntamente com Pierre Hohenberg, um artigo onde apresentavam uma reformulação da
Mecânica Quântica baseada, não em termos de funções de onda, mas na densidade
eletrônica (ρ) (HOHENBERG & KOHN 1964). Eles propuseram que o conhecimento
da densidade do estado fundamental de um sistema de muitos elétrons permite deduzir o
potencial externo no qual os elétrons residem. Esta densidade, mede a probabilidade de
encontrarmos um elétron em um ponto de uma coordenada.
No ano seguinte, 1965, novamente em um artigo de Kohn, mas agora em
parceria com Lu Sham, foi desenvolvida uma técnica computacional desta equação,
denominada de aproximação de Kohn & Sham (KOHN & SHAM 1965). Estes dois
44
artigos formam a base da denominada Teoria do Funcional da Densidade (DFT -
Density Functional Theory) (KOHN, 1999 e POPLE, 1999).
A equação de Kohn-Sham (1965), foi proposta como uma forma de contornar o
problema de se encontrar o funcional de energia exato. Desde a publicação destes
artigos, há mais de 40 anos, a Teoria do Funcional da Densidade (DFT), tem atraído
cada vez mais a atenção da comunidade científica e, atualmente, ela é largamente
utilizada para se estudar sistemas cada vez mais complexos tornando-se popular nas
áreas de Física, Química e Biologia Estrutural (DREIZLER & GROSS, 1990 e PARR &
YANG, 1989). Pelos serviços prestados a ciência, Walter Kohn foi agraciado com o
prêmio Nobel de Química em 1998.
Utilizando este teorema, e sabendo-se que todos os outros termos do
Hamiltoniano que representa um sistema de muitos elétrons podem ser escritos, em
princípio, como um funcional único da densidade eletrônica (ρ), conclui-se que o
conhecimento de ρ do estado fundamental pode ser a solução do problema de um
sistema de muitos corpos (LAIRD; ROSS & ZIEGLERS 1996). A partir da densidade
de cada átomo da molécula, determina-se o Hamiltoniano do sistema. Por conseguinte,
se a energia do sistema é calculada mediante a resolução da equação de Schrödinger
H ψ(r) = E ψ (r), (1)
a sua energia é determinada pela densidade eletrônica, ρ, ou seja, E = E(ρ) (ESCHRIG
,1996). A energia e expressa como uma função de uma única “variável”. A densidade
eletrônica é função das 3 coordenadas cartesianas (x,y,z), ao passo que a função de onda
ψ(r) necessita de 3N variáveis (função de onda para cada eletron) para a sua descrição
(onde N é o número de eletrons do sistema).
Esta é a característica essencial da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), em
que o total de energia de um sistema multieletrônico é expressa como uma funcional da
densidade de carga de elétrons, que é encontrada após resolução das equações de Kohn-
Sham (GROSS & DREIZLER, 1995). Pode-se concluir que cada variável representa o
conjunto de termos com que um elétron contribui para o Hamiltoniano eletrônico do
sistema, na equação de Schrödinger.
Sabe-se que cada elétron contribui para a função de onda ψ(r) com um termo de
energia cinética, K; um termo de interação elétron-elétron (o qual inclui a repulsão
45
Colombiana e termos de troca-correlação), U; e um relacionado com a interação
eletrostática entre elétrons e núcleos, Uen, i.e.
𝑯 = 𝑲 + 𝑼 + 𝑼𝒆𝒏 (2)
Com esta teoria, as propriedades de um sistema de muitos elétrons podem ser
determinadas valendo-se de funcionais, isto é, funções de outra função, a qual neste
caso é a densidade eletrônica. A densidade eletrônica (ρ) define qual a fração dos
elétrons que permanecem nos átomos após o estabelecimento das ligações químicas da
estrutura molecular. Logo, a diferença entre a densidade eletrônica ρ do átomo na
molécula e o número de elétrons do átomo isolado define o que se considera a carga
deste átomo na molécula. O potencial elétrostático (U) consiste na capacidade de um
sistema orgânico ou inorgânico de atrair ou repelir outras cargas. Essas capacidades de
repulsão/atração estão intimamente relacionadas com a propriedade de
eletronegatividade e cargas parciais dos átomos que compõem o sistema molecular
(OPHARDT, 2009; NÁRAY & SZABÓ, 1995).
Figura 13: Formaldeído otimizado por técnicas de mecânica molecular (esquerda), e sua superfície de potencial eletrostático (direita).
Fonte: OURIQUE, et al, 2016.
O barateamento no custo da aquisição de computadores, juntamente com o
desenvolvimento de tecnologias de redes de comunicação de alta velocidade e novos
métodos de paralelização de algoritmos, tem fomentado o surgimento de diversos
pacotes computacionais que programam soluções da equação de Kohn-Sham
46
(ACCELRYS: Materials Studio 2016). Uma medida utilizada neste trabalho para
superar as dificuldades de altos custos computacionais foi a escolha de um funcional da
densidade eletrônica adequado. Os funcionais são utilizados para se obter uma solução
aproximada da equação diferencial de Schrödinger, facilitando o cálculo.
Foi sugerido que a DFT é uma linguagem conveniente e universal para a teoria
de estrutura eletrônica, a qual ajuda substancialmente a unificar a química orgânica,
inorgânica, química de superfície e a ciência dos materiais (DOBSON; VIGNALE &
DAS, 1998). Deste modo, o método DFT está tornando-se também uma ferramenta de
grande utilidade no estudo aprofundado de sistemas bioquímicos, interações droga-
receptor e mecanismos de atividade biológica. Mais ainda, o DFT é também uma
ferramenta fundamental em áreas tão diversas como a Nanotecnologia e a
Biotecnologia. Os métodos do DFT contemporâneos são capazes de uma alta precisão
de análises química e de produção de mapas de densidade de elétrons de boa qualidade,
com resultados relativamente rápidos (DOBSON; VIGNALE & DAS, 1998).
Com o desenvolvimento dos computadores, a técnica do DFT poderá ser
aplicada a sistemas cada vez maiores e mais complexos. Melhoria das ferramentas que
temos disponíveis, tanto teóricas como computacionais, nos traz a possibilidade do
aprofundamento em novas propriedades, e a uma maior precisão nos estudos estruturais.
Seria uma saída inteligente para a obtenção e aprimoramento de novos fármacos para
doenças que se tornaram problemas da saúde pública mundial.
3.3 Obtenções das Estruturas Cristalográficas
O primeiro passo é obter a estrutura tridimensional de macromoléculas obtidas
através de técnicas experimentais de Cristalografia. O número de estruturas de
macromoléculas biológicas encontradas por trabalhos experimentais vem aumentando
ao longo do tempo (KAMP, et al., 2008). O site do Research Collaboratory for
Structural Bioinformatics (RCSB), é um reservatório mundial de estruturas
tridimensionais dos complexos biológicos descritos no Protein Data Bank (PDB), sendo
um dos únicos repositórios no mundo para o processamento e distribuição de dados de
estruturas tridimensionais tornando-se, portanto, um recurso fundamental para a
simulação biomolecular (KAMP, et al., 2008).
A técnica experimental responsável pela obtenção das estruturas tridimensionais
é a cristalografia de raios-X (RUSSO, 2006). O estudo da densidade de carga por
47
difração de raio-X, vem se aprimorando ao longo do tempo trazendo a possibilidade de
que informações quantitativas de ligações químicas precisas sejam obtidas (SABINO,
2003). Raios-X são ondas eletromagnéticas de comprimento muito curto
aproximadamente 1Å, que atravessam toda a matéria e são absorvidos e/ou espalhados
pelos átomos que compõe essa matéria (SABINO, 2003). O espalhamento é resultado
da interação com as cargas elétricas da matéria. Para a elaboração da imagem
cristalográfica, um feixe de ondas eletromagnéticas incide no cristal e interage com os
elétrons dos átomos. Estes entram em ressonância com a radiação gerando ondas com a
mesma energia da onda incidente e se espalhando isotropicamente, formando um padrão
de difração. Os elétrons produzem efeito mais pronunciante no padrão de difração
devido à enorme razão entre a massa do próton e do elétron, o que traz a possibilidade
de determinar a densidade eletrônica experimentalmente (SABINO, 2003).
Um indicativo essencial da proteína cristalografada é a sua resolução, sendo a
mesma considerado aceitável em torno de 2.0 Å. Durante um processo de design de
drogas, a seleção dos candidatos moleculares após cada etapa da pesquisa é crucial para
o resultado final do trabalho. Para este estudo foi utilizado a estrutura tridimensional
cuja entrada no PDB é: 2FP7, com resolução de 1.68 Å revelada no trabalho de Erbel
(2006).
3.4 Estado de Protonação e Otimização
O software Marvin Sketch 5.3.2, encontra a conformação correta do estado de
protonação. No nosso caso, utilizamos a protonação sanguínea, cujo pH é em torno de
7.4. Este programa utiliza como parâmetros a temperatura ambiente (27 graus Celsius
ou 300 K), adotando um padrão de duas casas decimais para os valores da fração molar
e o solvente simulado pela constante dielétrica da água. Posteriormente, utiliza-se o
software Materials Studio® com a finalidade de adicionar os átomos de Hidrogênio que
não são identificados durante o processo de difração de raio-X. Em estruturas
cristalográficas com resoluções maiores que 1.2 Å não há presença de átomos de
hidrogênio, uma vez que esses possuem densidade eletrônica mínima e diâmetro inferior
a esse valor.
Os átomos não detectados na difração de raios X (e, portanto, ausentes nos
arquivos cristalográficos) tais como o hidrogênio e algumas cadeias de aminoácidos,
foram adicionadas às estruturas cristalográficas e submetidos a uma otimização
48
geométrica clássica considerando-se os outros átomos fixos. Esta otimização foi
realizada no software Discovery Studio sob os parâmetros de cálculo do campo de força
CHARMM 22 (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics 22), tendo como tolerâncias
de convergência 2.0 x 10-5 Kcal/mol para a variação total da energia, 1.0 x 10-3 Kcal Å-1
mol-1 para a força máxima por átomo e 1.0 x 10-5 Å para o deslocamento atômico
máximo. A otimização de geometria de maneira clássica visa encontrar o estado de
equilíbrio do sistema, utilizando para isso a minimização da energia potencial do
sistema, a partir do ajuste das coordenadas atômicas.
3.5 Estabelecimento dos limites do Sítio de Ligação
O complexo droga-receptor e “separado” em raios subsequentes (0.5 - 0.5Å). O
raio com resíduo presente corresponde a 2.5 Å para o primeiro sítio de ligação. A partir
desses raios, continuou-se avaliando a energia de ligação dos resíduos presentes em
raios crescentes até os 15Å.
3.6 Cálculo das Energias de Interação
Uma abordagem importante para um trabalho desenvolvido através de cálculos
de Mecânica Quântica (MQ) em sistemas macromoleculares, é a utilização de um
métodos de fragmentação capaz de manter a precisão das simulações, apesar de um
menor custo computacional (ZANATTA, et al, 2012). Nesse tipo de método, pode-se
dividir uma espécie de interesse em fragmentos, empregar algum nível de ab initio para
calcular a função de onda, energia, e propriedades de cada fragmento, e depois
combinar os resultados a partir dos cálculos do fragmento para prever as mesmas
propriedades do todo. Vários métodos de fracionamento foram estudados e
desenvolvidos ao longo do tempo.
Neste trabalho, foi utilizado o método de Fracionamento Molecular com Caps
conjugados para o cálculo da energia de interação. Esta estratégia foi feita para
ultrapassar a limitação do número de átomos e para ser capaz de analisar, por meio de
bioquímica quântica, os resíduos que anteriormente eram descritos como importantes
em ambos os dados de cristalografia (resíduos de contato) e as estruturas modeladas do
receptor (BACKE et al., 2007). Este método também traz uma abordagem útil para
calcular as energias de interação para sistemas ligantes de proteína (MARTINS, et al,
2012). O método do MFCC, consiste na decomposição dos aminoácidos em fragmentos,
49
onde a esses são adicionados caps ou capas, para manter a valência do fragmento
estudado (ZHANG, 2003 e MARTINS, et al, 2012). Somando-se as contribuições
individuais dos fragmentos e subtraindo as contribuições dos caps incorporados, a
energia de interação total do sistema proteína-ligante pode ser calculada. Uma diferença
importante entre o método MFCC e outros métodos de fragmentação que empregam
nivelamento das ligações fraccionados é a natureza dos caps utilizados. Em vez de caps
de hidrogênio simples, os caps na abordagem MFCC são formados usando-se porções
das secções vizinhas da molécula (GORDON, et al 2011). Isso proporciona tanto um
método eficiente para a escolha de caps, bem como incluindo uma representação do
ambiente local durante os cálculos de fragmentos individuais (GORDON, et al 2011).
Neste caso, para cada aminoácido analisado, também foi incluído nas simulações os
seus três resíduos vizinhos à direita e os três resíduos vizinhos à esquerda. A energia de
interação E(Li Ri) entre a molecula − do ligante (Li) e o resíduo de aminoácido (Ri), é
dada pela equação:
𝐸(𝐿 − 𝑅𝑖) =
𝐸 (𝐿 − 𝑅𝑖) = [𝐸(𝐿𝑖 − 𝐶𝑖𝑅𝑖𝐶𝑖∗) − 𝐸(𝐶𝑖𝑅𝑖𝐶𝑖∗)] − [𝐸(𝐿𝑖 − 𝐶𝑖𝐶𝑖∗) − 𝐸(𝐶𝑖𝐶𝑖∗)]
(3)
Nesta equação, o termo E (Li − CiRiCi*) corresponde a energia total do sistema
formado pelo ligante e pelo resíduo com as caps do lado carboxil (Ci*) e do lado amino
terminal (Ci) do aminoácido; o termo E(CiRiCi*) refere-se a energia do resíduo com as
caps conjugados; o terceiro termo E(Li − CiCi*) e a energia total do sistema sem a
energia do resíduo por fim, o quarto termo corresponde a energia formada pelo conjunto
de caps. Dessa forma, em um primeiro momento são realizados cálculos levando em
consideração cada aminoácido e em seguida é feito o somatório das energias dos
aminoácidos presentes em um mesmo raio. A Figura 14, apresenta um desenho
esquemático das etapas necessárias para o cálculo da energia.
50
Figura 14: Representação gráfica para as equações envolvidas no cálculo da energia de interação entre o resíduo, e o fármaco ou ligante, e através da utilização dos Caps. sequência e CRFC (sistema completo); CRC (sem a presença do ligante); CFC (com o ligante, porém sem o resíduo) e CC (apenas os Caps).
Fonte: Dados da pesquisa
3.7 Simulação Computacional
Métodos ab initio podem ser aplicados apenas a moléculas pequenas e, apesar de
apresentarem uma maior precisão e não necessitar de dados armazenados, ainda
requerem uma grande capacidade de memória e tempo de cálculo do computador
(MARTINS, et al, 2012). O método semi-empírico é menos exato, porém mais rápido e
pode ser utilizado na minimização de energia e otimização de moléculas que variam de
10 a 120 átomos.
O DFT foi escolhido, tendo em vista seu melhor desempenho para a descrição de
estruturas eletrônicas de sólidos e moléculas, com número de átomos superior a vinte,
com precisão química aceitável e custo computacional, muitas vezes, equivalente a uma
fração do que era obtido com outros métodos tradicionais a exemplo do Hartree-Fock e
pós Hartree-Fock (SLATER, 1965). A técnica do DFT é utilizada com o objetivo de se
obter a densidade eletrônica ρ(r). Basicamente, o metodo consiste em uma dada
51
configuração nuclear encontrar a ρ(r) que minimiza a energia do sistema. A densidade
de carga, é um campo escalar tridimensional que tem um valor definido em cada ponto
do espaço. As propriedades topológicas da densidade de carga são determinadas pelas
características de seus pontos críticos. A partir da densidade de carga ficam
determinados a forma, o tamanho, os momentos da distribuição e propriedades químicas
e físicas do sistema molecular. As forças exercidas sobre um átomo em uma molécula
pelos átomos vizinhos e pela distribuição de elétrons podem ser rigorosamente
calculadas pela teoria eletrostática clássica.
Para realização dos cálculos das energias de interação utilizou-se o módulo
GAUSSIAN aplicado ao formalismo da Teoria Funcional da Densidade (DFT). O
módulo do GAUSSIAN permite a utilização de duas formas de aproximação para esses
cálculos: aproximação do gradiente generalizado (GGA), e a aproximação de densidade
local (LDA). As aproximações geralmente são utilizadas na forma de funcional com a
função de obter uma solução aproximada da equação diferencial de Schrödinger,
facilitando o cálculo. A aproximação mais simples é a LDA, do inglês Local Density
Approximation. A aproximação LDA, leva em consideração a energia de troca-
correlação para um sistema de densidade ρ(r) como sendo a energia de troca-correlação
ρ para um grupo de elétrons uniforme com a mesma densidade. A aproximação LDA
tambem supõe que a densidade ρ(r) varia suavemente nas ρ proximidades de r, ou seja,
a energia de troca- correlação de um elétron em um dado ponto depende da densidade
eletrônica nesse ponto, em vez de depender da densidade eletrônica em todos os pontos
do espaço. A aproximação LDA tem provado ser bastante razoável. Essa aproximação
funciona bem para sistemas cujo densidades eletrônicas não variam rapidamente dentro
de uma região pequena. Propriedades tais como a estrutura, frequências vibratórias,
módulos de elasticidade e estabilidade de fase (de estruturas similares) são descritas de
forma confiável para muitos sistemas. Contudo, no cálculo da diferença de energia entre
diferentes estruturas, a aproximação LDA não oferece a precisão desejada e pode ter
erros significativos. Por exemplo, a energia de ligação de muitos sistemas é
superestimada (normalmente em 20-30%) e barreiras de energia na difusão ou reações
químicas pode ser muito pequeno ou inexistente.
Para os casos onde a densidade eletrônica varia no espaço de forma menos
suave, inclui-se a dependência da primeira derivada espacial da densidade: a
aproximação GGA, do inglês Generalized Gradient Approximation. Nela, a energia de
troca- correlação por elétron é substituída por uma função local da densidade eletrônica
52
e do gradiente da densidade. Com o termo do gradiente da densidade eletrônica presente
no funcional de troca-correlação espera-se que uma melhor descrição dos sistemas não
homogêneos seja obtida. Para maior exatidão na descrição energética do sistema, foi
utilizada a aproximação de gradiente generalizado (GGA), pelo fato de em sistemas
com densidade eletrônica (ρ) heterogênica, a exemplo dos sistemas biológicos, os
cálculos ρ baseados na aproximação LDA não oferecerem precisão, levando a erros de
forma não-sistemática dos comprimentos das energias de ligação. Já a aproximação
GGA, em contrapartida, oferece um avanço nos cálculos por introduzir a dependência
com o gradiente da densidade ρ(r) na expressão do funcional (OLIVEIRA, 2012).
Visando uma melhor precisão quanto à representação energética do sistema,
utilizou-se a aproximação GGA aliado ao funcional M06-2X, de escolha para
combinações energéticas em sistemas não-covalentes. Finalmente utilizamos constantes
dieletricas (ε) para aumentar a similaridade com o ambiente in vivo, no qual se
encontram as proteínas, e estimar efeitos energéticos como a polarização eletrostática
promovida pelo solvente (SCHUTZ & WARSHEL, 2001). Para tal, o trabalho
empregou o vácuo 𝜀 = 1 em comparação com situações definidas por constantes
dielétricas variando de 𝜀 = 10 a 𝜀 = 40. Os resultados encontrados estão descritos no
próximo capítulo.
53
Capítulo IV. Resultados e
Discussões: O Caso do Vírus
da Dengue
54
Capítulo 4: Resultados e Discussões: O Caso do Vírus da
Dengue
Neste capítulo apresentaremos os principais resultados para a protease do vírus
da Dengue, obtidos em artigo publicado em 2016 com o título:
“A quantum chemistry investigation of a potential inhibitory drug against the
dengue virus” na revista RSC Advances (Ver Apêndice II).
