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CINTIA APARECIDA LOPES GODOY-ESTEVES
ESTUDO COMPARATIVO DA UTILIZAÇÃO DE MEMBRANAS
AMNIÓTICAS DE COELHA E HUMANA COMO ENXERTO EM
CERATOPLASTIA LAMELAR EM COELHOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Medicina Veterinária
Departamento: Cirurgia
Área de concentração: Cirurgia
Orientador: Prof. Dr. Paulo Sergio de Moraes Barros
São Paulo
2005
Livros Grátis
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FICHA CATALOGRÁFICA
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PARECER BIOÉTICA
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FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: GODOY-ESTEVES, Cintia A. Lopes Título: Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e
humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Cirurgia da da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Medicina Veterinária
Data: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. Paulo Sergio de Moraes Barros Instituição: ______________________ Assinatura _________________________ Julgamento: _____________________ Prof. Dr. José Luís Laus Instituição: ______________________ Assinatura _________________________ Julgamento: _____________________ Prof. Dr. José Álvaro Pereira Gomes Instituição: ______________________ Assinatura _________________________ Julgamento: _____________________ Prof. Dr. Maria Regina Baccaro Instituição: ______________________ Assinatura _________________________ Julgamento: _____________________ Prof. Dr. Idércio Luiz Signorini Instituição: ______________________ Assinatura _________________________ Julgamento: _____________________
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RESUMO
GODOY-ESTEVES, C. A. L. Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos. [Comparative study about the use of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit as graft in lamelar keratoplasty in rabbits]. 2005. 94 f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.
Recentemente, têm-se visto notáveis avanços nas cirurgias de reconstrução da superfície
ocular com a introdução do transplante de membrana amniótica. Para alcançar esses bons
resultados, muitas pesquisas têm sido feitas em laboratório, utilizando o coelho como modelo
animal experimental. Contudo, muitas dessas investigações são sobre os efeitos da membrana
amniótica humana na superfície ocular de coelhos e pesquisadores já relataram a possibilidade
de a membrana amniótica humana incitar reações de rejeição xenogênica no olho do coelho.
Frente à inexistência de relatos de estudos comparativos dos efeitos da membrana amniótica
de origem humana em relação à de coelha, objetivou-se o estudo comparativo da utilização de
membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em
coelhos. Foram utilizados 32 coelhos, raça Nova Zelândia, brancos, machos, com peso 1,5-
2,0kg, divididos em 4 grupos de 4 animais cada, para cada membrana e após períodos de
evolução de 2, 7, 15 e 30 dias, os animais foram submetidos à eutanásia, as córneas
trepanadas e fixadas em glutaraldeído a 2% tamponado, processadas e avaliadas por meio de
microscopia óptica (HE, picrosírius, alcian blue) e contagem de células inflamatórias e
neovasos. Nas avaliações clínicas, ambos os grupos apresentaram comportamento semelhante.
Nas avaliações microscópicas, a membrana amniótica tanto de origem humana quanto a de
coelha foram incorporadas e reabsorvidas, contudo os animais do grupo I (membrana
amniótica humana) apresentaram maior grau de infiltrado inflamatório e neovascularização do
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que o grupo II (membrana amniótica de coelha), diferença estatisticamente significativa
(p<0,05) no teste de Mann-Whitney.
Palavras-chave: Oftalmologia. Córnea. Membrana Amniótica. Coelho.
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SUMMARY
GODOY-ESTEVES, C. A. L. Comparative study about the use of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit as graft in lamelar keratoplasty in rabbits. [Estudo comparativo da utilização de membranas amnióticas de coelha e humana como enxerto em ceratoplastia lamelar em coelhos]. 2005. 94 f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.
Recently, we have seen a remarkable advance on ocular surface reconstruction
surgeries with the adjuvant amniotic membrane transplantation. To achieve these results, a lot
of laboratory research has been made, using the rabbit as an experimental animal model.
However, almost all investigations have been about the effects of the human amniotic
membrane on the rabbit ocular surface and, investigators have reported that the human
amniotic membrane can incite xenoresponse by the rabbit eye. The inexistence of papers
comparing the effects of human amniotic membrane and amniotic membrane of rabbit in the
cornea of rabbit was the purpose of this study. Thirty two New Zealand white rabbits, males,
weighing 1,5-2.0 kg were used, divided in 4 groups with 4 animals each, for each membrane.
After 2, 7, 15 and 30 days post operatively, the animals were euthanized and the cornea
trephined, fixed in 2% tapped glutaraldehyd, evaluated under optical microscopy (HE,
picrosirius and alcian blue) and inflamamatory cells and blood vessels in stroma were
counted. Clinically, one could observe similar reactions in both groups. At microscopic
evaluations, one could observe incorporation and resorption of amniotic membranes from
both groups, however the number of inflammatory cells and blood vessels in group I (human
amniotic membrane) was greater than in group II (rabbit amniotic membrane), diference
statistically significant with Mann-Whitney test (p<0,05).
Key words: Ophthalmology. Cornea. Amniotic Membrane. Rabbit.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 09
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................... 10
2.1 Aspectos histológicos...................................................................... 11
2.2 Aspectos imunológicos................................................................... 14
2.3 Preparo e armazenamento da membrana amniótica ................. 16
2.4 Aplicações da membrana amniótica ............................................ 17
2.5 Características da membrana amniótica .................................... 29
3 MATERIAL E MÉTODO ............................................................ 33
3.1 Animais........................................................................................... 33
3.2 Grupos experimentais ................................................................. 33
3.3 Obtenção da membrana amniótica ............................................ 35
3.4 Procedimento cirúrgico ............................................................... 35
3.5 Ceratoplastia .................................................................................. 36
3.6 Avaliação macroscópica ............................................................... 37
3.7 Avaliação microscópica ................................................................ 37
3.8 Análise estatística .......................................................................... 38
4 RESULTADOS .............................................................................. 39
4.1 Avaliação macroscópica ............................................................... 39
4.2 Avaliação microscópica ................................................................ 54
4.3 Análise estatística .......................................................................... 56
5 DISCUSSÃO .................................................................................. 70
6 CONCLUSÕES ............................................................................. 84
REFERÊNCIAS ........................................................................... 85
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1 INTRODUÇÃO
A utilização da membrana amniótica humana tem se consagrado na última década como
ótimo adjuvante nas cirurgias de reconstrução da superfície ocular.
Muitas das propriedades da membrana amniótica sobre a superfície ocular foram
determinadas a partir de pesquisas realizadas em coelhos. Contudo, o uso de membrana de
origem humana pode induzir reações ao tecido transplantado, o que interfere na interpretação
dos resultados. Têm sido pouco estudados os efeitos do transplante com membrana amniótica
de coelha nesses animais, bem como as reações desses receptores a enxertos xenógenos e
alógenos.
Devido à escassez de dados comparativos entre os enxertos com membranas amnióticas
de origem humana e de coelha, propusemos comparar as reações dos enxertos com membrana
amniótica humana (xenógena) e membrana amniótica de coelha (alógena) em ceratoplastia
lamelar em coelhos, utilizando-se parâmetros clínicos e histológicos (hematoxilina-eosina)
com determinação da distribuição e caracterização das proteoglicanas pela coloração com
alcian blue, determinação do tipo de colágeno com a utilização da técnica de picrosirius e
contagem de células inflamatórias e neovasos.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
As pesquisas em relação ao uso de membranas biológicas na oftalmologia têm
avançado nas últimas décadas demonstrando resultados promissores, principalmente
concernente à utilização da membrana amniótica para a reconstrução da superfície ocular.
A investigação da viabilidade da utilização de membranas fetais e, posteriormente, de
membrana amniótica propriamente, como enxerto, não é inédita; Davis1 (1910, appud
TRELFORD e TRELFORD-SAUDER, 1979) fez o primeiro relato do emprego de
membranas fetais para transplantes de pele. Sabella2 (1913, appud TRELFORD e
TRELFORD-SAUDER, 1979), relataram independentemente o uso da “membrana amniótica”
em superfícies cutâneas queimadas e ulceradas. No olho, foi utilizada, pela primeira vez por
DeRoth, em 1940, na reparação de simbléfaro e defeitos conjuntivais.
Trelford et al. (1972) relataram os resultados do uso do âmnion isolado como auto-
enxerto e aloenxerto em ovelhas, quando comprovou-se que os resultados eram melhores com
o lado mesenquimal voltado para o receptor. Foram diversos os experimentos utilizando a
membrana amniótica, sendo finalmente aclamada a sua aplicação em feridas não cicatrizadas
de diabéticos, como enxerto sobre defeitos cirúrgicos de glossectomia total, como
recobrimento biológico de onfaloceles e na prevenção da adesão tecidual em cirurgias da
cabeça, abdômen, pélvis, vagina e laringe (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979) .
Em 1992, no congresso da Sociedade Dominicana de Oftalmologia na República
Dominicana, foi apresentado o trabalho intitulado "Membranas placentárias como substituto
conjuntival", no qual descrevia-se o uso de "tecidos soviéticos" como transplantes alógenos
1 DAVIS, J. W. Skin transplantation with a review of 550 cases at The Johns Hopkins Hospital, Johns Hopkins Medical Journal v. 15; p. 307, 1910. 2 SABELLA, N. Use of fetal membranes in skin grafting. Medicine Records. v. 83, p. 478.
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em cirurgias de conjuntiva, tarso, órbita e tendão. Após muitas investigações, descobriu-se
que o misterioso tecido soviético se tratava de placenta humana (DUA et al., 2004).
Mais recentemente, o transplante de membrana amniótica foi reintroduzido na
reconstrução da superfície ocular. Kim e Tseng (1995), induziram lesões corneais severas em
coelhos, seguidas de transplante de membrana amniótica. Os resultados foram promissores,
evidenciando que a membrana amniótica é capaz de substituir algumas propriedades da
membrana basal corneal. Esse relato impulsionou as pesquisas e aplicações da membrana
amniótica na reconstrução da superfície ocular.
A partir de então, a membrana amniótica tem sido utilizada como adjuvante no
tratamento cirúrgico de diversas alterações oculares e resultados encorajadores têm sido
relatados por diferentes pesquisadores, atribuídos presumivelmente pela melhora do método
de processamento e preservação, o qual mantém as propriedades inerentes do âmnion.
2.1 Aspectos histológicos
A membrana amniótica, juntamente com o córion e a alantóide compõem a membrana
fetal ou placenta. O córion, a camada mais externa, está em contato com as células maternas e
consiste em tecido trofoblástico e mesenquimal; a alantóide é a camada intermediária e a
membrana amniótica é a camada mais interna do saco embrionário (DUA; AZUARA-
BLANCO, 1999). As placentas diferem de espécie para espécie, sendo a placenta humana do
tipo hemocorial (JAINUDEEN; HAFEZ, 1988) e a da coelha hemodicorial corion-alantóica
labiríntica (ENDERS; BLANKENXHIP, 1999).
A espessura do âmnion na espécie humana varia de 0,02mm a 0,5mm (BOURNE,
1960). Ele é avascular e não possui fonte direta de suprimento sangüíneo. Bourne (1960)
descreveu que, durante o estágio inicial da gestação, a membrana amniótica é composta por 5
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camadas: epitélio, membrana basal, camada compacta, camada de fibroblastos e camada
esponjosa.
A camada epitelial é constituída por uma única camada de células que variam de
colunares a cuboidais ou achatadas. Ultraestruturalmente, observa-se que a superfície apical
das células epiteliais amnióticas apresenta microvilosidades e sua base expressa processos
celulares ou pedículos que se estendem para dentro da membrana basal como um podócito. Os
processos basais têm junções do tipo hemidesmossomos e a membrana basal contém
tonofilamentos, e a substância basal da membrana é parcialmente amorfa e microfibrilar. O
citoplasma contém muitas vesículas pinocíticas, abundantes organelas, incluindo retículo
endoplasmático e complexo de Golgi. O núcleo tem uma configuração muito regular com
indentações na membrana nuclear. Os nucléolos são freqüentemente grandes e homogêneos,
sugerindo atividade nucleolar (POLLARD; AYE; SYMONDS, 1976). A ultra-estrutura do
epitélio sugere que o âmnion possui funções especializadas, realizando três papéis
primordiais: como epitélio de revestimento, como epitélio ativamente secretor e realizando
transporte intercelular e transcelular intenso.
A membrana basal é uma camada fina composta de fibras reticulares e está firmemente
aderida ao epitélio amniótico por processos interdigais. A lâmina basal da membrana
amniótica contém grandes quantidades de proteoglicanos ricos em heparin sulfato. Acredita-
se que os proteoglicanos atuem como uma barreira restringindo a permeabilidade do âmnion.
O âmnion contém uma grande quantidade de colágeno, hialuronato e predominantemente
pequenos proteoglicanos tais como o biglican e o decorin (MEINERT et al., 2001). Outros
autores acrescentam componentes como colágenos do tipo I, III, IV, V e VII (APLIN;
CAMPBELL; ALLEN, 1985; KEENE; SAKAI; LUNSTRUM, 1987; MODESTI; SCARPA;
DORAZI, 1989; YURCHENKO; RUBEN, 1987), laminina e fibronectina (APLIN;
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CAMPBELL; ALLEN, 1985) identificados na membrana basal e no estroma da membrana
amniótica.
A camada compacta é uma densa camada quase totalmente isenta de células e consiste
principalmente de um complexo reticular. A camada de fibroblastos é a mais espessa e os
fibroblastos encontram-se imersos em uma malha reticular frouxa. A camada mais externa, a
esponjosa, forma uma interface entre a membrana amniótica e o córion e consiste de bandas
de retículo banhados de mucina (BOURNE, 1960).
Completado o período gestacional, o âmnion consiste de uma única camada de células
firmemente aderidas à camada mesenquimal cuja espessura é de 6 a 8 camadas de células e
está frouxamente aderida ao córion. (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979)
Fukuda et al. (1999), observaram que a distribuição das cadeias de colágeno IV na
membrana basal da membrana amniótica é semelhante à distribuição presente na conjuntiva,
diferindo no entanto da existente na córnea. Essa observação baseou-se na presença das
cadeias α5(IV) no epitélio corneal e na ausência destas na membrana amniótica e na
conjuntiva.
