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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967

(Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e

relações de parentesco intracolonial.

Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva

Tese apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto da USP, como parte das exigências

para a obtenção do título de Doutor em

Ciências, Área: Entomologia.

RIBEIRÃO PRETO - SP

2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967

(Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e

relações de parentesco intracolonial.

Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,

como parte das exigências para a obtenção do

título de Doutor em Ciências, Área:

Entomologia.

Orientador Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento

RIBEIRÃO PRETO - SP

2015

Autorizo a divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou

eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.

SILVA, ALINE CANDIDA RIBEIRO ANDRADE

Estrutura genética e sócio-etológica de Euglossa melanotricha Moure 1967 (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) mediada por sinalização química e relações de parentesco intracolonial.

Aline Candida Ribeiro Andrade e Silva, - 2015. 205f.:il.

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto/USP – Pós Graduação em Entomologia, 2015. Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento.

1. Euglossa melanotricha. 2. Regulação reprodutiva. 3. Sinais químicos. 4. Relação parental. 5. Evolução do comportamento social.

Agradeço,

À Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto e ao Programa de Pós Graduação em Entomologia, pela oportunidade concedida.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento da pesquisa.

Ao Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento, pelo apoio, paciência, incentivo e confiança depositada.

Ao Prof. Dr. Marco Antonio Del Lama, pelo exemplo de seriedade e dedicação à pesquisa científica.

Ao meu querido filho Davi, pela compreensão e amor incondicional.

À Juliana e Geni, pelo tempo e carinho dedicados a Davi.

Aos meus pais e irmãos (Pedro, Maria, Dedé, Márcio, Marcelo e Pedro Filho) pela compreensão, confiança, e principalmente, pelo exemplo de amor e cumplicidade.

Aos especialistas de Laboratório Dr. Sidnei Mateus, Izabel Turatti e Isabel Cristina pelo auxílio técnico à realização do trabalho.

Às secretárias do Programa de pós-graduação em Entomologia, Renata e Vera, pela atenção, competência e presteza de sempre.

Ao colaborador e amigo Elder Miranda, pela amizade e pelo exemplo de competência e honestidade.

Ao Dr. Sidnei Mateus (Dneis), pela amizade, incentivo, pelo exemplo de honestidade, cafezinhos e discussões.

Aos colegas do Laboratório de Ecologia e Comportamento de Insetos Sociais, Glaúcia (Mami), Yarinha (Flor), Claudinha e Salsas, pela amizade, agradável convivência e pela troca de experiência durante o desenvolvimento do trabalho.

Ao Dr. Túlio Nunes, pela amizade, apoio, incentivo, e acima de tudo pelo exemplo de seriedade e competência.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Genética e Evolução de Hymenoptera na Universidade Federal de São Carlos, Tony, Dani Luna, Jamile, Camila, Teka, Pedro, Mariana e Vitor, pelo apoio, amizade, agradável convivência e pelo carinho com que me acolheram.

Aos amigos irmãos Dani Carol, Márcia Xavier, Nathy, Rafa, Fabrício, Raone, Ju Cordeiro, Ju Duarte, Nanda e Marília, pela compreensão, confiança, parceria e pela amizade verdadeira.

“Remember to look up at the stars and not down at your feet.

Try to make sense of what you see and wonder about what makes the universe exist.

Be curious. And however difficult life may seem, there is always something you can do and succeed at.

It matters that you don’t just give up”

Stephen Hawking

RESUMO

As sociedades animais exibem variações notáveis em suas estratégias reprodutivas. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que mantém o monopólio reprodutivo, ou podem ser formados por indivíduos que compartilham de forma igualitária a reprodução. No topo dessa variação, os indivíduos podem maximizar seu fitness pela reprodução direta ou indiretamente através da ajuda a parentes. A estrutura social pode ser mantida pela discriminação parental através do tratamento diferencial a coespecíficos. Em insetos sociais, o reconhecimento de parentes envolve pistas de odor, sendo a sinalização química fundamental para resolução dos conflitos. Rainhas indicam seus status através de sinais químicos e a resposta das operárias a esses sinais incluem a supressão da atividade ovariana. Em espécies de insetos primitivamente sociais, as dominantes podem indicar seu status e inibir a reprodução das subordinadas somente através do comportamento agressivo ou podem ser dóceis e ainda assim manter o monopólio reprodutivo, sugerindo que a sinalização química pode agir sinergicamente com as interações de dominância. Neste trabalho foram investigados quais mecanismos estão envolvidos na regulação social de Euglossa melanotricha, uma abelha primitivamente social. Para investigar esses mecanismos, foram feitas análises das interações comportamentais, testes experimentais, análises da composição química cuticular das fêmeas e do parentesco entre as fêmeas e sua prole em 42 famílias de Euglossa melanotricha. Os resultados mostraram que fêmeas dominantes mantêm o monopólio reprodutivo por coerção e oofagia dos ovos. Embora as diferenças entre os perfis químico cuticulares das dominantes e subordinadas indiquem que a sinalização química pode estar envolvida na comunicação da dominância reprodutiva. Contudo, essa variável não foi fator dependente da fertilidade associada a condição de acasalamento e atividade ovariana. Os resultados da análise genética indicaram sistema de acasalamento único para a espécie, e o parentesco entre as fêmeas apontou três distintos grupos: famílias de irmãs, mãe-filha e famílias de fêmeas não aparentadas. A assimetria reprodutiva variou de acordo com o parentesco, agressão e oofagia dos ovos. A participação das subordinadas na produção total foi menor nas famílias aparentadas (imãs e mãe-filha) do que nas famílias não aparentadas. Contudo, a produção dessas fêmeas foi desviada para machos nas famílias aparentadas. Tais resultados suportam as predições dos modelos de concessão, sendo a partilha da reprodução resultado do incentivo da dominante a permanência da subordinada em troca da sua cooperação. Este estudo fornece evidências a rara situação de correlação positiva entre assimetria reprodutiva e parentesco previsto pelos modelos de concessão, e indicam uma hierarquia social mantida por ‘contrato social’ com relação ao esforço reprodutivo em Euglossa melanotrica. Os dados também indicam que a organização de sociedades pequenas como em Euglossa pode ser modulada por traços complexos assim como em sociedades de insetos com socialidade avançada. Palavras-Chave: Euglossa melanotricha, regulação reprodutiva, sinais químicos, relação parental, evolução do comportamento social.

ABSTRACT

Animal societies exhibit remarkable variation in their breeding strategies. Groups may contain one or a few individuals that maintain a monopoly over reproductive output, or be formed by individuals that have an equal share in the reproductive process. Ultimately, an individual may maximize its fitness by either reproducing itself or contributing to the success of its close relatives. Social structure may be maintained by the discrimination of relatives through the differential treatment of conspecifics. In social insects, relatives may be recognized by their odor, with chemical signaling being fundamentally important for the resolution of conflicts. Queens indicate their social status through chemical signals and the response of workers to these signals may include the suppression of ovarian activity. In primitively social insects, dominant individuals may communicate their status and inhibit reproduction in subordinates by aggressive behavior alone, although they may also be docile, but still maintain their reproductive monopoly, indicating that chemical signaling may act synergistically with dominance behavior. The present study investigated the mechanisms determining social regulation of Euglossa melanotricha, a primitively social bee. This investigation was based on the analysis of behavioral interactions, experimental tests, the analysis of the chemical composition of the cuticle of the females, and the relatedness between the females and their offspring in 42 Euglossa melanotricha families. The results indicated that the dominant females maintain a reproductive monopoly through coercion and oophagy, although the differences in the chemical profiles of the cuticle of the dominant and subordinate females suggests that chemical signaling may also be involved in the communication of reproductive dominance. However, this factor was not dependent of the fertility associated with the mating condition and ovarian activity. The results of the genetic analysis indicated o unique mating system for the species, with the relatedness among females indicating three distinct types of group: families of sisters, mother-daughters, and families of unrelated females. Reproductive asymmetry varied according to relatedness, aggression, and oophagy. The participation of the subordinates in total production was lower in the related females (sisters and mother-daughters) than in the unrelated families. However, the production of the subordinates in the related families was biased towards males. These findings support the predictions of concession models, in which sharing of reproduction results from the incentives of the dominant females and the tolerance of the subordinate in exchange for cooperation. This study provides evidence of a rare positive correlation between reproductive asymmetry and relatedness, as predicted by concession models, and indicates the existence of a social hierarchy maintained by a “social contract” in relation to reproductive effort in Euglossa melanotrica. The data also indicate that the organization of small societies, such as those found in Euglossa, may be modulated by complex traits, as in advanced insect societies. Key words: Euglossa melanotricha, reproductive regulation, chemical signals, relatedness, evolution of social behavior.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. A - Município de Campo Formoso, com a localização da área de estudo. B – Localização dos ninhos na área urbana. Imagens feitas através do Software Google Earth 2011. C- Interior da sala onde os ninhos estão instalados.....................................................................................32

Figura 2. A. Entrada do ninho de Euglossa melanotricha na parede de blocos. B e C. Retirada do ninho. D. Transferência para caixa de observação. E. Visualização das caixas na bancada. F. Microcâmera posicionada sobre o vidro. G. Equipamento utilizado para captura, registro e análise das imagens. H. Marcação de uma fêmea ..............................................................................................34

Figura 3. Representação esquemática das interações agressivas ou de dominância nos ninhos de Euglossa melanotricha: (A) Mordiscar, (B) Empurrar e (C) Perseguir com sobrevôos de ameaça. Fêmea dominante e Fêmea subordinada.............................................................................................36

Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico das antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada .....................................................................37

Figura 5. Esquema de um dos ninhos de Euglossa melanotricha. No círculo pontilhado, as células estão identificadas pela ordem de oviposição e substituição do ovo. OS – Ovos substituídos e ON – Ovo não substituído.............................................................................................................................37

Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos ninhos de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas..........................................................39

Figura 7. Média do tamanho corporal (Média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes invasoras, subordinadas invasoras e dominantes residentes em ninhos de Euglossa melanotricha .......................48

Figura 8. Atividade ovariana em fêmeas de Euglossa melanotricha: (A) Fêmea dominante, (B) subordinada e (C) invasora que assumiu a dominância reprodutiva ......................................................48

Figura 9. Comparação das proporções (%; média ± desvio padrão) de n-alcanos, alcenos e alcanos ramificados entre dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha .........................55

Figura 10. Cromatogramas dos perfis cuticulares de fêmeas de Euglossa melanotricha. Uma fêmea de cada grupo foi escolhida aleatoriamente. Os principais componentes encontrados nesta amostra foram: (a) Tricosano; (b) (Z) 5-Pentacoseno; (c) n-Pentacosano; (d) 5-Metilpentacosano (e) n-Hexacosano; (f) (Z) 9- Heptacoseno; (g) n- Heptacosano; (h) 13-, 11-, 9- Metilheptacosano; (i) 9- Nonacoseno; (j) n-Nonacosano; (k) Hentriacontano.....................................................................57

Figura 11. Resultado da analise canônica mostrando as posições relativas dos grupos de fêmeas por status social (fêmeas dominantes, n = 30; subordinadas, n = 30; fundadoras, n=12) em Euglossa melanotricha. Elipses correspondem a 95% do intervalo de confiança .................................58

Figura 12. Comparação das proporções (% relativa, média ± desvio padrão) dos compostos C23 = n-tricosano, ZC25 = 5-pentacoseno, C25 = n-pentacosano, MeC25 = 5-metilpentacosano, C26 = n-hexacosano, ZC27 = 9-heptacoseno, C27 = n-heptacosano, MeC27= 13-, 11-, 9-Metilheptacosano, 9-Nonacoseno, n-nonacosano e n-hentriacontano entre fêmeas dominantes (n=30) e subordinadas (n=30) de colônias de Euglossa melanotricha. *p < 0,05 e ns = não significativo foram determinados pelo teste t para amostras independentes por grupo.........................................................58

Figura 13. Proporção relativa (média ± desvio padrão) of n-alcanos, alcenos, e alcanos ramificados entre fêmeas dominantes (invasoras e residentes) e subordinadas de Euglossa melanotricha ..........................................................................................................................................62

Figure 14. Análise discriminante do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes invasoras (n = 5), dominantes residentes (n = 30) e subordinadas (n = 30) em 10 ninhos de Euglossa melanotricha...........................................................................................................................62

Figura 15. Genealogia de himenópteros sociais com uma rainha fecundada por um macho (sistema monogínico/monoândrico). Os números ilustram o parentesco de uma operária com sua irmã (r = 0,75), seu irmão (r = 0,25), seu próprio filho (r = 0,5), e do seu filho com outra operária (r = 0, 375). Os indivíduos estão representados por meio de símbolos indicando o sexo (Hamilton 1972, Bourke & Franks 1995, Heinze et al 2004)..................................................................................90

Figura 16. Filogenia dos gêneros de Hymenoptera eussocial (formigas, abelhas e vespas) sugerida a partir da análise da frequência de acasalamento. Os clados que exibem alta poliandria (> 2 acasalamentos) têm ramos sólidos vermelhos, enquanto os clados com baixa ou poliandria facultativa (>1, mas < 2 acasalamentos) têm ramos pontilhados vermelhos; ao passo que, os clados que exibem monoandria têm ramos sólidos pretos (Hughes et al 2008)................................................93

Figura 17. Correlação entre a proporção de machos produzidos pelas fêmeas subordinadas e o parentesco (r) entre as fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30) ........................................................................................................................................................116

Figura 18. Esquema ilustrado da estrutura sócio-genética de Euglossa melanotricha, incluindo a média do parentesco entre os pares de fêmeas em cada família por grupo parental (irmãs, mãe e filha e fêmeas não relacionadas), a distribuição da reprodução a proporção sexual da prole dessas fêmeas ..................................................................................................................................................116

Figura 19. a) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e o parentesco (r) das fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30). b) Correlação entre a assimetria reprodutiva (B) e a frequência de policiamento dos ovos feito pelas fêmeas dominantes. c) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e a frequência de interações agressivas realizadas pelas fêmeas dominantes. Cada símbolo representa uma família .................................................................118

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Experimentos de remoção e reintrodução das dominantes em sucessivos e diferentes processos de reutilização de ninhos, com o número de repetições, de fêmeas, e o tempo de permanência das dominantes fora do ninho ...........................................................................................40

Tabela 2. Número de atos agressivos e ovos policiados (comidos) durante os processos de reutilização de ninhos, incluindo o status social das fêmeas e seus respectivos tamanhos corporais (distância intertegular) e desenvolvimento ovariano (comprimento dos oócitos basais) .......................47

Tabela 3. Reutilizações de ninhos por pares de fêmeas, incluindo o número de posturas, o número de ovos comidos pelas dominantes, e as interferências não agressivas (AN) e agressivas (A) observadas durante as atividades de construção das células (CC), aprovisonamento (AP), oviposição (OV), operculação (OP), reabertura da célula (RC) e outras atividades como limpeza das células, selamento de arestas e da entrada do ninho ........................................................................49

Tabela 4. Resultados dos experimentos de remoção: efeito da presença das fêmeas dominantes de Euglossa melanotricha com as interações que ocorreram após sua reintrodução nos ninhos (em 30 reutilizações de 10 ninhos).....................................................................................................................51

Tabela 5. Composição química em porcentagem média (± desvio padrão) dos hidrocarbonetos cuticulares de Euglossa melanotricha. Lista completa com todos os compostos determinados pela análise em CG-MS (Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas). Estão em negrito somente os 11 picos selecionados pela análise estatística......................................................................53

Tabela 6. Porcentagens médias (± desvio padrão) dos 11 picos selecionados pela análise discriminante entre fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha ..........56

Tabela 7. Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares dos grupos de fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha .........................57

Tabela 8. Proporção relativa de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes (residentes e invasoras) e subordinadas de Euglossa melanotricha. Letras em negrito representam os 11 picos selecionados pela análise estatística.......................................................................................................60

Tabela 9. Análise discriminante dos compostos químicos cuticulares encontrados nos grupos de fêmeas dominante invasora, dominante residente e subordinada de Euglossa melanotricha ................61

Tabela 10. Associação prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva ............................................................................................................................95

Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações e reativações de ninhos de Euglossa melanotricha.........................................................................................................................102

Tabela 12. Microssatélites utilizados, sequências e temperaturas de hidridação (TH) dos primers e suas referências. F: forward; R: reverse...............................................................................................104

Tabela 13. Diversidade alélica para as famílias de Euglossa melanotricha, com o número de machos e fêmeas genotipados por loco ................................................................................................110

Tabela 14. Parentesco entre as fêmeas de Euglossa melanotricha nas relações entre mãe e filhas e entre irmãs completas nas famílias de fundações (n = 12; NF1-NF12) .................................................111

Tabela 15. Estimativas de parentesco (r) entre categorias de fêmeas reprodutivas em cada família de reativação de Euglossa melanotricha (n = 30; N1FR1-N14FR3).......................................................112

Tabela 16. Número total da prole e a proporção de machos produzidos por cada fêmea reprodutiva nas famílias de Euglossa melanotricha, agrupadas de acordo com o parentesco ................................115

Tabela 17. Número de oviposições feitas pelas subordinadas e a frequência de ovos comidos pelas dominantes em cada família de Euglossa melanotricha agrupadas de acordo com o parentesco........119

Tabela 18. Associação observada e prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva.......................................................................................................128

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1: Introdução Geral.......................................................................................... 13 1.1 Objetivos............................................................................................................................. 19

1.2 Referências Bibliográficas.................................................................................................. 20

CAPÍTULO II: Regulação reprodutiva em Euglossa melanotricha: Contexto social, fertilidade e sinalização química ........................................................................................... 25 2.1 Introdução........................................................................................................................... 26

2.2 Materiais e Métodos ........................................................................................................... 30

2.2.1 Espécie estudada.............................................................................................................. 30

2.2.2 Local de estudo................................................................................................................ 31

2.2.3 Ninhos e protocolo de observações ................................................................................. 33

2.2.4 Experimentos ................................................................................................................... 38

2.2.5 Condições fisiológicas das fêmeas e razão sexual da prole............................................. 41

2.2.6 Medidas morfométricas das fêmeas ................................................................................ 41

2.2.7 Extração de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas ...................................................... 42

2.2.8 Análises químicas: comparação entre os perfis cuticulares das fêmeas.......................... 43

2.2.9 Análises estatísticas ......................................................................................................... 44

2.3 Resultados........................................................................................................................... 46

2.3.1 Interações de dominância em Euglossa melanotricha .................................................... 46

2.3.2 Experimento 1: Efeito da remoção e reintrodução das fêmeas dominantes .................... 50

2.3.3 Experimento 2: Efeito da remoção das fêmeas subordinadas ......................................... 50

2.3.4 Discriminação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas por status social.... 52

2.3.5 Comparação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares e a sinalização de dominância.... 59

2.4 Discussão ............................................................................................................................ 63

2.4.1 Regulação social e a dominância reprodutiva em Euglossa melanotricha ..................... 63

2.4.2 Efeito da remoção das fêmeas dominantes e subordinadas sobre o comportamento, reconhecimento e produtividade nos ninhos ............................................................................ 65

2.4.3 Análise do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas de acordo com o status social ocupado nos ninhos de Euglossa melanotricha ............................................................. 67

2.4.4 Implicações para a evolução da eussocialidade............................................................... 76

2.5 Referências Bibliográficas.................................................................................................. 77

CAPÍTULO III: Regulação reprodutiva e o parentesco em Euglossa melanotricha: evidência para seleção parental............................................................................................. 88 3.1 Introdução........................................................................................................................... 89

3.1.1 Assimetria reprodutiva e a resolução dos conflitos sobre a reprodução.......................... 91

3.1.2 Análises do parentesco genético por locos microssatélites ............................................. 95

3.2 Objetivos............................................................................................................................. 99

3.3 Materiais e Métodos ......................................................................................................... 100

3.3.1 Coleta de material .......................................................................................................... 100

3.3.2 Coleta de dados.............................................................................................................. 101

3.3.3 Extração do DNA e análise por microssatélite.............................................................. 101

3.3.4 Análise dos dados microssatélites ................................................................................. 105

3.3.5 Estimativa da frequência de acasalamento .................................................................... 106

3.3.6 Análise do parentesco (r)............................................................................................... 107

3.3.7 Razão sexual .................................................................................................................. 107

3.3.8 Medida da assimetria reprodutiva.................................................................................. 107

3.3.9 Análise das variáveis preditas pelos modelos de assimetria reprodutiva ...................... 108

3.3.10 Análise estatística ........................................................................................................ 108

3.4 Resultados......................................................................................................................... 108

3.4.1 Análise dos dados de microssatélites ............................................................................ 108

3.4.2 Frequência de acasalamento .......................................................................................... 109

3.4.3 Proporção sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas nas famílias de Euglossa melanotricha ........................................................................................................... 111

3.4.4 Assimetria reprodutiva .................................................................................................. 114

3.4.5 Análise combinada: ....................................................................................................... 114

3.4.5.1 Assimetria reprodutiva versus parentesco, policiamento do ovo e agressão.............. 114

3.4.5.2. Parentesco versus produtividade total ....................................................................... 117 3.5 Discussão .......................................................................................................................... 120

3.5.1 Análise de microssatélites ............................................................................................. 120

3.5.2 Frequência de acasalamento nas famílias de Euglossa melanotricha ........................... 120

3.5.3 Razão sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas de Euglossa melanotricha ........................................................................................................................... 121

3.5.4 Parasitismo e a razão sexual da prole ............................................................................ 123

3.5.5 Assimetria reprodutiva e o parentesco das fêmeas adultas em Euglossa melanotricha ...... 123

3.6 Referências Bibliográficas................................................................................................ 129

ANEXOS ............................................................................................................................... 135

CAPÍTULO 1: Introdução Geral

Cap. I – Introdução Geral | 14

s investigações sobre o comportamento social em Hymenoptera têm

tradicionalmente enfocado associações entre duas ou mais fêmeas

compartilhando o mesmo ninho, especialmente, quando interações

cooperativas no cuidado com a prole são manifestadas (Wilson 1971). A razão para este

enfoque é óbvia, pois as associações mais complexas encontradas nos himenópteros sociais

são compostas por um grande número de fêmeas completamente ou parcialmente estéreis

(operárias) especializadas no cuidado da prole e manutenção do ninho, e uma única ou poucas

fêmeas férteis (rainhas), especializadas na produção de ovos.

