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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA ACADÊMICA

COORDENAÇÃO GERAL DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS AMBIENTAIS

FELIPE ANDRÉ PEREIRA DA CUNHA AMARAL

PRODUÇÃO DE PROTEASE POR Aspergillus niger (SIS 18) ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO MEIOS ALTERNATIVOS CONTENDO

RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Recife 2017


PRODUÇÃO DE PROTEASE POR Aspergillus niger (SIS 18) ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO MEIOS ALTERNATIVOS CONTENDO

RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva

Recife 2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Desenvolvimento em Processos Ambientais

.Universidade Católica de Pernambuco como pré-requisito

para obtenção do título de Mestre em Desenvolvimento

de Processos Ambientais.

Área de Concentração: Desenvolvimento em Processos

Ambientais.

Linha de Pesquisa: Biotecnologia e Meio Ambiente

AMARAL. C.P.A. Produção de protease por Aspergillus niger (SIS 18)

i

A485p Amaral, Felipe André Pereira da Cunha

Produção de protease por aspergillus niger (sis 18) em fermentação

submersa utilizando meios alternativos contendo resíduos agroindustriais /

Felipe André Pereira da Cunha

Amaral ; orientador Carlos Alberto Alves da Silva, 2017.

107 f. : il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Católica de Pernambuco.

Pró-reitoria Acadêmica. Coordenação Geral de Pós-graduação.

Mestrado em Desenvolvimento de Processos Ambientais, 2017.

1. Biotecnologia. 2. Enzimas microbianas 3. Fermentação

submersa. 4. Planejamento fatorial. I. Título.

CDU 574.6


PRODUÇÃO DE PROTEASE POR Aspergillus niger (SIS 18) ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO

MEIOS ALTERNATIVOS CONTENDO RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS


Examinadores:

_____________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva (Orientador)

Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP

____________________________________________ Profª Drª Arminda Saconi Messias

Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP

________________________________________________ Profª Drª Norma Buarque de Gusmão (Membro Externo)

Universidade Federal de Pernambuco – UFPE

ii


AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a Deus pela força, coragem e sabedoria em todos os momentos, inclusive

nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais André da Cunha Amaral Filho e Angela Maria Pereira Amaral pelas palavras

de incentivo e força, por toda a dedicação prestada em cada momento da minha vida.

A minha tia Avandelucia Maria por todo apoio dado neste trabalho meus sinceros

agradecimentos por tudo que fizestes por mim no decorrer da minha vida.

Ao Professor Dr. Carlos Alberto Alves da Silva, pela orientação deste trabalho com sua

dedicação e disponibilidade de seu tempo, pelo incentivo e compreensão, pelos conselhos e

ensinamentos que contribuíram para meu crescimento científico. Sinto uma sincera

admiração, carinho e respeito.

Às Drªs. Thayse Alves e Rosileide Fontenele e ao Doutorando Marcos Luna, amigos de uma

generosidade absoluta. Obrigado pela amizade, motivação e dedicação e conselhos.

Aos funcionários e amigos do laboratório do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais e

Biotecnologia (NPCIAMB),Senhor Humberto e André pelo apoio prestado nos experimentos.

Aos meus amigos da Prefeitura Municipal da Ilha de Itamaracá em especial a Drª Morgana

Borba pelo incentivo e pela força durante todo esse processo.

FACEPE e a CAPES pelo incentivo finaceiro de suma importancia para o desenvolver dessa

dissertação.

iii

AMARAL. C.P.A. Produção de protease por Aspergillus niger (SIS 18) em fermentação submersa utilizando meios alternativos contendo resíduos agroindustriais.

ii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...............................................................................................................iii

SUMÁRIO................................................................................................................................iv

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................vii

LISTA DE TABELAS.............................................................................................................viii

RESUMO..................................................................................................................................ix

ABSTRACT..............................................................................................................................x

CAPÍTULO I

1. Introdução ...................................................................................................................... 11

1.2 Objetivos ...................................................................................................................... 13

1.2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 13

1.2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 15

1.3 Revisão da Literatura .................................................................................................. 14

1.3.1 Caatinga .................................................................................................................... 14

1.3.2 Gênero Aspergillus ssp ............................................................................................... 16

1.3.2.1 Aspergillus niger ..................................................................................................... 20

1.3.3 Enzimas ..................................................................................................................... 22

1.3.4 Proteases ................................................................................................................... 26

1.3.5 Processos Fermentativos ........................................................................................... 29

1.3.6 Substratos Alternativos na Produção de Bioprodutos ................................................. 31

1.3.6.1 Soro de Leite ............................................................................................................. 32

1.3.6.2 Resíduo de Sorvete ...................................................................................................35

1.4 Referências Bibliográficas .......................................................................................... 37

iv


iii

CAPÍTULO II Artigo científico .......................................................................................... 56

RESUMO ............................................................................................................................ 57

Introdução ........................................................................................................................ 57

Material e métodos .......................................................................................................... 58

Micro-organismos ............................................................................................................ 58

Pré-Inóculo ............................................................................................................... 59

Seleção de amostras produtoras de protease em meio sólido ......................................... 59

Seleção de meios de produção em fermentação submersa ............................................. 59 Determinação da biomassa microbiana ............................................................................ 59

Determinação do pH ........................................................................................................ 59

Determinação da atividade enzimática ............................................................................ 60

Resultados e discussão .................................................................................................. 60

Seleção de amostras produtoras de protease em meio sólido ......................................... 60

Produção de protease em fermentação submersa ........................................................... 61

Avaliação do crescimento microbiano em diferentes meios de produção.......................... 63

Determinação do pH ........................................................................................................ 64

Conclusões....................................................................................................................... .. 64

Conflitos de interesses.........................................................................................................64

Referências Bibliográficas................................................................................................ 74

Anexos..................................................................................................................................70

CAPÍTULO III Artigo científico ..........................................................................................75

Resumo................................................................................................................................76

Abstract..................................................................................................................................76


iv

1 Introdução .................................................................................................................... ...78v

2 Material e Métodos ...................................................................................................... ...79

2.1 Micro-Organismo ...................................................................................................... ...79

2.2 Meios alternativos de produção ................................................................................ ...80

2.3 Planejamento fatorial 22(soro de leite)....................................................................... ...80

2.4 Planejamento fatorial 22(resíduo de sorvete)............................................................. ...80

2.5 Determinação da atividade proteolítica ..................................................................... ...80

2.6 Determinação das proteínas totais ............................................................................ ...81

2.7 Determinação do pH ................................................................................................. ..81

2.8 Determinação da curva de crescimento .................................................................. ..81

3 Resultados e discussão ............................................................................................... ..81

3.1 Produção de protease através de planejamentos fatoriais ....................................... ..81

3.2 Influência de resíduos agroindustriais na produção enzimática ................................. ..83

3.3 Influencia da glicose na produção enzimática ........................................................... ..84

3.4 Influencia do pH na produção enzimática.................................................................. ..85

3.5 Produção proteolítica do Aspergillus niger melhores condições obtidas nos

planejamentos fatoriais ................................................................................................... ..86

4. Conclusões ................................................................................................................. ..86

5. Referências................................................................................................................. ..89

Anexos..................................................................................................................................96

CAPÍTULO IV ................................................................................................................. .100

Conclusões Gerais ......................................................................................................... .101

Anexos.................................................................................................................................103

vi


v

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 1 – Caatinga de Pernambuco ................................................................................ 15

Figura 2 – Morfologia do gênero Aspergillus ssp. ............................................................. 17

Figura 3 – Conidióforo ...................................................................................................... 17

Figura 4 – Aspergillus niger ............................................................................................... 20

Figura 5 – Aspergillus niger inoculado em meio CZApK Dox ............................................ 21

Figura 6 – Ilustração evidenciando o modo de ação enzimático ....................................... 23

Figura 7 – Representação da hidrólise de uma ligação peptídica por uma protease .......... 26

Figura 8 – Fermentação Submersa ................................................................................... 30

Figura 9 –Fluxograma da produção de enzimas microbianas utilizando uma

fermentação submersa ..................................................................................................... 31

Figura 10 – Soro de Leite ................................................................................................. 33

Figura 11 – Resíduo de Sorvete ....................................................................................... 36

CAPÍTULO II

Figura 1 – Formação de halo característico da protease pela amostra de Aspergillus

Níger (SIS 18), pH6 e 96h ................................................................................................. 61

Figura 2 – Atividade da enzima protease por Aspergillus niger (SIS18) em 150 rpm a

40 C° em 96 horas ............................................................................................................ 62

CAPÍTULO III

Figura 1 – Diagrama de pareto mostrando os efeitos principais e alterações das

variáveis independentes no processo de produção de protease por Aspergillus niger a

96 horas de fermentação, a 37Cº,(1)soro de leite,(2)Glicose. ............................................ 83

Figura 2 – Diagrama de pareto mostrando os efeitos principais e alterações das

variáveis independentes no processo de produção de protease por Aspergillus niger a

96 horas de fermentação, a 37Cº (1) resíduo de sorvete, (2) Glicose. ............................... 83

vii


vi

Figura 3 – Comparação da atividade enzimática pelo fungo Aspergillus niger nos melhores

ensaios dos planejamentos fatoriais a 150 rpm, 37° C por 144h ....................................... .86

Figura 4 – Comparação entre o crescimento do fungo Aspergillus niger nos melhores ensaios

dos planejamentos fatoriais a 150 rpm,37° C por 144 h.......................................................88

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1. Condições para o crescimento vegetativo do gênero Aspergillus spp.................18

Tabela 2. Importantes manuais de identificação para o gênero Aspergillus spp...................19

Tabela 3 – Enzimas e micro-organismos produtores..............................................................25

Tabela 4 – Concentração de Proteínas no soro de Leite........................................................34

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Ensaio de detecção de protease em meio sólido utilizando diferentes amostras de

Aspergillus sp (SIS19).............................................................................................................60


Aspergillus sp (SIS18).............................................................................................................61


Aspergillus spp).......................................................................................................................61

Tabela 4 – Determinação da atividade proteásica pelo fungo Aspergillus niger (SIS18).......62

Tabela 5. Determinação da biomassa (g/L) do fungo Aspergillus níger ( SIS 18)..................63

Tabela 6.Determinação dos valores de pH nos meios testados do fungo Aspergillus níger( SIS

18)...........................................................................................................................................64

CAPÍTULO III

Tabela 1- Matriz codificada utilizada no planejamento fatoria 22 com soro de leite.............80

Tabela 2 Matriz codificada utilizada no planejamento fatoria 22 com resíduo de sorvete .....80

Tabela 3 - Produção de biomassa, atividade proteolítica para as concentrações de Resíduo de sorvete, glicose no melhor tempo 144 horas de cultivo a 37Cº a 150 rpm...........................82

viii


vii

Tabela 4 - Produção de biomassa, atividade proteolítica para as concentrações de soro de leite,e glicose no melhor tempo a 144 horas de cultivo a 37Cº a 150 rpm...........................82 Tabela 5 - Produção de biomassa, pH e atividade proteolítica na melhor condição do planejamento com diferentes resíduos em 96 horas de cultivo a 37Cº a 150 rpm...............85

Tabela 6 - Produção de biomassa, pH e atividade proteolítica na melhor condição do planejamento com diferentes resíduos em 96 horas de cultivo a 37Cº a 150 rpm..........................................................................................................................................86

iv


RESUMO

A biotecnologia microbiana tem evoluído muito nas últimas décadas, principalmente pela utilização de diferentes micro-organismos para produção de inúmeros bioprodutos utilizados nos diferentes setores industriais e ambientas. As enzimas desempenham um importante papel catalítico em inúmeras reações metabólicas existentes, e as de origem microbiana apresentam diversas vantagens em relação as de origem animal e vegetal. A reutilização de resíduos agroindustriais oriundos da indústria alimentícia na elaboração de meios de produção de produtos biotecnológicos, tem surgido como uma alternativa econômica viável, pois diversos nutrientes descartados, apresentam um elevado teor nutricional que pode ser reaproveitado pelos micro-organismos nos processos fermentativos. As proteases são enzimas que constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise de proteínas e as degradam em pequenos peptídeos e aminoácidos. A relevância deste grupo de enzimas, ricas em diversidade e mecanismos de ação estrutural se reflete na importância de suas aplicações em processos industriais. Foram realizados ensaios de seleção de amostras de Aspergillus niger (SIS 18, SIS 19 e SIS 20) em diferentes temperaturas (28, 30, 40oC) e diferentes pH ( 6, 7, 8) para a obtenção da melhor amostra para a produção de protease. Após a seleção da melhor amostra, foram realizados ensaios de produção da enzima através de fermentação submersa utilizando 4 diferentes meios. Os ensaios ocorreram em câmara incubadora com agitação orbital, 150 rpm, 37oC, 96 horas, onde foram realizados a determinação do pH, da atividade enzimática e curva de crescimento. Em seguida, após a seleção do melhor meio de produção, foram realizados novos ensaios utilizando planejamento fatorial 22 completo com 4 repetições, utilizando os resíduos de soro de leite e de sorvete, nas mesmas condições cinéticas pré-estabelecidas. Os resultados obtidos indicaram que a amostra de A. niger (SIS 18) apresentou a formação do maior halo característico de 3,0 cm, com 96 h de crescimento. Os ensaios realizados com diferentes meios de produção em fermentação submersa, indicaram que o meio denominado 3, apresentou uma atividade proteolítica de 0,104 U/mL, após 96 horas de fermentação. No planejamento fatorial 22, utilizando meios contendo substratos agroindustriais, o melhor resultado obtido foi no ensaio 2, que apresentou uma atividade proteolítica de 0,118U/mL com o soro de leite e 0,093U/mL para o resíduo de sorvete.Esses resultados validam que a utilização de resíduos agroindustriais tem sido uma alternativa viável para produção de protease em fermentação submersa, e com isso pode reduzir os custos de produção e o descarte desses resíduos no meio ambiente. Palavras-chave: enzimas microbianas, planejamento fatorial, formulação de meios.

ix


ix

ABSTRACT

Microbial biotechnology has evolved a lot in the last decades, mainly by the use of different microorganisms for the production of numerous bioproducts used in the different industrial and environmental sectors. Enzymes play an important catalytic role in numerous metabolic reactions, and those of microbial origin have several advantages over those of animal and plant origin. The reuse of agroindustrial residues from the food industry in the elaboration of means of production of biotechnological products has emerged as a viable economic alternative because several discarded nutrients present a high nutritional content that can be reused by the microorganisms in the fermentative processes. Proteases are enzymes that constitute a large group of hydrolytic enzymes that catalyze the hydrolysis of proteins and degrade them in small peptides and amino acids. The relevance of this group of enzymes, rich in diversity and mechanisms of structural action, is reflected in the importance of their applications in industrial processes. Sampling assays of Aspergillus niger (SIS 18, SIS 19 and SIS 20) were carried out at different temperatures (28, 30, 40ºC) and different pH (6, 7, 8) to obtain the best sample for the production of Protease. After the selection of the best sample, enzyme production assays were performed by submerged fermentation using 4 different media. The tests were carried out in an orbital shaker, 150 rpm, 37oC, 96 hours, where the pH, the enzymatic activity and growth curve were determined. Then, after the selection of the best production medium, new assays were performed using a 22 complete factorial design with four replicates using milk serum and ice cream residues, under the same pre-established kinetic conditions. The results indicated that the A. niger (SIS 18) sample showed the formation of the largest characteristic halo of 3.0 cm, with 96 h of growth. The assays performed with different production media in submerged fermentation indicated that the medium 3 was a proteolytic activity of 0.104 U/mL after 96 hours of fermentation. In factorial design 22, using media containing agroindustrial substrates, the best result obtained for test 2, which presented a proteolytic activity of 0.118 U/mL with serum of milk and 0.093 U/mL for ice cream residue.These results validate that the use of agroindustrial residues has been a viable alternative for the production of protease in submerged fermentation, and with this can reduce the costs of production and the discard of these residues in the environment. Key-words: Microbial enzymes, factorial designer, media formulation.

x

AMARAL. C.P.A. Produção de protease por Aspergillus niger (SIS 18) em fermentação submersa utilizando meios alternativos contendo resíduos agroindustriais

CAPÍTULO I

11


1. INTRODUÇÃO

A Caatinga é um bioma exclusivamente brasileiro e apresenta um mosaico de paisagem

inserida em uma região semiárida. Possui uma extensão de 844.453 quilômetros quadrados,

correspondendo a 11%, do território nordestino, porém pouco protegida (apenas 7,5%) e

estudada. O solo apresenta uma ampla gama de organismos vivos e proporciona altas taxas

metabólicas que ocorrem em seu interior devido a existência de raízes e decomposição da

matéria orgânica. É nesta região, a da rizosfera, onde existe maior atividade microbiana, em

decorrência da grande liberação de compostos ricos em carbono que serão utilizados pelos micro-

organismos. Apesar das condições extremas, estudos comprovam que a caatinga é rica em

espécies animais e vegetais, muitas das quais endêmicas, contradizendo a teoria de que esse

bioma era improdutivo e pobre em diversidade, contém uma ampla gama de micro-organismos

entre os quais destacam-se os fungos filamentosos(LEAL;TABARELLI ,2005; BARROS, 2012;

MELLO et al., 2013; ALVAREZ; KIILL, 2014; PEREIRA;TELES; SANTOS, 2015; SANTOS et al;

2016).

Entre os diversos gêneros fungicos estudados na Caatinga esta o gênero Aspergillus. É

um gênero anamórfico pertencente à família Trichocomaceae, ordem Eurotiales, subclasse

Eurotiomycetidae, classe Eurotiomycetes, filo Ascomycota. Sua reprodução é assexuada e

caracteriza-se pela produção de fiálides e conídios em cadeia. O conidióforo de Aspergillus é

simples,usualmente aseptado e termina numa vesícula, onde ficam inseridas as fiálides. Algumas

espécies podem produzir células Hülle ou esclerócios. Muitas espécies de Aspergillus apresentam

telemorfos e se reproduzem sexuadamente. Também se destacam como excelentes produtores

de metabólitos secundários de interesse industrial e ambiental, pois apresentam uma elevada taxa

de crescimento e uma grande termotolerância, o que favorece estudos de seleção e produção de

bioprodutos de alto valor agregado. Entre estes bioprodutos destacam-se as enzimas,como as

proteases(SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012; CHAVAN ; DESHPANDE, 2013; GOPINATH et al;

2013; MALDONADO; MACEDO; RODRIGUES, 2014; LIMA et al., 2014; REIS et al., 2015)

Proteases são enzimas proteolíticas que degradam proteínas por quebra de ligações

peptídicas específicas. Essas enzimas são responsáveis, direta ou indiretamente, por todas as

funções celulares, incluindo o crescimento, diferenciação, nutrição, migração e invasão, bem

como turnover proteico, apoptose, fertilização e implantação. As enzimas proteolíticas não

simplesmente quebram as proteínas. Elas também estão envolvidas em uma ampla variedade de

processos fisiológicos, importantes nas células e tecidos. Ao clivar ligações peptídicas, as

proteases podem levar a uma perda, um ganho ou ainda interromper uma função. Sua atividade é

12


controlada, mas pode ser desregulada de forma inadequada.São produzidas por diversos

processos fermentativos entre os quais esta fermentação submersa (GERMANO et al ; 2003;

DIVAKAR; PRIYA; GAUTAM, 2010; MACHADO et al ; 2014; RAVI et al ; 2015; REICHHART et al;

2016).

