ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECI-FICAS EN TRIFOL1UM SUBTERKANEUM L.M E D I A N T E ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

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PASTOR P I X K 1 K O

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P U B L I C A D O E N

A N A L E S DE E D A F O L O G Í A Y A G R O B I O L O G Í A

TOMO XXXI, NÚMS. 9 -10 .—MADRID, 1972

ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECI-FICAS EN TRIFOLIUM SUBTERRANEUM L.MEDIANTE ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

p o r

J. PASTOR PJSEIRO

S U M M A R Y

STUDV OF INFRAESPECIFIC DIFFERENCES IX TRIFOLIUM SCfíTF.RRA-NEUM L. BY PROTEIN ELECTROPHORESIS

Proicins of seeds froni eight australian cuitivars of Trifohum subterraueutn T,. hawbeen separated ussing acrylamide gel electrophoresis techniquc. Cuitivars belong ;othe three existing suhespecies according to Katznelson and Morley (1965).

The number of bands dctected by this procedure \vas high. as the diagrum shows,and all the cuitivars coulcl be differenced by their baños.

Results were reproducible, even in cultivara in which seeds oí different origin and/oryear were used. The contrast was rcmarkable between the constancy of the patternwithin every cultivar and the variabiüty of patterns among cuitivars.

Coefficients of similarity of protein baños among different cuitivars have beenstablished.

The results obtained are discussed in relation to the oncs obtained by morphologicaland genetic studies by other authors.

The interest of the method for the quick identification of cuitivars is pointed out.

El problema de la subespeciación y variación de Trifoliiini subtc^ra-ncum L. ha sido estudiado por varios autores. Katznelson y Morley (12,13), en su estudio taxonómico de las categorías infraespecíficas de T. sub-terranctnn T.., intentan asociar barreras reproductoras con característicnsmorfológicas. Los resultados obtenidos les han llevado a concluir queTrifolium svbterronewn L. está constituido por tres subespecies sim-pátncas, ssf>. subtcrmneum. ssp. yamtinicum y ssp. brarhycalychium. queson, en un !)."">-100 por 100, interestériles. Atribuyen la esterilidad de loshíbridos a cambios cromosómicos, traslocaciones e inversiones, asociadoscon las diferencias de tipo subespecífico o varietal.

Dada la gran dificultad que ofrece la separación de las distintas pobla-ciones del trébol subterráneo por sus caracteres morfológicos, pensamos

792 ANALES DE EDAFOLOGÍA V AGROBIOLOGÍA

en la conveniencia de utilizar métodos quimiosistemáticos para estudiarlas diferencias infraespecificas en esta especie.

La electroforesis de proteínas se encuentra entre las técnicas que hanexperimentado un mayor incremento en los últimos años en los estudiostaxonómicos. La mayoría de los trabajos se efectúan en semillas porrazones prácticas muy importantes, como son la estabilización de sustan-cias y la ventaja de no tener que realizar estudios a lo largo del ciclode desarrollo.

Fox, Thurman y Bouiter (9) obtuvieron las bandas de proteína ensemillas de 1.7 especies de leguminosas y señalaron la utilidad potencialde la técnica. Bouiter y col. (4, 5), al examinar por separado las fraccio-nes de albúmina y globulina en semillas de leguminosas, observaron quelas globulinas tienen un valor taxonómico a nivel de tribu y género.En el caso concreto de la tribu Trifolioleas el electroforegrama de glo-bulinas se caracterizaba por la presencia de dos bandas fuertemente teñi-das en la parte superior del gel. A nivel de género. Kleczowska ( 1 4 )encontró que las proteínas de trébol podían separarse mediante electro-foresis en 18 fracciones.

Adriaanse y Robbers (2) estudiaron las fracciones de albúmina y glo-bulina en cultivares de Vicia faba L., Piswn satnmm L. \vulgaris L. Las fracciones de albúmina eran características en las espe-cies estudiadas, y de las tres fracciones de globulina obtenidas una deellas diferenciaba mejor los cultivares.