4.1 Sítios ativo: a estrutura Fármaco-Receptor
Este trabalho objetivou estudar as interações do ligante junto ao sítio ativo para
fornecer uma visão mais clara e aprofundada dessas interações. Para tal desenvolveu-se
um estudo in silico, com utilização de cálculos de mecânica quântica, baseado na Teoria
do Funcional da Densidade (DFT), com aproximações do Gradiente Generalizado
(GGA) para descrição dos efeitos de correlação e troca. Foi utilizado o complexo
protease NS3-NS2B + molécula inibidora BznKRR-H cristalografada com entrada 3U1I
com resolução 2.30Å disponibilizada por NOBLE, et al, 2012. A energia de interação
de cada aminoácido do sítio de ligação, com o ligante foi calculada com base no método
de fragmentação molecular com caps conjugadas (MFCC). Na Figura 15 abaixo, é
mostrado o complexo NS3-NS2B em ligação com o inibidor peptídeo Bz-nKRR-H
representado na cor azul.
55
Figura 15: Representação estrutural da serina protease do vírus da dengue NS3-NS2B / inibidor Bz-nKRR-Hcomplexa (PDBID: 3U1I). A Protease NS3 é destacada em verde, enquanto o co-fator NS2B em amarelo. A esfera da cavidade de ligação com raio (r) também é mostrada nesta figura como um círculo azul de linhas pontilhadas em torno do ligando Bz-nKRR-H.
Fonte: OURIQUE, et al, 2016
4.2 As Energias de Interação
Para começar a estudar as interações entre os resíduos do receptor com o ligante,
foi feito um gráfico de convergência da energia de interação em Kcal/mol pelo raio em
Angstrons. O gráfico de convergência mostra a extensão da energia de interação no sítio
ativo, indicando até qual raio ela vai variar. A convergência significa a estabilização da
energia de interação (variação inferior a 10% nos raios subsequentes), onde
supostamente a interação não exerce mais influência para a ligação ligante-receptor. No
caso, a Figura 16 mostra a energia de interação total para o BznKRR-H com variação
do raio de 2Å a 15Å. A energia de interação de cada raio é determinada somando-se a
energia de interação resíduo-ligante de cada resíduo presente dentro do raio de ação.
Quanto mais negativa é a energia de interação, maior é a interação entre a proteína e o
ligante.
Sabe-se que a constante dielétrica é uma medida de capacidade do material,
neste caso o solvente, de moderar a força de atração entre a as partículas com cargas
opostas em comparação a um padrão (CAREY, 2006). O valor dielétrico padrão é o
vácuo que recebe o valor de ε = 1. Quanto maior a constante (ε), mais o meio e capaz de
suportar espécies carregadas positivas ou negativas separadas (CAREY, 2006). Pode-se
56
concluir que é uma tendência do meio de proteger uma carga da influência de outra
carga. Solventes com um valor de ε altos tendem a ser mais polares (CAREY, 2006);
por exemplo, a água tem ε = 80, enquanto que no etanol é cerca de 20. Com a finalidade
de se aproximar o resultado aos obtidos no meio natural e tornando-os mais fidedignos,
as constantes dieletricas ε = 1, 2, 10 e 40 foram utilizadas.
Figura 16: Energia total de interação em função do raio de bolso de ligação calculado durante o estudo de convergência considerando diferentes valores de constante dielétrica: ε = 1 (preto), ε = 2 (vermelho), ε = 10 (azul) e ε = 40.
Fonte: Dados da pesquisa
De acordo com a Figura 16, mesmo para um grande raio de 15.0 Å (total de 131
aminoácidos), a energia de interação não atinge uma estabilização quando os cálculos
foram feitos quer no vácuo quer para um pequeno valor da constante dieléctrica (ε = 1
ou 2). A curva variou nos raios (r): 5.5, 6.5, 7.5, 8.0, 9.5 e 11.0 Å respectivamente,
principalmente devido às interações atrativas e repulsivas dos seguintes aminoácidos:
57
• Met49 para r = 5.5 Å,
• Asp79 para r = 6.5 Å,
• Asp80 para r = 7.5 Å,
• Met75 para r = 9.5 Å ,
• Lys87 para r = 8.0 Å,
• Lys26 para r = 11.0 Å
• Lys104 para r = 11.0 Å.
A energia de ligação total considerando a função dielétrica ε = 10 e 40 mostrou
dois raios de desestabilização, nomeadamente a r = 5.5 e 9.,5 Å, que são causados
principalmente pelos dois resíduos de metionina Met49 e Met75.
Uma vez que o esquema MFCC nos fornece a possibilidade de inspecionar a
energia de ligação de cada aminoácido individualmente, podemos usar esses resultados
para descrever os aminoácidos com as interações mais altas e estimar as regiões do
ligante que mais contribuem para sua ancoragem e estabilização. Elas estão resumidas
na Figura 17 que descreve um BIRD (Bind Interactions and Residues Domains) um
acrônimo do local de ligação das palavras-chave energia de interação e domínio de
resíduos, com as energias de ligação mais altas encontradas por nossos cálculos.
58
Figura 17: BIRD mostrando os resíduos mais relevantes que contribuem para a ligação do ligante. As distâncias mínimas entre cada resíduo e o ligante, bem como as moléculas de água utilizadas nos cálculos de energia também são mostradas.
Fonte: OURIQUE, et al, 2016
Considerando a constante dielétrica ε = 1 (cálculos de vácuo), pode-se observar
na Figura 17 que os aminoácidos carregados são os resíduos energeticamente mais
relevantes, seguindo a ordem:
• -111.19 kcal / mol (Asp81-NS2B)
• -110.09 kcal / mol (Asp79 -NS2B)
• -84.31 kcal / mol (Asp80-NS2B)
• -66.90 kcal / mol (Asp75-NS3)
• -66.89 kcal / mol (Asp129-NS3)
59
• -55.69 kcal / mol (Asp88-NS2B)
• -43,20 kcal / mol (Glu101-NS3)
• -41.14 kcal / mol (Glu54- NS2B)
• -30.46 kcal / mol (Met84-NS2B)
• -27.09 kcal / mol (Asn152-NS3)
• -17.98 kcal / mol (Val155-NS3)
• -17.08 kcal / mol (Lys26-NS3)
• 36.33 kcal / mol (Lys157-NS3)
• 14.97 kcal / mol (Met59-NS3) NS3)
• 41.68 kcal / mol (Lys87-NS2B)
• 50.32 kcal / mol (Lys74-NS3)
• 48.46 kcal / mol (Lys131-NS3)
• 49.18 kcal / mol (Arg54- NS3)
• 79.82 kcal / mol (Arg85-NS2B).
Para valores mais altos da constante dieletrica (ε = 10 e 40), a importância dos
resíduos carregados diminui, uma vez que ε influencia principalmente as energias
individuais desses aminoácidos (MARTINS, et al,2016). Como podemos ver pelos
resultados ε = 40, a ordem de importância de alguns aminoácidos foi alterada da
seguinte forma:
• Met84 (-23.44 kcal / mol)
• Asn152 (-16.47 kcal / mol)
• Met75 (-15.47 kcal / mol)
• Met49 (-14.84 kcal / mol)
• Tyr161-NS3 (-8.18 kcal / mol)
• Asp129 (7.68 kcal / mol)
• Gly151 (-6.15 kcal / mol)
• Gly153-NS3 (-4.53 kcal / mol)
• Asp81 ( -4.40 kcal / mol)
• Asp79 (-3.64 kcal / mol)
• Val155 (-3.17 kcal / mol)
• Asp75 (-3.08 kcal / mol)
• Trp83-NS3 (-3.02 kcal / mol)
60
• Phe130-NS3 (- 2.92 kcal / mol)
• Val36-NS3 (-2.81 kcal / mol)
• Asp80 (-2.00 kcal / mol)
• Pro132-NS3 (-1,89 kcal / mol)
• Lys74 (1,34 kcal / mol)
• Trp50 (1,57 kcal / mol) mol)
• Lys157 (1,66 kcal / mol)
• His51 (2,49 kcal / mol)
• Arg54 (2,52 kcal / mol)
• Arg85 (4,98 kcal / mol).
Comparando nossos resultados energéticos com o mapa da rede de ligação no
complexo Bz-nKRR-H / protease, fornecido por Noble (2012) e colaboradores, é fácil
perceber que os resultados obtidos para a constante dielétrica ε = 40 estão mais
próximos do cenário de ligação cristalográfica do que para qualquer outro cálculo de ε
aqui apresentado. Pode-se observar que as simulações realizadas para uma constante
dieletrica media ε = 40 melhoram os resultados, não apenas mostrando melhor
concordância com dados experimentais, mas também proporcionando uma melhor
convergência da energia total de interação com o tamanho do raio do sítio de ligação.
A Figura 18 representa alguns dos principais resíduos de aminoácidos e
respectivas interações intermoleculares com o inibidor Bz-nKRRH. A fim de
proporcionar uma melhor visualização espacial, mostramos as ligações de hidrogênio
(h-bonds) em três diferentes perspectivas.
• A Figura 18 (a) apresenta a ligação do inibidor com Gly153 (1,87 Å), Arg85
(2,04 Å), Met84 (2,30 Å) e Val155 (2,47 Å).
• A Figura 18 (b) apresenta interações com Asn152 (2,15 Å), His51 (2,86Å),
Asp81 (3,39 Å), Asp75 (3,59 Å) e Arg54 (3,73 Å).
• A Figura 18 (c) nos fornece uma imagem mostrando as interações entre Bz-
nKRR-H com Gly151 (1,89 Å), Tyr161 (1,97 Å), Phe130 (2,09 Å), Asp129
(2,25 Å) e Val36 (4,49 Å).
61
Figura 18: Imagem detalhada dos resíduos de aminoácidos mais relevantes envolvidos na ligação do complexo NS2B-NS3pro da serina-protease com o inibidor Bz-nKRR-H nas regiões (a) i, ii, iii; (b) região iv; (c) região v. As ligações de hidrogênio potenciais são indicadas por linhas tracejadas.
Fonte: OURIQUE, et al, 2016
Os aminoácidos Asp129 e Asp81 interagem com o inibidor Bz-nKRR-H através
de uma ponte salina entre a sua cadeia lateral de carboxilato nas regiões iv(C32)NH+2 e
v(C45)NH+2 do inibidor, respectivamente. Segundo Noble et al, (2012), são
aminoácidos conservados que auxiliam a protease serina NS2B-NS3 do vírus da dengue
em uma conformação fechada durante a proteólise.
62
Finalmente, observa-se a importância dos resíduos Met75, Met49, Arg54 e
Arg85. Enquanto a interação Met75-iv(C29)H e Met49-v(N4)H são duas das mais
atrativas; o grupo guanidina das argeninas 54 e 85 interagem com o grupo amônio da
região iv [iv(C32)NH+2] e iii [iii(C22)NH+3] respectivamente, através de.
63
Capítulo V. Resultados e
Discussões: O Caso do Virus
da Febre do Nilo Ocidental
64
Capítulo 5: Resultados e Discussões: O Caso do Virus da
Febre do Nilo Ocidental
O presente trabalho utilizou como modelo de estudo o cristal da molécula do
inibidor peptídico Bz-nKRR-H no caráter de molécula inibidora, em complexo (ligado)
ao alvo terapêutico de interesse, a protease NS3-NS2B do vírus Febre do Nilo
Ocidental. Após aplicada as metodologias citadas no capítulo anterior, foi obtido os
resultados apresentados nos próximos tópicos.
O artigo científico associado com este capítulo da presente tese de dourado está
na fase de escrita técnico-científica.
5.1 Sítios ativo: estrutura Fármaco-Receptor
Na Figura 19 abaixo, é mostrado o complexo NS3-NS2B em ligação com o
inibidor peptídeo Bz-nKRR-H representado na cor magenta.
Figura 19: Visão do sítio da NS3-NS2B em complexo com o inibidor Bz-nKRR-H (representado na cor magenta).
Fonte: Dados da pesquisa
65
O bolso S1 da protease NS3 é formado pelos resíduos: Gly151, Tyr161, Tyr150,
Asp129 com os resíduos estruturais Tyr130–Thr132 (ERBEL, et al, 2006). O resíduo
Asp129 está localizado no assoalho do bolso S1, sendo responsável por estabilizar a
cadeia lateral carregada positivamente da arginina do ligante, que irá interagir com o
importante resíduo Tyr161 (ERBEL, et al,2006). O bolso S2 é caracterizado por cargas
negativas do potencial eletrostático representantes do resíduo da protease NS2B Asp82,
Gly83 e Asn84. Estes átomos interagem com uma arginina carregada positivamente na
região 3 do ligante. Mais adiante no tópico 5.5 será mostrada que esta proximidade
favorece uma ligação de hidrogênio do resido Asn152 na região 3 da molécula inibidora
Bz-nKRR-H.
5.2 Gráfico da Convergência e determinação do raio
Para começar a estudar as interações entre os resíduos do receptor com o ligante,
foi feito um gráfico de convergência das energias de interação em Kcal/mol pelo raio
em Angstron. O gráfico de convergência mostra a extensão da energia de interação no
sítio ativo, indicando até qual raio a energia de interação irá variar. A convergência
significa a estabilização da energia de interação (variação inferior a 10% nos raios
subsequentes), onde supostamente a interação não exerce mais influência para a ligação
ligante-receptor. A Figura 20 abaixo, mostra a energia de interação total para o Bz-
nKRR-H que vai de 2.5Å a 15.0Å. A energia de interação de cada raio é determinada
somando-se a energia de interação resíduo-ligante de cada resíduo presente no raio.
Quanto mais negativa é a energia de interação, maior é a interação entre a proteína e o
ligante. O gráfico de convergência também apresenta os resíduos mais importantes para
alguns raios de interação.
66
Figura 20: Energia de interação total em função do raio da cavidade de ligação calculado durante o estudo de convergência considerando diferentes valores da constante dieletrica: ε = 1 (preto), ε = 10 (vermelho), ε = 40 (azul).
Fonte: Dados da pesquisa
Sabe-se que a constante dieletrica (ε) é uma medida de capacidade do material,
neste caso o solvente, de moderar a força de atração entre a as partículas com cargas
opostas em comparação a um padrão (CAREY, 2006). O valor dielétrico padrão é o
vácuo que recebe valor de ε = 1. Quanto maior a constante (ε), mais o meio e capaz de
suportar espécies carregadas positivas ou negativas separadas (CAREY, 2006). Pode-se
concluir que é uma tendência do meio de proteger uma carga da influência de outra
carga. Solventes com um valor de ε altos tendem a ser mais polares (CAREY, 2006).
Com finalidade de se aproximar o resultado aos obtidos no meio natural e torná-los
mais fidedignos, constantes dieletricas (ε) 10 e 40 foram utilizadas em comparação ao
resultado sem considerar a constante dielétrica (ε = 1).
Na Figura 20 pode-se observar que, com exceção da constante = 1, existe uma
convergência do sistema (ε = 10 e ε = 40) ou seja um ponto no qual a energia possui
uma variação desprezível da energia de interação. Para a curva com ε = 1 o ponto de
67
convergência encontra-se em aproximadamente em r = 14.5Å. Possuindo variações a
partir de 2,5Å a curva apresenta uma queda tornando-se mais negativa, ou seja, a
energia de interação é maior em:
(i) 3.0 Å, com os resíduos carregados negativamente Asp82 e Asp129;
(ii) 6.0Å, com o resíduo carregado negativamente Asp80;
(iii) 8.0Å, com o resíduo carregado negativamente Glu101;
(iv) 9.5Å, com o resíduo Asp76;
(v) 14.0Å, com o resíduo Glu120.
A energia assume um caráter positivo em
(i) 5.5Å, com resíduos carregados positivamente Lys73 e Lys54;
(ii) 6.5Å, com o resíduo carregado positivamente Arg78;
(iii) 10.5 Å, com o resíduo Arg24;
(iv) 11.0Å, com o resíduo Lys104;
(v) 12.0 Å, com o resíduo Lys107 e
(vi) 14.5Å com os resíduos Lys88 e Arg74.
Analisando-se a Figura 20, fica claro que as curvas vermelha e azul referentes
as constantes dielétricas 10 e 40 possuem um padrão muito mais regular, sendo que
entre si, não apresentam uma diferença significativa.
5.3 Resíduos energeticamente relevantes: Tabelas e BIRD
Após o cálculo da energia de interação individual dos resíduos que participam da
interação com o ligante, através de cálculos quânticos e da metodologia do DFT já
mencionados nos capítulos anteriores, foram obtidas as energias de interação envolvidas
na ligação de NS3-NS2B e o inbidor Bz-nKRR-H. A partir desses dados, pode-se
analisar quais os aminoácidos mais relevantes para a ligação em questão. As tabelas
apresentadas a seguir, trazem todos os resíduos que interagem com o ligante em um raio
de 15 Å. A tabela também fornece informações para a avaliação da afinidade do resíduo
com o ligante em questão, como por exemplo o grupo atômico e a região do fármaco
que interage com o resíduo e a distância dessas interações.
68
Tabela 1: Estruturas de raio-X de NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 1.
