estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE NEUROCIÊNCIA E CIÊNCIAS DO COMPORTAMENTO
Estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o
modelo triádico do desamparo aprendido em ratos
MATHEUS TEIXEIRA ROSSIGNOLI
Ribeirão Preto – SP
2018
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MATHEUS TEIXEIRA ROSSIGNOLI
Estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o
modelo triádico do desamparo aprendido em ratos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para a obtenção
do título de Doutor em Ciências. Área de
concentração: Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. João Pereira Leite
Ribeirão Preto – SP
2018
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Rossignoli, Matheus Teixeira
Estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o modelo triádico do desamparo aprendido em ratos / Matheus Teixeira Rossignoli. - - Ribeirão Preto, 2018.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Neurociências.
Orientador: João Pereira Leite 1. Estresse incontrolável. 2. Modelos animais de depressão. 3.
Desamparo aprendido. 4. Córtex pré-frontal. 5. Amígdala basolateral. 6. Eletrofisiologia. 7. Atividade unitária. 8. Potencial local de campo.
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Rossignoli MT. Estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o modelo triádico do desamparo aprendido em ratos. Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Neurociências. Aprovado em:
Banca examinadora Prof. Dr. Instituição:__________________ Julgamento: Assinatura:__________________ Prof. Dr. Instituição:__________________ Julgamento: Assinatura:__________________ Prof. Dr. Instituição:__________________ Julgamento: Assinatura:__________________ Prof. Dr. Instituição:__________________ Julgamento: Assinatura:__________________ Prof. Dr. Instituição:__________________ Julgamento: Assinatura:__________________
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Dedico a minha mãe, meu pai e minha irmã,
sem o amor deles eu nunca teria chegado até aqui.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço:
A minha família (Consuelo, Juarez e Ana Carolina) pelo apoio incondicional. Me
considero uma pessoa de sorte por todo o amor e carinho que recebi deles ao longo de toda
minha vida. Todas as minhas realizações sempre serão em homenagem a eles;
Ao meu orientador Prof. Dr. João Pereira Leite pela confiança, apoio nos momentos
críticos e pelas discussões no desenvolvimento do projeto. Dentre todas as suas qualidades
científicas, sou muito grato em especial pela sua postura de impulsionar e permitir novas
ideias no laboratório;
Ao Dr. Rafael Naime Ruggiero, sem o qual eu nunca teria conseguido realizar esta
tese, não teria chegado nem perto de terminá-la. Sou muito grato por todas as discussões
teóricas, por todas as aulas particulares sobre análise de sinal, por todo o tempo que ele se
dispôs a me ajudar, e principalmente pela amizade de anos;
Ao Me. Danilo Benette Marques, sem o qual eu nunca teria me interessado por
desamparo aprendido. As discussões durante a concepção do projeto e sua ajuda nas
análises foram decisivas para o meu doutorado;
Ao Dr. Lézio Soares Bueno Júnior que me ajudou nos primeiros passos experimentais
deste trabalho e foi fundamental para a apresentação dos meus dados no exterior;
Aos meus colegas de laboratório de Leonardo Rakauskas Zacharias, Lucas Barone
Peres, Fernando Figueiredo Mecca, Fernanda Assis Moraes, José Eduardo Peixoto Santos,
Raquel Araújo do Val da Silva, Elena Moradi, Bruno Mesquita, Benedito Alves, Tamiris Prizon
e Ana Paula Crestani pelas discussões e pelo espírito de equipe;
À técnica do nosso laboratório Sra. Renata Scandiuzzi e Sra. Daniela Cristina Borges
Ribeiro pela disposição na preparação das lâminas histológicas;
Ao técnico do departamento Renato Meirelles pela ajuda com os problemas no
equipamento da esquiva ativa;
Ao Luís Fernando Zanoto de Luca da Zemmix Eletrônica por me ajudar na odisseia
que foi melhorar a qualidade do sinal;
À secretária do Departamento de Neurociências e Ciências do Comportamento,
Ivana Geraldo Cintra Faria, pela paciência diante da minha dificuldade com questões
burocráticas;
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Aos funcionários do anexo A da FMRP responsáveis pela segurança e limpeza do
prédio;
Aos meus amigos, Fábbio (Bibiu), Luiz Fernando (Nasi), Marcelo (Berardo), Mário
(Jow), Murilo (Vaca), Oswaldo, Mateus e Marcus (Guma) pela compreensão e apoio nesses
quatros anos, mesmo que as vezes à distância;
Ao mais novo amor na minha vida, Isabella Caroline da Silva Dias, pelo
companheirismo;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da minha bolsa. Agradeço ao CNPq, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo (FAPESP) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior
(CAPES) pelo financiamento da infraestrutura utilizada neste trabalho.
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“I told you about the walrus and me-man
You know that we're as close as can be-man
Well here's another clue for you all
The walrus was Paul
Standing on the cast iron shore-yeah
Lady Madonna trying to make ends meet-yeah
Looking through a glass onion”
(Glass Onion – Lennon/McCartney, 1968)
“Eu quase que nada não sei. Mas desconfio de muita coisa.
O senhor concedendo, eu digo: para pensar longe,
sou cão mestre – o senhor solte em minha frente uma ideia ligeira,
e eu rastreio essa por fundo de todos os matos, amém!”
(Grande Sertão: Veredas – João Guimarães Rosa, 1958)
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Redes neurais na depressão e na resiliência. 22
Figura 2 Principais marcadores eletrofisiológicos do CPF e da ABL em modelos de
estresse. 28
Figura 3 Desenho experimental. 33
Figura 4 Esquema representativo da manufatura dos multieletrodos. 35
Figura 5 Implante dos multieletrodos. 36
Figura 6 Protocolo comportamental do desamparo aprendido 39
Figura 7 Esquema representativo das adaptações do aparato comportamental para
eliminação do ruído de movimento. 40
Figura 8 Esquema representativo do sistema de registro. 42
Figura 9 Épocas de interesse para a análise do registro eletrofisiológico. 43
Figura 10 Exemplos de possíveis unidade de disparo descriminadas no software Offline
Sorter 44
Figura 11 Exemplo da classificação dos períodos sem movimento. 46
Figura 12 Padronização comportamental. 52
Figura 13 Dados comportamentais. 54
Figura 14 Qualidade do registro eletrofisiológico após a padronização da aquisição do
sinal. 55
Figura 15 Parâmetros eletrofisiológicos e verificação histológica. (A) Implante dos
multieletrodos visando atingir o CPF e ABL. 56
Figura 16 No 1d a modulação do CPF aumenta no grupo IS 58
Figura 17 Modulação e atividade neuronal da ABL não é diferente entre os grupos no
1d. 59
Figura 18 No grupo ES a modulação e atividade neuronal do CPF aumentam durante o
teste da esquiva ativa. 60
Figura 19 Modulação e atividade do ABL não é distinta entre os grupos no teste da
esquiva ativa. 61
Figura 20 Perturbação média da potência de teta e alfa no CPF é maior no grupo ES no
1d. 63
10
Figura 21 Na ABL não há diferenças entre os grupos ES e IS na perturbação das
potencias no 1d. 64
Figura 22 Perturbação média da potência de alfa no CPF é maior no grupo ES no teste
da esquiva ativa. 66
Figura 23 Não há diferenças entre os grupos ES e IS na perturbação das potencias na
ABL no teste da esquiva ativa. 67
Figura 24 Exemplo de espectrogramas do CPF no 1d após a remoção dos períodos com
movimento. 69
Figura 25 As coerências de fase em delta e teta aumentam no grupo IS após o EC no 1d.
71
Figura 26 No grupo IS ocorre o aumento da coerência de fase em teta após o EC no teste
da esquiva ativa. 74
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Resumo dos principais resultados. 76
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1d Primeiro dia
2d Segundo dia
AMI Amígdala
AMY Amygdala
ANOVA Análise de variância de uma via
ANOVA RM Análise de variância de duas vias para medidas repetidas
AP ântero-posterior
ABL Amígdala basolateral
CPF Córtex pré-frontal
dB Decibéis
DREADD Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs
DSM-V Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais 5a Edição
DV Dorso-ventral
EC Estímulo condicionado
ES Escapável
EEG Registro eletroencefalográfico
F1 Fuga simples
F2 Fuga dupla
FFT Tranformada rápida de Fourier
GABA Ácido gama-aminobutírico
HIPO Hipocampo
HPA Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal
h Horas
Hz Hertz
i.p. Intraperitoneal
IS Inescapável
kg Quilograma
kHz Quilohertz
mg Miligrama
ML Médio-lateral
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MPC Média da coerência de fase
mV Milivolt
NDR Núcleo dorsal da rafe
PC Componente principal
PCA Análise do componente principal
PFA Paraformaldeído 4%
PFC Prefrontal cortex
PLC Potencial local de campo
PSD Densidade espectral de potência
s Segundo
Sham Nenhum choque
TTL Transistor-transistor logic
14
SUMÁRIO
RESUMO...........................................................................................................................16
ABSTRACT........................................................................................................................17
1.INTRODUÇÃO...............................................................................................................181.2.Depressão..........................................................................................................................191.3.NeurofisiologiadaDepressão.............................................................................................201.4.Modelosanimaisdedepressão...........................................................................................221.5.ComunicaçãoentreoCPFeABL..........................................................................................241.6.AtividadedoCPFedaABLnodesamparoaprendido..........................................................251.7.AtividadeeletrofisiológicadoCPFedaABLemmodelosdeestresse..................................261.8.Justificativa........................................................................................................................28
2.OBJETIVOS.....................................................................................................................302.1.ObjetivosGerais.................................................................................................................312.2.Objetivosespecíficos..........................................................................................................31
3.MATERIALEMÉTODOS.................................................................................................323.1.Desenhoexperimental........................................................................................................333.2.Sujeitos..............................................................................................................................333.3.Confecçãodosmultieletrodos............................................................................................343.4.Cirurgiaestereotáxicaparaimplantedosmultieletrodos....................................................353.5.Protocolocomportamental.................................................................................................37
3.5.1.Padronizaçãocomportamental..........................................................................................373.5.2.Protocolocomportamentaldefinitivo................................................................................38
3.6.Adaptaçõesdoaparatocomportamentalpararegistrosimultâneo.....................................393.7.Registroeletrofisiológico....................................................................................................413.8.Pré-processamento.............................................................................................................42
3.8.1.Épocasdeinteresse............................................................................................................423.8.2.Pré-processamentodasunidadesdedisparo.....................................................................433.8.3.Pré-processamentodospotenciaislocaisdecampo..........................................................443.8.4.Classificaçãodosperíodossemmovimento.......................................................................45
3.9.Análisededados................................................................................................................463.9.1Análisedasunidadesdedisparo..........................................................................................463.9.2Análisedospotenciaislocaisdecampo...............................................................................473.9.3Análiseestatística................................................................................................................48
3.10.Histologia.........................................................................................................................49
4.RESULTADOS.................................................................................................................504.1.Comportamento.................................................................................................................51
4.1.1.Padronizaçãocomportamental..........................................................................................514.1.2.NotestedaesquivaogrupoISapresentaoaumentodalatênciamédiaedonúmerodefalhas............................................................................................................................................52
4.2.Registroeletrofisiológico....................................................................................................554.2.1.Qualidadedoregistroeconfirmaçãohistológica...............................................................55
4.3.Atividadeunitária...............................................................................................................564.3.1.No1docorreoaumentodamodulaçãoneuronaldoCPFnogrupoESeIS.......................574.3.2.No1damodulaçãoeatividadeneuronaldaABLnãoédistintaentreosgrupos..............584.3.3.NotestedaesquivaativaamodulaçãoeatividadeneuronaldoCPFémaiornogrupoES......................................................................................................................................................594.3.4.NotestedaesquivaativaamodulaçãoeatividadeneuronaldaABLnãoédistintaentreosgrupos......................................................................................................................................61
15
4.4.Atividadeoscilatória...........................................................................................................624.4.1.No1daperturbaçãomédiadapotênciadetetaealfanoCPFémaiornogrupoES.........624.4.2.No1dasperturbaçõesmédiasdaspotênciasnaABLnãosãodiferentesentreosgruposESeIS............................................................................................................................................634.4.3.NotestedaesquivaaperturbaçãomédiadapotênciadealfanoCPFémaiornogrupoES......................................................................................................................................................654.4.4.NotestedaesquivaativanãohádiferençasentreosgruposESeISnaperturbaçõesdaspotenciaisdaABL.........................................................................................................................664.4.5.Espectrogramasapósaclassificaçãodosperíodossemmovimento.................................674.4.6.No1dapósoECacoerênciadefaseemdeltaetetaaumentamnogrupoIS...................704.4.7.NotestedaesquivaativaacoerênciadefaseemtetadogrupoISémaiorapósoEC.....72
5.DISCUSSÃO...................................................................................................................755.1.Comportamento.................................................................................................................77
5.1.2.Padronizaçãocomportamental..........................................................................................775.1.3.Protocolocomportamentaldefinitivo................................................................................78
5.2.Dadoseletrofisiológicos......................................................................................................815.2.1.Qualidadedoregistroeletrofisiológico..............................................................................815.2.2.Atividadeunitária...............................................................................................................825.2.3.Atividadeoscilatória...........................................................................................................85
5.3.Consideraçõestranslacionaisecorrelaçãocomachadosclínicos.........................................89
6.CONSIDERAÇÕESFINAIS...............................................................................................90
7.REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................92
16
RESUMO
Rossignoli, MT. Estudo da atividade eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o modelo
triádico do desamparo aprendido em ratos [tese]. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2018.
A exposição ao estresse incontrolável corresponde a um importante fator de risco para
respostas mal adaptativas, como a depressão. Tanto na depressão como no modelo triádico
do desamparo aprendido, se observa alterações funcionais no córtex pré-frontal (CPF) e na
amígdala (AMI) relacionadas a comportamentos do tipo-depressivos. Entretanto, a
neurofisiologia subjacente ao processamento neural do CPF e da AMI durante o desamparo
aprendido permanece obscura. Sendo assim, o presente trabalho se dispôs a investigar as
alterações eletrofisiológicas do CPF e da AMI durante o modelo triádico do desamparo
aprendido. Ratos cronicamente implantados com multieletrodos no CPF e na AMI foram
submetidos ao modelo triádico do desamparo aprendido. Nele os animais foram expostos
a choque escapáveis (ES), choques inescapáveis pareados (IS) ou a nenhum choque (Sham)
no primeiro dia (1d). O comportamento do tipo-depressivo nos animais foi avaliado no teste
da esquiva no segundo dia (2d). Durante todo o protocolo comportamental foram
registradas no CPF e na AMI a atividade unitária e oscilatória, evocadas em torno dos
estímulos condicionados (EC). Observamos que no 1d ocorreu o aumento da modulação
neuronal do CPF no grupo IS, enquanto no 2d tanto a modulação quanto a atividade
neuronal do CPF aumentaram no grupo ES. Quanto as oscilações no CPF do 1d, a
perturbação média da potência de teta aumentou no grupo ES, enquanto no grupo IS a
perturbação média da potência de alfa diminuiu. Por sua vez, a coerência de fase no 1d entre
o CPF e AMI mostraram o aumento da coerência em delta apenas no grupo IS. Por fim, no
2d ocorreu o aumento da potência de alfa no grupo ES e o aumento da coerência de fase
em teta no grupo IS. Tomados em conjunto, esses dados indicam o processamento neural
distinto do CPF e da AMI durante o desamparo aprendido, fornecendo novas evidências
para a compreensão do processamento neural do estresse incontrolável.
Palavras chave: estresse incontrolável; modelos animais de depressão; desamparo
aprendido; córtex pré-frontal; amígdala basolateral; eletrofisiologia; atividade unitária;
potencial local de campo.
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ABSTRACT
Rossignoli, MT. Cortical-amygdalar electrophysiology activity in the triadic learned
helplessness model [thesis]. Ribeirão Preto: University of São Paulo, Ribeirão Preto School of
Medicine, 2014.
Uncontrollable stress is an important risk factor to maladaptive responses, such as major
depression. Both major depression and the learned helplessness triadic model of induced
depressive behavior is associated with functional impairments in the prefrontal cortex (PFC)
and amygdala (AMY). However, electrophysiological measures underlying these
impairments are still lacking in the learned helplessness model. Thus, we aimed to
investigate the single-unit activity and the oscillatory correlates of such impairments during
triadic learned helplessness model. Rats chronically implanted with multi-electrode arrays
into PFC and AMY were submitted to triadic learned helplessness model. On the first day
(1d) animals were exposed to escapable shock (ES), paired inescapable shock (IS) or no shock
(Sham). On day 2 (2d) all three groups were evaluated for depressive-like behaviors in
avoidance task. The single-unit and oscillatory activity evoked by the conditioned stimuli
(EC) were recorded in the PFC and AMY throughout the behavioral protocol. In the PFC we
observed a positive neuronal modulation in IS group on the 1d, while in the 2d both the
modulation and neural activity increased in ES. Regarding the oscillations in the PFC of 1d,
theta power disturbance increased in ES group, and alpha power disturbance decreased in
IS. We also found elevated PFC-AMY delta phase coherence in IS at 1d. Lastly, alpha power
increased in ES group, and theta phase coherence enhances in IS at 2d. These data indicate
the distinct neural processing of PFC and AMY during triadic learned helplessness model,
providing new evidence for understanding the neural processing of uncontrollable stress.
Key words: uncontrollable stress; animal models of depression; learned helplessness;
prefrontal cortex; basolateral amygdala; electrophysiology; single-unit activity; local field
potentials.
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1. INTRODUÇÃO
19
A resposta ao estresse corresponde a um importante fenômeno fisiológico
relacionado tanto à sobrevivência do organismo quanto a respostas mal-adaptativas
(GODOY et al., 2018; MCEWEN et al., 2016). Na clínica, sabe-se que a exposição ao estresse é
o principal fator de risco para a depressão, contudo, enquanto há indivíduos que
vivenciaram situações estressoras e vão desenvolver este transtorno, outros são resilientes
ao estresse (SOUTHWICK et al., 2005). Não só as variações genéticas de cada indivíduo irão
influenciar essa resposta, mas também a forma como esse estressor (controlável ou
incontrolável) é apresentado e processado no sistema nervoso (MAIER e SELIGMAN, 2016;
SOUTHWICK et al., 2005). A identificação das dinâmicas neurais, envolvidas tanto no
processamento da susceptibilidade ao estresse quanto na sua resiliência, podem não só
aumentar a nossa compreensão sobre a depressão, como também pode levar ao
desenvolvimento de novos diagnósticos e tratamentos na clínica (FINGELKURTS;
FINGELKURTS, 2014).
Nesse contexto, o Laboratório de Investigação em Epilepsia vem realizando uma
série de trabalhos, tanto na clínica sobre a relação entre a epilepsia e a depressão
(KANDRATAVICIUS et al., 2012a, 2013, 2014, 2015), quanto na pesquisa básica, em modelos
experimentais de comorbidade (KANDRATAVICIUS et al., 2012b; WOLF et al., 2016) e no
estresse per se (MARQUES, 2016). Dando continuidade a esse histórico, o interesse em se
estudar o estresse ocorreu após a minha colaboração na dissertação de mestrado do colega
de laboratório Danilo B. Marques. Neste trabalho, foi possível observar os indicadores
eletrofisiológicos do CPF e do hipocampo (HIPO) acerca da controlabilidade do estresse,
utilizando-se para isso o modelo tríadico do desamparo aprendido. Diante destes primeiros
achados promissores e do surgimento de novas questões, ainda inexploradas, sucedeu-se o
meu interesse na realização do presente trabalho.