Endo et al. (2004), verificaram por meio de estudos imunohistoquímicos, em amostras
previamente tratadas com uréia, cadeias de colágeno tipo IV α5 nas membranas amniótica e
basal corneal. Entretanto, sua presença não foi detectada na membrana basal conjuntival.
Vários fatores de crescimento (TGF- β1 e β 2,EGF, TGF-α, KGF, HGF, bFGF) foram
identificados na membrana amniótica preservada a -80ªC por 1 mês. Constatou-se que a
provável origem dessas citoquinas seja epitelial, uma vez que a membrana amniótica com
epitélio apresentou os maiores níveis dessas substâncias (KOIZUMI; INATOMI;
SOTOZONO, 2000).
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2.2 Aspectos imunológicos
Imunologicamente, sugere-se, após observações clínicas e experimentais, que o córion
tanto alógeno quanto autógeno são mais antigênicos que a membrana amniótica, o que pode
ser devido ao maior contato dessa membrana com a face materna da placenta. O âmnion
autógeno é reconhecido como próprio, e o alógeno é minimamente ativo (TRELFORD;
TRELFORD-SAUDER, 1979).
Adinolfi et al. (1982) afirmaram que as células da membrana amniótica não expressam
antígenos HLA-A,B,C ou DR ou microglobulinas β2 em sua superfície. Porém, Houlihan et
al., 1995, evidenciaram a expressão de HLA-E e HLA-G.
HLA-A, HLA-B e HLA-C são antígenos de histocompatibilidade maior (MHC) classe
I, os quais são responsáveis pela regulação da resposta de linfócitos T CD8 (citotóxicos) e
estão relacionados ao controle de rejeição de transplantes. O HLA-G também é classe I e é
expresso na placenta com papel de proteção do feto contra ataques de células Natural Killers
da mãe. HLA-D é classe II e relaciona-se à ação de linfócitos CD4 (helper) (FORRESTER et
al., 2002). A resposta imune a um enxerto alógeno é, geralmente, iniciada pelas células T
CD4 (helper) reconhecendo os antígenos de histocompatibilidade maior (MHC) e menor
(mH) expressos no tecido enxertado. A indução de resposta inflamatória a aloenxertos
mediada por células T CD4 leva à diferenciação de células T CD8 contra o tecido enxertado, à
produção de anticorpos pelas células B e ativação de fagócitos. Recentemente, demonstrou-se
que a aloimunidade pode desencadear uma resposta auto-imune direcionada a antígenos
órgão-específicos (OSA) do enxerto. (ILLIGENS et al., 2002).
A ativação do CD 4 é desencadeada via dois mecanismos distintos: o direto (via
MHC) e o indireto (via mH). Os transplantes de córnea representam um modelo interessante
de investigação das vias direta e indireta da alo-resposta. Os enxertos de córnea naturalmente
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não possuem células apresentadoras de antígeno MHC classe II e possuem pequena
quantidade de moléculas MHC classe I. Na rejeição da córnea, os antígenos mH são mais
potentes mediadores do que os antígenos MHC, portanto a rejeição corneal é comandada por
uma alo-resposta indireta, enquanto que a resposta direta não ocorre (ILLIGENS et al.,
2002).
A aloimunidade é mediada por uma combinação doador/receptor, direta ou indireta,
que varia de acordo com a natureza do tecido ou órgão transplantado. O local receptor do
enxerto ou órgão, considerando-se seus sistemas linfático e vascular, pode ser um fator chave
no comando da escolha das vias direta ou indireta para a resposta imune após o transplante. É
pouco esclarecido o papel da predominância de reposta direta ou indireta influenciando na
natureza do processo de rejeição. É provável que respostas imunes por via direta, policlonal
de curta duração, induza formas de rejeição agudas e rápidas, enquanto que as que ocorrem
por via indireta, oligloclonal mas persistente, estejam associadas às formas agudas tardias ou
crônicas (ILLIGENS et al., 2002).
Kubo et al. (2001) demonstraram que a membrana amniótica criopreservada expressa
fortemente antígenos classe I, mesmo após 6 meses de preservação, sugerindo que a
membrana amniótica criopreservada pode conter células viáveis expressando HLA-G. Apesar
disso, no mesmo experimento, foi evidenciada que a membrana amniótica pode comportar-se
como tecido imune-privilegiado. Esses pesquisadores, utilizando modelos de transplante
xenógeno (membrana humana em rato Lewis) no limbo (local sem privilégio imunológico) e
na córnea (local de privilégio imunológico), observaram discreto infiltrado celular no
transplante límbico, contudo não havia destruição ou lise completa da membrana amniótica.
Por meio de análises imunohistoquímicas, realizadas uma semana após o enxerto no limbo,
foram observadas células T (especialmente CD 4+) ao redor da membrana amniótica
transplantada, indicando reação mediada por células. Todos os transplantes intracorneais não
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demonstraram qualquer reação imune e conservou plena transparência a longo prazo.
Enxertos de pele, utilizados como controle, foram todos rejeitados, mesmo nos espaços
intracorneais. Complementando a pesquisa, realizaram-se enxertos com membrana amniótica
e pele sob a cápsula renal, local considerado sem privilégio imune e fora do olho.
Observaram-se discreta reação inflamatória ao redor da membrana amniótica com poucas
células infiltrando o estroma amniótico e infiltração exuberante de células do hospedeiro na
pele enxertada.
2.3 Preparo e armazenamento da membrana amniótica
A membrana amniótica, previamente ao seu uso, deve ser submetida a processamento
e preservação realizados sob condições estéreis. Antibióticos com ação contra bactérias Gram
negativas e Gram positivas e contra fungos são usados na lavagem e na solução de
armazenamento. Quanto aos métodos de preservação, podem-se utilizar dois protocolos. O
desenvolvido pelo grupo de Tsubota (SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997) recomenda o
corte da membrana em fragmentos de 10cmX10cm e lavagem seqüencial por 5 minutos em
cada uma das soluções - 0,5M dimethyl sulfoxido (DMSO), 1.0M DMSO e 1.5M DMSO. O
outro protocolo consiste na preservação da membrana em glicerina a 50% em meio Eagle
modificado de Dulbeco (KIM; TSENG, 1995; LEE; TSENG,1997). Em ambos, a membrana é
mantida congelada a -80º C até sua utilização.
Adds, Hunt e Dart (2001) compararam os resultados da aplicação da membrana
amniótica congelada (-80º C) e a fresco (+4º C). Apesar de ambos os procedimentos terem
resultado em melhora da acuidade visual, com leve superioridade do material a fresco, a
membrana a fresco demonstra desvantagens, tais como a inviabilidade de sorologia do doador
devido ao curto período entre a captação e o transplante e realizar a captação para um receptor
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específico, sendo desprezado o restante da membrana. O método de congelamento beneficia
até trinta pacientes com a membrana amniótica de uma única placenta.
Outro método de preservação sugerido é o congelamento a seco da membrana
amniótica, acondicionada à vácuo e esterilizada com radiação gama. Testes realizados
demonstraram que esse método preservou as características físicas, biológicas e morfológicas,
da mesma forma que a criopreservação, conseqüentemente sendo um método útil
(NAKAMURA et al., 2004).
Em medicina veterinária, tem-se utilizado a membrana amniótica preservada em
glicerina 98%. Mackie (1997) descreve a glicerina como sendo meio satisfatório na
preservação de membranas biológicas, a qual mantém as características bactericidas,
antivirais e a integridade morfológica da estrutura. Maral, Borman e Arslan (1999)
preservaram a membrana amniótica em glicerol 85% a 4ºC por mais de um ano e
demonstraram que sua performance foi tão boa quanto a membrana utilizada a fresco no
tratamento de queimaduras cutâneas.
O método de preparação é importante para manter a baixa taxa de infecções
microbianas após o transplante de membrana amniótica (MARANGON et al., 2004).
2.4 Aplicações da membrana amniótica
As principais aplicações da membrana amniótica nas cirurgias de reconstrução da
superfície ocular foram descritas por Dua et al. (2004) em uma extensa revisão sobre a
utilização do âmnion na oftalmologia.
Quando a membrana amniótica é utilizada para recobrir uma área da superfície ocular
e ela é removida ou cai espontaneamente, refere-se como sendo "patch" (recobrimento). Se a
membrana é utilizada esperando-se que ela se torne epitelizada e incorporada ao tecido
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receptor, refere-se como enxerto. No "patch", a epitelização ocorre sob a membrana,
enquanto que no enxerto, o epitélio cresce sobre ela, utilizando-a como um substrato. A
aplicação da membrana amniótica sobre a córnea pode ser total ou parcial, dependendo da
severidade e extensão das lesões. Cirurgias de pálpebra e conjuntiva também podem ser
indicações para seu uso.
É importante dar atenção à orientação da membrana amniótica. Quando há a
necessidade da membrana funcionar como substrato para a migração celular, isto é, quando
utilizada como enxerto, a membrana tem que ser suturada no local com a membrana basal ou
o lado epitelial para cima. Quando utilizada como bandagem biológica, primariamente para
conter reação inflamatória enquanto a epitelização ocorre sob a membrana, ela é suturada com
o lado epitelial em contato com a superfície ocular. O lado estromal da membrana encarcera
células inflamatórias e induz apoptose, reduzindo inflamação.
Os dois métodos podem ser utilizados em associação, bem como podem-se utilizar
várias camadas de membrana para, por exemplo, preencher uma área de ceratomalácia ou
afinamento corneal. Advoga-se que a última camada seja maior que as outras e seja suturada
com o lado epitelial para cima .
A membrana amniótica pode ser utilizada como uma matriz para recuperar o estroma
danificado da superfície ocular em diferentes indicações clínicas, tais como Síndrome de
Stevens-Johnson (GOMES et al., 2003; HONAVAR et al., 2000; TSUBOTA et al., 1996) ;
queimaduras químicas e térmicas (GOMES et al., 2003; MELLER et al., 2000; SHIMAZAKI;
YANG; TSUBOTA, 1997); reconstrução da superfície conjuntival (TSENG;
PRABHASAWAT; LEE, 1997); defeitos epiteliais com ulceração (LEE; TSENG, 1997;
PRABHASAWAT; TESAVIBUL; KOMOLSURADEJ, 2001; TSENG, 2001); pterígio
(PRABHASAWAT et al., 1997); cirurgias filtrantes para glaucoma (BARTON et al., 1997;
FUJISHIMA et al., 1998); pterígio recidivante associado a simbléfaro (SHIMAZAKI;
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SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998); deficiência de células germinativas do limbo
(ANDERSON et al., 2001; TSENG et al., 1998); ceratopatia bolhosa (PIRES et al., 1999);
úlceras corneais profundas (KRUSE; ROHRSCHNEIDER; VÖLCKER, 1999);
ceratoconjuntivites cicatriciais (GOMES et al., 1999); úlcera corneal neurotrófica (CHEN;
PIRES; TSENG, 2000); perfuração escleral (RODRIGUEZ-ARES et al., 1999); perfuração
corneal com a combinação do uso de adesivos (SU; LIN, 2000); úlceras em escudo de
ceratoconjuntivite vernal (SRIDHAR et al., 2001); ceratite necrosante por HSV-1
(HEILIGENHAUS et al., 2001); ceratopatia em faixa (ANDERSON et al., 2001); calázio
conjuntival sintomático refratário a tratamento médico (MELLER et al., 2000); melanoma
conjuntival maligno (PARIDAENS et al., 2001); para redução de “haze” pós fotoablação com
excimer laser em coelhos (CHOI et al., 1998; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001);
necrose epidérmica tóxica aguda (JOHN et al., 2002).
Em algumas ocasiões não houve sucesso com a utilização da membrana amniótica, em
casos de defeitos epiteliais com afinamento estromal (AZUARA-BLANCO; PILLAI;
DUA,1999) e em perfurações corneais (LEE; TSENG, 1999). Esses insucessos com úlceras
profundas ou defeitos epiteliais persistentes com afinamento estromal foram superados com a
utilização da técnica de transplante de diversas camadas de membrana amniótica, como
relatado por Kruse, Rohrschneider e Völcker (1999), Prabhasawat, Tesavibul e Komolsuradej
(2001) e Rodriguez-Ares et al. (2004).
Fazendo-se um levantamento das indicações do transplante de membrana amniótica,
pode-se constatar que ela tem vasta aplicação nas ceratoconjuntivites cicatriciais.
As ceratoconjuntivites cicatriciais são consideradas um grupo heterogêneo de doenças
que possuem como denominador comum o processo cicatricial secundário à inflamação e seus
efeitos na superfície ocular (ALVES; LUI NETTO; GOMES, 2002). Seis são os tipos de
alterações principais decorrentes das ceratoconjuntivites cicatriciais: olho seco; alterações
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palpebrais; destruição do limbo e células germinativas corneais; destruição da membrana
basal; processo inflamatório; alteração na integração neuro-anatômica da superfície ocular
(GOMES, 2000).
As ceratoconjuntivites caracterizadas por deficiências das células germinativas do
limbo podem ser divididas em dois grupos: I) Aplasia: perda da população de células
germinativas do limbo por destruição primária e II) Hipofunção: disfunção do meio estromal
das células germinativas do limbo.
Como representantes do grupo I podemos citar: injúrias químicas ou térmicas,
Síndrome de Stevens-Johnson ou necrólise epidérmica tóxica, múltiplas cirurgias ou
crioterapias no limbo (iatrogênica), toxicidade por antimetabólitos, ceratopatia induzida por
lente de contato, infecção microbiana severa. No grupo II encontram-se: aniridia hereditária,
ceratites associadas à deficiências endócrinas múltiplas (hereditária), ceratopatia neurotrófica
(neuronal ou isquêmica), ceratopatia induzida por radiação, inflamação e ulceração corneal
periférica ou limbite crônica, pterígio e pseudopterígio e idiopática. (PIRES; GOMES, 2002).
Os efeitos observados no transplante de membrana amniótica foram a epitelização
facilitada, manutenção do perfil fenotípico epitelial normal (ESPANA et al., 2003), redução
da inflamação, bem como da vascularização e da cicatrização (PIRES; GOMES, 2002).
Nas ocasiões em que a deficiência de células germinativas do limbo é total, faz-se
necessário o transplante de limbo do olho contralateral ou, nos casos de doença bilateral, de
doador com HLA compatível.