Resíduo Grupo Atômico Distância (A) Energia (kcal/mol) ε = 1 ε = 10 ε = 40
GLY83 V(H42)C 4,789 -16,639 -4,905 -3,806 ASN84 V(H38)O 2,492 -11,534 -3,261 -2,769 PHE85 III(C18)O 2,023 -30,158 -10,038 -7,997
GLNA86 IV(H27)O 2,031 -26,644 -8,948 -7,732 HIS51 V(H43)N 1,894 -11,808 -8,280 -8,411
ASP75 V(H41)H 2,254 -127,986 -14,564 -4,749 TYR130 V(H45)O 1,990 -16,842 -6,925 -5,880 THR132 V(H56)O 2,086 -5,777 0,274 -5,777 SER135 V(H53)H 1,362 12,684 12,752 12,601 TYR150 V(H53)H 2,492 -2,345 -1,324 -1,245 GLY151 V(H44)O 1,990 -15,954 -7,484 -6,594 ASN152 V(H37)O 1,997 -22,000 -12,259 -11,381 GLY153 II(O4)HN 1,899 -15,166 -6,422 -5,490 VAL154 III(H21)H 2,343 -0,049 0,054 -0,292 TYR161 III(H18)H 2,198 -6,340 -3,768 -3,672 ASP82 V(H42)O 2,609 -120,314 -12,663 -3,786
ASP129 II(N4)O 2,871 -119,734 -18,629 -10,146 PRO131 II(H5)H 2,920 -8,692 -3,082 -2,387 THR134 V(H51)H 2,560 4,186 0,621 0,186 ILE155 III(H21)HN 2,627 -6,995 -1,994 -1,647 LEU87 IV(H28)HN 4,016 -34,890 -0,759 -0,344 LEU49 V(H43)H 4,334 2,683 0,500 0,106 TRP50 V(H40)H 4,139 5,326 1,184 0,379 THR52 V(H43)H 4,059 -0,583 -0,096 -0,126 VAL72 V(H42)O 4,178 -9,209 -1,026 -0,035
GLY133 V(H56)N 4,180 0,811 0,043 -0,075 LEU79 V(H41)H 7,262 3,969 0,533 0,119 GLY37 V(H56)H 4,861 1,253 0,203 0,057
SER163 V(H52)H 4,781 -1,354 -0,115 -0,107 ALA36 V(H56)O 5,219 -4,735 -0,561 -0,157 LYS54 V(H39)H 5,.622 81,663 8,550 2,136 LYS73 V(H41)O 5,150 64,021 5,637 1,366 GLU74 V(H41)C 5,398 -62,620 -6,034 -1,517
LEU128 V(H53)O 5,084 1,551 0,160 0,196 GLY136 V(H50)HN 5,130 1,421 0,210 0,024 ILE162 III(H18)HN 5,450 -2,890 -0,452 -0,198 ASP80 V(H42)O 5,604 -105,077 -11,176 -2,855 MET97 V(H53)H 5,679 0,799 0,105 -0,002
GLY159 V(H46)O 5,569 -2,787 -0,368 -0,117 SER160 V(H46)C 5,808 -2,976 -0,463 -0,187 ARG78 IV(H28)O 6,038 73,343 7,157 1,776 ALA38 V(H56)HN 6,230 -3,127 -0,356 -0,093
SER137 V(H50)HN 6,118 -1,536 -0,115 -0,005 ALA164 II(O4)HN 6,086 -3,409 -0,401 -0,113 VAL166 IV(H33)H 6,272 0,987 0,209 0,047 VAL77 IV(H28)H 6,508 2,140 0,618 0,160
69
Tabela 2: Estruturas de raios-X da protease NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 2
Resíduo Grupo Atômico Distância (A) Energia (kcal/mol) ε = 1 ε = 10 ε = 40
ASP81 V(H42)C 6,754 -68,967 -6,012 -1,380 SER71 V(H46)HN 12,916 -1,974 -0,205 -0,053 ARG76 V(H41)N 6,630 64,257 5,584 1,360
PHE116 IV(H34)N 5,000 1,107 0,146 0,047 MET156 III(H21)HN 6,639 -8,504 -0,985 -0,269
GLN35 V(H56)N 8,017 2,298 0,272 0,067 PRO102 V(H56)H 8,313 0,406 0,031 0,005
THR53 V(H39)C 9,140 2,654 0,390 -0,126 VAL99 I(C13)H 8,615 2,489 0,288 0,067
GLU101 V(H51)H 7,771 -61,284 -5,647 -1,409 VAL126 V(H52)H 8,361 -2,355 -0,341 -0,090 LEU149 V(H50)H 8,888 2,385 0,316 0,000 MET88 IV(H28)N 8,082 -11,390 -0,126 -0,054
ILE25 V(H56)H 8,291 -0,898 -0,138 -0,036 THR48 V(H43)H 8,314 3,145 0,390 0,095
VAL100 II(C3)N 14,688 -0,893 -0,198 -0,051 THR127 V(H53)H 8,977 4,069 0,539 0,182 ILE139 I(C14)H 9,341 -0,378 -0,076 -0,018
PRO157 III(H25)N 8,748 -1,694 -0,179 -0,024 ASP76 IV(H28)O 9,063 -56,239 -5,403 -1,348 TYR34 II(O3)H 9,160 2,514 0,318 4,935 LEU77 V(H41)HN 9,791 -3,067 -0,325 -0,085 MET52 V(H43)H 9,904 -0,329 0,094 0,026 VAL75 IV(H28)H 9,893 1,357 0,116 0,030 GLY39 V(H56)N 9,991 0,000 -0,142 -0,035 GLY55 V(H39)HN 9,666 -0,604 0,191 0,049
ALA125 II(O4)H 9,876 2,466 0,350 0,090 PRO138 V(H50)N 9,965 -2,460 -0,267 -0,069
ILE165 II(O4)N 10,288 -0,571 -0,008 0,316 ARG24 V(H56)H 10,400 49,060 4,928 1,232
ILE98 V(H51)O 10,284 -1,172 -0,151 -0,042 VAL109 V(H53)H 10,915 -0,404 -0,053 -0,045 ILE123 V(H41)H 10,938 -0,890 0,021 0,006
ASN158 V(H46)C 10,022 -2,291 -0,238 -0,062 GLN167 V(H37)HN 11,324 -3,921 -0,546 -0,138
GLY70 V(H41)H 11,011 2,002 0,279 0,072 LYS104 II(H4)H 10,684 49,270 4,925 1,231 THR118 IV(H28)H 10,796 0,431 0,390 0,030
TYR23 III(C20)O 11,854 -1,044 -0,135 -0,035 THR27 II(O3)H 11,071 0,304 0,251 0,011 TRP69 II(NH2)H2 11,870 0,230 0,029 0,007 TRP83 V(H41)H 11,305 1,535 0,142 0,036
GLY148 III(H20)C 11,361 4,113 0,476 0,121 MET26 V(H56)H 11,634 -1,970 -0,227 -0,058 PHE46 II(O3)H 12,083 0,671 0,100 0,026 ALA56 V(40)HN 11,960 -1,270 -0,137 -0,035
70
Tabela 3: Estruturas de raios-X da protease NS3-NS2B e seus ligantes - Parte 3
Resíduo Grupo Atômico Distância (A) Energia (kcal/mol) ε = 1 ε = 10 ε = 40
TYR79 V(H39)H 11,777 -0,351 -0,021 -0,005 LYS107 V(45)H 11,918 47,360 4,734 1,183 THR111 I(C13)H 12,777 -0,191 -0,041 -0,011 GLY124 II(O4)O 11,748 -1,874 -0,283 -0,074 THR69 V(H45)H 12,590 1,142 0,200 0,052 GLU73 V(H46)H 12,095 -53,551 -5,149 -1,286 HIS47 III(C20)C 12,648 2,950 0,332 0,082
LYS117 IV(H28)HN 12,103 47,720 4,657 1,161 GLY70 II(H2)C 11,130 3,578 2,884 0,072 SER71 V(H41)H 9,653 0,384 0,048 -0,053 VAL22 V(H51)H 13,054 -9,209 0,217 0,056 VAL40 V(H50)H 12,984 -2,099 -0,228 -0,057 LEU58 V(H43)H 13,122 -0,055 0,008 0,002
GLY103 V(H56)N 12,736 0,428 4,938 0,014 VAL106 V(H51)H 13,054 1,457 0,218 0,057 PRO119 IV(H28)H 13,243 2,599 0,244 0,064 GLY168 V(H41)H 13,640 2,026 -0,197 -0,197
ILE54 II(O3)H 14,291 0,438 0,093 0,025 THR57 V(H56)C 14,400 -4,038 0,075 0,020 CYS78 V(H40)NH 13,772 -1,601 -0,135 -0,033 GLN96 V(H51)C 14,119 0,650 0,032 0,008
VAL115 III(C17)O 14,247 5,415 0,185 0,067 TRP53 V(H56)O 13,969 -0,454 0,390 -0,056 PRO67 V(H39)H 14,487 -0,653 0,207 0,054 VAL95 V(H53)H 13,674 -2,350 0,118 0,030
ASN108 III(C17)O 14,027 3,662 0,048 0,013 GLU120 V(H41)O 13,967 -57,876 -5,026 -1,257 VAL146 V(H50)H 13,853 -0,174 0,175 0,045 ARG74 III(H25)C 14,125 51,843 4,658 1,163 LYS88 V(H41)H 14,129 50,436 5,242 1,316
ASN105 V(H51)C 14,913 -1,869 -0,218 -0,056 PRO113 V(H50)H 14,598 2,738 0,316 0,080 GLY114 II(H4)HN 14,454 1,437 0,133 0,033 VAL140 V(H50)H 14,650 -1,151 -0,232 -0,058 ILE147 V(H50)C 14,737 0,647 0,060 0,016 GLU55 V(H56)HN 14,581 -0,604 0,191 -1,017 LEU85 V(H50)H 14,899 -0,388 -0,051 -0,438
GLN110 V(H51)N 15,928 -0,560 -0,055 -0,013
Fonte: Dados da pesquisa
71
A partir das tabelas, foi feito o gráfico BIRD mostrando a energia de interação
de cada resíduo com o ligante, com o lado direito representando a energia repulsiva (não
traz benefício direto à ligação). Já o lado esquerdo exibe altos valores negativos de
energia, isto é, energia atrativa (resíduos importantes para a descrição da interação).
Foram calculadas as energias de interação individuais dos principais
nucleotídeos dentro de um raio de interação de 15Å interagindo com o inibidor
peptídico Bz-nKRR-H (representada na Figura 22) juntamente com as regiões do
fármaco onde os principais contatos intermoleculares ocorrem, como por exemplo
pontes de hidrogênio.
Ou seja, o painel do BIRD mostra:
• a energia de interação (Kcal/mol) do ligante com cada resíduo (barras
horizontais). A partir daí pode-se avaliar quantitativamente a relevância de
cada resíduo no sítio de ligação, quer atraindo ou repelindo o ligante;
• alguns dos resíduos mais importantes que contribuem para a ligação que é
representada na coluna do lado esquerdo;
• as regiões (i, ii, iii, iv, v) do ligante;
• a distância do resíduo para o ligante;
• se há ou não há moléculas de água anexadas aos resíduos;
• mostra as energias individuais dos ligantes para cada constante dielétrica.
Como já mencionado anteriormente, a constante dielétrica (ε) é uma propriedade
característica do meio que possui um solvente (BARREIRO & RODRIGUES, 1996). A
influência da constante dielétrica foi observada a fim de que fosse comparado o meio
cristalizado com o meio solvatado. Esta influência está mais destacada, mostrando a
influência do meio sobre a energia de ligação. Observando o gráfico do BIRD, pode-se
destacar os resíduos que mais contribuem com a ligação, ou seja os resíduos que
possuem grande energia de atração:
• Asp75 com v(H41)H e molécula de água W1047;
• Asp82 com V(H42)O e molécula de água W1026;
• Asp129 com ii(N4)O e com três moléculas de água W1016, W1030 e
W1073;
• Asp80 com v(H42)O;
72
• Asp81 com v(H42)O e molécula de água W1011;
• Asp76 com iv(H28)O e molécula de água W107;
• Glu120, com v(H41)O;
• Glu73 com v(H46)H e duas moléculas de água W98/123.
Além disso ele mostra os principais resíduos que não trazem benefício a ligação
por possuírem grande energia de repulsão:
• Lys54 com v(H39)N;
• Lys73 com v(H41)O;
• Arg76 com v(H41)N;
• Arg24 com v(H56)H e molécula de água W1024;
• Lys104 com ii(H4)H;
• Lys 107 com v(H45)H e duas moléculas de água W1098/122;
• Lys117 com iv(H28)HN e molécula de água W117;
• Arg74 com V(H45)H água W123/121/1052 e
• Lys88 com iii(H25)C e molécula de água W1103.
Os resíduos que possuem maior energia de atração são:
• Asp75 com energias de atração em torno de -127,99 Kcal/mol para ε = 1, -
14,56Kcal/mol para ε = 10 e -4,75Kcal/mol para ε = 40;
• Asp129 com energias de atração em torno de -119,73Kcal/mol para ε = 1, -
18,63Kcal/mol para ε = 10 e -10,15Kcal/mol para ε = 40;
• Asp82 com energias de atração em torno de -120,31 Kcal/mol ε = 1, -
12,66Kcal/mol para ε = 10 e -3,79Kcal/mol para ε = 40.
Em relação as energias de repulsão temos:
• Lys54 com energia de repulsão em torno de 81,66Kcal/mol para ε = 1,
8,55Kcal/mol para ε = 10 e 2,14 para ε = 40
• Lys73 com energia de repulsão em torno de -64,02 Kcal/mol ε = 1,
5,64Kcal/mol para ε = 10 e 1,37Kcal/mol para ε = 40 e
• Arg78 com energia de repulsão em torno de 73,34Kcal/mol para ε = 1;
7,16Kcal/mol para ε = 10 e 1,78Kcal/mol para ε = 40.
73
Quanto aos membros da tríade catalítica, curiosamente observa-se uma
participação energética bem tímida (não significativa) por parte dos seguintes resíduos:
• His51 na ligação com o inibidor que possui energia com cerca de -11,81
Kcal/mol para ε = 1, -8,28Kcal/mol para ε = 10 e -8,41Kcal/mol para ε = 40.
• Asp75 com energias de ligação em torno de -127,99 Kcal/mol para ε = 1, -
14,56Kcal/mol para ε = 10 e -4,75 Kcal/mol para ε = 40, apresentando uma
alta energia de atração, contribuindo de forma significativa com a ligação.
Comparativamente, trabalhos realizados anteriormente com a mesma protease do
vírus da dengue mostraram que o resíduo Asp75 alcançou uma energia atrativa de -
66.90 kcal/mol para ε = 1 e -3.08 kcal/mol para ε = 40, também trazendo uma grande
contribuição a ligação NS3-NS2B com o ligante. O resíduo His 51 da protease NS3 do
vírus da dengue possui energia de -3.09 Kcal/mol para ε = 1 e 2.49 kcal/mol para ε = 40
(OURIQUE, et al, 2016), mostrando uma grande semelhança entre as proteases NS3-
NS2B dos dois Flavivírus.
74
Figura 21: As energias de interação e os contatos intermoleculares entre o inibidor Bz-nKRR-H e aqueles nucleotídeos da protease NS3-NS2B que mais contribuem para estabilidade da droga em um sítio de ligação com raio de 15Å. O raio onde se localiza cada resíduo está à direita das barras laterais, as quais descrevem as energias de interação. Já a região e o átomo da droga mais próximo de cada resíduo identificados à esquerda das mesmas. ε = 1 (barra listrada), ε = 10 (barra de coloração cinza) e ε = 40 (barra de coloração negra).
Fonte: Resultados da pesquisa.
75
5.4 Mapa de densidade eletrostática
Os mapas de potencial eletrostático demonstram os sítios com maior
probabilidade de ataque eletrofílico, auxiliando também na identificação das ligações de
hidrogênio. Os átomos constituintes são:
• carbono (verde),
• hidrogênio (branco),
• nitrogênio (azul),
• oxigênio (vermelho).
A superfície foi colorida com o valor do potencial eletrostático. Portanto nas
regiões negativas (em vermelho) há uma maior probabilidade de ataque eletrofílico. Já
as regiões com mais cargas positivas (em azul), possuem maior probabilidade de ataque
nucleofílico. O mapa do potencial eletrostático é calculado a partir da densidade
eletrônica do sistema. Já foi visto que as propriedades topológicas da densidade de carga
são determinadas pelas características de seus pontos críticos (SABINO, 2003).
A topologia da densidade de carga é dominada por forças exercidas pelos
núcleos e elétrons vizinhos. Da topologia da densidade experimental podem ser obtidas
as propriedades químicas dos átomos e moléculas (SABINO, 2003). O arranjo
tridimensional da carga negativa ao redor de um átomo ou molécula é determinado pela
distribuição eletrônica, tendo sido justamente o estudo da distribuição eletrônica que
originou o surgimento da Farmacologia Quântica (RANG & DALE, et al, 2003).
O mapa do potencial da densidade eletrostática é apresentado na Figura 22 (B)
abaixo, juntamente como a estrutura planar do ligante separada por regiões. É fácil
observar que as áreas de maior carga positiva se devem a presença de dois resíduos
Arginina, que são resíduos carregados positivamente, somando-se ao fato do inibidor
possuir uma histidina, também contribuindo com a densidade de carga positiva. As
áreas negativas se devem a presença de grupos carboxílicos (COO-), mais evidentes nas
regiões 2, 3 e 4. A região 1, representa uma área de carga mais neutra em relação as
demais, o que demonstra que ela não deve exercer influência significativa na interação
receptor-ligante.
76
Figura 22: (A) Estrutura química mostrando as principai regiões de interação; (B) mapa de potencial eletrostático do Bz-nKRR-H em pH fisiológico (variando de 7.2 a 7.4).
Fonte: Dados da pesquisa
Estudos de especificidade de substrato para a protease de NS3 dos Flavivirus,
demonstraram que a enzima reconhece preferencialmente um par de resíduos básicos
(quer Lys ou Arg) nas regiões IV e V do substrato peptídico (CHANPRAPAPH, et al,
2005 e BOLLATI, et al, 2009). A preferência por Arg na região V provavelmente se
77
deve ao fato dela interagir com Asp75, componente na tríade catalítica (NOBLE, et al,
2011). O resíduo Arg também é o preferido porque pode interagir com o resíduo
Asp129 (apresentado no BIRD como um dos resíduos mais eletronegativos, ou seja, que
mais fortemente contribui com a ligação) e Phe130 (NOBLE, et al, 2011).
A preferência por resíduos básicos nos bolsos S1 e S2 da protease resulta na
organização tipo tripsina do sítio S1 juntamente com uma carga de superfície negativa
introduzida β-grampo de NS2B no bolso S2 (ALESHIN, et al, 2007), o que explica o
fato de se observar uma região carregada negativamente em torno de Asp 75 e Ser135
no sítio ativo (TAMBUNAN, KURNIAWAN, PARIKESIT, 2013). Como pode-se notar
através da figura acima, o inibidor peptídico Bz-nKRR-H apresenta o perfil adequado
para competir com o substrato e se ligar efetivamente a protease NS3-NS2B. Devido a
preferência da protease por resíduos dibásicos (como uma arginina por exemplo) nas
regiões III, IV e V (SCHÜLLER, et al, 2011, CHANPRAPAPH, et al, 2005), o ligante
Bz-nKRR-H de fato exibe uma potência inibitória elevada corroborando com trabalhos
anteriores.
5.5 Estudo dos resíduos receptor-ligante
Em geral, as ligações que se estabelecem entre o fármaco e o receptor são
relativamente fracas: pontes de hidrogênio, transferência de carga, hidrofóbicas ou
interações de van der Waals (RANG & DALE, 2003, GOLAN, 2009). Em
consequência, os efeitos produzidos são reversíveis, pois com o rompimento das
ligações fármaco-receptor tem-se o fim do efeito farmacológico. Tal ligação é ideal para
fármacos que atuam nos receptores de nosso organismo, pois sabemos que o efeito
desejado terá um tempo limitado (RANG & DALE, 2003). Há ocasiões, no entanto, em
que os fármacos visam um efeito prolongado ou até mesmo irreversível, como no caso
de alguns quimioterápicos, que exercem ação tóxica (prolongada) contra organismos
patogênicos e outras células exógenas do corpo. Tal interação com o receptor é feita por
ligações covalentes (RANG & DALE, 2003). Também deve ser lembrado que a força
de uma ligação depende da distância que separa dois átomos, onde na distância ótima
forma-se a ligação mais forte (RANG & DALE, 2003).
Visto que o inibidor peptídico Bz-nKRR-H, visa inibir com efeito prolongado a
protease NS3-NS2B, interações de hidrogênio entre os resíduos do sítio ativo e o
receptor foram investigadas. A Figura 23 abaixo mostra a molécula do inibidor
78
peptídico Bz-nKRR-H, interagindo com os resíduos do receptor. Os resíduos que
formam interações de hidrogênio em ordem de distância respectivamente são:
• Gln86 2.7Å;
• Phe85 2.7Å;
• Gly153 2.9Å;
• Asn152 3.0Å;
• Gly151 3.0Å.
A importância do resíduo Gly153, que realiza uma interação de hidrogênio a
2.9Å, já foi relatada anteriormente na literatura, uma vez que este resíduo participa da
formação do bolso S1 da NS3. O resíduo Phe85 que realiza uma interação de
hidrogênio a 2.7 Å, por sua vez, é um importante resíduo da proteína NS2B que age de
co-fator da proteína NS3. Tal resultado reforça a importância da proteína NS2B na
formação do sítio ativo e ativação da protease NS3. O trabalho de Noble (2012),
menciona uma formação de ponte de hidrogênio entre o resíduo Phe85 com uma Lys na
região III do mesmo inibidor.
Assim como o resíduo Gly153, Gly151, que realiza interações de hidrogênio a
3Å, já foi mencionada como um importante resíduo para o reconhecimento do inibidor,
participando da formação estrutural do sítio ativo (TIEW, et al., 2012). Ambos os
resíduos Gly151 e Gly153 da protease NS3 do vírus da dengue, foram relatados a
realizar pontes de hidrogênio com o inibidor peptídico Bz-nKRR-H (OURIQUE, 2016),
corroborando com estudos anteriores que apontam a alta semelhança estrutural das
proteases dos Flavivirus.