1.2. Depressão
A depressão é o transtorno psiquiátrico mais prevalente e incapacitante no mundo,
afetando cerca de 20% da população mundial (WHITEFORD et al., 2013). Além disso, a
depressão é altamente recorrente, dentre os indivíduos tratados após o primeiro episódio,
64% vivenciam outro episódio depressivo nos próximos meses e apenas 30% obtêm
remissão completa (MCINTYRE e O’DONOVAN, 2004; SOLOMON et al., 2000). No Brasil, a
20
depressão atinge 7,8 milhões de indivíduos, sendo que dentre os diagnosticados com
depressão grave, 14% cometem suicídio (IBGE, 2014).
Caracterizada pela presença de alterações emocionais-cognitivas, a depressão leva o
indivíduo a incapacidade funcional e ao comprometimento de sua saúde de maneira
crônica (FLECK et al., 2009). De acorodo com Manual Diagnóstico e Estatístico de
Transtornos Mentais 5a Edição (DSM-V), a depressão é diagnosticada quando um indivíduo
apresenta, por mais de 2 semanas, ao menos 4 dos seguintes sintomas: humor entristecido,
mudanças no apetite e no peso, problemas com sono, alterações psicomotoras, fadiga,
sentimentos de desvalia ou culpa, dificuldades para concentrar-se ou tomar decisões, perda
de interesse ou prazer, e pensamentos suicidas (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION,
2014). Apesar da alta prevalência da depressão e das suas consequências graves, os
progressos na compreensão da neurofisiologia da depressão são insatisfatórios: apenas 30%
dos casos contam com remissão completa do transtorno (MCINTYRE e O’DONOVAN, 2004),
e até 64% dos pacientes apresentam a reincidência de um segundo episódio nos meses
seguintes ao tratamento (SOLOMON et al., 2000).
As causas da depressão ainda não foram completamente compreendidas, mas o
estresse, e particularmente a falta de controle sobre eventos estressantes, corresponde a um
fator fundamental no desenvolvimento do transtorno (KESSLER, 1997; MAIER e SELIGMAN,
2016; PRYCE et al., 2011). Em indivíduos diagnosticados com depressão, 60% dos casos
foram seguidos de estressores psicossociais (POST, 1992). Estes estressores, por sua vez,
desencadeiam uma série de respostas fisiológicas ao estresse mediados pelo eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), tipicamente hiperativado em pacientes depressivos
(MELLO et al., 2007). Por fim, a resposta ao estresse produz uma série de mediadores
fisiológicos capazes de alterar a atividade e a conexão funcional de áreas cerebrais
envolvidas no processamento emocional-cognitivo (DEAN e KESHAVAN, 2017).
1.3. Neurofisiologia da Depressão
Técnicas de imageamento não-invasivas e registros eletroencefalográficos (EEG) são
comumente usados na clínica com o objetivo de se compreender melhor o processamento
neural da depressão (FINGELKURTS e FINGELKURTS, 2014; PRYCE et al., 2011). Em conjunto,
esses estudos mostram que estruturas como o CPF e AMI, desempenham um papel
fundamental na depressão (FINGELKURTS e FINGELKURTS, 2014; MURRAY et al., 2011).
21
Em pacientes com depressão ocorre o aumento do volume da AMI (DREVETS, 2000),
assim como o aumento da sua taxa metabólica na antecipação de estímulos aversivos
(SHELINE et al., 2001; SIEGLE et al., 2002). Já em relação ao CPF, durante estímulos aversivos
ocorre a diminuição de sua atividade em pacientes depressivos (STRIGO et al., 2008). Além
disso, no CPF ocorre a diminuição da densidade neuronal e de volume, sendo a gravidade
da depressão diretamente associada com esta perda de volume (BORA et al., 2012; COTTER,
2002; LAVRETSKY et al., 2011). Por sua vez, indivíduos resistentes a estressores incontroláveis
apresentam o aumento da atividade do CPF no período anterior ao estímulo (SALOMONS et
al., 2007). Diante desse achados, Price e Drevets (2012) sugerem que a depressão seja o
resultado de alterações na circuitaria neural envolvendo majoritariamente o CPF e a AMI, na
qual a hipofunção do CPF estaria associada a hiperexcitação da AMI, resultando nas
alterações comportamentais associadas à depressão.
De maneira convergente, Fingelkurts e Fingelkurts (2014) analisando a dinâmica
oscilatória a partir de dados com EEG, caracterizam a depressão como um transtorno
marcado pela hiperatividade límbica e hipoatividade do CPF, com persistente alterações nas
oscilações delta (1 - 4 Hz), teta (3 - 7 Hz) e alfa (7 - 13 Hz) (FINGELKURTS e FINGELKURTS,
2014). Quanto maior a conectividade fronto-temporal, em termos de delta e teta, maior a
resistência ao tratamento com antidepressivos (LEE et al., 2011). A potência relativa de teta,
por sua vez, corresponde a um importante valor preditivo da resposta a antidepressivos.
Quando pacientes submetidos a antidepressivos aumentavam a concordância em teta (4 –
8 Hz) no CPF logo no primeiro dia do tratamento, os sintomas diminuíam após 1 semana
(BARES et al., 2014). Além disso, nos pacientes depressivos é possível identificar o aumento
considerável das oscilações alfa no CPF (BRUDER et al., 2001). Funcionalmente essa atividade
alfa representa tipicamente uma relação inversa a atividade cortical, ou seja, o aumento de
alfa reflete a redução da atividade cortical (LAUFS et al., 2003). Por fim, em indivíduos com
depressão ocorre o aumento da coerência geral do sinal em delta, teta e alfa quando
comparado a indivíduos saudáveis (LEUCHTER et al., 2012).
Em conjunto, esses dados apresentados enfatizam a visão moderna de que
distúrbios mentais possam ser vistos como disfunções na conectividade funcional de
diferentes sistemas do encéfalo, ou seja, o processamento neural da depressão ou resiliência
ocorreria a partir de circuitarias neurais distintas (CASTRÉN, 2005; SIBILLE e FRENCH, 2013).
(Fig. 1). Na clínica é possível verificar essas alterações eletrofisiológicas em circuitarias
22
neuronais após a instauração do transtorno, contudo, fazer essas análises durante a
aquisição da depressão é impossível. Nesse sentido, modelos experimentais de depressão,
quando escolhidos de maneira apropriada, correspondem a uma ferramenta valiosa,
possibilitando o registro da atividade neurofisiológica de circuitarias neurais com maior
precisão espacial e temporal, tanto durante a aquisição quanto durante a expressão de
comportamentos do tipo depressivos (CZÉH et al., 2016; LEUCHTER et al., 2015).
Figura 1 – Redes neurais na depressão e na resiliência. A hipótese neural propõe que o
comportamento depressivo seria o resultado do processamento mal-adaptativo em circuitarias
neuronais distintas às da resiliência. Imagem adaptada de MARQUES, 2016.
1.4. Modelos animais de depressão
Como dito anteriormente, a exposição ao estresse representa um dos principais
fatores de risco para a ocorrência da depressão (KENDLER e GARDNER, 2010). Por esta razão,
modelos animais tentam reproduzir componentes da depressão através da exposição ao
estresse, dentre eles podemos citar: o nado forçado, o teste de suspensão pela cauda, o
estresse crônico moderado e o modelo de estresse crônico por derrota social (DUMAN,
2010). Na clínica, entretanto, é levado em conta a avaliação do indivíduo sobre o estresse,
sendo a incontrolabilidade fundamental para a etiologia da depressão (EVERAERT et al.,
2012). Considerando esse fator, a teoria cognitiva da depressão postula que o
23
desenvolvimento da depressão ocorre, a nível comportamental, através da incapacidade do
indivíduo de controlar emoções negativas, concomitantemente com a incapacidade de
acessar novas formas de processá-la, gerando respostas comportamentais mal-adaptativas
(CLARK e BECK, 2010). Nesse cenário, o único modelo animal de depressão que se propõe a
considerar essa homologia na clínica, ou validade teórica, seria o modelo do desamparo
aprendido (VOLLMAYR e GASS, 2013). Além disso, o desmaparo aprendido também supri
outros dois critérios de validade para modelos experimentais: 1) a analogia, os animais
desamparados apresentam sintomas relacionados a depressão como anedonia e alterações
no ciclo sono-vigília (SANCHIS-SEGURA et al., 2005); e 2) predictibilidade, antidepressivos
são capazes de reverter os déficits comportamentais dos animais desamparados (SHERMAN
et al., 1982). Ademais, a relação do desamparo aprendido com a depressão em humanos foi
extensamente estudada por Seligman e col (2016). Sujeitos saudáveis quando submetidos
ao estresse incontrolável, assim como sujeitos com depressão não submetidos a estresse,
apresentam um sucesso menor em tarefas cognitivas, como solução de anagramas (KLEIN
etal., 1976) e combinações de cartas (MILLER e SELIGMAN, 1976).
No protocolo comportamental do modelo triádico do desamparo aprendido existe a
formação de três grupos experimentais, os quais são submetidos a pelo menos duas fases
experimentais (MAIER e WATKINS, 2005). De forma que o uso destes três grupos é essencial
para que seja possível avaliar o efeito da controlabilidade sobre o estresse, e não apenas do
estresse per se (MAIER e SELIGMAN, 2016). Os três grupos se diferem já na primeira fase
experimental: os animais (normalmente ratos ou camundongos) do primeiro grupo
recebem um estímulo aversivo (choque), o qual pode ser interrompido pelo cumprimento
de uma tarefa (por exemplo, pular através de uma barreira). Já os animais do segundo grupo
são pareados com os do primeiro, de modo a receber o mesmo estímulo aversivo, de mesma
intensidade e duração que estes. Entretanto, o cumprimento ou não da tarefa não cessa a
exposição ao estímulo aversivo. Desta maneira, a única diferença entre estes dois grupos é
a controlabilidade do estímulo aversivo. Por fim, o terceiro grupo é submetido aos mesmos
procedimentos, mas sem receber nenhum estímulo aversivo (MAIER e SELIGMAN, 2016). Os
animais que são expostos ao choque IS apresentam uma série de respostas distintas do
grupo submetido ao choque ES, a citar: aumento da imobilidade do nado forçado (WEISS et
al., 1981), resposta exacerbada e prolongada no medo condicionado (BARATTA et al., 2007),
redução da atividade motora na presença de um estímulo (Rau and Fanselow, 2009),
24
redução da interação social (CHRISTIANSON et al., 2008, 2009; SHORT e MAIER, 1993),
diminuição de agressão (MAIER et al., 1972) e redução do consumo de alimentos, dentre
outros (MAIER e WATKINS, 2005).
Muitos são os estudos que afirmam utilizar o desamparo aprendido, mas a grande
maioria não faz uso do modelo triádico (MAIER e WATKINS, 2005). Entre aqueles que usam
adequadamente este modelo, a grande maioria foi desenvolvida pelos grupos de pesquisa
de Martin Seligman e Steven Maier, autores que juntos desenvolveram o modelo do
desamparo aprendido (SELIGMAN e MAIER, 1967). Em 50 anos de estudos na área foi
possível desvendar parte da circuitaria neural responsável por detectar a controlabilidade
do estresse e o que desencadeia os efeitos do desamparo aprendido. A partir desses
estudos, Maier e Seligman indicaram que a comunicação entre o CPF e a AMI, em especial a
amígdala basolateral (ABL), é fundamental para a aquisição e manutenção do desamparo
aprendido (MAIER e SELIGMAN, 2016).
1.5. Comunicação entre o CPF e ABL
Os aspectos anatômicos na conectividade entre o CPF e a ABL são essenciais para a
compreensão dos comportamentos do tipo depressivo (CARLSON et al., 2017; DILGEN et al.,
2013; DZIRASA et al., 2013; KUMAR et al., 2014). No lobo temporal a AMI está relacionada ao
processamento de informações emocionais, como aquisição, evocação e extinção do medo;
organização de respostas motoras de defesa; e planejamento de recompensas a longo prazo
(HARTLEY e PHELPS, 2010; HERNÁDI et al., 2015; HERRY et al., 2008; JOHANSEN et al., 2010;
MAREN e QUIRK, 2004). A amígdala é estruturalmente formada por diversos núcleos com
aferências e eferências amplamente distribuídas (SAH et al., 2003). Dentre os núcleos, a ABL
seria o principal receptor dos estímulos somatossensorias e responsável pelo
processamento emocional dessas informações, que por sua vez, as encaminha para diversas
regiões, em especial para outras regiões límbico-corticais, como o CPF (HEIDBREDER e
GROENEWEGEN, 2003; LEDOUX, 2007; MCDONALD, 1998). O CPF é frequentemente
associado a processamentos cognitivos, como processos atencionais, tomada de decisão,
comportamentos dirigidos, processos mnemônicos e controle de eventos emocionais
(COURTIN et al., 2013; KUMAR et al., 2013; REPOVŠ; BADDELEY, 2006). Da ABL, o CPF recebe
aferências monosinápticas glutamatérgicas, em específico no córtex pré-límbico, atingindo
os dendritos de neurônios piramidais e interneurônios nas camadas II e V (MCDONALD,
25
1991, 1996; MITRANO et al., 2010). No CPF, por sua vez, existem eferências glutamatérgicas
partindo da camada II para interneurônios GABAérgicos da ABL, fechando a comunicação
entre a ABL e o CPF (GABBOTT et al., 2005; HÜBNER et al., 2014; LITTLE e CARTER, 2013).
1.6. Atividade do CPF e da ABL no desamparo aprendido
De acordo com Maier e Seligman, no desamparo aprendido o CPF corresponde a uma
região integradora fundamental para o processamento de informações referentes a
controlabilidade do estresse, enquanto a ABL potencializa os comportamento de medo e
ansiedade (MAIER e SELIGMAN, 2016). A partir de uma abordagem comportamental e
neuroquímica, Amat e col (2005) demonstraram que a inibição do CPF durante o choque ES é
capaz de desamparar os animais. Em contrapartida, a ativação do CPF em ratos submetidos
ao choque IS é suficiente para inibir a indução do desamparo aprendido no grupo (AMAT et
al., 2008).
Em relação a ABL, a sua atividade também é distinta em função da controlabilidade
do estresse. No grupo submetido ao choque IS a ativação de genes relacionadas a
plasticidade sináptica é maior na ABL em comparação aos grupo ES (MACHIDA; LONART;
SANFORD, 2017). No desamparo aprendido a atividade da ABL é majoritariamente
modulada pela sinalização serotoninérgica. De modo que a ativação de receptores 5-HT2C
na ABL aumentam os déficits comportamentais induzidos pelo choque IS (STRONG et al.,
2011). Nesse contexto, o núcleo dorsal da rafe (NDR) se comunica mais intensamente com a
ABL no grupo IS, sendo que altos níveis de 5-HT na ABL são relacionados ao aumento de
comportamentos ansiogênicos (CHRISTIANSON et al., 2010). Amat et al. (2016) observaram
ainda que o aumento de serotonina na ABL em ratos submetidos ao choque IS pode ser
revertido por antidepressivos. Dessa forma, além da comunicação direta entre a ABL e o CPF,
na qual o CPF pode inibir a ABL diante da detecção de controle, ambas as regiões são
mediadas pelo NDR (BERRETTA et al., 2005). A região pré-límbica do CPF envia projeções
glutamatérgicas para o NDR, que se conectam com os interneurônios que contêm ácido
gamaminobutírico (GABA) neste núcleo (MAIER e WATKINS, 2005). Caso não haja a detecção
de controlabilidade do estímulo aversivo, o NDR não é inibido e então reenvia os sinais que
obteve para a ABL durante o choque IS (MAIER; SELIGMAN, 2016). Apesar do conhecimento
dessa circuitaria por meio de investigações psicofarmacológicas, pouco se sabe sobre o
processamento neural do CPF e da ABL no desamparo aprendido.
26
1.7. Atividade eletrofisiológica do CPF e da ABL em modelos de estresse
Há inúmeros trabalhos que se prontificaram a estudar a atividade eletrofisiológica do
CPF em modelos experimentais (ESTEVES et al., 2017; GODSIL et al., 2013; RUGGIERO et al.,
2017, 2018). Contudo, são escassos os trabalhos que investigaram a comunicação entre o
CPF e ABL durante protocolos de estresse, analisando tanto as suas dinâmicas oscilatórias
quanto os disparos unitários dessas estruturas (CARLSON et al., 2017; DZIRASA et al., 2013;
KUMAR et al., 2014) (Fig. 2).
Os primeiros experimentos sobre as alterações oscilatórias foram realizados em ratos
anestesiados, através do registro das oscilações dos potenciais locais de campo (PLCs) e das
unidades de disparo do CPF e da ABL. Nesses animais o tratamento sistêmico com o
antagonista GABAérgico FG-7142, droga reconhecidamente capaz de mimetizar as
respostas do estresse, aumentou a potência da oscilação teta (4 - 8 Hz) nos PLCs registrados
na ABL e no CPF (STEVENSON et al., 2007). Além disso, o tratamento com FG-7142 também
diminui a taxa de disparo neuronal no CPF e a sincronia das unidades de disparo entre o CPF
e ABL (STEVENSON et al., 2007).
Já no trabalho com animais em livre-movimento desenvolvido por Kumar e col
(2014), foi possível observar após a exposição do estresse crônico por derrota social que a
atividade do CPF precede a atividade da ABL nas oscilações delta e teta (2 - 7 Hz). No trabalho
de Kumar e col (2014) observou-se a direcionalidade do CPF sobre a ABL nos disparos
unitários acoplados a delta e teta, os quais respectivamente diminuíram no CPF e
aumentaram na ABL. Por sua vez, essa diminuição de disparos neuronais no CPF foi capaz
de predizer a susceptibilidade ao estresse. As alterações eletrofisiológicas no CPF e na ABL
não só estão relacionadas a comportamento do tipo-depressivos, como também na
expectativa de situações punitivas, nas quais a proporção de unidades que disparam mais
nessas situações é maior na ABL do que no CPF (BURGOS-ROBLES et al., 2017).
Além desses achados, alterações na sincronia entre o CPF e ABL também foram
observadas em modelos de estresse. Em camundongos geneticamente modificados para
não produzir serotonina, comportamentos do tipo-depressivos são relacionados ao
aumento da coerência CPF-ABL nas oscilações delta (2 - 4 Hz) e beta (15 - 30 Hz) (DZIRASA
et al., 2013). Por sua vez, em contextos seguros o aumento da coerência CPF-ABL de teta (4
– 12 Hz) corresponde a um importante marcador eletrofisiológico (LIKHTIK et al., 2014). A
interação destas oscilações no CPF e na ABL também foi analisada por Hultman e col (2016),
27
os quais observaram que no estresse crônico por derrota social ocorre a comudalação de
fase teta (2 – 7 Hz) – beta (14 – 23 Hz) entre o CPF e ABL. Apesar de todos estes marcadores
eletrofisiológicos em outros modelos experimentais de estresse, não há trabalhos
investigando a comunicação córtico-amigdalar no desamparo aprendido.
Em nosso laboratório, Marques (2016) mostrou pela primeira vez que o aumento da
perturbação média da potência de teta (4 – 8 Hz) e alfa (8 – 12 Hz) no CPF e no HIPO
correspondem a um importante marcador eletrofisiológico da controlabilidade do estresse.