A fermentação submersa tem sido constantemente utilizada na produção industrial de uma

grande maioria de enzimas microbianas, devido à grande facilidade de crescimento dos micro-

organismos e do controle de diferentes parâmetros, como pH, temperatura e aeração, além de

tornar fácil a recuperação dos bioprodutos originários do processo fermentativo. A utilização de

resíduos agroindustriais na produção de bioprodutos,através de fermentação submersa, apresenta

diversas vantagens em relação os compostos sintéticos como facilidade de aquisição,baixo valor

comercial, diminuição de possíveis impactos ambientais decorrentes do descarte inadequado etc

(PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000; SANDHYA et al., 2005; SOUZA et al., 2010;

ORLANDELLI et al ; 2012 ; ROCHA et al ; 2015).

Resíduos agroindustriais têm composições diversas podendo ser compostos orgânicos

ou inorgânicos, cadeias com alto ou baixo peso molecular, ser de fase sólida, líquida e/ou gasosa.

A utilização de substratos agroindustriais regionais e de baixo custo na formulação de meios de

produção de diversos bioprodutos torna-se uma alternativa considerada interessante e econômica,

pois além da sua facilidade de aquisição, representam uma fonte de baixo valor comercial, além

de minimizar possíveis impactos ambientais decorrentes do descarte inadequado(RUFINO;

SARUBBO; CAMPOS-TAKAKI,2007; BHATNAGAR; SILLANPÄÄ, 2010; TUCK et al., 2012;

BANASZEWSKA et al., 2014; SANTHI, 2014; VARDANEGA; PRADO; MEIRELES, 2015).

13


1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo Geral

Realizar a produção de protease fúngica através da formulação de meios de produção

alternativos contendo substratos agroindustriais, utilizando amostras de Aspergillus

spp. isoladas da Caatinga de Pernambuco.

1.2.2 Objetivos Específicos

Realizar um “screening” enzimático em meio sólido de protease em amostras de

Aspergillus spp. isoladas da Caatinga pernambucana;

Avaliar a produção da protease através de fermentação submersa em meios

tradicionais associando à cinética de crescimento microbiano;

Investigar a utilização de diferentes substratos agroindustriais provenientes de

indústrias alimentícias na produção de protease, através da utilização de um

planejamento fatorial 22 completo;

Investigar a influência do(s) substrato(s) selecionado(s) e do pH na produção de

protease fúngica;

Produzir protease a partir das melhores condições obtidas no planejamento fatorial.

14


1.3 REVISÃO DA LITERATURA

1.3.1 Caatinga

A Caatinga é um bioma exclusivamente brasileiro e apresenta um mosaico de paisagem

inserida em uma região semiárida. Possui uma extensão de 844.453 quilômetros quadrados,

correspondendo a 11%, do território nordestino, porém pouco protegida (apenas 7,5%) e tendo

sua biodiversidade ainda pouco estudada (PEREIRA; TELES; SANTOS, 2015). Apresenta um

clima semi-árido, quente, com baixos índices pluviométricos, baixa umidade relativa do ar e altas

temperaturas durante quase todo o ano (MUNIZ et al.,2014). Devido a pouca variação de chuva

por ano, a vegetação neste bioma está submetida a uma deficiência hídrica sazonal, que ainda

pode ser agravada por períodos de secas. Este bioma apresenta uma grande variedade de tipos

de vegetação: matas úmidas, matas estacionais, cerrados, tabuleiros, campos rupestres e

remanescentes de mata atlântica (SILVA; IZABELI; GUSMÃO, 2014; CARVALHO et al., 2016;

LIMA et al ;2017).

Embora a importância da Caatinga tenha sido negligenciada por décadas, sua

biodiversidade é considerada alta. Inventários realizados registram mais de 5000 espécies de

plantas vasculares, sendo dessas, pelo menos 318 endêmicas, ou seja, com ocorrência exclusiva

na Caatinga. A grande diversidade vegetal está relacionada com a existência de ambientes com

diversas condições edafoclímáticas (GIULIETTI et al; 2002; SÁ; RICHÉ; FOTIUS, 2004; SILVA et

al., 2004; GONZALEZ, 2015;GUTIÉRREZ ;MARINHO-FILHO, 2017).

O relevo é basicamente representado por depressões interplanálticas, com solos

pedregosos e rasos, predominando os latossolos e neossolos, derivados do intemperismo físico. A

hidrografia consiste em cursos de água intermitentes e sazonais, que desembocam no oceano e

as temperaturas médias anuais muito elevadas com valores entre 26 a 28ºC são características

marcantes da Caatinga. O índice de aridez é definido pela combinação de precipitações

irregulares e altas taxas de evapotranspiração, influenciados pelas massas de ar estáveis

empurradas para o sudeste pelos ventos Alísios, originados da ação do anticlone do Atlântico sul,

que contribuem para eventos de seca. Essas condições ambientais permitem uma diversidade

vegetal, com pelo menos cinco mil espécies de fanerógamas, e fisionomias onde predominam as

Caatingas arbustivas e relativamente abertas. Entretanto, ações antrópicas também influenciam a

fisionomia e composição da comunidade vegetal (MILES et al., 2006; TEIXEIRA, 2012;

PEREIRA;TELES;SANTOS, 2015; OLIVEIRA, 2015, MARANGON et al.,2016).

O solo apresenta uma ampla gama de organismos vivos e proporciona altas taxas

metabólicas que ocorrem em seu interior devido à existência de raízes e decomposição da

15


matéria orgânica. Na região da rizosfera, existe maior atividade microbiana, em decorrência da

grande liberação de compostos ricos em carbono, serão utilizados pelos diversos micro-

organismos existentes. Apesar das condições extremas, estudos comprovam que a Caatinga é

rica em espécies animais e vegetais, muitas das quais endêmicas, contradizendo a teoria de que

esse bioma era considerado improdutivo e pobre em diversidade (LEAL; TABARELLI, 2005;

BARROS, 2012; MELLO et al., 2013; ALVAREZ; KIILL, 2014; CARVALHO et al., 2016).

A escassez de água é um fator limitante na região da Caatinga e para viverem nestas

áreas as plantas encontraram diversas adaptações para a sua sobrevivência como a caducifolia

do estrato arbóreo-arbustivo e o estrato herbáceo-subarbustivo, por sua vez, está presente

apenas na estação chuvosa. A Figura 1 representa a vegetação característica da Caatinga

pernambucana (MMA, 2002; MILES et al., 2006; SANTOS et al., 2011; CORDULA; MORIM;

ALVES, 2014; SANTOS et al ; 2016).

Figura 1 – Caatinga de Pernambuco

Fonte: Mello et al.(2013)

A ação antrópica vem reduzindo a cobertura vegetal da caatinga, tornando-a um

verdadeiro mosaico natural, fragmentando o bioma e prejudicando assim a sua biodiversidade. O

uso não planejado dos recursos oferecidos pelo bioma Caatinga tem proporcionado a

fragmentação da sua cobertura vegetal, restringindo sua distribuição a remanescentes que podem

ser considerados refúgios para a biodiversidade local. Os principais impactos ambientais no

semiárido brasileiro são causados pelas atividades agrícolas, pecuária (caprinocultura), mineração

e extrativismo, estimando-se que cerca de 60 % dessa área esteja degradada. A Caatinga está

ameaçada, possuindo cerca de 45 % de suas áreas desmatadas (IBGE, 2004; HAUFF, 2010;

TEIXEIRA, 2012; ALVARES et al., 2014; BULHÕES et al; 2015 ;NETO et al ; 2017).

16


Atualmente, muitas são as informações sobre a degradação da Caatinga, mas pouco se

sabe sobre o aproveitamento econômico da biodiversidade existente nessa vegetação e as

espécies que poderiam ter valor no mercado. A falta desses conhecimentos ofusca as riquezas

existentes na Caatinga. Vários estudos biotenológicos envolvendo a produção de enzimas

microbianas tem sido realizadas, utilizando amostras de micro-organismos isoladas da Caatinga

(ALVAREZ ; KIILL, 2014; CORDULA ; MORIM ; ALVES, 2014; CARVALHO et al., 2016).

1.3.2 Gênero Aspergillus

Nas últimas décadas, um grande número de micro-organismos não patogênicos, capazes

de produzir enzimas, tem sido pesquisados nos diversos ramos industriais. Os fungos

filamentosos são micro-organismos que se destacam devido à sua grande facilidade de cultivo e

por secretarem uma grande quantidade de enzimas diretamente nos meios de produção, não

sendo necessária, assim, a ruptura celular para sua liberação. Adicionalmente, apresentam

elevados níveis de produção enzimático, com elevado potencial para inúmeras aplicações

industriais. Fungos do gênero Aspergillus, são conhecidos por sua ubiquidade e caracterizados

geralmente pela formação abundante de esporos, são amplamente estudados (HONG et al ; 2005;

RODRIGUES et al ; 2011; NASCIMENTO et al ; 2014 ; SILVA et al ; 2015; ZHAO et al ; 2017).

O gênero Aspergillus é considerado anamórfico pertencente à família Trichocomaceae,

ordem Eurotiales, subclasse Eurotiomycetidae, classe Eurotiomycetes, filo Ascomycota. Sua

reprodução é assexuada e caracteriza-se pela produção de fiálides e conídios em cadeia. O

conidióforo de Aspergillus spp. é simples, usualmente aseptado e termina numa vesícula, onde

ficam inseridas as fiálides ( Figura 2 e Figura 3).Algumas espécies podem produzir células Hülle

ou esclerócios. Muitas espécies de Aspergillus apresentam telemorfos e se reproduzem

sexuadamente (KLICH, 2002; GODET; MUNAUT, 2010; SILVA et al ; 2015;XUE et al ; 2017).

17


Figura 2 – Morfologia do gênero Aspergillus spp. Figura 3 – Conidióforo

Fonte: Silva(2015). Fonte: Luna(2013).

Esse gênero está entre os fungos mais abundantes em todo mundo. Não são muito

seletivos em relação a condições abióticas de crescimento (Tabela 1). Podem crescer ao longo de

um vasta gama de temperaturas (6-55 °C) e a umidade relativamente baixa. Além disso, as

espécies de Aspergillus spp. se alimentam de um grande variedade de substratos, incluindo fezes

de animais a tecidos humanos. No entanto, eles são encontrados predominantemente em plantas

e são considerados fungos deteriorizadores de alimentos. A eficiência do gênero Aspergillus sp

,também é descrito pela ampla capacidade de dispersão. Esporos deste gênero estão entre a

maioria das estruturas fúngicas presentes no ar e no solo (BENNETT; MACHIDA; GOMI, 2010;

CHAKRABORTHY; GHOSH 2010; SANCHEZ et al., 2012; KRIJGSHELD et al ; 2013; CHUTANI;

SHARMA , 2015 ; KENT et al ; 2016 ).

18


Tabela 1. Condições para o crescimento vegetativo do gênero Aspergillus spp.

Fonte: Krijgsheld et al.(2013).

O gênero Aspergillus é reconhecido através de características microscópicas como a

estipe do conidióforo terminado em uma vesícula, coberta por uma ou duas camadas de células

especializadas. Estas células que formam os conídios são chamadas de células conidiogênicas ou

fiálides, e sua conidiogênese é do tipo blástica fialídica. A cor é uma das principais características

macroscópicas e pode ser marrom, amarelo, branco, cinza e preto. A parte aérea (reprodutiva)

dos conídios apresenta quatro formas básicas: globular, radiante, colunar ou clavada, permitido o

agrupamento em seções ou grupos destas espécies (BENNETT; MACHIDA; GOMI 2010 ;

CHAKRABORTHY ; GHOSH, 2010 ; LUNA, 2013 ; LIRA, 2014 ; HE et al ; 2015; ZHAO et al ;

2017).

A taxonomia do gênero Aspergillus é considerada complexa e se encontra sempre em

evolução. A constante identificação desse gênero tem sido tradicionalmente baseada na

caracterização morfológica. O perfil bioquímico e os traços ultramicroscópicos, como a

ornamentação dos esporos, passaram a auxiliar as características para identificação da espécie.

No entanto, em várias seções, a variação morfológica deste gênero ocorre, resultando em

esquemas taxonômicos discutíveis. Neste sentido, a taxonomia de Aspergillus e seus telemorfos

recentemente tem sido renovada, utilizando-se atualmente uma abordagem polifásica interagindo

as características bioquímicas, ecológicas, genéticas, moleculares, a fim de examinar a

variabilidade dentro da espécie e adicionar ou reclassificar as espécies dentro do gênero. Manuais

e monografias importantes específicos à taxonomia Aspergillus estão descritos na Tabela 2

(FRISVAD ; SKOUBOE ; SAMSON , 2005 ; PILDAIN et al ., 2008 ; PETERSON, 2008 ; GODET ;

MUNAUT , 2010; BHUSHAN et al ; 2015 ; BASAK, ; PROSHANTA ,2017).

Espécies Temperatura

Ótima

pH

Ótimo

Concentração

mínima de água

Umidade

mínima (%)

Umidade mínima

Ótima (%)

A.niger 35 - 37 6.0 0,77 88 - 89 96 - 98 A.oryzae 30 - 37 6.0 - 7.5

A.fumigatus 37 5.5 - 6,5 0,82 85 98 - 99

A.clavatus 20 - 25 0,88 88 98

A. terrus 37 5.0 0,78

N.fischeri 26 - 45

A. nidulans 35 - 37 7.0 0,78 80 95

19


Tabela 2. Importantes manuais de identificação para o gênero Aspergillus spp.

Fonte: Silva (2015).

Esse gênero se destaca por ser um excelente produtor de metabólitos secundários de

interesse industrial e ambiental, pois apresenta uma elevada taxa de crescimento e uma grande

termotolerância, o que favorece estudos de seleção e produção de bioprodutos de alto valor

agregado. É reconhecido como grande produtor de enzimas microbianas sendo capaz de produzir

19 tipos diferentes de enzimas, dependendo da indução e/ou do substrato utilizado (OLIVEIRA et

al ; 2012 ; NASCIMENTO et al ; 2014 ; LIMA et al ; 2014; KENT et al ; 2016).

Secretam uma grande variedade de enzimas que degradam polímeros no interior do

substrato em moléculas que podem servir como nutrientes. Por exemplo, as amilases são

secretadas para degradar o amido, as xilanases para degradar xilano e pectinases para degradar

a pectina dentro do material vegetal. Da mesma forma, a elastase é secretada no pulmão humano

degradando a elastina. A capacidade para secretar grandes quantidades de proteínas (e outros

metabólitos, tais como ácidos orgânicos) em combinação com a tecnologia de fermentação,

estabelecida pela biologia molecular faz espécies do gênero Aspergillus spp. tais como A. niger,

A. oryzae, A. awamori, A. sojae, e A. terreus “fábricas” celulares atraentes para o produção de

Ano Referências

1926 Thom,C; and Church,M.The Aspergilli (Baltimore:Williams & Wilkins)

1954 Thom,C; and Raper,K.B. A Manual of the Aspergilli (Baltimore:Williams & Wilkins)

1985 Samsan,R.A;and Pitt,J.I.Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics(New

York:Plenum)

1988 Klich,M.A;and Pitt,J.I. A Laboratory Guide to Common Aspergillus Species and

Their Teleomorphs( North Ryde,Australia:Diision of Food Processing).

1989 Kozakiewicz ,A. Aspergillus Species on Stored Products (Wallingford : CAB

international)

1990 Samson,R.A,and Pitt,J.I.eds. Modern Concepts in Pnicillium and Aspergillus

Classification (New yor:Plenum Press)

2000 Samson,R.A,and Pitt,J.I.eds. Integration of Modern taxonomic Methods for

Penicillium and Aspergillus classification(Amsterdam :Harwood Academic

Publications)

2002 Klich,M.A.Identification of Common Aspergillus Species (Utrecht:Centraalbureau

voor Schimmelcultures).

2008 Samson,R.A,and Vargas ,J. Aspergillus systematics in the genomic era ( Utrecht :

CBS Fungal Biodiversity Centre).

20


proteínas homólogas e heterólogas (MEYER; WU; RAM, 2011 ; VARGAS; FRISVAD; SAMSON ,

2011; KRIJGSHELD et al ; 2013 ; SALIHU; BALA; OLAGUNJU,2015; LAPPA et al ;2017).

Essa classe de fungos possui ampla importância na microbiologia alimentar, seja como

produtor de metabólitos úteis (ex. ácido cítrico e amilases) ou como deteriorantes e produtores de

metabólitos tóxicos (ex. aflatoxinas e ocratoxinas). Tradicionalmente têm sido utilizados diversos

conservantes com vistas à prevenção da deterioração de alimentos, porém existe uma crescente

demanda dos consumidores por alimentos isentos de substâncias antimicrobianas sintetizadas

quimicamente, restando poucas alternativas para controlar este problema (ZEN et al; 2014 ;

ALCANO ; JAHN ; SCHERER ,2016).

1.3.2.1 Aspergillus niger

É uma das espécies mais comuns do gênero. A espécie se caracteriza por colônia de 4-5

cm de diâmetro, quando desenvolvida em agár Czapek a 25 Cº por 7 dias. Consiste de uma base

compacta branca ou amarela, com uma densa camada de conidióforos marrom escuro ou preta. A

cabeça tem forma radiada, preta, e composta de cadeias de conídeos que tendem a se dividir com

o tempo. Os conidióforos são formados por estípede liso hialino, também de coloração marrom,

vesículas globulares com 50-100 μm de diâmetro, fiálides ou métula com 7,0-9,5 μm x 3-4 μm,

métulas hialina ou marrom, muitas vezes septada com 15-25 x 4,5-6,0 μm, conídia globular com

3,5-5 μm de diâmetro, marrom, ornamentadas com verrugas, lombadas e cume. É abundante na

natureza sendo um importante micro-organismos industrial devido à sua capacidade para secretar

grandes quantidades de proteínas e metabolitos, tais como o ácido cítrico seu crescimento em

meio líquido resulta em micélio dispersos, em grupos ou em micro-colônias conhecidas como

pellets (Figura 4) (BENNETT; MACHIDA ; GOMI , 2010; CHAKRABORTHY; GHOSH,2010;

ANDERSEN; SALAZAR; SCHAAP,2011 ; LUNA, 2013 ; PENHA et al ; 2016;FINKLER et al ;

2017).