A importância da interação de hidrogênio do resíduo Asn152 com a arginina na
região V do ligante foi previamente citada no tópico 5.2. Tal interação demonstra a
importância da presença de resíduos básicos na região V do ligante (ERBEL et al,
2006). A interação de hidrogênio formada pelo resíduo Asn152 também foi observada
entre o resíduo Asn152 da protease NS3-NS2B do vírus da dengue e a arginina da
região V do inibidor Bz-nKRR-H, como apresentado no trabalho de Ourique e
colaboradores (2016), mais uma vez demonstrando a semelhança entre as proteases
NS3-NS2B dos Flavivirus Dengue e Febre do Nilo Ocidental.
79
Figura 23: Distância em angstrom (Å) das principais interações intermoleculares – pontes de hidrogênio– entre o Bz-nKRR-H e os resíduos do NS3-NS2B localizados no sítio da protease.
Fonte: Resultados da pesquisa.
80
A Figura 24 abaixo mostra a participação da tríade catalítica na ligação com o
ligante. A NS3pro é uma serina protease tipo tripsina com uma tríade catalítica
constituída pelos resíduos: His51, Asp75 e Ser135 (DOAN, et al, 2012 e POLGÁR,
2005). A tríade catalítica é localizada no sítio ativo da enzima, onde a catálise ocorre e é
preservada em todas as serino-proteases (POLGÁR, 2005; DOAN, et al, 2012). Sabe-se
que a tríade catalítica na protease NS3 dos flavivírus, é uma estrutura coordenada
composta por 3 aminoácidos essenciais: uma histidina (His51); uma serina (Ser135) e
um ácido aspártico (Asp75) (POLGÁR, 2005). Estes três aminoácidos estão localizados
próximos uns aos outros e exercem um papel chave na habilidade de clivagem das
serino-proteases, sendo que cada aminoácido irá exercer uma função específica
(POLGÁR, 2005). Tais aminoácidos podem variar de um Flavivirus para o outro.
Estudos realizados com outras serina-proteases acerca da relação geométrica dos
aminoácidos Asp, Ser e His, levou à postulação de que o resíduo His contribui através
da transferência de um próton de Ser para Asp em um mecanismo de retransmissão
gratuita. É pressuposto que o resíduo Asp pode estar envolvida na estabilização do par
iônico gerado entre o íon e o imidazol negativamente carregado de um intermediário
tetraédrico, e Asp pode participar na orientação correta do tautómero de His em relação
ao resíduo Ser (POLGÁR, 2005). Os aminoácidos Ser135 e His 51 estão perto do bolso
S2 e são posicionados para interagir com o grupo carbonil da ligação peptídica (LI, et
al, 2005). A ligação de hidrogênio entre os aminoácidos Asp e His aumenta o pKa do
resíduo Asp75, favorecendo a ativação de um nucleófilo do resíduo Ser que se liga de
forma covalente ao substrato, produzindo ligações intermoleculares diretas com o
inibidor Bz-nKRR-H (OURIQUE, 2016).
Foi sugerido que a tríade catalítica, vai atuar em conjunto com os resíduos do
bolso S1 (Gly151, Gly153, Tyr150) na estabilização da interação através de ligações de
hidrogênio com grupos funcionais localizados na extremidade do inibidor
(WATOWICH & TOMLINSON, 2011). Nessa interação, o triazol do ligante também
aceita interações de hidrogênio do próton amida do resíduo Gly153 e do próton da
hidroxila do resíduo Tyr161, provocando um rearranjo no qual interações com Pro132,
Tyr150 e Tyr161 são favorecidas.
81
Figura 24: Interação dos membros da Tríade Catalítica com o ligante.
Fonte: Dados da pesquisa.
Na Figura 24 pode-se observar uma ligação covalente realizada pelo resíduo
Ser135, com o ligante, o inibidor Bz-nKRR-H, sugerindo que o inibidor Bz-nKRR-H
irá formar uma ligação irreversível com o receptor, possuindo um efeito de ação
prolongado. Esta ligação covalente foi anteriormente observada entre o resíduo Ser135
da protease NS3 do vírus da dengue interagindo com o mesmo inibidor peptídico, o que
demonstra uma alta similaridade entre as proteases NS3 dos vírus Dengue e Febre do
Nilo Ocidental (NOBLE, 2012; ERBEl, et al, 2006). Além do resíduo Ser135, o resíduo
His51 da protease NS3 de DV também forma uma interação de hidrogênio semelhante
ao resíduo His51 de WNV como observado no trabalho de Ourique e colaboradores
(2016).
82
Capítulo VI. Conclusões e
Perspectivas
83
Capítulo 6: Conclusões e Perspectivas
6.1 Conclusão
Após calcularmos individualmente as energias dos resíduos do sítio ativo da
protease NS3-NS2B, presentes dentro do raio de interação pré-estabelecido (15 Å), o
gráfico BIRD foi montado para exibir os resíduos que mais (menos) contribuiram com a
interação fármaco-sítio de ligação, tanto para o vírus da Dengue (DV) quanto para o
vírus da Febre do Nilo Ocidental (WNV). Ele não só forneceu informações detalhadas
das interações dos resíduos com os fármacos, mas também as relacionou com as suas
estruturas químicas.
Para o caso do vírus da dengue, foi mostrado um forte contato intermolecular
entre o peptídeo Bz-nKRR-H e os seguintes resíduos:
a) com a sub-unidade da protease NS3: Asn152, Met49, Tyr161, Asp129, Gly151, Gly153, Val155, Asp75, Trp83, Phe130 e Val36.
b) com a sub-unidade da protease NS2B:
Met84, Met75, Asp81, Asp79 e Asp80.
Para o caso do vírus WNV os resíduos que mais contribuíram com a ligação, ou
seja, os resíduos que possuem grande energia de atração foram:
Asp129; Asp75; Asp82; Asp80; Asp81; Asp76 e Glu73.
Já os principais resíduos que não trouxeram benefício a ligação por possuírem
grande energia de repulsão foram:
Lys54; Lys73; Arg76; Arg24; Lys104; Lys107; Arg74.
O mapa do potencial da densidade eletrostática do vírus WNV está, juntamente
como a estrutura planar do ligante, separada por regiões em pH fisiológico (7.4). Pode
ser observado que as áreas de maior carga positiva se devem a presença de dois resíduos
Arginina e um Histidina, que são resíduos dibásicos carregados positivamente.
O reconhecimento de resíduos dibásicos nas regiões IV e V pela protease NS3
de WNV, é considerada a especificidade chave para a função catalítica das enzimas NS3
flavivirais, tendo sido relatado por um grande número de trabalhos presentes na
literatura (SCHÜLLER, et al, 2011). Este resultado mostra, através do mapa do
84
potencial eletrostático, que existe uma complementariedade elevada e alta afinidade
entre o inibidor peptídico e a protease de WNV.
Os resíduos, que realizaram interações de hidrogênio com o ligante foram, com
as suas respectivas distâncias:
• Gln86 2.7Å;
• Phe85 2.7 Å;
• Gly153 2.9 Å;
• Asn152 3.0 Å;
• Gly151 3.0 Å.
Também foi observado uma ligação covalente com o resíduo Ser135. Pode-se
inferir pela presença dessa ligação covalente, que o inibidor Bz-nKRR-H possui uma
alta afinidade com a protease NS3, se ligando irreversivelmente a ela, o que concorda
com estudos anteriores que demonstraram a importância dessa ligação covalente como
resultando da interação do resíduo His51 e Bz-nKRR-H (NOBLE, et al., 2011; ERBEL,
et al, 2006). Este dado demonstra uma alta capacidade inibitória de longa duração
essencial para que sua função terapêutica seja eficiente. Deve ser destacada também, a
participação da tríade catalítica composta pelos resíduos His51, Asp75 e Ser135 como
sendo de fato relevante na ligação do fármaco-receptor.
Destacamos também, que as regiões do fármaco mais ativas na interação com a
protease de NS3-NS2B do vírus Febre do Nilo Ocidental são predominantemente IV e
V, seguidas pela região III com uma participação bem menos relevante. Tal importância
deve-se ao fato destas regiões apresentarem resíduos positivos de Argininas e Lisina
que interagem com resíduos carregados negativamente da protease. Através deste
resultado, pode-se conduzir estudos que visem a melhoria desta molécula inibidora
através de alterações em regiões que não interagem tanto com a protease NS3-NS2B,
como a região I e a região II, por exemplo.
Este estudo revelou os principais resíduos envolvidos na interação do inibidor
Bz-nKRR-H com a protease NS3-NS2B. Os dados apresentados neste trabalho também
realçam a relevância estrutural e energética dos componentes da tríade catalítica na
interação com o ligante. Com estes dados, pode-se concluir que o inibidor Bz-nKRR-H
possui uma alta afinidade com a protease NS3-NS2B do vírus da Febre do Nilo
Ocidental, sendo, portanto, um bom candidato a fármaco para tratar a enfermidade
causada por este Flavivírus. Análises comparativas com trabalhos anteriores
85
confirmaram que as proteases NS3-NS2B de Dengue e WNV são altamente
semelhantes estruturalmente e possuem um comportamento energético muito parecido
quando ligadas ao mesmo ligante (Bz-nKRR-H). Este é um importante resultado para
ser levando em consideração no estudo e desenvolvimento de uma droga de finalidade
terapêutica comum ao tratamento de mais de um Flavivirus.
6.2 Perspectivas
O presente trabalho trouxe como principal resultado a lista de resíduos mais
influentes no âmbito de favorecer ou não a energia de ligação entre o inibidor Bz-
nKRR-H e a protease NS3-NS2B dos Flavivirus DV e WNV.
O conhecimento destes resíduos pode prover material para a formulação de um
fármaco específico para tratar as infecções causada não somente pelo vírus da dengue
mas também pelo vírus da Febre do Nilo Ocidental. Esta observação sugere que pode
ser possível desenvolver um novo inibidor peptídico ou até mesmo melhorar o
desempenho de Bz-nKRR-H para conter cadeias laterais polares sintéticos nas suas
regiões IV e/ou V para imitar estas interações, como sugerido no trabalho de Noble
(2012).
Foi observado que as regiões IV e V no WNV exibiram alta especificidade de
aminoácidos dibásicos, tais como arginina ou histidina, ao passo que as posições do
substrato I, II e III mostraram uma atividade menor, quando comparada com as posições
IV e V. Uma alternativa seria postular um inibidor que tivesse um nível maior de
interação com as regiões I e II e portanto, uma maior afinidade e especificidade com a
protease NS3-NS2B.
Mais ainda, a grande quantidade de resíduos conservados na protease de um
flavivírus para o outro (TOMLINSON & WATOWICH, 2010) sugere que pode ser
desenvolvido um fármaco inibidor de ação eficaz a infecções de Flavivirus diferentes.
Nos resultados comparativos pode-se observar a uma alta semelhança estrutural entre as
proteases NS3-NS2B do vírus da Dengue e Febre do Nilo Ocidental, com até mesmo
resíduos iguais realizando as mesmas interações com o inibidor. O presente trabalho
trouxe perspectivas renovadas no que diz respeito a interação da protease NS3-NS2B
com o inibidor Bz-nKRR-H.
Com a lista de resíduos que mais interagem, pode-se ainda inferir quais
melhorias podem ser feitas no inibidor Bz-nKRR-H, a fim de aumentar sua eficácia na
86
interação com a protease NS3-NS2B dos dois Flavivirus, podendo-se, a partir destes
resultados, formular-se uma comparação inédita da interação das proteases NS3-NS2B
com um inibidor peptídico para Febre do Nilo Ocidental e Dengue.
Na ausência de um medicamento terapêutico eficiente no mercado, o
desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas contra a replicação e maturação
destes vírus podem ser consideradas como uma rota promissora para o seu tratamento.
87
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100
Apêndice I Outros Trabalhos
101
Apêndice I
Neste Apêndice I apresentamos os outros trabalhos desenvolvidos durante o
período de doutorado, mas com enfoques diferentes do que foi apresentado aqui.
Estes trabalhos são:
1. F.A.B.F. de Moura, M.L. Lyra, M.L. Almeida, G.S. Ouriques, U.L. Fulco and
E.L. Albuquerque,
“Methylation effect on the ohmic resistance of a poly-GC DNA-like chains”
Physics Letters A 380, 3559-3563 (2016).
2. M.L. Almeida, G.S. Ourique, U.L. Fulco, E.L. Albuquerque, F.A.B.F. de Moura
and M.L. Lyra
“Charge transport properties of a twisted DNA molecule: a renormalization
approach”
Chemical Physics 478, 48-54 (2016).
3. G.S. Ourique, E.L. Albuquerque and U.L. Fulco
“Charge Transport in Biological Molecules”
18th ICBPS Conference Proc., Miami-FL, USA, Vol. 18 (3), 1738-1740 (2016).
Physics Letters A 380 (2016) 3559–3563
Contents lists available at ScienceDirect
Physics Letters A
www.elsevier.com/locate/pla
Methylation effect on the ohmic resistance of a poly-GC DNA-like
chain
F.A.B.F. de Moura a,∗,1, M.L. Lyra a, M.L. de Almeida b, G.S. Ourique b, U.L. Fulco b, E.L. Albuquerque b
a Instituto de Física, Universidade Federal de Alagoas, Maceió AL 57072-970, Brazilb Departamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history:Received 9 May 2016Received in revised form 13 July 2016Accepted 25 July 2016Available online 29 August 2016Communicated by R. Wu
Keywords:Tight-binding HamiltonianDNA Poly-GC finite segmentMethylated DNAIxV characteristic curves
We determine, by using a tight-binding model Hamiltonian, the characteristic current–voltage (IxV) curves of a 5-methylated cytosine single strand poly-GC DNA-like finite segment, considering the methyl groups attached laterally to a random fraction of the cytosine basis. Striking, we found that the methylation significantly impacts the ohmic resistance (R) of the DNA-like segments, indicating that measurements of R can be used as a biosensor tool to probe the presence of anomalous methylation.
© 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Theoretical and experimental investigations of the electronic and optical properties of biological self-assembled systems have at-tracted a great interest in recent years (for reviews see Refs. [1–3]). In general, within the context of molecular electronics, they present a wide range of different effects induced by the electric fields due to the unusual quality and quantity of their electric pa-rameters, as well as a consequence of their chemical modifications. [4,5].
As a bold example, the nucleic acids (DNA and RNA) and the proteins are not only biologically important polymers but also ba-sic functional materials, surpassing the conventional one in many aspects due to its unique transport properties [6,7]. However, the possible manipulation of these biopolymers via their charge trans-port between two conducting electrodes is still a challenge open problem, with several possible applications in the field of nano-electronic devices (for a review see Ref. [8]).
From the experimental point of view, some previous works have addressed the charge flow in DNA segments, unveiling im-portant issues regarding their electrical conductivity [9–13]. On the other hand, theoretical investigations of the charge transport
* Corresponding author.E-mail address: [email protected] (F.A.B.F. de Moura).
1 Fax: +55 82 3214-1645.
in DNA are being made by using a quantum formalism based on a single electron tight-binding Hamiltonian exploring its distinct aspects [14–18]. Focusing on the DNA case, the model consider Watson–Crick pairs attached to the sugar-phosphate backbone con-densed into a single nucleotide site. Although it was successful employed to describe numerous experimental data [8], it has some critical assessment [19]. A relevant consideration is the topology of the double-helix, which is not a rigid object, with the different constituents of DNA moving relative to each other presenting lin-ear deformations of its structure in response to the charge arrival at this particular site (polaronic effects) [20].
In general lines, the DNA Hamiltonian is constructed by as-suming that the transmission channels are along their longitudinal axis, consisting of a π -stacked array of DNA nucleobases formed by a symbolic sequence of a four letters alphabet, namely guanine (G), adenine (A), cytosine (C ) and thymine (T ) [21,22]. It is important to emphasize that under this formalism, the effective model of real DNA segments corresponds to a low-dimensional disordered struc-ture. Therefore, the electronic eigenstates become localized due to the scattering by the intrinsic disorder (Anderson localization), re-sulting in an insulator-like behavior [23].
Several mechanisms have been considered to provide a good understanding of the electronic transport properties of the DNA molecule, some of them related to the internal DNA correla-tions [24,25]. For instance, the presence of long-range correlations within the disorder distribution can promote electronic delocal-ization [26]. However, an instructive debate within the literature
http://dx.doi.org/10.1016/j.physleta.2016.07.0690375-9601/© 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
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suggests that the type of correlations present in real DNA segments is not strong enough to play a major role in their electronic trans-port. Besides, disorder effects in synthetic DNA-segments can be minimized, opening up the way to tailor the electronic properties required to operate distinct device functions [27,28].
The focus of this work is on the investigation of the electronic charge transport properties in a poly-GC DNA segment. Specifi-cally, we are interested to identify an electrical signature due to the presence of methyl groups randomly connected to the cyto-sine nucleobases in this structure, the so-called 5-methylcytosine, a well-studied epigenetic pathway implicated in gene expression control and disease pathogenesis. Usually, the 5-methylcytosine-based DNA methylation occurs through the covalent addition of a methyl group at the 5-carbon of the cytosine heterocyclic aromatic ring by an enzyme called DNA methyltransferase, a very important repressor of transcription in the human genome which contains over 60% repetitive DNA, much of which being transposable se-quences of viral origin that are kept inactive in part by DNA methy-lation [29,30]. Unfortunately, a growing number of human diseases have been found to be associated with aberrant DNA methylation, leading to new and fundamental insights about the roles played by DNA methylation and other epigenetic modifications on the human genome in the form of epigenetic marks that are heritable during cell division but do not alter the DNA sequence [31].
One of the most complex and challenging question is how to detect small methylation fractions along DNA segments. Consid-ering that, we set up here a quantum Hamiltonian approach to describe electronically a finite poly-GC segment with a variable methylation fraction p and nearest-neighbor hopping terms, to nu-merically compute its density of states, electronic transmittance profiles, and the current–voltage (IxV) characteristic curves, look-ing for a kind of signature that can be useful for the development of nanodevices as diagnostics tools for methylation-related dis-eases.
2. Theoretical model
Our theoretical model consists of a quantum one-dimensional tight-binding Hamiltonian describing a methylated single-strand poly-GC DNA sandwiched between two metallic electrodes, namely:
H =∑
n
ϵn|n >< n| +∑
(n,m)
tn,m(|n >< m| + c.c) + H L + H R . (1)
Here, ϵn represents the on-site energy related to the poly-GC seg-ment, (n, m) represents a sum over nearest-neighbor sites, and tn,m is the hopping term between the poly-GC DNA basis. Also H L and H R mean the quantum Hamiltonian describing the left and right metallic electrodes, respectively. Following [32], we will consider these electrodes as metallic systems whose Hamiltoni-ans have diagonal ionization energy term ϵE = 5.36 eV and non-diagonal internal hopping tE = 12 eV. The coupling between the methylated single-strand poly-GC DNA and the semi-infinite metal-lic electrodes is measured by a hopping amplitude tE P = 0.63 eV. The on-site distribution of the poly-GC segment is, from the the-oretical point of view, an alternate sequence of cytosine (C ) and guanine (G) basis, whose ionization energies (hopping amplitudes) are ϵC = 8.87 eV and ϵG = 7.75 eV (tC G = 0.282 eV and tGC =0.144 eV). The 5-methylcytosine-based DNA methylation, taking into account the attachment of methyl groups in the 5-carbon of a random fraction p of the cytosine basis, is characterized by an ion-ization energy (hopping term) ϵM = 7.02 eV (tMG = 0.145 eV and tGM = 0.210 eV).
Having defined the Hamiltonian model, we now briefly describe the methodology employed to investigate the electronic transport in a finite methylated synthetic poly-GC DNA segment with N ba-sis, starting from the calculation of the electronic density of states
of long segments (D O S) by using the Dean’s method [33]. To do that, we solve the secular equation det(HGC − E I) = 0, where E is the eigenvalue, I is the identity operator, and HGC is the Hamilto-nian of the methylated poly-GC DNA segment, i.e., the Hamiltonian of eq. (1) without the electrodes terms.