Nesse contexto, Tseng et al. (1998) avaliaram a eficiência do transplante de membrana
amniótica isolado e associado a enxertos alógenos de limbo na reconstrução da superfície
ocular de pacientes com deficiência das células germinativas do limbo. Para deficiências
límbicas parciais, a membrana amniótica é suficiente e até superior ao transplante alógeno de
limbo, face à não necessidade da administração de ciclosporina ao paciente. Nas deficiências
21
totais, o transplante de limbo é essencial, pois nele estão localizadas as células responsáveis
para a renovação apropriada do epitélio corneal.
Em 2003, um grupo de pesquisadores (MARINHO et al., 2003) questionou a
participação da membrana amniótica na recuperação de pacientes submetidos ao transplante
associado dessa membrana com enxerto de limbo. Para tal investigação, realizou-se
experimento a longo prazo com coelhos submetidos a queimadura química severa,
desenvolvendo deficiência total de limbo. Subseqüentemente procederam o transplante de
limbo isolado e transplante de limbo associado a transplante de membrana amniótica. A
conclusão foi a de que o transplante de limbo é efetivo para o tratamento da deficiência
límbica e que o transplante de membrana amniótica não acrescentou benefícios nesse modelo
experimental em coelhos.
Sob o aspecto morfológico, os efeitos do transplante de membrana amniótica foram
analisados em córnea de pacientes que tiveram que ser submetidos a ceratoplastia penetrante
para melhora da acuidade visual. Gris et al. (2002), descreveram os achados histológicos da
córnea de dois pacientes que receberam enxertos de membrana amniótica devido a defeito
epitelial persistente e úlcera neurotrófica. A epitelização foi bem sucedida em ambos os casos.
No primeiro paciente, cuja córnea não sofreu a invasão de vasos, três meses após o implante
pôde-se observar uma faixa de tecido espessa correspondente à membrana amniótica
implantada, com desaparecimento de alguns fragmentos desse material. Não foram
encontradas células gigantes, constantes nas reações de corpo estranho, tampouco células
monocíticas ou histiocíticas foram identificadas por meio de imunohistoquímicas (esperadas
no processo de reabsorção). No outro paciente sete meses após o implante, à microscopia
óptica, não foram identificados resquícios da membrana amniótica, em seu lugar foi
encontrado tecido fibroso espesso recém formado, diferente do tecido estromal adjacente. Em
contraste com o primeiro caso, vascularização e intenso infiltrado inflamatório composto por
22
histiócitos, linfócitos T e, em pequena proporção, linfócitos B. Portanto, uma vez que a
membrana amniótica é reabsorvida, é substituída por tecido estromal fibrótico que conserva
parcialmente a espessura estromal, mas não a mesma transparência do estroma saudável. Em
córneas com vascularização estromal, o enxerto é rapidamente absorvido devido à abundância
de células inflamatórias. O oposto ocorre nas córneas avasculares, nas quais a reabsorção da
membrana amniótica é lenta e nenhum tipo de reação inflamatória é produzida.
A histopatologia de córneas, 5 a 13 meses decorridos do transplante de membrana
amniótica e células germinativas do limbo de pacientes que sofreram queimadura química
severa, também foi realizada por Stoiber et al. (2002). Nesse estudo, realizaram-se análises à
microscopia óptica, eletrônica de transmissão e imunofluorescência direta. Todas as amostras
apresentaram epitélio estratificado sem evidências de células caliciformes, o que implicaria
em contaminação por epitélio conjuntival. As células basais demonstraram firme conexão aos
resquícios de membrana amniótica, os quais em alguns locais pareceram estar em um estado
de modificação ou remodelagem das fibras de colágeno. Por meio de imunohistoquímica,
colágeno tipo IV e VII, integrin α6 e β4, laminin5 e hemidesmossomos foram identificados na
região da membrana basal. Colágeno IV também foi identificado nos resquícios de membrana
amniótica, bem como na membrana amniótica criopreservada. A membrana amniótica
transplantada aparentemente sobrevive e se integra ao tecido do hospedeiro sendo modificada
e remodelada pelas células receptoras.
Tosi et al. (2005), avaliaram sob microscopia óptica córneas de cinco pacientes
submetidos a transplante de córnea ou a enucleação devido a causas diversas, 2 a 20 meses
após terem recebido transplante de membrana amniótica. O material das cirurgias, bem como
córneas e membranas amnióticas controles, foram fixados em formalina tamponada e os
cortes corados com hematoxilina-eosina, ácido periódico de Schiff (PAS), tricromio de
Gomori e Masson e Alcian Blue (pH 2,5), além da realização de várias provas
23
imunohistoquímicas. As membranas amnióticas controles coraram-se em azul pelo Alcian
Blue, seu estroma corou em verde claro com ao uso do tricrômio de Masson e sua membrana
basal foi evidenciada pelo PAS, contudo nenhum desses métodos foi eficiente em demonstrar
a presença de resquícios da membrana amniótica nas córneas dos pacientes que foram
submetidos ao transplante de membrana amniótica, evidenciando sua completa integração e
reabsorção. Esses achados indicam que a membrana basal da membrana amniótica promove a
reconstrução da superfície ocular logo em seguida ao transplante e, posteriormente, a
membrana amniótica, por meio de suas propriedades biológicas, favorece a restauração da
membrana basal pelas células epiteliais corneais basais.
Apesar dos avanços alcançados nos tratamentos de certas afecções oculares com o
advento do transplante de membrana amniótica para a superfície ocular, ainda há a
necessidade de obtenção de tecidos que substituam a córnea, o que parece ser possível através
da bioengenharia.
A produção de tecidos por bioengenharia e sua aplicabilidade na substituição da
córnea tem sido demonstrada em estudos in vitro, em animais de maneira experimental e,
muito recentemente em pacientes sofrendo de doenças da superfície ocular.
Em cultura de tecidos, a membrana amniótica suporta o crescimento de células
epiteliais do limbo por cultura de explantes e, em seguida, a membrana amniótica com células
epiteliais pode ser transplantada para a superfície corneal afetada (PIRES; GOMES, 2002).
A expansão ex-vivo de população celular colhida e o cultivo diretamente sobre uma
membrana amniótica modificada resulta em um tecido resistente o suficiente para ser
facilmente transplantado e que biologicamente mimetiza a superfície corneal (PIRES;
GOMES, 2002).
24
A expansão ex vivo de células epiteliais corneais sobre camadas de fibrina e
subsequente transferência para a superfície conjuntival para o manejo de deficiência de
células germinativas foi descrita primeiramente por Pellegrini, Traverso e Franzi (1997).
He et al. (1999) relataram o transplante experimental de células de limbo humano e de
células epiteliais amnióticas cultivadas sobre a superfície côncava de lentes de contato de
colágeno para a superfície corneal, concluindo que o transplante foi bem sucedido na córnea
desepitelizada, onde houve firme adesão do enxerto por meio de hemidesmossomos.
Koizumi et al. (2000) utilizaram a membrana amniótica humana como substrato para o
cultivo de células epiteliais corneais límbicas e realizaram seu transplante autógeno em
coelhos, concluindo que o procedimento é factível.
Nesse mesmo ano, avaliou-se o cultivo de células epiteliais extraídas da córnea central
de coelhos com a utilização de membrana amniótica humana com e sem epitélio como
substrato, obtendo-se melhores resultados com a membrana amniótica desepitelizada
(KOIZUMI et al., 2000).
Considerando os resultados dos experimentos realizados em coelhos com o transplante
de células cultivadas ex vivo em membrana amniótica, pacientes humanos estão sendo
submetidos ao mesmo tipo de procedimento.
Schwab, Reyes e Isseroff (1999) fizeram o primeiro relato da utilização de tecido
produzido por bioengenharia em pacientes com doenças na superfície ocular, descrevendo que
as células germinativas epiteliais da córnea podem ser colhidas com segurança do limbo,
expandidas com sucesso in vitro e cultivadas em membrana amniótica desepitelizada. O
tecido resultante pode ser transplantado e parece gerar bons resultados em olhos com
alterações da superfície ocular, incluindo deficiência de células germinativas.
Shimazaki et al. (2002), realizaram transplante de epitélio límbico humano cultivado
em membrana amniótica para o tratamento de alterações severas da superfície ocular,
25
revelando que a taxa de sucesso desse método não difere do método convencional de
transplante de limbo associado ao transplante de membrana amniótica.
Na mesma linha, Sangwan et al. (2003) realizaram reconstrução da superfície ocular
de paciente com severa deficiência de células germinativas límbicas parcial, bilateral
utilizando epitélio conjuntival e límbico autógenos cultivados em uma única membrana
amniótica, o que demonstrou ser uma excelente opção em pacientes selecionados com
pequenas áreas de limbo saudável, evitando assim o risco de rejeição.
Nakamura et al. (2003) relataram o sucesso da cultura e auto-transplante de células
epiteliais da mucosa oral de coelhos em membrana amniótica. O dano na superfície ocular de
coelhos foi provocado com a realização de ceratectomia lamelar e excisão da conjuntiva, se
estendendo até o limbo. Amostras de mucosa oral foram obtidas e cultivadas por três semanas
em uma membrana amniótica humana sem células epiteliais. Após três a quatro semanas de
evolução da lesão, a superfície ocular conjuntivalizada foi reparada transplantando-se as
células epiteliais da mucosa oral cultivadas em membrana amniótica. O resultado pós
cirúrgico foi bom e, com dez dias de evolução, a córnea estava transparente e completamente
epitelizada. Além disso, através de pesquisa da presença de queratina por meio de
imunohistoquímica, demonstrou-se que as queratinas presentes são as que imprimem a
característica de epitélio não queratinizado, como o epitélio corneal.
Grueterich, Espana e Tseng (2003), realizaram estudo in vitro e chegaram à conclusão
de que culturas de limbo em membrana amniótica intacta mantém o fenótipo epitelial do
limbo, enquanto que as culturas feitas em membrana amniótica desepitelizada se diferencia
em fenótipo corneal.
Mais recentemente, em 2004, Ishino et al., realizaram o cultivo de células endoteliais
corneais humanas em membrana amniótica, atingindo densidades maiores que 3000 céls/mm2
e transplantou esse tecido na face interna de córneas de coelhos já destituídas de membrana de
26
Descemet e endotélio. Com o auxílio de biomicroscopia e paquimetria, a espessura corneana
foi monitorada e, aos 7 dias de pós-transplante, os enxertos foram avaliados sob microscopia
óptica, eletrônica de varredura e de transmissão. As córneas que receberam o transplante
apresentaram pouco edema e mantiveram sua espessura e transparência. Os resultados
indicaram que a membrana amniótica mantém a morfologia e a função das células endoteliais
corneais humanas e que pode servir como carreador dessas células para seu transplante.
Bioengenharia de tecidos pode representar o futuro para o reparo de muitos tecidos e
órgãos e, para a córnea, a realização desse feito encontra-se próxima. Utilizando-se células
germinativas da córnea autólogas cultivadas permite que se faça um banco de células do
próprio paciente, assim enxertos repetidos podem ser construídos a partir dessas células
sempre que necessário. Não havendo a possibilidade de utilização de células autólogas, a
colheita de células alógenas é feita de pequena área do limbo doador (2mm2), minimizando
danos iatrogênicos (SCHWAB; REYES; ISSEROFF, 2000). Um dos fatores impedientes da
extrapolação dos resultados obtidos dessas pesquisas para o homem é a utilização de
membrana amniótica humana (xenógena) e não de coelha nos experimentos, o que pode
induzir rejeição ao enxerto xenógeno por parte do receptor (KUBO et al., 2001).
Experimento com a utilização de membrana amniótica de coelha foi relatado por Ti et
al. (2002), no qual deficiência total de células germinativas do limbo foi provocada com o
debridamento de todo epitélio corneal com n-eptanol e posterior remoção cirúrgica da
margem límbica de todo o perímetro em olhos de coelhos. Foram constituídos 4 grupos
experimentais. No grupo I, utilizou-se membrana amniótica de coelha. Nos grupos II e III, foi
transplantado epitélio límbico expandido ex vivo em membrana amniótica de coelha, diferindo
no modo de fixação. No grupo IV, foi utilizada membrana amniótica humana na forma de
patch além do epitélio límbico expandido ex vivo em membrana amniótica de coelha. Nos
animais do grupo I, nos quais foi utilizada membrana amniótica isolada, não houve
27
epitelização e todos os olhos permaneceram inflamados. A superfície ocular foi rapidamente
invadida por epitélio conjuntival. Os grupos II e III tiveram evoluções satisfatórias e
semelhantes. No grupo IV, o uso da membrana amniótica humana como patch temporário
promoveu rápida supressão da inflamação da superfície ocular. Além disso, o epitélio
transplantado era mais estável. O autor atribuiu o sucesso desse modelo ao uso de membrana
amniótica de coelha como substrato de cultura e como carreador para o transplante, resultando
na ausência de inflamações decorrentes do xenotransplante. A utilização da membrana
amniótica humana como patch foi decorrente da facilidade de obtenção dessa membrana em
relação à de coelha e, quando utilizada na forma de patch por menos de 2 semanas, não induz
rejeição ao xenotransplante.
Em moldes semelhantes, Ti et al. (2004), provocaram deficiência total de células
germinativas do limbo no olho esquerdo de 52 coelhos. Em 10 deles, transplantou-se
membrana amniótica de coelha, enquanto que nos outros 42 coelhos foram utilizadas células
límbicas colhidas do olho direito expandidas em membrana amniótica de coelha para o
transplante. Foram avaliados parâmetros clínicos para determinação de sucesso parcial ou
total e de insucesso no tratamento proposto. O fenótipo epitelial foi determinado por meio de
imunohistoquímica. No grupo no qual foi utilizada apenas a membrana amniótica de coelha,
observaram-se 100% de insucesso, prevalecendo epitélio conjuntival nas provas
imunohistoquímicas. A porcentagem de sucesso observada nos grupos de animais nos quais
células límbicas expandidas foram transplantadas juntamente com a membrana amniótica foi
de 26% e a presença do tipo epitelial corneal determinado pelas provas imunohistoquímicas
extremamente alta. Esses pesquisadores concluíram que existe forte correlação entre o
sucesso clínico e o fenótipo epitelial corneal resultante.