O modelo da seleção parental proposto por Hamilton (1964) forneceu um grande

avanço conceitual para a compreensão da evolução da socialidade, e se mantém como maior

paradigma teórico em relação à compreensão da evolução social em insetos.

Uma das predições do modelo afirma que em ninhos com apenas uma rainha que tenha

acasalado apenas uma vez (monoginia/monoandria), as operárias podem alocar seus esforços

entre dois tipos reprodutivos: fêmeas ou irmãs completas com as quais terão 75% de genes

compartilhados, e machos ou irmãos com os quais terão 25% dos genes em comum. Essa

assimetria na produção de fêmeas e machos, numa razão de 3:1 ao invés do investimento

igualitário de 1:1, como previsto pela teoria da alocação sexual em populações panmíticas

(Fisher 1930), pode gerar conflitos de interesse no momento da determinação do sexo da prole

(Trivers & Hare 1976). Em outras palavras, a estrutura social pode ser mantida pela

discriminação parental através do tratamento diferencial a coespecíficos como função da sua

relação genética (revisado por Gadagkar 1985).

Estudos têm testado as premissas do modelo, e demonstrado correlação positiva entre

parentesco e o ganho genético individual seja ele pela reprodução direta ou indiretamente

através da ajuda a parentes (Alexander et al 1991, Keller & Nonacs 1993, West-Eberhard

2003, Seppä et al 2012). Contudo, apesar das idéias de Hamilton terem sido largamente

A


aplicadas principalmente na compreensão da estrutura social dos himenópteros (Hamilton

1964a,b), se atos altruístas são dirigidos diretamente a “parentes” que tenham sido

reconhecidos como tal, ainda é um assunto controverso (Sherman et al 1997). Há, portanto,

considerável interesse na investigação das pistas que podem estar envolvidas no

reconhecimento parental (Fletcher & Michener 1987), incluindo seres humanos (Weisfeld et

al 2003).

Em insetos sociais, o reconhecimento de parentes envolve pistas de odor, sendo a

sinalização química fundamental para resolução dos conflitos reprodutivos. Os sinais

químicos podem compor uma assinatura individual que contribui para o reconhecimento de

companheiras de ninho (Nunes et al 2008, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Emery

& Tsutsui 2013). Além de desempenharem um importante papel na sinalização do status

social ou reprodutivo, fertilidade, e alocação de tarefas (Nunes et al 2009, 2010, 2014, Smith

et al 2009, van Zweden 2010, Evison et al 2012).

Estudos sobre os mecanismos envolvidos na resolução de conflitos foram realizados

em insetos sociais (revisado em Ratnieks et al 2006), mas pouco se sabe sobre a evolução e

manutenção desses mecanismos em insetos primitivamente sociais, além do papel que a

seleção parental assume em tais sociedades. Hipóteses concorrentes são baseadas em

conceitos como manipulação parental e interações mutualísticas entre indivíduos não

aparentados (Wilson 1971).

Os mecanismos de regulação social são de particular interesse em táxons de insetos

com níveis rudimentares de socialidade, em que conflitos reprodutivos são passíveis de

ocorrer devido ao sistema haplodiploide e à totipotência reprodutiva fisiológica das fêmeas

(Ratnieks et al 2006, Zanette et al 2012). Uma importante questão sobre essas interações é

como as variações nas estratégias individuais podem contribuir para manter o sistema social

estável.


Em algumas espécies de insetos primitivamente sociais, a divisão de trabalho

reprodutivo é mantida de forma ativa por rainhas ou “pacemakers” centrais. O comportamento

agressivo ou de domínio pode resultar na intimidação ou supressão da atividade reprodutiva

das operárias ou subordinadas (West-Eberhard 1969, 1977, Reeve 1991). A natureza

altamente direcional das interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode

ter uma base olfativa (revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977)

sugeriu que a regulação reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização

química, e isso tem sido demonstrado em testes experimentais realizados com vespas do

gênero Polistes e Ropalidia e em formigas Ponerinae (Downing & Jeanne 1985, Premnath et

al 1996, Hannonen et al 2002).

No topo desta variação em estratégias reprodutivas, as relações entre os indivíduos

dentro dos grupos sociais podem variar. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que

assumem a dominância reprodutiva (alta assimetria), ou podem ser formados por indivíduos

que compartilham de forma igualitária a reprodução (baixa assimetria) (Emlen & Wrege

1992).

Nas últimas décadas, os mecanismos de regulação social pela assimetria reprodutiva

ou “reproductive skew” têm sido amplamente discutidos. Essa percepção levou a formulação

de modelos teóricos que prevêem como a assimetria reprodutiva pode ser afetada por fatores

genéticos, ecológicos e comportamentais (Reeve & Ratnieks 1993, Reeve & Keller 1995,

Reeve 1998, Reeve et al 1998, Johnstone 2000, Reeve & Keller 2001, Bolton et al 2006,

Reeve & Shen 2006, Lucas et al 2011, Seppä et al 2012, Reeve & Shen 2013).

A teoria de Vehrencamp (1983) da assimetria reprodutiva, adaptada aos insetos sociais

por Reeve & Ratnieks (1993), prevê que uma fêmea dominante tem controle total sobre a

partilha da reprodução. No entanto, a dominante pode conferir uma 'concessão' reprodutiva

para outra fêmea, a fim de incentivá-la a permanecer no grupo. A concessão está relacionada


as relações parentais entre as fêmeas reprodutivas, de modo que, quanto maior o parentesco,

menor o incentivo para reprodução direta, e as operárias ou subordinadas alocariam mais

esforço no cuidado da prole da rainha ou dominante; do contrário, quanto menor o parentesco,

maior o incentivo, e, portanto, maiores as chances das operárias participarem da produção da

colônia (Reeve 1991). Esse contrato social conhecido como modelo de concessão foi proposto

com base nas associações de fêmeas do gênero Polistes (Reeve & Ratnieks 1993), uma vespa

primitivamente social.

Outro modelo conhecido como cabo-de-guerra ou ‘tug-of-war’ tem sido aplicado para

explicar a assimetria reprodutiva em abelhas, formigas e vespas (Field et al 1998, Hogendoorn

& Velthuis 1999, Reeve et al 2000, Hannonen et al 2002, Seppä et al 2012, Sumner et al

2002, Paxton et al 2002, Field & Cant 2009, Shen et al 2011). O modelo prevê que fêmeas

dominantes e subordinadas têm controle limitado sobre a reprodução e devem alocar mais

esforços para aumentar as suas próprias cotas e contribuir para produção total do grupo. A

principal previsão do modelo é que a assimetria reprodutiva está negativamente

correlacionada com o parentesco (Reeve et al 1998).

Dentro da família Apidae, as abelhas euglossine (Tribo Euglossini) formam o grupo

mais basal, monofilético e distinto dos Apinae corbiculados (Apini + Meliponini + Bombini)

por serem as únicas que não formam grandes ninhos e diferenciação morfofisiológica entre

castas (Roig-Alsina & Michener 1993). As abelhas euglossine possuem atualmente cinco

gêneros e mais de 200 espécies, sendo Euglossa, Eulaema e Eufriesea constituídos por

espécies coletoras de pólen, e Aglae e Exaerete constituídos por espécies cleptoparasitas

(Nemésio & Ramussen 2011).

O gênero Euglossa inclui 129 espécies amplamente distribuídas, encontradas desde o

norte do México até o Paraguai, norte da Argentina e Jamaica (Michener 2000, Nemésio &

Ramussen 2011). As abelhas desse gênero apresentam pequeno ou médio porte (8-19 mm),


possuem poucos pelos, tegumento metálico brilhante e coloração que varia do verde ao azul,

violeta e cobreado (Michener 2000).

Estas abelhas exibem comportamento de nidificação que varia do solitário (Kimsey

1987, Michener 2000, Cameron 2004), comunal (Garófalo et al 1998, Soucy et al 2003, Otero

et al 2008) ao primitivamente social, além das espécies com multifêmeas nos ninhos que

exibem divisão de tarefas, divisão reprodutiva e sobreposição de gerações (Cocom Pech et al

2008, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012). Em espécies

com multifêmeas nos ninhos, os estudos têm mostrado monopólio reprodutivo por uma única

fêmea que inclui interações agressivas e oofagia de ovos (Garófalo 1985, Ramirez-Arriaga et

al 1996, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012).

Dada a diversidade de sistemas sociais das abelhas euglossine que varia do solitário ao

primitivamente social com multi-fêmeas nos ninhos, entender como os conflitos de interesse

surgem e como evoluem em populações desse táxon são de particular interesse para

compreensão dos mecanismos envolvidos na evolução da socialidade em Hymenoptera.

Além desses aspectos, estudos prévios têm especulado que o comportamento solitário

das abelhas euglossine seria uma reversão evolutiva, com algumas espécies de Euglossa

retendo alguns traços eussociais (Cameron 2004, Cardinal et al 2010), enquanto outros

estudos sugerem que a eussocialidade foi herdada de um ancestral comum a todos os

corbiculados (Zucchi et al 1969, Chavarría & Carpenter 1994, Noll 2002, Canevazzi & Noll

2014). Portanto, o estudo da biologia comportamental das abelhas euglossine pode iluminar as

interpretações da evolução da socialidade em abelhas corbiculadas.

Até o momento, são poucos os estudos empíricos sobre os mecanismos da regulação

social em espécies com nível rudimentar de socialidade (Paxton et al 2002, Langer et al 2004)

e são ausentes estudos com abelhas euglossine. Os estudos atualmente disponíveis com

Euglossa foram baseados em dados descritivos de observações comportamentais. Contudo,


dados empíricos e análise do parentesco das famílias desse táxon são necessários para se

evitar avaliações incorretas dos traços comportamentais, e, como consequência, a

interpretações equivocadas sobre a evolução da eussocialidade neste grupo.

1.1 Objetivos

O principal objetivo dessa tese foi investigar os conflitos reprodutivos e as resoluções

destes através da análise das relações sócio-etológicas mediadas por sinalização química e

parentesco genético intracolonial em um grupo que apresenta nível rudimentar de socialidade.

Nosso modelo de estudo foi a espécie Euglossa melanotricha, por diferentes motivos. O

primeiro foi a possibilidade de estudar uma população encontrada em área urbana, com

registro de ocorrência de ninhos há mais de 10 anos. O segundo motivo diz respeito à

importância ecológica da espécie. Eg. melanotricha é abundante em áreas de Cerrado e

Caatinga (Nemésio & Faria Jr. 2004, Andrade-Silva et al 2012). O último se refere a questões

práticas como facilidade na transferência dos ninhos e manipulação.

De acordo com o objetivo principal da tese as questões norteadoras do trabalho foram:

a. Quais os conflitos reprodutivos em Euglossa melanotricha? b. Fêmeas subordinadas

participam da produção dos ninhos?

b. A sinalização química representa uma das formas de resolução dos conflitos sobre a

reprodução?

c. Qual o parentesco genético intracolonial? d. conflitos sobre a reprodução mediados

pelas interações de dominância são influenciados pelo parentesco entre as fêmeas? e.

Conflitos sobre a partilha na reprodução e na produção de machos têm relação com o

parentesco?


Este estudo foi dividido em etapas que consistiram em sessões de observação, sessões

experimentais (manipulação), e análise química e genética. Inicialmente foram feitos registros

do comportamento das fêmeas nos ninhos para identificação do status social ocupado por cada

uma delas, e registro das interações comportamentais. Em seguida, foram feitas as sessões

experimentais com manipulação das fêmeas adultas e, finalmente, foram feitas as análises da

composição do perfil químico cuticular das fêmeas, e do parentesco genético das fêmeas

adultas e da sua prole pela análise de microssatélites.

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CAPÍTULO II: Regulação reprodutiva em Euglossa melanotricha: Contexto social, fertilidade e sinalização química (Manuscrito submetido a Animal Behavior em Jan/2015: ANBEH-D-15-00021-Anexo XLIV).

Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 26

2.1 Introdução

Em insetos sociais, a comunicação do status social fornece um mecanismo pelo qual

membros de um grupo podem avaliar o status reprodutivo de um indivíduo reduzindo assim o

conflito (Smith et al 2009). A estrutura social é então protegida por sistemas de

reconhecimento eficientes com base em sinais químicos (revisado por D'Ettorre & Lenoir

2010).

De fato, insetos sociais vivem em um mundo de odores; mais de 100 glândulas

exócrinas que emitem sinais químicos reguladores da organização social e da reprodução na

colônia já foram caracterizadas no grupo (Billen 2004). Os sinais químicos ou feromônios

podem compor uma assinatura individual que contribui para o reconhecimento de

companheiras de ninho (revisado por Blomquist & Bagnères 2010, van Zweden & D’Ettorre

2010), além de desempenharem um importante papel na sinalização do status social,

fertilidade, e alocação de tarefas (Nunes et al 2009, 2014, Smith et al 2009, Evison et al

2012).

Sinais químicos são divididos em compostos voláteis, secretados pelas glândulas

exócrinas, e hidrocarbonetos, ou feromônios de contato, encontrados na cutícula (Howard

1993). A função primária dos hidrocarbonetos é proteger os insetos da perda de água e

formarem uma barreira contra micro-organismos (Jackson & Blomquist 1976, Lockey 1988,

Gibbs 2002). São compostos hidrofóbicos de cadeia longa que podem ter origem endógena,

ou serem adquiridos a partir do meio externo (Wigglesworth 1964, Carlin 1983, revisado por

Lorenzi et al 1996, Leonhardt et al 2013).

Os compostos de origem endógena são sintetizados pelos oenócitos, localizados perto

da epiderme ou dispersos no interior do corpo. Oenócitos são frequentemente associados com

corpos de gordura, uma importante fonte de ácidos graxos, que podem servir como


precursores para a biossíntese de hidrocarbonetos (ver Diehl 1975, Howard & Blomquist

2005, Juarez & Fernandez 2007). Eles ainda podem ser produzidos por glândulas

tegumentares da classe III, glândulas produtoras de feromônios de comunicação (Guerino

1999).

Os hidrocarbonetos são transportados entre os diferentes tecidos da epicutícula,

gordura corporal e ovários, associados à principal lipoproteína hemolinfática, a lipoforina

(Lp) (Chino et al 1985). Esta proteína está envolvida no transporte seletivo de feromônios

sexuais sobre a superfície cuticular (Schal et al 2001).

Na cutícula das abelhas, formigas e vespas usualmente são encontrados

hidrocarbonetos com 20 a 40 átomos de carbono (Akino 2006). Além dos compostos lineares,

são descritos compostos ramificados com um a três radicais metil ou etil (Howard 1993). São

encontrados também, compostos insaturados com uma ou duas ligações duplas (Howard &

Blomquist 2005, Akino 2006, revisado por Blomquist & Bagnères 2010). Nestes grupos de

insetos, hidrocarbonetos cuticulares constituem a principal fonte de sinais de comunicação

(revisado por Blomquist & Bagnères 2010, D'Ettorre & Lenoir 2010, Smith et al 2012).

Em espécies de insetos sociais, as rainhas sinalizam sua presença através de

feromônios e a resposta das operárias a esses sinais incluem o início da trofalaxia, a inibição

da produção de novas rainhas e, em algumas espécies, a supressão da atividade ovariana

(Dietemann et al 2005, Lommelen et al 2006, Nunes et al 2014). O potencial reprodutivo da

rainha transmitido pelo seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares pode estar estreitamente

associado com a ativação dos ovários ou somente ao seu status social definido a partir da

formação de hierarquias reprodutivas estáveis (revisado por Monnin 2006, Dapporto et al

2010, van Zweden 2010, Teseo et al 2013).

A sinalização química é particularmente interessante quando a regulação envolve

grupos de fêmeas que são potencialmente capazes de reproduzir. Entre os himenópteros


sociais, as formigas têm sido o melhor grupo estudado. Neste grupo, foram descritas

diferenças nos perfis de hidrocarbonetos cuticulares correlacionados à regulação reprodutiva

em 21 espécies representadas por 16 gêneros (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).

A importância da sinalização química na competição entre fêmeas com a mesma

condição reprodutiva é corroborada por vários estudos que mostram que as mudanças

importantes na composição do perfil de hidrocarbonetos cuticulares acompanham as

modificações fisiológicas quando envolvem as fases de pós-acasalamento ou ainda após o

estabelecimento da hierarquia de dominância (Kocher et al 2010,Foitzik et al 2011).

Em algumas espécies de abelhas, formigas e vespas, interações de dominância são mais

intensas depois que as colônias se tornam órfãs ou quando a hierarquia de dominância reprodutiva

é estabelecida pela primeira vez (Monnin & Peeters 1999, revisado por Ratnieks et al 2006). As

agressões tendem a diminuir logo que um ou poucos indivíduos assumem a dominância

reprodutiva (Monnin & Peeters 1999, Cuvillier-Hot et al 2004). Esta redução parece coincidir

com o desenvolvimento de um perfil de hidrocarbonetos cuticulares específico em indivíduos que

assumem a dominância (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).

Esse comportamento foi amplamente estudado em formigas, e neste grupo não ocorre

divisão reprodutiva em colônias órfãs somente por meio da regulação física ou de

dominância, sem que ocorra sinalização química (Blomquist & Bagnères 2010). A maioria

das descrições foi feita em estudos com espécies primitivamente sociais, proporcionando a

base para a identificação de uma rainha saudável e reprodutiva (Martin & Drijfhout 2009,

revisado por Blomquist & Bagnères 2010).

De acordo com a hipótese da "sinalização honesta", os odores emitidos por fêmeas

reprodutivas sinalizam de forma confiável tanto seu status de acasalamento como sua

fertilidade, e a resposta dos outros membros do grupo deve ser proporcional ao potencial

reprodutivo da rainha (Hannonen et al 2002, Evison et al 2012).