Defining a polynomial gm(E) (with m = 1, ..., N , N being the number of nucleobases), such that gN (E) = det(HGC − E I), the use of the co-factors method yields hm(E) = E −ϵM −t2
MG/hm−1, where hm = gm(E)/gm−1(E). The integrated density of states (I D O S) then follows by taking into account the signal changes in the set of the hm functions. Furthermore, the density of states (D O S) is thus obtained by using a simple direct numerical derivative D O S =d(I D O S)/dE .
Due to the random nature of methylation of cytosine sites, the electronic eigenstates become exponentially localized (Anderson localization) on very long single strand DNA’s geometry, strongly suppressing its electronic transmission spectrum. However, finite transmission can still be achieved in shorter DNA’s segments as-sociated to the presence of resonant states. In what follows, we will explore the electronic transmission spectra by considering a shorter DNA’s finite segment with N = 30 bases, closer to the real-istic size of a DNA primer, which is a short single strand structure that serves as a starting point for the DNA synthesis. For such realistic DNA’s segments, the DOS is composed of a sequence of delta-like peaks signaling the eigenstates of the finite Hamiltonian matrix.
The transmission coefficient is computed by considering a plane wave being injected at one of the ends of the methylated poly-GC single strand segment. The transmission coefficient T N (E), that gives the transmittance spectra through the chain and is related to the Landauer resistance, is then defined by [21]:
T N(E) = (4 − X2(E))
[−X2(E)(P12P21 + 1)
+ X(E)(P11 − P22)(P12 − P21) +∑
i, j=1,2
P2i j + 2
]−1
,
(2)
where X(E) = (E − ϵ j)/t j , and Pi j are elements of the transfer matrix P = M(N + 1)M(N − 1) · · · M(2)M(1)M(0), with [34]
M( j) =(
X(E) −t j−1/t j1 0
). (3)
Here the matrix M( j) is computed using the methylated poly-GC segment. Also, M(0) and M(N +1) represent the local transfer ma-trix related to the contacts at the ends of the poly-GC DNA model. For a given energy E , T N(E) measures the level of backscattering events for electrons (or holes) transport through the chain.
The transmission coefficient T N (E) is a useful quantity to de-scribe the transport efficiency in quantum systems. However, from the experimental point of view, the electronic transport properties are more easily investigated by measuring their current–voltage (IxV) characteristics curves. The theoretical calculation of the IxV curves can be done by applying the Landauer–Büttiker formulation [35,36], i.e.:
I(V ) = 2eh
+∞∫
−∞T N(E)[ f L(E) − f R(E)]dE, (4)
where f L(R)(E) is the Fermi–Dirac distribution at the left (right) side of the electrodes, i.e.:
f L(R) =[
exp [(E − E F ∓eV /2)/kB T ] + 1]−1
. (5)
F.A.B.F. de Moura et al. / Physics Letters A 380 (2016) 3559–3563 3561
Fig. 1. Electronic density of states (D O S) calculated by using the Dean’s method for a long single-strand methylated poly-GC segments with N = 105 and methyla-tion fractions p = 0, 0.15, 0.3, and 1.0. For p = 0 and p = 0, the D O S exhibits two sub-bands around E ≈ϵC and ϵG (p = 0) and E ≈ϵM and ϵG (p = 1), i.e. profiles quite compatible with a crystalline chain with two distinct atoms within the uni-tary cell. We also observe that the D O S of the non-methylated and fully methylated segments exhibit smooth profiles. For 0 < p < 1, a finite fraction of the cytosine nu-cleobases suffers the methylation process, and the D O S smooth profile is degraded by the presence of the disorder.
The Fermi level energy E F is properly located at the lowest characteristic resonances of the electrode—5-methylcytosine-based DNA methylatione—electrode nano-junction, namely the ionization energy of the guanine ϵG . Besides, we have considered T = 310 K (the mean body temperature) in such a way that the thermal en-ergy kB T << E F . The resulting IxV curves then will correspond to the low-temperature regime of the conducting electrons.
In order to calculate the IxV profiles, the transmission coeffi-cient will be considered to be bias-dependent by assuming that the potential energy at one of the ends is ϵ∗
E = 5.36 + eV (in units of electron-volts), where V represents the voltage and e the elec-tron charge. Further details of the above methodology can be found in [37–39].
3. Results and discussions
The Dean’s method is computationally efficient and allows us to calculate the electronic density of states (D O S) for large methy-lated poly-GC segments. In our calculations we used N = 105 basis in order to clearly unveil the methylation influence on the D O Sprofile, as depicted in Fig. 1 which shows a normalized electronic density of states versus the energy E for the methylation frac-tions p = 0, 0.15, 0.3 and 1.0. We emphasize that the case p = 0represents a crystalline poly-GC segment with no methylated cyto-sine sites, while for p > 0 a finite fraction of cytosine suffers the methylation process. p = 1 stands for the fully methylated chain. Observe that for the non-methylation (p = 0) and fully methy-lated (p = 1) cases, the D O S exhibits a profile quite compatible to crystalline chains with two distinct atoms within the unitary cell. Indeed, two sub-bands are found around E approximately equal to the ionization energies of the cytosine and guanine basis for p = 0and around the methylated cytosine and guanine basis for p = 1. Furthermore, the electronic density of states exhibits a smooth
Fig. 2. Transmission coefficient T N (E) versus the energy E for: (a) N = 30, V =0 and methylation fractions p=0, 0.15, 0.3 and 1.0; (b) as in (a) but considering N = 60. For p = 0 and p = 1 the transmission coefficient is close to unity within the bands of allowed energies, in good agreement with the crystalline behavior of the poly-GC and poly-GM chains. For 0 < p < 1 the presence of a finite fraction of methylated cytosine decreases the electronic transmission due to the intrinsic disorder characteristic of the methylated poly-GC chain.
profile with typical Van Hove singularities of translational invari-ant crystalline systems. The smoothness of the D O S results from the effective level repulsion of the extended energy eigenstates. When methylation occurs (0 < p < 1) the smooth profile of the D O S is degraded since the presence of methyl groups randomly distributed along the chain introduces a small disorder distribu-tion. Therefore, under the presence of disorder, one-dimensional systems exhibit localized states and the D O S displays a rough pro-file, a signature of the absence of level repulsion for exponentially localized states [40].
Fig. 2(a) presents the transmission coefficient T N (E) versus en-ergy E for the case where there is no bias voltage V by considering
3562 F.A.B.F. de Moura et al. / Physics Letters A 380 (2016) 3559–3563
Fig. 3. Current–Voltage (IxV) curves computed by using the Landauer–Büttiker for-malism. The curves exhibit a strong dependence on the methylation fractions p. As we increase their concentration the saturation current Isat substantially decreases, detecting the methylation within the poly-GC segments. Inset: the effective ohmic resistance R (in M#) versus the concentration of the methylation fraction p. We measure R by computing the numerical derivative dV /dI around V = 0.
the number of nucleobases N = 30, and the methylation fractions p = 0, 0.15, 0.3 and 1.0. For comparison, Fig. 2(b) depicts the case in which the number of nucleobases N = 60. The average transmission becomes small at longer chains due to the Anderson localization of the energy eigenstates. In short chains, the trans-mission peaks reflect the presence of resonant states. Our results for p = 0 (i.e. the crystalline poly-GC model) are in good agree-ment with similar calculations found in the literature [37–39]. We emphasize that the specific parameter set used here is an intrinsic characteristic of the modeled system. However, despite the set of values considered, the periodic poly-GC model represents a crys-talline system, and high electronic transmission can be readily anticipated. As one can see in Figs. 2(a) and 2(b), the transmis-sion coefficient T N (E) is in fact close to unity for the pure poly-GC case (no methylation fraction, i.e., p = 0) as well as for the pure poly-GM chain p = 1 within the nads of allowed energies. As we increase the concentration of methylated cytosines (0 < p < 1), one can observe a considerable deterioration of the degree of transmit-tance, although some resonant modes appears around the on-site energy of the methylated cytosine as a precursor of the low energy transmission band that sets up at p = 1. For 0 < p < 1, the poly-GC DNA structure loses its translational invariance, becoming a disordered chain. Therefore, the eigenstates become exponentially localized and the transmission coefficient T N (E) decreases as the system size N is increased. Notice that the sub-band with energies around the cytosine’s ionization energy ϵC feels more drastically the effect of the presence of methylated cytosine sites. We can un-derstand this feature by recalling that the high-energy eigenmodes are more sensitive to the presence of disorder. Therefore, the trans-mission band around ϵM develops quickly as p increases while the transmission band around ϵc is rapidly degraded.
As evidenced above, both the electronic density of states and the transmission coefficient exhibit a great sensibility in the pres-ence of the methylated cytosine concentration p, being useful to detect the presence of methylation within poly-GC segments. How-ever, current–voltage (IxV) curves are the usual experimental quan-tifiers of electronic transport characteristics, as depicted in Fig. 3, considering the unity of the computed current (bias) µA (Volt). We have taken N = 30 basis and distinct methylation fractions p, setting the Fermi level within the first sub-band (E F = ϵG ). There-fore, the transmission coefficient, although small, is not null for
p > 0, leading to a finite transmission near the Fermi level, and thus promoting an ohmic behavior for small voltages V .
By further analyzing the IxV characteristic curves depicted in Fig. 3, we observe this ohmic behavior close to the zero bias re-gion characterized by a linear curve I(V ) = −I(−V ), besides a strong sensitivity to the presence of the methylated cytosine con-centration. As we increase the methylation fraction p, the current I(V ) decreases, implying that the IxV curves can probe methyla-tion in poly-GC segments. Note that the current saturates in the large bias regime in which electrons in the entire conducting band contribute. The saturation current decreases by approximately one order of magnitude for a p = 0.3 methylation fraction.
In the inset of Fig. 3, we plot the effective ohmic resistance R (in M#) versus the concentration of methylated cytosine p, by computing the numerical derivative dV /dI around V = 0. Our re-sults show clearly the sensitivity of the electric conductance of poly-GC segments regarding the presence of the methylated cy-tosine concentration, with the resistance also changing up to one order of magnitude. It saturates at a maximum value and decreases for larger methylation fractions. This feature is related to the fact that the system recovers its periodicity when all cytosine basis are methylated. Therefore, IxV curves and localization characteristics may be an useful tool to detect the presence of methylated cyto-sine in DNA-like segments, being a kind of important signature for methylation-related diseases.
4. Summary and conclusions
In summary, we investigated some electronic transport char-acteristics of a single-strand methylated poly(GC) DNA segment considering the possibility that methyl groups can be attached to a finite fraction of the cytosine sites in a random way. After the methyl group is attached to a specific cytosine, both its ioniza-tion energy and nearest neighbor hopping are modified. Our main aim was the investigation of the effects of methylated cytosine concentration on the electronic transport along poly(GC) DNA-like segments, modeling this system by a quantum one-electron Hamil-tonian containing nearest-neighbor hoppings, as well as the on-site poly-GC basis ionization energies.
Our results suggest that the localization properties, as well as the IxV curves, may be used as an important biosensor to de-tect the presence of methylated cytosines, which considerably de-grade the electronic transport in poly-GC chains. We numerically demonstrated that the effective resistance of methylated synthetic poly-GC segments increases by up to one order of magnitude when the concentration of the methylated cytosine p is increased. Con-sidering that methylation is an important mechanism related to several biological processes, the present results suggest that mea-surements of standard electronic characteristics can be used as a suitable witness of methylation in DNA segments.
Acknowledgements
This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies CAPES (PROCAD), CNPq (INCT-Nano(Bio)Simes, Procad-Casadinho), FAPERN, and FAPEAL.
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Charge transport properties of a twisted DNA molecule: Arenormalization approach
M.L. de Almeida a, G.S. Ourique a, U.L. Fulco a, E.L. Albuquerque a,⇑, F.A.B.F. de Moura b, M.L. Lyra b
aDepartamento de Biofísica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal-RN, Brazilb Instituto de Física, Universidade Federal de Alagoas, 57072-900 Maceió-AL, Brazil
a r t i c l e i n f o
Article history:Available online 4 June 2016
Keywords:Tight-binding HamiltonianRenormalization approachTwisted DNA segmentElectronic transmittance spectraI ! V characteristic curves
a b s t r a c t
In this work we study the charge transport properties of a nanodevice consisting of a finite segment of theDNA molecule sandwiched between two metallic electrodes. Our model takes into account a nearest-neighbor tight-binding Hamiltonian considering the nucleobases twist motion, whose solutions makeuse of a two-steps renormalization process to simplify the algebra, which can be otherwise quiteinvolved. The resulting variations of the charge transport efficiency are analyzed by numerically comput-ing the main features of the electron transmittance spectra as well as their I ! V characteristic curves.
! 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Due to the increase diversification of materials requiring speci-fic electronic properties, nowadays research in charge transporthas been changing its focus from solid-state crystals to organicmolecules [1–3]. One of the main reason for that is the use of dif-ferent physical and biochemical methods on important biologicalpolymers, since the approaches to these molecules should be fun-damentally different from those working for any other inorganic ornon-bioorganic substance. As a consequence, their structural anddynamical behavior is much more complicated than that eitherartificial polymers or conventional materials. The net result is therecognition of novel functional materials surpassing in many waysthe conventional ones, as well as unraveling their novel and impor-tant mechanisms [4–7].
The transmission and conduction processes of the DNA chargetransport between two conductors electrodes is a challenger struc-tural problem associated not only to the design and construction ofsuch junctions, but also to the need to understand their macro-scopic transport properties, the output being the transformationof structural DNA nanotechnology to practical applications as animportant component in nano-electronic devices. Indeed, basicproperties pertaining to single electron transistor behavior and tocurrent rectification of a molecular device made up of an oligopep-tide chain directly coupled to two platinum electrodes have
already been demonstrated [8]. More intriguing still, and a chal-lenge for biochemists today, is the consideration of the conse-quences and opportunities for charge transport through the DNAbase pair stack within the cell.
A variety of experimental approaches have been used to probethe charge transport in biological molecules, mainly those relatedwith DNA and proteins, a scientific advance bridging the molecularworld to the world where we live. In particular, earliest studiesinvolved physical measurements of current flow in DNA segmentslead to a mixture of conclusions, some suggesting high electronmobility, while others indicating opposite conclusions [9–12].Some years ago, the conductivity of DNA duplexes bridging a car-bon nanotube gap have been measured. The observed resistancethrough stacked DNA bases was found to be comparable to theresistance perpendicular to graphite planes [13]. More recently,experiments on DNA charge transport in 100-mer monolayers ongold have demonstrated an efficient transport over distances aslarge as 34 nm [14], thus exceeding that of most reports of molec-ular wires. As a result, charge transport in biological molecule hastriggered recently a series of theoretical and experimental investi-gations (for a recent review see [15] and the references there in).
Theoretical models devised to study the electronic transport inDNA molecules assume that the transmission channels are alongtheir longitudinal axis. A p-stacked array of DNA nucleobases,formed by a symbolic sequence of a four letters alphabet, namelyguanine (G), adenine (A), cytosine (C) and thymine (T), providesthe way to promote long-range charge migration, which in turngives important clues about the mechanisms and biological
http://dx.doi.org/10.1016/j.chemphys.2016.05.0200301-0104/! 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
⇑ Corresponding author.E-mail address: [email protected] (E.L. Albuquerque).
Chemical Physics 478 (2016) 48–54
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functions of charge transport [16–20]. Based on these previousworks and the related literature, there is a vast collection of possi-ble theoretical mechanisms to provide electronic transport in DNA(or low-dimensional molecules). A central point to emphasize isthat DNA is a low-dimensional disordered structure and therefore,the electronic eigenfunctions become exponentially localized dueto the scattering by the intrinsic disorder (Anderson localization).Some authors proposed that internal DNA correlations could berelevant to promote charge transport. Although the presence oflong-range correlations within the disorder distribution in DNAcan in fact increase the electronic localization length, it has beenshown that it does not have a significant impact on the localizednature of the states [21,22]. However, the distinct character ofthe intrinsic base pair correlations in coding and non-coding DNAsegments has been shown to produce measurable differences inthe electronic properties of intron and exon-like segments [23].
Usually charge transfer studies for a wide variety of systems,including organic materials such as the DNA molecule, are basedon the Schrödinger equation in the tight-binding approximationfor both random and quasiperiodic sequences of the on-site poten-tial !n and/or the hopping potential tnm between the quantumstates jni and hmj, the former (latter) leading to Anderson localiza-tion (Cantor set of zero Lebesgue measure). Focusing on the DNAcase, the model consider a simplified vision of the Watson–Crickpairs attached to the sugar-phosphate backbone condensed intoa single nucleotide site. Although it was successful employed todescribe numerous experimental data [15], it has some criticalassessment, as discussed by Shinwari et al. [24]. One key point isthe ‘‘one-orbital-per-site” picture, insufficient in some aspect tocharacterize the quantum state. A reasonable solution is the adop-tion of nucleotide pairs instead of the separate nucleotides todefine the tight-binding quantum states by using more sophisti-cated quantum chemistry models such as the DFT (Density Func-tional Theory) approach, whose accuracy is achieved at a greatercomputer cost. Other relevant consideration is the topology ofthe double-helix, which is not a rigid object, with the different con-stituents of DNA moving relative to each other presenting lineardeformations of its structure in response to the charge arrival atthis particular site (polaronic effects), beyond the scope of the pre-sent work. The presence of water molecules and counterions inter-acting with the nucleobases and the backbone can be taken intoaccount by considering a realistic value of the backbone ionizationenergy. Fortunately, we do not expect any relevant change by con-sidering these refinements in our tight-binding model, keeping themain features of our results unaffected.
In this work, we use a model Hamiltonian within a two-stepsrenormalization approach to describe the charge transport proper-ties of a twisted DNA molecule following the model described in[25,26]. Our description of the DNA molecule takes into accountthe contributions of the nucleobase system as well as the sugar-phosphate backbone molecules on a tight-binding Hamiltonianmodel. The DNA’s helicoidal structure is considering by means ofnot only the longitudinal intra-chain hopping term but also thetwist angle hn;n"1 between two adjacent base pair (n;n" 1)attached along the molecule backbone. The resulting variationsof the charge transport efficiency are analyzed by numericallycomputing the main features of their transmittance and I ! V char-acteristic curves.
This paper is organized as follows: in Section 2 we present ourtheoretical approach based on a tight-binding model Hamiltoniansolved by the help of a two-steps renormalization process. Section 3deals with the discussion of the charge transfer properties, bymeans of the electronic transmittance spectra and the current–voltage (I ! V) characteristic curves. The conclusions and perspec-tive of future works are depicted in Section 4.
2. Theoretical model
We use a tight-binding model Hamiltonian to describe thecharge transport properties of a DNA molecule sandwiched bytwo metallic electrodes (the source#S and the drain#D contacts),considered to be platinum, with a single orbital per site and near-est-neighbor interactions (see Fig. 1a). Our description of the DNAmolecule takes into account the contributions of the nucleobasesystem, considering both the base pairing between the comple-mentary strands and the stacking interaction between nearest-neighbor bases, as well as the sugar-phosphate backbone, yielding:
Htotal ¼ HDNA þ Helectrode þ Hcoupling : ð1Þ
Here, the first term HDNA describes the inter and intra-strandcharge propagation through the DNA molecule, the second termHelectrode is related to the two metallic electrodes, while the lastterm Hcoupling describes the coupling between the DNA strand andthe semi-infinite metallic electrodes.
A relevant feature to be considered here is the inclusion oftorsional effects, responsible for the helicoidal DNA structure. Thiseffect was already considered in earlier works [27–31]. Its role isquite important since in physiological conditions the DNA’s doublehelix structure exhibits a full-fledged three-dimensional geometry.As a consequence, every two consecutive nucleobases aretwisted by a certain angle hn;n"1 (in equilibrium conditionshn;n"1 ¼ h0 ¼ p=5), and therefore the orbital overlapping is substan-tially reduced, yielding smaller values for the hopping integralvalues [32,33]. In addition, at physiological temperatures the rela-tive orientation of neighboring bases becomes a function of time,thereby modifying their mutual overlapping in an oscillatory way(dynamical effect). Twisted DNA model was also considered[34,35] using a path integral formalism to study the thermody-namics of a short fragment of heterogeneous DNA interacting witha stabilizing solvent on the temperature range in which denatura-tion takes place.