28
Em Medicina Veterinária, a membrana amniótica foi utilizada preservada em glicerina
no reparo de feridas cutâneas de membros locomotores de eqüinos (OLIVEIRA;
ALVARENGA, 1998).
Em Oftalmologia Veterinária, Barros et al. (1998) descreveram a utilização
experimental da membrana amniótica xenógena (eqüina) para a reparação de perfuração
corneal criada por ceratectomia penetrante em cães, com ótimos resultados anatômicos e
funcionais. Safatle (1998) estudou comparativamente a capacidade angiogênica do pericárdio
e da membrana amniótica de eqüino em córnea de ratos, concluindo que ambas as membranas
induziram angiogênese, sendo porém a provocada pela implantação de pericárdio xenógeno
mais intensa e mais duradoura do que a da membrana amniótica xenógena.
Godoy (2001), realizou estudo da viabilidade da aplicação da membrana fetal
(membrana amniótica, córion e alantóide) eqüina como enxerto em ceratoplastia lamelar em
cães, obtendo bons resultados, não evidenciando reação de rejeição do material implantado.
Souza (2003), comparou os efeitos dos enxertos de membranas amniótica e
alantoamniótica alógenas preservadas em glicerina, em ceratoplastia lamelar em cães,
concluindo que as membranas implantadas evoluíram de forma semelhante, foram bem
toleradas e constituem métodos de real valor na reparação da córnea.
No mesmo ano, Freddo discorreu sobre a avaliação do efeito da ciclosporina A a 0,2%
tópica sobre a neovascularização em córnea de ratos após implante de membrana amniótica
xenógena em microbolsa no estroma corneal, cuja conclusão foi de que a membrana
amniótica induziu neovascularização corneal até o 15ª dia de pós-operatório, com posterior
regressão e que o uso da Ciclosporina A 0,2% intensificou o processo de neovascularização
até o 7ª dia de pós-operatório, mas após esse período, a diminuição dos neovasos foi mais
rápida e intensa do que a que ocorreu no grupo controle.
29
Recentemente, Barros et al. (2005) relataram o transplante de membrana amniótica
canina para a reconstrução da superfície ocular em cão com ceratomalácia bolhosa severa, em
gato com anquilobléfaro e após ressecção de histiocitoma esclero-corneal de cão, com ótimos
resultados.
2.5 Características da membrana amniótica
Cotejando-se os vários estudos que utilizaram a membrana amniótica, pode-se
concluir que ela possui várias características inerentes que a tornam um bom material para o
tratamento de diversas oftalmopatias. Deve-se salientar que alguns mecanismos de ação da
membrana amniótica são descritos por meio de dedução de acordo com sua composição e não
por meio de provas científicas de sua aplicação em cirurgias oculares.
A membrana amniótica é um material biológico de fácil obtenção com
disponibilidade quase ilimitada (DUA; AZUARA-BLANCO, 1999; SHIMAZAKI;
SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998); pode ser preservada em glicerina a 98% para uso em
Medicina Veterinária (BARROS et al., 1998; GODOY, 2001; SOUZA, 2003); para sua
utilização em humanos, ela tem sido conservada a –80ºC, por vários meses (DUA;
AZUARA-BLANCO, 1999; DUA et al., 2004; KIM; TSENG, 1995; SHIMAZAKI; YANG;
TSUBOTA, 1997).
Não provoca rejeição imunológica pós-transplante (ADINOLFI et al., 1982;
AZUARA-BLANCO et al., 1999), provavelmente por ser um tecido imune-privilegiado
(KUBO et al., 2001); possui propriedades antimicrobianas, reduzindo o risco de infecções
pós-cirúrgicas (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979).
Possui atividade antifibroblástica (KIM et al., 1998; TSENG; LI; MA, 1999; TSENG
et al., 1998). Fibrose é conseqüência comum no processo de cicatrização após uma variedade
30
de insultos patológicos. Ela envolve processos biológicos complexos mediados por
citoquinas, dentre elas o TGF-β (fator de crescimento transformante). Sua expressão aberrante
tem sido implicada em diversas lesões fibróticas e inflamatórias. O TGF-β estimula a síntese e
a deposição de várias proteínas da matriz extracelular, acompanhadas pelo aumento na síntese
de inibidores de proteases, regulando moléculas de adesão celular e suprimindo a síntese de
proteases degradadoras de matriz. Coletivamente, essas ações resultam em aumento das
interações e adesividade da matriz celular levando à fibrose (TSENG; LI; MA, 1999).
Tseng, Li e Ma (1999) demonstraram que a matriz da membrana amniótica suprime o
sistema de sinalização do TGF-β, a síntese de DNA e subsequente diferenciação
miofibroblástica, o que explica, em parte, os resultados de diminuição da fibrose com o uso da
membrana amniótica em cirurgias de reconstrução da superfície ocular. Pode explicar também
porque a cura de feridas em fetos não produz cicatriz.
O estroma da membrana amniótica é normalmente avascular e acredita-se que ele
inibe a incursão de novos vasos. Serve de substrato para o restabelecimento das camadas da
córnea (BARROS et al.,1998; SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997) podendo o
transplante de membrana amniótica ser considerado como um “transplante de substrato”
(SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997); sendo capaz de substituir algumas propriedades
da membrana basal corneal (SHIMAZAKI; SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998), de promover a
diferenciação epitelial (GRUETERICH; ESPANA; TSENG, 2003; KURPAKUS et al.,
1992;), e de impedir a apoptose epitelial (CHEN et al., 2000).
A membrana amniótica serve como uma membrana basal transplantada, atuando como
substrato saudável apropriado para a adequada epitelização. Além disso, a membrana
amniótica produz vários fatores de crescimento, como o fator de crescimento fibroblástico,
fator de crescimento do hepatócito e fator de crescimento transformante beta, o que pode
estimular a epitelização (CHEN et al., 2000; DUA; AZUARA-BLANCO, 1999). A
31
membrana basal da membrana amniótica pode prolongar a vida das células epiteliais
progenitoras (CHEN et al., 2000) e quando transplantada sobre a superfície ocular não induz
alteração na concentração de proteoglicanos (ANDRADE, 2003).
Possui efeito antiadesivo (AZUARA-BLANCO et al., 1999; SHIMAZAKI;
SHINOZAKI; TSUBOTA, 1998; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979); promove
redução da dor (AZUARA-BLANCO et al., 1999; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER,
1979), o que pode ser explicado pela restauração do epitélio corneal (PIRES et al.,1999),
proteção da ferida (AZUARA-BLANCO et al., 1999; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER,
1979), redução da inflamação (PIRES et al., 1999), redução da vascularização (SHAO et al.,
2004) e da cicatrização (TSENG; LI; MA, 1999).
Solomon et al. (2001) demonstraram in vitro que a matriz da membrana amniótica
suprime regulação induzida por lipopolissacarídeos de interleucinas 1α e 1 β em cultura de
células epiteliais corneais límbicas, explicando, em parte, o efeito do transplante de membrana
amniótica de reduzir inflamação da superfície ocular.
A membrana amniótica especificamente inibe o crescimento de células endoteliais e
assim suprime a neovascularização da córnea, pois ela libera o fator derivado do epitélio
pigmentar (PEDF), fator essencial para a manutenção da avascularidade da córnea e do vítreo
(SHAO et al., 2004).
Cobrindo-se áreas inflamadas ou expostas com a membrana amniótica, isto é como
uma bandagem biológica, influencia positivamente o processo de cura, bem como tem um
efeito favorável na diminuição da dor e do desconforto (DUA et al., 2004).
A matriz estromal da membrana amniótica contém também várias formas de
inibidores de proteases, importantes para promover a cura epitelial e reduzir a inflamação e a
ulceração (PIRES et al., 1999). Kim et al. (2000) comprovaram, por meio de modelo
experimental de queimadura química em coelhos, que a membrana amniótica aplicada na
32
forma de patch estimula a cicatrização e inibe a atividade de proteases. O grupo de animais no
qual foi feita apenas a injúria ocular demonstrou maior quantidade de células
polimorfonucleares e atividade de proteases muito maior que os grupos que receberam patch
de membrana amniótica. Provavelmente, os efeitos terapêuticos da membrana amniótica
sejam conseqüência de inibição da infiltração de células polimorfonucleares e da atividade de
proteases.
Muitos dos trabalhos científicos foram realizados utilizando o coelho como modelo
experimental (AVILA et al., 2001; HE et al., 1999; KIM; TSENG, 1995; KIM et al., 2000;
KIM et al., 2001; MARINHO et al., 2003; NAKAMURA et al., 2003; NAKAMURA et al.,
2004; TI et al., 2002; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001). A córnea do coelho possui
diâmetro horizontal de 15mm e vertical de 13,5-14mm, sendo um pouco ovalada. A espessura
é de apenas 0,4mm em média, com a camada epitelial perfazendo 30-40 µm, a estromal no
mínimo 0,24 mm (90% da espessura total), a membrana de Descemet 7-8 µm e o endotélio 3-
5 µm. A presença da camada de Bowman é questionável nessa espécie, sendo mais aceita
como inexistente, pois não é evidente à microscopia eletrônica como a observada no homem.
Após a remoção do epitélio corneal, sua regeneração é processada rapidamente e só cessa
quando a espessura da camada atinge aproximadamente 200% da espessura original, o que se
completa em cerca de 24 horas após o trauma. Após 1-4 dias, a camada epitelial recupera sua
espessura original (PRINCE, 1964).
Contudo, como mencionado anteriormente, muitas das pesquisas realizadas podem ter
conferido resultados distorcidos devido à utilização de membrana amniótica xenógena, fato
que contribuiu para a investigação comparativa dos efeitos dos enxertos de membranas
amnióticas humana e de coelha em córnea de coelhos.
33
3 MATERIAL E MÉTODO
Para a realização do projeto, foram utilizados coelhos albinos da raça Nova Zelândia
como modelo experimental. Esses animais foram divididos em 2 grupos para serem
submetidos à ceratoplastia lamelar utilizando membrana amniótica de origem humana e de
coelha. Realizaram-se avaliações clínicas durante os períodos de evolução e microscópicas
pós-morten.
3.1 Animais
Foram utilizados 32 coelhos , raça Nova Zelândia, adultos jovens, com peso médio de
1,5 - 2,0 kg, obtidos de criatório particular, de acordo com as normas da ARVO (Association
for Research in Vision and Ophthalmology) para a realização de pesquisa com
experimentação em animais. Foi eliminada qualquer possibilidade de alterações sistêmicas
que pudessem comprometer o desenvolvimento do experimento, bem como quaisquer
alterações oculares, por meio de exame clínico e oftalmológico que consistiu em exame
biomicroscópico com lâmpada de fenda , teste de fluoresceína, tonometria por aplanação e
fundoscopia direta e indireta.
3.2 Grupos experimentais
Para a avaliação de cada membrana foram utilizados 16 animais divididos em grupos
de 4 animais cada, que tiveram períodos de observação distintos de 2, 7, 15 e 30 dias.
Convencionou-se chamar o grupo da membrana amniótica humana de gupo I MAH e o da
membrana amniótica de coelha de grupo II MAC (Quadro 1).
34
Grupo I MAH - Membrana Amniótica Humana
EVOLUÇÃO COELHO
2 DIAS 22 DIAS 302 DIAS 312 DIAS 327 DIAS 17 DIAS 37 DIAS 117 DIAS 1415 DIAS 515 DIAS 815 DIAS 1215 DIAS 1530 DIAS 430 DIAS 930 DIAS 1030 DIAS 13
G II MAC - Membrana Amniótica de Coelha
EVOLUÇÃO COELHO
2 DIAS 212 DIAS 222 DIAS 232 DIAS 257 DIAS 167 DIAS 197 DIAS 207 DIAS 2415 DIAS 615 DIAS 715 DIAS 1715 DIAS 1830 DIAS 2630 DIAS 2730 DIAS 2830 DIAS 29
Quadro 1 - Constituintes dos grupos experimentais GI MAH (membrana amniótica humana) e
GII MAC (membrana amniótica de coelha), São Paulo, 2005
35
3.3 Obtenção da membrana amniótica
As membranas amnióticas humanas foram obtidas por doação feita pelo Laboratório
de Doenças Externas Oculares do setor de Patologias Externas e Córnea, do Departamento de
Oftalmologia da UNIFESP.
As placentas humanas foram obtidas de operação cesariana e lavadas com solução
fisiológica 0,9% em ambiente estéril. A membrana amniótica foi separada do restante dos
envoltórios fetais, por meio de dissecação romba e foi estendida sobre papel filtro de
nitrocelulose estéril (Micropore, Bedfort, MA, EUA) com a face epitelial para cima. A
membrana amniótica e o filtro foram lavados com solução tampão fosfato contendo 1000U/ml
de penicilina, 20µg/ml de estreptomicina e 2,5µg/ml de anfotericina B. Fragmentos de
aproximadamente 5cmX5cm foram cortados e colocados em recipiente estéril contendo
glicerol (Baxter Healthcare corporation, Stone Mountain, GA, EUA) e meio de preservação
de córnea (Ophthalmos, São Paulo, SP, Brasil), na proporção 1:1 e congelados a -80ºC
(GOMES et al., 1999).
A placenta de coelha foi obtida após ovariosalpingohisterectomia de coelha com 28
dias de gestação. Após a separação da membrana amniótica dos outros envoltórios, seguiu-se
o mesmo protocolo de preparação utilizado para a membrana amniótica humana, excetuando-
se o recorte dos fragmentos que foi de 3cmX3cm.
3.4 Procedimento cirúrgico
Após jejum alimentar de 2 horas, foi feita pré-medicação anestésica com
acepromazina - 0,4mg/kg associada a meperidina 10mg/kg via intramuscular. Nesse mesmo
36
momento, instilou-se colírio anestésico à base de cloridrato de proparacaína. Após 15
minutos, realizou-se a indução com a associação de ketamina 10mg/kg com midazolan 0,3
mg/kg por via intravenosa. A manutenção foi feita com ketamina 5-10mg/kg por via
intravenosa, com reaplicações quando necessário. Foi mantida infusão intravenosa de solução
ringer lactato. Foi administrado flumixin meglumine 1mg/kg por via intravenosa, na veia da
orelha. Com o animal anestesiado, procederam-se a antissepsia, a colocação dos campos
operatórios e a blefarostase.