Essa modulação em teta no CPF se correlaciona positivamente com o comportamento
resiliente no protocolo do desamparo aprendido. Este achado vai de encontro a outros
trabalhos na literatura que também observaram a modulação dessas bandas diante de
estímulos aversivos. No medo condicionado, um protocolo semelhante ao grupo IS, o
congelamento comportamental é associado a diminuição de teta (8 -12 Hz) no CPF após o
estímulo, enquanto os períodos de não congelamento são associados ao aumento desse
teta. Nesta tarefa a atividade em teta (8 – 12 Hz) no CPF está intimamente ligada a atividade
de neurônios piramidais, sendo estes regulados por interneurônios parvalbumínicos, de
forma que a desinibição dos interneuônios possibilita a sincronização em teta (COURTIN et
al., 2014). Já no desamparo aprendido, a relação entre o teta no CPF e a sua atividade unitária
ainda não está clara. Contudo, Marques (2016) observou unidades neuronais no grupo ES e
IS com modulações distintas. Diante desses achados, seria importante verificar como esses
marcadores eletrofisiológicos do CPF interagem com outras estruturas importantes para o
desamparo aprendido, como a ABL.
28
Figura 2 – Principais marcadores eletrofisiológicos do CPF e da ABL em modelos de estresse. No CPF,
após a exposição ao estresse, a potencia de delta (1 – 4 Hz) diminui enquanto a potência de teta
aumenta ( 4 – 8 Hz). O aumento dessas potências está associado ao aumento da coerência em delta
e teta entre CPF e ABL. Entretanto a frequência de disparo no CPF diminui. Já na ABL a potência de
delta e teta diminui após o estresse, enquanto os disparos unitários aumentam, em específico os
disparos coordenados a partir das oscilações teta do CPF.
1.8. Justificativa
Diversas abordagens psicoformacológicas na investigação do desamparo aprendido
mostraram que a controlabilidade do estresse proporciona a regulação da atividade da ABL
via a atividade do CPF, o que em alguns trabalhos se é referido como “Top-down regulation”
(MAIER e SELIGMAN, 2016). Na presença de choques ES, o CPF exibe o controle sobre a
atividade da ABL, em contrapartida, no choque IS esse controle se inverte, com a atividade
da ABL se sobrepujando a do CPF (AMAT et al., 2005, 2016; MACHIDA; LONART; SANFORD,
2017; STRONG et al., 2011). Apesar desses achados, ainda não se sabe como se dá essa troca
no processamento neural entre o CPF e a ABL.
Em trabalhos eletrofisiológicos com outros modelos experimentais, sabe-se que o
estresse diminui a taxa de disparo no CPF enquanto aumenta os disparos na ABL,
29
especificamente durante as oscilações delta e teta. Por sua vez, nesses modelos a
sincronização entre o CPF e ABL também é observada por mudanças na coerência das
oscilações delta e teta. Dados coletados no nosso laboratório mostraram que o aumento da
potência em teta no CPF corresponde a um importante marcador eletrofisiológico da
controlabilidade do estresse no desamparo aprendido. No entanto, não se sabe ainda como
essa atividade eletrofisiológica do CPF no desamparo aprendido afetaria a dinâmica
oscilatória e os disparos neuronais da ABL.
Com base nesses achados, nossa hipótese de trabalho é de que a controlabilidade
do estresse, avaliada pelo desamparo aprendido, seja caracterizada pelo aumento das
oscilações em teta e a diminuição em delta no CPF, associadas a diminuição de disparos
neuronais e a diminuição de delta na ABL, de forma que a sincronização dessas estruturas
seja alterada. Esses achados representariam o primeiro relato eletrofisiológico da
comunicação entre o CPF e a ABL no desamparo aprendido, ampliando a compreensão
sobre o processamento neural da controlabilidade do estresse.
30
2.OBJETIVOS
31
2.1. Objetivos Gerais
O objetivo do presente trabalho foi descrever a atividade oscilatória e unitária no CPF
e na ABL durante o modelo triádico do desamparo aprendido. Desta forma, testou-se a
hipótese de que a controlabilidade do estresse altera a funcionalidade e conectividade entre
o CPF e ABL de maneira distinta ao estresse per se.
2.2. Objetivos específicos
I. Padronizar o protocolo comportamental do modelo triádico do desamparo
aprendido, de modo que atenda as premissas apontadas por Maier et al., (2016).
II. Adaptar o aparato de esquiva ativa, de modo que seja possível o registro
eletrofisiológico simultâneo ao comportamento, livre de ruído e sem perdas de registro.
III. Caracterizar e comparar os efeitos do choque ES e IS no comportamento,
avaliando-se para isso a latência da fuga dos animais e o número de falhas.
IV. Caracterizar e comparar os efeitos do choque ES e IS nos disparos neuronais do
CPF e da ABL nos dois dias de experimento, utilizando-se para isso o registro da atividade
unitária.
V. Caracterizar e comparar os efeitos do choque ES e IS no padrão oscilatório do CPF
e da ABL nos dois de experimento, utilizando-se para isso o registro dos potenciais locais de
campo (PLCs).
32
3. MATERIAL E MÉTODOS
33
3.1. Desenho experimental
Os experimentos propostos para a investigação eletrofisiológica durante o
desamparo aprendido podem ser divididos em três momentos: (1) confecção dos
multieletrodos e realização da cirurgia estereotáxica, com o intuito de implantar os
eletrodos no CPF e na ABL; (2) o 1d do registro eletrofisiológico durante o desamparo
aprendido, com a exposição dos animais a choques ES (grupo ES), choques IS (grupo IS) ou
a nenhum choque (grupo Sham); e (3) o registro eletrofisiológico no 2d durante o teste da
esquiva ativa (Fig. 3). Todas essas etapas do desenho experimental serão descritas
detalhadamente nas próximas seções.
Figura 3 – Desenho experimental. Na primeira etapa experimental os sujeitos foram submetidos a
cirurgia estereotáxica para o implante dos multieletrodos no CPF e na ABL. Após 7 dias de
recuperação, foi realizado o 1d de registro eletrofisiológico durante a exposição de 100 sessões de
choque escapável, choque inescapável ou sem choque. 24 h após o 1d de registro realizou-se o
registro durante as 30 sessões do teste da esquiva ativa.
3.2. Sujeitos
Foram utilizados 81 ratos Wistar adultos machos com pesos entre 270 e 350 g,
provenientes do Biotério Central da Universidade de São Paulo – USP/RP. Em função da taxa
de mortalidade durante a cirurgia, erros no posicionamento dos eletrodos, bem como
dificuldades na padronização do registro eletrofisiológico (e.g. ruído da rede elétrica, ruído
de movimento, falhas de posicionamento de eletrodos), apenas 67 destes animais foram
aproveitados como sujeitos experimentais. Todos os protocolos experimentais foram
submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (CEUA – FMRP – USP, Processo n°105/2015).
10 Dia de Registro
24 Horas
100 SessõesCirurgia
estereotáxica
7 diasTeste da esquiva
ativa
Recuperação
20 Dia de Registro30 Sessões
Sem choque (Sham)Choque escapável (ES)
Choque Inescapável (IS)
34
No biotério, os animais foram alojados em grupos de quatro em uma caixa de
polipropileno (40 x 33 x 18 cm) contendo raspas de madeira (maravalha) sobre o assoalho.
A temperatura do ambiente foi controlada em 24 ± 2 °C e o ciclo de claro/escuro foi de 12 h,
com as luzes acendendo às 7 h 00 e apagando às 19 h 00. A disponibilidade de água e
comida para os animais foi ad libitum.
3.3. Confecção dos multieletrodos
A fim de se realizar os registros eletrofisiológicos durante o desamparo aprendido
foram utilizados arranjos de multieletrodos semi-manufaturados (Fig. 4), já descritos em
outros trabalhos do grupo (BUENO-JUNIOR et al., 2017). Cada arranjo de multieletrodos foi
confeccionado utilizando um conector (Omnetics, modelo A12623-001, USA) soldado a 8
fios de tungstênio de 50 µm de diâmetro revestidos por teflon (California Fine Wires, USA).
Estes fios, por sua vez, passavam por uma cânula com 0,6 mm de diâmetro e
aproximadamente 1 cm de comprimento. Durante a cirurgia cada conector era soldado a
um fio de prata (A-M Systems, Inc, USA), usado para a conexão com o microparafuso de
referência no crânio (microparafuso de 1,2 mm de diâmetro soldado a um fio de prata). Os
conectores eram então recobertos por acrílico odontológico, de modo a manter as pontas
das cânulas e dos conectores livres. Em especial, no arranjo de multieletrodos
confeccionado para o implante na ABL, um dos fios de tungstênio era mantido fora da
cânula, sendo utilizado futuramente para o registro do eletromiograma na musculatura do
pescoço. Por fim, cortava-se os fios de tungstênio com uma tesoura fina, de modo a ficarem
com comprimento adequado às suas respectivas coordenadas dorso-ventral de implante
(CPF: - 2,9 mm; ABL - 6,6 mm). Além da confecção dos multieletrodos, um microparafuso de
referência do sinal foi feito a partir de um microparafuso de 1,2 mm de diâmetro soldado a
um fio de prata.
35
Figura 4. Esquema representativo da manufatura dos multieletrodos. (A) Primeiro os fios de
tungstênio e o fio de prata foram soldados ao conector, e então os fios de tungstênio eram passados
por uma cânula. A ponta dos eletrodos era cortada de acordo com a profundidade da coordenada e
os fios recobertos por acrílico odontológico. Por fim, o microparafuso de referência era preparado
soldando um fio de prata a um microparafuso. (B) Fotos retiradas durante o processo de confecção
dos eletrodos até a sua finalização. Com o auxílio de um suporte com garras era possível passar os
eletrodos de tungstênio pela cânula e recobri-los com acrílico.
3.4. Cirurgia estereotáxica para implante dos multieletrodos
Inicialmente os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (0,75 mg/Kg
intraperitoneal, i.p., seguido por 0,5 mg/Kg intramuscular, i.m.) e xilazina (0,38 mg/Kg i.p. e
0,25 mg/Kg i.m.). Com os animais anestesiados realizava-se a tricotomia do escalpo e fixação
do crânio em estereotáxico (KOPF Instruments; EUA). Após a verificação do grau de
anestesia por meio do pinçamento de cauda, foi realizada a assepsia do escalpo com iodo,
água oxigenada e injeção subcutânea de anestésico local (lidocaína 2% em NaCl 0,15M) para
incisão do escalpo, exposição e limpeza da superfície do crânio. Tomando-se o bregma
como referência anteroposterior e médio-lateral, foram feitos dois orifícios no crânio para o
implante de multieletrodos, visando atingir de forma ipsilateral: 1) a região pré-límbica do
CPF, ântero-posterior (AP): + 3,2 mm; médio-lateral (ML): – 0,5 mm; dorso-ventral (DV): - 2,9
mm; e 2) a ABL , AP: - 2,6 mm; ML: + 5,1 mm; DV: - 6,7 mm (PAXINOS; WATSON, 2007). Nestas
36
coordenadas de interesse a dura-máter era removida com o auxílio de uma agulha de ponta
fina. Este procedimento foi realizado utilizando um estereomicroscópio de haste móvel que
auxiliou na visualização da dura-máter, e no desvio de pequenos vasos sanguíneos do
caminho dos multieletrodos. A descida dos multieletrodos foi feita em intervalos de 0,1
mm/min até às coordenadas DV. Durante a descida o tecido foi constantemente hidratado
e a presença de sangramento verificada.
Além do implante dos multieletrodos, fixava-se no crânio próximo ao lambda o
microparafuso de referência, que ao final do implante era soldado ao fio de prata do arranjo
dos multieletrodos. Com o intuito de sustentar o implante, realizou-se a inserção de
microparafusos em cinco orifícios adicionais no crânio. Por fim, uma base acrílica ao redor
dos parafusos e multieletrodos era formada para manter o capacete mecanicamente estável
(Fig. 5). Após a cirurgia, os animais receberam injeção subcutânea de flunixina meglumina
(banamine; 2,5 mg/K; analgésico com ação anti-flamatória) e injeção intramuscular de
pentabiótico (1 ml/Kg), permanecendo em observação até sua recuperação. No biotério, os
animais eram acomodados em caixas individuais e deixados para repouso durante 7 dias
após a cirurgia. Com o implante crônico finalizado e os animais já recuperados da cirurgia,
seguia-se para o registro eletrofisiológico durante o desamparo aprendido.
Figura 5 – Implante dos multieletrodos. (A) Esquema representativo das coordenadas do implante
dos arranjos de multieletrodos no CPF e na ABL seguido pelo implante dos multieletrodos e a
formação de um capacete acrílico. (B) Imagem do estereomicróscopio (aumento 40x) indicando a
craniotomia referente as coordenadas do CPF. Ao centro da craniotomia a exposição da dura-máter
incluindo o seio superior sagital, perifericamente o implante de microparfusos para a fixação do
capacete de acrílico.
37
3.5. Protocolo comportamental
3.5.1. Padronização comportamental
Para a indução e verificação do desamparo aprendido, utilizamos um aparato de
esquiva ativa (Insight), com 54 cm de comprimento x 30,7 cm de altura x 34 cm de largura.
A parede frontal é de acrílico transparente, e as laterais são cinzas, lisas, sendo o teto aberto
para a passagem dos fios de registro eletrofisiológico. O assoalho é gradeado e dividido ao
meio por uma barreira de 1,5 cm de altura. O aparato contém dois pontos luminosos de LEDs
para emissão do estímulo luminoso, bem como um alto-falante para emissão de estímulos
sonoros. Durante a tarefa comportamental o movimento do rato foi detectado por sensores
infravermelhos próximos ao assoalho.
Os experimentos comportamentais foram conduzidos durante a manhã ou à tarde,
em dois dias consecutivos, de modo que houvesse um intervalo de 24 h entre os dois testes.
No 1d, conforme o modelo triádico do desamparo aprendido, os ratos foram aleatoriamente
distribuídos em três grupos: grupo ES, grupo IS e grupo Sham. No 1d os ratos eram
posicionados no centro da caixa de esquiva ativa por um período de habituação de 30 min.
Após a habituação se dava o início de 100 sessões, sendo cada sessão correspondente a
exibição de 10 s de estímulo luminoso (200,0 lux; estímulo condicionado, EC) seguido por
um choque de 0,6 mA por até 10 s (para os grupos ES e IS), tempo durante o qual o estímulo
luminoso continuava ativo. Por fim, entre cada sessão ocorreu um intervalo de 40 s ± 20 s.
Os ratos do grupo ES podiam interromper o choque ao deslocar-se de uma metade à outra
da caixa (fuga simples, F1). Por outro lado, os ratos do grupo IS não tinham controle sobre a
duração do choque. Eles eram submetidos ao choque a um tempo idêntico ao sofrido por
um rato ES, de modo que pares ES/IS recebiam os mesmos tempos de choque. Os ratos do
grupo Sham não foram submetidos a choque algum, apenas ao período do estímulo
luminoso e ao intervalo entre as sessões.
No 2d os animais eram recolocados na mesma caixa de esquiva ativa, contudo, os
sujeitos dos três grupos (ES, IS e Sham) eram submetidos ao protocolo para a análise do grau
de desamparo aprendido. Neste teste da esquiva ativa o sujeito era posicionado no centro
da caixa durante 30 min, seguido pelo teste, propriamente dito, composto por 30 sessões.
Cada ciclo das primeiras 5 sessões correspondia a 10 s de luz, seguido por 10 s de luz e
choque de 0,6 mA, divido por intervalos de 40 s ± 20 s. Nos 5 primeiros ciclos, o choque
podia ser interrompido por F1. Nos próximos 25 ciclos mantinha-se este mesmo protocolo,
38
com exceção de que o choque poderia ser interrompido apenas se o rato atravessasse duas
vezes a barreira na caixa (fuga dupla, F2). Entre os testes de cada animal durante os dois dias,
a caixa era cuidadosamente limpa com etanol 70% e água (Fig. 6-A).
3.5.2. Protocolo comportamental definitivo
Após a padronização do protocolo do desamparo aprendido, novas modificações
foram propostas e um novo protocolo foi utilizado, protocolo este usado para a coleta dos
dados eletrofisiológicos. Este novo protocolo teve como objetivo aperfeiçoar o nosso
modelo experimental, de modo que fosse incorporado todas as diretrizes propostas por
Maier e col (2016). De acordo com os criadores do modelo triádico do desamparo aprendido,
Maier e Selligman afirmam que por definição no protocolo do desamparo deve-se investigar
a trans-situcionalidade do estresse incontrolável, ou seja, deve-se verificar os efeitos do
choque IS a um novo contexto (Maier et al., 2016). Sendo assim, o protocolo utilizado foi
idêntico ao descrito na seção 3.5.1., exceto por modificações no contexto e nos ECs do 2d.
No 1d borrifava-se uma fragrância de baunilha no aparato, além de se realizar os
experimentos com as luzes apagadas, para se aumentar o contraste com a presença do
estímulo luminoso. Já no 2d, mudou-se o contexto do teste da esquiva e o EC. O aparato era
borrifado com uma fragrância de limão e as suas paredes eram formadas por placas acrílicas
de 2 cm de espessura com padrões de listras pretas. Além disso, no teste da esquiva ativa do
2d todo o experimento foi realizado com as luzes acessas, e ao invés do estímulo luminoso
havia um estímulo sonoro (75 dB) (Fig. 6-B).
39
Figura 6 – Protocolo comportamental do desamparo aprendido. (A) Padronização inicial do modelo
triádico protocolo do desamparo aprendido. Neste protocolo os sujeitos foram expostos ao mesmo
contexto nos dois dias. (B) Protocolo utilizado durante o registro eletrofisiológicos, neste os animais
eram expostos a um contextos distinto no teste da esquiva.
3.6. Adaptações do aparato comportamental para registro simultâneo
Inicialmente, para realização de registros eletrofisiológicos de qualidade, MARQUES
et al., (2016) realizou uma série de adaptações no equipamento da esquiva ativa, as quais
foram utilizadas no presente trabalho. As principais alterações incluem: 1) adaptações na
caixa de esquiva ativa para que o animal pudesse se locomover livremente sem o perigo de
que os cabos de registro se enrolassem, para isso foi instalado um comutador com 16 canais
na caixa do aparato comportamental; 2) eliminação de grande parte dos ruídos de 60 Hz e
seus harmônicos através do aterramento dos componentes da caixa de esquiva ativa; 3)
elaboração de um sistema de transistor-transistor logic (TTL) para a emissão das marcações
temporais durante o registro eletrofisiológico, registrando simultaneamente os eventos
ocorridos na esquiva ativa com o registro eletrofisiológico; 4) implementação de um
sistema de relés que era ligado na ausência do choque mas desligado quando o choque era
Sessões Sessões
F1
F210 s 10 s 40 s ± 20 s 25
Sessões
Dia 1 Teste
30 min 30 min100 min
10 s 10 s 40 s ± 20 s 5Sessões
30 min
Sham, ES, IS
10 s 10 s 40 s ± 20 s 10 s 10 s
10 s 10 s 40 s ± 20 s 100Sessões
10 s 10 s 40 s ± 20 s 100Sessões
Sham
ES
IS
Sham, ES, IS
F1
F1
F2
A
100Sessões
Sessões Sessões
F1
F210 s 10 s 40 s ± 20 s 25
Sessões
Dia 1 Teste
30 min 30 min100 min
10 s 10 s 40 s ± 20 s 5Sessões
30 min
Sham, ES, IS
10 s 10 s100Sessões
10 s 10 s 40 s ± 20 s
10 s 10 s 40 s ± 20 s 100Sessões
10 s 10 s 40 s ± 20 s 100Sessões
Sham
ES
IS
Sham, ES, IS
F1
F1
F2
B
40
aplicado, essa modificação foi fundamental, pois sem ela a conexão do capacete ao cabo de
registro funcionava como um aterramento, diminuindo a intensidade do choque. Contudo,
apesar destas modificações, outras alterações se mostraram necessárias e foram
implementados no presente trabalho.