Rainhas da espécie de formiga Camponotus floridanus, marcam seus ovos com os

mesmos compostos presentes na sua cutícula. Esses ovos são distribuídos pelas operárias ao

longo do ninho indicando dessa forma a presença de uma rainha fértil dentro da colônia o que

resulta em ausência de oviposição das operárias (Endler 2004, 2006).

Efeitos comportamentais e fisiológicos do feromônio da rainha sobre a reprodução das

operárias têm sido demonstrados em algumas espécies de formigas, abelhas e vespas (Slessor

et al 2005, Holman et al 2010, Nunes et al 2014, van Zweden et al 2014, van Oystaeyen et al

2014) e em espécies de cupins (Matsuuraa et al 2010). Na formiga Lasius niger, por exemplo,

o composto 3-metilhentriacontano foi o principal componente da cutícula de rainhas (Lenoir

et al 2009). Operárias expostas a esse composto apresentaram uma grande resposta elétrica

nas antenas, medido por um eletroantenógrafo, além de apresentarem uma diminuição da

agressão a objetos expostos ao composto. Testes com o sintético do composto resultaram em

inibição do desenvolvimento ovariano nas operárias, comprovando ser o feromônio de

esterilidade proveniente de compostos cuticulares (Holman et al 2010).

Em insetos primitivamente sociais, o estudo dos perfis individuais de hidrocarbonetos

cuticulares é particularmente interessante, pois a complexidade social envolve interações entre

fêmeas sem distinção morfológica entre rainhas e operárias, em que todas as fêmeas são

potencialmente capazes de reproduzir e produzir machos e fêmeas (Peeters 1993). Neste grupo de

insetos, interações agressivas resultam no estabelecimento de relações hierárquicas (Röseler &

van Honk 1990, Augusto & Garófalo 2010). Contudo, a natureza altamente direcional das

interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode ter uma base olfativa

(revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977) sugeriu que a regulação

reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização química, e isso tem sido

demonstrado em testes experimentais feitos com vespas do gênero Polistes e Ropalidia e em

formigas do gênero Formica (Downing & Jeanne 1985, Premnath et al 1996, Hannonen et al

2002, Blomquist & Bagnéres 2010).


Apesar da existência de uma extensa base de dados para as abelhas das tribos Bombini

(Ayasse et al 1999), Apini (Wossler & Crewe 1999) e Meliponini (Nunes et al 2014), não há

evidência disponível sobre a possibilidade de regulação social química em abelhas euglossine.

Neste estudo, foram investigados os mecanismos que regulam a estrutura social em famílias

de Euglossa melanotricha com ênfase na sinalização química. Para a investigação dos

mecanismos, foi testado como a dominância reprodutiva é estabelecida e mantida nessas

famílias. Uma das previsões do estudo é que a regulação reprodutiva envolve sinais químicos

além do controle físico ou de dominância. Contudo, as agressões direcionadas a indivíduos

subordinados afetam o comportamento desses indivíduos, mas não inibe seu desenvolvimento

ovariano. Adicionalmente, foram avaliados a partir de uma série de experimentos de remoção

e reintrodução e dos registros das invasões nos ninhos, se o status de indivíduos dominantes

(residentes ou invasores) foi refletido pelo seu perfil químico cuticular.

2.2 Materiais e Métodos

2.2.1 Espécie estudada

Euglossa melanotricha é uma abelha de tamanho médio (comprimento do corpo 13

mm), tegumento metálico brilhante e de cor azul, comumente encontrada em áreas com

vegetação aberta no Brasil e na Bolívia (Nemésio 2009). No Brasil, a espécie encontra-se

distribuída nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste (Moure et al 2007, Nemésio

2009), sendo uma das mais abundantes em áreas de Cerrado e Caatinga (Andrade-Silva et al

2012).

A fundação dos ninhos é solitária e as fêmeas das sucessivas gerações podem reutilizar

os ninhos, resultando em ninhos com multi-fêmeas. Ninhos reutilizados são ocupados por 2-5


fêmeas. Todas as fêmeas podem potencialmente acasalar e colocar ovos, embora somente

uma delas apresente comportamento de dominância (Andrade-Silva & Nascimento 2012). Um

processo de reutilização de ninho (R) é iniciado quando pelo menos duas fêmeas da mesma ou

de diferentes gerações reutilizam os ninhos ou quando novas associações são formadas por

fêmeas não aparentadas. A duração do processo de reutilização de ninhos (do início do

forrageamento, coleta de resina até à postura final das fêmeas) varia de 18 a 79 dias (46,4 ±

14,9 dias, n = 30 famílias). Após a fase de reutilização, as fêmeas interrompem as atividades

de nidificação e permanecem nos ninhos a maior parte do tempo. Este período de inatividade

dura de 15-63 dias (34,11 ± 11,7 dias) (Andrade & Silva 2012).

Neste estudo, as fêmeas foram removidas durante o período de inatividade como

forma de controlar o número de fêmeas em cada processo de reutilização do ninho. As

observações, manipulações e testes experimentais foram então reiniciados após a associação

entre fêmeas fundadoras e sua prole, entre recém emergidas ou entre fêmeas residentes e

invasoras.

2.2.2 Local de estudo

O estudo foi realizado em área residencial, situada na cidade de Campo Formoso

(10º30’00’’S e 40º19’00’’W), Chapada Diamantina, Bahia, Brasil (Fig. 1). O tipo climático

da região é tropical subúmido seco com precipitação variando de 302 a 1935 mm anuais, e

maior ocorrência de chuvas de março a agosto. A temperatura anual varia de 19 ºC a 28 ºC

(PERH 2010).


Figura 1. A - Município de Campo Formoso, com a localização da área de estudo. B – Localização dos ninhos na área urbana. Imagens feitas através do Software Google Earth 2011. C- Interior da sala onde os ninhos estão instalados.

C

A

B


2.2.3 Ninhos e protocolo de observações

Quatorze ninhos com multifêmeas de E. melanotricha foram acondicionados em

caixas de madeira (12 x 10 x 8 cm) cobertas com tampa de vidro. Os ninhos foram mantidos

sobre uma bancada e estiveram conectados ao meio externo através de um tubo plástico, de

modo que as abelhas podiam sair livremente para forragear (Fig. 2A, B, C, D e E). O

protocolo de transferência foi o mesmo adotado por Andrade-Silva e Nascimento (2012).

As observações comportamentais foram feitas continuamente através de uma

combinação de imagens de vídeo capturadas usando mini-câmeras (Citrox 5001 de cor digital

de dia/noite) e imagens focais com melhor resolução foram feitas com câmera digital -

modelo Sony HDR-CX580V. As câmaras foram posicionadas a cerca de 20 cm sobre a tampa

de vidro da caixa de madeira (Figura 2F e G).

As câmeras foram conectadas a um Microcomputador (Dell Vostro 260), onde as

imagens foram processadas e editadas (USB Camera Viewer 1.25) (Figura 2G). As análises

dos vídeos foram feitas diariamente e cópias foram armazenadas em DVD e HD externo. Para

facilitar a análise foram criadas sessões de 3 horas para leitura e registro dos dados, sem

intervalo, entre 6-9 h, 9-12 h, 12-15 h, 15-18 h, 18-21 h, 21-24 h, 24-3h, 3-6h. Duas análises

foram feitas por sessão, a primeira utilizando o método de todas as ocorrências para

montagem do repertório comportamental, e a segunda, o método ‘indivíduo focal’, como

forma de identificar a condição reprodutiva de cada fêmea (Altmann 1974). Ambos os

métodos seguiram o mesmo esquema: três vezes por semana durante os meses de

Janeiro/2013 a Abril/2013.

Como a fundação de ninhos em Euglossa melanotrica é solitária, todas as análises

comportamentais se referem às interações entre as fêmeas que ocorreram a partir do primeiro

processo de reutilização dos ninhos. A identificação das fêmeas foi feita com base em


características comportamentais. Ao emergirem, as fêmeas receberam uma marca com a

identificação do ninho, e, depois de registradas as interações, elas receberam uma segunda

marca indicando seu status ou condição reprodutiva. As marcações foram feitas no tórax das

fêmeas com pontos de caneta permanente colorida não-tóxica, sem cheiro e de secagem

rápida (Fig 2H).

Figura 2. A. Entrada do ninho de Euglossa melanotricha na parede de blocos. B e C. Retirada do ninho. D. Transferência para caixa de observação. E. Visualização das caixas na bancada. F. Microcâmera posicionada sobre o vidro. G. Equipamento utilizado para captura, registro e análise das imagens. H. Marcação de uma fêmea.

Durante o estudo, foram observadas 12 invasões nos ninhos por fêmeas ‘alienígenas’.

Assim, os diferentes grupos de fêmeas – dominante vs subordinadas, dominantes residentes vs

invasoras - foram analisados separadamente.

As observações foram focadas nos seguintes comportamentos:

(1) Dominância: dez pares de fêmeas com estrutura reprodutiva estável (ou seja,

fêmeas que permaneceram como dominante e subordinada por várias semanas) foram

filmadas por 24 h continuamente (240 dias; 5760 horas; LD 3:3 h). As observações foram

focadas nas interações de dominância, incluindo comportamentos como mordiscar (a


dominante ataca outra fêmea mordiscando a extremidade abdominal; Figura 3a), empurrar (a

dominante ataca outra fêmea dando cabeçadas no abdômen; Figura 3b), ameaçar com

sobrevôos (a dominante persegue a outra fêmea sem contato físico com sobrevôos de ameaça;

Figura 3c) e canibalismo dos ovos das subordinadas.

Foram então calculadas as taxas das interações de dominância para cada abelha, após

correção para a proporção de tempo gasto por abelhas em seus ninhos, no dia em questão. Os

resultados foram analisados utilizando o teste exato de Wilcoxon.

(2) Não-dominância ou não agressivo: envolveu os componentes ativos de interações

não-dominantes ou não agressivas entre os pares de fêmeas, como antenação e aproximação

(A dominante se aproxima e acompanha outra fêmea tocando as antenas durante as atividades

realizadas nos ninhos; Figura 4d e 4e). Como no caso do comportamento de domínio,

calculamos as taxas de interações de não-dominância de cada abelha, após correção para a

proporção de tempo gasto por essa abelha no seu ninho, no dia em questão.

(3) Comportamento de subordinação: As fêmeas subordinadas não demonstram

comportamento de defesa ou reação e se escondem embaixo do conjunto de células, recuam

ou saem dos ninhos para evitar o confronto.

(3) Outras atividades: a proporção de tempo que uma abelha esteve envolvida em

atividades fora ou dentro do ninho durante o período de monitoramento. Tais atividades foram

classificadas como:

a) Forrageamento: somente as fêmeas subordinadas saem do ninho para coleta de

resina e alimento larval;

b) Repouso: a fêmea permanece a maior parte do tempo dentro dos ninhos, sem

realizar atividades de forrageamento; a fêmea anda no ninho ou, muito raramente,

no substrato, sem realizar qualquer atividade aparente, que não seja para se

deslocar de um ponto para outro;


c) Auto limpeza: a abelha se limpa passando as pernas pelo corpo, antenas, uma

contra as outras e lambendo as pernas anteriores. Não há sincronia entre as regiões

a serem limpas. Nas regiões sensoriais a auto limpeza é entendida como uma

forma de manter desobstruídas as áreas receptoras. No corpo, além da limpeza,

pode ocorrer a manutenção de ferômonios e hidrocarbonetos cuticulares;

d) Postura de ovos: as subordinadas constroem um anel circular em torno da célula

(colar da célula) após a última deposição de alimento larval. Essas fêmeas então

fazem a postura imediatamente após a construção do colar, enquanto as fêmeas

dominantes aguardam as subordinadas opercularem as células para substituem os

ovos dessas fêmeas pelos seus.

A B

C

Figura 3. Representação esquemática das interações agressivas ou de dominância nos ninhos de Euglossa melanotricha: (A) Mordiscar, (B) Empurrar e (C) Perseguir com sobrevôos de ameaça. Fêmea dominante e Fêmea subordinada.


Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico das antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada.

Nos processos de reutilização de ninhos, foram quantificados o número de posturas

das subordinadas e o número de ovos substituídos pelas dominantes. Para auxiliar na

determinação da maternidade do ovo, cada ninho foi esquematizado com registro da ordem e

posição das células que tiveram os ovos substituídos (Figura 5). Os eventos são facilmente

observáveis, a oviposição envolve uma subordinada ou uma dominante inserindo o abdômen

dentro da célula (média de duração: subordinadas 120,80 ± 23,48 segundos, n = 76; e

dominantes 88,09 ± 16,70 segundos, n = 70) (Mann-Whitney, Z = 8,86 p <0.0001, n = 76), e

o canibalismo do ovo envolve a prolongada inserção da cabeça dentro da célula (duração

média: 158,35 ± 45,65 segundos, n = 70), seguido por rotação ou movimentos ascendentes e

descendentes, que indicam que o ovo está sendo consumido.

Figura 5. Esquema de um dos ninhos de Euglossa melanotricha. No círculo pontilhado, as células identificadas pela ordem de oviposição e substituição do ovo. OS – Ovos substituídos e ON – Ovo não substituído.

ED

1 cm

1 OS

2OS

3OS 4

OS5

OS6 OS

7ON 8

OS

9OS 10

OS


2.2.4 Experimentos

1. Remoção e reintrodução das fêmeas dominantes

As sessões experimentais foram conduzidas em cinco repetições para cada intervalo de

tempo (n = 30 reutilizações em 10 ninhos, Tabela 1) entre os meses de maio/2013 a

outubro/2013. Cada repetição foi feita durante um novo processo de reutilização de um ninho,

logo após a emergência ou associação das fêmeas (Tabela 1). O número de fêmeas associadas

em cada reutilização de ninho variou entre dois e cinco. Contudo, apenas um par de fêmeas

foi monitorado em cada repetição. As fêmeas que emergiram após a identificação do par

residente foram removidas do experimento (uma a três fêmeas por repetição).

Por ninho, em cada processo de reutilização, as sessões experimentais foram

realizadas em três dias, entre 6 h e 18 h. No primeiro dia, foram observados os ninhos como

descrito no protocolo de observações, sem qualquer tipo de manipulação. Foram designadas

como dominantes, as fêmeas que apresentaram comportamento agressivo, passaram a maior

parte do tempo no ninho, comeram e substituíram os ovos postos por outras fêmeas pelos

seus. Por outro lado, as fêmeas subordinadas foram aquelas que realizaram atividades

externas, tiveram seus ovos comidos e sofreram as intervenções agonísticas.

Em cada ninho, uma dominante foi removida no segundo dia de manhã, entre 0500 h e

0600 h. As dominantes removidas foram mantidas em gaiolas individuais feitas com ‘bobs’

plásticos para cabelo, tamanho 3 (2,8 x 6,3 cm) (Figura 6). Cada gaiola foi coberta com tule e

suas extremidades fechadas com papelão. Um microtubo do tipo Eppenforf (2 ml) foi

pendurado dentro de cada gaiola com solução de mel a 40% para alimentação das fêmeas

(Figura 6). As dominantes foram mantidas nas gaiolas em intervalos que variaram de 12 a 72

horas (Tabela 1).


Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos ninhos de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas.

Os testes experimentais consistiram na manipulação de 30 fêmeas para análise do (1)

efeito da remoção das fêmeas dominantes sobre a atividade reprodutiva das subordinadas e

análise do (2) efeito da remoção com posterior reintrodução sobre a capacidade das

dominantes em reconhecerem células com ovos das subordinadas.

2. Remoção das fêmeas subordinadas

Seguindo os mesmos procedimentos utilizados para remoção das dominantes (Tabela

1), foram conduzidas as sessões experimentais nas quais as subordinadas foram removidas de

10 ninhos (durante 30 processos de reutilização), com 5 repetições para cada intervalo de

tempo (Tabela 1). Como descrito anteriormente para os experimentos de remoção das

dominantes, as sessões experimentais foram iniciadas com pares de fêmeas adultas em

processo de reutilização de um ninho. Os experimentos foram realizados entre

novembro/2013 e abril/2014. Após verificar a ordem hierárquica dos pares, as subordinadas

foram removidas permanentemente em cada uma das repetições para avaliar o efeito da

presença das subordinadas na produtividade das dominantes. Para avaliar o efeito da ausência


da subordinada na produtividade de cada ninho, as taxas de postura de ovos foram

comparadas antes de depois da remoção das subordinadas usando o teste de Wilcoxon.

Ao final dos testes experimentais, as fêmeas foram retiradas dos ninhos usando pinças

limpas, e colocadas em frascos secos previamente lavados com hexano. Em seguida, as

fêmeas foram sacrificadas por resfriamento, congeladas a -10º C, e armazenadas para análise

do desenvolvimento ovariano e para extração do perfil químico cuticular.

Tabela 1. Experimentos de remoção e reintrodução das dominantes em sucessivos e diferentes processos de reutilização de ninhos, com o número de repetições, de fêmeas e o tempo de permanência das dominantes fora do ninho.

Número de fêmeas Experimentos Repetições Ninho/Reuso Dominantes Subordinadas

Tempo fora do ninho (h)

1 N1R1 1 1 12h 2 N2R1 1 1 12h 3 N31 1 1 12h 4 N4R1 1 1 12h

1

5 N5R1 1 1 12h 1 N6R1 1 1 24h 2 N7R1 1 1 24h 3 N8R1 1 1 24h 4 N9R1 1 1 24h

2

5 N10R1 1 1 24h 1 N1R2 1 1 36h 2 N2R1 1 1 36h 3 N3R2 1 1 36h 4 N4R2 1 1 36h

3

5 N5R2 1 1 36h 1 N6R2 1 1 48h 2 N7R2 1 1 48h 4 3 N8R2 1 1 48h 4 N9R2 1 1 48h 5 N10R2 1 1 48h 1 N1R3 1 1 60h 2 N2R3 1 1 60h 5 3 N3R3 1 1 60h 4 N4R3 1 1 60h 5 N5R3 1 1 60h 1 N6R3 1 1 72h 2 N7R3 1 1 72h 6 3 N8R3 1 1 72h 4 N9R3 1 1 72h

5 N10R3 1 1 72h


2.2.5 Condições fisiológicas das fêmeas e razão sexual da prole

Os ovários das fêmeas foram removidos cuidadosamente em solução de Ringer e o

material foi fotografado em microscopia de contraste de fase (400x). O conteúdo dos ovários

foi quantificado por contagem do número de oócitos que eram maiores do que 70% do

comprimento de um óvulo maduro (LME), e foi medido o comprimento de oócitos maduros

(não incluindo a câmara adjacente aos trofócitos). A espermateca foi removida e colocada

numa lâmina de uma solução 1: 1 de glicerina e álcool (70%) para a análise dos conteúdos.

A razão sexual da prole foi calculada a partir da divisão do número de fêmeas pelo

total de indivíduos (machos + fêmeas) (Silveira Neto et al 1976). Para verificar a existência de

conflitos potenciais, a razão sexual foi determinada pela proporção de machos que emergiram

dos ovos das subordinadas e das dominantes.

2.2.6 Medidas morfométricas das fêmeas

Durante as observações comportamentais foram registradas 12 comutação de fêmeas entre

ninhos. Cinco fêmeas invasoras (n = 12 invasões) substituíram com sucesso a posição da

dominante reprodutiva dos ninhos, enquanto sete invasoras (n = 12 invasões) assumiram a

posição de subordinadas. Para testar se a relação entre o tamanho da fêmea confere vantagem em

termos de ocupação, foram tomadas as medidas das fêmeas invasoras e residentes. Cada abelha

foi colocada em um aparato de metal preenchido por material esponjoso com cavidades de

diferentes tamanhos. Dentro dessa cavidade, uma placa de vidro foi colocada sobre o indivíduo, a

fim de que sua cabeça e tórax fossem mantidos em posição adequada para as medições. As

imagens foram capturadas com uma câmera fotográfica acoplada a um estereomicroscópio (Leica

MZ16), com auxílio de câmera digital, e as medidas realizadas nas fotografias, usando o software

Leica Soft IM50. Para as análises realizadas neste trabalho, foi considerada apenas a distância

intertegular, medida padrão utilizada em Bombus (Goulson et al 2002, Couvillon & Dornhaus


2010) e nas espécies solitárias (Cane 1987). A confirmação taxonômica das fêmeas foi feita pelo

professor Dr. André Nemésio (Universidade Federal de Uberlândia).