Convencionou-se realizar a cirurgia apenas no olho direito, evitando maiores
desconfortos para o animal. Devido a insucesso da cirurgia no olho direito do coelho nº 26,
realizou-se cirurgia no olho esquerdo desse animal.
3.5 Ceratoplastia
Sob aumento de 10x do microscópio cirúrgico, produziu-se inicialmente uma
ceratectomia com o auxílio de trépano de Castroviejo 5 mm de diâmetro, de forma
semipenetrante em região temporal superior, com profundidade de 0,1mm, que serviu de leito
para o implante do fragmento da membrana amniótica humana ou de coelha. O recorte da
membrana amniótica humana foi feito com trépano de 5mm, e a de coelha com trépano de
6mm, devido às diferenças de elasticidade das duas membranas e para permitir um perfeito
posicionamento. A fixação do enxerto foi efetuada com ponto contínuo, utilizando-se fio de
mononylon 10-0 encastoado de fábrica.
No período pós-operatório, os animais foram mantidos em gaiolas individuais. Colírio
de tobramicina foi instilado 3 vezes ao dia na primeira quinzena. Não houve a necessidade de
colar elizabetano.
37
3.6 Avaliação macroscópica
Os animais foram avaliados com o auxílio de biomicroscópio com lâmpada de fenda
portátil a intervalos de 24 horas na primeira semana e posteriormente, a cada 3 dias até serem
eutanasiados de acordo com os períodos de evolução.
Na avaliação diária, foram observados sinais de fotofobia, blefarospasmo, secreção
ocular (presença e tipo), edema, hiperemia conjuntival, neovascularização, permanência e
viabilidade do enxerto. As alterações foram designadas por valores de graduação subjetivos
(0) ausente; +(1): discreto; ++(2): moderado; +++(3): intenso).
3.7 Avaliação microscópica
Após o término dos períodos pré-estabelecidos, os animais foram submetidos à
eutanásia, com anestesia profunda com tiopental sódico e parada cardiorrespiratória
provocada por injeção intravenosa de cloreto de potássio 19,1%. A seguir, procedeu-se a
trepanação da córnea contendo região de transição esclero-corneal (Figura 1), fixando-a em
glutaraldeído 2% tamponado. O material foi mantido sob refrigeração a 4ºC até a confecção
das lâminas.
O material fixado foi processado para avaliação em microscopia óptica (HE, método
de picrosirius e coloração com alcian blue).
Nos cortes corados com hematoxilina-eosina, além da análise descritiva dos
fenômenos decorrentes da enxertia, realizou-se a contagem das células inflamatórias que
invadiram o estroma (CHOI et al., 1998), e vasos presentes no estroma corneano com o
auxílio do programa Image Pro Plus acoplado a Microscópio óptico Nikon E-800. A área de
38
enxertia foi dividida em pequenas áreas (35401,2µ cada área) e cinco dessas pequenas áreas
(177006µ a área total), distribuídas ao longo do local do enxerto, foram examinadas sob
aumento de 20x . Padronizou-se descartar as áreas referentes aos pontos de sutura.
O método de picrosirius permitiu, sob luz polarizada, a demonstração do colágeno
presente (DAGLI et al., 1998; SIEVERT et al., 1998). Sugere-se que as fibras espessas de
tonalidade laranja avermelhada visibilizadas por esse método sejam colágeno tipo I, enquanto
que as menos espessas de tonalidade esverdeada sejam colágeno tipo III (MASSIRONI et al.,
2005). O método de coloração utilizando Alcian blue cora glicosaminoglicanos ácidos em
azul (MASSIRONI et al., 2005) permitindo demonstrar a distribuição e caracterização das
proteoglicanas (TAWARA et al., 1996).
Amarelo: esclera
Azul: limbo (junção esclero-corneal)
Verde: tecido implantado
Vermelho: corte
Figura 1 - Representação esquemática do material para o estudo histopatológico
3.8 Análise estatística
Os valores obtidos na contagem de células inflamatórias e vasos presentes nos cortes
histológicos dos diferentes animais foram submetidos ao teste para amostras não paramétricas
de Mann-Whitney. Se p≤ 0,05 foi encontrado, os resultados foram considerados
significativos.
39
4 RESULTADOS
Os resultados do projeto foram obtidos por avaliações macroscópica e microscópicas e
foram submetidos a análise estatística descritas a seguir.
4.1 Avaliação macroscópica
Todos os animais do grupo I MAH permaneceram isentos de desconforto ocular
durante todo o período de evolução, enquanto que no grupo II MAC, os coelhos 28 e 29
apresentaram blefarospasmo leve aos 15 dias de evolução, porém ausente aos 30 dias. O
coelho 27, por sua vez, apresentou blefarospasmo nos últimos dias de evolução, estando
evidente no momento de sua eutanásia (Quadros 2A e 2B e Gráficos 1 e 2).
Quanto à secreção, no grupo I MAH os coelhos 2 e 4 apresentaram secreção mucosa
moderada, nas primeiras horas do experimento. No grupo II MAC, os coelhos 26 e 27
apresentaram secreção discreta aos 15 dias, a qual evoluiu para intensa aos 30 dias. No coelho
28, observou-se discreta secreção mucosa aos 15 e aos 30 dias (Quadros 3A e 3B e Gráficos
3 e 4).
A hiperemia foi evidente logo nos primeiros dias apenas nos coelhos 2 e 4 do grupo I
MAH, em grau moderado. Os coelhos 6,7, 23 e 25 do grupo II MAC apresentaram grau leve
nos primeiros dias, com remissão completa logo em seguida. O coelho 27 apresentou grau
moderado de hiperemia aos 30 dias de evolução (Quadros 4A e 4B e Gráficos 5 e 6).
O grau de opacidade se manteve praticamente inalterado, considerado leve em todos
os animais do grupo II MAC, durante todos os períodos experimentais. No grupo I MAH, a
maioria dos animais apresentou grau leve de opacidade com exceção de 5 animais(1,3,4,5,11)
40
aos 7 dias, 3(9,10,13) aos 15 dias e 1(9) aos 30 dias, com grau moderado. Apenas 1 animal
apresentou opacidade mais intensa, o coelho 13 do grupo I MAH, aos 30 dias de
evolução(Quadros 5A e 5B e Gráficos 7 e 8).
A formação de vasos na córnea, para os grupos I MAH e II MAC, progrediu de
acordo com a evolução do experimento, sendo discreta aos 15 dias e exuberante aos 30 dias.
Os animais do grupo II MAC não exibiram neovasos nos primeiros dias de pós-operatório
(Quadros 6A e 6B e Gráficos 9 e 10).
41
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
ANIMAIS
4 2 0 0 09 0 0 0 010 0 0 0 013 0 0 0 05 0 0 08 0 0 012 0 0 015 0 0 01 0 03 0 011 0 014 0 02 230 031 032 0
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 2A - Demonstrativo do grau de
fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005.
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
ANIMAIS
26 0 0 0 027 0 0 0 228 0 0 1 029 0 0 1 06 0 0 07 0 0 017 0 0 018 0 0 016 0 019 0 020 0 024 0 021 022 023 025 0
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 2B - Demonstrativo do grau de
fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005.
42
Gráfico 1 - Representação gráfica do fenômeno fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
Gráfico 2 - Representação gráfica do fenômeno fotofobia/blefarospasmo de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
0
1
2
evolução
blefarospasmo MAH
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
0
1
2
evolução
blefarospasmo MAC
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
43
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIASANIMAIS
4 2 0 0 09 0 0 2 010 0 1 2 013 0 0 0 25 0 1 28 0 0 112 0 0 315 1 0 01 0 23 0 011 0 014 1 02 230 131 232 3
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 3A - Demonstrativo do grau de
secreção de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo. SP, 2005.
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIASANIMAIS
26 0 0 1 327 0 0 1 328 0 0 1 229 0 0 0 06 0 0 07 0 0 017 0 0 018 0 0 016 0 119 0 120 0 024 0 021 022 023 025 0
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 3B - Demonstrativo do grau de
secreção de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo. SP, 2005.
44
Gráfico 3 - Representação gráfica do fenômeno secreção ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
Gráfico 4 - Representação gráfica do fenômeno secreção ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
0
0,5
1
1,5
evolução
secreção MAH
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
0
0,5
1
1,5
2
evolução
secreção MAC
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
45
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
ANIMAIS
4 3 0 0 09 0 0 2 210 0 0 0 213 0 0 0 05 1 0 08 1 0 012 0 0 315 1 0 01 1 03 1 011 0 214 0 22 230 031 032 0
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 4A - Demonstrativo do grau de
hiperemia conjuntival de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
ANIMAIS
26 0 0 0 027 0 0 0 228 0 0 0 029 0 0 0 06 1 0 07 1 0 017 0 0 018 0 0 016 0 019 0 020 0 024 0 021 022 023 125 1
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 4B - Demonstrativo do grau de
hiperemia conjuntival de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
46
Gráfico 5 - Representação gráfica do fenômeno hiperemia ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
Gráfico 6 - Representação gráfica do fenômeno hiperemia ocular de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
0
1
2
evolução
hiperemia MAH
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
0
1
2
evolução
hiperemia MAC
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
47
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DAS 30 DIASANIMAIS
4 1 2 1 19 1 1 2 210 1 1 2 113 1 1 2 35 1 2 18 1 1 112 1 1 115 1 1 11 1 23 1 211 1 214 1 12 130 131 132 1
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 5A - Demonstrativo do grau de
opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIASANIMAIS
26 1 1 1 127 1 1 1 128 1 1 1 129 1 1 1 16 1 1 17 1 1 117 1 1 118 1 1 116 1 119 1 120 1 124 1 121 122 123 125 1
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso
Quadro 5B - Demonstrativo do grau de opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
48
Gráfico 7 - Representação gráfica do fenômeno opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005.
Gráfico 8 - Representação gráfica do fenômeno opacidade em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005.
00,5
1
1,5
2
evolução
opacidade MAH
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
0
1
2
evolução
opacidade MAC
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
49
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIASANIMAIS
4 0 0 1 29 0 1 2 310 0 1 2 213 0 1 2 35 0 0 18 0 0 212 0 1 315 0 1 21 0 03 0 011 0 114 1 22 030 031 032 2
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 6A - Demonstrativo do grau de
neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
EVOLUÇÃO 2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIASANIMAIS
26 0 1 2 327 0 1 1 228 0 1 1 229 0 1 1 16 0 0 27 0 1 217 0 0 118 0 0 116 0 119 0 120 0 124 0 121 022 023 025 0
0 - Ausente 1 - Discreto 2 - Moderado 3 - Intenso Quadro 6B - Demonstrativo do grau de
neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
50
Gráfico 9 - Representação gráfica do fenômeno neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
Gráfico 10 - Representação gráfica do fenômeno neovascularização em córnea de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
0
1
2
3
evolução
neovascularização MAH
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
0
1
2
3
evolução
neovascularização MAC
2 dias
7 dias
15 dias
30 dias
51
CÓRION
FETO ENVOLTO POR LÍQ.AMNIÓTICO E MEMB. AMNIÓTICA
Figura 2 - Feto de coelho com 28 dias de gestação, envolto por líquido amniótico, membrana amniótica. O córion está separado acima
MEMB.AMNIÓTICA
Figura 3 - Membrana Amniótica em destaque
52
Figura 4 - Fotografia correspondente a 2 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se bom posicionamento do enxerto no leito corneal. Pequena quantidade secreção mucosa aderida ao nó
Figura 5 - Fotografia correspondente a 2 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Bom posicionamento do enxerto no leito corneal
Figura 6 - Fotografia correspondente a 7 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se opacidade evidente na região do implante. Sutura presente
Figura 7 - Fotografia correspondente a 7 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Observam-se neovasos invadindo a área do implante. Sutura começando a se desprender na região ventral
53
Figura 8- Fotografia correspondente a 15 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Observa-se pequena quantidade de neovasos invadindo área de enxertia. Sutura frouxa
Figura 9- Fotografia correspondente a 15 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Observam-se poucos neovasos invadindo a érea de enxertia. Sutura frouxa
Figura 10 - Fotografia correspondente a 30 dias de evolução de implante de membrana amniótica humana. Área mais opaca e levemente irregular onde foi realizada a ceratoplastia, com a presença de neovasos. Ausência do fio de sutura
Figura 11 - Fotografia correspondente a 30 dias de evolução de implante de membrana amniótica de coelha. Área mis opaca e levemente irregular onde foi realizada a ceratoplastia, com a presença de neovasos. Fio de sutura preso apenas na região dorsal do enxerto
54
4.2 Avaliação microscópica
A representação dos resultados obtidos da observação histológica da área do
implante foi feita de forma descritiva, obedecendo à ordem crescente de cada etapa
experimental.
Aos dois dias de implante, em ambos os grupos, foi possível observar o tecido
implantado, caracterizado por matriz extracelular amorfa, acidófila, abundante.
Imediatamente abaixo, observou-se migração e invasão de células inflamatórias junto ao
tecido de implante (Figura 12). Logo acima do tecido implantado, observou-se camada
única ou dupla de epitélio plano (Figura 12C). No corte histológico representativo do
animal 23 do grupo II MAC, uma camada mais evidente de células epiteliais foi notada
entremeando o tecido implantado. (Figura 12F)
No período de 7 dias, o tecido implantado apresentava-se integrado ao tecido
autóctone, o qual exibia remanescentes que eram ainda evidenciados por áreas de material
amorfo e acidófilo (seta). Toda a superfície encontrava-se epitelizada com epitélio plano
estratificado. Havia numerosos elementos celulares infiltrando a área do implante (Figura 13).
Com a objetiva de maior aumento, observou-se no tecido implantado células com
morfologia de fibroblastos, denotando proliferação desses elementos sobre o substrato que era
representado pelo tecido implantado. (Figura 13C e 13F)
Aos 15 dias de evolução, no corte histológico representativo do grupo I MAH, notou-
se a presença da membrana amniótica totalmente integrada, caracterizada por áreas de
material amorfo acidófilo, apresentando descontinuidade em sua extensão. A superfície
corneal apresentava-se completamente epitelizada com epitélio do tipo pavimentoso
estratificado. Nas áreas subjacentes ao enxerto, observaram-se muitos elementos celulares de
55
natureza inflamatória, bem como células com morfologia de fibroblastos. Na periferia do
corte, visibilizou-se imagem negativa do ponto de sutura circundado por intenso infiltrado
inflamatório (Figura 14A, 14B, 14C).