Figura 4 - Aspergillus niger

Fonte: Luna.(2013).

21


A germinação dos conídios do Aspergillus niger leva à formação de hifas que crescem por

extensão apical (figura 5) resultando em um micélio vegetativo formado e interconectado

formando uma rede aérea de hifas e conidióforos. O crescimento de tais estruturas aéreas

depende da translocação de nutrientes e água a partir do micélio vegetativo. Esta translocação

nos fungos superiores (ascomicetos e basidiomicetos) é possível por causa da presença de

septos porosos que formam compartimentos separados dentro e entre as hifas (BEKKE et al ;

2011; BLEICHRODT, 2012 ; KRIJGSHELD et al ; 2012 ; KRIJGSHELD et al ; 2013 ;

BLEICHRODT et al ; 2013; ALCANO ; JAHN ; SCHERER, 2016).

Figura 5: Aspergillus niger inoculado em meio Czapek Dox

Fonte: Ellis et al.(2007).

A. niger destaca-se pelo potencial biotecnológico e aplicabilidade na indústria, onde tem

sido utilizado desde 1919 para a produção de ácidos orgânicos, em especial o ácido cítrico,

aplicado extensivamente nas indústrias alimentícia e farmacêutica. É uma espécie classificada

como segura para o manuseio, a manipulação e o uso na indústria, já que diferentemente de

outras espécies classificadas dentro do mesmo gênero, não produz aflatoxinas. Tal fato foi

avaliado em seu genoma onde não foram encontrados genes ortólogos relacionados à

biossíntese de aflatoxinas nem outros tipos de micotoxinas (MEIJER et al ., 2009 ; GUO ;

ZHENG ; SUN , 2010 ; ANDERSEN et al ., 2011; ABDULLAH-AL-MAHIN et al ; 2012 ; SANCHEZ

et al ; 2012 ; LUNA, 2013; PENHA et al ; 2016).

Diversos micro-organismos são capazes de sintetizar enzimas, dentre eles Aspergillus

niger, fungo de fácil obtenção e satisfatório poder aminolítico nas reações fermentativas. Além da

ampla possibilidade de uso na produção de enzimas e biomoléculas, tal fungo também se destaca

no tratamento de resíduos. Um exemplo é a produção de lactase capaz de catalisar a degradação

22


de compostos fenólicos e aminas de efluentes da indústria têxtil. A enzima mencionada é

responsável pela quebra da lactose, o principal componente do soro conhecido como açúcar do

leite. A lactase é encontrada em animais, plantas, bactérias, fungos e leveduras; porém, as mais

utilizadas são as originárias de leveduras e fungos (CARDOSO et al; 2008; BLEICHRODT, 2012;

KRIJGSHELD et al; 2012; NASCIMENTO et al; 2014; PROSHANTA,2017).

A. niger tem sido reconhecido como importante fonte de secreção de enzimas, as quais

têm sido extensivamente estudadas quanto à sua aplicabilidade industrial. É capaz de produzir

mais de 19 enzimas diferentes. É reconhecido por ser utilizado na produção de vários metabólitos

secundários em nível industrial, tais como, ácido oxálico, ácido glicônico, amilases, lipases,

cellulases, xilanases e proteases, lactases, lacases, peroxidases (ANDERSEN ; NIELSEN ;

NIELSEN , 2008 ; ANDERSEN ; MIKAEL ; JENS, 2009; COUTINHO et al ., 2009 ; GUO ; ZHENG ;

SUN , 2010 ; SANCHEZ et al ., 2012 ; LUNA, 2013 ; KENT et al ; 2016).

Nos últimos 20 anos, A. niger tem sido usado como um hospedeiro para transformação de

diferentes enzimas tas como enzimas exocelular: exo-glicanase, xilosidase, exo-

poligalacturonase, exo-rhamnogalacturonase, manosidase e arabino-furanosidase, e enzimas com

atuação endocelular: ndo-glicanase, xilanase, endo-poligalacturonase, endo-

rhamnogalacturonase, mananase e arabinase (BENNETT; MACHIDA; GOMI, 2010; ABDULLAH-

AL-MAHIN et al ., 2012; LUNA, 2013 ; KENT et al;2016).

1.3.3.Enzimas

São proteínas que atuam como catalisadoras de reações químicas, sendo essenciais para

o sistema metabólico de todos os organismos vivos, possuem um papel fundamental na

degradação da matéria orgânica, na infecção do hospedeiro e deterioração dos alimentos. Podem

ser divididas em seis classes, segundo as reações que catalisam: oxidorredutases (catalisam

reações de óxidoreduções);transferases (catalisam reações de transferência de grupos de uma

molécula a outra); hidrolases (catalisam reações de hidrólise); liases (catalisam reações de quebra

de ligações); isômerases (catalisam reações de mudança intramolecular, onde um substrato

transforma-se em um produto isômero) e ligases (catalisam a ligação covalente de moléculas,

com simultânea quebra de uma ligação de alta energia) (ORLANDELLI et al., 2012; TAVARES,

2013; ADRIO; DEMAIN, 2014; LIMA et al., 2014; GONZALEZ; IRINEO, 2014;

ALTARUGIO;PEREIRA, 2016).

Têm como principal função a ação catalítica, ou seja, aceleram as reações bioquímicas.

Estão presentes na natureza, nos organismo vivos, no ambiente e em todos os seres vivos,

desempenhando um papel fundamental na conversão da luz ou da energia das ligações químicas

em ATP na transformação de nutrientes contendo carbono e metabolitos utilizáveis pelas células,

23


na replicação e expressão da informação genética e na detecção e transdução de sinais químicos

externos à célula. O pH, a temperatura, a concentração de substrato e a presença de inibidores

são os principais alteradores da ação enzimática.A atividade biológica da enzima se dá no sitio

ativo, local que permite a interação de alguns resíduos de aminoácidos da cadeia protéica

(TORTORA; FUNKE; CASE, 2005; DEUTCH, 2007; KANDASAMY et al; 2012; ROCHA et al;

2015; MARCHAND et al ; 2017 ).

Possuem estrutura molecular complexa, constituída principalmente por uma parte proteica

que pode estar integrada a outras moléculas, como carboidratos e lipídeos (Figura 6). Esses

heteropolímeros são formados por aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas.

Sua produção é uma área da Biotecnologia em expansão, que vem movimentando bilhões de

dólares anualmente. Novas enzimas e usos estão sendo descobertas a partir do trabalho conjunto

de equipes multidisciplinares da Microbiologia, Bioquímica, Química, Engenharia Bioquímica,

entre outras áreas, complementando os conhecimentos que cada área possui sobre as enzimas

(PARK et al., 2002; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; SANTOS et al ; 2013 ; THADATHIL ;

VELAPPAN , 2014 ; CARVALHO et al ; 2016)

Figura 6: Ilustração evidenciando o modo de ação enzimático

Fonte: Santos et al.(2013).

Apresentam três propriedades essenciais: a atividade, que é a capacidade da enzima de

agir de forma a reduzir a energia necessária para transformar um substrato em produto,

aumentando a velocidade da reação; a especificidade, sendo esta a afinidade da enzima por

grupos específicos em um determinado substrato; e a estabilidade, que é a dependência de uma

enzima por sua estrutura nativa, que é mantida por meio de pontes de hidrogênio, ligações de

sulfeto, forças de Van der Waals, interações apolares e iônicas (SONG et al., 2012; CHÁVEZ-

GONZÁLEZ et al ., 2012 ; ROCHA et al ; 2015 ; MUSLIM ; MAHAMMED ; MUSAFER ,2015 ;

PEREIRA; FERNÁNDEZ-GIMENEZ , 2017).

24


O mercado mundial de produção enzimática movimenta anualmente bilhões de dólares.

Esses investimentos são justificados pelo interesse nos processos que envolvem tecnologia de

baixo custo energético, que causam um menor impacto ambiental e utilizam matérias-primas

renováveis, através da utilização e reaproveitamento de diversos subprodutos oriundos da

agroindústria (BOM ; FERRARA ; CARMO, 2008 ; PANDEY et al ., 2010 ; SARROUH et al ., 2012;

SANTOS et al ; 2016).

A utilização de diversos gêneros microbianos para produção de inúmeros compostos

bioativos tem aumentado nas últimas décadas devido à grande eficiência que esses organismos

apresentam na produção de metabólitos secundários, principalmente as enzimas microbianas.

Entre estes compostos bioativos tem-se destacado as enzimas que apresentam como principal

função a ação catalítica, ou seja, aceleram as reações bioquímicas, com extrema importância para

o controle de processos biológicos. Dentre as diversas fontes de enzimas, os micro-organismos

compõem um dos maiores recursos genéticos disponíveis. Muitas espécies, inclusive, tem sido

alvo para investigação da potencialidade industrial, principalmente como fontes de amilases,

celulases e proteases, que tem especial uso no processamento de alimentos e detergentes

(VELOORVALAPPIL et al ; 2011; TAVARES et al ., 2012 ; ADRIO ; DEMAIN , 2014 ; MUNIZ et al ;

2014 ; ROCHA et al ; 2015 ; NASCIMENTO et al ; 2014 ; MUNIZ et al ; 2014 ; REIS et al ; 2015;

PEREIRA; FERNÁNDEZ-GIMENEZ , 2017).

Enzimas microbianas são conhecidas por desempenhar um papel crucial como

catalisadores metabólicos, levando a sua utilização e aplicação em diversas indústrias.

São compostos extracelulares secretados no meio de cultura. A procura de enzimas para uso

industrial teve um contínuo aumento, impulsionado por uma crescente necessidade de soluções

sustentáveis. Sendo assim são mais utilizadas que as enzimas de plantas e animais devido à

grande variedade catalítica, além de serem obtidas em elevadas quantidades, com preço

relativamente reduzido, possuindo bastante homogeneidade e qualidade (NASCIMENTO;

MARTINS, 2005; BOM; FERRARA ; CARMO , 2008 ; RIBEIRO et al ; 2013; ADRIO ; DEMAIN ,

2014 ; SPECIAN et al ; 2014;UDAY et al ; 2016).

A produção de enzimas microbianas é um evento necessário nos diversos setores

industriais, devido às suas elevadas performances sob uma ampla gama de condições física e

química. Servem como um substituto potencial, na ausência ou insuficiência de enzimas

humanas. Também são a fonte preferida da indústria enzimática pois, podem ser produzidas em

grandes quantidades numa curto período de tempo pois a produção pode ser otimizada através

de manipulações genéticas que são executadas sobre as células dos micro-organismos

(principalmente bactérias) com o objetivo de aumentar a produção enzimática (BATTESTIN;

MATSUDA; MACEDO, 2008; PRASAD et al., 2012; ANBU et al ; 2015; SATYANARAYANA;

JOSHI, 2015 ; LYLLOFF et al ; 2016).

25


Enzimas microbianas tornaram-se uma tendência no campo da engenharia de proteínas

para ultrapassar as limitações dos biocatalisadores naturais e para desenvolver enzimas com

especificidades para cada processo. Os cientistas vêm tentando gerar enzimas que podem

suportar condições adversas e desfavoráveis, prevalecentes em processos industriais, como a

tolerância a variações de temperaturas, atividades em ambientes alcalinos ou ácidos, alto

desempenho em meios não aquosos, aumento da resistência protéica evitando uma rápida

desnaturação etc (HAKI; RAKSHIT, 2003; NELSON ; COX , 2006 ; PANDEY et al., 2010;

CARVALHO et al ; 2015 ; JOSHI ; SATYANARAYANA , 2015; HAMMAMI et al ; 2017).

Estas enzimas são amplamente utilizadas em uma série de outras aplicações. Indústria de

alimentos, têm sido utilizadas na síntese de aminoácidos, indústrias químicas na produção de

petróleo, na indústria de papel para produção de celulose. Também são utilizados para a

eliminação de poluentes contendo enxofre através da biodegradação de compostos como

dibenzotiofeno, na produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol e na substituição de reagentes

químicos que geram poluentes tóxicos (SATYANARAYANA; JOSHI , 2015 ; CARVALHO et al .,

2016).

Alguns exemplos de enzimas e micro-organismos produtores podem ser visualizados na Tabela

3

Tabela 3 – Enzimas e micro-organismos produtores

ENZIMA ATUAÇÃO MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES

Amilases

Proteases

Hidrolisam o amido

Hidrolisam as proteínas

Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae,

Aspergillus niger,

Aspergillus flavus,

Aspergillus awamori

Glicose Oxidase oxida a glicose

em ácido glicônico

Aspergillus niger, Penicillium

amagasakiense, Penicillium notatum

Lactase Hidrolisa a lactose do

leite

Saccharomyces fragilis,

Zygosaccharomyces lactis

Lipases Hidrolisam triglicérides Aspergillus niger, Rhysopus sp

Proteases

Hidrolisam proteínas

Bacillus subtilis, Bacillus liheniformis

Aspergillus oryzae, Endothia arasítica

Mucor pusillus, Aspergillus flavus

Fonte: (Adaptado de Tomotan; Neves; Vitolo (2005).

26


1.3.4 Proteases

Constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise de proteínas

e as degradam em pequenos peptídeos e aminoácidos. A relevância deste grupo de enzimas,

ricas em diversidade e mecanismos de ação estrutural se reflete na importância de suas

aplicações em processos industriais. Estas enzimas microbianas, estão entre as mais importantes

enzimas hidrolíticas e têm sido estudadas extensivamente, representam um dos três grupos de

enzimas industriais responsável por aproximadamente 60 % das vendas totais de enzima no

mundo (ABIDIA et al ; 2014 ; ROCHA et al ; 2015; MUSLIM; MAHAMMED; MUSAFER., 2015 ;

CUNHA et al ; 2016).

Apresentam uma vasta gama de aplicações industriais: detergentes, processamento de

couros, produção de alimentos e medicamentos, tratamento de efluentes. E são enzimas de

caráter indutivo, ou seja, precisam de um indutor para serem secretadas pelos micro-organismos

(GUPTA ; BEG, 2002 ; NASCIMENTO et al ., 2006 ; FUJINAMI ; FUJISAWA , 2010 ; KUDDUS ;

RAMTEKE, 2012 ; LYLLOFF et al ; 2015; HAMMAMI et al ; 2017 ).

Possuem uma alta especificidade catalítica (Figura 7). E diferem entre si através de suas

especificidades pelo substrato, sítio ativo, mecanismo catalítico, perfis de estabilidade e atividade

quanto à temperatura e pH (BEYNON; BOND, 2001; SAWANT; NAGENDRAN; 2014; LYLLOFF

et al; 2016).

Figura 7 – Representação da hidrólise de uma ligação peptídica por uma protease.

Fonte: Beynom;Bond ( 2001).

Proteases extracelulares desempenham um papel crítico na hidrólise de nutrientes

proteícos. Podem funcionar numa variedade de ambientes, não se limitando ao lado interno da

célula. Do ponto de vista funcional, as proteases podem ser subdivididas em exopeptidases

enzimas que clivam um ou alguns aminoácidos a partir da N- ou C-terminal e endopeptidases

enzimas que atuam sobre a cadeia de polipeptidos interna. São enzimas de caráter indutivo, ou

27


seja, precisam de um indutor para serem secretadas pelos micro-organismos. Outro parâmetro de

suma importância é fornecer um ambiente propício ao crescimento microbiano (OLIVEIRA et al ;

2012, KUMAR et al ., 2012; SANKARALINGAM et al ., 2012 ; VEILARD ; LAURENT ;

REICHHART et al; 2016).

Estão envolvidas diretamente nos processos biológicos essenciais, tais como a

coagulação sanguínea, morte celular, diferenciação de tecidos, catabolismo de proteínas,

processamento e transporte de proteínas secretoras através da membrana. Além da sua

importância fisiológica, as proteases possuem inúmeras aplicabilidades biotecnológicas (GUPTA;

BEG ; LORENZ, 2002; VISHWANATHA; RAO; SINGH ; 2010 ; ERJAVEC et al ; 2012 ; KUDDUS ;

RAMTEKE , 2012 ; SAWANT ; NAGENDRAN , 2014 ; SOUZA et al ; 2015; MHAMDI et al ; 2017).

Muitas proteases estão associadas com doenças como o câncer, a osteoporose, doenças

inflamatórias e neurodegenerativas, bem como doenças parasitárias, virais ou bacterianas, visto

que elas estão envolvidas na patogênese de várias doenças e que podem ser bons alvos

terapêuticos, juntamente com os seus inibidores específicos (HUBBUCH; KULA , 2011 ; ZHANG ;

HUANG ; LUO , 2013 ; MACHADO et al ; 2014 ; HÖFFNER ; BARTON , 2014 ; CUNHA et al ;

2016).

Das enzimas industriais, 75 % são hidrolases, sendo que as proteases representam

aproximadamente 40 % desse total utilizadas na indústria e são responsáveis por

aproximadamente 60 % da venda total de enzimas no mundo. Nas indústrias, as proteases

contribuem para o desenvolvimento de processos ou produtos de alto valor agregado (SEVINC;

DEMIRKAN, 2011; GUPTA et al ; 2012; SINGH; MUKHOPADHYAY., 2012; INÁCIO et al ; 2013 ;

VOJCIC et al ., 2015 ; UDAY et al ; 2016 ).