Bingham y Yeh (3) hallaron, en 30 variedades de alfalfa y 26 diploidesy tetraploides de Medicado sath'a L. y Medicago fal cata L., que las pro-teínas va riciales de las semillas eran cualitativamente similares en 12 ó 13bandas en todos los casos estudiados. Esta semejanza estaba de acuerdocon los resultados obtenidos en estudios genéticos y citogenéticos. Lamayoría de las variedades diferían más en los electroforegramas de lasproteínas que en sus caracteres morfológicos. La variación detectada enlas proteínas era suficiente para justificar el empleo del método en laidentificación de variedades.

Vaughan y col. (21, 22) estudiaron las fracciones de albúmina y glo-bulina de semillas de varias especies pertenecientes a los géneros Brassicay Sinapis, tanto por métodos serológicos como de electroforesis sobregeles. y correlacionaron los resultados obtenidos con lo? de la clasifi-cación ya establecida.

Crouden y col. (f>) examinaron 174 muestras de semillas de Umbelí-feras pertenecientes a 99 especies y 39 géneros La investigación revelódiferencias entre las especies examinadas, algunas de indudable s ignif i-cado taxonómico.

Silano y col. (19) estudiaron las fracciones de albúmina y globulinade diversas variedades de Tritícum a estiva ni L. y Triticii-m- durum Desf.,no encontrando diferencias varietales muy marcadas, si bien las bandasde albúmina de movimiento rápido presentaban diferencias mayores.

ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS WFRAESPEC1FICAS EN « T R I F O L I U M SUBTEKRANEUM» L. 793

En la separación electroforética de proteínas en otras partes de laplanta señalamos los trabajos de Lee y Fairbrothers (16), efectuadosen polen y semillas procedentes de cuatro taxa de Typlia, utilizando méto-dos serológicos y electroforéticos. Los resultados obtenidos por ambosmétodos eran complementarios y semejantes en el polen y las semillas.Zwartz (24) estudió diferencias varietales en la patata mediante la elec-troforesis de proteínas del tubérculo. Me Co\vn y col. (17) investigaronlas proteínas del tallo y hojas de tres clones de Diantlms. Hilty ySchmitthenner (10) compararon proteínas de la hoja de dos variedadesde soja Harosoy y llarosoy (5:5, sin apreciar diferencias en la composi-ción de proteínas de ambas variedades.

Nuestro propósito en este t rabajo f u e :

Identificar cultivares de Trifolium siibtcrrancum L. utilizando la elec-troforcsis de proteínas de semillas en geles de poliacrilamida.

Estudiar la similitud existente entre los proteinogramas de dichoscultivares.

Comparar, a nivel subespecífico. los datos obtenidos por el métodoquimiotaxonómico con la clasificación establecida por Katznelson yMorley.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudiaron ocho cultivares australianos pertenecientes a las tressubespecies de Trifolium sitbterraneum L.. ssp. siibterrnneum (Tallarook,Monnt Barker, Geraldton, Woogenellup. Bacchus Marsh y Dwalganup).Trifolium subterrancum L. ssp. bracliycalvchiuin. Katzn. et Morley (Cla-re). Trifnliuní suMcrroncum L. ssp. yaninnicinn. Katzn . et Morley(Yarloop).

Extracción de proteínas

Las proteínas se extrajeron de las semillas de los ocho cultivares.Las semillas fueron proporcionadas por el CSIRO y por el InstitutoNacional de Selección de Semillas y Plantas de Vivero. La cantidad deharina utilizada fue de 1 gr. por cada 20 mi. de solución extractora(tampón tris-glicina). por ser esta razón la más idónea para lograr laresolución del mayor número de bandas. El procedimiento seguido fueel utilizado por Boulter y col. (4-).

Preparación de los gelcs v electraitircsis

El método empleado fue el de Ornstein y Davis (18, Ti. simplificadopor Tombs y Akroyd (20) según lo señalado por Hjertén y col. (11),

794 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA

quienes usaron en lugar de gel separador una solución de sacarosa al 40por 100. Se colocaron 100 [il de extracto de proteína en el extremo decada gel. Como indicador se usó azul de bromofenol. Fox y col. (9) yVaughan y col. (21), entre otros, efectuaron por separado la electrofore-sis de albúminas y globulinas, en tanto que Fairbrothers (8) no separólas dos fracciones antes de efectuar la electroforesis. obteniendo datossatisfactorios. Nosotros hemos seguido el criterio de este último autor.