2.2.7 Extração de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas

A comparação do perfil químico cuticular das fêmeas de Euglossa melanotricha foi

feita a partir da análise dos indivíduos provenientes de 14 ninhos. Foram então amostradas as

fêmeas fundadoras (n = 12 ninhos), e as fêmeas que reutilizaram os ninhos durante o processo

de monitoramento (n= 30 processos de reutilização de ninhos; Tabela 1). Ao todo foram

amostradas, 12 fêmeas fundadoras, 30 dominantes residentes, 30 subordinadas residentes e 12

invasoras, durante as etapas de manipulação e testes experimentais.

As 12 fêmeas fundadoras foram coletadas após encerrarem as atividades de nidificação ou

iniciarem o período de inatividade. As fêmeas dominantes e subordinadas foram coletadas após o

estabelecimento da hierarquia e observações das interações comportamentais. Neste estudo,

fêmeas fundadoras foram inseridas na análise como grupo controle, uma vez que o perfil cuticular

dessas fêmeas não é teoricamente dependente das interações sociais.

Para caracterização do perfil cuticular, as fêmeas previamente coletadas e mantidas

sob refrigeração (-10ºC), foram submetidas a extração dos compostos cuticulares feito por

meio de banho em solvente hexano a 500 µl por 2 minutos. Os extratos foram analisados no

Laboratório de Ecologia e Comportamento de Insetos Sociais na Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto, SP, em sistema de Cromatografia a gás acoplado à Espectrometria de Massas

(SHIMADZU, modelo GCMS-QP2010 relativo ao processo Fapesp No. 10/10027-5)

equipado com coluna Rtx-5MS e hélio como gás carreador à 1 ml/min, utilizando o método

ionização eletrônica de 70V (EI). O volume de injeção foi de 1,5µl em uma temperatura

inicial de 50ºC, mantida por 1 minuto, seguida de um acréscimo de 10ºC/min até 300ºC, e

tempo de espera de 15 minutos. Análises foram feitas em modo splitless.


2.2.8 Análises químicas: comparação entre os perfis cuticulares das fêmeas

O perfil químico individual das fêmeas foi analisado com o auxílio do programa

GCMSsolutions para Windows (Shimadzu Corporation). Devido aos diferentes tempos de

retenção de cada soluto na coluna cromatográfica, os picos cromatográficos foram

apresentados em diferentes posições. Cada pico contém todas as informações obtidas pelo

espectrômetro de massa. A quantificação foi realizada com base nas áreas de pico obtidas

pelos cromatogramas (Singer, Espelie 1992).

Para comparação, uma amostra de solução de padrões de alcanos (C15-C40, em tolueno,

Fluka®) foi submetida à cromatografia sob as mesmas condições as quais foram submetidas

todas as amostras das fêmeas. A partir dos tempos de retenção dos alcanos da amostra padrão

e dos tempos de retenção dos compostos das amostras, foi empregada a seguinte fórmula:

IRc= 100.N + 100 (TRc-TRa/TRp-TRa), onde: IRc= índice de retenção do composto, ou

índice de Kováts; N= número de carbonos do alcano de tempo de retenção imediatamente

inferior ao composto; TRc= tempo de retenção do composto; TRa= tempo de retenção do

alcano imediatamente anterior ao composto; TRp= tempo de retenção do alcano

imediatamente posterior ao composto.

Identificação da posição das ligações duplas em alcenos

Para a identificação da insaturação dos alcenos encontrada nos perfis químicos das

fêmeas foram realizadas reações de derivatização dos extratos de hexano contendo 10

indivíduos para cada grupo analisado (fundadora, dominante residente, subordinada e

invasora) (Carlson et al 1989). Os extratos de cada grupo foram secos sob fluxo de nitrogênio

e ressuspensos em 200 µl de hexano, seguido de 200 µl de dimetildissulfide (DMDS) (Sigma-

Aldrich®) e 100 µl de solução de iodo (iodo à 6%, em éter etílico). Os frascos foram mantidos


em agitador magnético por 24 horas, em temperatura ambiente. Após esse período, 4 ml de

hexano e 4 ml de solução de tiossulfato de sódio (4%, em água destilada) foram adicionados.

A fase orgânica foi extraída e à esta fração foi adicionado sulfato de sódio em quantidades

suficientes para a completa extração da água restante. A solução foi seca, e 50 µl de hexano

adicionada. Após o término da reação, as amostras foram analisadas em CG-EM, seguindo

protocolo de temperatura descrito por Carlson et al (1989).

Os índices de retenção ou índices de Kováts (1958) e os espectros de massa dos

compostos foram comparados com os índices encontrados por Adams (1995) e pelas bibliotecas

digitais FFNSC Library (Flavor and Fragrance Natural and Synthetic Compounds) e NIST-08.

2.2.9 Análises estatísticas

As variáveis comportamentais e fisiológicas foram comparadas utilizando modelos

lineares generalizados mistos, GLMMs (Bolker et al 2009). Inicialmente o GLMM foi testado

para verificar se o nível de agressão, medido pela proporção de comportamentos agressivos

durante período observado foi influenciado pelo status reprodutivo, tamanho do corpo e / ou

desenvolvimento ovariano. Em seguida, foi testado se o canibalismo dos ovos também foi

regulado pela dominância ou tamanho corporal. Cada tratamento foi especificado como um

efeito fixo, e a identidade do ninho (procedência) como um efeito aleatório (Neter et al 1996).

Para as análises químicas, os compostos quantificados pela análise individual foram

agrupados em n-alcanos, alcenos e alcanos ramificados, e suas proporções médias foram

comparadas entre os grupos de fêmeas. Para esta análise, os valores da área de cada pico

(expressos em % relativa de cada composto) foram analisados pela ANOVA e pelo teste F. O

teste F foi utilizado para verificar a significância estatística da diferença entre as médias.

Os dados dos perfis químicos obtidos pelo GC-MS foram então comparados entre os

grupos experimentais pela análise estatística multivariada. A Análise dos principais


componentes (PCA) foi usada para se definir os principais picos de compostos a serem

comparados. Posteriormente, análise discriminante stepwise foi utilizada para se contrastar o

perfil químico cuticular dos indivíduos dos grupos experimentais formados. Substâncias

ausentes na maior parte dos indivíduos de um grupo foram excluídas das análises estatísticas.

Os compostos apontados pela análise dos componentes principais como responsáveis por

menos de 5% de contribuição para os dois primeiros fatores dessa análise, não foram

utilizados na análise discriminante.

Os compostos escolhidos para a análise discriminante foram reajustados para 100%.

Para se evitar erros na composição dos dados amostrais (Aitchison 1986), a área de cada pico

apontado pelo cromatograma foi transformada de acordo com a seguinte fórmula:

Z = ln [ Ap / g (Ap) ],

onde Ap é a área do pico, g (Ap) é a média geométrica entre os compostos dentro de

um mesmo indivíduo e Z é a área transforma do pico.

A interpretação dos resultados da análise multivariada baseia-se fundamentalmente na

comparação dos valores de F e das distâncias de Mahalanobis. Valores de F fornecem dados

sobre a significância da discriminação; as distâncias de Mahalanobis são calculadas entre os

grupos, dois a dois, para compreensão das distâncias entre as nuvens de pontos a serem

comparadas. Porcentagens de indivíduos corretamente classificados são também dadas como

forma de avaliar a relevância da discriminação dos diferentes hidrocarbonetos cuticulares

utilizados como preditores dos membros de cada grupo.

Para análise individual dos compostos que mais contribuíram para discriminar entre

fêmeas dominantes e subordinadas, os valores da área de cada pico selecionados pela

discriminante (n=11) foram comparados entre os dois grupos de fêmeas e então sua

significância foi testada através do teste t para amostras independentes por grupo. Todas as

análises foram feitas no Statistica 10.0 (Statsoft, Tulsa)


2.3 Resultados

2.3.1 Interações de dominância em Euglossa melanotricha

Durante os 240 dias de monitoramento nos ninhos, foram registrados 3965 eventos

agonísticos (média ± desvio padrão = 33,04 ± 30,57, n = 14 ninhos), o que permitiu determinar a

classificação hierárquica das abelhas com sucesso. A natureza da dominância foi significativamente

unidirecional em todos os ninhos (Tabela 2). Em outras palavras, interações foram sempre

direcionadas as subordinadas pelas fêmeas dominantes. Do número total de eventos, 2541 (64%)

foram classificados como não agressivos e 1424 (36%) como agressivos ou de dominância (Tabela 3).

O resultado das análises de GLMM indicou que atos agressivos foram mediados pelo status

reprodutivo das fêmeas nos ninhos (F1,59 = 237,66, p <0,0001; Tabela 2), ao invés do tamanho

corporal (F1,59 = 0,94, p = 0,34) ou do desenvolvimento ovariano (F1,59 = 0,15, p = 0,69). Contudo,

quando foram comparados os grupos de fêmeas invasoras que assumiram a dominância, os

resultados mostraram que invasoras (DI) significativamente maiores que as dominantes residentes

(DR) tiveram sucesso na substituição da dominância (DI: média ± desvio padrão = 4,11 ± 0,06 mm

vs DR = 3,33 ± 0,17; t = 16,85 p <0,001; Tabela 2, Figura 7), enquanto invasoras (SI) que não

apresentaram diferença significativa de tamanho em relação às dominantes residentes realizaram

atividades subordinadas (SI: 3,52 ± 0,15 vs DR: 3,56 ± 0,17; t = 1,35, p = 0,19) (Tabela 2, Figura 7).

O desenvolvimento ovariano foi significativamente maior nas dominantes invasoras

(média ± desvio padrão = 3,77 ± 0,33 mm) em comparação com as dominantes residentes

(DR: 3,12 ± 0,26 mm; DI vs DR: t = 5,47, p <0.0001; Tabela 2, Figura 8). Contudo, o

desenvolvimento ovariano não foi diferente entre dominantes e subordinadas residentes (SR)

(SR: 3,32 ± 0.25 mm vs DR: 3,34 ± 0,27 mm; t = 1.57, p = 0.12; Tabela 2, Figura 8). As

análises do conteúdo espermático mostraram que todas as fêmeas estavam inseminadas. O

GLMM também confirmou que o canibalismo do ovo pode ser previsto pelo status

reprodutivo das fêmeas (F1,165 = 6,62, p <0,05), ao invés do tamanho do corpo (F1,59 = 0,27, p

= 0,60) ou desenvolvimento ovariano (F1,59 = 0,65; p = 0,42) (Tabela 2).


Tabela 2. Número de atos agressivos e ovos policiados (comidos) durante os processos de reutilização de ninhos, incluindo o status social das fêmeas e seus respectivos tamanhos corporais (distância intertegular) e desenvolvimento ovariano (comprimento dos oócitos basais).

Oócitos basais (mm) Ninho/Reuso

Atos agressivos

Ovos comidos

Status social

Distancia Intertegular (mm) Primeiro Segundo Total

N1R1 59 10 Dominante 3,57 2,26 1,01 3,27 0 0 Subordinada 3,49 2,23 1,03 3,26 N1R2 74 5 Dominante 3,54 2,24 1,03 3,27 0 0 Subordinada 3,62 2,23 0,99 3,22 N2R1 68 8 Dominante 3,21 2,21 0,89 3,10 0 0 Subordinada 3,33 2,25 0,91 3,16 N2R2 49 7 Dominante 3,27 2,25 0,87 3,12 0 0 Subordinada 3,44 2,24 0,91 3,15 N2R3 75 6 Dominante 3,28 1,81 0,85 2,66 0 0 Subordinada 3,18 1,79 0,81 2,60 N3R1 59 6 Dominante 3,59 2,27 1,05 3,32 0 0 Subordinada 3,33 2,25 0,98 3,23 N4R1 42 7 Dominante 3,42 2,24 0,95 3,19 0 0 Subordinada 3,36 2,21 0,89 3,10 N5R1 74 5 Dominante 3,45 2,26 0,94 3,20 0 0 Subordinada 3,39 2,23 0,91 3,14 N6R1 36 5 Dominante 3,51 2,27 0,99 3,26 0 0 Subordinada 3,47 2,24 0,97 3,21 N6R2 77 6 Dominante 3,32 2,27 0,95 3,22 0 0 Subordinada 3,17 2,25 0,88 3,13 N6R3 44 5 Dominante 4,11 2,51 1,11 3,62 0 0 Subordinada 3,71 2,41 1,05 3,46 N6R4 44 5 Dominante 3,76 2,53 1,01 3,54 0 0 Subordinada 3,67 2,44 1,03 3,47 N7R1 55 5 Dominante 3,89 2,53 1,09 3,62 0 0 Subordinada 3,44 2,37 0,99 3,36 N7R2 26 9 Dominante 3,61 2,45 1,05 3,50 0 0 Subordinada 3,59 2,36 0,98 3,34 N7R3 30 6 Dominante 3,61 2,44 1,03 3,47 0 0 Subordinada 3,57 2,35 1,01 3,36 N8R1 71 5 Dominante 3,21 2,11 0,89 3,00 0 0 Subordinada 3,16 1,89 0,91 2,80 N8R2 81 6 Dominante 3,56 2,33 1,03 3,36 0 0 Subordinada 3,61 2,36 1,06 3,42 N9R1 71 4 Dominante 4,12 2,55 1,13 3,68 0 0 Subordinada 3,89 2,49 1,08 3,57 N9R2 45 5 Dominante Invasora 4,14* 2,59 1,15 3,74 0 0 Dominante Residente 3,21 2,13 1,01 3,14 N10R1 29 4 Dominante Invasora 4,03* 2,68 1,15 3,83 0 0 Dominante Residente 3,57 2,47 1,04 3,51 N10R2 35 5 Dominante Invasora 4,16* 2,63 1,13 3,76 0 0 Dominante Residente 3,45 2,22 0,99 3,21 N10R3 24 4 Dominante Invasora 4,07* 2,65 1,11 3,76 0 0 Dominante Residente 3,19 1,94 0,97 2,91 N10R4 34 5 Dominante Invasora 4,15* 2,64 1,12 3,76 0 0 Dominante Residente 3,23 1,97 0,89 2,86 N11R1 33 5 Dominante Residente 3,29 1,89 0,91 2,80 0 0 Subordinada Invasora 3,22 1,86 0,87 2,73 N11R3 35 4 Dominante Residente 3,33 2,27 0,96 3,23 0 0 Subordinada Invasora 3,44 2,29 0,98 3,27 N12R2 35 4 Dominante Residente 3,63 2,41 1,05 3,46 0 0 Subordinada Invasora 3,61 2,43 1,01 3,44 N12R3 27 5 Dominante Residente 3,56 2,46 1,03 3,49 0 0 Subordinada Invasora 3,67 2,48 1,05 3,53 N13R2 33 4 Dominante Residente 3,54 2,45 1,02 3,47 0 0 Subordinada Invasora 3,65 2,41 1,04 3,45 N14R2 27 6 Dominante Residente 3,63 2,44 1,06 3,50 0 0 Subordinada Invasora 3,64 2,37 1,03 3,40 N14R3 32 5 Dominante Residente 3,67 2,43 1,06 3,49 0 0 Subordinada Invasora 3,69 2,38 1,06 3,44 *Invasoras que substituíram a dominante residente.


3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

Dis

tânc

ia In

tert

egul

ar (m

m)

Dominante invasora (DI)

Subordinada invasora (SI)

Dominante residente (DR)

Figura 7. Média do tamanho corporal (média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes invasoras, subordinadas invasoras e dominantes residentes em ninhos de Euglossa melanotricha.

Figura 8. Atividade ovariana em fêmeas de Euglossa melanotricha: (A) Fêmea dominante, (B) subordinada e (C) invasora que assumiu a dominância reprodutiva.

As fêmeas dominantes raramente interromperam a postura das subordinadas (38/1424

= 2%; Tabela 3) permitindo a finalização da operculação das células por essas fêmeas.

Contudo, após a postura e operculação, as dominantes reabriram as células (onde atos

agressivos ocorreram em 21% dos casos; 292/1424), comeram e substituíram 73% (185, n=

252; Tabela 3) dos ovos das subordinadas pelos seus. A duração do canibalismo do ovo

variou entre 758 s e 1.301 s (média ± desvio-padrão = 999,00 ± 140,70 s, n = 65).

2 mm 2 mm 2 mm

A B C


Tabela 3. Reutilizações de ninhos por pares de fêmeas (dominante e subordinada), incluindo o número de posturas, o número de ovos comidos pelas dominantes, e as interferências não agressivas (AN) e agressivas (A) observadas durante as atividades de construção das células (CC), aprovisonamento (AP), oviposição (OV), operculação (OP), reabertura da célula (RC) e outras atividades como limpeza das células, selamento de arestas e da entrada do ninho

Número de interações durante as atividades de:

CC AP OV OP RC Outros Total geral

Ninho Reuso

Postura das fêmeas subordinadas

Número de ovos comidos pelas dominantes

NA A NA A NA A NA A NA A NA A NA A

N1R1 12 10 25 13 27 26 21 0 37 7 4 12 2 1 116 59

N1R2 7 5 23 13 30 28 15 0 20 16 3 17 1 0 92 74

N2R1 9 8 46 16 26 28 9 0 21 15 0 8 1 1 103 68

N2R2 8 7 30 15 15 25 15 0 13 2 1 6 1 1 75 49

N2R3 7 6 22 18 21 17 12 19 8 2 2 19 1 0 66 75

N3R1 7 6 17 23 21 15 13 4 21 3 4 14 3 0 79 59

N4R1 9 7 15 14 16 7 12 0 11 7 3 14 3 0 60 42

N5R1 5 5 25 28 27 36 18 0 19 5 1 5 2 0 92 74

N6R1 6 5 17 16 21 7 11 0 31 7 2 6 3 0 85 36

N6R2 8 7 33 19 22 31 22 1 61 11 4 13 6 2 148 77

N6R3 8 6 31 6 14 9 35 0 65 10 5 17 6 2 156 44

N6R4 11 5 31 6 14 9 35 0 65 10 5 17 6 2 156 44

N7R1 7 5 37 17 24 12 11 0 34 6 4 19 2 1 112 55

N7R2 7 9 16 13 14 5 7 0 17 4 1 4 0 0 55 26

N7R3 12 6 16 13 14 5 7 0 7 8 1 4 0 0 45 30

N8R1 8 5 26 16 24 13 27 3 70 18 6 20 2 1 155 71

N8R2 7 6 26 16 24 23 27 3 70 18 6 20 2 1 155 81

N9R1 8 6 26 16 24 13 27 3 70 18 6 20 2 1 155 71

N9R2 8 5 23 12 10 10 9 0 14 17 1 6 1 0 58 45

N10R1 13 4 23 12 10 10 9 0 14 1 1 6 1 0 58 29

N10FR2 12 10 18 10 17 16 10 0 10 0 1 7 1 2 57 35

N10R3 12 8 15 5 18 11 5 0 7 2 1 3 0 3 46 24

N10R4 9 7 19 4 17 15 11 0 8 6 1 9 1 0 57 34

N11R1 8 5 18 3 15 17 15 0 21 5 1 6 2 2 72 33

N11R3 9 8 17 2 18 16 13 0 9 7 2 8 1 2 60 35

N12R2 7 4 12 9 9 19 5 1 9 4 4 1 1 1 40 35

N12R3 7 5 9 9 11 11 8 1 7 2 3 3 1 1 39 27

N13R2 7 4 7 9 7 16 7 1 6 5 4 1 1 1 32 33

N14R2 7 6 21 9 15 9 9 1 22 1 4 6 1 1 72 27

N14R3 7 5 13 9 11 19 8 1 11 1 4 1 1 1 48 32

Total 252 185 657 371 536 478 433 38 778 218 85 292 55 27 2544 1424

Interações agressivas também foram pouco associadas com atividades envolvidas na

limpeza de células e/ou selamento de arestas (27/1424 = 2%) (Tabela 3), sendo mais


frequentes durante as atividades de aprovisionamento (478/1424 = 34%), construção ou reuso

das células (371/1424 = 26%) e operculação (218/1424 = 15%) (Tabela 3).