No corte representativo do grupo II MAC, não se observou a membrana com a mesma
definição observada no representante do grupo I MAH. Constatou-se uma faixa delgada de
material amorfo acelular imediatamente abaixo da camada epitelial, o que sugeria ser
resquícios da membrana amniótica utilizada como enxerto. O epitélio foi caracterizado por
tipo pavimentoso estratificado e no estroma subjacente à área de implante, notaram-se
numerosas células inflamatórias e outras com morfologia de fibroblastos. Na periferia do
corte, pôde-se notar imagem negativa do ponto de sutura com moderado infiltrado
inflamatório circunjacente (Figura 14D, 14E, 14F) .
Aos 30 dias de evolução, em ambos os grupos, observou-se a membrana amniótica
integrada e bem definida, sob epitélio pavimentoso estratificado (Figura 15). No corte
histológico representativo do grupo I MAH, observou-se intenso infiltrado de células
inflamatórias no estroma subjacente à área de enxertia (Figura 15A, 15B, 15C). No corte
histológico do grupo II MAC, observaram-se resquícios da membrana amniótica, com células
com morfologia de fibroblastos e moderado infiltrado inflamatório no estroma, tanto acima,
quanto abaixo do tecido implantado. Na periferia do corte, observou-se infiltrado inflamatório
intenso correspondente ao ponto de sutura (Figura 15D, 15E, 15F).
Os cortes avaliados sob luz polarizada corados com picrosírius, demonstraram a
membrana amniótica em tonalidade alaranjada, avermelhada, o que pode sugerir presença de
colágeno tipo I (Figura 16).
Nos cortes histológicos corados com Alcian blue, observou-se a membrana amniótica
na tonalidade rosada e áreas onde o colágeno provavelmente estava se remodelando
56
impregnadas pelo corante azul, sugerindo a presença de glicosaminoglicanas ácidas nesses
locais (Figura 17).
A contagem de células inflamatórias e vasos presentes no estroma adjacente à área de
enxertia realizada com o auxílio do programa Image-Pro Plus acoplado ao microscópio óptico
Nikon E-800, revelou uma variação tanto individual quanto entre os grupos I e II (Quadro 7 e
Gráficos 11-14). No grupo I MAH, observou-se uma contagem mais expressiva em relação ao
grupo II MAC.
A presença da membrana amniótica foi observada em 11 dos 15 animais do grupo I
MAH e em 11 dos 16 animais do grupo II MAC (Quadros 8 e 9). A espessura do tecido
integrado ao estroma era evidentemente maior nos representantes do grupo I MAH.
4.3 Análise estatística
Os valores obtidos na contagem de células inflamatórias e vasos presentes nos cortes
histológicos dos diferentes animais (Quadro 7) foram submetidos ao teste não paramétrico de
Mann-Whitney.
Em relação às células inflamatórias, a comparação entre os animais do subgrupo 2 dias
com os de 7 dias, do subgrupo 7 dias com os de 15 dias e os do subgrupo 15 dias com os de
30 dias de cada grupo separadamente, não apresentou diferença significativa, isto é Z<2 e p>
0,05.
Ainda em relação às células inflamatórias, fazendo-se a comparação entre os grupos I
MAH e II MAC, com 2 dias e 7 dias não houve diferença estatística significativa (Z<2 e p>
0,05). Porém, a diferença foi significativa ao se compararem grupos I MAH e MAC com 15 e
com 30 dias de evolução (Z= 2,02 e p= 0,043 (<0,05)).
57
A contagem do número de vasos observados nos dois grupos demonstrou diferença
significativa entre os dois grupos nos períodos de evolução de 15 e de 30 dias (p<0,05).
No grupo I MAH, houve ainda diferença significativa intra-grupo dos animais com
período de evolução de 30 dias quando comparado com os demais períodos de evolução para
vasos na córnea.
No grupo II MAC, a comparação entre os animais com períodos de evolução
diferentes dentro do mesmo grupo não demonstrou diferença significativa.
58
MAH CEL INF VASOS MAC CEL INF VASOS
2 DIAS 2 415 4 2 DIAS 21 174 12 DIAS 30 103 0 2 DIAS 22 68 02 DIAS 31 144 0 2 DIAS 23 173 12 DIAS 32 40 0 2 DIAS 25 264 0
7 DIAS 1 58 4 7 DIAS 16 111 27 DIAS 3 65 1 7 DIAS 19 354 47 DIAS 11 198 0 7 DIAS 20 7 07 DIAS 14* ... ... 7 DIAS 24 0 0
15 DIAS 5 1614 10 15 DIAS 6 32 015 DIAS 8 192 0 15 DIAS 7 102 015 DIAS 12 158 2 15 DIAS 17 28 015 DIAS 15 60 5 15 DIAS 18 0 0
30 DIAS 4 807 12 30 DIAS 26 350 230 DIAS 9 1148 6 30 DIAS 27 3 030 DIAS 10 292 16 30 DIAS 28 108 330 DIAS 13 1144 27 30 DIAS 29 119 0
* lâmina perdida Quadro 7 - Contagem do número de células inflamatórias e de vasos em 177006µ de área total
por lâmina, segundo período de evolução de cada grupo experimental. São Paulo, SP, 2005
59
Gráfico 11 - Representação gráfica da contagem de células inflamatórias em amostras
representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
CÉLULAS INFLAMATÓRIAS - MAH
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
GRUPOS
QT
E C
ÉL
CÉLULAS INFLAMATÓRIAS - MAC
0
50
100
150
200
250
300
350
400
2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
GRUPOS
QT
E C
ÉL
60
Gráfico 12 - Representação gráfica da contagem de células inflamatórias em amostras
representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
Gráfico 13 - Representação gráfica da contagem de vasos em amostras representativas de
córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica humana. São Paulo, SP, 2005
NEOVASOS - MAH
0
5
10
15
20
25
30
2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
GRUPOS
QT
E V
ASO
S
61
Gráfico 14 - Representação gráfica da contagem de vasos em amostras representativas de córneas de coelhos submetidos a ceratoplastia lamelar com enxerto de membrana amniótica de coelha. São Paulo, SP, 2005
MAH ANIMAIS PRESENÇA MAH2 DIAS 2 SIM 2 DIAS 30 SIM 2 DIAS 31 SIM 2 DIAS 32 SIM 7 DIAS 1 NÃO7 DIAS 3 SIM 7 DIAS 11 SIM 7 DIAS 14* ...15 DIAS 5 NÃO15 DIAS 8 SIM 15 DIAS 12 SIM 15 DIAS 15 SIM 30 DIAS 4 SIM 30 DIAS 9 NÃO30 DIAS 10 NÃO30 DIAS 13 SIM
* lâmina perdida Quadro 8 - Presença da membrana
amniótica humana de
acordo com o período de evolução. São Paulo, SP, 2005
NEOVASOS - MAC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
2 DIAS 7 DIAS 15 DIAS 30 DIAS
GRUPOS
QT
E V
ASO
S
62
MAC ANIMAIS PRESENÇA MAC2 DIAS 21 SIM2 DIAS 22 SIM2 DIAS 23 SIM2 DIAS 25 SIM7 DIAS 16 SIM7 DIAS 19 SIM7 DIAS 20 SIM7 DIAS 24 SIM
15 DIAS 6 NÃO15 DIAS 7 NÃO15 DIAS 17 SIM15 DIAS 18 NÃO30 DIAS 26 SIM30 DIAS 27 NÃO30 DIAS 28 SIM30 DIAS 29 NÃO
Quadro 9 - Presença da membrana
amniótica de coelha de acordo com o período de evolução. São Paulo, SP, 2005
C Figura 12 - legenda na página 63 Figura 13 - legenda na página 64
63
Legenda Figura 12
A - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante de membrana amniótica humana do
animal n. 31, aos 2 dias de evolução, mostrando imagem negativa do ponto de sutura, deslizamento
epitelial sobre o tecido implantado. Coloração: Hematoxilina-eosina. Aumento 4X.
B- Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior evidenciando invasão de células
inflamatórias na região do implante. Coloração HE. Aumento 10X.
C - Fotomicrografia destacando o tecido implantado (seta ) do animal n.30 aos dois dias de
evolução, com recobrimento de monocamada de epitélio. Coloração: HE. Aumento 20X.
D- Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do
animal n.23, aos dois dias de evolução, mostrando o tecido implantado caracterizado por material
amorfo e acidófilo. Coloração: HE. Aumento 4X.
E - Detalhe em maior aumento mostrando recobrimento epitelial. Aumento: 10X.
F- Em maior aumento, nota-se tecido epitelial recobrindo e entremeando o tecido implantado destacado
pelas setas ( )e células inflamatórias invadindo a área do enxerto. Coloração: HE. aumento 20X.
64
Legenda Figura13
A - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica humana aos 7 dias de
evolução do animal n.1 mostrando imagem negativa do ponto de sutura e regeneração de toda extensão da
área de enxertia por epitélio plano estratificado. Coloração: HE. Aumento 4X.
B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior onde se observa área de tecido implantado (seta
) integrado ao estroma autóctone. Coloração HE. aumento: 10X.
C - Fotomicrografia da área de enxertia do animal n.3 aos 7 dias de evolução, evidenciando a presença da
membrana amniótica humana ainda íntegra (seta ), caracterizada por material amorfo e acidófilo e
presença de células com morfologia de fibroblastos. Coloração: HE. Aumento 20X.
D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal
n.19, delimitada pelas imagens negativas dos pontos de sutura nas margens e regeneração epitelial.
Coloração: HE. Aumento 4X.
E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, destacando resquícios da membrana amniótica
(seta ), numerosas células inflamatórias e outras com morfologia de fibroblastos no estroma subjacente.
Coloração: HE. Aumento 10X.
F - Detalhe em maior aumento de remanescente da membrana amniótica de coelha mostrado na
fotomicrografia anterior. Coloração: HE. Aumento 20X.
65
Figura 14 - legenda na página 66
A B
D E
Figura 15 - legenda na página 67
A B C
F D E
C
F
66
Legenda Figura14
A - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante com membrana amniótica humana do
animal n.12 aos15 dias de evolução, mostrando tecido implantado perfeitamente integrado ao tecido
autóctone com regeneração epitelial. Imagem negativa do ponto com intenso infiltrado inflamatório
circunjacente. Coloração: HE. Aumento 4X.
B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior mostrando a membrana amniótica humana
fragmentada (seta ) e estroma adjacente sendo remodelado com inúmeras células com morfologia de
fibroblastos e células inflamatórias. Coloração: HE. Aumento 10X.
C - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando o fragmento da membrana
amniótica humana (seta ) abaixo do epitélio pavimentoso estratificado. Coloração: HE. Aumento
20X.
D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal
n. 7 aos 15 dias de evolução, mostrando epitélio regenerado, imagem negativa do ponto com infiltrado
inflamatório circunjacente e células inflamatórias em estroma. Coloração: HE. Aumento 4X.
E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, mostrando delgada faixa de material amorfo e
acelular (membrana amniótica) logo abaixo do epitélio (seta ). Coloração HE. Aumento 10X.
F - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando a membrana amniótica (seta )
abaixo do epitélio. Coloração: HE. Aumento 20X.
67
Legenda Figura15
A - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica humana aos 30 dias
de evolução mostrando a membrana amniótica íntegra abaixo do epitélio pavimentoso estratificado e
intenso infiltrado inflamatório no estroma subjacente. Coloração: HE. Aumento 4X.
B - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior destacando intenso infiltrado inflamatório.
Coloração: HE. Aumento 10X.
C - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, evidenciando infiltrado inflamatório misto,
composto por mononucleares e neutrófilos, no estroma subjacente à membrana amniótica humana
(seta ). Coloração: HE. Aumento 20X.
D - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante de membrana amniótica de coelha do animal
n.28 aos 30 dias de evolução, mostrando resquícios de material amorfo correspondente à membrana
amniótica implantada. Intenso infiltrado inflamatório na periferia do corte relativo à presença do ponto de
sutura. Coloração: HE. Aumento 4X.
E - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, destacando fragmento da membrana amniótica
de coelha (seta ) e estroma adjacente repleto de células com morfologia de fibroblastos e células
inflamatórias. Coloração: HE. Aumento 10X.
F - Detalhe em maior aumento da fotomicrografia anterior, mostrando detalhes do fragmento da membrana
amniótica de coelha (seta ) e estroma sendo remodelado. Coloração: HE. Aumento 20X.
68
A B C
Figura 17 - legenda na página 69
Figura 16- legenda na página 69
69
Legenda Figura16
A - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante aos 30 dias de evolução mostrando
tecido implantado caracterizado por material amorfo, acelular corado em vermelho (seta ).
Coloração: picrosírius. Aumento 10X.
B - Fotomicrografia do corte histológico anterior em luz polarizada, destacando a membrana
amniótica corada em laranja-avermelhado. Coloração: picrosírius. Aumento 10X.
C - Fotomicrografia de corte histológico da área de implante aos 15 dias de evolução com o tecido
implantado íntegro destacado na tonalidade laranja-avermelhada (seta ). Coloração: picrosirius.
Aumento 10X.
Legenda Figura 17
A - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante com membrana amniótica humana do
animal n.12, aos 15 dias de evolução mostrando o tecido implantado caracterizado por material
amorfo e acidófilo e ao seu redor áreas coradas pelo corante Alcian blue, sugerindo a presença de
glicosaminoglicanas ácidas nessa área de colágeno sendo remodelado. Coloração: Alcian blue.
Aumento 20X.
B - Fotomicrografia de corte histológico da área do implante de membrana amniótica de coelha do
animal n.29, aos 30 dias de evolução, mostrando área de colágeno sendo remodelado. Coloração:
hematoxilina-eosina. Aumento 20X.