Em nossos primeiros registros eletrofisiológicos durante o protocolo de desamparo
aprendido notamos a presença de ruído de movimento, o que impossibilitava um registro
de qualidade em todos as sessões. Após um longo período de investigação, realizamos uma
série de modificações no aparato que eliminaram este ruído e melhoraram o sinal: 1) todo o
hardware da caixa da esquiva ativa foi desacoplada da caixa comportamental, de modo que
a circuitaria do hardware fosse aterrada e não influencia-se o registro; 2) o aterramento que
era feito nas barras de choque foi removido, pois a cada movimento do animal entre barras
o aterramento do sinal se alterava, gerando assim o ruído de movimento; 3) o gerador do
choque foi isolado do restante do hardware da esquiva já que a sua presença era uma fonte
de ruído de 60 Hz e seus harmônicos, e 4) na fonte de energia do hardware da esquiva foram
adicionados componentes ópticos a fim de evitar infiltrações de corrente, visto que antes
dessa implementação frequentemente a comunicação entre o computador e a esquiva
cessava por falhas (Fig. 7).
Figura 7 – Esquema representativo das adaptações do aparato comportamental para eliminação do
ruído de movimento. Da esquerda para a direita: comutador paro o registro durante o movimento
dos animais, seguido pelo gerador de corrente e hardware da esquiva, aterrados e separados da
caixa de registro. Por fim, os dados comportamentais eram gravados em um computador acoplado
ao hardware da esquiva.
Comutador Gerador de corrente
Hardware da esquiva
Fio terra
41
3.7. Registro eletrofisiológico
Para obtenção dos dados eletrofisiológicos usou-se o sistema de aquisição
eletrofisiológica Plexon Inc (Fig. 8). Os arranjos de multieletrodos foram conectadas a um
headstage de alta impedância com trava (HST/8o50, Plexon Inc.), o que possibilitava o livre
movimento dos animais sem que a conexão com os conectores falhasse (Fig. 8-1). A partir
de um cabo, os sinais do headstage seguiam para o comutador (Plexon Standard
Commutator, Plexon Inc.) em 16 canais (Fig. 8-2) que, por sua vez, passava o sinal pelo
sistema de relés adaptados ao nosso registro com choques e dava continuidade ao pré-
amplificador analógico (PBX, Plexon Inc., USA) (Fig. 8-3). No pré-amplificador os sinais eram
amplificados em 1.000 vezes, duplicados e então divididos para a aquisição da atividade
oscilatória (PLC) e dos disparos unitários. Em relação aos PLCs, foi aplicado um filtro para a
obtenção do sinal de baixa frequência (filtro passa-alta de 0,7 Hz e passa-baixa de 300 Hz),
já em relação aos disparos unitários foi obtido o sinal de alta frequência (filtro passa-alta de
150 Hz e passa-baixa de 8 KHz). O sinal dos PLCs passava por um hub e então era digitalizado
na frequência de amostragem de 1 kHz a partir de uma placa especializada no computador
(Fig. 8-4). Os sinais de alto frequência seguiam para o processador de sinal (MAP ou
Multichannel Acquisition Processor Data System, Plexon Inc.). No MAP ocorria a digitalização
em 40 kHz do sinal e então seguia-se para o computador (Fig. 8-5). A partir do MAP era
possível avaliar o sinal de outras formas através de saídas BNCs, assim como também
receber os sinais de entrada dos TTLs (Fig. 8-6). Em específico às saídas do sinal, nós
utilizávamos uma saída para o osciloscópio (TBS1000, Textronix) e outra para o monitor de
áudio (modelo 3300, A-M Systems) (Fig. 8-7). Para acompanhar o registro, utilizou-se a
interface do software SortClient (Plexon, Inc). Nela foi possível acompanhar a atividade
oscilatória através dos PLCs, os disparos neuronais através das unidades de disparo, e as
marcações dos TTLs emetidos pelo aparato comportamental ao MAP (vídeo do registro:
https://youtu.be/1bIKq-LgiIQ). Auxiliando a descriminação das unidades de disparo, foi
utilizada a interface Refs (Plexon, Inc) que permitia controlar o referenciamento do sinal do
arranjo de multieletrodos do CPF e da ABL. Por fim, o sinal referente as oscilações que
entravam no hub eram destinadas ao conversor analógico-digital (PowerLab 4/30;
ADInstruments, Inc.; Austrália) e a um computador com o software LabChart 7.2, que
possibilitava uma nova fonte de registro e a sincronia com a gravação em vídeo do
comportamento do animal durante a tarefa.
42
Figura 8 – Esquema representativo do sistema de registro. (1) Headstage de alta impedância
conectado aos multieletrodos. (2) Comutador de 16 canais. (3) Pré-amplificador do sinal dos PCLs e
dos disparos. (4) Digitalização dos PCLs a partir de uma placa especializada no computador. (5)
Digitalização dos disparos no processador de sinal MAP. (6) Envio dos sinais de TTL para o sistema
MAP. (7) Saídas de sinal para o osciloscópio e monitor de áudio.
3.8. Pré-processamento
3.8.1. Épocas de interesse
Com o objetivo de se investigar as respostas eletrofisiológica específicas aos ECs, que
por sua vez precediam aos choques ES, IS ou a nenhum choque, nós definimos como épocas
de interesse os segundos anteriores ao EC (pré-EC) e os segundos posteriores ao EC (pós-
EC). Em específico, para a análise do disparo neuronal utilizou-se 10 s tanto do período pré-
EC quanto do período pós-EC, sendo o sinal subdividido em bins de 0,1 s. Para a análise do
espectro de potência dos PCLs reduzimos a época para 1 s ao entorno dos ECs, e para as
análises de conectividade utilizamos 4 s pré e pós-EC. No caso do espectro de potência, o
objetivo desse recorte foi relacionar de maneira mais direta os efeitos do EC, já no caso das
análises de conectividade, o objetivo foi utilizar uma janela temporal com uma quantidade
de ciclos oscilatórios suficiente para as análises de coerência (Fig. 9). Para estas análises de
conectividade, elaborou-se uma rotina semi-automatizada com o intuito de eliminar as
Controle Disparos e eventos
Comutador
Emissor de TTLs
Headstage(HST/8o50)
PLCs
Pré-amplificador(PBX)
Disparos
Computador:- Conversors A/D-Interface-Armazenamento
Conversor A/D e processador de sinal (MAP) Osciloscópio
Monitor de áudio1
2
3
Sinal (> 0,7 Hz e <300 Hz)
Sinal (> 150 Hz e < 8 KHz)
4
5
6
7
43
sessões com movimento, que por sua vez poderiam alterar a interpretação dos resultados
de coerência (seção 3.8.4.).
Figura 9 – Épocas de interesse para a análise do registro eletrofisiológico. O estímulo condicionado
(EC), especificamente o estímulo luminoso no 1d e o estimulo sonoro no 2d, é definido como o ponto
0. Os períodos pré-EC e pós-EC correspondem aos períodos anteriores e posteriores ao EC. Nas
análises dos disparos neuronais o período analisado foi de 10 s pré e pós-EC, nas análises dos PCLs o
período foi de 1 s pré e pós-EC, e nas análises de coerência o período foi de 4 s pré e pós-EC. As faixas
vermelha, azul e verde correspondem aos períodos de análise, respectivamente, dos disparos
neuronais, PCLs e coerência.
3.8.2. Pré-processamento das unidades de disparo
Inicialmente foram feitas as delimitações das unidades após o registro. Com o uso
software Offline Sorte v6 (Plexon, Inc) analisou-se individualmente os canais registrados,
separando cada unidade manualmente (Fig. 10). Através deste software é possível visualizar
as unidades de disparo manipulando os eixos X, Y e Z contendo os componentes principais
(PC) ou outras características das ondas dos disparos. De modo geral, a análise de
componente principal (PCA) é a forma mais usada para a delimitação de unidades e
separação de ruído. No PCA cada formato de onda é convertido a um ponto no gráfico de
dispersão. Cada ponto deste é calculado como um score correspondente a transformação
do dado pelo PC, de forma que os pontos que se apresentarem aglomerados em
coordenadas próximas entre si representam formatos de ondas semelhantes. Usualmente,
aglomerados elípticos representam a atividade de uma unidade neural específica, enquanto
aglomerados com formatos inconsistentes correspondem a ruído e são progressivamente
ES
- 10 + 10 0
Período pré-EC Período pós-EC
Tempo (s)
ES
- 10 + 10 0
Período pré-EC Período pós-EC
Tempo (s)
ES
- 10 + 10 0
Período pré-EC Período pós-EC
Tempo (s)
Choque
Choque
Choque
Disparoneuronal
Espectro de potência
Análise deconectividade
44
eliminados no pré-processamento. Para a descriminação das unidades de disparo em
relação ao ruído, os eixos com as características da onda (i.e. PC1, PC2, PC3, latência,
amplitude) foram manipulados de forma a se obter o aglomerado mais representativo de
uma ou mais unidades de disparo. Além desses parâmetros, o histograma do intervalo entre
os disparos de cada unidade foi utilizado para garantir que aquele aglomerado representa-
se de fato uma atividade fisiológica.
Figura 10 – Exemplos de possíveis unidade de disparo descriminadas no software Offline Sorter. Em
destaque três unidades descriminadas através dos paramêtros PC1 (eixo x), PC2 (eixo y) e PC3 (eixo
z).
3.8.3. Pré-processamento dos potenciais locais de campo
O pré-processamento dos PCLs foi realizado na plataforma MATLAB 2015b (Matrix
Laboratory, MathWorks Inc), na qual foram utilizadas rotinas prontas dos pacotes Chronux
e EEGLAB. Inicialmente os sinais foram organizados de modo a separar as épocas de
interesse nos intervalos pré-EC e pós-EC. Cada sinal foi filtrado em 0,5 Hz, a partir de uma
rotina própria, e para a eliminação de sessões com movimento ou ruído utilizamos como
critério a presença de sinal de 1 mV maior ou menor que o sinal médio de cada sessão por
canal.
45
3.8.4. Classificação dos períodos sem movimento
Nas análises dos PCLs registrados em roedores, o aumento da potência na banda de
8–12 Hz é conhecidamente associado a movimentação dos animais (GERVASONI et al., 2004;
KRAMIS et al., 1975). Com o intuito de eliminar possíveis influências da movimentação na
interpretação dos dados relacionados a controlabilidade do estresse, elaborou-se uma
rotina semi-automatizada na plataforma MATLAB 2015b capaz de distinguir sessões com
movimento ou sessões sem movimento. Nesta rotina o sinal dos PCLs do CPF foi
primeiramente filtrado nas bandas de intervalo delta (0,8 – 4 Hz) e teta (4 – 10 Hz), assim
como o sinal do miograma foi filtrado no intervalo de 150 – 400 Hz. Em seguida, obteve-se
o envelope desses sinais a partir da transformada de Hilbert. Estas bandas de frequência no
sinal foram escolhidas com base em trabalhos que utilizam esse parâmetros para distinguir
estados de vigília em roedores (COSTA-MISERACHS et al., 2003; ROBERT; GUILPIN; LIMOGE,
1999; VAN LUIJTELAAR; COENEN, 1984). Obtendo-se esse parâmetros, construiu-se gráficos
de dispersão utilizando os valores da razão teta (4 – 10 Hz)/delta (0,8 – 4 Hz) e do miograma
em janelas de 1s segundo durante a época de interesse. A partir desses dados, foi possível a
separação de grupos de valores, utilizando para isso método de análise de clusters K-means.
Neste algoritmo a cada iteração, centróides inicialmente aleatórios são recalculados com
base na distância euclidiana quadrática média entre os pontos e seu respectivo centróide.
Este processo é repetido minimizando a distância dos pontos aos seus centróides até a
convergência. Na distinção destes aglomerados classificou-se os valores de cada sessão em
três estados comportamentais: 1) sem movimento, caracterizado por baixos valores de
razão teta/delta e baixos valores no miograma; 2) pouco movimento, com valores
intermediários da razão teta/delta e no miograma, e 3) muito movimento, apresentando
valores altos em ambos os parâmetros (Fig. 11). Durante o processo de classificação dos
estados comportamentais realizava-se a confirmação visual dos aglomerados de cada
animal. Após a classificação dos períodos por esta rotina verificou-se o seu índice de acerto
a partir da confirmação visual de 25% do total de indivíduos nos grupos Sham, ES e IS. O
índice de acerto da rotina para a classificação de movimento foi de 81% no grupo Sham,
92% no grupo ES e 87% no grupo IS.
46
Figura 11 – Exemplo da classificação dos períodos sem movimento. Gráfico representativo de um
animal mostrando a dispersão da razão teta/delta pelo envelope absoluto do miograma, cada ponto
corresponde a um período analisado. Após a separação dos clusters pelo método k-means, os
períodos foram classificados em “sem movimento”, “pouco movimento” e “muito movimento”.
3.9. Análise de dados
3.9.1 Análise das unidades de disparo
As análises da atividade unitária forma feitas no MATLAB a partir de rotinas
customizadas. O período de interesse analisado foi durante os 10 s anteriores ao EC (pré-EC)
e os 10 s posteriores ao EC (pós-EC), com bins de 0,1 s (ver seção 3.8.2.).
Atividade neuronal evocada pelo EC: a primeira análise feita referente as unidades
de disparo foi a avaliação de sua atividade após o EC. Incialmente foi calculado o número de
disparos a cada bin de cada unidade e foram calculados os valores de z-score em relação ao
período pré-EC, seguido pelo cálculo da média do z-score de todas as sessões.
Categorias neuronais: a partir das análises da atividade neuronal foi possível a
categorização das unidades em função da diminuição, não modulação ou do aumento da
atividade neuronal. Esta categorização foi obtida através do teste t pareado bicaudal com
correção de Bonferroni (p < 0,05/correção de Bonferroni) entre os períodos pré-EC e pós-EC.
Dessa forma, as unidades classificadas como as que diminuíam o z-score pré-EC > z-score
pós-EC, as unidades que não modulam o z-score pré-EC = z-score pós-EC, e as unidades que
aumentam o z-score pré-EC < z-score pós-EC.
20 40 60 80 100Miograma
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
Razã
o te
ta/d
elta
Sem movimento
Pouco movimento
Muito movimento
47
Modulação evocada pelo EC: na avaliação da modulação evocada calculou-se os
valores do módulo do z-score obtido na análise da atividade neuronal. A partir desse
modulo comparou-se a média da modulação por grupo entre os períodos pré-EC e pós-EC.
3.9.2 Análise dos potenciais locais de campo
Os dados dos potenciais locais de campo, após o pré-processamento, foram
organizados e analisados na plataforma MATLAB 2015b de acordo com as respectivas
épocas de interesse (ver seção 3.8.1). Para a analise deste potencias delimitou-se as bandas
de frequência com intervalos classicamente descritos no EEG: delta (1 – 4 Hz); teta (4 - 8 Hz);
alfa (8 – 12 Hz); beta (12 – 30 Hz) e gama (30 – 50 Hz) (International Federation of Societies
for Electroencephalography and Clinical Neurophysiology, 1974). A partir dessa classificação
uma série de análises foram feitas com o intuito de se investigar a atividade oscilatória.
Densidade espectral de potência relativa: utilizou-se o método de Welch para a
apresentação da densidade espectral de potência (PSD, do inglês Power Spectral Density)
entre os períodos pré-EC e pós-EC. Neste método o sinal do domínio do tempo é analisado
em janelas que se sobrepõem e o periodograma é calculado para cada segmento a partir da
transformada rápida de Fourier (FFT, do inglês Fast Fourier Transform). Computa-se a
magnitude quadrada do resultado da FFT e então os periodogramas individuais são
promediados, reduzindo em cada período a variação e o ruído individual da potência média.
Esta análise foi feita no MATLAB a partir da rotina pwelch, já incorporada nos pacotes de
rotinas da própria plataforma, utilizando o janelamento de Hamming com 1000 pontos e
sobreposição de 50%. O número de pontos da FFT foi a primeira potência de 2 maior que o
tamanho de cada segmento (i.e. 1024 pontos).
Perturbação espectral de potência relacionada ao EC: para a detecção de mudanças
transientes no espectro de potência foi utilizada a rotina newtimef do pacote EEGLAB.
Sucintamente, foi realizada a convolução do sinal com série de onduletas de Morlet,
definidas como uma senoide complexa janelada por uma função gaussianana: 𝑒"#$%𝑒&()
)*+)
onde t é o tempo e f é a frequência que aumenta linearmente de 1 a 50 e determina número
de ciclos para cada frequência analisada indo de 3 a 12.
A partir desta análise foram calculados os espectrogramas (tempo x frequência x
potência) médio dos ciclos de cada sujeito para cada região. As potências dos períodos pré-
EC e pós-EC foram normalizadas em diferenças logarítmicas (dB) utilizando a linha de base
48
de -1000 ms a 0 ms pré-EC, e partir desta normalização, calculou-se a média das potências
de cada banda por rato. Por fim, comparou-se as médias da perturbação das potências por
banda entre os grupos.
Coerência espectral e de fase: o calculo da coerência espectral foi feito através da
função própria do MATLAB, mscohere. Esta função usa o método de periodograma
modificado por Welch e faz uma estimativa da magnitude quadrada de coerência do
sistema. Com valores entre 0 e 1, a coerência espectral indica o quanto as oscilações de uma
região correspondem à oscilação de outra região, e comumente é utilizada como um
parâmetro para se avaliar a sincronia entre regiões (RUGGIERO et al., 2018). A magnitude da
coerência quadrada é dada por: 𝐶𝑥𝑦(𝑓) = |456 % |)
788 9 7::(9) ; onde Gxx e Gyy correspondem ao
PSD de x e y respectivamente, e Gxy corresponde ao cross-PSD de x e y. Os parâmetros
utilizados foram os mesmos para os cálculos da densidade espectral de potência.
Além disso, foram feitas as análises de coerência de fase de cada banda (delta, teta,
alfa, beta, gama). Para isso os sinais do CPF e BLA foram filtrados nas bandas de interesse
(e.g 1- 4 Hz para delta) e o sinal analítico de valor complexo foi obtido a partir da
transformada de Hilbert. Assim, a fase de cada sinal analítico foi extraída e a diferença de
fase entre as duas estruturas foi obtida. Foi calculado então a magnitude da média da
diferença dos vetores de fase, correspondendo a média da coerência de fase (MPC, do inglês
Mean Phase Coherence). A distribuição circular das diferenças de fase foram plotadas no
plano polar e testadas se diferenciavam de uma distribuição uniforme, utilizando o pacote
de estatística circular do MATLAB e utilizando distribuições simuladas por meio de
randomização de trechos do registro ao longo das sessões. Todas as análises foram
realizadas durante os períodos de 4 s pré-EC e pós-EC.
3.9.3 Análise estatística
Todos os dados comportamentais e eletrofisiológicos foram organizados e
analisados no software GraphPad Prism 7 e no MATLAB 2015b. No primeiro momento a
distribuição normal dos dados foi verificada através do teste de Shapiro-Wilk.
Nas análises comportamentais, após a distribuição normal constatada, utilizava-se
os testes estatísticos de análise de variância (ANOVA) de uma via ou análise de variância de
duas vias com medidas repetidas (ANOVA RM), seguido por comparações post-hoc de
Tukey. Para a definição dos conjuntos comportamentais nomeados como “desamparados”
49
e “não desamparados” foi utilizada a análise de clusters pelo o método K-means, aplicado
através do pacote de rotinas do MATLAB 2015b.
Quanto a análises estatística das unidades de disparo, utilizou-se o teste de Qui-
quadrado bicaudal para a comparação do número de unidades por categoria. Para as
análises de modulação e atividade neural foram utilizados ANOVA de duas vias com
medidas repetidas, seguido por comparações post-hoc de Tukey.