Encontros agressivos consistiram em morder em 40% dos eventos (296 de 745),

empurrar em 24% (182 de 745), ameaçar com sobrevôos de ameaça em 19% (138 de 745), e

perseguir em 17% (129 de 745) dos eventos registrados.

2.3.2 Experimento 1: Efeito da remoção e reintrodução das fêmeas dominantes

As fêmeas dominantes mantidas até 36 h fora dos ninhos foram capazes de reconhecer

as células que continham ovos das subordinadas em todos os testes experimentais (15 fêmeas

em 10 ninhos). Nestes casos, ao serem recolocadas nos ninhos, às fêmeas dominantes ficaram

agitadas e inspecionaram as células por um tempo que variou entre 300 e 960 segundos

(média ± desvio padrão: 760 ± 109,3 segundos, n=8). Após a inspeção, as dominantes

reabriram as células, na presença ou ausência da subordinada, comeram o ovo e substituíram

pelo seu. No entanto, as fêmeas dominantes reintroduzidas por períodos acima de 36 h não

ingeriram os ovos das subordinadas, e ainda, foram substituídas por seus antigos pares de

subordinadas. As dominantes que foram substituídas desapareceram do ninho, em média, dois

dias após a reintrodução (Tabela 4).

2.3.3 Experimento 2: Efeito da remoção das fêmeas subordinadas

Na ausência das fêmeas subordinadas, as dominantes iniciaram o aprovisionamento

das células, mas a produtividade média foi significativamente menor (4,8 ± 1,19 células

aprovisionados) do que quando as subordinadas estavam presentes (8,4 ± 1,97 células

aprovisionadas: teste de Wilcoxon: T = 3, Z = 2,82 , p = 0,002, n = 10 ninhos).


Tabela 4. Resultados dos experimentos de remoção: efeito da presença das fêmeas dominantes de Euglossa melanotricha com as interações que ocorreram após sua reintrodução nos ninhos (em 30 reutilizações de 10 ninhos).

Após reintrodução das

Número de fêmeas Número de fêmeas: Experimentos Repetições Ninho

Reutilização Dominantes Subordinadas

Tempo fora dos ninhos (h)

Número de ovos

dMantidas Substituídas

1 N1R1 1 1 12h 1 1 02 N2R1 1 1 12h 1 1 03 N3R1 1 1 12h 1 1 04 N4R1 1 1 12h 1 1 0

1

5 N5R1 1 1 12h 1 1 01 N6R1 1 1 24h 1 1 02 N7R1 1 1 24h 1 1 03 N8R1 1 1 24h 1 1 04 N9R1 1 1 24h 1 1 0

2

5 N10R1 1 1 24h 1 1 01 N1R2 1 1 36h 1 1 02 N2R1 1 1 36h 1 1 03 N3R2 1 1 36h 1 1 04 N4R2 1 1 36h 1 1 0

3

5 N5R2 1 1 36h 1 1 0 1 N6R2 1 1 48h 0 0 1 2 N7R2 1 1 48h 0 0 14 3 N8R2 1 1 48h 0 0 1 4 N9R2 1 1 48h 0 0 1 5 N10R2 1 1 48h 0 0 1 1 N1R3 1 1 60h 0 0 1 2 N2R3 1 1 60h 0 0 15 3 N3R3 1 1 60h 0 0 1 4 N4R3 1 1 60h 0 0 1 5 N5R3 1 1 60h 0 0 1 1 N6R3 1 1 72h 0 0 1 2 N7R3 1 1 72h 0 0 16 3 N8R3 1 1 72h 0 0 1 4 N9R3 1 1 72h 0 0 1 5 N10R3 1 1 72h 0 0 1


2.3.4 Discriminação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas por status social

A análise dos compostos cuticulares das fêmeas fundadoras, subordinadas e

dominantes de Euglossa melanotricha resultou em 63 hidrocarbonetos encontrados. Os

hidrocarbonetos variaram entre o n-C20 e o n-C38, sendo mais representativos os alcanos de

cadeia linear, seguidos de alcenos e alcanos ramificados.

Os alcanos foram os compostos mais abundantes para todos os grupos e, entre os

alcanos, o n-pentacosano foi o mais abundante para as fêmeas fundadoras e dominantes,

enquanto o n-tetracosano foi o mais abundante para as subordinadas (Tabela 5).

A proporção relativa de n-alcanos, alcenos e alcanos ramificados variou

significativamente entre os grupos de fêmeas analisados. (n-Alcanos F2,104 = 86,1; p <

0,00001; Alcenos F2,104 = 83,9; p < 0,00001; Alcanos ramificados (metilados e dimetilados) F

2,104 = 30,9; p < 0,00001 (Figura 9). A proporção de n-alcanos foi maior entre fundadoras,

seguido das dominantes, e em menor proporção nas subordinadas. Enquanto a proporção de

alcenos e alcanos ramificados foi maior nas subordinadas quando comparadas as dominantes

e fundadoras (Figura 9). Os dimetilados (Tabela 5) foram excluídos da análise comparativa

devido a ausência destes compostos no perfil químico das fundadoras. As fêmeas fundadoras

apresentaram a menor diversidade de compostos, representados por 34 hidrocarbonetos (54%;

n = 63) entre n-alcanos e alcenos. Quando comparadas as dominantes e subordinadas, as

ausências estão, principalmente, nos alcenos e alcanos ramificados.

As subordinadas apresentaram a maior diversidade de compostos quando comparadas

as dominantes e fundadoras. A composição química pra esse grupo de fêmeas foi de 57

hidrocarbonetos (90,4%; n = 63), sendo 7 presentes somente neste grupo, como os

dimetilados do tetracosano, um alceno do hexacosano, um alceno do heptacosano e um alceno

do nonacosano. Quando comparadas as dominantes, as ausências estão, principalmente,

representadas nos compostos de maior peso molecular como o n-hexatriacontano e o n-

octatriacontano, além dos dimetilados do pentacosano.


Tabela 5. Composição química em porcentagem média (± desvio padrão) dos hidrocarbonetos cuticulares de Euglossa melanotricha. Lista completa com todos os compostos determinados pela análise em CG-MS (Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas). Estão em negrito somente os 11 picos selecionados pela análise estatística.

Dominantes Subordinadas Fundadoras Nº do pico

KI

Compostos Média DP Média DP Média DP

1 2000 Eicosano C20 0,36 ± 0,35 0,44 ± 0,38 0,31 ± 0,28 2 2091 7-Heneicoseno C21 0,25 ± 0,07 0,20 ± 0,07 _ 3 2100 Heneicosano C21 0,21 ± 0,16 0,37 ± 0,08 _ 4 2200 Docosano C22 0,90 ± 0,65 0,70 ± 0,68 0,85 ± 0,76 5 2271 9- Tricoseno C23 1,53 ± 0,48 0,74 ± 0,04 _ 6 2283 5- Tricoseno C23 1,18 ± 0,84 2,92 ± 1,64 1,48 ± 0,62 7a 2300 Tricosano C23 6,03 ± 2,26 3,79 ± 2,00 7,66 ± 2,04 8 2374 9-Tetracoseno C24 0,60 ± 0,23 0,32 ± 0,05 _ 9 2383 5-Tetracoseno C24 0,78 ± 0,56 0,86 ± 0,66 0,74 ± 0,50 10 2400 Tetracosano C24 2,66 ± 0,20 7,66 ± 2,48 _ 11 2459 11-Pentacoseno C25 0,15 ± 0,00 2,42 ± 0,77 _ 12 2479 7-Pentacoseno C25 6,03 ± 2,08 0,33 ± 0,08 _ 13b 2485 5-Pentacoseno C25 10,00 ± 3,61 5,46 ± 1,91 7,59 ± 3,40 14 2495 6,8-Dimetil C24 _ 0,11 ± 0,03 _ 15c 2500 Pentacosano C25 9,66 ± 4,67 0,67 ± 0,54 12,19 ± 3,08 16 2505 4,10- Dimetil C24; 4,8- Dimetil C24 _ 0,36 ± 0,30 _ 17 2530 13-; 11-; 9-Metil C25 0,06 ± 0,05 0,04 ± 0,04 0,20 ± 0,11 18 2532 7-Metil C25 0,05 ± 0,05 0,04 ± 0,04 0,25 ± 0,15 19d 2541 5-Metil C25 0,05 ± 0,05 1,33 ± 0,67 0,04 ± 0,05 20 2552 9,13-Dimetil C25 0,61 ± 0,56 _ _ 21 2560 3-Metil C25 0,91 ± 0,59 0,74 ± 0,45 0,48 ± 0,35 22 2565 9-Hexacoseno C26 0,59 ± 0,42 0,84 ± 0,94 0,49 ± 0,19 23 2578 7-Hexacoseno C26 0,09 ± 0,02 2,27 ± 0,79 _ 24 2585 5-Hexacoseno C26 _ 1,45 ± 2,23 _ 25e 2600 Hexacosano C26 2,45 ± 0,47 4,26 ± 2,79 2,27 ± 1,87 26 2603 6,8-Dimetil C25 0,12 ± 0,06 _ _ 27 2608 8,10-Dimetil C25 0,13 ± 0,05 _ _ 28 2632 12-, 10-Metil C26 _ 0,19 ± 0,06 _ 29 2643 3,5-Dimetil C25 0,16 ± 0,23 _ _ 30 2665 11- Heptacoseno C27 _ 7,54 ± 3,94 _ 31f 2670 9- Heptacoseno C27 3,07 ± 0,99 5,25 ± 2,02 2,76 ± 1,68 32 2679 7- Heptacoseno C27 1,62 ± 1,13 3,92 ± 4,42 _ 33 2686 5- Heptacoseno C27 4,01 ± 1,24 5,44 ± 3,32 _ 34g 2700 Heptacosano C27 2,99 ± 1,65 0,79 ± 0,35 0,92 ± 0,49

Continuação...


Tabela 5. Composição química em porcentagem média (± desvio padrão) dos hidrocarbonetos cuticulares de Euglossa melanotricha. Lista completa com todos os compostos determinados pela análise em CG-MS (Cromatografia a gás acoplado à espectrometria de massas). Estão em negrito somente os 11 picos selecionados pela análise estatística.

Dominantes Subordinadas Fundadoras Nº do pico

KI

Compostos Média DP Média DP Média DP

35h 2727 13-; 11-; 9-Metil C27 0,62 ± 1,32 0,88 ± 0,66 0,06 ± 0,02 36 2730 7-Metil C27 0,04 ± 0,02 0,04 ± 0,03 0,02 ± 0,01 37 2745 5-Metil C27 0,04 ± 0,04 0,04 ± 0,03 0,03 ± 0,01 38 2757 3-Metil C27 2,49 ± 0,35 0,31 ± 0,08 _ 39 2765 9- Octacoseno C28 0,29 ± 0,07 0,48 ± 0,76 _ 40 2678 7- Octacoseno C28 0,24 ± 0,24 1,66 ± 0,47 0,27 ± 0,16 41 2800 Octacosano C28 0,56 ± 0,45 0,27 ± 0,08 0,36 ± 1,33 42 2864 11-Nonacoseno C29 1,74 ± 0,42 3,29 ± 2,69 _ 43i 2876 9-Nonacoseno C29 7,90 ± 1,84 0,24 ± 0,04 3,39 ± 1,05 44 2886 7-Nonacoseno C29 _ 2,80 ± 2,26 _ 45j 2900 Nonacosano C29 3,31 ± 1,65 1,96 ± 1,88 0,97 ± 1,08 46 2904 4,8-Dimetil C28 _ 0,13 ± 0,07 _ 47 2919 13-; 11-; 9-Metil C29 0,27 ± 0,29 0,55 ± 0,35 0,09 ± 0,03 48 2926 7-Metil C29 0,12 ± 0,11 0,35 ± 0,27 0,05 ± 0,02 49 2934 5-Metil C29 0,05 ± 0,05 0,04 ± 0,04 0,03 ± 0,01 b50 2958 3-Metil C29 0,07 ± 0,06 0,40 ± 0,35 0,20 ± 0,09 51 2993 9-Triaconteno C30 0,53 ± 0,35 0,72 ± 0,62 _ 52 3000 Triacontano C30 0,07 ± 0,06 0,29 ± 0,30 1,77 ± 1,10 53 3047 13- Hentriaconteno C31 0,21 ± 0,03 0,30 ± 0,16 _ 54 3072 9- Hentriaconteno C31 0,19 ± 0,24 0,22 ± 0,14 0,42 ± 0,27 55k 3100 Hentriacontano C31 0,53 ± 0,35 1,32 ± 1,78 0,47 ± 0,36 56 3173 3-Metil C31 0,63 ± 0,57 0,12 ± 0,11 0,21 ± 0,30 57 3269 11-Tritriaconteno C33 0,20 ± 0,16 0,33 ± 0,23 0,20 ± 0,18 58 3300 Tritriacontano C33 0,29 ± 0,32 0,42 ± 0,30 0,41 ± 0,39 59 3377 11-Tetriaconteno C34 2,57 ± 0,25 0,76 ± 0,70 _ 60 3400 Tetriacontano C34 2,91 ± 0,75 0,30 ± 0,01 _ 61 3500 Pentatriacontano C35 1,52 ± 0,00 0,35 ± 0,09 _ 62 3600 Hexatriacontano C36 1,80 ± 0,00 _ 0,32 ± 0,01 63 3800 Octatriacontano C38 1,31 ± 0,00 _ 0,59 ± 0,07 a-j As letras sobrescritas nos números dos picos, correspondem ao código dos picos selecionados pela análise estatística representados na tabela 2 e na figura 3.

As fêmeas dominantes apresentaram 56 hidrocarbonetos (88,9%; n=63), sendo quatro

desses, os dimetilados do pentacosano, presentes somente neste grupo. Dada a descrição geral

dos resultados, dos 63 picos identificados pela análise individual, como determinado pela CG-


MS, 11 foram selecionados pela análise discriminante (Tabela 6). Cada um desses picos

representa mais do que 3% da área total do cromatograma em pelo menos um dos grupos

estudados (fêmeas fundadoras, dominantes e subordinadas).

Os resultados mostraram diferenças na composição química do perfil cuticular entre os

grupos de fêmeas. O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 50,3%

da variação encontrada. O Fator 1 + Fator 2 descreveu 83,4% da variância total observada. A

análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os

grupos analisados (Modelo global: Wilks’s λ =0,0297; F15,36 = 42,17; p < 0,00001) (Tabela 6).

Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos de fêmeas foram o n-tricosano, 5-

pentacoseno, n-pentacosano, 5-metilpentacosano, n-hexacosano, 9-heptacoseno, n-

heptacosano 13-,11-,9- Metilheptacosano (isômeros agrupados no mesmo pico), 9-

nonacoseno, n-nonacosano e o n-hentriacontano (Figura 10).

Figura 9. Comparação das proporções (%; média ± desvio padrão) de n-alcanos, alcenos e alcanos ramificados entre dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.

Dominantes Subordinadas Fundadoras-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Prop

orçã

o do

s co

mpo

stos

(Méd

ia ±

DP)

Alcanos Alcenos Alcanos ramificados


A discriminação dos grupos por status social foi significativa (Figura 10; p < 0,00001;

Tabela 7). A classificação da matriz apontou um total de 92,3 % da correta alocação dos

indivíduos dentro do grupo previsto, enquanto o esperado para uma distribuição ao acaso é de

25%.

Tabela 6. Porcentagens médias (± desvio padrão) dos 11 picos selecionados pela análise discriminante entre fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.

Código do pico (ref. Fig.2)

KI

Compostos

Dominantes (N=30)

Subordinadas (N=30)

Fundadoras (N=12)

a10 2300 Tricosano C23 6,03 ± 2,26 3,79 ± 2,00 7,66 ± 2,04

b7 2485 5-Pentacoseno C25 10,00 ± 3,61 5,46 ± 1,91 7,59 ± 3,40

c4 2500 Pentacosano C25 9,66 ± 4,67 0,67 ± 0,54 12,19 ± 3,08

d2 2541 5-Metil C25 0,05 ± 0,05 1,33 ± 0,67 0,04 ± 0,05

e1 2600 Hexacosano C26 0,45 ± 0,47 4,26 ± 2,79 2,27 ± 1,87

f6 2670 9- Heptacoseno C27 3,07 ± 0,99 5,25 ± 2,02 2,76 ± 1,68

g3 2700 Heptacosano C27 2,99 ± 1,65 0,79 ± 0,35 0,92 ± 0,49

h11 2727 13-; 11-; 9-Metil C27 0,62 ± 1,32 0,88 ± 0,66 0,06 ± 0,02

i9 2876 9-Nonacoseno C29 3,29 ± 1,84 0,24 ± 0,04 3,39 ± 1,05

j5 2900 Nonacosano C29 3,31 ± 1,65 1,96 ± 1,88 0,97 ± 1,08

k8 3100 Hentriacontano C31 0,53 ± 0,35 1,32 ± 1,78 0,47 ± 0,36 1-13 Os números sobrescritos nos códigos dos picos correspondem ao ranking dos hidrocarbonetos encontrados nas fêmeas pela análise discriminante steptwise. Os picos destacados em negrito foram aqueles que contribuíram significativamente para discriminar entre fêmeas dominantes e subordinadas.

O perfil cuticular das fêmeas dominantes e subordinadas foi significativamente (t

sempre > 2,68, p sempre < 0,04) discriminado por 9 dos 11 compostos selecionados pela

análise discriminante para os três grupos de fêmeas (Tabela 7, Figura 12). Tais compostos

foram o n-tricosano, 5-pentacoseno, n-pentacosano, 5-metilpentacosano, n-hexacosano, 9-

heptacoseno, n-heptacosano, 9-nonacoseno e o n-nonacosano. Dos alcenos que contribuíram

para discriminar entre dominantes e subordinadas, o 5-pentacoseno e o 9-nonacoseno foram

significativamente mais concentrados nas dominantes (Figura 12).


Tabela 7. Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares dos grupos de fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.

Combinações entre os grupos de fêmeas

Distância de Mahalanobis

F 5,13

P

Dominantes x Subordinadas 31,00 28,25 p < 0,00001 Fundadoras x Dominantes 36,90 13,74 p < 0,00001 Subordinadas x Fundadoras 40,62 14,80 p < 0,00001

21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

(x100,000,000)

a

c

c

d

d

d

f

a

a

b

b

b

c

e

e

e

g

g

g

h

h

h

j

i

i

Dominante

Subordinada

Fundadora

f

f

i

j

jk

k

k

Intensidade do pico

Tempo de Retenção Figura 10. Cromatogramas dos perfis cuticulares de fêmeas de Euglossa melanotricha. Uma fêmea de cada grupo foi escolhida aleatoriamente. Os principais componentes encontrados nesta amostra foram: (a) Tricosano; (b) (Z) 5-Pentacoseno; (c) n-Pentacosano; (d) 5-Metilpentacosano (e) n-Hexacosano; (f) (Z) 9- Heptacoseno; (g) n- Heptacosano; (h) 13-, 11-, 9- Metilheptacosano; (i) 9- Nonacoseno; (j) n-Nonacosano; (k) Hentriacontano. O tempo de retenção é dado em minutos.


-6 -4 -2 0 2 4 6

Root 1

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

Roo

t 2

Dominantes Subordinadas Fundadoras

Figura 11. Resultado da analise canônica mostrando as posições relativas dos grupos de fêmeas por status social (fêmeas dominantes, n = 30; subordinadas, n = 30; fundadoras, n=12) em Euglossa melanotricha. Elipses correspondem a 95% do intervalo de confiança.

C23

ZC25

C25

MeC

25

C26

ZC27

C27

MeC

27

ZC29

C29

C31

00

02

04

06

08

010

012

Prop

orçã

o re

lativ

a do

s co

mpo

stos

Dominante Subordinada

*

**

*

*

*

*

ns

* *

ns

Figura 12. Comparação das proporções (% relativa, média ± desvio padrão) dos compostos C23 = n-tricosano, ZC25 = 5-pentacoseno, C25 = n-pentacosano, MeC25 = 5-metilpentacosano, C26 = n-hexacosano, ZC27 = 9-heptacoseno, C27 = n-heptacosano, MeC27= 13-, 11-, 9-Metilheptacosano, 9-Nonacoseno, n-nonacosano e n-hentriacontano entre fêmeas dominantes (n=30) e subordinadas (n=30) de colônias de Euglossa melanotricha. *p < 0,05 e ns = não significativo foram determinados pelo teste t para amostras independentes por grupo.