C - Fotomicrografia de corte histológico da mesma área da fotomicrografia anterior mostrando a área
de colágeno remodelado corado em azul, sugerindo a participação de glicosaminoglicanas ácidas
nesse processo. Coloração: Alcian blue. Aumento 20 X.
70
5 DISCUSSÃO
A utilização da membrana amniótica na oftalmologia se consagrou como um ótimo
adjuvante no tratamento das doenças da superfície ocular na última década.
Muito do que é conhecido atualmente sobre as propriedades e efeitos dessa membrana
na superfície ocular foi resultado de pesquisas nas quais o coelho foi utilizado como modelo
experimental (AVILA et al., 2001; HE et al., 1999; KIM; TSENG, 1995; KIM et al., 2000;
KIM et al., 2001; MARINHO et al., 2003; NAKAMURA et al., 2003; NAKAMURA et al.,
2004; TI et al., 2002; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001), o qual tem-se mostrado
adequado para estudos na área da oftalmologia. Contudo, um dos fatores impedientes da
transposição dos resultados obtidos dessas investigações para a aplicação no homem é a
utilização de membrana amniótica humana (xenógena) e não de coelha (alógena) nos
experimentos, o que pode incitar reação ao enxerto xenógeno por parte do receptor (KUBO et
al., 2001).
Portanto a escolha do coelho como modelo experimental para o presente estudo,
deveu-se ao fato desse ser o animal mais utilizado nas pesquisas em oftalmologia,
principalmente nas realizadas com membrana amniótica.
Pesquisadores têm demonstrado que a membrana amniótica é um tecido imune-
privilegiado, não provocando reações esperadas para um tecido que expressa antígenos MHC
(KUBO et al., 2001). Além disso, na Oftalmologia Veterinária, o transplante de membrana
amniótica xenógena tem sido realizado com aclamado sucesso, mesmo com sua aplicação de
maneira penetrante (BARROS et al., 1998; GODOY, 2001).
É importante salientar as características estruturais das placentas nas diferentes
espécies, o que implica em maior ou menor contato das membranas fetais com a parte
materna. A placenta da mulher é do tipo hemocorial, no qual o contato com a parte materna é
71
máximo. A de coelha é hemodicorial (ENDERS; BLANKENXHIP, 1999). Já a de égua, cuja
aplicação na oftalmologia veterinária foi relatada referindo ausência de reações de rejeição, é
epiteliocoriônica, isto é, mínimo contato com a parte materna (JAINUDEEN; HAFEZ, 1988).
Portanto, as duas membranas pesquisadas possuem o mesmo grau de contato com as
estruturas maternas, a máxima.
O nível de contato com a parte materna é fator preponderante no aparecimento de
reação imune, como demonstrado com a utilização do córion - componente mais externo das
membranas fetais, que tanto alógeno, quanto autógeno é mais antigênico que o âmnion -
constituinte mais interno das membranas fetais (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979).
A opção das membranas, deveu-se à escassez de dados comparativos entre os enxertos
com membranas amnióticas de origem humana (xenógena) e de coelha (alógena).
Os únicos relatos de utilização de membrana de coelha é de Ti et al. (2002) e Ti et al.
(2004), nos quais o âmnion da coelha foi utilizado como substrato para o cultivo de células
límbicas e o tecido produzido foi implantado na córnea lesada de coelhos.
A colheita da membrana amniótica de coelha foi descrita por Ti et al. (2002),
destacando-se o pouco aproveitamento da membrana de cada feto, já que a membrana obtida
de cada coelha (4 a 8 fetos) foi suficiente para apenas 3 ou 4 "culture inserts"(30mm de
diâmetro). Membranas foram perdidas por sua extrema fragilidade e facilidade de roturas à
manipulação e outras foram descartadas devido à contaminação com mecônio. Um total de 36
coelhas prenhes foram utilizadas.
No presente estudo, apenas uma coelha aos 28 dias de prenhez (5 fetos) foi submetida
à ovariosalpingohisterectomia para a captação da membrana amniótica e, 2 das 5 membranas
foram aproveitadas, resultando num montante de 16 fragmentos de 3cmx3cm. A colheita foi
bem difícil pois é uma membrana extremamente fina e frágil. À manipulação, pôde-se notar
72
que áreas mais próximas ao cordão umbilical eram ligeiramente mais espessas e mais
resistentes que as áreas mais distantes.
Comparando-se as características, tais como espessura, elasticidade, maleabilidade da
membrana amniótica da coelha com a da mulher, pôde-se perceber que a de origem humana é
muito mais espessa e mais elástica, se prestando melhor à fixação ao leito corneal.
As técnicas anestésicas empregando-se acepromazina + meperidina (IM) como
medicação pré-anestésica e instilação de colírio anestésico; indução com ketamina +
midazolan (IV), manutenção com ketamina (IV) e administração de flumixin meglumine (IV)
no trans-operatório, resultaram em boa anestesia e analgesia para os procedimentos propostos.
Observou-se que a primeira manifestação da necessidade de reaplicação de ketamina foi leve
nistagmo observado ao microscópio. Logo a seguir, o animal saía do plano anestésico ideal.
Para a realização da ceratectomia, utilizou-se trépano de Castrovejo de 5mm de
diâmetro, com intuito de manter uniformidade na profundidade das lesões (0,1mm).
As membranas foram recortadas com trépanos de 5mm de diâmetro (humana) e 6mm
(de coelha). Essa diferença no recorte do fragmento da membrana amniótica de coelha, tendo
de ser um pouco maior que a lesão produzida por ceratectomia, deveu-se à sua pouca
elasticidade para suportar a tensão exercida pelos pontos de sutura.
Godoy (2001) referiu a utilização do recorte da membrana fetal eqüina maior que o
leito corneal para evitar qualquer defeito decorrente da retração do tecido implantado.
Nas ceratoplastias realizadas com a membrana amniótica humana, não houve
dificuldades na fixação do material biológico. Já nas realizadas com membrana de coelha, por
ser muito fina e frágil, houve um pouco mais de dificuldade na colocação dos pontos e para
não promover roturas no implante. Mesmo assim, apenas em um animal, o coelho 28, houve a
necessidade de troca da membrana no trans-operatório, pois a primeira tinha consistência
friável e não permitia sua fixação ao leito corneal. O único coelho que teve perda espontânea
73
evidente da membrana, com afrouxamento do ponto aos sete dias de evolução, foi o coelho
26. O fragmento de membrana amniótica de coelha que havia sido utilizado nessa
ceratoplastia era mais fino que outros, provavelmente fragmento oriundo de áreas mais
distantes do cordão umbilical. O coelho 26 foi submetido a novo procedimento cirúrgico com
implante de membrana amniótica de coelha no olho contralateral, tendo período de evolução
de 30 dias.
A dificuldade na utilização da membrana amniótica de coelha foi decorrente de suas
características já salientadas anteriormente, o que provavelmente tenha sido minimizado nos
experimentos realizados por Ti et al. (2002, 2004), naqueles grupos em que a membrana
amniótica de coelha foi utilizada como substrato para o cultivo de células límbicas e esse
novo tecido foi transplantado para a córnea de coelhos. Segundo Pires e Gomes (2002), a
expansão ex-vivo de células e o cultivo diretamente sobre uma membrana amniótica
modificada resulta em tecido resistente o suficiente para ser facilmente transplantado e que
biologicamente mimetiza a superfície corneal.
As membranas foram implantadas na córnea mediante fixação com ponto contínuo
não perfurante. O fio escolhido foi o mononylon 10-0 encastoado de fábrica, o qual mostrou-
se compatível com a espessura da córnea do coelho, bem como com a fragilidade dos tecidos
utilizados como enxerto. A sutura contínua foi bem tolerada pelos animais, observando-se que
o parâmetro de blefarospasmo foi praticamente inexistente no grupo I (MAH) e mínimo no
grupo II (MAC).
Ti et al. (2002, 2004) aplicaram a membrana amniótica de coelha como enxerto e a
suturaram com pontos separados junto à conjuntiva episcleral, utilizando mononylon 10-0. Ao
utilizarem o novo tecido membrana amniótica + células límbicas, as suturas foram realizadas
com mononylon 9-0 com pontos separados.
74
Nos artigos relatando a aplicação da membrana amniótica na superfície corneal de
coelhos como enxerto, esse tecido foi suturado na região episcleral e naqueles em que a
membrana amniótica foi utilizada como recobrimento, também foi suturada na região
episcleral e a membrana amniótica foi removida entre 12 e 48 horas ou 1 semana após o
procedimento (AVILA et al., 2001; CHOI et al., 1998; HE et al., 1999; KIM; TSENG, 1995;
KIM et al., 2000; KIM et al., 2001; MARINHO et al., 2003; NAKAMURA et al., 2003;
NAKAMURA et al., 2004; WANG et al., 2001; WOO et al., 2001).
A permanência do fio foi observada na maioria dos animais, exceto nos coelhos 8, no
qual o fio estava solto aos 15 dias de evolução, e no coelho 9 o ponto se soltou a partir do 21º
dia, estando ausente aos 30 dias. Sua ausência também foi observada no coelho 29 e no
coelho 26 estava parcialmente fixo à córnea, ambos aos 30 dias de evolução.
Godoy (2001) descreveu a perda espontânea dos pontos simples separados aos trinta
dias de evolução em seu experimento utilizando membrana fetal eqüina em córnea de cães.
A avaliação clínica revelou os mesmos sinais observados por outros pesquisadores
com a utilização de membrana amniótica xenógena (BARROS et al., 1998; SOUZA, 2003) e
de membrana fetal xenógena (GODOY, 2001), entretanto eles se manifestaram de maneira
mais amena do que os observados na espécie canina.
Nenhum animal apresentou sinais de blefarospasmo nos períodos iniciais, apesar do
trauma cirúrgico e exposição das terminações nervosas (POWER; NEVES, 1997), o que pode
ser decorrente da propriedade da membrana amniótica de promover redução da dor e proteger
a ferida (AZUARA-BLANCO et al., 1999; TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979).
O aparecimento de secreção foi tênue, com apenas 2 animais do grupo I MAH
apresentando grau moderado de secreção mucosa em intervalo curto de tempo. No grupo II
MAC, esse parâmetro foi observado nos períodos intermediários e tardios em três animais
apenas. Em nenhum momento evidenciou-se contaminação da secreção por meio de alteração
75
na coloração para amarelada ou esverdeada, o que pode ser explicado pelos possíveis efeitos
antimicrobianos da membrana amniótica (TRELFORD; TRELFORD-SAUDER, 1979) e,
principalmente, pela cobertura antibiótica tópica (colírio de tobramicina) na freqüência de três
vezes ao dia nos primeiros 15 dias de evolução. Ti et al. (2002) utilizaram como protocolo
terapêutico a injeção subconjuntival nos fórnices superior e inferior de 40mg de
triamcinolona, colírio de neomicina + polimixina B + sulfato de dexametasona e colírio à base
de acetato de prednisolona 1%, duas vezes ao dia por 4 a 6 semanas.
Hiperemia foi um parâmetro notado nos primeiros dias de evolução, em um número
um pouco maior de animais (7 dos 32 animais) em relação aos parâmetro anteriores, mas
nunca chegou a ser considerada intensa. À semelhança do ocorrido com os parâmetros de
blefarospasmo e secreção, um animal apresentou hiperemia conjuntival tardiamente. Souza
(2003) observou, nos cães que receberam enxertos de membranas amniótica e alantoamniótica
alógenas na córnea, graus leve a intenso na primeira semana com regressão progressiva
subseqüente.
Opacidade foi visibilizada em todos os animais, mantendo-se por todos os períodos
evolutivos de forma leve e era notada bem circunscrita à área de enxertia. Nos experimentos
realizados com membrana fetal xenógena (GODOY, 2001) e membranas amniótica e
alantoamniótica alógenas (SOUZA, 2003), a opacidade era mínima na fase final de
avaliações, isto é, 60 dias.
Neovascularização foi o único parâmetro observado em todos os animais do presente
experimento, com variabilidades individuais, mas mantendo a mesma curva de progressão
observada nos estudos com membrana fetal xenógena (GODOY, 2001) e membranas
amniótica e alantoamniótica alógenas (SOUZA, 2003) em cães. A regressão progressiva
observada nesses mesmos estudos após 30 dias de evolução, não se repetiu na presente
pesquisa, porque os animais foram mantidos para avaliação por, no máximo, 30 dias.
76
O aparecimento de blefarospasmo, bem como maior quantidade de secreção e
hiperemia em alguns animais nos períodos tardios de evolução coincidiu com a mudança do
local das gaiolas onde os coelhos 26 - 32 ficaram contidos.
À microscopia óptica, regeneração e migração epitelial sobre o tecido enxertado foram
observadas logo nos primeiros dias de pós-operatório e aos 15 dias de evolução, o
recobrimento epitelial estava completo do tipo pavimentoso estratificado, à semelhança dos
achados de Godoy (2001) e Souza (2003). Em alguns espécimes havia hiperplasia dessa
camada epitelial na área lesada. Segundo Prince (1964), a regeneração do epitélio corneal do
coelho é processada rapidamente e só cessa quando a espessura dessa camada atinge 200% da
espessura original, o que se completa em cerca de 24 horas após o trauma e após 1 a 4 dias, a
camada epitelial recupera sua espessura original.
Em amostras de olhos humanos coradas com hematoxilina-eosina avaliadas sob
microscopia óptica, 3 a 20 meses após o enxerto de membrana amniótica (GRIS, et al., 2002;
GRUETERICH et al., 2002; STOIBER et al., 2002; TOSI, et al., 2005) a epitelização da
superfície corneal encontrava-se completa, do tipo estratificado (5-6 camadas) e em alguns
locais onde havia afinamento estromal, esse epitélio apresentava hiperplasia para compensar
esse afinamento (GRIS et al., 2002).
O achado de células epiteliais envolvendo o tecido implantado encontrado em algumas
amostras coincide com o que foi descrito por Souza (2003) como "seqüestro" do implante e
pode ter sido decorrente da infiltração de células epiteliais sob a membrana no ato da sutura.