Tinción y desteñido

Los geles se tiñeron con una solución de negro de almidón en meta-nol/agua/acético (5 :5 :1). A continuación se pasaron durante unas horasa la misma mezcla pero sin colorante. El colorante empleado da resul-tados análogos a los obtenidos mediante el uso de colorantes enzima-ticos (6).

Examinamos los electroforegramas sobre una superficie luminosa y lasbandas de proteína se fotografiaron y representaron mediante esquemas.Las fotografías y los densitogramas no recogen todas las bandas detec-tadas a simple vista, hecho ya señalado por varios autores (9, 20)

La posición de una banda de proteína después de efectuada la electro-foresis se expresa por un valor Rp o posición relativa de la banda com-parada con el frente de azul de bromofenol.

El criterio usado para estudiar las bandas de proteína, de acuerdocon Whitney y col. (23), ha sido considerarlas similares cuando se sola-pan en más de 50 por 100.

Para comparar dos taxa se calculó un índice de similitud de la siguien-te forma:

n.° de pares de bandas similares

n.° de bandas diferentes + n.° de pares de bancias similares

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la separación de las bandas de proteínade los taxa investigados se muestran en la fig. 1. Cada representaciónde ésta se obtuvo a partir de 7 a 9 repeticiones. La diferente intensidadde tinción que presentan las bandas se expresa de la manera convencionalque se indica en la figura. Esta diferencia de intensidad puede tenersignificado taxonómico, pero en el presente trabajo no la hemos tenidoen cuenta. En el diagrama destaca el gran número de bandas que puedenapreciarse con el extracto utilizado.

Las oscilaciones entre los valores, una vez transformados en valoresde Rp, =on pequeñas dentro de cada cultivar y serie de experimentos, porlo que no se consideró necesario incluir los valores del error standard.

LSTUDIO DK LAS DIFERENCIAS INFRAESl'ECÍFICAS EN aTRIFOLIUM SUBTERRANEUM» L. 705

o -

10'-

20-

30-

40-

50-

60-

70-

80-

90-

100-C. D. M.B. B.M. T. G. W. Y

Fig. 1.—Diagrama de las bandas de proteínn de semillas de 8 cultivares australianosde Trifolium subterraneum L. (C. - Clare ; D. - Dwalganup ; M. B. - Mount Barkt-r ;b'. M. - Bacchus Marsh; T. - Tallarook ; G. - Geraláton ; W. - Woogenellup ; Y. - Yar-loop). Las intensidades de tinción se expresaron, en orden creciente, de la siguienteforma: intensidad 1: líneas discontinuas ; intensidad 2: lineas de trazo fino ; inten-sidad 3: líneas de trazo grueso ; intensidad 4: líneas cruzadas ; intensidad 5:

bandas negras.

En el estudio comparativo de las bandas, Boulter y col. (4) señalaronque es necesario tener presente lo siguiente: n) e! extracto inicial puedecontener un gran número de proteínas diferentes, por lo que una bandapuede estar formada por más de una proteína ; b~] es imposible asegurarque las bandas situadas en la misma posición en ¿relés obtenidos dediferentes taxa sean debidas a proteínas iguales. No obstante, en el casopresente todo el material examinado son taxa infraespecíficos con bas-tantes rassjos comunes.

79^ \- \ \ I .KS DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA

Todos los cultivares pueden distinguirse claramente por sus bandasde proteína en contraste con lo encontrado por IJinghan y Veh (3) envariedades y poliploides pertenecientes al género Medicado, donde lamayor diferencia cualitativa observada entre todo el material era la pre-sencia o ausencia de una banda; teniendo en cuenta esta banda podíanestablecerse cuatro grupos, dentro de los cuales fue posible separar lamayoría de las variedades sólo en razón de la diferencia de densidadobservada en las otras bandas.

Hemos prescindido de las bandas de la zona inicial por no ser fácil-mente homologables debido a su extrema delgadez y por sufrir algunasalteraciones.