2.3.5 Comparação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares e a sinalização de dominância

Dado o registro de comutação das fêmeas entre ninhos (12 invasões em 30 processos

de reutilizações, n = 12 ninhos), com interessante variação do status social ocupado pelas

fêmeas invasoras, sendo que 5 dessas invasões resultaram em substituição da dominância

reprodutiva, e 7 resultaram em atividades de subordinação. Foram então comparados os perfis

químicos das invasoras que assumiram a dominância com os perfis das dominantes residentes

e das subordinadas. Foi testado então se os sinais de dominância estão envolvidos na

determinação do status social em Euglossa melanotricha.

A análise do perfil cuticular das fêmeas invasoras e residentes também revelou 63 picos já

identificados na discriminação do perfil cuticular das fêmeas fundadoras, dominantes e

subordinadas. Assim como, foram encontrados hidrocarbonetos com cadeia entre n-C20 a n-C38, e

os alcanos lineares foram mais abundantes, seguidos pelos alcenos, e alcanos ramificados (Tabela

8). A proporção dos compostos químicos cuticulares não variou entre fêmeas dominantes

residentes e dominantes invasoras (n-alcanos: F1,104 = 4,02; p = 0,12; alcenos: F1,104 = 6,07; p =

0,15; alcanos ramificados: F1,104 = 3,91; p = 4,55), mas variou significativamente entre

dominantes (residentes e invasoras) e subordinadas (n-alcanos: F1,104 = 75,2; p < 0,00001;

alcenos: F1,104 = 84,2; p < 0,00001; alcanos ramificados: F1,104 = 25,4; p < 0,00001; Figura 13).

A análise discriminante ‘stepwise’ separou significativamente os grupos de fêmeas

invasoras + dominantes vs subordinadas (modelo global: Wilks’s λ = 0,0346; F15,36 = 53,21; p

< 0,00001; Tabela 9, Figura 14). Os principais compostos que discriminaram os dois grupos

de fêmeas (invasora + dominante vs subordinada) foram o n-tricosano, 5-pentacosano, n-

pentacosano, 5-metilpentacosano, n-hexacosano, 9-heptacoseno, n-heptacosano, 13- 11- 9-

metilheptacosano, 9-nonacoseno, n-nonacosano, and n-hentriacontano. A classificação da

matriz apontou um total de 83,4 % da correta alocação dos indivíduos dentro do grupo

previsto como predito pelo seu papel funcional.


Tabela 8. Proporção relativa de hidrocarbonetos cuticulares (média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes (residentes e invasoras) e subordinadas de Euglossa melanotricha. Letras em negrito representam os 11 picos selecionados pela análise estatística.

Dominante Invasoras SubordinadasNº do pico

KI

Compostos Média ± DP Média ± DP Média ± DP

1 2000 Eicosano C20 0,36 ± 0,35 0,35 ± 0,26 0,44 ± 0,38 2 2091 7-Heneicoseno C21 0,25 ± 0,07 0,22 ± 0,02 0,20 ± 0,07 3 2100 Heneicosano C21 0,21 ± 0,16 0,24 ± 0,03 0,37 ± 0,08 4 2200 Docosano C22 0,90 ± 0,65 0,97 ± 0,23 0,70 ± 0,68 5 2271 9- Tricoseno C23 1,53 ± 0,48 1,24 ± 0,10 0,74 ± 0,04 6 2283 5- Tricoseno C23 1,18 ± 0,84 1,20 ± 0,49 2,92 ± 1,64 7a 2300 Tricosano C23 6,03 ± 2,26 8,63 ± 1,44 3,79 ± 2,00 8 2374 9-Tetracoseno C24 0,60 ± 0,23 0,65 ± 0,02 0,32 ± 0,05 9 2383 5-Tetracoseno C24 0,78 ± 0,56 0,15 ± 0,05 0,86 ± 0,66

10 2400 Tetracosano C24 2,66 ± 0,20 2,16 ± 0,97 7,66 ± 2,48 11 2459 11-Pentacoseno C25 0,15 ± 0,00 0,13 ± 0,01 2,42 ± 0,77 12 2479 7-Pentacoseno C25 6,03 ± 2,08 6,24 ± 1,61 0,33 ± 0,08 13b 2485 5-Pentacoseno C25 10,00 ± 3,61 6,32 ± 0,15 5,46 ± 1,91 14 2495 6,8-Dimetil C24 _ _ 0,11 ± 0,03 15c 2500 Pentacosano C25 9,66 ± 4,67 16,67 ± 0,15 0,67 ± 0,54 16 2505 4,10- Dimetil C24; 4.8- Dimetil C24 _ _ 0,36 ± 0,30 17 2530 13-; 11-; 9-Metil C25 0,06 ± 0,05 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,04 18 2532 7-Metil C25 0,05 ± 0,05 0,04 ± 0,04 0,04 ± 0,04 19d 2541 5-Metil C25 0,05 ± 0,05 0,08 ± 0,03 1,33 ± 0,67 20 2552 9,13-Dimetil C25 0,61 ± 0,56 0,59 ± 0,07 _ 21 2560 3-Metil C25 0,91 ± 0,59 0,86 ± 0,04 0,74 ± 0,45 22 2565 9-Hexacoseno C26 0,59 ± 0,42 0,58 ± 0,10 0,84 ± 0,94 23 2578 7-Hexacoseno C26 0,09 ± 0,02 0,07 ± 0,02 2,27 ± 0,79 24 2585 5-Hexacoseno C26 _ _ 1,45 ± 2,23 25e 2600 Hexacosano C26 2,45 ± 0,47 2,49 ± 0,20 4,26 ± 2,79 26 2603 6,8-Dimetil C25 0,12 ± 0,06 0,10 ± 0,03 _ 27 2608 8,10-Dimetil C25 0,13 ± 0,05 0,11 ± 0,02 _ 28 2632 12-. 10-Metil C26 _ _ 0,19 ± 0,06 29 2643 3,5-Dimetil C25 0,16 ± 0,23 0,13 ± 0,03 _ 30 2665 11- Heptacoseno C27 _ _ 7,54 ± 3,94 31f 2670 9- Heptacoseno C27 3,07 ± 0,99 3,12 ± 1,29 5,25 ± 2,02 32 2679 7- Heptacoseno C27 1,62 ± 1,13 1,32 ± 0,26 3,92 ± 4,42 33 2686 5- Heptacoseno C27 4,01 ± 1,24 3,70 ± 0,25 5,44 ± 3,32 34g 2700 Heptacosano C27 2,99 ± 1,65 6,10 ± 0,28 0,79 ± 0,35 35h 2727 13-; 11-; 9-Metil C27 0,62 ± 1,32 0,52 ± 0,11 0,88 ± 0,66 36 2730 7-Metil C27 0,04 ± 0,02 0,03 ± 0,02 0,04 ± 0,03 37 2745 5-Metil C27 0,04 ± 0,04 0,03 ± 0,02 0,04 ± 0,03 38 2757 3-Metil C27 2,49 ± 0,35 2,68 ± 1,11 0,31 ± 0,08

Continuação...


Dominantes Invasoras SubordinadasNº do pico

KI

Compostos Média ± DP Média ± DP Média ± DP

39 2765 9- Octacoseno C28 0,29 ± 0,07 0,25 ± 0,33 0,48 ± 0,76 40 2678 7- Octacoseno C28 0,24 ± 0,24 0,29 ± 0,08 1,66 ± 0,47 41 2800 Octacosano C28 0,56 ± 0,45 0,52 ± 0,04 0,27 ± 0,08 42 2864 11-Nonacoseno C29 1,74 ± 0,42 1,47 ± 0,15 3,29 ± 2,69 43i 2876 9-Nonacoseno C29 7,90 ± 1,84 6,63 ± 0,56 0,24 ± 0,04 44 2886 7-Nonacoseno C29 _ _ 2,80 ± 2,26 45j 2900 Nonacosano C29 3,31 ± 1,65 5,28 ± 0,49 1,96 ± 1,88 46 2904 4,8-Dimetil C28 _ _ 0,13 ± 0,07 47 2919 13-; 11-; 9-Metil C29 0,27 ± 0,29 0,19 ± 0,09 0,55 ± 0,35 48 2926 7-Metil C29 0,12 ± 0,11 0,11 ± 0,08 0,35 ± 0,27 49 2934 5-Metil C29 0,05 ± 0,05 0,04 ± 0,03 0,04 ± 0,04 50 2958 3-Metil C29 0,07 ± 0,06 0,05 ± 0,02 0,40 ± 0,35 51 2993 9-Triaconteno C30 0,53 ± 0,35 0,35 ± 0,14 0,72 ± 0,62 52 3000 Triacontano C30 0,07 ± 0,06 0,09 ± 0,05 0,29 ± 0,30 53 3047 13- Hentriaconteno C31 0,21 ± 0,03 0,20 ± 0,09 0,30 ± 0,16 54 3072 9- Hentriaconteno C31 0,19 ± 0,24 0,23 ± 0,07 0,22 ± 0,14

55k 3100 Hentriacontano C31 0,53 ± 0,35 0,57 ± 0,06 1,32 ± 1,78 56 3173 3-Metil C31 0,63 ± 0,57 0,48 ± 0,18 0,12 ± 0,11 57 3269 11-Tritriaconteno C33 0,20 ± 0,16 0,21 ± 0,14 0,33 ± 0,23 58 3300 Tritriacontano C33 0,29 ± 0,32 0,20 ± 0,14 0,42 ± 0,30 59 3377 11-Tetriaconteno C34 2,57 ± 0,25 2,40 ± 1,14 0,76 ± 0,70 60 3400 Tetriacontano C34 2,91 ± 0,75 2,63 ± 0,56 0,30 ± 0,01 61 3500 Pentatriacontano C35 1,52 ± 0,00 1,49 ± 0,38 0,35 ± 0,09 62 3600 Hexatriacontano C36 1,80 ± 0,00 1,69 ± 0,52 _ 63 3800 Octatriacontano C38 1,31 ± 0,00 1,39 ± 0,34 _

a-j As letras sobrescritas nos números dos picos, correspondem ao código dos picos selecionados pela análise estatística representados na tabela 2 e na figura 3.

Tabela 9. Análise discriminante dos compostos químicos cuticulares encontrados nos grupos de fêmeas dominante invasora, dominante residente e subordinada de Euglossa melanotricha.

Associação entre grupos de fêmeas Distância de Mahalanobis F P Dominante invasora x dominante residente 8,06 3,63 p = 0,10 Dominante invasora x subordinada 43,76 18,82 p < 0,00001 Dominante residente x subordinate 29,91 16,83 p < 0,00001

Tabela 8. Proporção relativa dos hidrocarbonetos cuticulares (média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes (residentes e invasoras) e das subordinadas (residentes e invasoras) de Euglossa melanotricha. Os compostos em negrito representam os 11 picos selecionados pela análise estatística.


Dominante Invasora + Residente Subordinada-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Prop

orçã

o de

com

post

os (M

édia

± D

P)

Alcano Alceno Alcanos ramificados

Figura 13. Proporção relativa (média ± desvio padrão) of n-alcanos, alcenos, e alcanos ramificados entre fêmeas dominantes invasoras + dominantes residentes e subordinadas de Euglossa melanotricha.

Figure 14. Análise discriminante do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes invasoras (n = 5), dominantes residentes (n = 30) e subordinadas (n = 30) em 10 ninhos de Euglossa melanotricha.

-15 -10 -5 0 5 10 15

Root 1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

Roo

t 2

Inv asora Dominante residente Subordinada


2.4 Discussão

2.4.1 Regulação social e a dominância reprodutiva em Euglossa melanotricha

Neste estudo, o principal resultado mostrou que fêmeas dominantes de Euglossa

melanotricha monopolizam a reprodução por coerção e canibalismo dos ovos (cerca de 70%

dos ovos das subordinadas foram policiados pelas dominantes; Tabela 3). A ocorrência de

coerção e policiamento dos ovos pelas dominantes é esperada, dado que em Euglossa

melanotricha os ninhos são pequenos, com duas ou três fêmeas associadas (Foster et al 2001).

A teoria do fitness inclusivo prevê que a competição entre fêmeas é esperada em

sociedades simples quando todas as fêmeas são capazes de produzir machos e fêmeas

(Ratnieks et al 2006). Assim, em termos de benefício reprodutivo, dominantes podem ser

selecionadas a reconhecer e remover os ovos das subordinadas, dado que elas são mais

relacionadas com sua própria prole (r = 0.5) do que com a prole das suas irmãs completas (r =

0.375) ou filhas, r = 0.25 (Ratnieks et al 2006).

O comportamento de dominância em Euglossa melanotricha foi então expresso

através da agressão e canibalismo dos ovos. Particularmente interessante, é que esses traços

comportamentais claramente definem a divisão de trabalho e a hierarquia entre fêmeas,

embora não afetem a ativação dos ovários nas subordinadas. Em colônias de vespas

primitivamente sociais, as fêmeas usualmente apresentam altas taxas de interações agressivas

que resultam em uma das fundadoras assumindo a dominância reprodutiva, enquanto a

reprodução das operárias é suprimida fisiologicamente (Reeve & Gamboa 1983, 1987).

Estudos com abelhas têm demonstrado que a substituição das dominantes por

subordinadas ocorre quando as dominantes morrem ou desaparecem dos ninhos (Euglossa

cordata, Garófalo 1985; Euglossa fimbriata Augusto & Garófalo 2009; Evylaeus calceatus,


Plateaux-Quénu 1985; Dialictus lineatulus, Eickwort 1986; Halictus rubicundus, e Exoneura

bicolor, Schwarz & O’Keefe 1991), ou quando há registro de substituição da dominante por

fêmeas invasoras (Zobel & Paxton 2007).

Neste estudo, as fêmeas invasoras curiosamente apresentaram particularidades na

relação entre o status reprodutivo assumido nos ninhos, tamanho do corpo e desenvolvimento

ovariano. As fêmeas invasoras maiores que as residentes, tornaram-se dominantes, e as

invasoras que não apresentaram diferença de tamanho em relação às residentes tornaram-se

subordinadas. Uma das explicações para esse fato é que invasoras maiores podem usurpar e

manter a residência nos ninhos por intimidação física (Smith & Weller 1989, Richards &

Packer 1996, Pabalan et al 2000) ou o tamanho pode está associado ao feromonio de

sinalização (Smith & Weller 1989) que a caracteriza como invasora ou usurpadora potencial

(Zobel & Paxton 2007).

Da mesma forma, residentes maiores podem evitar a usurpação do ninho. Em

Lasioglossum malachurum, rainhas residentes maiores evitaram a usurpação numa

porcentagem que variou entre 60% a 94% das tentativas de invasão (Smith & Weller 1989,

Kaitala et al 1990).

A aceitação das invasoras de tamanho semelhante ou menores que as dominantes

residentes podem estar associadas à estratégia de ganho da dominante no cuidado da sua prole

devido aos riscos de morte das subordinadas durante o forrageamento (Ward & Kukuk 1998,

Field et al 1999), ou ainda, as fêmeas invasoras não apresentariam sinalização química como

potencial usurpadora (Zobel & Paxton 2007).

Nos ninhos de Euglossa melanotricha em diferentes processos de reutilização, as

interações não agressivas foram mais comuns do que as agressivas ou de dominância (Tabela

3). Em outros insetos sociais, baixas frequências de interações de dominância foram

observadas em ninhos já estabelecidos, apesar de uma das fêmeas assumirem a dominância


reprodutiva (West-Eberhard 1969, 1982a, b, 1986, Strassmann 1981, Dew 1983, Reeve &

Gamboa 1983, 1987, Hughes & Strassmann 1988, Reeve 1991, Röseler 1991, Augusto &

Garófalo, 2009, 2010). Uma explicação para esse comportamento pode ser a presença de

outra forma mais sutil ou química de controle reprodutivo das subordinadas, além da

intervenção física (Premnath et al 1996)

Em abelhas sociais, a exemplo do gênero Bombus, o domínio de uma rainha em

pequenos ninhos, é estabelecido inicialmente através de agressão física e, interações diretas

depois do estabelecimento dos ninhos tornam-se cada vez mais raras, devido aos sinais

químicos da rainha (West-Eberhard 1977, Hölldobler 1984, 1987).

Não está claro, qual destas duas transições evolutivas, a inibição física ou à regulação

química do controle reprodutivo das operárias evoluiu primeiro (Kardile & Gadagkar 2003).

O que se sabe é que com a evolução dos feromônios, as rainhas já não apresentam altos níveis

de comportamento de domínio para manter o monopólio reprodutivo. Assim, o sistema

apresentado em Euglossa melanotricha é atrativo para discussão sobre a transição evolutiva

do sistema primitivamente social ao altamente social, com base no controle físico

(centralizado nas interações de dominância) e na regulação química da reprodução das

subordinadas (controle descentralizado).

2.4.2 Efeito da remoção das fêmeas dominantes e subordinadas sobre o comportamento,

reconhecimento e produtividade nos ninhos

Os resultados mostraram que fêmeas dominantes de Euglossa melanotricha mantidas

até 36 h fora dos ninhos foram capazes de reconhecer as células com ovos das subordinadas,

e, como consequência, comer e substituir os ovos dessas fêmeas pelos seus. Isto indica que as

fêmeas são capazes de recuperar a dominância reprodutiva. Uma explicação para este


resultado é que células com ovos das subordinadas não teriam as pistas químicas deixadas

pelas dominantes durante o policiamento. Em insetos sociais, a sinalização química em ovos

de rainhas tem sido demonstrada como explicação para ausência de policiamento do ovo da

rainha por operarias que policiam ovos de outras operárias (Ayasse et al 1999, Endler et al

2006, Sramkova et al 2008, Amsalem et al 2009). Em Melipona marginata, por exemplo,

Ferreira-Caliman et al (2012) compararam os componentes químicos da superfície das células

e do abdômen das rainhas, e mostraram que de fato a rainha deixa pistas químicas nas células

de cria sinalizando o fim da sequência de aprovisionamento e oviposição.

Contudo, subordinadas foram capazes de assumir o controle reprodutivo quando as

fêmeas dominantes foram mantidas por mais de 36 h fora dos ninhos. É provável que este

resultado não tenha relação com a capacidade de discriminação das células neste intervalo de

tempo, mas sim com o fato das dominantes terem sido substituídas pelas subordinadas mais

velhas (potenciais dominantes). Substituição de dominantes (em caso de morte ou

desaparecimento) por subordinadas mais velhas foram observados em estudos feitos com

Euglossa cordata (Garófalo 1985), Eg. fimbriata (Augusto & Garófalo 2009), Eg. melanotricha

(Andrade-Silva & Nascimento 2012), Evylaeus calceatus (Plateaux-Quénu 1985), Dialictus

lineatulus (Eickwort 1986), Halictus rubicundus e Exoneura bicolor (Shwarz & O’keefe 2001).

A análise da condição reprodutiva das fêmeas de Euglossa melanotricha mostrou que

as subordinadas estão aptas a reproduzir e produzir fêmeas e machos, e, portanto, podem

fundar seus próprios ninhos. Os resultados indicaram também que a remoção das

subordinadas afetou o comportamento e a produtividade nos ninhos. Em outras palavras, a

produtividade, medida pelo número de células aprovisionadas nos ninhos foi

significativamente reduzida quando as subordinadas foram removidas, indicando claro

benefício da divisão de trabalho entre fêmeas reprodutivas e não reprodutivas. Estudos

prévios demonstraram que a nidificação solitária é adaptativa quando o incentivo reprodutivo


para operárias ou subordinadas é maior do que o potencial de ocupar a posição da dominante

nos ninhos natais (Reeve & Gamboa 1983).