A completa reepitelização sobre a membrana amniótica de toda a área lesada
corrobora sua característica de atuar como substrato para o restabelecimento das camadas da
córnea (BARROS et al.,1998; SHIMAZAKI; YANG; TSUBOTA, 1997), sendo capaz de
substituir propriedades da membrana basal do epitélio corneal (SHIMAZAKI; SHINOZAKI;
TSUBOTA, 1998), de promover a diferenciação epitelial (GRUETERICH; ESPANA;
77
TSENG, 2003; KURPAKUS et al., 1992), e de impedir a apoptose epitelial (CHEN et al.,
2000).
A presença da membrana amniótica foi observada na maioria dos espécimes
analisados (em 11 dos 15 animais do grupo I MAH e em 11 dos 16 animais do grupo II MAC)
à microscopia óptica, caracterizada por matriz extracelular amorfa, acidófila, abundante. A
sua ausência foi observada independentemente da presença de células inflamatórias e
neovasos. Nas amostras avaliadas dos representantes do grupo I MAH, a membrana amniótica
era observada como um tecido mais espesso e mais evidente do que nas amostras dos
representantes do grupo II MAC, o que era previsto devido às características físicas de cada
membrana. Segundo Bourne, 1960, a espessura do âmnion na espécie humana varia de 0,02 a
0,5mm. Não há dados numéricos sobre a espessura da membrana amniótica da coelha, mas os
relatos a citam como sendo extremamente fina (AMOROSO, 1961).
Nas amostras que obtiveram maior contagem de células inflamatórias e vasos
invadindo o estroma, os n.5 e n.9 (1614/10 e 1148/6 células inflamatórias/vasos na área total
de 177006µ respectivamente) do grupo I MAH com evolução de 30 dias não apresentavam
resquícios da membrana amniótica enxertada. Já os animais n.4 e n.13 (807/12 e 1144/27
células inflamatórias/vasos na área total de 177006µ respectivamente) também do grupo I
MAH com evolução de 30 dias, ainda apresentavam fragmentos evidentes de membrana
amniótica humana. No grupo II MAC, a contagem não atingiu números tão expressivos
quanto do grupo I MAH, estando a membrana ausente tanto em animais com contagens altas
para o grupo (350/2 células inflamatórias/vasos na área total de 177006µ) quanto naqueles
com contagens baixíssimas (3/0 células inflamatórias/vasos na área total de 177006µ),
diferindo do que foi encontrado por Gris et al. (2002) os quais correlacionaram a ausência da
membrana enxertada em um dos casos analisados por esses pesquisadores devido à presença
de infiltrado inflamatório e vasos, aspectos não observados no outro paciente. De acordo com
78
esses pesquisadores, em córneas com vascularização estromal, o enxerto é rapidamente
absorvido devido à abundância de células inflamatórias. O oposto ocorre em córneas
avasculares, nas quais a absorção é lenta e nenhum tipo de reação inflamatória é produzida.
Stoiber et al. (2002), ao avaliarem córneas de pacientes que sofreram queimaduras
oculares 5 e 8 meses após terem recebido transplantes de membrana amniótica na superfície
ocular, relataram que no paciente com evolução de 8 meses ainda era possível observar a
membrana amniótica integrada ao estroma corneal. No outro paciente, a presença da
membrana não foi evidenciada, mas abaixo do epitélio corneal, uma camada nova semelhante
a estroma podia ser detectada, contendo poucos ceratócitos quando comparada com o
estroma subjacente.
Tosi et al. (2005) não encontraram resquícios da membrana amniótica 2 a 20 meses
após seu transplante, evidenciando sua completa integração e absorção, indicativo de que a
membrana basal da membrana amniótica promoveu a reconstrução da superfície ocular na
fase inicial e, posteriormente, a membrana amniótica, por meio de suas propriedades
biológicas, favoreceu a restauração da membrana basal pelas células epiteliais corneais basais.
A absorção da membrana amniótica em ambos os grupos ocorreu portanto de modo
variável, havendo ou não a participação de células inflamatórias nesse processo. De acordo
com Nishita (1998), na ausência de células inflamatórias atuando na degradação do colágeno
e absorção da membrana amniótica, os ceratócitos ativos possuem propriedades fagocíticas
contra o corpo estranho (membrana amniótica) e podem contribuir para a dissolução do
colágeno estromal por meio de aumento da síntese e secreção de enzimas degradadoras de
colágeno.
No presente estudo, utilizou-se o corante Alcian blue com o intuito de tornar evidente
o tecido implantado (membrana amniótica), pois segundo Stevens e Lowe (2001), esse
corante impregna em azul mucinas sulfatadas ácidas, substâncias abundantes na membrana
79
amniótica. Contudo, só observaram-se áreas coradas de azul onde o colágeno estava sendo
remodelado. A membrana amniótica era evidente no corte histológico, mas na tonalidade rosa.
Tosi et al. (2005), utilizaram o alcian blue (pH 2,5), além do tricrômio de Masson e
do ácido periódico de Shiff na tentativa de tornar evidente a membrana amniótica
transplantada para a córnea de pacientes com 2 a 20 meses de evolução pós-cirúrgica, com
base nas características desses três corantes. Nos cortes histológicos de membrana amniótica,
o estroma desse tecido foi corado em verde claro pelo tricrômio de Masson, com o alcian blue
a membrana ficou impregnada em azul devido ao seu alto conteúdo de mucinas sulfatadas
ácidas e o PAS evidenciou sua membrana basal, contudo nos cortes histológicos das córneas
dos pacientes, não houve a demonstração do tecido implantado com nenhuma das técnicas, o
que os fez concluir que a membrana amniótica já havia sido totalmente absorvida.
A não impregnação da membrana amniótica pelo alcian blue no presente estudo pode
ser devido a alguma diferença na técnica empregada em relação à utilizada por Tosi et al.
(2005), pois diferente do que foi evidenciado por esses pesquisadores de que a membrana
amniótica implantada já havia sido totalmente absorvida, em nossa pesquisa, os fragmentos de
membrana amniótica eram muito evidentes mesmo com a coloração de hematoxilina-eosina.
Com a utilização do método de picrosirius sob luz polarizada, a membrana amniótica
obteve coloração semelhante à do estroma circunjacente, com fibras de colágeno espessas na
coloração vermelha-alaranjada, o que, segundo Massironi et al. (2005) caracteriza o colágeno
do tipo I. Esse tipo de colágeno foi identificado juntamente com os colágenos tipo III, IV, V e
VII, por diversos pesquisadores (APLIN; CAMPBELL; ALLEN, 1985; KEENE; SAKAI;
LUNSTRUM, 1987; MODESTI; SCARPA; DORAZI, 1989; YURCHENKO; RUBEN,
1987), como um dos componentes da membrana amniótica humana. As fibras constituintes da
membrana amniótica apareceram com direcionamento diferente das fibras do estroma, o que a
tornava evidente no corte histológico.
80
Todos os artigos relacionados à avaliação histológica de córneas que receberam
transplante de membrana amniótica (GRIS, et al., 2002; GRUETERICH et al., 2002;
STOIBER et al., 2002; TOSI, et al., 2005) fazem referência a alterações na camada de
Bowman. No presente estudo, não se pode avaliar essa camada por sua existência ser
questionável no coelho (PRINCE, 1964).
Quanto à contagem de células inflamatórias, a utilização do programa Image-Pro Plus
foi de grande valia para esse processo, possibilitando a padronização da área a ser avaliada,
conferindo um dado constante na leitura de todas as lâminas.
O descarte das áreas referentes aos pontos de sutura em todas as lâminas no processo
de contagem foi devido ao intenso infiltrado inflamatório presente nesses locais, o que
demonstra que o fio mononylon induziu processo inflamatório considerável, contudo não foi
observada formação de granuloma de corpo estranho, à semelhança dos relatos de Godoy
(2001) e diferindo do encontrado por Souza (2003), que identificou reação tipo corpo estranho
em alguns animais.
Observou-se maior número de células inflamatórias e neovasos invadindo o estroma
das córneas dos animais do grupo I MAH. Essa diferença foi significante (p<0,05) entre os
subgrupos de 15 e 30 dias de evolução, quando avaliados pelo teste estatístico de Mann-
Whitney. Além disso, a contagem de vasos mostrou uma diferença significativa intra-grupo
MAH dos animais com 30 dias de evolução em relação aos outros períodos de evolução.
Esses valores demonstraram que a membrana amniótica humana provocou maior reação
inflamatória do que a membrana amniótica de coelha nos períodos mais tardios.
Choi et al. (1998) ao realizarem a contagem de células inflamatórias em todo o
estroma da córnea de coelhos submetidos a ceratectomia fotorrefrativa encontraram valores
próximos a 1440 células inflamatórias nas primeiras 24 horas de pós-operatório e naqueles
animais que receberam a membrana amniótica humana na forma de "patch" além da
81
fotoablação, encontrou menor quantidade de infiltrado inflamatório, isto é, aproximadamente
280 células em todo o estroma. Com esses dados, pode-se inferir que o próprio procedimento
cirúrgico de ceratectomia leva a uma resposta inflamatória. A comparação com a presente
pesquisa é inviável, pois os procedimentos diferem entre si. Quando a membrana amniótica é
utilizada na forma de patch por menos de 2 semanas, não induz rejeição ao xenotransplante e
barra a invasão de células inflamatórias oriundas da lágrima (TOSI et al., 2005).
A resposta inflamatória observada nas córneas que receberam enxerto de membrana
amniótica humana foi progressiva de acordo com os tempos de evolução, sendo os valores
mais altos observados nos períodos mais tardios. O enxerto de membrana amniótica de coelha
também provocou reação inflamatória, porém tênue e praticamente constante, com variações
individuais durante todos os períodos de evolução.
A resposta inflamatória observada na maioria dos animais foi composta por
polimorfonucleares. Em 4 animais tanto do grupo I MAH, quanto do grupo II MAC observou-
se resposta inflamatória mista, isto é, havia a participação de mononucleares além dos
polimorfonucleares no infiltrado, contudo, em nenhuma amostra foram observadas células
gigantes.
A resposta inflamatória dos cães que receberam membrana fetal xenógena em
ceratoplastia lamelar (GODOY, 2001) caracterizou-se primordialmente por
polimorfonucleares e a dos que receberam enxertos de membranas amniótica e
alantoamniótica alógenas (SOUZA, 2003), o infiltrado inflamatório foi composto por
mononucleares, além dos polimorfonucleares. Em ambos os relatos, o infiltrado inflamatório
foi considerado leve (avaliação subjetiva), descrevendo uma curva descendente a partir dos 15
dias de evolução. Nos animais que permaneceram sob avaliação por períodos mais longos (60
dias), era evidente a inexistência de células inflamatórias no estroma remodelado (GODOY,
2001).
82
No presente estudo, houve uma variação individual quanto à resposta inflamatória,
sendo difícil delinear uma curva de progressão. Aparentemente, no grupo I MAH, a resposta
inflamatória intensificou com os períodos de evolução mais avançados.
Tosi et al. (2005) declararam que o sucesso de seu experimento transplantando células
límbicas expandidas ex vivo em membrana amniótica em coelhos foi decorrente da utilização
de membrana amniótica alógena, isto é, de coelha para esse fim e não a membrana amniótica
de origem humana, devido à possibilidade de reações adversas pelo uso de membrana
amniótica de origem xenógena.
Gris et al. (2002), por meio de imunohistoquímica verificaram que o infiltrado
inflamatório presente em amostras de um dos pacientes com 7 meses de evolução pós
transplante de membrana amniótica era composto por histiócitos e linfócitos (T>B), células,
segundo ele, responsáveis pela reabsorção da membrana amniótica. Entretanto, não há
referências de sinais macroscópicos de rejeição.
Deve-se considerar que a degradação do colágeno é dependente da ação das células
inflamatórias e dos ceratócitos (NISHITA, 1998). A membrana amniótica humana é
extremamente mais espessa do que a membrana amniótica de coelha, o que implica em maior
quantidade de colágeno. A resposta inflamatória mais exacerbada nos animais que receberam
membrana amniótica de origem humana pode ser decorrente da necessidade de degradar
maior quantidade de colágeno e remodela-lo para ser totalmente incorporado ao estroma
autóctone.
Para melhor entendermos a resposta inflamatória induzida pelo enxerto xenógeno
(membrana amniótica humana) em coelhos, os animais deveriam ser observados por períodos
mais prolongados e realizarem-se provas imunohistoquímicas para identificação das células
inflamatórias presentes, pois a participação de linfócitos na resposta inflamatória pode ser
sinal de resposta imune contra o enxerto que, de acordo com Forrester et al. (2002), pode ser
83
iniciada pelas células T CD4 (helper) reconhecendo antígenos de histocompatibilidade maior
(MHC) e menor (mH) expressos no tecido enxertado.
A membrana amniótica expressa HLA-E e HLA-G, os quais são antígenos MHC
(HOULIHAN et al., 1995), mesmo após criopreservada por 6 meses (KUBO et al., 2001).
Apesar dessas evidências, houve a demonstração de que a membrana amniótica humana seja
provavelmente um tecido imune-privilegiado, pois enxertada na córnea e sob cápsula renal de
ratos Lewis provocou, respectivamente, nenhuma e discreta reação inflamatória ao redor da
membrana amniótica (KUBO et al., 2002).
84
6 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos pudemos concluir que:
. Clinicamente, os animais de ambos os grupos (I MAH e II MAC) apresentaram
comportamento semelhante, demonstrando aos 30 dias de evolução aspecto macroscópico
similar com boa epitelização da superfície ocular.
. Morfologicamente, houve integração perfeita da membrana amniótica, tanto de origem
humana quanto de coelha, ao tecido autóctone. A regeneração epitelial ocorreu em ambos os
grupos e era do tipo pavimentoso estratificado aos 30 dias de evolução.
. A coloração com Alcian blue não serviu para o propósito de evidenciar a membrana
amniótica implantada, mas destacou a participação de glicosaminglicanas ácidas apenas em
locais onde o colágeno estava sendo remodelado.
. A coloração de pirosirius demonstrou que o estroma da membrana amniótica de ambos os
grupos apresenta colágeno tipo I.
. A membrana amniótica humana provocou reação inflamatória e neovascularização no
estroma corneal do que a membrana amniótica de coelha, as quais foram evidenciadas por
contagem de células inflamatórias e vasos no estroma corneal. Essa diferença foi significativa
entre os grupo I MAH e grupo II MAC (p<0,05), principalmente nos períodos tardios de
evolução.
85
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