Considering the nucleobases as identical point masses, helicallyarranged and mutually connected by means of elastic rods, whichdescribe the sugar-phosphate backbone, the position of the nthnucleobase can be expressed in cylindrical coordinates as
xn ¼ rn cos/n; yn ¼ rn sin/n; zn ¼ r0/n; ð2Þ
where n labels the considered base-pair along the DNA doublestrand, rn and /n are the usual cylindrical coordinates, andr0 ¼ h0=h0; h0 ( 0:34 nm being the equilibrium separation betweentwo successive base-pair planes (B-DNA form). Thus, the geometri-cal distance between two neighboring nucleobases can beexpressed as [31]
dn;n"1 ¼ r20h2n;n"1 þ r2n þ r2n"1 # 2rnrn"1 coshn;n"1
h i1=2; ð3Þ
where, hn;n"1 ¼ "/nþ1 ) /n. In equilibrium conditions
dn;n"1 ¼ l0 ¼ h20 þ 4r2n sin
2ðh0=2Þh i1=2
: ð4Þ
Following the procedure described in Refs. [32,31], and consid-ering that the atomic orbitals are orthogonal to each other, in theequilibrium condition (dn;n"1 ¼ l0) the full 3D description of thehelix geometry yields, for the longitudinal intra-chain hoppingterm:
tLðhn;n"1Þ ¼ tLðhtÞ ¼ tLð0Þ 1# g 2r0l0
sinhn;n#1
2
! "2" #
: ð5Þ
Here
g¼ 1þ jgpppj=gppr; ð6Þ
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where gppp and gppr describe the hibridization matrix elementsbetween neighboring bases pz orbitals [32]. Further simplificationcan be done, if one considers the propagation of low-frequencytwist oscillations (acoustic modes), leading to a small (althoughnon-zero) fixed twist angle ht , i.e.:
tLðhtÞ ¼ tLð0Þð1# vh2t Þ: ð7Þ
Here, v is a dimensionless coupling strength between the chargeand the lattice system. For small twists, v ¼ 2:92 [31].
In order to get a simple mathematical description of the DNAmolecule, keeping most of its relevant physical information, weuse now a two-steps renormalization process. In the first step wemapped the full DNA chain into a linear diatomic lattice (seeFig. 1b). Afterwards, we renormalize the linear diatomic lattice intoa one-dimensional lattice shown in Fig. 1c, reducing the elevenphysical parameters, namely:
(a) the ionized energies !SP (sugar-phosphate backbone) and !a(abeing the four nitrogen bases A; T;C;G);
(b) the hopping terms ta (between the nitrogen bases and thesugar-phosphate backbone) and tab (the transverse hoppingbetween the nitrogen bases).
into three variables only, the hopping term tL (the longitudinal hop-ping between the nitrogen bases) and the ionized energies CjðEÞ(j ¼ 1;2), defined by:
C1ðEÞ ¼ tCG þX
a¼C;G
s2aðEÞE# !SP
; ð8Þ
with
saðEÞ ¼ taþ!aðE# !SPÞ
ta; a¼ C;G: ð9Þ
The term C2ðEÞ can be obtained from Eqs. (8) and (9), providedwe replaced C;G by A; T.
The energies !a are chosen from the ionization potential of theirrespective bases. Taking into account explicitly the contribution ofwater molecules, their experimental values are [36–40]: !A = 7.7 eV(adenine), !T = 8.1 eV (thymine), !G = 7.4 eV (guanine), and!C = 8.1 eV (cythosine). We use the energy of the electrode (plat-inum) !M = 5.36 eV, which is related to the work function of thismetal [41]. The energy of the sugar-phosphate backbone is!SP = 12.27 eV, justified by the presence of a number of counterionsand water molecules, located along the DNA backbone structure,interacting with the nucleobases and the backbone itself by meansof hydration, solvation, and charge transfer processes [25]. We takethe hopping potentials between the base (G;C;A or T) and thesugar-phosphate (SP) backbone as tG ¼ tC ¼ tA ¼ tT = 1.0 eV, whilethe hopping between the base pair intra (inter)-chain istLð0Þ ¼ 0:15 eV (tGC ¼ 0:9 eV and tAT ¼ 0:3 eV, respectively) [25],which are within the range of values obtained by quantum
Fig. 1. Sketch illustrating the renormalization process mapping the DNA chain model (a), first into a linear diatomic lattice (b), and then a linear monoatomic lattice (c),reducing the eleven physical parameters, namely, the ionized energies !SP (sugar-phosphate backbone) and !a (abeing the four nitrogen bases A; T;C;G), and the hoppingterms ta (between the nitrogen bases and the sugar-phosphate backbone) and tab (the transverse hopping between the nitrogen bases), into three variables only, the hoppingterm tL (the longitudinal hopping between the nitrogen bases) and the ionized energies CjðEÞ (j ¼ 1;2).
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chemistry calculations [42]. Furthermore, the hopping term in theelectrode is t0 = 12.0 eV [43].
Now considering the renormalization procedure depictedschematically in Fig. 1, the first term of the Hamiltonian (1) isdescribed by
HDNA ¼X
j¼1;2
X
n
CjðEÞjn >< njþX
n
tLðhtÞjn >< n" 1j: ð10Þ
The second term, related to the two semi-infinite metallic elec-trodes, reads:
Helectrode ¼X0
n¼#1!M jn >< njþ t0jn >< n" 1j½ +
þX1
n¼Nþ1
!Mjn >< njþ t0jn >< n" 1j½ +; ð11Þ
where !ðMÞ (t0) is the ionized energy (hopping term) of the elec-trode. Our DNA molecule is coupled to the electrodes by the tunnel-ing Hamiltonian
Hcoupling ¼ tM j0 >< 1jþ jN >< N þ 1j½ +; ð12Þ
where tM ¼ 0:63 eV represents the hopping amplitude between thesource (drain) electrode and the beginner (end) of the DNA base-pair structure, N being the number of nucleotides in the structureunder consideration [44].
3. Results and discussions
Considering the tight-binding Hamiltonian given above, thetransmission coefficient TNðEÞ, that gives the transmission ratethrough the chain and is related to the Landauer resistance, isdefined by [21]
TNðEÞ¼4#X2ðEÞ
½#X2ðEÞðP12P21þ1ÞþXðEÞðP11#P22ÞðP12#P21ÞþX
i;j¼1;2
P2ijþ2+
;
ð13Þ
where
XðEÞ ¼ E#X
j¼1;2
CjðEÞ
" #,
tLðhtÞ; ð14Þ
and Pij are elements of the transfer-matrixP ¼ MðNÞMðN # 1Þ , , ,Mð2ÞMð1Þ, with [45]
MðjÞ ¼XðEÞ #11 0
! ": ð15Þ
For a given energy E; TNðEÞ measures the level of backscatteringevents in the electrons (or hole) transport through the chain.
Fig. 2 depicts the transmittance spectra as a function of theenergy (less the Fermi energy) in units of eV, for the Poly GCsequence, in which C1ðEÞ– 0 and C2ðEÞ ¼ 0 (Fig. 2a), Poly ATsequence, in which C1ðEÞ ¼ 0 and C2ðEÞ– 0 (Fig. 2)b, and PolyGCAT sequence in which C1ðEÞ and C2ðEÞ are different of zero(Fig. 2c). We have considered the Fermi energy equal to the gua-nine’s ionization energy for the Poly GC and Poly GCAT structures,and adenine’s for the Poly AT one. Also N, the number of nucleo-tides, is equal to 24, and the torsion angle ht ¼ 0 (black full line)and p=10 (blue full line). The transmittance spectra show severalenergies with high transmission resonances [TNðEÞ ¼ 1+, besides astriking symmetry around the energies 1.71 (Poly GC, seeFig. 2a), 1.46 (Poly AT, see Fig. 2b) and 1.21 (Poly GCAT, seeFig. 2c), all units in eV, independent of the value of the torsionangle h. The reason for the former (symmetrical spectra) is dueto the periodicity of the DNA structures considered here, as
depicted in Fig. 1, since for quasi-periodic DNA structure theenergy spectra exhibit distinct physical properties, giving rise toa novel description of disorder. Indeed, theoretical transfer matrixtreatments can be used to show that these spectra are fractals,defining intermediate systems between a periodic and a randomstructure [46]. The independence on the torsion angle h lies onthe role played by the sugar-phosphate backbone ionizationenergy !SP . Indeed, the expected two transmission bands aroundthe ionization energies of the Guanine-!G and Cytosine-!C (Ade-nine-!A and Thymine-!C) basis for the Poly GC (Poly AT) structure,formed when the backbone ionization energy !SP is equal to zero,progressively approach each other as !SP increases, leading to theone band structure depicted in Figs. 2,a 2,b and 2c for its realisticvalue considered here [47]. This profile is insensitive to theadopted value for the hydrogen bonding strength (tGC ¼ 0:9 eVand tAT ¼ 0:3 eV, respectively) responsible for the binding of thecomplementary DNA strands, because its energetic value is muchless than the backbone ionization energy !SP = 12.27 eV, justifiedby the presence of a number of counterions and water molecules.
It is important to mention that stationary electron transmissionspectra through finite DNA chains is usually investigated through-out a dynamical map, as it is quite common in quasi-periodic sys-tems. According to that, the electronic transmission propertiespresent localization of the electronic wave functions, in despiteof the fact that long-range correlations in DNA finite segmentscould be a possible mechanism to induce delocalization. However,the actual correlations are not strong enough to produce this cor-relation-induced transition and the stationary states remain alllocalized [21,22]. For inhomogeneous random sequences, the sce-nario is worst since almost all states are strongly localized andthe electronic transport is dominated by dissipative processes.Nevertheless, as in our case, the presence of long-range correla-tions due to the periodicity of the renormalized structure mightenhance the localization length and, therefore, the transmissionresonances survive in larger segments as compared with a non-correlated random sequence.
The transmission coefficient TNðEÞ is a useful quantity todescribe the transport efficiency in quantum systems. Nonetheless,TNðEÞ is usually difficult to be directly measured experimentally.Access to transmission properties can be performed by measuringtheir I ! V characteristics by applying the Landauer-Büttiker for-mulation [48,49], i.e.:
IðVÞ ¼ 2eh
Z þ1
#1TNðEÞ½f SðEÞ # f DðEÞ+dE; ð16Þ
where f SðDÞ is the Fermi–Dirac distribution given by:
f SðDÞ ¼ exp½ðE# lSðDÞÞ=kBT+ þ 1h i#1
: ð17Þ
Here lSðDÞ is the electrochemical potential of the two electrodesfixed by the applied bias voltage V as j lS # lD j¼ eV. Before that,the electrochemical potential of the whole system is taken to bezero. It must be kept in mind, however, that the determination ofthe electronic properties of biological molecules such as DNA seg-ments, should be done taking into account a transport theory con-sidering the time evolution of the appropriate charge propagation,as depicted in Eq. 1. The reason for that is because static solid-statetheory is not capable of capturing all aspects of the charge transferdynamics in biomolecules.
As V is switched on, by properly locating the Fermi level energyequal to the lowest characteristic resonances of the electrode-DNAmolecule-electrode nano-junction, namely guanine for the Poly GCand Poly GCAT structures, and adenine for the Poly AT one, thetransmission coefficient becomes voltage-dependent leading tothe appearance of transmission band shifts. As a result, the I ! V
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curves may show a current rectification due to the appearance ofeither a lower or a higher current at a given bias [8]. Nonetheless,the turn-on current here shows a symmetric profile, with eithernone or a negligible rectification current, as depicted in Figs. 3a(Poly GC), 3b (Poly AT) and 3c (Poly GCAT) for several torsionangles.
Fig. 3a shows the Poly GC current–voltage profiles for torsionangles ht = 0 (black full line), ht ¼ p=30 (red full line), ht ¼ p=15(green full line) and ht ¼ p=10 (blue full line). All of them presentan ohmic region #2.5 V 6V 62.5 V, and symmetric regions other-wise, indicating a semiconductor behavior which can be attributedto the resonant dipoles of the DNA segment leading to an overalldepletion region effect. This behavior can be explained by the tun-neling of electrons under an energy barrier between adjacent local-ized states of the basis so that electrons can travel through the
molecule mainly by the hopping mechanism. The localized statesmay be located in the vicinity of the Fermi energy of the electrodes,so that when voltage bias is applied, the Fermi energy alignes witha localized state and the charge electron transport is initiated. Norectifying behavior is observed indicating that the charge transportin the highest occupied molecular orbital (HOMO) of the Poly GCDNA, located at the guanine base, is of the same magnitude of itslowest unoccupied molecular orbital (LUMO), located at the cyto-sine base, when the voltage bias is applied to the sample. It isworth mentioning that the observed symmetry might be contam-inated by a residual Schottky effect from the contacts, as measuredby the contribution of Helectrode depicted in Eq. 11. The maximumvalue of the current, obtained when there is no torsion angle, is8.26 lA. Observe that as the torsion angle ht increases, the absolutevalue of the current decreases indicating a transition towards an
Fig. 2. Transmittance spectra as a function of the energy (less the Fermi energy, which is equal to the guanine’s ionization energy for the Poly GC and Poly GCAT structures,and adenine’s for the Poly AT one) in units of eV considering N (the number of nucleotides) equal to 24, and a torsion angle ht ¼ 0 (black full line) and p=10 (blue full line). (a)DNA Poly GC; (b) DNA Poly AT; (c) DNA Poly GCAT. (For interpretation of the references to colour in this figure caption, the reader is referred to the web version of this article.)
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insulator phase, reaching a critical value at ht approximately equalto p/7.5 (Poly GC); p/7 (Poly AT) and p/6.2 (Poly GCAT), all of thembelow the torsion angle ht ¼ p=5 between the base pairs of the B-form of DNA [50].
Fig. 3b (3c) shows a similar pattern for the Poly AT (Poly GCAT)current–voltage profiles for the same torsion angles. Observe thatfor the Poly AT case the curve without torsion angle (ht = 0, blackfull line), is hidden by the red curve corresponding to ht ¼ p=30.The maximum value of the current, is now 6.20 (7.06) lA.
4. Conclusions
In conclusion, by using an effective tight-binding model, wehave theoretically investigated the transport properties of a molec-ular device made up of a DNA double-helix molecule, including thesugar-phosphate contribution, directly coupled to two platinum
electrodes. The electronic transmittance and I ! V characteristicsare discussed in terms of its on-site ionization and electrode ener-gies, as well as its different hopping parameters. Overcoming thelimitations modeling the DNA trough two parallel chains, we havealso introduced a twist angle ht between two adjacent base pairattached along the molecule backbone. In order to get a simplemathematical description of the DNA molecule, keeping most ofits relevant physical information, we used also a two-steps renor-malization process to map it into a linear monoatomic lattice,allowing us to incorporate the sugar-phosphate backbone contri-bution into an energy-dependent on-site ionization potential onthe main DNA’s basepairs.
Future works in this field should point to the possibility ofdeveloping new sophisticated nanodevices integrating man-madenanostructures with different biomolecules, as well as the abovementioned DNA base pair stack within the cell. In doing so, care
Fig. 3. I ! V characteristic curves for torsion angles ht = 0 (black full line), ht ¼ p=30 (red full line), ht ¼ p=15 (green full line) and ht ¼ p=10 (blue full line). (a) DNA Poly GC;(b) DNA Poly AT; (c) DNA Poly GCAT. (For interpretation of the references to colour in this figure caption, the reader is referred to the web version of this article.)
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should be taken with the DNA’s spontaneous point mutations,whose plausible cause is the so-called rare tautomers arising fromthe proton transfer (PT) reactions between the base pairs doublehelix architecture of DNA proposed by Watson and Crick [51].Nano biomolecular sensors may be developed for the detectionof these point structural defects in DNA associated with the forma-tion of the mismatches of the canonical A-T and G-C Watson–Crickbase pairs [52–54]. Our I ! V characteristic curves, depicted inFig. 3, may shed some light on this biologically important question,in the same line as those developed in a previous work [55].Another important mechanism, besides the biological environ-ment, is the vibrational modes and the formation of polarons(the bound state of an electron with a lattice distortion). Surelythey might open up the possibility of monitoring and controllingcritical biological functions and processes in unprecedented ways,giving rise to a vast array of potential technological achievements.
Acknowledgments
This work was partially financed by the Brazilian ResearchAgency CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio) Simes andCasadinho/Procad).
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54 M.L. de Almeida et al. / Chemical Physics 478 (2016) 48–54
18th ICBPS Conference Proceedings, Miami-FL, USA, Vol. 18 (3) Part XII
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� Abstract— The focus of this work is on the numerical
investigation of the charge transport properties of the de novo-designed alpha3 polypeptide, as well as in its variants, all of them probed by gene engineering. The theoretical framework makes use of a tight-binding model Hamiltonian, together with ab-initio calculations within quantum chemistry simulation. The alpha3 polypeptide is a 21-residue with three repeats of the seven-residue amino acid sequence Leu-Glu-Thr-Leu-Ala-Lys-Ala, forming an alpha–helical bundle structure. Its variants are obtained by Ala→Gln substitution at the e (5th) and g (7th) position, respectively, of the alpha3 polypeptide amino acid sequence. Using transmission electron microscopy and atomic force microscopy, it was observed that the alpha3 polypeptide and one of its variant do have the ability to form fibrous assemblies, while the other does not. Our main aim is to investigate whether or not the biased alpha3 polypeptide and its variants can be also identified by quantum charge transport measurements through current-voltage (IxV) curves as a pattern to characterize their fibrous assemblies. It was observed that each peptide has a characteristic current pattern, which may be distinguished by charge transport measurements, suggesting that it might be a useful tool for the development of biosensors.
Keywords—Charge transport properties, Electronic transmittance,
Current-Voltage characteristics, Biological sensor.
I. INTRODUCTION The theoretical treatment of biologically active molecules forming the proteins is a mature, challenging, and active research area. Driven by important advances of quantum mechanical methods and increasing hardware performance, and mirrored by an astonishing number of computational studies devoted to the structural and conformational behavior of biomolecules, this subject has become nowadays an exciting field of research (for recent reviews see Refs. [1]-[2]). The main difficulties faced in the field involve taking into account the topology of the structures, as well as the high level of precision required to characterize the biomolecules, which often present a high degree of complexity, and must therefore be approached with approximate methods [3]. Specifically, the quest for a deeper understanding of the protein and polypeptide nanoelectronics remains a fundamental challenge. Besides being very promising for the development of electronics applications, it may pave the road for the development of many sophisticated devices, since it relates changes on the protein's molecular kinetic properties like
G.S. Ourique, U.L. Fulco and E.L. Albuquerque, are with the Department of Biophysics and Pharmacology, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (phone; 55-84-32153793; fax: 55-84-32153791; e-mail: eudenilson@ gmail.com).
interatomic potential energies, bond stretching, bending, etc. [4]-[5]. Initial theoretical investigations on charge transport in polypeptides was focused on the calculation of band structures through semi-empirical and ab initio methods. It was then suggested that the conductivity of proteins was caused by electronic delocalization, although later the possibility of hopping conductivity was considered [6]-[8]. In this work we investigate the charge transport properties of a modified biological molecule, the de novo-designed alpha3 polypeptide, as well as in its variants, all of them probed by gene engineering. The alpha3 polypeptide is formed by a 21-residue with three repeats of the seven-residue (heptad) amino acid sequence Leu-Glu-Thr-Leu-Ala-Lys-Ala. As an important biological characteristic, it has an alpha–helical bundle structure through hydrophobic interaction between Leu residues. Its variants are obtained by Ala→Gln substitution at the (5th) and (7th) position, the so-called alpha3 5Q and alpha3 7Q variants, respectively, of the original molecular polypeptide amino acid sequence (see Fig. 1). The alpha3-peptide has the ability to form fibrous assemblies that are observed by transmission electron microscopy and atomic force microscopy. However, the alpha-helix of the alpha3-peptide was destabilized by the substitution of Ala residues at the 5th position in the heptad sequence with Gln residues, and much more prominently by the substitution at the 7th position. As a result, among the peptides examined, the alpha3 7Q -peptide had the most unstable alpha-helix. On the other hand, the Ala→Gln substitution attenuates the formation of fibrils, which become very short in the alpha3 5Q case and are not observed in the alpha3 7Q one.