Já nas análises estatísticas dos PCLs, o teste T de Student pareado bicaudal foi
utilizado para as comparações dos valores da potência relativa entre os períodos pré e pós-
EC em todos os grupos. A perturbação média da potência entre os grupos foi investigada
através do teste T de Student bicaudal com correção de Welch. Por fim, as análises
estatísticas referentes a MPC foram feitas através do o teste T de Student pareado bicaudal.
Em todas as análises estatísticas o valor de p < 0,05 foi utilizado como critério para
significância estatística. Os resultados serão apresentados na forma de: [X2 (para teste do
Qui-quadrado) com os respectivos graus de liberdade, t (para teste t) ou F (para análises de
variância), nome do teste utilizado, valor p, teste post-hoc se houver].
3.10. Histologia
Após a finalização dos registros eletrofisiológicos os animais foram sacrificados por
asfixia em CO2 e seus cérebros marcados por lesão eletrolítica. Os animais eram decapitados
e seus encéfalos retirados e armazenados em solução de paraformaldeído (PFA) 4% gelado.
Depois de 24 horas na geladeira os encéfalos eram colocados em uma solução sacarose 30%
por mais dois dias seguido do seu armazenamento no freezer -40ºC. Por fim, cortes no
criostato das regiões de interesse foram feitos para a confirmação da localização dos
eletrodos via coloração cresil-violeta.
50
4.RESULTADOS
51
4.1. Comportamento
4.1.1. Padronização comportamental
Após a realização do protocolo exposto na seção 3.5.1. (Fig.12–A), o primeiro passo
da análise comportamental foi observar no grupo ES o tempo de latência da fuga simples
no 1d. Essa análise é importante para se verificar o quanto os animais do grupo ES são
capazes de fugir do choque já no 1d. Nesse sentido, nota-se que todos os animais do grupo
ES foram capazes de fugir do choque, como é indicado pela média baixa da latência de fuga
no final do teste (1,56 ± 0,091) (Fig. 12- B).
Com os dados do 2d realizou-se a a discriminação comportamental dos grupos
Sham, ES e IS a partir dos valores de número de falhas e latência média no gráfico de
dispersão (Fig. 12-C). Utilizando o método de K-means para a análise de aglomerados, os
animais foram classificados em dois grupos, um com valores de números de falhas e latência
média altos, e outro com número de falhas e latência média baixos, nomeados
respectivamente de “desamparados" e “não desamparados”. Sujeitos do grupo Sham e ES
pertencentes ao grupo dos “desamparados” foram excluídos das análises, enquanto animais
do IS pertencentes ao grupo dos “não desamparados” também foram excluídos. Com essa
classificação, todos os animais do grupo IS foram classificados como “desamparados”,
enquanto nos grupos Sham e ES apenas 25% dos sujeitos ficaram “desamparados” e não
foram incluídos nas análises seguintes (Fig. 12-D). Após essas exclusões, observou-se que no
grupo IS a latência de fuga é maior em comparação aos outros grupos [F(10, 85) = 3,247;
ANOVA RM; p < 0,05], tanto nas sessões iniciais quanto nos ciclos finais do 2d [IS vs Sham, IS
vs ES; Teste Tukey; p < 0,05] (Fig. 12-E). Por sua vez, os valores de latência dos grupos Sham
e ES não são diferentes entre si ao longo do 2d [Sham vs ES, Teste Tukey; p > 0,05] (Fig. 12-
E). Em relação a latência média do 2d, os valores do IS são maiores em relação grupo Sham
e ES [F (2, 17) = 15,09; ANOVA; p < 0,001; IS vs Sham, IS vs ES; Teste Tukey; p < 0,05], assim
como o número de falhas [F(2, 17) = 35,45; ANOVA; p < 0,001; IS vs Sham, IS vs ES; Teste
Tukey; p < 0,001], sendo os valores do grupo Sham e ES semelhantes em ambas as
comparações [Sham vs ES, Teste Tukey; p > 0,05] (Fig. 12-F e G).
52
Figura 12 – Padronização comportamental. (A) No 1d do teste comportamental os animais foram
separados em três grupos experimentais (Sham, ES e IS n = 8) e treinados de acordo com o protocolo
do desamparo aprendido. No 2d realizou-se o teste da esquiva ativa, idêntico para os 3 grupos, com
10 s de estímulo condicionado e 10 s de estímulo aversivo, este último podendo ser interrompido
por fuga simples (primeiros 5 ciclos) ou fuga dupla (25 ciclos restantes), com intervalos de 40 s ± 20
s. (B) Latências de fuga de cada animal do grupo ES no 1d. (C) Número de falhas pela latência média
de cada animal no 2d. O “X” marca os centroides de cada um dos aglomerados (desamparados ou
não desamparados). (D) Número de animais incluídos a partir da classificação “desamparados” e
“não desamparados” para cada um dos grupos experimentais. (E) Latência média de cada grupo ao
longo do tempo no 2d. (F) Latência média de cada grupo no 2d. (G) Número de falhas média de cada
grupo no 2d. As linhas centrais representam as médias e as barras representam o erro padrão da
média. * = p < 0,05; ***=p < 0,001.
4.1.2. No teste da esquiva o grupo IS apresenta o aumento da latência média e do número
de falhas
Após a padronização comportamental, um novo protocolo foi proposto, visando a
melhoria do modelo com base nas diretrizes apontadas por Maier e col (2016) (seção 3.5.2).
Foi durante esse novo protocolo em que se ocorreu o registro eletrofisiológico simultâneo
G
Sham ES IS0
6
12
18
24
30
Sham ES IS0
2
4
6
8
10
Latê
ncia
méd
ia (s
)
F******
E
1 2 3 4 5 60
2
4
6
8
10
Bloco (5 ciclos)
Latê
ncia
(s)
IS (n = 8)ES (n = 6)Sham (n = 6)
**
Sham ES IS0
20
40
60
80
100
Anim
ais i
nclu
ídos
(%)
ShamES ISD
Não incluídos
0 2 4 6 8 100
6
12
18
24
30
Latência média (s)
Núm
ero
de fa
lhas
ShamESIS
X
X
C
Núm
ero
de fa
lhas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
2
4
6
8
10
Bloco (10 ciclos)
Latê
ncia
de
fuga
(s)
B
A
ShamESIS
1° Dia 2° Dia
Teste Esquiva Ativa
1° Dia10 s 10 s 40 s ± 20 s
F1
2º Dia10 s 10 s 40 s ± 20 s
F1/F2
F1 F2
Desamparados
Não desamparados
53
aos dados comportamentais, os quais são descritos a seguir (Fig. 13–A). Assim como na
padronização, houve uma série de alterações comportamentais restritas ao grupo IS. No 2d
a média de latência do grupo IS é maior em relação ao grupo Sham e ES, tanto ao longo dos
blocos [F (2, 40) = 8,752; ANOVA RM; p < 0,001; IS vs Sham, IS vs ES; Teste Tukey; p < 0,05]
(Fig. 12-B) quanto na latência média [F (2, 40) = 8,793; ANOVA; p < 0,001; IS vs Sham, IS vs ES;
Teste Tukey; p < 0,05] (Fig. 12-C). Os números de falhas do 2d também são
consideravelmente maiores no grupo IS [F (2, 40) = 7,264; ANOVA; p < 0,05; IS vs Sham, IS vs
ES; Teste Tukey; p < 0,05] (Fig. 12- D). Contudo, entre os grupos Sham e ES não há diferenças
no 2d na latência média [F (2, 40) = 8,793; ANOVA; p < 0,001; Sham vs ES; Teste Tukey; p >
0,05] e no número de falhas [F (2, 40) = 7,264; ANOVA; p < 0,05; Sham vs ES; Teste Tukey; p >
0,05].
Apesar desses resultados, uma análise mais minuciosa sugere diferenças intra-
grupos. No 1d, apesar de todos os sujeitos do grupo ES apresentarem a latência de fuga
baixa ao final do experimento (1,56 ± 0,26), inclusive semelhante aos valores encontrados
na padronização, há indivíduos com a média da latência de fuga bastante variável no 1d
(Fig. 12-E). No 2d as diferenças intra-grupos ficam ainda mais evidentes com a análise dos
valores de latência média e número de falhas. No 2d foi possível observar que alguns
indivíduos do grupo Sham e do grupo ES apresentaram latências médias e número de falhas
altas, com valores próximos ao de animais do grupo IS. Assim como alguns poucos animais
do grupo IS apresentaram latências médias e números de falhas baixos. Sendo assim, de
maneira semelhante as análises feitas na padronização comportamental, utilizou-se mais
uma vez o método K-means para a classificação dos conjuntos de animais “desamparados”
e “não desamparados” (Fig. 12-F). Os sujeitos classificados como “desamparados” e
pertencentes ao grupo Sham ou ES não foram incluídos nas análises seguintes, assim como
os sujeitos “não desamparados” do grupo IS também foram excluídos das análises. A
proporção de sujeitos não incluídos dos grupos Sham, ES e IS corresponderam a 38,4%, 40%
e 13,3%, respectivamente (Fig. 12-G). Após essas exclusões, as diferenças comportamentais
do grupo IS se acentuam. A latência média ao longo do 2d é maior no grupo IS [F (2, 27) =
57,91; ANOVA RM; p < 0,001; IS vs sham; IS vs ES; Teste Tukey; p < 0,001], assim como na
latência média [F (2, 27) = 44,67; ANOVA; p < 0,001; IS vs sham; IS vs ES; Teste Tukey; p <
0,001] e no número de falhas [F (2, 27) = 73,28; ANOVA; p < 0,001; IS vs sham; IS vs ES; Teste
Tukey; p < 0,001] (Fig. 12–I e J). Em todos os parâmetros comportamentais analisados, os
54
valores do grupo ES não foram diferentes do grupo Sham, a citar, latência média ao longo
do tempo [F (2, 27) = 57,91; ANOVA RM; p < 0,001; ES vs Sham; Teste Tukey; p > 0,05], latência
média do 2d [F (2, 27) = 44,67; ANOVA; p < 0,001; ES vs Sham; Teste Tukey; p > 0,05] e o
número de falhas [F (2, 27) = 73,28; ANOVA; p < 0,001; ES vs Sham; Teste Tukey; p > 0,05].
Figura 13 – Dados comportamentais. (A) Protocolo comportamental no qual foram realizados os
registros eletrofisiológicos. No 1d o protocolo é similar a padronização, contudo, no 2d o ocorre a
mudança do estímulo condicionado e do contexto. (B) Latência média de cada grupo (Sham n = 13;
ES n = 15 e IS n = 15) ao longo do tempo no 2d. (C) Latência média do 2d. (D) Número de falhas
médio de cada grupo no 2d. (E) Latências de fuga de cada animal do grupo ES no 1d. (F) Número de
falhas pela latência dos animais. O “X” marca os centroides de cada um dos aglomerados
(desamparados ou não desamparados). (G) Número de animais incluídos a partir da classificação
J
Sham ES IS0
6
12
18
24
30
Núm
ero
de fa
lhas
***
Sham ES IS0
2
4
6
8
10
Latê
ncia
méd
ia (s
)
I***
H
1 2 3 4 5 60
2
4
6
8
10
Bloco (5 ciclos)
Latê
ncia
(s)
IS (n = 13)ES (n = 9)Sham (n = 8)
Não incluídos
Sham ES IS0
20
40
60
80
100An
imai
s inc
luíd
os (%
)
ShamES ISG
0 2 4 6 8 100
6
12
18
24
30
Latência média (s)
Núm
ero
de fa
lhas
ShamESIS
X
X
F
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
2
4
6
8
10
Bloco (10 ciclos)
Latê
ncia
de
fuga
(s)
ESham ES IS
0
6
12
18
24
30
Núm
ero
de fa
lhas
*D
Sham ES IS0
2
4
6
8
10
Latê
ncia
méd
ia (s
)
*C
1 2 3 4 5 60
2
4
6
8
10
Bloco (5 ciclos)
Latê
ncia
(s)
IS (n = 15)ES (n = 15)Sham (n = 13)
B
A
ShamESIS
1° Dia 2° Dia
Teste Esquiva Ativa
1° Dia10 s 10 s 40 s ± 20 s
F1
2º Dia10 s 10 s 40 s ± 20 s
F1/F2
F1 F2
Desamparados
Não desamparados
55
“desamparados” e “não desamparados” para cada um dos grupos experimentais. (H-J) Análise
comportamental após a classificação (Sham n = 8; ES n = 9 e IS n = 13). (H) Latência média ao longo
do tempo. (I) Latência média no teste da esquiva. (J) Número de falhas no teste da esquiva. As linhas
centrais representam as médias e as barras representam o erro padrão da média. * = p < 0,05; ***=p
< 0,001.
4.2. Registro eletrofisiológico
4.2.1. Qualidade do registro e confirmação histológica
Após a padronização comportamental, bem como as padronizações na aquisição
dos dados eletrofisiológicos no CPF e ABL, foi possível eliminar os ruídos de movimento e
de 60 Hz. Antes da padronização se aproveitava em média apenas 37% do registro
eletrofisiológico (Fig. 14–A), mas com a padronização a média de aproveitamento subiu
para 93% (Fig. 14–B).
Figura 14 – Qualidade do registro eletrofisiológico após a padronização da aquisição do sinal. (A)
Registro dos PCLs do CPF sem pré-processamento antes da padronização. Em destaque, espículas
no registro quando o animal se movimentava. (B) Registro dos PCLs do CPF sem pré-processamento
após a padronização do equipamento de registro.
Com as melhorias na aquisição dos dados eletrofisiológicos foi possível então o
registro simultâneo do comportamento com as unidades de disparo e os PCLs do CPF e da
ABL (Fig. 15-A-C). Na figura 15–B há exemplos de unidades de disparo típicas do CPF e ABL
e na figura 15–C exemplos de PLCs típicos das mesmas, sem nenhum pré-processamento
37%
93%
10 min1 mV
A
B
10 min1 mV
56
digital. Quanto a confirmação histológica, foram incluídos apenas os animais cujo os cortes
coronais mostraram a localização dos eletrodos na região pré-límbica do CPF, e na ABL (Fig.
15-D,E).
Figura 15 – Parâmetros eletrofisiológicos e verificação histológica. (A) Implante dos multieletrodos
visando atingir o CPF e ABL. (B) Exemplos de unidade de disparo típicas do CPF e da ABL. (C) PCLs
típicos do CPF e ABL semnenhumpré-processamentodigital. (D-E) Confirmação histológica da
localização dos eletrodos. (D) Esquemas de secções delimitando o córtex pré-frontal, região pré-
límbica, e a amígdala, região basolateral. Pontos azuis se referem a localização das marcações da
lesão eletrolítica. (E) Imagens histológicas representativas do CPF e da ABL com as marcações
eletrolíticas indicadas por setas.
4.3. Atividade unitária
Ao todo foram registrados 344 canais no CPF e 344 canais na ABL. No 1d foram
consideradas no CPF 123 unidades (Sham n = 26, ES n = 51 e IS n = 46) e no 2d 119 unidades
(Sham n = 18, ES n = 52 e IS n = 49). Já em relação a ABL, o número de unidades foi menor
em função das dificuldades de se acertar a região no implante e na discriminação de
unidades. No 1d foram consideras 74 unidades na ABL (Sham n = 9, ES n = 24 e IS n = 41) e
74 unidades no 2d (Sham n = 9, ES n = 19e IS n = 46). Para as comparações da atividade
unitária de cada grupo no CPF e na ABL foram utilizadas as médias dos valores de z-score
das unidades de disparo.
57
4.3.1. No 1d ocorre o aumento da modulação neuronal do CPF no grupo ES e IS
No 1d a atividade neuronal do CPF é indicada pelo z-score médio (escala de cor) por
bin, 10 s pré e pós EC (eixo X) para cada unidade de disparo (eixo Y) nos três grupos (Fig. 16-
A). A proporção de unidades categorizadas com modulação negativa, não moduladas e
modulação positiva é distinta entre os grupos [X2 = 26,82; teste Qui-quadrado; p < 0,001].
Enquanto no grupo Sham não há unidade que modulam negativamente, no grupo IS a
modulação negativa é proporcionalmente maior [15 unidades; n = 15/46; 32,61%] do grupo
ES [10 unidades; n = 10/51; 19,61%]. Já em relação a proporção de unidades que modulam
positivamente, o Grupo ES apresenta mais unidades [21 unidades; n = 21/51; 41,18%] do
que o grupo IS [13 unidades; n=13/46; 28,26%] (Fig. 16-B). Comparando o |z-score| médio ao
longo dos 10 s pré-EC e pós-EC, verificamos o aumento da modulação no grupo ES nos
intervalos pós-EC de 0 - 0,4 s; 0,8 – 1,2 s; 1,6 – 2,4 s e 2,8 – 3,2 s [F (98, 6027) = 1,737; ANOVA
RM; p < 0,001; ES vs Sham; Teste Tukey; p < 0,05], assim como o aumento da modulação do
grupo IS nos intervalos 0 – 2,4 s; 2,8 – 3,2 s; 3,6 – 4,0 s; 6,0 – 6,8 s; 7,6s – 8,0 s e 9,2 – 9,6 s [F
(98, 6027) = 1,737; ANOVA RM; p < 0,001; IS vs Sham; Teste Tukey; p > 0,05]. Quando
comparamos os valores da modulação entre o grupo IS e ES, o grupo IS apresenta uma
modulação maior no intervalo de 0 – 0,8 s [F (98, 6027) = 1,737; ANOVA RM; p < 0,001; IS vs
ES; Teste Tukey; p < 0,05]. Além do |z-score| médio, investigou-se a atividade líquida
resultante dessa modulação, indica pelo z-score médio. Neste caso, apesar dos resultados
indicando modulações distintas no CPF entre os grupos, o z-score médio entre os grupos
não foi diferente [F (98, 5880) = 1,184; ANOVA RM; p > 0,05] (Fig. 16-D).
58
Figura 16 – No 1d a modulação do CPF aumenta no grupo IS. (A) Z-score médio (cor) por bin (x) por
unidade (y) do CPF nos três grupos durante o 1d (Sham n = 26, ES n = 51 e IS n = 46). (B) Proporção
de unidades pós-EC com modulação negativa (azul), não moduladas (verde), modulação positiva
(vermelho) nos três grupos. (C) Z-score absoluto médio de todos os grupos 10 s pré e pós-EC. Linhas
vermelhas representam diferenças estatísticas IS vs Sham, linhas azuis diferenças ES vs Sham e linhas
pretas ES vs IS. (D) Z-score médio 10 s pré e pós-EC. * = p < 0,001.
4.3.2. No 1d a modulação e atividade neuronal da ABL não é distinta entre os grupos
Na figura 17-A a atividade neuronal da ABL pode ser observada através do Z-score
médio por bin ao longo do tempo (eixo X) em cada unidade de disparo (eixo Y), assim como
foi mostrado no CPF. As proporções de unidades que modulam negativamente,
positivamente ou não modulam, não são diferentes entre os grupos [X2 = 0,7028; teste Qui-
quadrado; p > 0,05], assim como os valores da modulação da atividade, indicados pelo |z-
score| médio, não são distintos entre os grupos [F (2, 71) = 0,071; ANOVA RM; p > 0,05]. De
maneira semelhante, a atividade líquida, observada pelo z-score médio, também não é
diferente entre os grupos [F (2, 71) = 0,859; ANOVA RM; p > 0,05]. Apesar da ausência de
resultados positivos quanto as diferenças entre os grupos, é possível observar o efeito do
59
tempo ao longo do 1d na ABL, tanto do z-score absoluto médio [F (49, 3479) = 2,15; ANOVA
RM; p < 0,001] quanto do z-score médio [F (49, 3479) = 2,871; ANOVA RM; p < 0,001].