T A I! L A I

índices de similitud de las bandas de proteina entre 8 cultivares de "Trifolium subterra-neutn' L. (T. - Fallarook : B. _V/. - Bacchus Marsh ; G. - Geraldton ; M. B. - Mounttiarker \V. - Woogeneüiip: D. - Divalganup, C. - Clare; Y. - Yarloop). Se señalan con

negritas los porcentajes iguales o superiores al 2í por 100.

T B.M. G. M.B. W. D. C. Y••••(%% 50

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41

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42

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C.

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I.a tabla 1 muestra los índices de similitud de las bandas de proteínaentre todos los cultivares. F.l índice de similitud más elevado e-, elexistente entre los cultivares Tallarook y Bacchus Marsh, ."ifl por 100.Los cultivares Tallarook. Bacchus Marsh. Geraldton, Mount Barker y\Yoogenellup están más asociados entre sí que respecto a las otras formas,como lo pone de manifiesto el que los índices de similitud entre ellososcilan c'e un 2S a un ."O por 100. siendo valores más altos que los quepresentan respecto a los otros tres cultivares. Dwalganup. Clare y Yar-

ESTfDlO UK LAS DJl-'ERENCIAS DIFEAESPKCÍFICA8 K.N «TRIFOUL'M SUBTERKAKBUMl L. 797

loop. Esto concuerda con la clasificación establecida por Kat/nelson yMorley, que los introducen dentro de la misma subespecie, ssf>. ;,ul>ti>-i\i-ncum, y con los datos de cruzamiento obtenidos por ellos (1-J.

Existe una excepción, Alount Barker, que tiene un índice de similitudmayor respecto a Clare, perteneciente a la ssp. brachycalycinutn, querespecto a Woogenellup, aunque la diferencia no es muy grande. Unestudio parecido, realizado por Whitney y col. ('23) en especies pertene-cientes a los géneros l'crticilliiim y Fitsar'mm, puso de manifiesto unamayor diferencia interespecífica que ínter genérica, explicando este hechomediante la hipótesis de que la relación entre la semejanza de proteínasy la semejanza establecida por otros criterios no es lineal. Así, algunas!proteínas reflejan solamente diferencias genéticas menores; otras, encambio, reflejan diferencias genéticas mayores, y entre ellas puede haberalgunas proteínas de apariencia difusa, cuya variación corresponde agrandes diferencias genéticas.

El cultivar Dwalganup, que Katznelson y Morley incluyen enla ssp. siibterraiiemn, muestra, con el grupo de cultivares menciona-do con anterioridad, índices de similitud notablemente más bajos, pare-ciendo presentar una posición intermedia entre dicho grupo y Clare,aunque tiene un índice de similitud mayor con este último (31 por 100j.

El cultivar Clare, perteneciente a la ssp. brachycal\'dnnm, presentaíndices de similitud aún menores en relación al grupo de formas anterior-mente citado, excepto el caso ya mencionado con respecto a AlountBarker. Esto también coincide con la clasificación establecida.

En el caso del cultivar Yarloop los índices de similitud son bajosrespecto a los restantes cultivares, lo que está de acuerdo con lo encon-trado por los autores ya nombrados, que lo incluyen en la ssp. yaiinini-ciim y también con los cruzamientos realizados por ellos.

Un hecho que parece oportuno resaltar es la repetibilidad de losresultados dentro de cada cultivar, aun usando semillas de distinta pro-cedencia obtenidas en diferente época, en comparación con la marcadadiferencia entre cultivares. Esto concuerda con lo observado por Foxy col. (9) en Cytisns scoparius (L.) Link procedentes de dos localidades.También Adriaanse y col. (1), en un estudio efectuado en 32 cultivaresde Pltaseohis vulgarís L.. establecieron que los electroforegramas deproteína no parecían afectados por las condiciones externas, tales comola fertilización con nitrógeno, condiciones climáticas y propiedades delsuelo. Larsen (15) estudió 61 variedades de soja, encontrando modelosde banda muy reproductibles y uniformes dentro de cada variedad, queno se veían afectadas por año, localidad o serie de separación electro-forética.