Fig. 1: (color online) The alpha3-helical (Leu-Glu-Thr-Leu-Ala-Lys-Ala)3 polypeptide. The red and yellow arrows indicate the mutations Ala5Gln and Ala7Gln in the first, second and third heptad sequence, giving rise to the alpha3 5Q and alpha3 7Q variants, respectively.
G.S. Ourique, U.L. Fulco and E.L. Albuquerque
Charge Transport in Biological Molecules
18th ICBPS Conference Proceedings, Miami-FL, USA, Vol. 18 (3) Part XII
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II. THEORETICAL/COMPUTATIONAL METHOD The charge transport properties are here investigated within a tight-binding model Hamiltonian where input parameters (amino acid vertical ionization and dipeptide hopping energy) were obtained by performing quantum-chemistry ab-initio calculation based on the density functional theory (DFT). The isolated amino acid and dipeptide conformers of smaller energies were found through a minimization energy process within the DFT framework using the DMOL3 code. The generalized gradient approximation Perdew–Burke–Ernzerhof exchange-correlation functional was adopted, and a double numerical plus polarization basis set was chosen to expand the Kohn–Sham wave functions. All electrons, valence and core, were taken into account. The geometry optimization convergence thresholds were 10-5 Ha for the total energy variation, 2x10-4 Ha/nm for the maximum force per atom, and 5x10-4 nm for the maximum atomic displacement. To obtain the vertical ionization energies of the amino acids, the total energy differences between the N-electron ground state and the excited states of the amino acids conformers of smaller energies were computed. The lowest single-electron excitations are the (first) amino acid vertical ionization potential
IE = E(N-1 ) - E(N), (1)
where the ionized amino acids with one missing electron are characterized by the total energies E(N-1). The calculated amino acids vertical IEs of the alpha3 - helical peptides and the (5Q,7Q) alpha3 variants are:
alanine, 9.25 eV; glutamine, 8.52 eV; lysine, 8.00 eV; glutamic acid, 8.63 eV; threonine, 9.05 eV; leucine, 8.85 eV.
The hopping terms, on the other hand, are estimated through the following relation [9]:
Vn.m = (1/2)[En,m (HOMO) - En,m (HOMO – 1)], (2) where En,m (HOMO) and En,m (HOMO – 1), are, respectively, the first and second highest occupied molecular orbital energies for the dipeptides formed by the n,m amino acid residues. The charge carriers are supposed to be traveling between the biased platinum electrodes by hopping through discrete molecular orbitals of the alpha3-helical peptides and the (5Q,7Q) alpha3 variants. The energy of the platinum electrode is 5.36 eV, which is related to the work function of this metal [10].
III. RESULTS The electronic transport properties of a molecular-junction, as depicted in Fig. 2, are usually described by two approaches: ab initio calculations and model-based Hamiltonians (for recent reviews see [11]). The former can provide a detailed description but is currently limited to relatively short molecules, while the
latter is less detailed but allows for describing systems of realistic length.
Fig. 2: The alpha3-helical (Leu-Glu-Thr-Leu-Ala-Lys-Ala)3 polypeptide and its alpha3 5Q and alpha3 7Q variants sandwiched between two metallic electrodes (Pt). Here, as our focus is mainly on the qualitative properties of a alpha3-nano-junction, we choose a mathematical framework based on an effective tight-binding model, together with a transfer matrix technique, employed to simplify the algebra which can be otherwise quite involved, as described in our previous work [10], without any environment or complex contact related effects. Our main concern is related to the determination of the IxV characteristic curves, which are obtained by using the Landauer-Bütiker formalism, considering the profile of the current in the positive and negative biased peptides, as depicted in Fig. 3. Although the alpha3-helical peptides and its (5Q,7Q) alpha3 variants differ only by the Ala→Gln substitutions, their IxV relationship should change considerably due the degree of fibrils formation. This allows to distinguish the alpha3, alpha3 5Q and alpha3 7Q peptides, and consequently to point the existence (or not!) of fibrous assemblies. This means that charge transport can be used as a tool for characterizing their fibrous assemblies. Fig. 3 shows the behavior of the current in the positive and negative biased peptides. For both the positive and negative polarity, there is a characteristic Ohmic region for
-1.0 < V > +1.0 eV, (3) and nonlinear regions indicating transitions toward current saturation for V < -1.0 eV and V > +1.0 eV. The inset in Fig. 1 shows the transconductance dI/dV x V of the devices, which are highly nonlinear. On the basis of the dI/dV characteristics, the peptides alpha3, alpha3 5Q, and alpha3 7Q have an average energy gap of 3.25, 3.32, and 3.53 eV, respectively. They have semiconductors characteristics, as in the case of dry proteins [12]. Each peptide has a characteristic current pattern, which was assumed to depend mainly on its primary structure. The result of the straightforward calculations is that the fibrous/not fibrous
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alpha3, alpha3 5Q, and alpha3 7Q peptides can be distinguished by charge transport measurements. As a matter of fact, the alpha3 peptide, that has the most fibrous assemblies, shows the smaller current saturation; the alpha3 5Q variant, which forms fibrous assemblies more attenuated than those of the alpha3 peptide, has a current saturation higher than alpha3, but smaller than alpha3 7Q; finally, the alpha3 7Q variant does not form fibrils and shows the highest current saturation. If the secondary structure of the peptides is considered, the number of charge transport channels should increase due to hydrogen bonding related to the secondary structure, further increasing saturation currents, but not specifically enough to change the order
I (alpha3) < I (alpha3 5Q) < I (alpha3 7Q). (4) Further development on this line is hampered by the absence of crystallographic data allowing the characterization of the fibrous/not fibrous alpha3 and (5Q,7Q) alpha3 peptides secondary structure.
Fig. 3: The current through the biased alpha3 (dotted), alpha3 5Q (dashed), and alpha3 7Q (solid) peptides. The inset shows the transconductance dI/dV x V of the devices.
IV. CONCLUSIONS In summary, by taking full advantage of the vertical ionization (hopping) energies of the molecular peptide alpha3, and its (5Q, 7Q) variants peptides, their charge transport properties were calculated within a tight-binding Hamiltonian model approach. They showed semiconductor character, in agreement with electrical conduction in dry proteins, being their current saturation behavior very useful to discover the existence (or not) of fibrous assemblies. Since the formation of fibrous assemblies are characteristic of Alzheimer, Parkinson, and Creutzfeldt-Jakob diseases, our result suggests that charge
transport in peptides can be a useful tool for the development of biosensors to probe amyloidosis-like diseases.
ACKNOWLEDGMENT This work was partially financed by the Brazilian Research Agencies CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio)Simes and Universal 454328/2014-1).
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117
Apêndice II Trabalhos Publicados
118
Apêndice II
Esta tese e baseada nos seguintes trabalhos científicos:
1. G.S. Ourique, J.F. Vianna, J.X. Lima-Neto, J I.N. Oliveira, P.W. Mauriz, M.S.
Vasconcelos, E.W.S. Caetano, V.N. Freire, E.L. Albuquerque and U.L. Fulco
“A quantum chemistry investigation of a potential inhibitory drug against the
dengue virus”
RSC Advances 6, 56562 - 56570 (2016).
2. G.S. Ourique, K.S. Bezerra, E.L. Albuquerque and U.L. Fulco
“A quantum biochemistry investigation of a inhibitory drug against the west
Nile virus”
in preparation (2018).
A quantum chemistry investigation of a potentialinhibitory drug against the dengue virus†‡
G. S. Ourique,a J. F. Vianna,a J. X. Lima Neto,a J. I. N. Oliveira,a P. W. Mauriz,b
M. S. Vasconcelos,c E. W. S. Caetano,d V. N. Freire,e E. L. Albuquerquea
and U. L. Fulco*a
We present an in silico study of the interaction energy between NS2B–NS3, a serine protease of the dengue
virus (DENV), and the inhibitor benzoyl-norleucine-Lys-Arg-Arg-aldehyde (Bz-nKRR-H), a crucial step in
the design and development of dengue's antiviral drugs, using quantum chemistry calculations based on
the density functional theory (DFT) at the generalized gradient approximation (GGA). The interaction
energies between the inhibitor Bz-nKRR-H and each amino acid belonging to the binding site was
calculated through the molecular fragmentation with conjugate caps (MFCC) approach employing
a dispersion corrected exchange-correlation functional. Besides the interaction energy, we also
calculated the distances, types of molecular interactions, and the atomic groups involved in the process.
Our results show that the interaction energy of the system reached convergence at 15.0 A, with the
central residues identified in this interaction radius, as well as their attraction/repulsion energies, all of
them being important inputs to improve the effectiveness of antiviral drugs to avoid the dissemination of
the dengue virus.
IntroductionDengue virus (DENV) belongs to the family Flaviviridae, genusFlavivirus, which also includes several human pathogens suchas the West Nile virus (WNV), Japanese Encephalitis Virus (JEV),Yellow Fever Virus (YFV), and Zika Virus (ZIKV), among others.1
It is transmitted by mosquitoes of the species Aedes aegypti and,less frequently, Aedes albopictus. According to the World HealthOrganization (WHO), the incidence of dengue in the worldincreased 30 times in the last ve decades.2 Some factorscontributed to this dramatic growing worldwide, such as thepopulation growth, unplanned urbanization, global warming,lack of efficient mosquito control, increased air travel andinsufficient public health care facilities. As a result, currentlythe disease is present in more than 125 countries, covering
a large amount of the world population.3 A recent estimateindicates globally 390 million dengue infections per year, ofwhich 96 million (25% of all cases) manifest clinically withdifferent degrees of severity of the disease, including 500 000dengue hemorrhagic fever cases resulting in 25 000 deaths,mostly children.4 These data clearly point to the urgent need ofa comprehensive understanding of the DENV pathogenesis,which could lead to the discovery of new control strategies.
Currently, there are four distinct serotypes (DENV-1 to 4)consolidated by the scientic community and subclassied intoseveral different phylogenetic clusters or genotypes.5 Recently itwas announced the discovery of a h serotype, DENV-5, foundonly in specic regions like the Malaysian and Indonesianjungles, usually following the sylvatic cycle and not the humanone.6 It is known that the rst four serotypes are geneticallysimilar and share approximately 65% of their genomes.7
Despite this, although infection with one serotype confers life-long immunity to that serotype, it does yield only short-termprotection against a secondary infection with a heterologousserotype. Subsequent infection with a different type increasesthe risk of severe complications like the life-threatening denguehemorrhagic fever, a rare case characterized by high fever,damage to lymph and blood vessels, bleeding from the nose andgums, enlargement of the liver, and failure of the circulatorysystem. The symptoms may progress to the dengue shocksyndrome (DSS) with massive bleeding, shock, and ultimatelydeath, a phenomenon oen attributed to the antibody-dependent enhancement (ADE).8,9
aDepartamento de Biofısica e Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande doNorte, 59072-970, Natal, RN, Brazil. E-mail: [email protected]; Fax: +55-84-32153791; Tel: +55-84-32153793bDepartamento de Fısica, Instituto Federal de Educaçao, Ciencia e Tecnologia doMaranhao, 65030-005, Sao Luıs, MA, BrazilcEscola de Ciencia e Tecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal, RN, BrazildInstituto Federal de Educaçao, Ciencia e Tecnologia do Ceara, 60040-531, Fortaleza,CE, BrazileDepartamento de Fısica, Universidade Federal do Ceara, 60455-760, Fortaleza, CE,Brazil
†This document is a collaborative effort of all authors.
‡Electronic supplementary information (ESI) available. See DOI:10.1039/c6ra10121f
Cite this: RSC Adv., 2016, 6, 56562
Received 19th April 2016Accepted 6th June 2016
DOI: 10.1039/c6ra10121f
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56562 | RSC Adv., 2016, 6, 56562–56570 This journal is © The Royal Society of Chemistry 2016
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PAPER
Dengue viruses are small particles (50 nm in diameter) con-taining a single-stranded, positive-sense RNA of approximately11 Kb. The genomic RNA encodes a polyprotein precursor that isprocessed proteolytically into 10 proteins: three structuralproteins (C, capsid; prM, precursor membrane; and E, envelope)and seven non-structural ones (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,NS4B and NS5).10,11 The coding of these ten viral proteins isarranged as |C|prM|E|NS1|NS2A|NS2B|NS3|NS4A|NS4B|NS5|.12
The structural proteins form the viral particle while thenonstructural ones participate in the replication of the RNAgenome, virion assembly, and attenuation of the host antiviralresponse. However, according to recent studies, it has beenfound that NS3 protein is one of the most signicant non-structural protein involved in the DENV infection. This regionis named as NS3 protease (NS3 for short), and its activitydepends on a cofactor named as NS2B, which is crucial in thevirus replication process. They collectively forms the activeserine protease complex known as NS2B–NS3, which hasa function to cleave the precursor polyprotein at the NS2A–NS2B,NS2B–NS3, NS3–NS4A and NS4B–NS5 junctions.13 Thus, theinteraction between NS2B and NS3 is essential for the compositefunction of active viral protease. The NS3 (69 kDa) is a serineprotease that has a typical catalytic triad formed by the residuesHis51, Asp75 and Ser135.4,6 The NS3 is a multifunctional proteinthat not only promotes cleavage of genomic polyprotein (cleavingC, NS2A/NS2B, NS2B/NS3, NS3/NS4A and NS4B/NS5 proteins), butalso has autoproteolytic function, helicase, ATPase and GTPaseactivity.6,13 It is precisely the autoproteolytic cleavage at the NS2B/NS3 site that results in the formation of an enzymatically activenon-covalent complex between NS2B and NS3.4 Thereby, is pre-dicted that the NS3 protease requires a portion of 40 residues ofthe NS2B protein to assume the activity conformation, where theNS2B will act as a cofactor.4,7 These observations suggest thatcompetitive drugs targeted to the serine protease of the denguevirus NS2B–NS3 complex represent promising candidates fortherapeutic agents that could inhibit the maturation of DENVproteins and thereby inhibit viral replication.11,14
The biochemical and structural properties of dengue proteasehave been recently extensively reviewed.15 Currently, four strat-egies have been pursued to identify inhibitors of DENV by tar-geting both viral and host proteins, namely: HTS (high-throughput screening) using virus replication assays; HTSusing viral enzyme assays; structure-based in silico docking; andrational design repurposing hepatitis C virus inhibitors forDENV. Although a number of inhibitor candidates for denguewere investigated so far, like the pancreatic trypsin inhibitor(aprotinin) and Ribavirin inhibitor (to cite just a few), the tetra-peptide aldehyde Bz-nKRRH requires direct interactions with thesubunit NS2B, essential for the protease catalytic activity, beingthe best-studied targets for the development of anti-infectivetherapeutics against dengue virus (see Fig. 1 for its structuralillustration). Fig. 2 depicts the Bz-nKRR-H molecule with itsmain chemical regions. The electron density projected onto anelectrostatic potential isosurface is also shown for completeness.
Asmentioned before, the dengue protease is responsible for thepost-translational cleavage of the viral polyprotein, being essentialfor viral replication. In the past, other viral proteases, such as those
of HCV andHIV, have been successfully established as targets withtherapeutic relevance. Recently Yin et al.16 examined some tetra-peptides as protease inhibitors and have suggested the tetrapep-tide inhibitor benzoyl-norleucine-Lys-Arg-Arg-aldehyde (Bz-nKRR-H), with a Ki (equilibrium inhibition constant) of 5.8 to 7.0 mMas a potent inhibitor of DENV-2. Besides, Parida and co-workersinvestigate non structural NS3 inhibitors by means of a protein–protein interacting sites of the dengue virus.17,18
On the experimental side, a rapid assay for detecting andtyping dengue viruses was already developed by using reversetranscriptase-polymerase chain-reaction.19 Although thecontemporary worldwide distribution of the risk of dengue virusinfection and its public health burden are still poorly known,data on clinical diagnosis and pathophysiology of vascularpermeability and coagulopathy, parenteral treatment of thedengue, viral factors and new laboratory tests were recentlyreviewed.20 However, the resurgence of dengue in tropical andsubtropical areas of the world, and its spread and establishmentin new habitats and environments21 was always a big challenge,like the dengue severity associated with age and a new lineage ofdengue virus-type 2 during an outbreak in Rio de Janeiro, Bra-zil.22 Immunological concerns in dengue virus vaccine develop-ment, leaving dengue viruses susceptible to antibody-dependentenhancement (ADE), was successfully investigated.23 Further-more, technical feasibility of engineering dengue viruses todisplay targets of protective antibodies are being investigatedaiming the development of new dengue vaccines and diagnosticassays (ref. 24 and the reference there in).
The purpose of this work is to describe the interactionenergies between the serine protease of the dengue virus NS2B–NS3 and the peptide inhibitor Bz-nKRR-H (receptor–ligand
Fig. 1 Structural representation of the serine protease of the denguevirus NS2B–NS3/inhibitor Bz-nKRR-H complex (PDB ID: 3U1I).26 TheProtease NS3 is highlighted in green, while the NS2B cofactor inyellow. The binding pocket sphere with radius (r) is also shown in thispicture as a blue dotted-line circle around the Bz-nKRR-H ligand.
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complex) bounded to the site of greatest activity, whose struc-tural representation is depicted in Fig. 1. Our theoretical/computational method makes use of a quantum molecularbiochemistry calculations, particularly ab initio techniquesbased on the density functional theory (DFT) approach, togetherwith the molecular fractionation with conjugate caps (MFCC)method (for a review of these techniques see ref. 25).
Our results allow us to provide a detailed energy prole of theinteractions between the inhibitor and its residues in thebinding site near the receptor. These data are essential to iden-tify those residues that contributemore to the interactive processbetween receptor and ligand. Thus, adjustments could be madeto improve the effectiveness in the design of new viral drugsleading to a quantitative description of the interaction mecha-nism of the NS2B–NS3/Bz-nKRR-H complex of DENV. Our ulti-mate aim is to shed light on the design and development ofantiviral drugs to avoid the dissemination of this disease.
Materials and methodsThe calculations performed in this study took advantage of theX-ray crystal structure of the NS2B–NS3 protease of DENV-3 in
complex with the inhibitor Bz-nKRR-H (PDB le 3U1I) deter-mined with a resolution of 2.30 A.26 The protonation state of theinhibitor Bz-nKRR-H at physiological pH was obtained usingthe Marvin Sketch code version 5.4.1.0 (Marvin Beans Suite –ChemAxon). Hydrogen atoms were inserted into the X-raystructure and their positions were optimized classically,keeping the non-hydrogen atoms frozen. The optimizationprocedure was performed using the COMPASS forceeld avail-able in the FORCITE code,27 with convergence tolerances set to2.0 ! 10"5 kcal mol"1 (total energy variation), 0.001 kcal mol"1
A"1 (maximum force per atom), and 1.0 ! 10"5 A (maximumatomic displacement).
The total/individual interaction energy between the inhibitorBz-nKRR-H molecule (ligand) and the serine protease NS2B–NS3 was calculated by using an MFCC-based scheme withina DFT framework. MFCC has been widely used to calculateprotein-ligand binding energy,28–31 once it turns possible theinvestigation of a vast number of amino acid residues ina protein with small computational cost and no loss in accu-racy.32,33 The fractionation scheme was initially aimed toprovide an efficient linear-scaling ab initio calculation ofprotein-ligand interaction energies by dividing a protein mole-cule into amino acid fragments properly capped.34,35 A signi-cant difference between the MFCC method and otherfragmentation methods that employ capping of fractionatedbonds is the nature of the caps used. Instead of simplehydrogen caps, the caps in the MFCC approach are portions ofthe neighboring sections of the molecule, providing an efficientmethod for representation of the local environment duringindividual fragment calculations.