2.4.3 Análise do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas de acordo com o status

social ocupado nos ninhos de Euglossa melanotricha

Os resultados mostraram que fêmeas fundadoras diferiram das dominantes e

subordinadas por apresentarem maior proporção de n-alcanos (Tabela 5, Figura 9).

Fundadoras solitárias têm uma frequência de atividade de forrageamento quase três vezes

maior que subordinadas, porque elas coletam recurso para nidificação, enquanto as

subordinadas, usualmente aproveitam material do ninho reutilizado para construção das

células (Andrade-Silva & Nascimento 2012). Assim, como os alcanos são estruturalmente os

melhores hidrocarbonetos para função de resistência a dissecação e impermeabilização

(Blomquist & Dillwith 1985, Gibbs 2002), espera-se que fêmeas fundadoras expostas a

maiores pressões ambientais tenham uma quantidade maior de n-alcanos sobre a cutícula. Tais

resultados foram demonstrados em estudos com formigas da espécie Pogonomyrmex barbatus

(Wagner et al 1998, 2001).

A maior parte dos compostos encontrados na análise do perfil cuticular das fêmeas de

Euglossa melanotricha também foi descrito em espécies de vespas (Polistes fuscatus: Espelie

et al 1994; Polistes dominulus: Bonavita-Cougourdan et al 1991, Dani et al 2001, Dapporto et

al 2004, revisando por Monnin 2006, Green & Field 2011; Polistes gallicus: Dapporto et al

2007; Polistes satan: Tannure-Nascimento et al 2007, 2008; Vespa crabro: Butts et al 1995) e

de abelhas do gênero Bombus (Bombus hypnorum: Ayasse et al 1995; Bombus terrestris:

Sramkova et al 2008, Rottler et al 2013). Para todas estas espécies, os compostos foram

principalmente hidrocarbonetos de cadeia longa variando de 20 a 38 átomos de carbono.


A explicação para a proporção de alcanos em fundadoras, não pode ser aplicada para

analise comparativa entre fêmeas dominantes e subordinadas, porque as dominantes são mais

velhas e a concentração desses compostos pode estar relacionada tanto a idade quanto as

frequências de atividade de forrageamento (Layton et al 1994, revisado por Blomquist &

Bagnères 2010).

O efeito da dominância reprodutiva sobre o perfil cuticular é particularmente

interessante e demonstrou que em Euglossa melanotricha alguns picos podem estar

associados com a sinalização reprodutiva ou de dominância (Figura 10). A análise geral dos

grupos de compostos mostrou que a proporção entre alcanos e alcenos foi o fator principal

para discriminação entre dominantes e subordinadas (Tabela 5, Figura 11), semelhante ao que

foi encontrado em outros trabalhos com abelhas, formigas e vespas (revisado por Monnin

2006, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Green & Field 2011, Evison et al 2012).

A análise individual dos 11 compostos que foram selecionados pela estatística

discriminante mostrou que entre fêmeas dominantes e subordinadas nove compostos

contribuíram significativamente para variação (p < 0,04, Tabelas 5 e 6; Figura 12). Este

resultado sugere que sinais químicos podem estar envolvidos na comunicação e

reconhecimento da posição hierárquica das fêmeas em Euglossa melanotricha. Se esses sinais

químicos forem honestos para sinalização do status social, semelhante ao que ocorre em

outros insetos, as interações agressivas e o policiamento feito de forma unidirecional das

dominantes sobre as subordinadas podem refletir sua posição na hierarquia e reforçar o

estabelecimento e a manutenção da dominância reprodutiva (Heinze & Smith 1990, Oliveira

& Hölldobler 1990, Visscher & Dukas 1995, Ortius & Heinze 1999, revisado por Blomquist

& Bagnères 2010, Zanette et al 2012)

Entre os alcanos lineares, o n-pentacosano foi significativamente mais abundante no

perfil químico das fêmeas dominantes do que nas subordinadas (Tabela 5, Figura 12). Na


formiga Aphaenogaster cockerelli este alcano também foi o mais abundante no perfil químico

de rainhas ou de operárias poedeiras (Smith et al 2009). A utilização de bioensaios com o n-

pentacosano demonstrou que em colônias órfãs quando operárias poedeiras foram tratadas

com doses extras desse composto em suas cutículas, suas companheiras de ninhos policiaram

seus ovos e expressaram comportamento semelhante ao exibido na presença de rainhas

intrusas (Smith et al 2009, 2011). Este resultado aponta que alterações na concentração do n-

pentacosano interferem na discriminação das fêmeas reprodutivas residentes pelas suas

companheiras de ninho.

Alcanos ramificados, como os dimetilados do pentacosano C25, por exemplo, foram

encontrados somente nas fêmeas dominantes. Outros compostos insaturados como o 5-

pentacoseno C25 e o 9-nonacoseno C29 foram significativamente mais abundantes na cutícula

dessas fêmeas do que nas fêmeas subordinadas (Tabela 5, Figura 12). Estes resultados

corroboram com estudos feitos com abelhas, formigas e vespas, os quais apontam essas

substâncias como sinais químicos individuais que carregam informações a respeito da casta,

fertilidade e dominância (D'Ettorre et al 2004, revisado por Howard & Blomquist 2005,

Nunes et al 2010, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Foitzik et al 2011)

Alcenos e especialmente o 9-nonacoseno C29 têm sido associados a alterações na

fertilidade em outras espécies de insetos sociais. O 9-nonacoseno C29 foi significativamente

mais abundante em fêmeas que mantiveram a dominância reprodutiva em comparação com

operárias ou subordinadas na vespa Polistes dominulus (Sledge et al 2001, Green & Field

2011). Além disso, nas formigas ponerine Harpegnathos saltator, Streblognathus peetersi e

Hypoponera opacior, mudanças na abundância dos alcenos foram correlacionados com a

capacidade reprodutiva das fêmeas (Liebig et al 2000, Cuvillier-Hot et al 2004, Foitzik et al

2011).


Recentemente, o 9-nonacoseno C29 também foi apontado como um dos principais

componentes do sinal de fertilidade em estudos feitos com a formiga da espécie

Odontomachus brunneus (Smith et al 2012, 2013). Nestes estudos, os autores usaram

bioensaios para manipular o perfil cuticular das fêmeas. Fêmeas não reprodutivas receberam

doses do composto 9-nonacoseno C29 em suas cutículas e foram tratadas como reprodutivas

intrusas por suas companheiras de ninho. As reações agressivas contra as fêmeas manipuladas

foram semelhantes às provocadas em experimentos feitos em ninhos com rainha quando

foram realizadas introduções de rainhas intrusas. Interações agressivas, expressas como

antenação rápida, compunham a maioria das respostas ao 9-nonacoseno C29 (Smith 2012).

Resultados semelhantes já haviam sido encontrados em ninhos órfãos, embora as reações às

fêmeas manipuladas com o 9-nonacoseno C29 envolveram respostas submissas das fêmeas não

reprodutivas (Powell & Tschinkel 1999).

Ainda com relação aos hidrocarbonetos que contribuíram para diferir os perfis

químicos das fêmeas dominantes e subordinadas em Euglossa melanotricha, resultados

semelhantes foram encontrados na formiga primitivamente social Myrmecia gulosa. Nesta

espécie, o 9-pentacoseno C25 e o 3-metilpentacosano C25 foram encontrados quase que

exclusivamente em dominantes, além das diferenças nas proporções de outros 13 compostos

de hidrocarbonetos (Dietemann et al 2003).

Hidrocarbonetos cuticulares associados com a fertilidade e dominância, também foram

encontrados em espécies de formigas que estabelecem hierarquias de dominância agressiva,

como por exemplo, Diacamma ceylonense (Cuvillier-Hot et al 2001, 2002), Dinoponera

quadriceps (Monnin et al 1998) e Streblognathus peetersi (Cuvillier-Hot et al 2004). Estes

sinais de fertilidade são supostamente para ajudar na resolução de conflitos dentro da colônia

estimulando operárias a tomarem sua posição na hierarquia de dominância (Cuvillier-Hot et al

2001).


Na formiga Streblognathus peetersi o perfil de hidrocarbonetos cuticulares foi

correlacionado com a fertilidade. As operárias reprodutivas ou gamergates e as operárias com

posição inferior na hierarquia tiveram perfis característicos (Cuvillier-Hot et al 2004). Tal

como ocorre em Dinoponera quadriceps, quando a gamergate foi removida, fêmeas de

hierarquias inferiores apresentaram respostas agressivas durante alguns dias até o

estabelecimento de uma nova alfa ou gamergate. A condição de poedeira da nova alfa foi

aralela às modificações no seu perfil de hidrocarbonetos que se assemelhou ao perfil da rainha

removida (Cuvillier-Hot et al 2004).

Na formiga Camponotus vago, a rainha difere quimicamente das operárias durante a

primavera e o verão, quando a rainha põe muitos ovos, mas não difere no final do inverno,

período em que rainha mesmo inseminada, ainda não iniciou a postura dos ovos (Bonavita-

Cougourdan & Clément 1994, Biseau et al 2004). Isto mostra que os hidrocarbonetos

cuticulares sinalizam a dominância pela capacidade de oviposição, o que sustenta a hipótese

de que esses compostos são sinais honestos da fertilidade e/ou dominância.

Uma prova fundamental da importância dos hidrocarbonetos cuticulares como sinal de

fertilidade foi evidenciada na formiga Ponerinae Platythyrea punctata. Todas as operárias

desta espécie são potencialmente capazes de reproduzir por partenogênese telítoca (produção

de fêmeas a partir de ovos não fertilizados), mas apenas uma normalmente a faz, e ela

quimicamente diferente das outras operárias (Hartmann et al 2005). Experimentalmente,

quando grupos de operárias foram isoladas por 27 dias da fêmea poedeira, elas iniciaram a

postura dos ovos, mas continuaram a ter o perfil de hidrocarbonetos cuticulares típico de

fêmeas não poedeiras. No entanto, quando os grupos foram isolados por 47 dias, as fêmeas

adquiriram o perfil de hidrocarbonetos cuticulares típico das fêmeas poedeiras (Hartmann et

al 2005). Esta discrepância temporal entre as alterações na fertilidade e no perfil de

hidrocarbonetos cuticulares mostra que a fertilidade e o perfil químico podem ser


presumivelmente regulados por fatores subjacentes comuns. A produção de hormônios

reprodutivos é um exemplo de um mecanismo subjacente.

De fato, estudos comparativos com abelhas, vespas e formigas demonstraram que os

perfis de hidrocarbonetos cuticulares estão mais correlacionados com o desenvolvimento

ovariano do que com a classificação de hierarquia (Heinze et al 2002, revisado por Monnin

2006, Izzo et al 2010, Blomquist & Bagnères 2010). Contudo, estudos com Polistes

dominulus têm demonstrado que a relação entre o tamanho dos corpora allata (e, portanto, dos

títulos de hormônio juvenil - JH), a atividade ovariana e o perfil de hidrocarbonetos

cuticulares é complexo e varia dependendo do ambiente social (Tibbetts & Izzo 2009,

Tibbetts et al 2011, Tibbetts & Sheehan 2012).

Em Euglossa melanotricha, a dominância reprodutiva de uma fêmea não resulta na

supressão da atividade ovariana das subordinadas que participam de parte da produção do

ninho (cerca de 20%, Andrade-Silva & Nascimento 2012). Desta forma, se a sinalização

química estiver relacionada ao status social das fêmeas, esta não será fator dependente da

fertilidade. Possivelmente, nesta espécie, a sinalização reprodutiva não está associada somente

a condição de acasalamento e fertilidade, mas, como ocorre em algumas formigas ponerinae

(Oliveira & Hölldobler 1990, Peeters et al 1999, Cuvillier-Hot et al 2002) as hierarquias de

dominância podem ser estabelecidas antes do desenvolvimento dos sinais reprodutivos

(Peeters et al 1999, revisado por Blomquist & Bagnères 2010) e dessa forma, as interações até

o estabelecimento da hierarquia desencadeia a produção dos hidrocarbonetos que sinalizam a

capacidade da fêmea reprodutiva (Liebig et al 2000, Cuvillier-Hot et al 2002, 2004, 2005).

Na formiga da espécie Streblognathus peetersi, por exemplo, o tamanho dos ‘corpora

allata’ diferiu entre as operárias e gamergates (Cuvillier-Hot et al 2004b). A aplicação tópica de

‘pyriproxyfen’ (uma substância análoga ao hormônio juvenil) na gamergate não afetou sua

agressividade, mas diminuiu sua produção de ovos e acionou sua imobilização por operárias de


hierarquia inferior com consequente substituição por outra fêmea na escala hierárquica

(geralmente beta ou gama). As respostas estão associadas a alterações na composição dos

hidrocarbonetos cuticulares da gamergate imobilizada (Cuvillier-Hot et al 2004a). Estes trabalhos

mostram que a relação entre fertilidade, níveis hormonais e perfis de hidrocarbonetos cuticulares é

realmente complexa. O efeito hormonal pode variar de acordo com a condição social ou a

fisiologia do indivíduo, e pode haver atrasos entre mudanças nos títulos hormonais,

ativação/desativação dos órgãos reprodutivos e modificações de comportamento.

A discriminação entre grupos de fêmeas pode ser química, comportamental e

hormonal, com ou sem rainhas morfológicas. O perfil de hidrocarbonetos cuticulares não

apenas indica que um indivíduo reproduz ou não, ele anuncia a sua capacidade e nível de

atividade reprodutiva. Com efeito, o perfil químico pode variar gradualmente a partir do perfil

de um indivíduo estéril ao de um indivíduo parcialmente fértil, e até o perfil de um indivíduo

totalmente fértil. Contudo, a correlação entre hidrocarbonetos cuticulares e fertilidade não é

sempre ideal, uma vez que não varia no mesmo ritmo. Isso não quer dizer que a correlação

seja fraca, ou que os hidrocarbonetos cuticulares não sejam uma reflexão honesta da

fertilidade. Ambos os fatores podem ser regidos pelos mesmos mecanismos subjacentes, mas

pode reagir em velocidades diferentes.

Em outros grupos animais, como nas aves, por exemplo, Gonzalez et al 2002

demonstraram que o sinal honesto de fertilidade é assegurado pelo custo relacionado a

condição de ser dominante, funcionando assim como um ‘sinal avaliador’ de resistência pelas

companheiras a possíveis combates com intrusas. Agressão física é, portanto, essencial para o

sistema, pois é um ‘controle de qualidade’, que garante que a rainha torne evidente sua

capacidade reprodutiva (Johnstone & Norris 1993).

Estudos com vespas têm demonstrado que no início do estabelecimento de ninhos,

fundadoras associadas não apresentam diferenças químicas entre seus perfis cuticulares


(Sledge et al 2001). Estes estudos sugerem ainda que devido a ausência de discriminação, a

competição entre as fêmeas é maior, e por esse motivo são mais frequentes interações

agressivas ou de dominância. Curiosamente, no início das associações, as fundadoras parecem

ser menos capazes de realizar o reconhecimento do ovo e frequentemente comem seus

próprios ovos (Gervet 1964).

Segundo Sledge et al (2004), nesta fase inicial, como as fundadoras estão em

semelhante condição reprodutiva, os sinais cuticulares podem estar correlacionados apenas

com a fertilidade. Interações hierárquicas passam a ocorrer após o nascimento das

subordinadas jovens, e, após cerca de 1 mês de interações, estão definidas as posições

hierárquicas entre as fêmeas, surgindo três grupos distintos, as fundadoras ‘alfa’, fundadoras

subordinadas ou ‘beta’ e subordinadas jovens. Os grupos apresentam diferenças no tamanho

dos ‘corpora allata’ e variações entre seus perfis cuticulares (Turillazzi et al 1982, Sledge et al

2004).

Na vespa Polistes dominulus os estudos confirmaram a correlação entre o tamanho dos

‘corpora allata’ (Dapporto et al 2007) e as diferenças de perfis entre os ovos e a cutícula das

fêmeas, enquanto as variações nos perfis foram inversamente relacionadas com diferenças de

desenvolvimento ovariano. Assim, a sinalização de dominância e não de fertilidade, pode

permitir o reconhecimento do ovo (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).

Os sinais de dominância podem ser sugeridos como confiáveis para discriminação

entre os ovos de fêmeas dominantes e subordinadas. Em Euglossa melanotricha foi

demonstrado que as dominantes são capazes de reconhecer e policiar os ovos das

subordinadas mesmo quando estas são removidas do ninho antes da postura das subordinadas,

excluindo a possibilidade de pistas visuais no reconhecimento.

Dapporto et al (2010) mostraram que fêmeas subordinadas da vespa Polistes

dominulus podem colocar ovos a uma frequência correspondente a fertilidade inicial da fêmea


alfa, mas notavelmente seus perfis cuticulares não correspondem ao perfil das alfas. Os

autores mostraram então que a posição relativa dos indivíduos na hierarquia de dominância

foi correlacionada quimicamente, e sugerem que o estado é anunciado através de proporções

variáveis de hidrocarbonetos, em vez da referência a um único hidrocarboneto como

sinalizador de fertilidade.

Assim, os indivíduos parecem expressar um perfil característico de hidrocarbonetos,

independente do sinal de fertilidade, perfil também encontrado em seus ovos. Este resultado

reforça a afirmação de que o status de dominância é comunicado através de um sinal separado

de fertilidade, e que este permite o domínio da produção de ovos por fêmeas dominantes

mesmo na presença de outros indivíduos férteis.

Keller & Nonacs (1993) afirmaram que a ausência da supressão ovariana entre as

subordinadas pode ocorrer quando a sinalização da fertilidade somente comunica a aptidão

das fêmeas dominantes. Assim, tanto o controle físico, quanto a sinalização química são

confiáveis indicadores da capacidade reprodutiva das fêmeas (vertebrados: Hrdy & Hrdy 1976

e em insetos: West-Eberhard 1967, Sledge et al 2001, Cuvillier-Hot et al 2004, Hartmann et al

2005, Endler et al 2006, Heinze & D’Ettorre 2009, Weil et al 2009).

Recentemente Martin et al (2012) verificaram que na formiga Formica exsecta, o

perfil de hidrocarbonetos resulta de componentes genéticos e ambientais atuando de forma

independente nos processos bioquímicos de síntese destes compostos. Os componentes

ambientais alteram a composição do perfil a curto prazo, a exemplo do que ocorre com as

fêmeas durante as interações sociais, mas não contribuem para a manutenção da diversidade

entre colônias, sendo este fenômeno uma resultante dos componentes genéticos que mantêm a

variabilidade a longo prazo.

Os resultados das analises dos perfis cuticulares das fêmeas invasoras, dominantes

residentes e subordinadas, claramente confirmam que a composição de hidrocarbonetos


cuticulares das fêmeas dominantes (invasoras ou residentes) foi significativamente diferente

das subordinadas (Tabela 9, Figura 14). É importante mencionar que as dominantes

apresentaram maiores proporções de alcanos lineares do que as subordinadas (Figura 13).

Estes resultados mostram que o efeito do ambiente social no perfil cuticular é particularmente

interessante, dado o significante papel dos alcanos na supressão da atividade ovariana em

outras abelhas (van Oystaeyen et al 2014, Nunes et al 2014).

Os resultados com Euglossa melanotricha são congruentes com as hipóteses sobre a

evolução dos sinais químicos de dominância em insetos sociais (Ayasse et al 2001, revisado

por Blomquist & Bagnères 2010). Assim como ocorre em abelhas do gênero Bombus, as

interações agressivas são determinantes para o reconhecimento individual (Ayasse et al 2001).

Em outras palavras, a superioridade agressiva está ligada a discriminação individual,

permitindo que as companheiras de ninho identifiquem as fêmeas dominantes e, assim, evitem

os custos dos conflitos físicos (Hölldobler 1984, Cuvillier-Hot et al 2004). As fêmeas

dominantes podem também evitar o custo da alocação de tempo e energia em conflitos

repetidos através da sinalização química.