El gran número de bandas y el hecho de que los índices de similitudentre los cultivares no sobrepasen el valor del 50 por 100 refleja la granheterogeneidad de la especie ya comentada por diversos autores.

Los resultados obtenidos están de acuerdo con las subespecies

798 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA

que Katznelson y Morle\n asociando ciertas barreras deesterilidad con determinadas características morfológicas ; sin embargo,estas barreras existen también y además muy difundidas entre numero-sas poblaciones que no se pueden separar por los caracteres morfo-lógicos.

Un hecho importante en los procesos de subespeciación ha sido laautogamia casi absoluta de todas las formas de trébol subterráneo, loque facilita la fijación de las alteraciones cromosómicas y los cambiosgenéticos. Esto causa una divergencia progresiva y da característicasde mosaico a la estructura de la variación de la especie.

Concluyendo, el método utilizado parece muy adecuado para la 'den-tificación de cultivares de trébol subterráneo a partir de las semillas.Identificación que es difícil sin este sistema, pues exige en algunos deellos la observación de la planta en varios estadios de su ciclo y una des-cripción muy detallada que no puede ser objetiva y además con frecuenciadifícil de interpretar.

Esta aplicación puede tener interés inmediato, siendo fácil la com-paración de los resultados; las posibilidades de confusión entre cultiva-res son pequeñas, dadas las características muy individuales de cadaproteinograma,

Agradecimiento

El autor agradece al Prof. Dr. F. González Bernáldez, catedráticode Ecología de la Universidad de Sevilla, la ayuda prestada para larealización de este trabajo.

R K ? U M K N

Las proteínas de las semillas oe ocho cultivares pertenecientes a las tres subespeciesde Trifolium subterraneiim L. se separaron mediante electroforesis en ge!es de poliacri-lamida.

El número de bandas detectadas por este procedimiento era elevado, como reflejael diagrama adjunto. Todos los cultivares pudieron diferenciarse por sus bandas.

Los resultados eran reproducibles incluso en cultivares en los que se usaron semillasde distinta procedencia y obtenidas en época diferente. Es notable el contraste entrela constancia del electroforegrama obtenido dentro de cada estirpe con la variabilidadde dicho electroforegrama entre estirpes.

Se establecieron los índices ¿e similitud de las bandas de proteína entre los dife-rentes cultivares.

Los resultados obtenidos se discutieron con los proporcionados por estudios morfo-lógicos y genéticos de otros autores.

Finalmente se señala el interés del 7iiétodo para la rápida identificación decultivares.

Sección de Kcofisiología l'egctal.Instituto de I-'ilafolagia y Biología Vegetal. Madrid.

ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECÍFICAS EN tTRIFOLIUM SUBTERRANEUM» L. 799

B I B L I O G R A F Í A

(1) ADKIAANSE, A., KLOP, W. and ROBBERS, J. E. (1969). Characterisation of Phaseoluivulgaris cultivars by their electrophorctic patterns. J. Sci. Fd. Agrie., 20,(¡47-650.

(2) ADRIA^NSK, A. and ROBBERS, J. E. (1970). Characterisation and fractionation studieson seed proteins of some of the leguminosae by starch-gel electrophoresis.J. Sci. Fd. Agrie., 21, 126-128.

(3) BINGHAM, E. T. and YEH, K. J. (1971). Electrophoretic patterns r.mong alfa l faseed proteins from selected varieties, experimental stocks, and species accessions.Crop Sci., 11, 58-61.

(4) ÍÍOULTER, D., THURMAN, D. A. and TURNER, B. L. (1906). The use of discelectrophore=is of plant proteins in systematics. Taxon, 15 (4), 135-143.

(5) BOULTER, D.. THURUAN, D. A. ana DERBYSHIRE, E. (1967). A disc electrophoreticstudy of globulin proteins of legume seeds with reference to their systematicsNew Phytol., 66, 27-36.

(6) CROWDEN, R. K., HARBORNK, J. B. and HEYWOOD, V. H. (1969). Chemosystematicsof the Umbelliferae. A general survey. Phytochemistry, 8, 19IÍ3-1984.