As proteases têm uma grande variedade de aplicações, principalmente nos detergentes,

processamento de couro, recuperação de metal, fins médicos, processamento de alimentos

industriais, bem como em tratamento de resíduos. Indústria de detergentes: enzimas para

detergentes são responsáveis por 89% das vendas totais da protease do mundo; Curtimento de

couro: Os métodos convencionais de processamento de couro envolvem produtos químicos

perigosos como o sulfeto de sódio, que criam problemas como a eliminação de efluentes. A

utilização de enzimas como alternativas aos produtos químicos tem sido bem sucedida na

melhoria da qualidade de couro e na redução da poluição ambiental. As proteases são utilizadas

para a hidrólise seletiva de componentes não colagenosos da pele e para a remoção de proteínas

não fibrilares tais como albuminas e globulinas, o que resultou numa redução significativa na

quantidade de águas residuais gerada (GERMANO et al ; 2003; CABRAL et al; 2004; PILLAI;

MANDGE; ARCHANA, 2011; JISHA et al; 2013; JENITTA ; PRIVA ; GANANADOS, 2015 ;

FLORES et al ; 2016 ).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Erjavec%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22341093

28


No tratamento dos rejeitos: Por solubilizar rejeitos protéicos, colaborando assim com a

redução da DBO em sistemas aquáticos, a utilização de proteases alcalinas que tem sido adotada

recentemente, na gestão dos resíduos domésticos e de várias indústrias de processamento de

alimentos iniciou uma nova era na gestão de resíduos. Podem ser eficientemente utilizadas para

remover obstruções em tubos de drenagem. Apresentam ainda grande utilidade na conversão de

resíduos gerados pelas indústrias de pescados, aves, carnes, e matadouros em produtos com

valor agregado, tais como farinha de peixe, farinha de penas, e rações animais. Grandes

quantidades de resíduos são geradas em forma de pêlos, penas e outros resíduos sólidos ricos

em proteínas em matadouros animais. Por exemplo, as penas constituem cerca de 5% do peso

corporal de um frango e com a utilização de queratinases (protease que age sobre a queratina),

produtos como pelos e penas podem ser utilizados para preparar suplementos e rações para

animais, aminoácidos e peptídeos (FACCHIN, 2013 ; SAWANT; NAGENDRAN, 2014 ; LI et al ;

2014; BRAR; VERMA, 2014 ; SOUZA et al ; 2015 ; XU et al ; 2017).

Todos os organismos são capazes de produzir proteases, independentemente do seu

reino. Cada micro-organismo possui características específicas tanto nutricionais como

ambientais. As características do meio de propagação são de suma importância para uma boa

secreção de metabólitos, pois quanto mais rápido o micro-organismo se adaptar ao meio, mais

rápida e eficiente será a secreção do metabólito de interesse. Fungos filamentosos secretam

eficientemente diferentes tipos de proteases. Sendo conhecidamente produtores de proteases

neutras, alcalinas e metaloproteases, e ainda um único organismo pode produzir mais de um tipo

de 13 protease. Proteases de origem fúngica também são ativas em um amplo espectro de pH

(pH 4 a 11) e exibem uma ampla gama de especificidade por substratos (HADDAR et al ., 2010 ;

FACCHIN , 2013 ; PILLAI ; MANDGE ; ARCHANA ; 2011; KALASKAR ; 2014 ; PANT et al ; 2015 ;

FLORES et al ; 2016).

Proteases microbianas estão entre as mais importantes enzimas hidrolíticas e têm sido

estudadas extensivamente. Têm atraído atenção na última década devido ao seu potencial

biotecnológico em vários setores industriais, tais como na produção de detergentes, indústrias

têxteis, indústrias de curtimento de couro, produtos lácteos e preparações farmacêuticas. Sendo a

fonte preferida na aplicação industrial de enzimas ,devido a alta vantagem técnica e econômica.

Este grupo representa um dos maiores grupos de enzimas industriais e constitui cerca de 60%

das vendas totais de enzimas do mundo (KUMAR et al ., 2005 ; SARAN ; ISA ; SAXENA, 2007 ;

ZAMBARE ; NILEGAONKAR , KANEKAR , 2011 ; ANITHA ; PALANIVELU, 2013 ; SOUZA et al ;

2015; XU et al ; 2017).

Nos últimos anos, tem havido inúmeras tentativas para produzir diferentes tipos de

protease em FSm ou SSF, utilizando diferentes tipos de substratos. Um grande número de fungos

têm sido utilizados como os pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor,

Humicola, Thermoascus, Thermomyces, entre outros. As proteases produzidas por Aspergillus

29


ssp., em particular, têm sido amplamente estudadas, uma vez que são conhecidas por sua grande

capacidade de secretar níveis elevados de enzimas no ambiente de crescimento. Várias destas

enzimas secretadas, têm sido amplamente utilizado na indústria alimentar e de bebidas ao longo

de décadas. Exemplo de espécies são Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae.

Proteases microbianas são as líderes do mercado de enzima industrial em todo o mundo, são

responsáveis por aproximadamente 60% do total da venda da enzima no mundo. O mercado

mundial de enzimas industriais foi estimado em US $ 3,3 bilhões em 2010, e é esperado para

chegar a US $ 4,4 bilhões até 2017 (MACCHIONE et al ; 2008; VISHWANATHA ; RAO ; SINGH,

2009; VISHWANATHA ; RAO; SINGH, 2010; KRANTHI ; RAO; JAGANMOHAN, 2012 ; SOUZA et

al; 2015 ; PUSHPA, KEN, 2015; LAURENT;REICHHART ; 2016).

Enzimas fúngicas são geralmente utilizadas nas indústrias devido a várias razões técnicas,

incluindo a facilidade de obtenção em grande concentração no meio de fermentação e oferecem

uma vantagem distinta sobre as enzimas bacterianas em termos de facilitar o processamento das

enzimas (HAJJI et al; 2010; SOUZA et al; 2015; PUSHPA; KEN, 2015;WU et al ; 2017).

A utilização de proteases em diferentes indústrias tem sido predominante durante muitas

décadas em detrimento ao elevado número de fontes microbianas existentes para a produção

eficaz desta enzima. Sua vasta diversidade, a ampla gama específica de ações e suas

propriedade de ser ativa em uma ampla faixa de temperatura e pH têm atraído a atenção desta

biotecnologia. A busca por micro-organismos que possa ser usado para a produção de protease é

um contínuo processo em razão do advento de novas fronteiras na área da biotecnologia,

aumentando o espectro de aplicações de protease que se expandiu para novos campos, tais

como clínica, medicamentos e química analítica (ABIDIA et al; 2014; SAWANT, NAGENDRAN,

2014; NAGENDRAN, 2014; SOUZA et al; 2015; XU et al ; 2017).

1.3.5 Processos Fermentativos

Existem dois tipos básicos de processos fermentativos para obtenção de metabólitos: a

fermentação no estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FSm) (Figura 8). A FES baseia-

se no crescimento dos microrganismos em substratos sólidos na ausência (ou quase) de água

livre, sendo um processo microbiano que geralmente ocorre na superfície dos materiais sólidos

que tem capacidade de absorver água, podendo ou não conter nutrientes solúveis. A fermentação

submersa (FSm) é um processo que disponibiliza os nutrientes para o microrganismo em meio

líquido. Nutrientes como peptonas, açúcares e substâncias complexas (vitaminas e íons) são

dissolvidos em água ou mesmo soluções tampões. Essas fermentações devem ser mantidas em

agitação constante para ideal aeração e disponibilidade de nutrientes (FARINAS et al ., 2011 ;

OLIVEIRA et al ; 2012; ORLANDELLI et al ., 2012 ; GULLO ; VERZELLONI ; CANONICO, 2014).

30


Figura 8 – Fermentação Submersa

Fonte: Orlandelli et al.(2012).

Enzimas microbianas podem ser obtidas por cultivo superficial em substratos sólidos,

também conhecida por fermentação semi-sólida (FSS), sólida (FS) ou em estado sólido (FES),

em que se pode utilizar diversos substratos/suportes. Majoritariamente, a produção de enzimas

em escala industrial é realizada por processo submerso devido a esta possuir relativa facilidade

de cultivo, garantir homogeneidade do meio e facilidade de parâmetros de controle de processo;

entretanto, a maior facilidade de contaminação devido à alta atividade de água e consequente

possibilidade de desenvolvimento de bactérias, leveduras e fungos filamentosos (WANDERLEY ;

NEVES ; ANDRADE, 2011 ; STROPARO et al., 2012; MUKHTAR ; HAQ , 2013 ; ROCHA et al ;

2015).

Os processos submersos são aqueles em que a célula produtora se desenvolve no interior

do meio de cultivo, geralmente agitado. A massa de células cultivadas fica totalmente submersa

de maneira uniforme no meio nutriente, que pode ser ajustado para fornecer as condições ideais

de crescimento e produção. Comparados com os processos em superfície (meio sólido), os

processos submersos oferecem uma serie de vantagens, como manipular, com maior facilidade,

maiores volumes de meio, facilidade operacional (SILVEIRA, 2003; YEGIN; GOKSUNGUR;

FERNANDEZ-LAHORE; 2012; MUKHTAR; HAQ, 2013; MOUNSEF et al., 2014).

Em escala industrial, exoenzimas como as proteases alcalinas, são produzidas em meios

de cultura complexos, contendo resíduos industriais e outros substratos. No entanto, sua

otimização é de grande importância para viabilizar o desenvolvimento de tecnologia em países

importadores (Figura 9). O uso de substratos de baixo custo, como resíduos industriais, tem sido

uma alternativa para reduzir os custos de produção (PANDEY, SOCCOL ; MITCHELL , 2000 ;

LADEIRA et al., 2010 ; MUKHTAR ; HAQ , 2013 ; BUENROSTRO-FIGUEROA et al ., 2014).

31


Figura 9: Fluxograma simplificado da produção de enzimas microbianas utilizando o processo de

fermentação submersa

Fonte: Orlandelli et al.(2012).

1.3.6 Substratos Alternativos Utilizados na Produção De Bioprodutos

Devido à elevada demanda pela industrialização e consequente exploração dos recursos

naturais, uma quantidade muito grande de resíduos tem se acumulado no meio ambiente. Estes

resíduos têm composições diversas podendo ser compostos orgânicos ou inorgânicos, cadeias

com alto ou baixo peso molecular, ser de fase sólida, líquida e/ou gasosa. Na maioria das vezes

os resíduos são complexos, apresentando composição combinada de diferentes compostos.

Alguns resíduos podem ser reciclados, como certos materiais plásticos, metálicos, cerâmicos e

celulósicos, evitando seu descarte no meio ambiente. Resíduos orgânicos que não são reciclados

podem ser aproveitados, em muitos casos, como ingredientes em formulações de novos produtos

e, por processos biotecnológicos, podem ser valorizados quando utilizados como substratos para

a geração de produtos com elevado valor agregado, como enzimas e antibióticos (RUFINO;

SARUBBO; CAMPOS-TAKAKI, 2007; BHATNAGAR; SILLANPÄÄ, 2010; TUCK et al., 2012;

SANTOS et al ; 2012; BANASZEWSKA et al., 2014; SANTHI, 2014; VARDANEGA; PRADO;

MEIRELES, 2015; ALBANO et al ; 2017).

A utilização de substratos alternativos regionais e de baixo custo na formulação de meios

de produção de diversos bioprodutos torna-se uma alternativa considerada interessante e

econômica, pois além da sua facilidade de aquisição, os substratos agroindustriais apresentam

baixo ou quase nenhum custo.. A tendência atual é de aproveitar estes materiais, obtendo

produtos com alto valor agregado, como as enzimas. Recentemente, vários subprodutos têm sido

utilizados como substratos para micro-organismos em processos fermentativos, visando à

produção de enzimas. Por sua ampla disponibilidade e por representar uma fonte alternativa de

baixo valor comercial, o aproveitamento destes materiais pode contribuir para a redução do custo

32


operacional da produção enzimática, além de minimizar possíveis impactos ambientais

decorrentes do seu descarte inadequado (GOLDEMBERG, 2008; DELATORRE et al., 2009;

LEITÃO et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2012; BERNADES, 2014; MA et al; 2015 ; SILVA

;MALTA,2016).

O Brasil apresenta sua economia baseada principalmente no agronegócio. Devido a

crescente demanda deste setor, há geração de grande quantidade de resíduos agroindustriais

oriundos dos processamentos dos alimentos. Muitas vezes, esses resíduos representam um

grande problema, pois são descartados no meio ambiente. No entanto, muitos deles são ricos em

compostos bioativos, reconhecidos por aplicações tecnológicas, representando fontes naturais

destas substancias (LOPES et al; 2013; BALI; PANESAR; BERA, 2014; FARIASA et al., 2014;

VARDANEGA; PRADO; MEIRELES, 2015 ; RODRIGUEZ et al ; 2017).

Uma ampla variedade de subprodutos, têm sido utilizados na produção de muitos metabólicos

microbianos, pois a grande disponibilidade e a composição da matéria-prima utilizada pode

contribuir consideravelmente para a diminuição do custo de produção. Estima-se que 10% a 30%

da matéria-prima, represente o custo total de um produto biotecnológico através da formulação de

meios de produção (FEDERICI et al., 2009; NEE’NIGAM ; GUPTA; MANDER et al., 2014; MA et

al; 2015; ALBANO et al ; 2017).

O reaproveitamento de resíduos industriais como fontes de carbono e de nitrogênio na

elaboração de meios de produção tem sido frequentemente investigado em pesquisas científicas

na área biotecnológica, por se apresentarem potentes fontes nutritivas para o cultivo de micro-

organismos (MALDONADO; MACEDO; RODRIGUES, 2014; VARDANEGA; PRADO; MEIRELES,

2015).

A aplicação de resíduos agroindustriais não apenas representa substratos alternativos para os

processos fermentativos, mas também ajuda a reduzir custos de fabricação de produtos, com

elevado valor agregado e a resolver problemas de poluição ambiental relacionados ao acúmulo ou

má disposição desses resíduos. A produção de enzimas, a partir de técnicas de conversão

biológica com a utilização de resíduos agroindustriais, tem sido cada vez mais estudada devido à

sua aplicabilidade em diferentes setores industriais, nos quais se destacam indústrias de

alimentos e bebidas, têxteis, papeleiras e farmacêuticas (DIAS et al; 2008; CARDOSO et al;

2008; GUSMÃO et al; 2014; WASTOWSKI et al., 2015).

1.3.6.1 Soro de Leite

O soro lácteo ou soro do leite bovino (Figura 10) é um líquido que contém de 4 a 6 g de

proteínas por litro. É a porção aquosa liberada do coágulo durante a fabricação convencional de

33


queijos, considerado um efluente residual que pode acarretar graves problemas ambientais

associados ao seu alto teor de matéria orgânica. Cerca de 90 a 95% do volume do leite usado

para a fabricação de queijos resultam em soro, o qual contém, aproximadamente metade dos

sólidos totais do leite, incluindo proteínas solúveis, sais e principalmente lactose (PACHECO et al.,

2005; PELEGRINE; CARRASQUEIRA ; 2008; BIEGER; RINALDI, 2009; CHAVES; CALLEGARO;

SILVA, 2010; OLIVEIRA; BRAVO; TONIAL, 2012; POPPI et al., 2014;COSTA et al ; 2016).

Figura 10 – Soro de Leite

Fonte: Autoria própria (2016).

A composição do soro varia de maneira substancial, dependendo da variedade de queijo

produzido, dos processos tecnológicos empregados e do tipo de leite utilizado na produção de

queijo ou de caseína. A maior parte da água contida no leite faz parte do soro, onde também se

encontram compostos como lactose, proteínas solúveis, sais minerais e gordura, sendo que 70%

dos sólidos totais deste soro são constituídos por lactose e 20% pelas proteínas do soro

(RÉVILLION; BRANDELLI; AYUB;2000; OLIVEIRA, 2009; ZIEGLER ; SGARBIERI, 2009;

ALMEILDA et al ; 2013; ANDRADE; NETO; LOPES,2015).

Contém, em média, 93 % de água, 5 % de lactose, 0,9 a 0,7 % de proteínas, 0,5 a 0,3 %

de gordura, 0,2 % de ácido láctico e pequenas quantidades de vitaminas. A fração protéica

contém, aproximadamente, 5 0 % de b lactoglobulina, 25 % de a-lactoalbumina e 25 % de outras

frações protéicas, incluindo imunoglobulinas observados na (Tabela 4) (FITZSIMONS ;DANIEL ;

EDWIN ,2006 ; OLIVEIRA;BRAVO;TONIAL, 2012; BITELLO et al ; 2013; FERNAMDEZ et al ;

2016).

34


Tabela 4 – Concentração de Proteínas no soro de Leite.

Fonte: Bobbio; Bobbio(2001).

As proteínas solúveis do soro possuem peptídeos bioativos contendo alto teor de

aminoácidos essenciais, especialmente os de cadeia ramificada, tais como leucina, isoleucina e

valina, que estão relacionados com fatores de crescimento, reconstrução e reparação muscular

(HARAGUCHI; ABREU; PAULA 2006; RENHE, 2008; SOUSA et al., 2012; ALMEIDA et al; 2013;

POPPI et al ., 2014;FERNAMDEZ et al 2016).

A composição média de aminoácidos no soro de leite é de (mg/ proteína) é: triptofano

(1,3), cisteína (1,7), glicina (1,7), histidina (1,7), arginina (2,4), fenilalanina (3,0), metionina (3,1),

glutamina (3,4), tirosina (3,4), asparagina (3,8), serina (3,9), prolina (4,2), treonina (4,6), isoleucina

(4,7), valina (4,7), alanina (4,9), lisina (9,5), ácido aspártico (10,7), leucina (11,8) e ácido glutâmico

(15,4) (HARAGUCHI; ABREU; PAULA, 2006; ALMEIDA et al; 2013; SOARES;

SILVA;OLIVEIRA,2016 ).

As proteínas do soro do leite apresentam uma estrutura globular contendo algumas pontes

de dissulfeto, que conferem um grau de estabilidade estrutural. As frações, ou peptídeos do soro,

podem ser divididos de acordo com a sua concentração no soro, em proteínas majoritárias, que

correspondem a β- lactoglobulina, α-lactoalbumina, albumina do soro bovino (BSA),

imunoglobulinas, glico-macropeptídeos (GMP), peptona e proteases e em proteínas minoritárias

ou sub-frações, como é o caso da lactoferrina e da lactoperoxidase. Essas frações podem variar

em tamanho, peso molecular e função, fornecendo às proteínas do soro características especiais

que serão descritas a seguir (HARAGUCHI ; ABREU ; PAULA, 2006; YÜKSEL, ERDEM, 2009;

SOUSA et al ., 2012; ALMEIDA et al ; 2013; COSTA et al ; 2016).

O soro é um dos poluentes líquidos que mais contribuem para a alta carga poluidora das

indústrias de laticínios. A demanda bioquímica de oxigênio (DBO 5) do soro varia de 25.000 a 1

Proteína Concentração(g/L)

Β- lactoglobulina 3,50

α - lactoalbumina 0,84

Albumina do soro bovino 0,70

Imunoglobulina 0,35

Protease-peptona 1,40

35


20.000 mg.L, o qual contém metade dos sólidos do leite integral. As indústrias produtoras de

derivados de leite têm enfrentado grandes problemas com os resíduos gerados em sua produção.

Estima-se que para cada quilo de queijo produzido, a indústria de laticínios gere nove quilos de

subproduto com alta concentração de matéria orgânica. Descarte em rios, esgotos e solo,

alimentação animal, evaporação e secagem, desmineralização, extração e refino de lactose, bem

como ultrafiltração são destinos comumente dados ao soro de leite (CETESB, 2008; BIEGER,

RINALDI, 2009; SILVA; PACHECO; ANTUNES; 2010; OLIVEIRA; BRAVO; TONIAL, 2012;

ROHLFES et al., 2014; SOARES; SILVA;OLIVEIRA,2016).