Figura 17– Modulação e atividade neuronal da ABL não é diferente entre os grupos no 1d. (A) Z-score
médio (cor) por bin (x) por unidade (y) da ABL no 1d (Sham n = 9, ES n = 24 e IS n = 41). (B) Proporção
de unidades pós-EC com modulação negativa (azul), não moduladas (verde), modulação positiva
(vermelho). (C) Z-score absoluto médio dos grupos 10 s pré e pós-EC. (D) Z-score médio dos grupos
10 s pré e pós-EC.
4.3.3. No teste da esquiva ativa a modulação e atividade neuronal do CPF é maior no grupo
ES
No teste comportamental da esquiva ativa no 2d a atividade neuronal do CPF é
indicada pelo Z-score de cada grupo na figura 18-A. Entre os grupos, não há alterações entre
as proporções de unidades que são moduladas negativamente, não modulam ou modulam
positivamente [X2 = 6,225; teste Qui-quadrado; p > 0,05] (Fig. 18-B). Contudo, apesar da
ausência de diferenças nas proporções de unidades que modulam, na figura 18-C o |z-score|
médio indica que o valor da modulação da atividade neuronal no grupo ES é maior em
relação ao grupo Sham, especificamente nos intervalos de 0 – 0,4 s e 4,0 – 4,4 s pós-EC [F
60
(98, 5684) = 1,368; ANOVA RM; p < 0,05; ES vs Sham; Teste Tukey; p < 0,05] (Fig. 18-C). Assim
como em relação ao grupo IS, na qual o aumento da modulação ocorre nos intervalos de 3,2
– 4,4 s; 5,2 – 6,0 s; 6,8 – 7,2 s; 8,4 – 8,8 s F (98, 5684) = 1,368; ANOVA RM; p < 0,05; ES vs IS;
Teste Tukey; p < 0,05]. Comparações da modulação entre os grupos IS e Sham não
apresentaram diferenças [F (98, 5684) = 1,368; ANOVA RM; p < 0,05; IS vs Sham; Teste Tukey;
p > 0,05] (Fig. 18-C). Por sua vez, analisando a atividade líquida do CPF do grupo ES no 2d é
possível observar que esta modulação resulta no aumento da atividade neuronal. No grupo
ES o z-score é maior em relação ao grupo Sham nos intervalos de 0 – 0,4 s; 2,4 – 2,8 s; 3,6 –
4,0 s; 4,8 – 5,2 s; 5,6 – 6,0 s; 6,4 - 6,8 s; 7,6 – 8,8 s [F (98, 5684) = 1,899; ANOVA RM; p < 0,001;
ES vs Sham; Teste Tukey; p > 0,05]. Se comparado com o grupo IS, o aumento do z-score
médio é ainda maior, tanto em relação ao valor da média total do 2d [F (2, 116) = 3,533;
ANOVA RM; p < 0,05; ES vs IS; Teste Tukey; p < 0,05], quanto nos intervalos 0 – 1,2 s; 2,4 – 2,8
s; 3,6 – 4,4 s; 4,8 – 6,0 s; 6,4 – 6,8 s; 8,0 – 9,2 s e 9,6 – 10 s [F (98, 5684) = 1,899; ANOVA RM; p
< 0,001; ES vs IS; Teste Tukey; p < 0,05] (Fig. 18-D). Na análise dos valores da atividade líquida
entre os grupos Sham e IS não há diferenças em nenhum momento pós-EC [F (98, 5684) =
1,899; ANOVA RM; p < 0,001; Sham vs IS; Teste Tukey; p > 0,05].
61
Figura 18 – No grupo ES a modulação e atividade neuronal do CPF aumentam durante o teste da
esquiva ativa. (A) Z-score médio (cor) por bin (x) por unidade (y) do CPF no 2d (Sham n = 18, ES n =
52 e IS n = 49). (B) Proporção de unidades pós-EC com modulação negativa (azul), não moduladas
(verde), modulação positiva (vermelho). (C) Z-score absoluto médio dos grupos. Linhas azuis
representam diferenças estatísticas ES vs Sham, linhas pretas diferenças ES vs IS. (D) Z-score médio
ao longo do tempo.
4.3.4. No teste da esquiva ativa a modulação e atividade neuronal da ABL não é distinta entre
os grupos
No teste da esquiva ativa as proporções de unidades moduladas na ABL após o EC
não são diferentes entre os grupos [X2 = 4,092; teste Qui-quadrado; p > 0,05] (Fig. 19-A e B).
Em relação a modulação da atividade neuronal também não há diferenças entres os grupos
[F (2, 72) = 0,6483; ANOVA RM; p > 0,05], assim como z-score médio entre os grupos não é
distinto [F (2, 72) = 1,769; ANOVA RM; p > 0,05]. Entretanto, assim como na atividade da ABL
do 1d, é possível observar o efeito de tempo em relação aos valores da modulação e da
atividade neuronal, respectivamente [F (49, 3528) = 1,552; ANOVA RM; p < 0,001] e [F (49,
3528) = 1,253; ANOVA RM; p < 0,05] (Fig. 19-C e D).
62
Figura 19 – Modulação e atividade do ABL não é distinta entre os grupos no teste da esquiva ativa.
(A) Z-score médio (cor) por bin (x) por unidade (y) da ABL no 2d (Sham n = 9, ES n = 19 e IS n = 46).
(B) Proporção de unidades pós-EC com modulação negativa (azul), não moduladas (verde),
modulação positiva (vermelho). (C) Z-score absoluto médio dos grupos 10 s pré e pós-EC. (D) Z-score
médio dos grupos 10 s pré e pós-EC.
4.4. Atividade oscilatória
4.4.1. No 1d a perturbação média da potência de teta e alfa no CPF é maior no grupo ES
Nas análises da atividade oscilatória inicialmente foram observados no 1d os
espectrogramas (tempo x frequência x potência) médios do CPF, normalizados em relação
ao período pré-EC. Nos espectrogramas observa-se que enquanto o EC não gera
perturbações na atividade oscilatória do grupo Sham, no grupo ES e IS as perturbações são
evidentes. No grupo ES e IS há uma diminuição aparente na faixa em delta, alfa e beta,
contudo, no grupo ES ocorre um aumento considerável em teta no período pós-EC (Fig. 20–
A). Nos PSDs do período pré-EC e pós-EC, nota-se o pico em teta apenas nos grupos ES e IS.
Quando comparada a potência relativa de teta no período pré-EC com o período pós-EC
observa-se o aumento tanto no grupo ES (t=4,199; df=4; p < 0,05; Teste t pareado) quanto
no grupo IS (t=2,672; df=8; p < 0,05; Teste t pareado) (Fig. 20–B). Após essas primeiras
análises, com o intuito de se verificar as diferenças na atividade oscilatória entre o grupo ES
e IS, foram realizadas as comparações estatísticas entre as perturbações média da potência
(dB) de cada faixa de frequência entre os grupos ES e IS. Destas análises verifica-se que no
grupo ES a perturbação média de teta é maior do que no grupo IS (+0,733 ± 0,33 dB; t=2,223;
df=11,95; p < 0,05; Teste t), assim com a perturbação média de alfa (+0,611 ± 0,23 dB;
t=2,674; df=11,93; p < 0,05; Teste t) (Fig. 20–C). Em relação às outras bandas de frequências
analisadas (delta, beta e gama), não foram encontradas diferenças (ES vs IS; p > 0,05; Teste
t).
63
Figura 20 – Perturbação média da potência de teta e alfa no CPF é maior no grupo ES no 1d. (A)
Espectrogramas do CPF dos três grupos no 1d (Sham n = 6, ES n = 5 e IS n = 9). (B) Densidade espectral
da potência relativa no CPF durante o período pré-EC e pós-EC do 1d. (C) Comparação da
perturbação média da potência no CPF entre ES e IS nas bandas de frequência delta, teta, alfa, beta,
gama. * = p < 0,05.
4.4.2. No 1d as perturbações médias das potências na ABL não são diferentes entre os grupos
ES e IS
Na figura 21-A os espectrogramas médios da ABL no 1d indicam, assim como no CPF
do 1d, que no período pós-EC do grupo Sham não há alterações na potência das bandas, já
nos grupos ES e IS ocorre a diminuição da potência em delta, alfa e beta, associada ao
aumento de teta. Este aumento por sua vez é robusto no grupo ES e menos aparente no IS.
Na ABL, a densidade espectral da potência relativa indicada na figura 21-B, mostra que o
pico em teta do período pós-EC é maior no grupo ES (t=4,909; df=4; p < 0,05; Teste t
64
pareado) e no grupo IS (t=3,746; df=7; p < 0,05; Teste t pareado). Contudo, quando se analisa
as diferenças na atividade oscilatória entre o grupo ES e IS nas perturbações médias das
potências não foi observado nenhuma diferença nas bandas de frequência investigadas
(delta, teta, beta e gama; ES vs IS; p > 0,05; Teste t) (Fig. 21-C).
Figura 21 – Na ABL não há diferenças entre os grupos ES e IS na perturbação das potencias no
1d. (A) Espectrogramas da ABL dos três grupos no 1d (Sham n = 5, ES n = 5 e IS n = 8). (B) Densidade
espectral da potência relativa na ABL no período pré-EC e pós-EC do 1d. (C) Perturbação média da
potência na ABL dos grupos ES e IS nas bandas de frequência delta, teta, alfa, beta, gama. * = p <
0,05.
65
4.4.3. No teste da esquiva a perturbação média da potência de alfa no CPF é maior no grupo
ES
No teste da esquiva ativa do 2d a análise da atividade oscilatória do CPF, observada
nos espectrogramas, mostra que após o EC a potência das bandas delta, beta e gama
diminuem nos três grupos. Em relação as faixas de frequência em teta e alfa, aparentemente
no grupo Sham e ES ocorre o aumento da potência, enquanto no grupo IS os valores da
potência dessas bandas se mantem constantes (Fig. 22–A). Quanto a densidade espectral da
potência relativa desses grupos, analisou-se especificamente a banda teta, já que no 1d o
aumento da potência relativa desta oscilação pós-EC no CPF ocorreu tanto no grupo ES
quanto no IS. No 2d, as análises da potência relativa de teta mostraram que apenas no grupo
ES houve o aumento da potência de teta (t=2,895; df=4; p < 0,05; Teste t pareado) (Fig. 22–
B). Contudo, na comparação entre os grupos ES e IS em relação a perturbação média da
potência teta não foram encontradas diferenças (ES vs IS; p > 0,05; Teste t), assim como os
valores nas bandas delta, beta e gama não são diferentes entre os grupos (ES vs IS; p > 0,05;
Teste t). A exceção corresponde a banda alfa, que no grupo ES apresenta o aumento na
perturbação média em relação ao grupo IS (+1,616 ±11,72 dB; t=4,367; df=11,72; p < 0,05;
Teste t) (Fig. 22–C).
66
Figura 22 – Perturbação média da potência de alfa no CPF é maior no grupo ES no teste da esquiva
ativa. (A) Espectrogramas do CPF dos três grupos no teste da esquiva (Sham n = 6, ES n = 5 e IS n =
9). (B) Densidade espectral da potência relativa no CPF no teste da esquiva nos períodos pré-EC e
pós-EC. (C) Perturbação média da potência no CPF dos grupos ES e IS nas bandas de frequência delta,
teta, alfa, beta, gama. * = p < 0,05.
4.4.4. No teste da esquiva ativa não há diferenças entre os grupos ES e IS na perturbações
das potenciais da ABL
Nos espectrogramas da ABL, de maneira semelhante ao CPF durante o teste da
esquiva ativa, a potência das bandas delta, beta e gama diminuem nos três grupos,
enquanto a potência de teta e alfa aumentam no grupo Sham e ES (Fig. 23–A). Quanto a
densidade espectral, a potência relativa da banda teta aumenta após o EC apenas no grupo
ES (t=2,065; df=7; p < 0,05; Teste t pareado), também de maneira semelhante ao CPF no
teste da esquiva (Fig. 23 – B). No grupo ES, a perturbação média de alfa indica a tendência
67
do aumento em relação ao grupo IS (+1,436 ±0,68 dB; t=2,094; df=9,76; p = 0,0634; Teste t).
Apesar dessa tendência em alfa, as comparações com as outras bandas de frequência
analisadas (delta, teta, beta e gama) também não apresentaram diferenças entre os grupos
ES e IS (ES vs IS; p > 0,05; Teste t) (Fig. 23–C).
Figura 23 – Não há diferenças entre os grupos ES e IS na perturbação das potencias na ABL no teste
da esquiva ativa. (A) Espectrogramas da ABL dos três grupos no teste da esquiva (Sham n = 5, ES n =
5 e IS n = 8). (B) Densidade espectral da potência relativa na ABL no período pré-EC e pós-EC no teste
da esquiva. (C) Perturbação média da potência na ABL dos grupos ES e IS. ˜ p = 0,0634.
4.4.5. Espectrogramas após a classificação dos períodos sem movimento
Para a análise de coerência dos PCLs em períodos sem movimento utilizou-se uma
rotina desenvolvida pelo grupo e descrita na seção 3.8.4. Após a separação dos períodos
68
sem movimento verificou-se visualmente os espectrogramas dos grupos antes da
classificação e após a classificação (Fig. 24). No 1d os espectrogramas do CPF 4 s pré e pós-
EC mostraram que no grupo ES ocorreu o aumento da potencia no intervalo de 4-12 Hz no
grupo ES (Fig. 24-A). Após a eliminação das sessões com movimento o aumento da potência
no grupo ES ficou restrito às oscilações de teta (4-8 Hz) (Fig. 24-B). Em específico, no período
de 1 s pós-EC os espectrogramas em ambas análises não se diferenciaram os PCLs no 1d. Por
sua vez, no teste da esquiva ativa após a eliminação das sessões com movimento a potência
de alfa (8 – 12 Hz) diminuiu nos três grupos.
69
Figura 24 – Exemplo de espectrogramas do CPF após a remoção dos períodos com movimento no
1d e no teste da esquiva. (A) Na primeira linha espectrogramas do CPF no 1d durante o período de 4
s pré e pós-EC sem a eliminação dos períodos com movimento, na segunda linha seus respectivos
espectrogramas sem movimento. (B) Espectrogramas do CPF no teste da esquiva, na primeira linha
os espectrogramas com movimento e na segunda linha os espectrogramas sem movimento. Os
períodos de 1s pós-EC foram marcados em destaque com transparências escuras.
70
4.4.6. No 1d após o EC a coerência de fase em delta e teta aumentam no grupo IS
Com o intuito de se verificar a conectividade da atividade oscilatória entre o CPF e
ABL, foram realizadas as análises de coerência espectral e da coerência de fase entre as
regiões peri-evento ao EC. Nas análises de coerência teve-se o cuidado de se analisar apenas
os dados sem os períodos com movimento, como descrito na seção 3.8.4. e demonstrado
na seção 4.5.6.
Na figura 25-A fica exemplificado um período com os traçados dos PCLs filtrados em
teta típicos do CPF e da ABL, os quais foram utilizados para as análises de coerência espectral
e de fase. No grupo Sham, o coerograma spectral médio e o gráfico da coerência espectral
dos PCLs do CPF e da ABL não indicaram alterações. De maneira convergente, na coerência
de fase não há alterações nas bandas de frequência delta, teta, alfa, beta e gama (Teste T
pareado, p > 0,05). Especificamente, na figura 25-B há a indicação da distribuição circular da
coerência de fase em teta e da análise das médias da coerência de fase nas bandas delta
(t=1,4341; df=3; p > 0,05; Teste T pareado) e teta (t=-0,3771; df=3; p > 0,05; Teste T pareado).
No grupo ES ocorre o aumento da coerência de fase em teta após o EC. No coerograma
médio e na coerência espectral pode-se observar o aumento da coerência em teta no
período pós-EC. Esse aumento é representativo na distribuição circular da coerência de fase
em teta e na média da coerência de fase (MPC, do inglês Mean Phase Coherence) (t=3,6345;
df=4; p < 0,05; Teste T pareado). Nas bandas de frequência delta, alfa, beta e gama não foram
encontradas diferenças na coerência de fase (Teste T pareado, p > 0,05) (Fig. 25-C). Já em
relação ao grupo IS, o aumento da média da coerência espectral e de fase no período pós-
EC pode ser visto tanto em delta como em teta. O aumento da coerência de delta e teta
ficam evidentes no coerograma médio e no gráfico da coerência espectral. Analisando o
MPC em delta (t=3,8139; df=7; p < 0,05; Teste T pareado) e teta (t=3,8139; df=7; p < 0,05;
Teste T pareado) observa-se o aumento dessas potencias no grupo IS (Fig. 25-D). Apesar
dessas diferenças, quando se analisou os valores inter-grupos, ou seja, as diferenças entre
ES e IS, não foram encontradas distinção entre os grupos no MPC de delta e teta (ES vs IS; p
> 0,05; Teste T).
71
Figura 25 – As coerências de fase em delta e teta aumentam no grupo IS após o EC no 1d. (A) PCLs
filtrados em teta típicos do CPF e da ABL no período de -2 s pré-EC e +2 s pós-EC no 1d, ambos do
grupo IS. (B) Coreograma médio seguido pela coerência espectral e pela coerência de fase do grupo
Sham (n = 4). Em destaque na terceira coluna, a distribuição circular de teta no período pré-EC e pós-
EC sobrepostas a distribuição simulada. No canto direito da terceira coluna o MPC de delta e teta no
período pré-EC e pós-EC. (C) Aumento do MPC em teta após o EC no grupo ES (n = 5). Da esquerda
para a direita: coreograma médio, gráfico da coerência espectral pré-EC e pós-EC; coerência de fase
de teta no gráfico circular, com destaque para a ausência de diferenças no MPC de delta e para o
aumento do MPC de teta. (D) O aumento do MPC em delta e teta no grupo IS (n = 8). Da esquerda
72
para a direita: coreograma médio, gráfico da coerência espectral; coerência de fase de teta e por fim,
o aumento do MPC de delta e teta.
4.4.7. No teste da esquiva ativa a coerência de fase em teta do grupo IS é maior após o EC
Replicando as análises de coerência nos dados do 2d, foi possível investigar como
aqueles indicadores de sincronia se alteram no teste da esquiva ativa. Na figura 26-A no
período -2 s pré-EC e +2 s pós-EC, observa-se os traçados dos PCLs filtrados em teta típicos
do CPF e da ABL no teste da esquiva, ambos do grupo IS. Assim como no 1d, o grupo Sham
não apresentou diferenças em nenhuma banda de frequência nós períodos pré-EC e pós-EC
análisados pela coerência espectral e pela coerência de fase. Esse resultado pode ser visto
no seu coerograma médio, no gráfico da coerência espectral e em específico, na distribuição
circular de teta e nos valores do MPC de delta e teta (Teste T pareado, p > 0,05) (Fig. 26-B).
Apesar de não indicados na figura 26-B a coerência de fase das bandas alfa, beta e gama
também não apresentaram diferenças entre os períodos pré-EC e pós-EC (Teste T pareado,
p > 0,05). Assim como o grupo Sham, o grupo ES também não apresentou diferenças entre
os períodos, como indicado no coreograma médio, na coerência espectral e na coerência de
fase em todas as bandas de frequência analisadas. Na terceira coluna da figura 26–C a
distribuição circular da coerência de fase de teta e o MPC de delta e teta indicam esses
valores (Teste T pareado, p > 0,05). Quanto aos dados de coerência do grupo IS, no teste da
esquiva ativa, expostos na figura 26-D, observa-se o aumento da coerência de fase de teta
quando se analisa os valores de MPC entre o período pré-EC e pós-EC (t=2,7095; df=7; p <
0,05; Teste T pareado). Esse aumento é ainda indicado no coreograma médio, na coerência
espectral e na distribuição circular da coerência de fase em teta. Nas bandas de delta, alfa,
beta e gama não foram encontradas diferenças no MPC entre os períodos (Teste T pareado,
p > 0,05). Por fim, comparações entre os grupos ES e IS não apresentaram diferenças na
coerência de fase das bandas analisadas (ES vs IS; p > 0,05; Teste T pareado).