(7) DAVJS, B. J. (1964). Disc electrophoresis, II. Ann. New York Acad. Sc^., 121,404-427.

(8) FAIKBROTHERS, D. E. (1968). Chemosystematics with emphasis on systematicserology. Modern methods ¡n plant taxonomy. Acadeinic Press. Inc., London.

(9) Fox, D. J , THURMAN, D. A. and BOULTER, D. (1964). Studies on the proteinsof secas of the Leguminosae. I. Phytochemistry, 3, 417-419.

(10) HILTY, J. \V. and SCUMITTENNER. A. F. (14)66). Electrophoretie comparison ofsoybean leaf proteins trom varieties resistan! and susceptible to Phytophtoramegasperma var. sojae. Phytopathology, 56, 287-291.

(11) HJEKTÉN, S., JERSTEU, S. and TISSELIUS, A. (1965). Some aspeéis of use of«continuos* and «discontinuos» buffer systems in polyacrvlamide gel elec-trophcresis. Anal. Biochem , 11, 219-233.

(12) KAT/NF.LSON, J. and MORLEV, F. H. W. (1965 a). Speciation processes in Trj¡o-Kum subterraneum L. Israel J. Bot., 14, 15-35.

(13) KATZXELSON, J. and MORLEY, F. H. W. (1965 b). A taxonomic revisión of sect.Calycomorp/iitm of the genus Trifolium. J. The geocarpic species. Israel J.Bot., 14, 112-134.

(14) KLECZOWSKA, D. (1968). Starch-gel electrophoresis of a l f a l f a , clover ano' meadowgrass proteins. Herbage Abstraéis, 38, 123 (749).

(15) LAB SEN, A. L. (1967). Electrophoretic differences in seed proteins among varietiesof soybean, Glycine nia.v (L.) Merrill. Crop. Sci., 7 (4), 311-313.

(16) LEE, D. W. and FAIRBUOTHERS, D. E. (1967). Serological and disc-electrophoreticstudies of North American Typha. Am. J . Bot., 54, 660.

(17) -Me COVVN, B. H., BECK, G. E. and HALL, T. C. (1968). Plant leaf and stemproteins. 1. Extraction and electrophoretic separation of the basic, water-soluble fraction. Plant Physiol., 43, 578-582.

(18) ORNSTEIN, L. (11164). Disc electrophoresis. ]. Ann. New York Acad. Sci., 121,321-349.

(19) SILANO, V., DK CILLIS. U. and POCCIIIARI, F. (1969). Varietal differences inalbumin ano globulin fractions of Tríticum aestivum and Triticutn duritm.J. Sci. Fd. Agrie., 20, 260261.

(20) TOMBS, M. P. and AKROVD, P. (1967). Acrylamide gel electrophoresis. ShandonInstrument Applications núm. 18.

Soo AXAI-KS DI: EDAFOLOGÍA v A C K O I Ü O L O C Í A

(21) YAUGHA.V. |. C,.. \ \ A I T K . A., |!OI;I,TKK. I ) , and \\".\ITI-:US. S. (1900). Comparativastudies of tlie seed proteins of Hrassica campestris, Hrossica clcracca andHrassica aígra. I. oxp. l .ot . . 17. .'!.'!2-'{-).'¡.

(^2) N ' A C G M A N , ] . ( i . aiui I ) K X I I I K D . K. H. (19(iS). An acrylamido gel electrophoreticstudy of llie secd proteins of Brassica an<¡ Sinafis species, witli special referenceto tlieir taxonomic valúe. J. cxp. Bot.. 7lM-7.'!L'.

(23) \Vn iTXi -y . P. J . . V A C < ; H A N . J. (',. and HKAI.K. J. R. (19(¡S). A disc electrophoreticstudy of the proteins of l'~erticillium alhn-atnuit. l'crticitliuin dahltac and Fusa-ríum oxysporuiu vvitli reference to their taxonomv. I. exp. I'ot.. 19, 415 42(i.

(24) Z\VARTZ, J. A. (1907). Characteriíation of potato varieties by electrophoreticseparation of the tuher proteins. Mcdedeling'en I.and. Wageningtn, 67. 9.

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