No Brasil ainda é um efluente de preocupação, estima-se que só 15% do soro de queijo

produzido anualmente, cerca de 70.000 toneladas, é utilizado em outros setores industriais.

Alguns pesquisadores têm utilizado soro de queijo como substrato para o crescimento de

microorganismos para fins biotecnológicos. Em termos ambientais esse processo é bastante

interessante, pois resíduos que inicialmente seriam descartados, podem ser transformados em

produtos de alto valor agregado (DIAS et al ; 2008; CARDOSO et al ; 2008; GUSMÃO et al ; 2014

; COSTA et al ; 2016).

1.3.6.2 Resíduo de Sorvete

O sorvete é uma excelente fonte de energia, devido principalmente ao seu alto conteúdo de

carboidratos e gordura. As proteínas do leite representam de 34 a 36% de seus sólidos não

gordurosos, e o sorvete contém elevada concentração de minerais e vitaminas, cujo conteúdo

dependerá primariamente da quantidade de sólidos do leite utilizados na formulação (SOUZA et

al; 2010; ZULIM et al., 2013; WARREN; HARTEL, 2014;OLIVEIRA;GOMES;RICARDO,2016).

As indústrias de sorvete, derivadas das indústrias de laticínios, contêm em seus despejos

quantidades variáveis de leite diluído e sólidos flutuantes (principalmente substâncias graxas de

variadas fontes), apresentando elevada demanda bioquímica de oxigênio (DBO) e sólidos

suspensos (NAIME ; GARCIA, 2005 ; VILELA, 2012; WARREN ; HARTEL, 2014 ; NASCIMENTO

et al ; 2016 ).

Contém basicamente uma composição bastante variada, normalmente apresentando de 8 a

20 % de gordura, 8 a 15 % de sólidos não gordurosos do leite, 13 a 20 % de açúcar e 0 a 0,7 %

de emulsificante-estabilizante, porém pode haver variabilidade de acordo com a região (SOUZA et

al ; 2010 ; KARAMAN; KAYACIER, 2012; SUN-WATERHOUSE et al., 2013; PATEL; DHARAIYA;

PINTO, 2014;PASSOS et al ; 2016 ).

Nutrientes como nitrogênio e fósforo, presentes no leite, são considerados essências para os

tratamentos biológicos, contudo, quando gerados em grandes quantidades em processadoras de

laticínios se constituem poluentes inorgânicos, ocasionando a extrapolação desse tipo de efluente,

36


o qual possui cerca de 3 % de proteínas e 1.000 mg / L de fósforo e pode vir a causar a

eutrofização dos rios (CORRÊA et al., 2007; BRUM; SANTOS ; JUNIOR ; BENEDETTI, 2009;

VILELA, 2012 ; ZULIM et al ., 2013 ; SILVA et al ; 2016).

As proteínas são um dos fatores que contribuem de maneira significativa para o

desenvolvimento da estrutura do sorvete e influenciam a emulsificação, batimento e capacidade

de retenção de água. Os principais tipos de açúcares adicionados ao sorvete são glicose e

sacarose, os quais contribuem para a diminuição do ponto de congelamento, aumento da

viscosidade e cremosidade do produto (LIM et al.,2008 ; SOUZA et al;2010 ; PATE;, DHARAIYA

;PINTO, 2014 ; MORAIS,2015).

As principais proteínas encontradas no leite são as caseínas, proteína do soro (globulina e

albumina) e proteínas das membranas dos glóbulos de gordura. As proteínas devido aos grupos

laterais hidrófobos que contém, formam parte da membrana que recobre os glóbulos de gordura,

determinando com os estabilizantes e emulsificantes, as propriedades reológicas do gelado

(CORRÊA et al., 2007; SOUZA et al; 2010; BAHRAMPARVAR; MAZAHERI , 2011 ; HONORATO

et al ., 2014 ; SILVA et al ; 2016)

A lactose é o carboidrato do leite sendo que o seu poder adoçante e a sua solubilidade são

menores quando comparados aos de outros açúcares. Esta intervém na textura do sorvete, dá

sabor doce. Os sais minerais, além dos inerentes aos ingredientes utilizados na formulação do

sorvete, são geralmente utilizados em quantidades limitadas (aproximadamente 0,1 %). Este

incremento visa alterar as propriedades de manipulação e aparência do produto (CORRÊA et al .,

2007 ; SOUZA et al ; 2010 ; HONORATO et al ., 2014 ; ALMEIDA et al ; 2016).

Os resíduos gerados nos diversos processos de fabricação da indústria de sorvetes (Figura

11) apresentam uma elevada carga nutricional, que muitas vezes são descartados, quando

poderiam ser reaproveitados para elaboração de meios de produção de compostos de elevado

potencial biotecnológico, como enzimas, lipídeos, biossurfactantes etc (FRIEDECK ; ARAGUL-

YUCEER ; DRAKE ; 2003 ; COSTA et al ., 2008 ; SOUZA et al ; 2010 ; PASSOS et al ; 2016).

Figura 11 – Resíduo de Sorvete

Fonte: Autoria própria (2016).

37


1.4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO II

Produção de Protease por Aspergillus spp. Isolados da

Caatinga Pernambucana Através de Fermentação

Submersa Utilizando Diferentes Meios de Produção

Manuscrito a ser submetido para publicação na Revista African Journal of Biotechnology ISSN:

1684-5315

57


Produção de Protease por Aspergillus spp. Isolados da Caatinga Pernambucana Através de

Fermentação Submersa Utilizando Diferentes Meios de Produção

PROTEASE PRODUCTION BY ASPERGILLUS SPP. ISOLATES OF PERNAMBUCANA CAATINGA THROUGH

SUBMERSAL FERMENTATION USING DIFFERENT MEANS OF PRODUCTION

Felipe, André Pereira Amaral 1* ; Tainã Crisia de Souza Fonseca 2, Paloma Santa Cruz de Sales 3;

Carlos, Alberto Alves da Silva 4

1 Universidade Católica de Pernambuco(UNICAP),Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais,

NPCIAMB,Recife/PE/Brasil ,[email protected],987275459.

2 Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP),Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais,

NPCIAMB, Recife/PE/Brasil ,

3 Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP),Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais,

NPCIAMB, Recife/PE/Brasil,

4 Universidade Católica de Pernambuco(UNICAP),Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais,

NPCIAMB, Recife /PE/Brasil [email protected],999965214.

* Autor Correspondência

Felipe Andre Pereira da Cunha Amaral. Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP) ,Núcleo de

Pesquisas em Ciências Ambientais, NPCIAMB, R. do Príncipe, 526 – Boa Vista,CEP, 50050-900, Recife ,

Pernambuco-Brasil-987275459 - [email protected]

Resumo

O aproveitamento de novas amostras de micro-organismos para produção de enzimas microbianas por

processos fermentativos tem aumentado nas últimas décadas. O gênero Aspergillus spp. se destaca na

produção de uma grande quantidade de produtos biotecnológicos de alto valor agregado. As enzimas

microbianas como as proteases apresentam uma alta especificidade catalítica, pois atuam principalmente na

hidrólise de proteínas e de aminoácidos. Neste estudo foram realizados testes para avaliar o potencial de 3

amostras de Aspergillus spp., (SIS18,SIS20 e SIS19) isoladas da Caatinga, Pernambuco, Brasil, de produção

da enzima protease em meio sólido utilizando diferentes temperaturas (28Cº, 37Cº e 40Cº). Após a seleção

da amostra com maior atividade proteolítica em meio sólido, foram realizados ensaios de produção

enzimática em fermentação submersa utilizando 3 diferentes meios a 150 rpm , 40oC, durante 96 h. Os

resultados revelaram que a amostra (SIS18) Aspegillus niger obteve o maior halo característico de produção

enzimática (3,0 cm) na temperatura de 40Cº, durante 96 h em estado sólido. A produção através da

fermentação submersa revelou que o meio denominado de 3 apresentou a maior atividade enzimática obtida

(0,104U/ mL).

Palavras-chave: fungos filamentosos, seleção condições, proteases microbianas

INTRODUÇÃO

A Caatinga é um bioma exclusivamente brasileiro, apresenta um mosaico de paisagem inserida em uma

região semiárida. Apresenta um clima semi-árido, quente e com baixos índices pluviométricos, baixa

umidade relativa do ar e altas temperaturas durante quase todo o ano. Sua vegetação é composta por: Matas

Úmidas, Matas Estacionais, Cerrados, Tabuleiros, Campos Rupestres e remanescentes de Mata Atlântica

(Silva et al.,2014; Muniz et al., 2014; Pereira et al .,2015; Carvalho et al., 2016).

mailto:[email protected]



58


Enzimas são proteínas que atuam como catalisadoras de reações químicas, são essenciais para o sistema

metabólico de todos os organismos vivos, possuem um papel fundamental na degradação da matéria

orgânica, na infecção do hospedeiro e deterioração dos alimentos. Têm como principal função a ação

catalítica, ou seja, aceleram as reações bioquímicas. Estão presentes na natureza, no organismo, no ambiente

e em todos os seres vivos (Tortora et al ., 2005 ; Deutch,2007; Orlandelli et al., 2012; Kandasamy et al.,

2012; Tavares et al., 2012 ; Adrio, 2014; Lima et al.,2014; Gonzalez ; Irineo,2014; Rocha et al.,2015).

As biomoléculas produzidas por micro-organismos como as enzimas microbianas são conhecidas por

desempenhar um papel crucial como catalisadores metabólicos, levando a sua utilização e aplicação em

diversos setores industriais. São compostos extracelulares secretados por micro-organismos diretamente no

meio de cultura , apresentam diversas vantagens como grande variedade catalítica, obtenção em elevadas

quantidades, com preço relativamente reduzido, bastante homogeneidade e qualidade (Nascimento, 2005;

Sharma ., 2013;Ribeiro et al.,2013;Kieliszek et al.,2014;Adrio et al.,2014;Specian, 2014;Majid, 2015).

A produção de enzimas microbianas é um evento necessário nos diversos setores industriais, devido as suas

elevadas performances sob uma ampla gama de condições física e química. Servem como um substituto

potencial, na ausência ou insuficiência de enzimas humanas. São a fonte preferida da indústria enzimática

pois, são obtidas em grandes quantidades, num curto período de tempo. São amplamente utilizadas em uma

série de outras aplicações na indústria de alimentos, na síntese de amino ácidos, indústrias químicas na

produção de petróleo, indústria de papel para produção de celulose etc. (Battestin et al .,2008; Souza et al .,

2010; Prasad et al., 2012; Verma et al.,2012; He et al., 2013 ; Satyanarayana, 2015; Anbu et al., 2015;

Carvalho et al., 2016).

As proteases constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise de proteínas e

degradam-as em pequenos péptidos e aminoácidos. Representam um dos três grupos de enzimas industriais

responsável por aproximadamente 60% das vendas totais de enzima no mundo. Possuem uma alta

especificidade catalítica. Apresentam uma grande variedade de aplicações, principalmente nos detergentes,

processamento de couro, recuperação de metal, fins médicos, processamento de alimentos industriais, bem

como em tratamento de resíduos (Beynon et al., 2001; Cabral, et al., 2004; Pillai et al ., 2011; Sevinc et al.,

2011; Gupta et al., 2012; Singh et al .,2012; Jisha, 2013; Inácio , 2013 ; Sawant et al ., 2014; Abidia et al.,

2014; Rocha, 2014; Muslim ; Mahammed et al ., 2015; Jenitta et al ., 2015; Vojcic et al., 2015).

Proteases microbianas estão entre as mais importantes enzimas hidrolíticas e têm sido estudadas

extensivamente. Têm atraído atenção na última década devido ao seu potencial biotecnológico em vários

setores industriais, tais como na produção de detergentes, indústrias têxteis, indústrias de curtimento de

couro, produtos lácteos e preparações farmacêuticas (Kumar et al., 2005; Saran et al ., 2007; Zambare et al .,

2011; Anitha et al ., 2013; Souza et al., 2015).

Aspergillus spp se destaca como um excelente produtor de metabólitos secundários de interesse industrial e

ambiental, pois apresentam uma elevada taxa de crescimento e uma grande termotolerância, o que favorece

estudos de seleção e produção de bioprodutos de alto valor agregado (Oliveira et al., 2012; Nascimento et al.,

2014; Lima et al., 2014).

O trabalho realizado teve como objetivos a seleção da melhor amostra de Aspergillus spp. isoladas do semi-

árido do Estado de Pernambuco produtoras de protease, temperatura e pH em meio sólido e seleção de meios

de produção em fermentação submersa a partir das melhores condições encontradas.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Micro-organismos

Foram utilizadas 3 amostras de Aspergillus spp. SIS 18 (Aspergillus niger), SIS 19 e SIS 20 isoladas de

amostras de solo da Caatinga do Estado de Pernambuco, catalogadas no Banco de Culturas daUniversidade

Católica de Pernambuco- Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais e Biotecnologia (NPCIAMB). As

culturas foram mantidas aclimatadas em meio Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), suplementado com o

indutor enzimático a gelatina, com a seguinte composição: dextrose (40g/L), peptona (10g/L), Agar

(20g/L),água destilada 1000m/L, pH 7,0 e suplementado com gelatina (2%).

59


Pré Inóculo

A contagem do número de esporos e de células em suspensão foi realizada em câmara de Neubauer e

microscópio binocular,utilizando-se volumes de 10 mL da suspensão, quantificados no valor de 107 UFC/mL

.

Seleção de amostras produtoras de protease em meio sólido

Para detecção da presença da enzima protease em meio sólido, foi utilizada a metodologia descrita por

Hankin et al. (1975). Foram preparadas placas contendo o meio de detecção da atividade da protease:

Extrato de carne (0,3%), Agar (1,5%), Peptona (0,5%) pH 7,0 e gelatina (5%) pH 6,0.

O meio de cultura foi distribuído em placas de Petri e, após a solidificação, foi feito um furo no centro das

placas, cujo diâmetro foi de 0,8cm. Foram preparadas suspensões espóricas com as três amostras de

Aspergillus denominadas (Aspergillus niger SIS 18, SIS 19 e SIS 20) e inoculados de 50µL a 100µL da

suspensão nos poços. As placas foram incubadas As placas foram incubadas em estufa com temperaturas

variadas (28 C°, 37C° e 40C°) e pH (6, 7 e 8) durante 96 horas com acompanhamento diário. As placas

foram reveladas com uma solução de iodo 0,1N, durante 5 minutos. Todos os experimentos foram realizados

em triplicata.

Seleção de meios de produção em fermentação submersa

Após a seleção da melhor amostra produtora de protease (SIS 18) catalogada como Aspergillus niger (SIS

18), foram realizados ensaios de produção da enzima através de fermentação submersa, utilizando meios de

produção, com as seguintes composições:

Meio 1: (pH 6,9)- g/L de água será feito 50 ml de uma solução de sais - (KH2PO4 (2 g/L), (NH4)2SO4 (1 g

/L), MgSO4.7H2O (0,1 g/L), Na2HPO4. 2H2O (0,9 g/L), extrato de levedura (1 g/L) acrescido de gelatina (5

g/L).

Meio 2:(pH 7,0) (g/L): MgSO4, 0,52; KCl, 0,52; KH2PO4, 1,52; FeSO4 · 7H2O, 0,01; ZnSO4.7H2O, 0,01 e

gelatina, 5.

Meio 3 (pH 7,0) - (g/L ): peptona, 5; Glicose,10; NaCI, 0,5; CaCl2 2H 2 O, 0,1; K 2 HPO 4, 0,3; KH 2 PO 4,

0,4; MgSO 4 · 7H 2 O, 0,1; e extrato de levedura 5g e gelatina (1%).

Meio 4: (pH 7,0) -5% (gelatina), 5% glicose, 5% de extrato de levedura, e 50 mL de uma solução de sais

(KH2PO4 0,23%, MgSO4 0,1%, K2HPO4 0,25%, FeSO4 0,1%)

A produção da protease foi realizada em shaker orbital utilizando Erlenmeyers de 250 mL, com volume útil

de 125 mL (% p:v), 150 rpm, temperatura de 40Cº, durante 96 horas, com acompanhamento diário. Todos os

ensaios foram realizados em triplicata.

Determinação da biomassa microbiana

A biomassa foi determinada após o término dos ensaios dos meios de produção. A massa micélial foi filtrada

em papel de filtro e o material retido foi transferido para frascos previamente etiquetados e pesados. Em

seguida destinados ao liofilizador para posterior quantificação da biomassa. O sobrenadante denominado

extrato enzimático foi utilizado para a determinação do pH e para a atividade enzimática.

Determinação do pH

Todas as amostras coletadas foram submetidas ao processo de leituras no potenciômetro para determinação

do pH.

Determinação da atividade enzimática

60


Para a determinação da atividade enzimática da protease nas amostras coletadas ao longo do processo de

produção, foi utilizada a metodologia descrita por Leogton et al. (1973).Foi preparada uma reação contendo

250 μL da solução azocaseina a 0,2% em solução tampão de Tris-HCl (0,05M, pH=8,0), previamente

aquecida em 40Cº. Foram utilizadas amostras de 150 μL de líquido metabólico obtido no processo de

produção em diferentes intervalos de tempo coletados.Em seguida, as amostras coletadas foram levadas para

um banho-maria a 40Cº, durante 10 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 500 μL de ácido

tricloroacético a 10% (TCA). Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 8.000 rpm, a

temperatura de 4Cº. Após o término da centrifugação, foram adicionados 500 μL de uma solução de NaOH

1M.A presença das enzimas proteolíticas foi observada através da leitura em espectrofotômetro a um

comprimento de 440 nm.

Uma unidade de atividade proteásica foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferença de

0,01 na absorbância entre o branco e a amostra, por minuto, nas condições do ensaio.A atividade enzimática

da protease foi calculada através da seguinte equação proposta por Leogton et al .(1973) : AE (U/mL) =

[ABS am * (Vam * fd / t)]

AE= atividade proteásica (U/mL unidades por litros); ABS am=absorbância da amostra; Vam= volume da

amostra (mL); fd = Fator de diluição; t= o tempo de reação em minutos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Seleção das amostras produtoras de protease em meio sólido

Foram realizados ensaios com as amostras de Aspergillus spp. , SIS 18 (Aspergillus niger), SIS 19 e SIS 20

em diferentes valores de temperatura e pH onde verifica-se que não houve nenhuma formação dos halo

característico da enzima nas temperaturas de 28Cº em todas as amostras testadas. Melo et al.(2015)

descrevem que a atividade proteolítica dos micro-organismos pode ser confirmada através de ensaios em

meios sólidos, onde a formação do halo característico indica a produção da enzima estudada, e quanto maior

o tamanho do halo formado, possivelmente será proporcional a atividade enzimática estudada. Relataram

também que um estudo da produção de protease em diferentes temperaturas e, verificaram que os maiores

níveis de enzima foram encontrados numa faixa de temperatura entre 37 Cº e 40 Cº. Os resultados realizados

nos ensaios com temperaturas entre 37Cº e 40 Cº confirmam os dados descritos na literatura.