73
Figura 26 – No grupo IS ocorre o aumento da coerência de fase em teta após o EC no teste da esquiva
ativa. (A) PCLs filtrados em teta típicos do CPF e da ABL no teste da esquiva entre os períodos de -2 s
pré-EC e +2 s pós-EC. O traço escuro representa o sinal registrado no CPF e o traço vermelho
corresponde ao sinal registrado na ABL, ambos do grupo IS. (B) Dados de coerência do grupo Sham
(n = 4) são indicados da esquerda para a direita pelo coreograma médio, coerência espectral e pela
coerência de fase. Em destaque são indicados os valores dos MPCs de delta e teta no teste da
esquiva. (C) Coreograma médio do grupo ES (n = 5), coerência espectral entre os períodos e a
coerência de fase de teta no gráfico circular, com destaque para a ausência de diferenças no MPC de
delta e teta após o EC. (D) O aumento do MPC em teta no grupo IS (n = 8). Da esquerda para a direita:
74
coreograma médio, gráfico da coerência espectral; a distribuição circular da coerência de fase de
teta, e por fim, o aumento do MPC de teta pós-EC.
75
5. DISCUSSÃO
76
A controlabilidade do estresse é associada a uma série de respostas
comportamentais mal-adaptativas (ABELAIRA; REUS; QUEVEDO, 2013; MAIER; SELIGMAN,
2016; PRYCE et al., 2011; VOLLMAYR; GASS, 2013; YIN; GUVEN; DIETIS, 2016). No modelo
tríadico do desamparo aprendido, utilizado para a investigação dos efeitos da
controlabilidade do estresse, sabe-se que o CPF e ABL são diretamente relacionadas as
alterações comportamentais geradas pelo estresse incontrolável (MAIER e SELIGMAN, 2016;
MAIER e WATKINS, 2005; PRYCE et al., 2011; VOLLMAYR e GASS, 2013). A partir do nosso
estudo foi possível observar as diferenças no processamento neural do CPF e da ABL com
seus respectivos correlatos comportamentais no desamparo aprendido (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo dos principais resultados. Símbolos: “↑” aumento e “↓” redução em relação ao
controle. * indica diferenças entre os grupos ES e IS.
Através do teste da esquiva pode-se observar no grupo IS o aumento tanto da
latência média quanto do número de falhas, em contrapartida ao grupo ES e Sham que
apresentaram a latência média e o número de falhas menor, sem distinção entre si. Na
atividade unitária do 1d, tanto o grupo ES quanto o IS apresentaram o aumento da
modulação neuronal no CPF, contudo, no grupo IS a modulação neuronal foi ainda maior
do que a do grupo ES. Por sua vez, no teste da esquiva tanto a modulação quanto a atividade
neuronal do CPF aumentaram no grupo ES. Durante os dois dias de protocolo a atividade
unitária da ABL não foi diferente entre os grupos. Em relação a atividade oscilatória no CPF,
ES IS ES IS
Latência média --- --- --- ↑*Número de falhas --- --- --- ↑*
CPF Modulação da atividade neuronal ↑ ↑* ↑* ---CPF atividade neuronal --- --- ↑* ---ABL Modulação da atividade neuronal --- --- --- ---ABL atividade neuronal --- --- --- ---
CPF Perturbação média da potência de teta ↑* ↑ ↑ ---CPF Perturbação média da potência de alfa ↓ ↓* ↑* ↓ABL Perturbação média da potência de teta --- --- --- ---ABL Perturbação média da potência de alfa --- --- --- ---Coerência de fase em delta --- ↑ --- ---Coerência de fase em teta ↑ ↑ --- ↑
Atividade unitária
Atividade oscilatória
1º Dia Teste da esquiva
Comportamento
77
durante o 1d a perturbação média da potência de teta aumentou grupo ES, enquanto no
grupo IS a potência de alfa diminuiu. Já no teste da esquiva a perturbação média da potência
de alfa no CPF aumentou no grupo ES. Na ABL não foram encontradas diferenças na
potência das bandas durante os dois dias de protocolo, contudo, a coerência de fase entre
o CPF e ABL foi alterada nos dois dias de protocolo. No 1d a coerência de fase em teta
aumentou tanto no grupo ES quanto no grupo IS, enquanto no grupo IS ocorreu também o
aumento da coerência de fase em delta. Por fim, no 2d apenas o grupo IS apresentou o
aumento da coerência de fase em teta. Tomados em conjunto, esses dados indicam o papel
fundamental do CPF e da ABL no processamento neural da controlabilidade do estresse.
5.1. Comportamento
5.1.2. Padronização comportamental
Os achados eletrofisiológicos da presente tese possibilitam uma série de implicações
para a compreensão do processamento neural do estresse incontrolável, todavia, estes
achados eletrofisiológicos só podem ser apreciados a luz dos cuidados tomados na
elaboração do modelo triádico do desamparo aprendido.
Na literatura científica há inúmeros protocolos comportamentais que se intitulam
como “desamparo aprendido”, entretanto, poucos trabalhos contemplam todas as
prerrogativas relacionadas ao escopo teórico proposto por Maier e Seligman (2016). Um dos
primeiros desafios nos estudos germinais de Mayer e Seligma foi tentar observar o
desamparo aprendido não só em cachorros, seus primeiros sujeitos experimentais, mas
também em roedores (HUNZIKER, 2003; MAIER et al., 1973). Maier et al. (1973) foram os
primeiros a observar o desamparo aprendido em ratos, neste trabalho quando os animais
eram submetidos ao teste da esquiva, avaliando-se apenas a fuga simples, não havia
diferenças entre os grupos. O autores ainda se propuseram a mudar a intensidade do
choque, o número de sessões e os intervalos entre os choques, sem contudo, observar
diferenças entre os grupos (MAIER et al., 1973). Foi apenas quando se utilizou a contingência
da fuga dupla no teste da esquiva que o comportamento entre os grupos foi distinto (MAIER
et al., 1973). Quando comparada a fuga simples, a contingência da fuga dupla possibilita a
descriminação de respostas mais complexas e cognitivas, e não apenas respostas motoras e
reflexas (JACKSON et al., 1978; MAIER et al., 1973; PRYCE et al., 2012). Por sua vez, esses
achados iniciais foram ainda corroborados por diversos trabalhos subsequentes (AMAT et
78
al., 2005; BARATTA et al., 2018; BELUJON e GRACE, 2014; STRONG et al., 2011), o que nos
levou a padronizar o protocolo do 2d com a fuga dupla no teste da esquiva.
Os resultados da nossa padronização conseguiram replicar os dados da literatura, com
o grupo IS apresentando a latência média e o número de falhas maior no teste da esquiva
quando comparado aos grupos Sham e ES (seção 4.1.1) (AMAT et al., 2005; BARATTA et al.,
2007). Além disso, através da categorização comportamental foi possível observar que tanto
o grupo Sham e ES apresentaram proporções semelhante de animais “não desamparados”
(~75%). O rendimento desses dois grupos corresponde a um importante indicador de que
tanto o grupo Sham quanto o grupo ES são igualmente capazes de aprender a fuga dupla
no teste da esquiva (MAIER, 1984).
Para a classificação comportamental dos animais em “desamparados” ou “não
desamparados” optou-se por um método objetivo de análise de conjuntos, o K-means, o
qual já foi utilizado por outros autores que investigaram o desamparo aprendido
(CHOURBAJI et al., 2005; KIM et al., 2016; WANG et al., 2014), e até mesmo em outros modelos
experimentais de transtornos psiquiátricos (BÉRUBÉ et al., 2014; LIM et al., 2016). Assim
como em humanos, nos roedores pode-se observar uma diversidade de respostas
comportamentais após a exposição ao estresse, de modo que descriminar esses
comportamentos é fundamental para se compreender o correlato neuronal de cada um
desses fenótipos (COHEN et al., 2004; RITOV et al., 2015).
5.1.3. Protocolo comportamental definitivo
Após a padronização dos testes comportamentais outras questões emergiram do
estudo mais aprofundado sobre o desamparo aprendido. Descrito inicialmente na década
de 60 e sendo estudado exaustivamente desde então, o protocolo comportamental do
desamparo aprendido é repleto de detalhes que podem ressignificar ou limitar as suas
implicações. Maier et al., 2016 avaliando os 50 anos de estudos sobre o desamparo
aprendido aponta que um dos aspectos importantes no estudo do desamparo aprendido é
sua trans-situacionalidade. A trans-situacionalidade corresponde a situação na qual a
exposição prévia ao estressor incontrolável afeta o comportamento do animal quando
exposto a outro contexto distinto (MAIER e WATKINS, 2005). Já nos experimentos iniciais a
trans-situacionalidade fez parte da definição do desamparo aprendido, com animais sendo
expostos no 2d a um ambiente distinto do 1d (MAIER, 1984). Maier e Seligman (2016)
79
ressaltam a ideia de que nas respostas ao estresse incontrolável, o fracasso na fuga durante
o teste da esquiva deve ser mediado por uma mudança no estado cognitivo/emocional do
animal, ao invés de uma resposta estritamente relacionada ao condicionamento Pavloviano
induzido pelo mesmo contexto.
Nesse sentido, há várias evidências de que os déficits produzidos pela trans-
situacionalidade do choque IS diferem de protocolos no mesmo contexto, e sejam resultado
de uma resposta independente a do medo condicionado. Primeiro, em protocolos que
utilizam contextos distintos no desamparo aprendido, os animais apresentam pouco ou
nenhum congelamento no teste da esquiva, indicando que inicialmente não há uma
resposta de medo ao novo contexto (GREENWOOD et al., 2003, 2005; MAIER, 1990).
Segundo, enquanto os protocolos que fazem o uso de contextos diferentes observaram
alterações comportamentais em até 3 dias após a exposição ao choque IS (OVERMIER e
SELIGMAN, 1967; WEISS, 1968), nos protocolos em que não se muda o contexto as alterações
permanecem por até 8 dias (MAIER e WATKINS, 2005; MALBERG e DUMAN, 2003). Terceiro,
os sistemas de neurotransmissão envolvidos nos protocolos de mesmo contexto são
distintos dos que acessam a trans-situacionalidade pela mudança de contexto. Embora a
administração de benzodiazepínicos seja capaz de impedir o medo condicionado, nos
protocolos com contextos diferentes a administração de benzodiazepínicos não afeta o
número de falhas no teste da esquiva (DRUGAN et al., 1984; MAIER, 1990). Além disso, nos
protocolos que utilizam contextos diferentes a sinalização serotoninérgica e noradrenérgica
são fundamentais para a geração e expressão do desamparo (MAIER e WATKINS, 2005).
Neste tipo de protocolo, a inibição serotoninérgica do NDR tanto no 1d quanto no 2d
bloqueia os efeitos do choque IS (MAIER et al., 1995), assim como no grupo IS os níveis de
noradrenalina diminuem no 1d do protocolo e podem perdurar por até 3 dias (WEISS et al.,
1981). Já no caso dos protocolos que utilizam o mesmo contexto, a inibição serotoninérgica
do NDR, independente do dia de tratamento, não inibe as alterações comportamentais no
grupo IS (MAIER e WATKINS, 2005). Por fim, a trans-situacionalidade no desamparo
aprendido recruta circuitos neuronais distintos dos protocolos em que se utiliza o mesmo
contexto. Nos protocolos que se leva em conta a trans-situacionalidade o CPF é
fundamental para a controlabilidade do estresse. Nestes protocolos a inibição
farmacológica do CPF via muscimol (agonista de receptores GABAA) no grupo ES afeta a
capacidade de fuga na teste da esquiva (AMAT et al., 2005), assim como no grupo IS a
80
ativação do CPF via picrotoxina (antagonista de receptores GABAA) impede o desamparo
nos animais (AMAT et al., 2008). Entretanto, nos protocolos que utilizam o mesmo contexto,
a estimulação elétrica do CPF não é capaz de reverter os déficits no grupo IS, diferentemente
do resultado de outros testes que também investigaram os efeitos dessa estimulação, como
o nado forçado e o consumo de sacarose (HAMANI et al., 2010). Já em relação a ABL, lesões
eletrolíticas neste estrutura não afetam a indução do desamparo aprendido em protocolos
com contextos distintos (MAIER et al., 1993), enquanto nos protocolos de mesmo contexto
lesões excitotóxicas na ABL recuperam a capacidade de fuga no teste da esquiva
(GREENWOOD et al., 2010).
Levando em consideração a discussão acima, houve-se um novo esforço em se alterar
o protocolo do desamparo aprendido, modificando-se desta vez o contexto entre o 1d e 2d.
As modificações no contexto foram inspiradas a partir de trabalhos que investigaram tanto
a influência do contexto na formação de memórias, quanto em trabalhos de desamparo
aprendido (ANDERSON e JEFFERY, 2003; JOCA et al.,2003; POLLACK et al., 2018; STANQUINI
et al., 2017). Com as modificações, os resultados do protocolo definitivo também foram
compatíveis com a literatura (AMAT et al., 2010; PAULA et al., 2011). No teste da esquiva a
latência média da fuga e o número de falhas no grupo IS foi maior em relação aos grupos
Sham e ES. Após a classificação comportamental essas diferenças se tornaram ainda mais
robustas (seção 4.1.2.). Contudo, neste protocolo definitivo o rendimento dos grupos foi
menor do que quando comparado a padronização, cerca de 60% do grupo Sham e ES não
ficaram desamparados e foram incluídos nas análises, enquanto que no grupo IS o
rendimento foi de 80% de animais desamparados. Apesar do rendimento menor quando
comparado ao protocolo da padronização, essa queda era esperada em função das
mudanças de contexto, com um rendimento próximo ao indicado na literatura (DRUGAN,
2001). Além disso, o rendimento semelhante entre os grupos Sham e ES indicou que em
ambos os grupos a tarefa foi igualmente inédita, diferentemente do grupo IS, no qual é
possível observar os déficits comportamentais. Tomados em conjunto, esses dados
correspondem a indícios de que a trans-situcionalidade foi verificada nesse último
protocolo (MAIER e SELIGMAN, 2016).
Apesar do nosso protocolo ir de encontro às premissas do desamparo aprendido
proposta por Maier et al. (2016) é importante discutir as suas limitações e possíveis passos
seguintes. Os artigos originais sobre o desamparo aprendido tinham como objetivo avaliar
81
a controlabilidade do estresse sobre o comportamento, de modo que a proposta do seu uso
como um modelo experimental de depressão surgiu quase duas décadas depois (WEISS et
al., 1981). Desde então o desamparo aprendido vem sendo investigado como um modelo
de depressão, com validações de predição, de face e até mesmo de construção (seção 2.4.).
Contudo, o nosso protocolo do desamparo aprendido possui particularidades que outros
protocolos típicos do modelo tríadico do desamparo aprendido não possuem, o que não
nos permite a rigor afirmar que o nosso protocolo possua todas essas validações do modelo.
Para fazer essa afirmação o nosso protocolo deve ainda satisfazer outros critérios de
validade (PRYCE et al., 2011). Nesse sentido, já estão em andamento experimentos no nosso
laboratório investigando os efeitos do antidepressivo escitalopram (inibidor seletivo da
receptação de serotonina) neste protocolo do desamparo aprendido, com o objetivo de
validar a predição de antidepressivos. Por sua vez, os dados preliminares desse experimento
já indicam que o nosso protocolo seja sensível ao efeitos do antidepressivo escitalopram.
5.2. Dados eletrofisiológicos
5.2.1. Qualidade do registro eletrofisiológico
Além da padronização comportamental, outro importante passo no presente
trabalho foram as padronizações do registro eletrofisiológico, principalmente com a
eliminação do ruído de movimento (seção 3.6. e seção 4.2.1.). O ruído de movimento
corresponde a uma perturbação no sinal eletrofisiológico que decorre da movimentação do
animal sem qualquer relação com o sinal biológico (MASIMORE et al., 2004). Tipicamente o
ruído de movimento inviabiliza a análise do sinal eletrofisiológico, diminuindo em grande
parte o número de épocas para análise. Na presença do ruído de movimento, a cada 100
sessões do 1d, em média apenas 37 sessões podiam ser utilizadas. Isso não só limitava as
análises eletrofisiológicos sobre a dinâmica oscilatória ao longo do experimento, como
também enviesava as análises com a média das sessões. As adaptações no registro
eletrofisiológico corresponderam a resolução de um problema enfrentado até por grupos
com publicações de alto impacto, os quais não fazem o registro eletrofisiológico próximo a
exposição de choques (COURTIN et al., 2014; HULTMAN et al., 2016; KARALIS et al., 2016;
KUMAR et al., 2014). Estas adaptações possibilitaram um grande salto experimental para a
analise dos resultados, os quais a partir de então puderam ser explorados de diversas
formas.
82
5.2.2. Atividade unitária
No 1d observamos que a modulação da atividade unitária no CPF foi maior no grupo
IS, apesar do grupo ES também apresentar o aumento da modulação neuronal em relação
ao grupo Sham. Alguns experimentos in vitro já se prontificaram a investigar a
excitabilidade do CPF após a exposição ao estresse IS, contudo não há consenso entre os
resultados obtidos. Varela e col (2012) observaram que logo após a exposição ao choque ES
a excitabilidade dos neurônios piramidais do CPF é maior em comparação ao grupo IS. Nesse
sentido, é interessante notar que nos nossos resultados, apesar da modulação da atividade
ser maior no grupo IS, a proporção de unidades que modulam positivamente é maior no
grupo ES, o que vai de encontro aos dados de Varela et al., (2012). No nosso grupo IS ocorre
o aumento da proporção tanto de unidades que modulam positivamente como o de
unidades que modulam negativamente, o que por fim não altera a atividade final dos
disparos no CPF. Por outro lado, Wang e col (2014) utilizaram a linhagem de camundongos
transgênicos FosGFP para investigar in vitro especificamente os neurônios piramidais
responsivos ao choque IS e obtiveram resultados opostos. Neste trabalho, após dois dias de
exposição ao choque IS, os neurônios piramidais responsivos aumentaram a sua atividade
apenas nos animais desamparados (WANG et al., 2014). A aparente discrepância entre esses
achados com o nossos resultados pode ser elucidada a partir de diferenças experimentais e
particularidades das análises. Diferentemente do nosso estudo, tanto o trabalho de Varela
et al., (2012) quanto o de Wang et al., (2014) registraram apenas neurônios piramidais do
CPF in vitro após a tarefa, enquanto no nosso trabalho o registro ocorreu em livre-
movimento, sem a distinção de tipos neuronais e durante todo protocolo do desamparo
aprendido.
Trabalhos que abordaram farmacologicamente o papel do CPF na controlabilidade
do estresse sugerem que a sua ativação esteja relacionada ao controle do estresse,
enquanto a sua inibição seria relacionada a falta de controle (AMAT et al., 2005, 2008;
DOLZANI et al., 2018; ROZESKE et al., 2011). Entretanto, nos nossos resultados o aumento da
modulação da atividade neuronal tanto no grupo ES quanto no grupo IS sugerem que a
controlabilidade do estresse não esteja relacionada a inibição ou ativação do CPF, mas sim
que no CPF ocorra a codificação os graus de controlabilidade. De maneira complementar
aos nossos achados, Marques (2016) mostraram a partir da análise da PC dos disparos
83
neurais, que tanto nos grupos ES e IS, há padrões específicos de dinâmicas neuronais no CPF
durante o desamparo. Por sua vez, a codificação dos graus de controlabilidade no CPF pode
corresponder a interação de determinadas estruturas que se comunicam com o CPF.