Labelling the ligand molecule as L, and the residue inter-acting with L as Ri (i denotes the index of the i-th amino acidresidue), the individual interaction energy between L and eachRi, E(L–Ri), at DFT level is calculated according to:
EI(L–Ri)¼ E(L + C1"iRiCi+1 )" E(C1"iRiCi+1 )" E(L + C1"iCi+1 )
+ E(C1"iCi+1 ), (1)
where the rst term E(L + Ci"1RiCi+1) is the total energy of thesystem formed by the ligand and the capped residue; the secondterm, E(Ci"1RiCi+1), is the total energy of the capped residuealone; the third term E(L + Ci"1Ci+1) is the total energy of thesystem formed by the set of caps and the ligand L; the fourthand nal term E(Ci"1Ci+1) is the total energy of the systemformed by the isolated caps. Furthermore, crystallographicwater molecules have been included as part of the closestresidue to whom they are hydrogen-bonded (length of 2.5 A).
All energetic calculations were made in the DMol3 programpackage,36,37 using the generalized gradient approximation(GGA)38 within the parameterizations developed by Perdew–Burke–Ernzerhof (PBE),39 together with the Grimme's long-range dispersion correction.40 It improves the description ofthe non-covalent interactions, providing a better compromisebetween the cost of rst principles evaluation of the dispersionterms (non-covalent interactions). The orbital cutoff, which isa parameter used to control the quality of the numerical basisset and the numerical integrations performed during the
Fig. 2 Representation of the Bz-nKRR-H molecule. (a) Chemicalstructure subdivided into five regions to help the analysis of its inter-actions with the protease; (b) electron density projected onto anelectrostatic potential isosurface showing negatively and positivelycharged regions in a red and blue color, respectively.
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computations, was set to 3.0 A. Besides being suitable for thetreatment of this system, this cutoff value reduce the compu-tation time with little impact on the accuracy of the results.41
The total energy variation, which species the self-consistenteld (SCF) convergence threshold, was selected to be 10"5 Ha,ensuring a well converged electronic structure for the system.
A convergence study of the interaction energy as a functionof the ligand binding pocket radius was performed inputtinga limit to the number of amino acid residues to be analyzed,without missing important interactions.42 Convergence heremeans the stabilization of the total binding energy by a varia-tion less than 10% within sequential pocket radius r. The totalbinding energy is determined by adding up all residue-ligandenergies within a pocket radius, and summing consecutivebinding pocket energies. We investigated the variation of thetotal interaction energy considering the contributions of allamino acid residues within a sphere of radius r from 2.0 to15.0 A, with origin in the ligand, capping the dangling bonds ofeach amino acid residue (Ri) with the following three aminoacids before (Ci"1) and aer (Ci+1) them.
The representation of molecular environment is a necessarystep for the theoretical study of molecular properties. Recently,models of implicit solvation have been used in MFCC schemeby Liu et al.43 and Dantas et al.44 to calculate binding affinity inprotein–ligand complexes, by assuming different values of thedielectric constant 3 to take into account the effect of the proteinand solvent environment in the evaluation of the electrostaticenergies. Here, we have employed the MFCC approach togetherwith the COSMO (Conductor-like Screening Model) continuumsolvation model and dielectric constant 3 ¼ 1, 2, 10 and 40 toincrease the similarity with the protein environment and esti-mate energy effects, such as the electrostatic polarizationpromoted by the solvent.
Results and discussionsMany efforts have been done so far looking for the developmentof drugs or vaccines that can stop dengue infection (see ref. 15and 45 for recent reviews). A crucial step in the design anddevelopment of these antiviral drugs is related to the peptideinhibitor Bz-nKRR-H in complex with its molecular target, theserine protease NS2B–NS3, whose quantum chemistry approachto estimate their energy of interaction, as well as the mostimportant residues (energetically) in this complex, is the mainpurpose of this investigation.
We analyzed the binding pocket of the receptor employingthe MFCC scheme to obtain the individual contribution of eachamino acid residue, ranking the most relevant interactionsbetween residues and ligands. The total binding energy wasobtained by adding up the individual contributions. To evaluatethe binding interactions through the fragment-based quantummechanics method, it is important to take into account eachsignicant attractive and repulsive amino acid residue whichcan inuence this mechanism. Therefore, to avoid the adoptionof an arbitrary binding site size, we performed a search for anoptimal limit for which no signicant variation in the totalinteraction energy could be observed aer its increase. The
result is depicted in Fig. 3, which shows the prole of theinteraction energy (measured in kcal mol"1) as a function of r(varied from 2.0 to 15.0 A).
According to Fig. 3, even for a large radius of 15.0 A (meaning131 amino acids), the interaction energy does not achievea stabilization when the calculations have been made either invacuum or for a small value of the dielectric constant (3 ¼ 1 or2). The convergence was broken for the pocket radius r equal to5.5, 6.5, 7.5, 8.0, 9.5 and 11.0 A, respectively, mainly due to theattractive (repulsive) interactions of Met49 for r ¼ 5.5 A, Asp79for r ¼ 6.5 A, Asp80 for r ¼ 7.5 A, and Met75 for r ¼ 9.5 A (Lys87for r¼ 8.0 A, Lys26 for r¼ 11.0 A, and Lys104 for r¼ 11.0 A). Thetotal binding energy considering the dielectric function 3 ¼ 10and 40 has shown two destabilization pocket radius, namely at r¼ 5.5 and 9.5 A, that are caused mainly by the two methionineresidues Met49 and Met75. Beyond the pocket radius r ¼ 9.5 A,these total binding energies are shown within the convergencecriteria. Furthermore, our results have shown that inside r, anincrease in the dielectric constant is related to a decrease of thetotal binding energy, following the order: "313.11 kcal mol"1
(3 ¼ 1) > "242.07 kcal mol"1 (3 ¼ 2) > "129.06 kcal mol"1 (3 ¼10) > "112.58 kcal mol"1 (3 ¼ 40). Thus, destabilization of thetotal curves is mainly linked to the attractive or repulsiveinteraction energies between the inhibitor Bz-nKRR-H and thecharged amino acid residues of the serine protease NS2B–NS3,which are overestimated when low dielectric constant values areused in the MFCC scheme.44,46
Once the MFCC scheme provides for us a possibility toinspect the binding energy of each amino acid individually, wecan use these results to describe the amino acids with highestinteractions and estimate the regions of the ligand that mostcontribute to its docking and stabilization. They are summa-rized in Table S1, shown in the ESI,†as well as in Fig. 4 whichdepicts a BIRD (an acronym of the keywords binding site,interaction energy and residues domain) panel with the highestbinding energies found by our calculations.
Fig. 3 Total interaction energy as a function of the binding pocketradius calculated during the convergence study considering differentdielectric constant values: 3¼ 1 (black), 3¼ 2 (red), 3¼ 10 (blue) and 3¼40 (green).
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Considering the dielectric constant 3 ¼ 1 (vacuum calcula-tions), one can see from Table S1†that charged amino acids arethe most relevant energetically, following the order: "111.19kcal mol"1 (Asp81-NS2B) > "110.09 kcal mol"1 (Asp79-NS2B) >"84.31 kcal mol"1 (Asp80-NS2B) > "66.90 kcal mol"1 (Asp75-NS3) > "66.89 kcal mol"1 (Asp129-NS3) > "55.69 kcal mol"1
(Asp88-NS2B) > "43.20 kcal mol"1 (Glu101-NS3) > "41.14 kcalmol"1 (Glu54-NS2B) > "30.46 kcal mol"1 (Met84-NS2B) >"27.09 kcal mol"1 (Asn152-NS3) > "17.98 (Val155-NS3) >"17.08 kcal mol"1 (Met75-NS2B) > "14.67 kcal mol"1 (Met49-NS3) > "14.19 kcal mol"1 (Gly151-NS3) > 29.97 kcal mol"1
(Lys26-NS3) > 36.33 kcal mol"1 (Lys157-NS3) > 41.68 kcal mol"1
(Lys104-NS3) > 48.46 kcal mol"1 (Lys131-NS3) > 49.18 kcalmol"1 (Lys87-NS2B) > 50.34 kcal mol"1 (Lys74-NS3) > 64.18 kcalmol"1 (Arg54-NS3) > 79.82 kcal mol"1 (Arg85-NS2B). Under theeffect of a small dielectric constant value (3 ¼ 2), there area decrease in each binding energies implying some smalldifferences concerning the amino acids relevance sequence,such as Met84 and Asn152 which were the 9th and 10th mostimportant residues for the vacuum calculation, becoming nowthe 7th and 8th ones.
For higher values of the dielectric constant (3 ¼ 10 and 40),the importance of charged residues decreases, once 3 inuencesmainly individual energies of these amino acids.47,48 As we cansee from 3 ¼ 40 results, the order of importance of some amino
acids was changed as follow: Met84 ("23.44 kcal mol"1) >Asn152 ("16.47 kcal mol"1) > Met75 ("15.47 kcal mol"1) >Met49 ("14.84 kcal mol"1) > Tyr161-NS3 ("8.18 kcal mol"1) >Asp129 ("7.68 kcal mol"1) > Gly151 ("6.15 kcal mol"1) >Gly153-NS3 ("4.53 kcal mol"1) > Asp81 ("4.40 kcal mol"1) >Asp79 ("3.64 kcal mol"1) > Val155 ("3.17 kcal mol"1) > Asp75("3.08 kcal mol"1) > Trp83-NS3 ("3.02 kcal mol"1) > Phe130-NS3 ("2.92 kcal mol"1) > Val36-NS3 ("2.81 kcal mol"1) >Asp80 ("2.00 kcal mol"1) > Pro132-NS3 ("1.89 kcal mol"1) >Lys74 (1.34 kcal mol"1) > Trp50 (1.57 kcal mol"1) > Lys157 (1.66kcal mol"1) > His51 (2.49 kcal mol"1) > Arg54 (2.52 kcal mol"1) >Arg85 (4.98 kcal mol"1).
Comparing our energetic results with the map of the bindingnetwork in Bz-nKRR-H/protease, complex provided by Nobleand co-workers,26 it is easy to see that the results obtained from3 ¼ 40 are closer to the crystallographic binding scenario thanany other 3-calculations showed here. In a recent study based ona MFCC scheme within the DFT framework, simulations per-formed for an averaged dielectric constant 3 ¼ 40 improve theresults, not only showing better agreement with experimentaldata, but also giving a better convergence of the total interactionenergy with the binding pocket size.44 A similar achievementwas also found by Vicatos et al.46 regarding the best-tted valueof the dielectric constant 3 for charge–charge interactions andfor self-energies.
Fig. 5 depicts some of the main amino acid residues andrespective intermolecular interactions with the inhibitorBz-nKRR-H. In order to give a better spatial visualization, weshow the hydrogen bonds (h-bonds) from three differentoutlooks. Fig. 5a presents the inhibitor binding with Gly153(1.87 A), Arg85 (2.04 A), Met84 (2.30 A) and Val155 (2.47 A).Fig. 5b displays interactions with Asn152 (2.15 A), His51(2.86 A), Asp81 (3.39 A), Asp75 (3.59 A) and Arg54 (3.73 A).Finally, Fig. 5c give us a picture showing the interactionsbetween Bz-nKRR-H with Gly151 (1.89 A), Tyr161 (1.97 A),Phe130 (2.09 A), Asp129 (2.25 A) and Val36 (4.49 A).
The electron density distribution in the binding cle of theserine protease NS2B–NS3/inhibitor Bz-nKRR-H complex can beobserved in Fig. 6, which highlight the negative chargeconcentrations at carbonyl oxygen atom of all amino acid resi-dues, as well as the anionic carboxylate (hydroxyl group) ofAsp81 and Asp129 (Asn152). The approximation of these resi-dues with the guanidinium groups of the inhibitor explains thestrength of its attractive interactions. In contrast the cationicside chain of the residues Arg54, Arg85 and Lys74 presents lowcharge densities centered at their basic nitrogen atoms, leadingto repulsive electrostatic interactions with positively regions ofthe inhibitor Bz-nKRR-H.
Asp75 and His51 are members of the catalytic triad of serineprotease, and their mutations are related to the loss of theprotease function of NS3,49 becoming one of the most thor-oughly characterized catalytic motifs. The hydrogen bondbetween Asp and His increases the pKa of the latter, favoring theactivation of a Ser nucleophile that binds covalently to thesubstrate,50 making direct intermolecular bonds with theinhibitor Bz-nKRR-H (see Fig. 5). There is a salt bridge betweenthe guanidinium group of region iv(C32)NH2
+ of inhibitor with
Fig. 4 BIRD graphic panel showing the most relevant residues thatcontribute to the binding of the ligand. Theminimal distances betweeneach residue and the ligand, as well as the water molecules used inenergy calculations are also shown.
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the carboxylate group of Asp75 (3.59 A). Meanwhile, the imid-azole ring of His51 is interacting with the side chain of Argininein the same region.
Phe130, Gly151 and Gly153 (Val36) are involved in direct(water mediated) h-bonds at least with one of the three polaramino acids of the inhibitor – region v(N5)H, v(N4)H and iii(C35)O [v(C39)OH] respectively. The inhibitor Bz-nKRR-H and otherligands were related to make h-bonds with these amino acids,showing that they are essential for the ligands recognition.26,51,52
Salaemae et al.53 re-visited the conformational properties ofthe dengue virus NS3 protease active site by a structure-guidedmutagenesis approach in the dengue virus two-componentprotease NS2B–NS3 to clarify the functional importance ofactive site residues. Mutation of the conserved residue Asn152to Ala, for example, reduced enzymatic activity dramatically,further indicating that targeting this amino acid is a validapproach for antiviral development. Indeed, the uorometricassays and docking studies with a novel class of serine proteaseinhibitors (diaryl thioethers) indicate that the number ofh-bonds with the side chain or with a backbone carbonyl groupof Asn152 lead to an improved affinity/activity.54 In our study,one can note that the Asn152 residue is responsible for a secondmore attractive contribution ("16.47 kcal mol"1) due toa h-bond (2.5 A) interaction between its carboxamide side chainand the region iv(C32)NH2
+ of the inhibitor Bz-nKRR-H.A recent study indicates that stronger aromatic–aromatic
stacking interactions between phenyl groups of pyrazole esterderivatives with Tyr161 can be important for a potent inhibitoryactivity against the serine protease NS2B–NS3.55 Furthermore, itis believed that this amino acid acts together with Gly153 toform direct interactions with ligands. Here, the carbon–oxygendouble bond of region iii(C35)O and the guanidinium of regionv(C45)NH2
+ form h-bond and p-cation interactions in respectiveorder with the phenolic oxygen atom and aromatic ring ofTyr161, providing an interaction energy of "8.18 kcal mol"1.
Liu et al.56 present a detailed report of the synthesis of novelthiadiazoloacrylamide derivatives as potential inhibitors of theDENV2 NS2B/NS3 protease. One of the main feature in thedocked conformation of the most potent/effective analogue isthe presence of a hydrogen bond with the main chain of Met84.In our NS2B-NS3/Bz-nKRR-H binding, region iii of the inhibitor[iii(C22)NH3
+] also forms a strong h-bond with it ("23.44 kcalmol"1).
Asp129 and Asp81 interact with the inhibitor Bz-nKRR-Hthrough a salt bridge between their carboxylate side chain atregions iv(C32)NH2
+ and v(C45)NH2+ of the inhibitor, respec-
tively. According to Noble et al.,26 they are conserved aminoacids that help the serine protease NS2B–NS3 of DENV to be ina closed conformation during proteolysis. Crystallographic,docking and molecular dynamic studies have shown that theydisturb the interaction of ligands whose residues are related toa destabilization of the binding pocket.51,52
Finally, note the importance of the residues Met75, Met49,Arg54 and Arg85. While Met75 at region iii(C22)NH3
+ andMet49at regions iv(C29)H and v(N4)H are two of the most attractiveresidues, Arg54 and Arg85 are repelled through cation–cationrepulsion by guanidinium and cationic ammonium group ofregion iv [iv(C32)NH2
+] and iii [iii(C22)NH3+] respectively.
The aliphatic side chain of region ii of the inhibitor Bz-nKRR-H is surrounded by just one non-polar amino acid residue,namely Val155, which stabilizes this hydrophobic moietythrough dispersion forces ("3.17 kcal mol"1) which should notbe neglected. Besides, hydrophobic interactions with residues,including Val155, may explain the high inhibitory activityagainst serine protease of the dengue virus NS2B–NS3 observedin thiadiazoloacrylamide derivatives with benzyl groups.56
Fig. 5 Detailed view of themost relevant amino acid residues involvedin the binding of the serine protease NS2B–NS3 complex with theinhibitor Bz-nKRR-H at (a) regions i, ii, iii; (b) region iv; (c) region v.Potential hydrogen bonds are indicated by dashed lines.
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ConclusionsDengue is a mosquito-borne tropical disease caused by thedengue virus that brings many deaths annually at global levels.The symptomatic treatment ends up to be insufficient eventoday, since its prevention methods are restricted to ght thedisease vector and not the mosquito itself. Unfortunately thedengue disease is spreading much in underdeveloped countriesby affectingmainly children, sometimes due to a lack of a propertreatment, having a greater risk of severe complications. There-fore, it is in the public interest and urgency to search a way toprevent and combat this disease. Increasing efforts are beingmade to ght its epidemic and pandemic worldwide.11
In the absence of an efficient therapeutic drug in the market,the development of small molecule inhibitors against thereplication and maturation of the virus have been considered asa promising route for the treatment of acute dengue diseases.The dengue virus two-component protease NS2B–NS3 mediatesprocessing of the viral polyprotein precursor and is therefore animportant determinant of virus replication. The design ofchemicals capable of neutralizing this enzyme requiresa precise knowledge of the structural determinants of substratebinding and catalysis.
In this context, we have investigated the geometrical aspectsand the interactions among the peptide inhibitor Bz-nKRR-H
and a potential dengue drug target, DENV-3 NS2B–NS3protease, using quantum chemistry calculations. We have per-formed a convergence study of the size of the binding pocketradius considering the dielectric constant 3¼ 1, 2, 10, and 40 fora precise evaluation of what are the main residues involved inthe protease inactivation. In agreement with the literature, lowdielectric constant values make difficult this study since thelocal dielectric properties of serine protease and solvent areweakened. For 3 ¼ 40, 131 amino acid residues within a radiusof 15 A make a perfect convergence curve with the total inter-action energy of "112.58 kcal mol"1. It is worth highlightingthat strong intermolecular contacts are formed between tetra-peptide aldehyde inhibitor Bz-nKRR-H and the Asn152, Met49,Tyr161, Asp129, Gly151, Gly153, Val155, Asp75, Trp83, Phe130and Val36 (Met84, Met75, Asp81, Asp79 and Asp80) at NS3(NS2B) serine protease subunit. The computational methodsused in this work emerged as an elegant and efficient alternativefor the development of drugs that can alleviate the suffering ofindividuals with this socially neglected disease.
AcknowledgementsThis work was partially nanced by the Brazilian ResearchAgencies CAPES (PNPD) and CNPq (INCT-Nano(Bio)Simes andUniversal 454328/2014-1).
Fig. 6 The electrostatic potential isosurface and projected electron density of the serine protease NS2B–NS3/inhibitor Bz-nKRR-H complex. Ahigh (low) electron density is represented in red (blue) color on an electrostatic potential isosurface, with color scales given at the right side. (a)The amino acid residues Arg54, Arg85 and Lys74; (b) the amino acid residues His51, Phe130, Gly153 and Tyr161; (c) the acidic amino acid residuesAsp81, Asp129 and Asn152; (d) the methionines Met49, Met75 and Met84.
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