A Tabela 1 apresenta os resultados da amostra de Aspergillus sp SIS 19, no meio sólido em diferentes

valores de pH e temperatura. Verifica-se que não houve nenhuma formação de halo correspondente à

enzima, nas temperaturas 28Cº, 37 Cº e 40 Cº, para o valor de p H8 desta amostra. De acordo com

Rodriguez-Zuñiga (2011) a produção de enzimas para fins comerciais em estado sólido, em comparação a

outros fungos, pode ser eficiente num tempo de 3 dias. O experimento apresentou um halo de crescimento

enzimático de 2,0 cm, nesse meio,para o valor de pH 7, na temperatura de 40 Cº, após 96 h de ensaio.

Micro-organismos crescem em meio sólido, sem a presença de água livre, utilizando a umidade do meio

(Canel et al .,1980), o que faz com que essa condição de crescimento tente se aproximar do habitat natural

do fungo.

A produção da enzima protease também foi observada nas Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3, para os mesmos

valores de pH, temperatura e horas de ensaio.Contudo a melhor produção enzimática foi obtida pelo fungo

Aspergillus niger (SIS 18) com pH 7,temperatura de 40 Cº e 96 horas( Tabela 2).

Tabela 1. Resultado da detecção de protease em meio sólido utilizando a amostra(SIS19)

Temperatura (oC) 48h 72h 96h

pH 6 37°C 1,5(cm) 1,5(cm) 2,0(cm)

40°C 1,5(cm) 1,5(cm) 1,5(cm)

pH 7 37°C 1,0(cm) 1,0(cm) 1,5(cm)

40°C 1,5(cm) 2,0(cm) 2,0(cm)

61


Tabela 2. Ensaio de detecção de protease em meio sólido utilizando a amostra (SIS18) Aspergillus niger


pH6 37°C 1,0(cm) 1,5(cm) 1,5(cm)

40°C 2,0(cm) 2,0(cm) 3,0(cm)

pH7 37°C 1,5(cm) 2,0(cm) 2,5(cm)

40°C 1,5(cm) 2,0(cm) 3,0(cm)

pH8 37°C 1,0(cm) 1,0(cm) 1,5(cm)

40°C 2,0(cm) 2,0(cm) 2,0(cm)

Tabela 3. Ensaio de detecção de protease em meio sólido utilizando diferentes amostras de Aspergillus sp.

(SIS 20)

A atividade enzimática foi determinada pelo método de Hankin et al .(1975) através da relação entre o

diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia, expresso como Índice Enzimático

(IE). A formação do halo transparente indicando a degradação da gelatina ao redor da colônia, evidência a

presença da protease. A determinação enzimática foi expressa com o cálculo do índice enzimático (IE)

mediante a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia. IE =

halo/crescimento da colônia.

A Figura 1 apresenta a formação do halo transparente indicando a degradação da gelatina ao redor da

colônia, evidência a presença da protease. A determinação enzimática foi expressa com o cálculo do índice

enzimático (IE) mediante a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia.

IE = HALO/CRESCIMENTO DA COLÔNIA. Hajji et al.(2007) descrevem uma temperatura ótima de

produção enzimática pelo fungo Aspergillus clavatus ES1 semelhante a obtida neste projeto. Silva et al.

(2011) e Savitha et al. (2011) descrevem a temperatura de 50Cº, para atividade enzimática. O pH ótimo

obtido neste trabalho ficou na faixa do pH 7 resultados semelhantes aos obtidos por Zanphorlin et al.(2011),

ao avaliarem os efeitos do pH na produção de protease.

Figura 1. Formação do halo característico da protease pelo fungo amostra SIS 18 catalogado como

Aspergillus niger. (+formação de halo/-ausência de halo).

Produção de protease em fermentação submersa

Após a seleção da melhor amostra produtora de protease em meio sólido, onde a amostra SIS 18 foi

selecionada, foram realizados ensaios para a produção de protease através de fermentação submersa

utilizando 4 diferentes meios. A Tabela 4 e a figura 2 descrevem os valores da atividade em fermentação


pH 6 37°C 1,5(cm) 1,5(cm) 2,0(cm)

40°C 1,0(cm) 1,5(cm) 1,5(cm)

pH 7 37°C 1,0(cm) 1,0(cm) 1,5(cm)

40°C 2,0(cm) 2,0(cm) 2,0(cm)

62


submersa. Segundo Landolo et al . (2011) e Pandey (2003), a fermentação submersa é uma alternativa

vantajosa e importante para obtenção de enzimas, vitaminas, hormônios, pigmentos, biopesticidas, entre

outros produtos de interesse industrial proteolítica nos 4 meios de produção em fermentação submersa.

Foram coletadas amostras a cada 24 horas durante 96 horas para determinação da biomassa, pH e atividade

enzimática.

Dois tipos básicos de fermentação são utilizados para a produção de enzimas: a fermentação submersa (FSm)

e a fermentação em estado sólido (FES), que oferece vantagens econômicas e ambientais (Landolo et

al.,2011). A Tabela 4 e Figura 2 informam os quatro resultados após 96 h de ensaio, através de fermentação

submersa, numa temperatura de 40º C, usando a amostra SIS 18 (Aspergillus niger), classificada, depois da

seleção, como a melhor produtora da protease.

Tabela 4. Determinação da atividade proteásica nos meios testados do fungo Aspergillus níger (SIS 18).

Para a realização do experimento foram utilizados quatro meios de produção na fermentação submersa. O

Meio 3 que utilizou- (g / L): peptona,5; Glicose,10; NaCI, 0,5; CaCl22 H2O, 0,1; K 2 HPO4, 0,3; KH2PO4,

0,4; MgSO 4·7H2O, 0,1; extrato de levedura 5g e gelatina (1%) e pH 7,0 apresentou as melhor atividade

proteolítica de 0,104 (U/mL). Huber (2000) , Cavalcanti et al.(2006) e Paul et al .(1989) observaram a

predominância de fungos Penicillium e Aspergillus, isolados dos solos estudado como excelentes produtores

enzimáticos. Cavalcanti et al.(2006), obtveram uma atividade proteolítica de 0,117(U/mL) próxima a obtida

nesse trabalho.

Figura 2. Atividade da enzima protease por Aspergillus níger (SIS 18) em 150 rpm a 40°C em 96 horas.

Na Figura 2 observa-se que o meio 3 em comparação com outros meios obteve a maior atividade

proteolítica após 96 h de fermentação comprovando que a maior produção enzimática ocorre ao final da fase

exponencial de crescimento. Confirmando os dados obtidos neste experimento, Melo et al.(2015) relataram

Ativ. Enzim.

(U/mL)

24h

Tempo

48h

72h

96h

Meio 1

Meio 2

Meio 3

Meio 4

0,014

0,040

0,022

0,014

0,018

0,019

0,025

0,020

0,050

0,050

0,086

0,052

0,061

0,053

0,104

0,060

63


que micro-organismos produzem maior quantidade de enzimas microbianas, como as proteases,

principalmente ao final da fase exponencial de crescimento.

Para Andrade(2002) obter enzimas por processos fermentativos através do trabalho com fungos

proporciona a vantagem de não tornar necessário o uso de métodos que usem grande quantidade de reações

químicas, já que seu micélio pode ser facilmente removido, por filtração a vácuo e centrifugação, obtendo-se

um extrato livre de células. Rao et al. (1988) acrescentam que os fungos são capazes de produzir uma maior

variedade de enzimas do que bactérias, entre elas: proteases ácidas, neutras ou alcalinas, ativas numa ampla

faixa de pH (4,0 a 11,0) e em uma ampla variedade de substratos.

Nascimento et al. (2015) reportam a máxima atividade da protease com Aspergillus niger com 96 horas de

cultivo idêntica ao obtido neste estudo. Castro et al.(2014) estudando o gênero Aspergillus spp. obtiveram

uma maior produção em 96 horas, o que pode ser explicado em função da variação dos nutrientes

empregados (Gupta et al.,2002). Oliveira et al.(2015) relatam uma máxima produção enzimática em 72 h de

fermentação. Channe, Shewale (1998), descrevem uma ótima produção enzimática 0,078(U/mL) em 96h de

experimento.

Outras condições empregadas no processo fermentativo como: tipo de fermentação, tipo e concentração do

substrato, temperatura de incubação e concentração da solução salina afetam a taxa de produção enzimática.

Avaliação do crescimento microbiano em diferentes meios de produção

Na tabela 5 esta descrito o crescimento do fungo Aspergillus niger (SIS 18) em diferentes meios através da

fermentação submersa. Os cultivos foram filtrados após os ensaios e levados para frascos etiquetados onde

foram liofilizados para uma quantificação da biomassa onde verificou-se que o meio 3 apresentou o melhor

resultado com um peso seco de 1,31(g/L) de biomassa no período de 96 h de fermentação submersa.

Tabela 5. Determinação da biomassa (g/L) do fungo Aspergillus níger ( SIS 18).

Jenitta et al. (2015) descrevem diversos fatores que influenciam no crescimento dos micro-organismos e que

influenciam na produção enzimática entre eles estão, as fonte de carbono como a glicose obtendo uma

atividade proteolítica de 0,094 (U/mL), fontes de nitrogênio, indutores enzimáticos e variações nas faixas de

pH.

Orlandelli (2012) descreve que a presença de elementos minerais (fósforo, enxofre, potássio, cálcio,

magnésio, sódio, ferro e cloro) e uma pequena quantidade de elementos traços, que desempenham importante

papel como constituintes de enzimas e coenzimas (manganês, cobre, zinco, molibdênio, crômio, níquel,

cobalto e boro), são geralmente necessários nos meios de produção de enzimas por micro-organismos,

aumentando assim sua biomassa microbiana.

Na Tabela 5 também pode-se observar a influência do tempo na produção de biomassa o que influencia

significativamente a produção enzimática. Campos et al.(2010) relatam que tanto o tempo quanto a

temperatura afetaram significativamente a produção de biomassa interferindo na produção enzimática.

Tempo (h) Aspergillus níger (SIS18)

Biomassa

Meio 1

Biomassa

Meio 2

Biomassa

Meio 3

Biomassa

Meio 4

24 0,9 1,09 0,8 1,18

48 1,23 1,25 1,12 1,48

72 1,37 1,45 1,21 1,64

96 1,51 1,61 1,31 1,98

64


Determinação do pH

Nos ensaios realizados foi observado uma variação do pH nos 4 diferentes meios testados. Observa-se que o

meio 3 e o meio 4 apresentaram a maior faixa de pH final 7,0 / 6,9 respectivamente enquanto que os meios

1 e 2, apresentaram valores de 5, 6 e 6,3 respectivamente.

O efeito do pH na atividade enzimática da protease produzida pelo Aspergillus níger foi observado em pH

ótimo de 7,0, como mostra a Tabela 6. O mesmo pH ótimo foi encontrado em uma protease alcalina

produzida por Aspergillus nidulans HA-10(Charles et al., 2008), utilizando meio sintético para o crescimento

do micro-organismo.

Tabela 6 . Determinação dos valores de pH nos meios testados do fungo Aspergillus níger ( SIS 18).

Melo et al.(2015) descreveram que o efeito do pH na velocidade das reações enzimáticas pode ser devido às

constantes alterações de estabilidade da enzima, da afinidade da enzima pelo substrato e da transformação

catalítica existente. Esses três fatores podem atuar de maneira isolada ou combinada, dependendo da situação

em estudo. Entretanto, deve-se levar em consideração que pH muito elevado pode diminuir a estabilidade da

enzima produzida.

Freitas(2013), descreve que as enzimas proteolíticas produzidas pelo fungo A. oryzae também obtive maior

atividade em pH 7,0. Silva (2013), descreve o Aspergillus oryzae como a principal fonte de protease neutra

fúngica.

O pH e os valores de temperatura apresentaram efeitos positivos significativos na atividade enzimática, ou

seja, o aumento dos valores destes parâmetros são favoráveis para a produção da enzima. O pH permaneceu

estável durante o processo fermentativo em ambos os meios, ficando em torno de 7,0 ± 0,7.

Conclusões

Estudar o amplo potencial biotecnológico dos micro-organismos coletados na Caatinga de Pernambuco

utilizando-os para produção de enzimas tem apresentado bons resultados, devido a ampla capacidade desses

micro-organismos de se adaptar e de produzir uma ampla gama de biomoléculas de alto valor

biotecnológico. Proteases são enzimas que catalisam a reação da hidrólise de proteínas, peptídeos ou

aminoácidos livres. A habilidade da amostra Aspergillus niger (SIS18) isolada da Caatinga de Pernambuco,

revela o grande potencial biotecnológico existente em micro-organismos que habitam ambientes pouco

estudados.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver qualquer conflito de interesse.

Referências

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Meio 0h 24h 48h 72h 96h

Meio 1

Meio 2

Meio 3*

Meio 4

7,0

7,0

7,0

7,0

7,3

6,2

5,6

5,8

7,2

6,1

6,0

5,7

6,2

6,3

6,8

5,6

5,6

6,3

7,0

6,9

65


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70


ANEXOS

Normas da Revista - Revista African Journal of Biotechnology ISSN: 1684-5315

71


AJB - Instructions for Authors

Introduction

Research ethics

Reporting guidelines

Preparing your manuscript

Title

Abstract

Abbreviations

The Introduction

Materials and methods

Results and discussion

Declaration of conflict of interest

Acknowledgments

References

Tables and figures

Acceptance Certificate

Payment of manuscript handling fee

Proofs

Publication

Publication Notification

Introduction

Authors should read the editorial policy and publication ethics before submitting their

manuscripts. Authors should also use the appropriate reporting guidelines in preparing their

manuscripts.

Research Ethics

Studies involving human subjects should be conducted according to the World Medical

Association (WMA) Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving

Human Subjects.

Studies involving non human animals should follow appropriate ethical guidelines such as

the Animal Welfare Act, The Animals (Scientific Procedures) Act (Amendment) Order

1993, The EU parliament directive on the protection of animals used for scientific

purposes, ARRP policies and guidelines, etc.

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Introduction

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Research Ethics

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Reporting guideline

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Preparing your manuscript

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Title

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Abstract

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Abbreviations

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#The Introduction

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Materials and methods

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Results and discussion

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Disclosure of conflict of interest

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Acknowledgments

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#References

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Tables and figures

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Acceptance Certificate

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Payment of manuscript handling fee

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Proofs

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Publication

http://www.academicjournals.org/journal/AJB/authors#Publication Notification

http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html

http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html

http://www.aphis.usda.gov/wps/portal/aphis/ourfocus/animalwelfare?1dmy&urile=wcm%3apath%3a%2Faphis_content_library%2Fsa_our_focus%2Fsa_animal_welfare%2Fsa_landing_page%2Fsa_spotlights%2Fct_awa_program_information

http://www.legislation.gov.uk/uksi/1993/2103/made

http://www.legislation.gov.uk/uksi/1993/2103/made

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:EN:PDF

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:EN:PDF

http://www.animalethics.org.au/policies-and-guidelines

72


Reporting guideline

Responsible reporting of research studies, which includes a complete, transparent, accurate

and timely account of what was done and what was found during a research study, is an

integral part of good research and publication practice and not an optional extra.

See additional guidelines for reporting of health research.

Preparing your manuscript

The type of article should determine the manuscript structure. However, the general structure

for articles should follow the IMRAD structure.

Title The title phrase should be brief. List authors’ full names (first-name, middle-name, and last-name). Affiliations of authors (department and institution). Emails and phone numbers

Abstract

The abstract should be less than 300 words. Abstract may be presented either

in unstructured or structured format. The keywords should be less than 10.

Abbreviations

Abbreviation should be used only for non standard and very long terms.

The Introduction

The statement of the problem should be stated in the introduction in a clear and concise

manner.

Materials and methods

Materials and methods should be clearly presented to allow the reproduction of the

experiments.

Results and discussion

Results and discussion maybe combined into a single section. Results and discussion may

also be presented separately if necessary.

http://academicjournals.org/guidelines_for_reporting_health_research

http://en.wikipedia.org/wiki/IMRAD

http://en.wikipedia.org/wiki/Abstract_(summary)

73


Disclosure of conflict of interest

Authors should disclose all financial/relevant interest that may have influenced the study.

Acknowledgments

Acknowledgement of people, funds etc should be brief.

Tables and figures

Tables should be kept to a minimum.

Tables should have a short descriptive title.

The unit of measurement used in a table should be stated.

Tables should be numbered consecutively.

Tables should be organized in Microsoft Word or Excel spreadsheet.

Figures/Graphics should be prepared in GIF, TIFF, JPEG or PowerPoint.

Tables and Figures should be appropriately cited in the manuscript.

References

References should be listed in an alphabetical order at the end of the paper. DOIs, PubMed

IDs and links to referenced articles should be stated wherever available.

Examples:

Baumert J, Kunter M, Blum W, Brunner M, Voss T, Jordan A, Klusmann U, Krauss S,

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classroom, and student progress. Am. Educ. Res. J. 47(1):133-180.

http://dx.doi.org/10.3102/0002831209345157

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Mishra A, Mishra SC (2001). Cost-effective diagnostic nasal endoscopy with modified

otoscope. J. Laryngol. Otol. 115:648-649.

http://dx.doi.org/10.1258/0022215011908739 PMid:11535147

http://dx.doi.org/10.3102/0002831209345157

http://dx.doi.org/10.1016/j.jdeveco.2003.03.002

http://dx.doi.org/10.1097/00006565-200104000-00013

http://dx.doi.org/10.1258/0022215011908739

74


Acceptance Certificate

Authors are issued an Acceptance Certificate for manuscripts that have been reviewed and

accepted for publication by an editor.

Payment of manuscript handling fee

Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will be contacted to make

the necessary payment of the manuscript handling fee. Kindly note that on the manuscript

management system, the payment option is only enabled for manuscripts that have been

accepted for publication.

Proofs

Prior to publication, a proof is sent to the corresponding author. Authors are advised to read

the proof and correct minor typographical or grammatical errors. Authors should promptly

return proofs to the editorial office.