Warden et al., (2012) demonstraram que no nado forçado a reversão da imobilidade ocorre
a partir da estimulação específica da via CPF-NDR. Inicialmente eles se propuseram a analisar
a modulação da atividade neuronal do CPF simultaneamente ao nado forçado. Nesse
experimento a atividade unitária do CPF foi fortemente modulada durante a imobilidade no
nado forçado, apresentando tanto unidades que modulavam positivamente quanto
negativamente durante a tarefa. De modo que a estimulação óptica no CPF não alterou o
comportamento do animal. Porém quando se estimulou especificamente a via CPF-NDR
interrompeu-se a imobilidade no nado forçado (WARDEN et al., 2012). Nesse sentido,
enquanto a atividade neuronal do CPF e do NDR é relacionada a comportamentos do tipo-
resistentes ao estresse (GEDDES et al., 2016; MCLAUGHLIN et al., 2012), a atividade neuronal
de outras estruturas, como o CPF e a ABL, é associada a comportamentos do tipo-
depressivos (KUMAR et al., 2014; WEI et al., 2017).
No que diz respeito a atividade neuronal do CPF no teste da esquiva, tanto a
modulação quanto a atividade neuronal aumentaram no grupo ES, enquanto os valores do
grupo Sham e IS não foram distintos entre si. Tendo em vista que tanto o grupo ES quanto
o grupo Sham foram capazes de fugir no teste da esquiva, pode se entender que esta
resposta da atividade neuronal no grupo ES não seja estritamente relacionada ao
movimento ou a dificuldade da tarefa, mas sim a uma consequência da exposição aos
choques ES no 1d. Em tarefas de medo condicionado, o aumento da atividade neuronal no
CPF é associada ao decaimento do medo (BURGOS-ROBLES et al., 2007; BURGOS-ROBLES et
al., 2009). Por sua vez, comportamentos apetitivos também aumentam a atividade neuronal
no CPF (BURGOS-ROBLES et al., 2013). De modo que a atividade neuronal do CPF é
fundamental para a descriminação de estímulos que podem predizer a punição ou a
recompensa em um contexto. Burglos-Robles e col (2017) registraram a atividade neuronal
do CPF durante a realização de uma tarefa na qual os animais recebiam tanto pistas
preditivas de choque quanto pistas preditivas de recompensa. A atividade neuronal do CPF
aumentava durante a exposição às pistas preditivas de recompensa, em contrapartida, os
disparos no CPF diminuíam diante das pistas preditivas ao choque (BURGOS-ROBLES et al.,
2017). Lembrando que no teste da esquiva os animais do grupo ES são também expostos a
84
choques, é interessante notar que a exposição prévia a controlabilidade do estresse é
responsável por uma atividade neuronal do CPF semelhante a situações de recompensa.
Quando se compara os nossos resultados a outros modelos de estresse, pode-se
ainda entender que o aumento da atividade neuronal do CPF corresponde a um marcador
eletrofisiológico da resistência ao estresse. Tanto na indução farmacológica de respostas
que mimetizam o estresse como na exposição a estressores crônicos, ocorre a diminuição
na taxa de disparos neuronais no CPF (KUMAR et al., 2014; STEVENSON et al., 2007). No
estresse crônico por derrota social essa diminuição é ainda capaz de predizer a
susceptibilidade ao estresse (KUMAR et al., 2014). Por sua vez, quando se estimula
especificamente a via CPF-ABL por DREADD (do inglês, Designer Receptors Exclusively
Activated by Designer Drugs), os comportamentos do tipo depressivos são revertidos e a
excitabilidade do CPF aumenta (WEI et al., 2017). Nesse contexto, os nossos achados se
destacam ao mostrar pela primeira vez que os animais expostos ao estresse controlável
apresentam no CPF um correlato neuronal associado a resistência ao estresse.
Quanto a nossa investigação sobre a atividade neuronal da ABL, não foram
encontradas diferenças entre os grupos nos dois dias de protocolo do desamparo
aprendido. Especificamente em relação a controlabilidade, Maier et al., (1993) demostraram
que lesões na ABL não afetam a controlabilidade do estresse per se, contudo, as análises da
expressão de proteínas relacionadas a plasticidade sináptica na ABL, sugerem o seu
envolvimento na controlabilidade do estresse. Apenas na ABL do grupo IS observa-se o
aumento dos níveis da expressão da proteína Arc, enquanto apenas na ABL do grupo ES
ocorre o aumento da expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês
Brain-Derived Neurotrofic Factor) (MACHIDA et al., 2017). De qualquer modo, o papel da ABL
no desamparo aprendido é claro quanto a trans-situcionalidade do medo, a potencialização
dos déficits comportamentais e a geração de comportamentos ansiogênicos no desamparo
(CHRISTIANSON et al., 2010; MAIER et al., 1993; MAIER e SELIGMAN, 2016; STRONG et al.,
2011). Em investigações eletrofisiológicas o aumento da modulação e da atividade neuronal
na ABL é associada a exposição crônica de estressores (CORRELL et al., 2005; PADIVAL et al.,
2013). Esse achados na literatura nos levaram a criar a hipótese de que a atividade neuronal
da ABL seria maior durante o estresse incontrolável, no entanto, é provável que o aumento
da atividade neuronal da ABL possa ocorrer de maneira mais específica. Em camundongos
submetidos ao estresse crônico por derrota social Kumar e col (2014) observaram o aumento
85
da taxa de disparo na ABL apenas nas unidades acopladas as oscilações locais em delta e
teta (2 – 7 Hz). De maneira semelhante, Likhtik e col (2014) observaram especificamente o
aumento dos disparos neuronais da ABL acoplados a teta na descriminação de estímulos
relacionados ao medo. Por sua vez, Burgos-Robles e col (2017) observaram que diante de
pistas preditivas de punição ocorre o aumento da proporção de unidades da ABL que
disparam mais, e não necessariamente o aumento da atividade neuronal líquida. Além
dessas especificidades apontadas, na literatura há ainda resultados contraditórios em
relação a atividade neuronal da ABL em função do tempo e da repetição da exposição a
estressores. Em investigações in vitro, fatias da ABL expostas a corticosterona ficam mais
excitáveis, porém, um segundo tratamento de corticosterona diminui a excitabilidade da
ABL, assim como a ABL de animais previamente estressados também diminui a
excitabilidade quando expostos a corticosterona (KARST et al., 2010). Por outro lado, Shors
(1999) registrando a ABL de ratos em livre movimento observou que a exposição aguda ao
choque na cauda suprime a atividade unitária da ABL, a qual pode persistir por até 48 h.
Shors (1999) argumenta que a resposta da ABL seja sensível a estímulos aversivos, mas
sobretudo a estímulos aversivos que não sejam familiares (ONO et al., 1995), de forma que
a supressão desses neurônios contribui para o aumento do estado de vigilância do animal.
Para Shors (1999) o aumento da vigilância do animal é o reflexo do aumento da relação sinal-
ruído de sua representação neural, o que pode ser conseguido tanto aumentando o sinal ou
reduzindo o ruído. Dessa forma, a exposição ao estressor aumentaria representação neural
reduzindo a atividade neuronal na ABL, ou seja, reduzindo o “ruído” na ABL. Entretanto, em
relação aos nossos resultados sobre a atividade neuronal da ABL não podemos
desconsiderar o número reduzido de unidade registradas na ABL. Enquanto nos registramos
na ABL a atividade unitária de 74 unidades nos três grupos, no CPF foram registradas 123
unidades. Mesmo que em outros trabalhos tenha se registrado na ABL uma quantidade de
unidades de disparo semelhante a nossa (KUMAR et al., 2014; STUJENSKE et al., 2014), este
número reduzido de unidades pode influenciar a interpretação dos resultados.
5.2.3. Atividade oscilatória
Nas análises das oscilações do CPF no 1d um dos principais marcadores
eletrofisiológico da controlabilidade do estresse foi o aumento da perturbação média da
potência de teta (4 - 8 Hz) no grupo ES. Nesse sentido, os nossos resultados replicaram os
86
achados obtidos por Marques (2016), os quais também indicaram o aumento da potência
de teta (4 – 8) Hz após o EC no grupo ES. Em roedores as oscilações teta são associadas a
uma série de comportamentos, os quais podem nos ajudar a esclarecer o seu papel no
desamparo aprendido, dentre eles podemos citar: a antecipação de comportamentos, tanto
em protocolos de medo condicionado (BUZSÁKI et al., 1979; LESTING et al., 2011, 2013)
quanto em tarefas de recompensa (AMARANTE et al., 2017; DONNELLY et al., 2014). Estes
dados são particularmente elucidativos se entendermos o aumento da potência de teta
como um correlato da expectativa do controle sobre o estresse. Além disso as oscilações
teta correspondem a um importante marcador eletrofisiológico na formação de memórias
(LISMAN e IDART, 1995; MILLER, 1989; PAZ et al., 2009; POPA et al., 2010). Nesse sentido,
Marques (2016) mostrou que a perturbação da potência de teta (4 – 8 Hz) no CPF do 1d é
positivamente correlacionada com o comportamento resiliente no teste da esquiva, o que
seria um argumento de que o aumento de teta também estaria associado à aquisição da
resiliência. Nessa perspectiva, sabe-se que a controlabilidade do estresse pode aumentar a
expressão de proteínas relacionadas a plasticidade sináptica no CPF, como o BDNF
(MACHIDA et al., 2017). Além disso, em modelos de estudos de plasticidade sináptica
observou-se que as oscilações teta podem modular a sua indução. Hölscher e col (1997)
mostrou em fatias do HIPO que a indução da potenciação de longa duração (LTP, do inglês
Long-term potentiation) é modulada positivamente pela oscilação teta. Por sua vez, Shors
e col (1989) mostraram que a controlabilidade do estresse inibe os o prejuízo induzido por
estresse na LTP de CA1 do HIPO. Em conjunto esses achados apontam para um possível
papel de teta nas oscilações do CPF durante a formação de comportamentos resistentes ao
estresse.
É importante discutir também que as oscilações em teta podem ser relacionadas ao
movimento do animal, o que explicaria o aumento da perturbação da potência de teta no
grupo ES em comparação ao grupo IS. O primeiro achado comportamental relacionado a
oscilação teta mostrou que durante a movimentação ou exploração ativa ocorre o aumento
da atividade em teta, e desde então este achado tem sido corroborado inúmeras vezes
(BUZSÁKI, 2002; GERVASONI, 2004; KAHANA et al, 2001; KRAMIS et al., 1975; VANDERWOLF,
1969). Contudo, em nosso trabalho tivemos o cuidado de selecionar os períodos dos PCLs
em que não se observa-se os efeitos relacionadas à movimentação dos animais. Como
indicado na seção 3.8.4., nosso grupo desenvolveu uma rotina com o intuito de eliminar as
87
sessões nas quais os animais se movimentavam. Após a eliminação dos períodos com
movimento, observou no 1d que no período de 1 s pré e pós-EC não ocorre o aumento da
potência da banda relacionada ao movimento (8 – 12 Hz) (MCFARLAND et al., 1975; ODDIE
e BLAND, 1998; SAINSBURY, 1998). De modo que os nossos resultados referentes ao 1d
podem ser interpretados sem a influencia do movimento. Assim como as análises de
coerência, as quais foram feitas apenas com as sessões sem movimento.
No 1d do nosso protocolo comportamental pode se observar um outro marcador da
controlabilidade do estresse no CPF, a diminuição da perturbação da banda alfa (8 – 12 Hz),
o que replicou os dados já coletados pelo nosso grupo (MARQUES, 2016). As oscilações na
banda alfa correspondem a um importante marcador da atividade cortical (FLINT e
CONNORS, 1996; KLIMESCH et al.,, 2007). De modo que durante o estado de vígilia a
oscilação alfa é associada a supressão sensorial e atenção seletiva (FOXE e SNYDER, 2011;
KLIMESCH et al., 2007; NICOLELIS e FANSELOW, 2002). Durante a realização de tarefas táteis,
Nicolelis e Fanselow (2002) mostraram que o processamento neuronal em alfa (7 – 12 Hz)
no CPF permite a optimização da detecção de estímulos novos. Nesse sentido, o decaimento
da potência de alfa no grupo IS indicaria a diminuição da atenção seletiva ao EC no grupo
IS. No teste da esquiva esse decaimento de alfa foi ainda maior no grupo IS. Todavia, em
relação a este dado em específico, não se pode eliminar a hipótese de que o aumento da
potência nessa banda (8 – 12 Hz) não esteja relacionado ao movimento, já que a partir das
análises das épocas sem movimento foi possível observar que no teste da esquiva ocorre
uma forte influência do movimento na banda alfa (8 – 12 Hz). Além disso, é importante
ressaltar, que as oscilações em alfa não correspondem a um fenômeno unitário,
comportando diferentes oscilações dentro de si, de modo que alguns autores incorporam
essa banda dentro da faixa de teta (4 – 12 Hz) (BUZSÁKI, 2002; KLIMESCH et al., 2007).
Contudo, no nosso estudo foi importante estudar essas delimitações clássicas do EEG, a
título de comparação com os nossos resultados prévios obtidos por Marques (2016), assim
como facilitar a discussão de possíveis correlatos clínicos.
Em relação a ABL nos dois dias de protocolo não foram encontradas diferenças quanto
a perturbação média das potências analisadas. Entretanto, quando se analisou a coerência
das oscilações do CPF e da ABL verificamos uma série de alterações. No 1d tanto no grupo
ES quanto no grupo IS ocorreu o aumento da coerência de fase em teta após o EC. Vários
trabalhos mostraram no medo condicionado a sincronização em teta entre o CPF e ABL
88
diante de ECs, indicando o recrutamento dessas estruturas na antecipação do
comportamento (BUZSÁKI et al., 1979; COURTIN et al., 2014; KARALIS et al., 2016; LIKHTIK et
al., 2014). Karalis e col (2016) mostraram que durante a expressão de medo, indicada pelo
congelamento dos animais, ocorre a sincronia CPF-ABL, de modo que a coerência CPF-ABL
em 4 Hz não só é capaz de predizer respostas ao medo, como também a estimulação via
optogenética do CPF nessa frequência induz o congelamento nos animais. Por sua vez,
Likhtik e col (2014) observaram que o aumento da coerência CPF-ABL em teta é fundamental
na descriminação de contextos seguros ou aversivos. Por fim, Marques (2016) descreveu o
aumento da coerência em teta entre o HIPO-CPF, tanto no grupo ES quanto no IS, indicando
no desamparo aprendido o papel da sincronia em teta na antecipação dos ECs.
No grupo IS, em específico, foi possível observar no 1d o aumento da coerência de fase
em delta. Em outros protocolos de estresse as alterações em delta no CPF e na ABL são
comumente associadas a comportamentos do tipo depressivos (DZIRASA et al., 2013;
HULTMAN et al., 2016; KUMAR et al., 2013, 2014). No estresse crônico por derrota social as
oscilações em delta no CPF antecedem as oscilações na ABL, de modo que essa
direcionalidade das oscilações em delta é capazes de predizer a susceptibilidade ao estresse
(HULTMAN et al., 2016; KUMAR et al., 2014). O aumento da coerência em delta no grupo IS
pode ainda indicar uma forte modulação serotoninérgica. Em camundongos
geneticamente deficientes na produção de serotonina os seus comportamentos do tipo-
depressivos são associados ao aumento da coerência em delta entre CPF e ABL (DZIRASA et
al., 2013). Quando submetidos ao tratamento com fluoxetina (inibidor seletivo da
receptação de serotonina) a coerência CPF-ABL em delta diminuiu nos camundongos
geneticamente modificados, assim como o seu comportamento do tipo-depressivo
(DZIRASA et al., 2013).
Por fim, no grupo IS foi possível observar também o aumento da coerência em teta no
teste da esquiva ativa. O aumento dessa coerência pode indicar a trans-situacionalidade do
estresse IS. De acordo com Maier e Seligman (2016), a trans-situacionalidade do estresse IS
ocorre quando os animais respondem a um novo EC de maneira semelhante ao estresse IS
prévio, dessa forma, pode-se entender a coerência em teta como um importante marcador
de antecipação a ECs(COURTIN et al., 2014; KARALIS et al., 2016; LIKHTIK et al., 2014), sendo
que a repetição dessa alteração apenas no grupo IS pode representar um marcador
eletrofisiológico da trans-situacionalidade no teste da esquiva.
89
5.3. Considerações translacionais e correlação com achados clínicos
O estudo da atividade oscilatória cerebral corresponde a uma ferramenta valiosa na
compreensão de marcadores eletrofisiológicos tanto na depressão como em modelos
animais (ALHAJ et al., 2011; SMART et al., 2015). Isto se deve a conservação dos ritmos
cerebrais na evolução dos mamíferos, de modo que a sua dinâmica temporal não só é
conservada entre as espécies, mas possui um papel essencial na função cerebral (BUZSÁKI;
LOGOTHETIS; SINGER, 2013; LOPES DA SILVA, 1991). Dessa forma, não inesperadamente os
nossos resultados apresentaram uma série de correlações clínicas.
Na clínica um dos principais marcadores eletrofisiológicos da depressão são as
alterações nas atividades das bandas teta e alfa, o que se correlaciona com os nossos
achados no CPF (tabela 1). Em humanos a maior atividade em teta no córtex frontal é
associada a resposta de antidepressivos (KNOTT et al., 1996; SPRONK et al., 2011). Assim
como o aumento da atividade em alfa no córtex frontal é associada a predisposição da
resposta ao tratamento (BRUDER et al., 2008). Além disso, na depressão a maior atividade
em teta no córtex frontal é observada após o tratamento com placebo, esta resposta, por
sua vez, pode representar um correlato neuronal da expetativa de controle sobre os
sintomas depressivos (LEUCHTER et al., 2002). Curiosamente, Leuchter e col (2002)
mostraram que a expectativa no tratamento é até mais eficiente que o tratamento com
antidepressivos para a remissão dos sintomas depressivos. Nas análises de coerência com
pacientes depressivos ocorre ainda o aumento da coerência de delta fronto-temporal em
comparação a indivíduos saudáveis (LEUCHTER et al., 2012).Neste sentido, o nosso trabalho
e sua relação com os achados clínicos representam um primeiro passo na compreensão
desses marcadores, fortalecendo a utilização do modelo triádico do desamparo aprendido
como um modelo experimental da depressão e possibilitando novas investigações
translacionais.
90
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
91
A partir do estudo da análise eletrofisiológica córtico-amigdalar durante o modelo
triádico do desamparo aprendido podemos concluir que: (1) a exposição ao estresse
incontrolável aumenta a modulação do CPF; (2) a expressão de comportamentos resistente
ao estresse é relacionada ao aumento da modulação e atividade neuronal do CPF; (3) a
controlabilidade do estresse aumenta a atividade oscilatória de teta e alfa no CPF; (4) a
controlabilidade do estresse não altera a atividade neuronal e as oscilações na ABL; (5) na
exposição ao estresse inescapável ocorre o aumento da coerência em delta entre o CPF e
ABL; e (6) a coerência em teta entre CPF e ABL é maior nos animais desamparados. Tomados
em conjunto, esses dados indicam que o processamento neural da controlabiliade do
estresse altera a funcionalidade e conectividade do CPF e da ABL, fornecendo novas
evidências para a compreensão do estresse incontrolável.
92
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