Publication

Once proofs are received at the editorial office, the manuscripts are usually included in the

next issue of the journal. The article will thereafter be published on the journal’s website

Publication Notification

After the article is made available on the journal’s website, a publication notice is sent to the

corresponding author with links to the issue and article

http://ms.academicjournals.me/

http://ms.academicjournals.me/

75


CAPÍTULO III

Produção De Protease Por Aspergillus Niger (Sis 18)

Em Meios Contendo Resíduos Agroindustriais Utilizando

Planejamento Fatorial

Manuscrito submetido para publicação na Revista Engevista - ISSN: 1415-7314

76

AMARAL. C.P.A. Produção de protease por Aspergillus niger (SIS 18) em fermentação submersa utilizando meios alternativos contendo resíduos

agroindustriais

Produção de Protease por Aspergillus niger (SIS 18) em Meios

Contendo Resíduos Agroindustriais Utilizando Planejamento

Fatorial

Protease production by Aspergillus niger (SIS 18) in medium containing

agroindustrial residues using the factorial designer

Felipe André Pereira da Cunha Amaral 1

Tainã Crisia de Souza Fonseca 2

Paloma Santa Cruz de Sales 3

Carlos Alberto Alves da Silva 4

Resumo:A utilização de enzimas microbianas tem movimentado o mercado mundial industrial

e/ou ambiental, pelo interesse nos processos que envolvem baixo custo energético e pela

eficácia das enzimas. As proteases constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que

catalisam a hidrólise de proteínas e possuem diversas aplicações industriais. O gênero

Aspergilluss e apresenta como um excelente produtor de biomoléculas. A utilização de resíduos

provenientes das indústrias de alimentos tem surgido como uma excelente alternativa para

formulação de meios de produção em processos fermentativos, por apresentarem elevados

índices de nutrientes em sua composição. Foram realizados ensaios de produção de protease

através de planejamento fatorial 22 utilizando soro de leite e resíduo de sorvete. Os ensaios

ocorreram durante 144 horas, 37Cº, 150 rpm. Os resultados obtidos indicaram que ambos os

meios contendo os resíduos da indústria de alimentos obtiveram atividade proteolítica de

0,118U/mL para o soro de leite e de 0,093U/mL para o resíduo de sorvete, respectivamente.

1 Unicap - Universidade Católica de Pernambuco 2Unicap - Universidade Católica de Pernambuco 3Unicap - Universidade Católica de Pernambuco 4Unicap - Universidade Católica de Pernambuco

77


agroindustriais

A utilização de resíduos na formulação de meios alternativos tem surgido como uma opção

viável na produção de moléculas bioativas , pois reduzem os custos de produção enzimática.

Palavras-chave: formulação meios; protease fúngica ; produção enzimática.

Abstract: The use of microbial enzymes has moved the world industrial and / or environmental

market, due to the interest in the processes that involve low energy costs and the efficiency of

the enzymes. Proteases are a large group of hydrolytic enzymes that catalyze the hydrolysis of

proteins and have many industrial applications. The Aspergillus genus presents itself as an

excellent producer of biomolecules. The use of residues from the food industry has emerged as

an excellent alternative for the formulation of media of production in fermentative processes,

because they present high nutrient contents in their composition. Protease production tests were

performed through factorial design 22 using milk serum and ice cream residues. Assays occurred

for 144 hours, 37 ° C, 150 rpm. The results indicated that both media containing the food

industry residues obtained proteolytic activity of 0.118U / mL for milk serum and 0.093U / mL

for the ice cream residue, respectively. The use of residues in the formulation of alternative

media has emerged as a viable option in the production of bioactive molecules because they

reduce the costs of enzymatic production.

Keywords: media formulation; fungal protease; enzymatic production.

78


agroindustriais

1.Introdução

Enzimas são proteínas que atuam como catalisadoras de reações químicas, sendo

essenciais para o sistema metabólico de todos os organismos vivos, possuem um papel

fundamental na degradação da matéria orgânica, na infecção do hospedeiro e deterioração dos

alimentos (Gonzalez e Irineo , 2010; Orlandelli et al ., 2012;Tavares ,2013; Adrio e Demaino,

2014;Lima et al.,2014;).

Apresentam a função de catalisar as reações bioquímicas nos organismos vivos (Santos et

al .,2013; Thadathil e Velappan,2014 ; Carvalho et al .,2016).O mercado mundial de produção

enzimática movimenta anualmente bilhões de dólares. Esses investimentos são justificados pelo

interesse nos processos que envolvem tecnologia de baixo custo energético, que causam um

menor impacto ambiental e utilizam matérias-primas renováveis, através da utilização e

reaproveitamento de diversos subprodutos oriundos da agroindústria (Pandeyet al .,2010;

Sarrouh et al .,2012) .

Diversos gêneros microbianos (bacterias e fungos) são utilizados para a produção de

inúmeros compostos bioativos. Entres estes compostos estão as proteases microbianas ,que são

compostos extracelulares secretados no meio de cultura. Sua produção é um evento necessário

nos diversos setores industriais, devido às suas elevadas performances sob uma ampla gama de

condições física e química (Zhu et al., 2013; Adrio e Demaino,2014;Muniz et al.,2014;

Nascimento et al.,2014; Rocha e Silveira,2015; Reis et al.,2015; Tavares et al.,2014;

Satyanarayana e Joshi ,2015).

Aspergillus niger é uma das espécies que destaca-se pelo grande potencial biotecnológico

e aplicabilidade na indústria, na produção de ácidos orgânicos, em especial o ácido cítrico,

aplicado extensivamente nas indústrias alimentícia e farmacêutica e na produção de diversas

enzimas como a protease(Andersen et al .,2004 ; Andersen et al ., 2008 ; Coutinho et al .,2009;

Guo et al .,2010;Luna,2013).

As proteases constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que catalisam a

hidrólise de proteínas e degradam-nas em pequenos péptidos e aminoácidos, apresentam uma

vasta gama de aplicações industriais: detergentes, processamento de couros, produção de

alimentos e medicamentos, tratamento de efluentes etc (Germano et al.,2003;Cabral et al .,

2004; Nagaraju e Divakar ., 2011; Kuddus e Ramteke ,2012; Abidia et al .,2014; Jenitta et al .,

2015; Muslim et al.,2015; Rocha et al., 2015).

Hoje em dia, busca-se diversas alternativas que valorize os resíduos agroindustriais

através do seu reaproveitamento em diversas atividades já que podem contribuir positivamente

para a diminuição da poluição ambiental. O desenvolvimento de tecnologia por

79


agroindustriais

reaproveitamento de resíduos na produção de enzimas favorece o desenvolvimento sustentável,

fundamental na preservação do meio ambiente(Fernandes et al.; 2008; Menezes et al., 2012;

Lopes et al ., 2013 ; Lima et al ;2014).Diversos resíduos agroindustriais vêm sendo usados

como substratos para a produção de vários metabolitos, devido à sua grande disponibilidade e

por representar uma fonte alternativa de baixo valor comercial entre esses resíduos encontra-se

o soro de leite e resíduo de sorvete (Lima et al.,2014).

O soro lácteo ou soro do leite bovino é um líquido que contém de 4 a 6 g de proteínas por

litro. É a porção aquosa liberada do coágulo durante a fabricação convencional de

queijos.Considerado um efluente residual que pode acarretar graves problemas ambientais

associados ao seu alto teor de matéria orgânica. Contém , em média, 93 % de água, 5% de

lactose, 0,9 a 0,7% de proteínas, 0,5 a 0,3 % de gordura, 0,2% de ácido láctico e pequenas

quantidades de vitaminas. A fração protéica contém, aproximadamente, 5 0 % de b-

lactoglobulina, 25% de α-lactoalbumina e 25% de outras frações protéicas, incluindo

imunoglobulinas( Fitzsimons et al ., 2006 ; Oliveira et al., 2012; Bitello et al.,2013;Poppi et

al;2014).

O sorvete é uma excelente fonte de energia, devido principalmente ao seu alto conteúdo

de carboidratos e gordura. Contém basicamente uma composição bastante variada, normalmente

apresentando de 8 a 20% de gordura, 8 a 15% de sólidos não gordurosos do leite, 13 a 20% de

açúcar e 0 a 0,7% de emulsificante-estabilizante. Após a produção do sorvete, encontra-se em

seu descarte sólidos lácteos não gordurosos representados principalmente por proteína, sais

minerais e lactose, alginatos, carboximetilcelulos(Thadathil e Velappan , 2015).

O uso de métodos matemáticos, como os planejamentos fatoriais nos processos

fermentativos, diminuído a quantidade de experimentos realizados, pois os resultados obtidos

podem selecionar as melhores condições de produção, através da influência das variáveis

estudadas (Park et al ., 2002 ; Veloorvalappil et al ; 2011 ; Ayeni et al ., 2013 ; Melo et al .,

2014).

2.Material e métodos

2.1. Micro-organismo

Foi utilizada a amostra de Aspergillus niger SIS 18, isolada do solo da Caatinga do

Estado de Pernambuco, catalogadas no Banco de Culturas da Universidade Católica de

Pernambuco- Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais e Biotecnologia (NPCIAMB). A

cultura foi mantida em meio de aclimatação composto por : Ágar Sabouraud Dextrose (ASD),

com a seguinte composição: dextrose (40g/L), peptona (10g/L), Agar (20g/L), água destilada

1000m/L pH 7,0 e suplementado com gelatina.

80


agroindustriais

2.2. Meios alternativos de produção

Os meios alternativos foram elaborados utilizando resíduos de soro de leite e resíduo de

sorvete, a partir do meio de produção controle com a seguinte composição - (g/L ): peptona,

5; Glicose,10; NaCI, 0,5; CaCl2 2 H 2 O, 0,1; K 2 HPO 4, 0,3; KH 2 PO 4, 0,4; MgSO 4 ·

7H 2 O, 0,1; e extrato de levedura 5g , gelatina (1%) e (pH 7,0). A formulação do meio

alternativo se deu com a supressão da gelatina ,da peptona , do extrato de levedura e com o

acréscimo de soro de leite e de resíduo de sorvete. Os ensaios foram realizados em cultivos

submersos a 150 rpm, durante 144 horas à 37Cº ,foram realizados em erlenmeyers de 500 mL,

com volume útil de 250 mL (%p:v) onde foram introduzidas alíquotas de 25 mL de pré-inóculo

2.3. Planejamento fatorial 22 (soro de leite)

Foi realizado um planejamento fatorial 22 (Tabela 1) para analisar os principais efeitos e

interações das variáveis, concentrações: Soro de leite e Glicose. Com 4 pontos centrais e níveis

+ 1 e – 1, com apoio de um Software Statistica 7.0 da Stat Soft.

Tabela 1 - Matriz Codificada utilizada no Planejamento Fatorial 22 com soro de leite

2.4. Planejamento fatorial 22 (resíduo de sorvete)

Foi realizado um planejamento fatorial 22 (Tabela 2) para analisar os principais efeitos e

interações das variáveis, concentrações: Resíduo de Sorvete, Glicose. Com 4 pontos centrais e

níveis + 1 e – 1com apoio de um Software Statistica 7.0 da Stat Soft.

Tabela 2- Matriz Codificada utilizada no Planejamento Fatorial 22 com resíduo de

sorvete

2.5. Determinação da atividade proteolítica

Foi realizada através da metodologia descrita por Leogton et al .(1973) reação composta

de 250 μL da solução azocaseina, 150 μL da amostra centrifugada produzida nos meios controle

e alternativos.

A temperatura foi mantida em 40 Cº em banho-maria por 10 minutos. A reação foi

interrompida pela adição de 500 μL de ácido tricloroacético. Em seguida, a solução com as

amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 8.000 rpm à 4 Cº. As enzimas proteolíticas

livres presente na mistura, foram identificadas na solução de 500 μL da solução resultante,

Variável -1 0 1

Soro de Leite (mL) 12 15 18

Glicose (g) 4 6 8

Variável -1 0 1

Resíduo de Sorvete (mL) 6 8 10

Glicose (g) 2 4 6

81


agroindustriais

adicionada de Hidróxido de Sódio (1:1). A leitura foi realizada ao término da reação, em

espectrofotômetro Biochrom S21, a um comprimento de onda de 440 nm. Uma unidade de

atividade proteásica foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferença de

0,01 na absorbância entre o branco e a amostra, por minuto, nas condições do ensaio. A

atividade enzimática dos meios controle e alternativos foi calculada através da seguinte

equação:

AE (U/mL) = [ABSam * (Vam * fd / t) ]

AE= atividade proteásica (U/mL);

ABSam = Absorbância da amostra;

Vam= volume da amostra (mL);

fd = Fator de diluição; t = o tempo de reação em minutos

2.6. Determinação das proteínas totais

As proteínas totais foram determinadas pela metodologia de descrita por Bradford (1976).

Para a preparação do reagente, foram dissolvidos 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250

em 50 mL de etanol a 95% e, em seguida, adicionou-se 100 mL de ácido fosfórico a 85%. A

solução foi completada para 1L com água destilada.

2.7. Determinação do pH

Foi realizada por potenciometria em todas as amostras coletadas.

2.8. Determinação da curva de crescimento

Para a determinação do crescimento microbiano foram utilizados os meios alternativos

formulados a partir dos resíduos agroindustriais em agitador orbital a 150 rpm, 37°C, por 144 h

com 25 mL de pré inóculo,em triplicata, com amostras coletadas a cada 24 horas.

3. Resultados e discussão

3.1. Produção de protease através de planejamentos fatoriais completos

Segundo Melo et al.(2015) proteases constituem o maior grupo de enzimas utilizadas

industrialmente no mundo todo, movimentando a economia deste setor ativamente, apresentam

uma alta especificidade catalítica, pois atuam principalmente na hidrólise de proteínas e de

aminoácidos, sendo produzidas principalmente por diversos gêneros de micro-organismos

Gupta et al .(2002), descrevem as proteases microbianas como uma das mais importante enzima

hidrolítica.

Ladeira et al.(2010) descrevem que as proteases podem ser extraídas de diversos

organismos, incluindo bactérias, fungos filamentosos, leveduras, tecidos de mamíferos e de

82


agroindustriais

plantas. Contudo, não foi definido um meio de cultura ideal que propicie uma máxima produção

de protease microbiana, porque cada micro-organismo apresenta condições diferentes de cultivo

para uma produção ótima da protease.

Os resultados apresentados na tabela 3 e na tabela 4 mostram que a cultura de Aspergillus

niger (SIS 18) obteve uma atividade proteolítica em todas as condições testadas em ambos ao

planejamentos fatoriais. A maior atividade proteolítica foi de 0,118(U/mL) em 144 h de cultivo

submerso, utilizando o soro de leite como o indutor enzimático.

Foram realizados dois planejamentos fatoriais 22 o primeiro com o soro de leite e o

segundo com o resíduo de sorvete. Na tabela 3 encontra-se a matriz codificada do planejamento

fatorial, composto pelas variáveis resíduo de sorvete , glicose e a atividade proteolítica.

Observou-se que a máxima atividade proteolítica foi evidenciada no ensaio denominado 2, que

apresentou um valor inicial de resíduo de sorvete 10 (g/L), glicose 2(g/L), obtendo uma

atividade proteolítica de 0,093U/mL maior atividade obtida nos oito ensaios. Na tabela 4

encontra-se a matriz decodificada com as variáveis glicose e soro de leite e as determinações

proteolíticas realizadas, observa-se que a máxima atividade proteolítica evidenciada ocorreu no

ensaio 2, apresentando um valor inicial de glicose (4g/L), soro de leite (18,0 g/L), produzindo

assim uma atividade proteolítica de 0,118 U/mL.

Sendo assim o ensaio 2 foi a melhor condição obtida na produção de protease utilizando

o soro de leite como indutor protéico. Malathi e Chakraborty (1991) em seu trabalho utilizando

resíduos agroindustriais e Aspergillus niger, obtiveram uma atividade máxima da protease

entorno de 0,104 U/mL próxima a obtida neste trabalho.

Tabela 3 – Matriz do planejamento 22, atividade proteolítica para as concentrações de resíduo

de sorvete glicose no melhor tempo de 144 horas de cultivo a 37Cº a 150rpm

Ensaios 1 *2 3 4 5 6 7 8

Resíduo de Sorvete (mL) 6,0 10 6,0 10 8,0 8,0 8,0 8,0

Glicose 2,0 2,0 6,0 6,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Proteínas Totais 0,225 1.134 0,267 0,565 0,509 0,456 0.564 0,653

Protease (U/mL) 0,026 0,093 0,059 0,054 0,051 0,056 0,049 0,045

* Melhor condição do Planejamento Fatorial

Tabela 4 – Matriz do planejamento 22, atividade proteolítica para as concentrações de soro de

leite e glicose no melhor tempo a 144 horas de cultivo a 37Cº e 150rpm

Ensaios 1 *2 3 4 5 6 7 8

Soro de Leite (mL) 12 18 12 18 15 15 15 15

Glicose 4,0 4,0 8,0 8,0 6,0 6,0 6,0 6,0

Proteínas Totais 0,525 1.232 0,237 0,765 0,609 0,856 0.457 0,479

Protease (U/mL) 0,0435 0,118 0,0294 0,0525 0,0484 0,0564 0,0546 0,0688

83


agroindustriais

* Melhor condição do Planejamento Fatorial

3.2 . Influência de resíduos agroindustriais na produção enzimática

Os resultados demonstrados nos Diagramas de Pareto (Figura 1) e (Figura 2) apresentam

a significância dos resultados, com 95% de confiança, representado pela linha tracejada

vermelha, correspondente ao valor de p = 0,05. As seguintes variáveis independentes: soro de

leite, glicose e resíduo de sorvete influenciaram diretamente para a produção proteolítica.

Contudo foi comprovado que o resíduo de sorvete e o soro de leite foram as variáveis

independentes, nos seus respectivos planejamentos, com maior relevância para a produção

enzimática.

Figura 1. Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e alterações das variáveis

independentes no processo de produção de Protease por Aspergillusniger a 144 horas de

fermentação a 37Cº.(1) Glicose e(2) Soro de Leite

Figura 2: Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e alterações das variáveis

independestes no processo de produção de protease por Aspergillusniger a 144 horas de

fermentação a 37Cº. (1) Resíduo de Sorvete e (2) Glicose.

84


agroindustriais

O fungo Aspergillus niger (SIS 18) apresentou uma elevada taxa de crescimento e uma

grande produção proteolítica em todos os meios contendo os resíduos agroindustriais

industriais investigados. Ladeira et al (2010) também relatam a produção de proteases

utilizando uma diversidade de fontes de carbono e nitrogênio. O soro lácteo ou soro do leite

bovino é um líquido que contém de 4 a 6 g de proteínas por litro o que o torna uma excelente

indutor protéico.

Nascimento et al .(2015) descrevem o fungo Aspergillus niger como um bom produtor de

diversas enzimas, incluindo as proteases. Segundo descrito pelos autores, os melhores

resultados foram determinados em diferentes meios de cultura alternativos contendo resíduos

agroindustriais obtendo atividades proteolíticas de 0,386 U mL e 0,253 U/mL.O fungo

Aspergillus niger (SIS 18) utilizado neste trabalho obteve um produção de 0,118 U/mL com

soro de leite e 0,093 U/mL com resíduo de sorvete comprovando a atividade proteolítica na

presença de resíduos agroindustriais com alto teor proteíco.

A atividade máxima da enzima com o soro de leite equivalente a 0,118 U/mL e com

resíduo de sorvete equivalente a 0,093 U/mL descritas nas tabela 3 e tabela 4 foi alcançada após

96h de cultivo submerso do fungo Aspergillus niger (SIS 18). Ward (1985) descreve que os

micro-organismos geralmente produzem maior quantidade de protease ao final da fase

exponencial de crescimento.

Oliveira e Gomes (2015) verificaram que a melhor condição para produção da protease

de modo geral se deu em 72 h de fermentação. Radha et al .(2011) em seu estudo envolvendo a

produção de proteases ácidas por Aspergillus spp. reportaram uma melhor produção em um

tempo superior, 120 h, ao obtido no presente estudo.

Nascimento et al .(2015) reportam a máxima atividade da protease com Aspergillus

nigercom 96 horas de cultivo idêntica ao obtido neste estudo. Castro et al .(2014) estudando o

gênero Aspergillus spp. em meios com resíduos agroindustriais obtiveram uma maior produção

em 96 horas, o que segundo Gupta et al .(2002),pode ser explicado em função da variação dos

nutrientes empregados.Portanto a máxima produção proteolítica obtida com 96 horas de cultivo

como descrita por Nascimento et al .(2015) e Castro et al .(2014),corroboram com os valores

da produção proteolítica, obtidos nesse estudo.

3.3. Influência da glicose na produção enzimática

Na figura 1 e figura 2, é observado a influencia da variável independente glicose.

Embora não seja um indutor proteolítico sua interação com as outras varáveis na produção

enzimática, apresenta significância de 95% de confiança, representado pela linha tracejada

vermelha no diagrama de Pareto, correspondente ao valor de p = 0,05. De fato a influência das

85


agroindustriais

fontes de carbono e suas concentrações na produção de protease tem sido discutidas na

literatura.

Jenitta e Priva (2015) descreveram a influência de diferentes fontes de carbono na

produção de protease por Penicillium griseofulvum LCJ231, em seu estudo observaram que ,

suplementando o meio com glicose variando sua concentração entre 5 a 30 g obtiveram uma

produção enzimática de 0,110 U/mL. Wang e Lee (1996) também descrevem que a máxima

produção de protease foi observada quando o meio foi suplementado com glicose para o fungo

Aspergillus niger. Similarmente Chellapandi (2010) relatou que a frutose e a glicose provaram

ser as melhores fontes de carbono que influenciam na atividade proteolítica

3.4. Influência do pH na produção enzimática

A atividade enzimática é amplamente influenciada pelo pH, uma vez que os sítios ativos

das enzimas são muitas vezes compostos por grupos iônicos cuja conformação deve ser

mantida, para permitir com sucesso a ligação do substrato, por isso é de extrema importância

conhecer o pH ótimo de cada enzima proporcionando uma otimização na reação (Silva ,2013).

A variação da faixa do pH , durante os ensaios, a 144 horas de cultivo ficou na faixa de

6,0 a 7,0 descrita na tabela 5. Nos ensaios contendo o soro de leite e resíduo de sorvete como

indutor enzimático a atividade proteolítica máxima foi de 0,118 U/mL para o soro de leite

e0,093 U/mL para o resíduo de sorvete, com o pH tendendo a 7,0 caracterizando a enzima

produzida como uma protease neutra.

Tabela 5 - Valores do pH finas nos planejamentos fatoriais ,utilizando resíduos agroindustriais

a 144 horas de cultivo a 37Cº e 150rpm

No estudo realizado por Freitas (2013), as proteases produzidas pelo fungo A. oryzae

também obtiveram maior atividade em pH neutro . Silva (2013) descreve o Aspergillus oryzae

como a principal fonte de protease neutra fúngica. O fungo Aspergillus niger(SIS 18) deste

trabalho apresentou uma estabilidade considerável na faixa de pH entre 6,0 e 7,0, com a

caracterização de proteases neutras estáveis em pH 7,0 . Ahmed et al. (2011) obtiveram uma

faixa de estabilidade enzimática para as proteases de Aspergillus niger entre os pHs 5,0 e 8,0,

com a maior atividade em pH 7,0. No estudo de Cunha et al .(2016), foi produzida a enzima

protease a partir do fungo Aspergillus niger em uma faixa neutra de pH. Esses autores

pH final

Soro de Leite 6,2 7,3 5,5 6,3 6,0 7,0 6,8 6,3

Resíduo de Sorvete 6,5 7,1 5,2 6,5 6 6,9 6,6 6,5

86


agroindustriais

comprovam a capacidade do Aspergillus niger na produção enzimática em diversas faixas de pH

neutro a alcalino.

3.5. Produção proteolítica do Aspergillus niger nas melhores condições obtidas nos

planejamentos fatoriais

Após a seleção das melhores condição de produção de protease encontradas nos ensaios 2

através da utilização do planejamento fatorial, foram elaborados os meios alternativos contendo

os resíduos agroindustriais previamente selecionados. A influência da utilização dos substratos

contendo resíduos agroindustriais na produção da enzima protease está descrita na tabela 6.

Tabela 6 - Produção de biomassa, pH e atividade proteolítica na melhor condição do

planejamento com diferentes resíduos em 96 horas de cultivo a 37Cº a 150 rpm.

Resíduos Biomassa(g/L) pH Protease(U/mL)

Soro de Leite 0,736 7,3 0,134

Resíduo de Sorvete 0,712 6,8 0,113

Controle 0,874 6,2 0,120

Nos ensaios com as melhores condições dos planejamentos fatoriais foi comprovada a

atividade proteolíticas em ambos os resíduos o soro de leite apresentou uma atividade

proteolítica de 0,134 (U/mL), pH 7,3 em 96 h de cultivo, já o resíduo de sorvete teve uma

atividade proteolítica de 0,113(U/mL), pH 6,6 em 96 h de cultivo. A figura 3 mostra a produção

enzimática em 144 horas de fermentação, demonstrando uma melhor produção em 96 h e que

ambos os resíduos apresentaram atividade proteolítica nos ensaios testados.

Figura 3: Comparação da atividade enzimática pelo fungo Aspergillus niger nos melhores

ensaios dos planejamentos fatoriais a 150 rpm, 37° C por 144h

87


agroindustriais

Proteases são enzimas que catalisam a reação da hidrólise de proteínas, peptídeos ou

aminoácidos livres.Compõe a classe das mais importantes enzimas comerciais, extracelulares.

Desempenham um papel importante em diversos processos biotecnológicos. Apresentam uma ampla

aplicação nas indústrias de processamento de alimentos, laticínios e farmacêutica ( Ladeira et al.,

2010; Cunha et al.,2016).

O fungo Aspergillus niger é descrito por Nascimento et al.(2015) como um dos fungos

filamentosos mais utilizados em processos fermentativos, uma vez que é considerado “geralmente

seguro” pelo FDA (“United States Food and Drug Administration”). Muitas das enzimas produzidas

por este organismo têm aplicações nas indústrias de alimentos, farmacêutica, bebidas, têxtil,

agricultura, polpa e papel. Cunha et al.(2016) descrevem a importância do uso de resíduos

agroindustriais como uma alternativa, pois representam uma das mais importantes fontes renováveis

de energia disponíveis no planeta e, quando indevidamente descartados ou utilizados, tornam-se fontes

adicionais de poluição ambiental.

Na figura 3 fica evidenciado uma maior atividade proteolítica com o soro de leite obtendo uma

atividade proteolítica de 0,134 (U/mL), em 96 h de cultivo. Os resultados obtidos corroboram com dados

descritos na literatura. Malathia e Chakraborty (1991) em seu trabalho obteveram uma boa produção de

protease por fungo filamentoso ao utilizar um meio de produção contendo resíduos agroindustriais,

obtendo uma atividade proteolítica por volta de 0,107(U/mL) .Wu et al .(2016) utilizando o fungo

Aspergillu terreus em meio contendo resíduo de óleo de palma, observaram máxima atividade proteolítica

de 0,129 U/mL em 96 h de cultivo.

Oliveira et al.(2015) e Nascimento et al.(2015) mostraram que, para os diferentes meios de cultura

utilizados, ocorreu um efeito significativo na atividade da protease em relação ao controle. Aspergillus

niger é considerando um bom produtor de várias enzimas, incluindo proteases. Resultados para as

atividades de coagulação do leite e de protease das enzimas produzidas por A.niger apresentaram

atividade proteolítica superior às demais preparações avaliadas, como também diferentes valores em

resposta a cada resíduo utilizado para a produção.

Também foi analisada a variação do pH a 96 h de fermentação nas melhores condições obtidas

nos planejamentos fatoriais. Foi demonstrado que tanto para o soro de leite como o resíduo de sorvete os

pH variaram entre 6,5 e 7,5. Esses resultados corroboram com a literatura que relata uma diminuição da

atividade enzimática conforme ocorra o aumento do pH, esse comportamento é esperado já que a grande

maioria das enzimas produzidas por fungos tem uma melhor resposta em pH baixos. Resultados

semelhantes ao presente estudo também foram observados nos trabalhos de Preetha e Boopath (1997)

utilizando o Rhizo mucormiehei, Kumar et al .(2005)a partir do Rhizopus oryzae; Merheb-Dini et al

.(2010), os quais utilizaram o Thermoascus aurantiacus e El-backy et al .(2011) com o basidiomiceto

88


Piptoporuss oloniensis. Em ambos os trabalhos citados, conforme houve o aumento do pH , a atividade

enzimática era reduzida.

Os estudos relacionados à morfologia dos fungos filamentosos tornaram-se ferramentas

importantes, para a produção enzimática, pois a ampla variação morfológica dos fungos filamentosos

os credenciam a participar de diversos processos industrias ,para produção enzimática, com diferentes

condições de pH, temperatura , luminosidade ,concentração de oxigênio etc ( Krull et al.,2002).

Neste experimento, foi observado, na figura 4, a comparação do crescimento do Aspergillusniger,

utilizando como indutores proteolíticos o resíduos de sorvete e soro de leite através de fermentação

submersa com as melhores condições encontradas nos planejamentos fatoriais obtendo uma máxima

atividade proteolítica no tempo de 96 h, para as amostras trabalhadas. Sendo assim a figura 4 comprova

que a máxima atividade proteolítica obtida neste estudo é diretamente proporcional ao crescimento

fúngico

Figura 4 Crescimento do fungo Aspergillus niger nos melhores ensaios dos planejamentos fatoriais a

15o rpm,37° C por 144 h.

4. Conclusões

O uso de resíduos agroindustriais para produzir biomoléculas de alto valor agregado, através da

formulação de meios de baixos custos tem surgido como uma alternativa para reduzir os custos de

produção e também o descarte de forma incorreta de uma grande maioria de resíduos com elevado

potencial nutritivo. O meio contendo o soro de leite apresentou maior atividade proteolítica, quando

comparado aos demais meios testados. Verificou-se que os meios alternativos contendo o soro de leite

teve uma atividade proteolítica superior ao denominado meio controle.

89


5.Referências

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96


ANEXOS

Normas da Revista – Engevista -ISSN: 1415-7314

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NORMAS PARA APRESENTAÇÃO DE ARTIGOS PARA A ENGEVISTA

O TEXTO:

Os artigos submetidos não devem conter nenhuma identificação dos autores. Deve constar nos

metadados de submissão a identificação completa de TODOS os autores.

1. Os artigos devem ser inéditos, não sendo aceitas compilações, transcrições, traduções, reproduções

ou adaptações de trabalhos já publicados em revista. Não são aceitos trabalhos que tenham cunho

promocional de empresa, marcas ou produtos e que possam induzir à promoção comercial;

2. Os trabalhos devem ser apresentados em formato Word 97 ou versão posterior. Devem ser

submetidos exclusivamente através da página

do SEER.

3. As seguintes instruções devem ser observadas: a. Formato de Página: A4 b. Margens: superior e

inferior – 2,5; esquerda - 3 e direita - 3; c. Espaçamento: 1,5 d. Tipo de letra: Títulos e subtítulos:

Times New Roman (12) em negrito; corpo do texto: Times New Roman (11) e. No máximo 20 (vinte)

páginas, contendo, no mínimo, os seguintes itens: títuloresumo, palavras-chave, desenvolvimento,

conclusão e bibliografia. Artigos com maior número de páginas poderão ser aceitos a critério dos

editores:

i. Título: o mais conciso possível, sugerindo, sem dubiedade, o assunto. Centralizado, em Times New

Roman 16. Nos metadados o título deverá estar todo em

maiúsculo seguido, entre parênteses pela versão do titulo em inglês (quando o artigo não for nesse

idioma);

ii. Resumo (e abstract): em no máximo vinte linhas. O abstract deve vir precedido do título em

inglês;

iii. Palavras-chave (e keywords): no máximo quatro (4);

iv. Desenvolvimento (em uma coluna e sem qualquer nota de rodapé):

1. numeração progressiva de títulos e subtítulos, em Times New Roman negrito;

2. tabelas e figuras: devem ser centralizadas, ter um número e um título, colocados acima da

tabela e abaixo da figura;

3. equações: centralizadas e numeradas sequencialmente.

98


4. Na descrição da metodologia, ou equivalente, não deve ser incluído nenhum tópico sobre

classificação da pesquisa (exploratória, quantitativa, etc). Informações desse tipo apenas aumentam o

tamanho do artigo sem acrescentar nada de relevante ao conteúdo do texto.

5. Evitar complicar desnecessariamente o texto. Evite modismos linguísticos, gramaticalmente

errados. Por exemplo, modal não é substantivo (não existe o modal terrestre ou aéreo) e uma situação

que gera um problema não é uma “situação problema” é, no máximo, uma situação problemática.

6. Muito cuidado com o espaçamento de palavras. É comum alguns editores de texto incluírem

códigos que anulam os espaçamentos feitos. Recomenda-se, antes da submissão de cada versão,

verificar como fica o arquivo quando aberto no Word para Windows, em especial se o texto foi feito

num MAC.

V. Conclusão: clara, objetiva e concisa.

vi. Bibliografia:

1-As citações, no corpo do texto, não devem usar caixa alta. Apenas a primeira letra de cada nome

deve estar em maiúscula.

2-Ainda nas citações, deve-se usar o et al para 3 ou mais autores.

3-Nas referências não usar et al em hipótese alguma. Deve aparecer o nome de todos os autores.

4-Nas referências apenas o(s) último(s) sobrenome(s) de cada autor é por extenso. Os primeiros

nomes virão apenas com a inicial.

5-As referências devem ser à obra original, não se admitindo o uso do "apud".

6-Devem ser evitadas citações literais. O seu uso abusivo, mesmo com referência à obra citada,

caracteriza plágio. Em caso de extremamente necessário fazer um citação literal, ela deve ser

curta, em itálico e com citação à obra original. Não serão publicados artigos com mais de 2

citações literais

7-Em cada referência os nomes dos autores devem ser indicados. Mesmo que os autores de duas

referências sejam os mesmo, os seus nomes devem ser novamente escritos. Nunca usar "----"

para indicar a repetição de autores.

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Universidade Federal de Santa Catarina.

Confira o modelo aqui.

ÉTICA NA PUBLICAÇÃO: A submissão de um artigo à Engevista implica que não está

submetido a nenhum outro periódico. São sumariamente recusados artigos que não respeitem

esta norma. Igualmente são recusados artigos que sejam considerados plágio. Qualquer cópia de

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CAPÍTULO IV

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CONCLUSÕES GERAIS

Diante dos resultados obtidos, foi possível concluir que:

Protease são enzimas que catalizam a hidrolise das cadeias de polipeptídios e que

podem ser obtidas através de processos metabólicos utilizando diversos micro-

organismos como os fungos filamentosos.

Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus spp. coletados na Caatinga de

Pernambuco e armazenados no Sistema Nacional de Pesquisa em Biodiversidade-

SISBIOTA apresentam um amplo potencial biotecnológico na produção da enzima

protease;

A utilização de diversos resíduos derivados da agroindústria na formulação de meios

alternativos,torna-se uma solução eficaz e ecologicamente correta,pois esses

resíduos apresentam um alto teor nutritivo que favorece o crescimento dos micro-

organismos e obtendo a produção de diversas biomoléculas;

Dentre as amostras de Aspergillus ssp. testadas neste estudo, para a seleção de

melhores cepas produtoras de protease em meio sólido, o micro-organismo

(Aspergillus niger) SIS 18 foi o que se apresentou o melhor índice enzimático

(IE)=3,0 cm, nas condições de pH entre 6,5 e 7,0 e com temperaturas variando entre

37Cº e 40Cº, diante das outras amostras testadas;

Nos ensaios referentes à seleção dos meios de produção de Protease em fermentação

submersa, o meio que apresentou os melhores resultados foi o meio 3, apresentando

uma AE(atividade enzimática)=0,104U/ml e um pH variando entre 6,5 e 7,0;

Os ensaios que utilizaram os planejamentos fatoriais 22 tendo como variáveis

independente o soro de leite ,o resíduo de sorvete , glicose, para a produção de

protease, utilizando o Meio 3 como controle apresentaram, os melhores resultados

nos ensaios numero 2,dos respectivos planejamentos, a 96 horas,utilizando como

indutor o soro de leite obteve uma atividade enzimática de 0,118 (U/mL) e com o

resíduo de sorvete como indutor obteve uma atividade enzimática de 0,93 (U/mL);

Na formulação dos meios alternativos, apesar da ausência da peptona e do extrato de

levedura, da gelatina como indutor da produção de protease, a utilização de resíduos

agroindustriais, tais como a soro de leite e o resíduo de sorvete, testados neste

trabalho, foram suficientes para a obtenção da enzima protease por meio de

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fermentação submersa, com destaque para o resíduo de soro de leite que obteve o

melhor resultado uma atividade enzimática de 0,118 (U/ml);

Foi comprovado que os resultados obtidos demonstraram a grande eficácia na

utilização de resíduos agroindustriais como substratos alternativos na produção de

protease, através da formulação de meios alternativos, pois o reaproveitamento

desses resíduos contribui para minimização dos impactos ambientais, bem como a

redução dos custos da produção de protease de vasta utilização biotecnológica.

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ANEXOS

produÇÃo de protease por aspergillus niger (sis 18 ... · figura 9 –fluxograma da produção de...

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