2.4.4 Implicações para a evolução da eussocialidade

Estudos prévios sugeriram que as abelhas euglossine são predominantemente solitárias

ou comunais, com poucas espécies apresentando níveis rudimentares de socialidade (revisado

em Cameron 2004, Dressler 1982). Contudo, recentes estudos filogenéticos indicaram que a

eussocialidade evoluiu uma única vez em ancestrais comuns dos Apinae corbiculados, e foi

subsequentemente perdido nas abelhas euglossine (Cardinal & Danforth 2011, Canevazzi &

Noll 2014). Os resultados do presente estudo fornecem novos “insights”, e indicam que

elementos da eussocialidade são bem definidos em algumas espécies de abelhas euglossine.


Nos Hymenoptera sociais, a forte correlação entre perfil químico cuticular e o status

reprodutivo das fêmeas têm sido demonstrado (revisado em Liebig 2010). Contudo, neste

estudo foi demonstrado que esta relação em Euglossa melanotricha parece ser parcialmente

evoluída. Os dados sugerem que a hierarquia de dominância foi primitivamente estabelecida

através do comportamento, e então, reforçada quimicamente. De fato, hidrocarbonetos

cuticulares são refletidos pelo status social, mas não resulta em supressão da atividade

ovariana. No entanto, os hidrocarbonetos cuticulares parecem ser efetivos na manutenção da

dominância reprodutiva como foi demonstrado nos experimentos de remoção das fêmeas.

Esses aspectos sugerem que a organização de sociedades pequenas tais como em Euglossa

pode ser modulada por traços complexos como ocorre em insetos com socialidade avançada.


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CAPÍTULO III Regulação reprodutiva e o parentesco em Euglossa melanotricha: evidência para seleção parental

Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 89

3.1 Introdução

A teoria da seleção parental proposta por Hamilton (1964) prevê que um

comportamento altruísta pode se tornar evolutivamente estável quando o indivíduo que o

executa apresenta elevado parentesco com os indivíduos que recebem. Em outras palavras, a

soma do sucesso reprodutivo de um indivíduo é diretamente atribuída ao aumento do sucesso

reprodutivo de parentes, como resultado da sua cooperação (Hamilton 1964). Os indivíduos

são então capazes de avaliar os custos e benefícios da ajuda social e devem agir de modo a

maximizar seu ganho genético ou aptidão inclusiva. O parentesco (r) entre os indivíduos é

dado pela probabilidade deles compartilharem cópias genéticas idênticas.

O conceito de aptidão inclusiva tem importantes implicações na compreensão da

origem e evolução do comportamento social, bem como sua relação com o sistema

haplodiploide dos himenópteros sociais (Hamilton 1964).

De fato, as demonstrações mais notáveis das previsões do modelo de aptidão inclusiva

foram feitas em estudos com insetos cuja determinação do sexo é haplodiploide e o sistema de

acasalamento é monogâmico (monogínico/monoândrico) (Hamilton 1964, Boomsma &

Grafen 1990, Boomsma & Grafen 1991, Mueller 1991, Sundström 1994, Hughes et al 2008,

Gardner & Ross 2013).

No sistema haplodiploide, ovos fertilizados se desenvolvem em fêmeas diplóides e ovos

não fertilizados se desenvolvem em machos haplóides (Cook & Crozier 1995). Assumindo

acasalamento ao acaso, uma fêmea reprodutiva por colônia, e acasalamento único

(monoginia/monoandria), as fêmeas serão, em média, mais relacionadas com suas irmãs (r = 0,75)

do que com a sua própria prole (r = 0,5) (Figura 14). Além disso, o parentesco entre uma operária

e seu irmão é de apenas 0,25, ou seja, menor do que com suas irmãs. As operárias então serão

mais relacionadas com seus próprios filhos (r = 0,5), e com os filhos de outras operárias, seus

sobrinhos (r = 0,375), do que com seus irmãos (Figura 15). Essa assimetria de parentesco pode

resultar em conflitos sobre a alocação sexual (Ratnieks & Reeve 1992). Um desses conflitos é


sobre a produção de machos. As operárias podem aumentar a sua aptidão inclusiva cuidando dos

seus próprios filhos ou dos filhos das suas irmãs (Bourke 1988, Hamilton 1972), enquanto a

rainha terá maior aptidão se produzir seus próprios filhos.

Figura 15. Genealogia de himenópteros sociais com uma rainha fecundada por um macho (sistema monogínico/monoândrico). Os números ilustram o parentesco de uma operária com sua irmã (r = 0,75), seu irmão (r = 0,25), seu próprio filho (r = 0,5), e do seu filho com outra operária (r = 0,375). Os indivíduos estão representados por meio de símbolos indicando o sexo (modificado de Heinze et al 2004).

O outro conflito é sobre a produção de fêmeas. Enquanto a rainha é igualmente

relacionada com suas filhas e filhos e, portanto, é selecionada para produzir uma proporção

sexual de 1:1, as operárias irão se beneficiar da ajuda ‘altruísta’ somente se investirem mais

na produção de fêmeas, neste caso suas irmãs, do que em machos (Trivers & Hare 1976,

Heinze 2004). Elas podem então tentar aumentar a sua aptidão inclusiva através da

manipulação da proporção sexual em favor das fêmeas. Assim, o conflito potencial existe

mesmo em sociedades de himenópteros mais simples e com um elevado parentesco (r = 0,75)

entre companheiras de ninho.

Estudos comparativos com táxons de formigas, abelhas e vespas forneceram

evidências de que a monogamia (monoginia/monoandria) constitui o estado ancestral em


todas as linhagens estudadas (Hughes et al 2008, Figura 16). Além disso, estes estudos

sugerem que a totipotência reprodutiva das operárias está associada com a monoandria, de

maneira que a seleção direcional para a perda da totipotência reprodutiva das operárias pode

ter sido reforçada pelo sistema haplodiplóide (Bourke & Franks 1995, Hughes et al 2008).

Alta frequência de acasalamentos ou poliandria obrigatória são estados invariavelmente

derivados, e ocorrem unicamente em espécies em que as operárias perderam a habilidade

reprodutiva. Assim, poliandria parece ter evoluído depois que a evolução social alcançou um ponto

em que a reversão da eussocialidade se tornou improvável. Tais estudos indicam que o elevado

parentesco foi fundamental na evolução da eussocialidade em Hymenoptera, apoiando fortemente

as predições da teoria da aptidão inclusiva (Hughes et al 2008, Boomsma 2009; Figura 16).

3.1.1 Assimetria reprodutiva e a resolução dos conflitos sobre a reprodução

Sociedades animais são notáveis pela enorme variação que exibem em suas estratégias

sociais e reprodutivas. No nível mais básico, as estratégias que os indivíduos adotam dentro

das colônias podem variar. Alguns indivíduos deixam o ninho, ao passo que outros ali

permanecem (Clutton-Brock et al 1998, Field et al 1999, Buston 2003); alguns reproduzem,

outros renunciam ou retardam a sua reprodução (Sumner et al 2002, Buston 2004, Heg et al

2006 ); ou ainda, alguns ajudam, enquanto outros não (Field et al 2006, Cant 2012).

No topo da variação em estratégias individuais, as relações entre os indivíduos dentro

dos grupos sociais podem variar. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que assumem

a dominância reprodutiva (alta assimetria), ou podem ser formados por indivíduos que

compartilham de forma igualitária a reprodução (baixa assimetria) (Emlen & Wrege 1992).

Em insetos sociais, modelos que explicam a assimetria reprodutiva se concentram

principalmente na aptidão indireta adquirida através da ajuda a parentes, uma vez que as

operárias "estéreis" têm capacidade limitada de reproduzir (Bourke 2011). No entanto, em

Polistes dominulus, uma vespa primitivamente social, Queller et al (2000) demonstraram que


a vantagem significativa que as subordinadas obtêm ao permanecerem no ninho foi à chance

de reprodução tardia, especialmente após a morte da dominante. Assim, nessa espécie, o

sistema social é funcionalmente diferente de outros insetos sociais, mas semelhante a algumas

sociedades de vertebrados, em que os indivíduos subordinados ganham através da herança de

um território, razão pela qual a aptidão indireta não explica totalmente a vida em grupo

(Nonacs et al 2006, Leadbeater et al 2011).

De fato, insetos com nível rudimentar de socialidade constituem um excelente modelo

para se testar as previsões das teorias da evolução da socialidade devido ao sistema de

regulação social que envolve uma ou poucas fêmeas no monopólio reprodutivo do ninho,

embora todas ou a maioria delas sejam totipotentes, razão pela qual as subordinadas podem

escolher entre ajudar ou reproduzir (Queller et al 2000).

A totipotência aumenta o potencial do conflito porque qualquer fêmea no ninho pode

substituir a dominante (Monnin et al 2002, Ratnieks et al 2006). Assim, os benefícios do

parentesco para as fêmeas devem ser semelhantes aos de se tornar uma rainha

morfologicamente especializada. Os conflitos reprodutivos devem ser então resolvidos de

forma a garantir o ganho genético a todas as fêmeas e contribuir para a estabilidade do

sistema social (Ratnieks & Reeve 1992, Buston 2003, Ratnieks et al 2006, Wong et al 2007).

A teoria da assimetria reprodutiva fornece uma explicação convincente de como e por que

os conflitos reprodutivos são resolvidos, sendo inclusive sugerida como uma teoria geral da

evolução social (Keller & Reeve 1994, Sherman et al 1995, Johnstone 2000, Seppä et al 2012).

Dois tipos básicos de modelos, conhecidos como modelos de concessão e cabo-de-

guerra ou ‘tug-of-war’, usualmente têm sido sugeridos para explicar a assimetria reprodutiva

em vespas, abelhas e formigas (Field et al 1998, Hogendoorn & Velthuis 1999, Reeve et al

2000, Field & Cant 2009, Lucas et al 2011, Shen et al 2011, Seppä et al 2012).


Figura 16. Filogenia dos gêneros de Hymenoptera eusocial (formigas, abelhas e vespas) sugerida a partir da análise da frequência de acasalamento. Os clados que exibem alta poliandria (> 2 acasalamentos) têm ramos sólidos vermelhos, enquanto os clados com baixa ou poliandria facultativa (>1, mas < 2 acasalamentos) têm ramos pontilhados vermelhos; ao passo que, os clados que exibem monoandria têm ramos sólidos pretos (Modificado de Hughes et al 2008).

Euglossa


Os modelos de concessão pressupõem que os grupos contêm uma única fêmea

dominante que tem controle completo sobre a reprodução (Vehrencamp 1983, Reeve &

Ratnieks 1993). Esta fêmea tem a opção de conceder parte da reprodução a outra fêmea em

troca da sua cooperação. A concessão pode representar um incentivo para a permanência da

subordinada, ou uma estratégia da dominante para evitar interações agressivas fatais. A

subordinada pode então decidir entre aceitar a oferta da dominante e permanecer no grupo ou

sair e fundar seu próprio ninho. Este processo de decisão sequencial do modelo de concessão

tem sido largamente reconhecido e foi claramente descrito como mecanismo para resolução

de conflitos dentro da teoria dos jogos em biologia reprodutiva (Maynard Smith 1982, Reeve

& Shen 2013).

Este modelo prevê um aumento da assimetria reprodutiva com aumento do parentesco

(r) entre dominante e subordinada e um aumento da produtividade social em relação à

produtividade solitária das subordinadas que ficam para ajudar. A subordinada garante maior

aptidão inclusiva em associações do que na produção solitária ou independente. Isso porque

os maiores benefícios da aptidão de cooperação ocorrem com o aumento de parentesco e da

produtividade, portanto, requer a reprodução indireta. No entanto, quando as chances de

sucesso da reprodução solitária das subordinadas são elevadas, a dominante tem que conceder

uma fração maior da reprodução para a subordinada ficar.

Os modelos de cabo-de-guerra prevêem que dominantes e subordinadas têm controle

limitado sobre a reprodução e devem alocar mais esforços para aumentar as suas próprias

cotas e contribuir para produção total do grupo. A principal previsão do modelo é que a

assimetria reprodutiva está negativamente correlacionada com o parentesco, porque a

competição pela reprodução ocorre ao custo da produtividade total do grupo (Reeve & Shen

2013).


Os modelos de concessão e cabo-de-guerra fazem diferentes previsões sobre a relação

entre a assimetria reprodutiva e outras variáveis, que incluem o parentesco, a capacidade

competitiva das fêmeas envolvendo agressão e policiamento do ovo, a produtividade e os

benefícios do grupo social contra o sucesso da nidificação solitária (Tabela 10) (Field et al

1998, Reeve & Shen 2013).

Tabela 10. Associação prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva

Associação entre as variáveis Modelo de Concessão Modelo de Cabo-de-guerra

Assimetria reprodutiva vs parentesco (r) entre fêmeas adultas + Nenhum ou -

Assimetria reprodutiva vs agressão + Nenhum ou -

Assimetria reprodutiva vs policiamento do ovo + Nenhum ou -

Assimetria reprodutiva vs o sucesso da nidificação solitária (Subordinada) - Nenhum

Assimetria reprodutiva vs os benefícios da nidificação em grupo + Nenhum Parentesco vs produtividade total do grupo Nenhum +

+ = correlação positiva; - = correlação negativa; vs = versus Fonte: Field et al 1998, Reeve & Shen 2013

3.1.2 Análises do parentesco genético por locos microssatélites

Metodologias moleculares permitem mensurar a similaridade genética entre indivíduos

e, com isso, inferir relações de parentesco (Yagi & Hasegawa 2012). Os microssatélites foram

introduzidos em analises de parentesco por Queller (1992) e são considerados ideais para esse

tipo de análise devido ao seu alto grau de polimorfismo, o que resulta em uma grande

quantidade de alelos por loco, diminuindo as chances de dois indivíduos não relacionados

compartilharem esses alelos (Webster & Reichart 2005). Além disso, por serem marcadores

codominantes, permitem a distinção entre indivíduos homozigotos e heterozigotos e,

consequentemente, comparações diretas entre genótipos. As estimativas de parentesco são

influenciadas pela heterozigosidade, pelo número de microssatélites utilizados, pela

frequência alélica e pelas relações de parentesco a serem analisadas (Wang 2002).


Estimar relações de parentesco é de fundamental importância para inúmeros tipos de

estudos, como comportamento de dispersão (Radespiel et al 2008), sistema de acasalamento

(Paxton et al 2009, Zimmerman et al 2009), papel do parentesco na estrutura social (Langer et

al 2004, Bolton et al 2006, Field & Cant 2009), bem como no sucesso reprodutivo de cada

indivíduo (Hughes 1998, Lucas et al 2011).

Através do sequenciamento e clonagem de trechos do DNA, Souza et al (2007)

desenvolveram primers microssatélites para abelhas Euglossini. Destes marcadores, treze

foram desenhados especificamente para Eulaema nigrita e outros treze para Euglossa

cordata.

Paxton et al (2009) desenvolveram “primers” microssatélites (nove loci microssatélites

polimórficos) desenhados para Euglossa annectans. “Os primers” de E. annectans e Eg.

cordata (Souza et al 2007) foram polimórficos para Eg. imperialis, Eg. viridissima, Eg.

hemichlora e Eg. “2dentada”. Nas três últimas espécies, os loci microssatélites foram

utilizados em estudos sobre estrutura genética intracolonial (Paxton et al 2009, Zimmermann

et al 2009). Os resultados desse estudo mostraram que os ninhos dessas espécies foram

fundados por fêmeas acasaladas com um único macho (Zimmermann et al 2009).

López-Uribe et al (2011) descreveram e caracterizaram oito loci microssatélites

polimórficos para Eulaema meriana. Nos testes de amplificação em outras espécies do

gênero, sete dos oito loci amplificaram em El. cingulata, El. bombiformis, El. chocoana, El.

luteola, El. mocsaryi, El. nigrifacies e El. nigrita.

Em investigações sobre a frequência de diploidia nos machos das abelhas euglossine,

Souza et al (2010) genotiparam indivíduos de 26 espécies de Euglossini usando loci de

microssatélites polimórficos desenvolvidos para Euglossa cordata, Eulaema nigrita (Souza

et al 2007), e Eg. annectans (Paxton et al 2009). As análises mostraram que a frequência de

machos diploide é baixa em populações neotropicais.


Tais resultados demonstram a viabilidade em se utilizar primers heteroespecíficos em

estudos de parentesco, estrutura genética populacional e na inferência de ploidia em várias espécies

de Euglossini. Assim, primers desenhados para Euglossa cordata e Eg. annectans (Souza et al

2007, Paxton et al 2009) podem ser utilizados para as análises parentais em Eg. melanotricha.

Marcadores microssatélites tem sido empregados para testar as predições dos modelos

da assimetria reprodutiva ou ‘reproductive skew’ em espécies de vespas das subfamílias

Polistinae (Polistes bellicosus, Field et al 1998; P. fuscatus , Reeve et al 2000; P. carolina.

Seppä et al 2002; P. aurifer , Liebert et al 2005a); P. dominulus, Liebert & Starks 2006),

Stenogastrinae (Liostenogaster flavolineata, Sumner et al 2002; Parischnogaster mellyi,

Fanelli et al 2005 e P. alternata, Bolton et al 2006) e da família Cabronidae (Microstigmus

nigrophthalmus, Lucas et al 2011); e de abelhas das tribos Allodapine (Exoneura nigrescens,

Langer et al 2004, 2006) e Halictidini (Lasioglossum malachurum, Paxton et al 2002), além

dos estudos com formigas da família Fomicidae (Leptothorax rugatulus, Rüppell et al 2002 e

Formica fusca, Hannonen & Sundström 2003).

Os estudos têm tipicamente testado a relação entre assimetria e parentesco genético

entre dominante e subordinada, a relação entre tamanho corporal das fêmeas e a contribuição

de cada uma na produtividade total do grupo.

A estrutura genética de um grupo social e, portanto, o grau de heterogeneidade dentro

dela, depende de fatores tais como, os mecanismos de determinação do sexo (por exemplo,

haplodiploidia), a frequência de acasalamento de cada fêmea, o número de fêmeas

reprodutivas e seu parentesco, e a relativa contribuição de cada fêmea para produção da prole

(reproductive skew) (Ratnieks & Reeve 1992).

Em insetos primitivamente sociais a assimetria reprodutiva pode ser comparada aos

modelos previstos em vertebrados devido as semelhanças em relação a totipotência das

fêmeas, ao tamanho dos grupos, normalmente pequenos, e ao sistema monogâmico

(monogínico/monoândrico) (Field & Foster 1999, Langer et al 2004, Field & Cant 2009).


O comportamento social de Euglossa melanotricha fornece um excelente modelo de

estudo para se testar os modelos de assimetria reprodutiva. Em primeiro lugar, porque a

fundação de ninho é solitária, com famílias formadas por fêmeas que nidificam de forma

independente nas fundações e famílias formadas por associações de fêmeas nas reutilizações

de ninhos, o que permite a comparação entre produtividade social e solitária. Segundo, a

espécie é primitivamente social e não há castas morfológicas (Andrade-Silva & Nascimento

2012), o que significa que todas as fêmeas são potencialmente capazes de reproduzir, evitando

assim o problema de ter que distinguir entre a assimetria para a prole reprodutiva e não

reprodutiva (Reeve & Ratnieks 1993). Terceiro, uma elevada proporção de famílias (cerca de

80%, Andrade-Silva & Nascimento 2012) contém pelo menos duas fêmeas reprodutivas,

sendo o tipo de modelo onde testes de assimetrias reprodutivas com outros táxons têm sido

desenvolvidos. Finalmente, devido às contínuas reutilizações dos ninhos por sucessivas

gerações e a comutação de fêmeas entre os ninhos, o parentesco (r) entre famílias é variável.

Além desses aspectos, estudos com as espécies Euglossa hemichlora, Euglossa

viridissima e Euglossa“2dentada” mostraram que os ninhos foram fundados por uma fêmea

fecundada por um único macho (Zimmermann et al 2009). Assim, se essa condição for

encontrada também nas famílias de Euglossa melanotricha, o parentesco e todos os conflitos

envolvidos na variação deste podem estar correlacionados com o sistema de acasalamento

monoândrico e monogínico.

Até o momento, são poucas as pesquisas empíricas sobre os conflitos envolvidos na

assimetria reprodutiva ou “reproductive skew” em abelhas primitivamente sociais (Paxton et

al 2002, Langer et al 2004) e não há estudos desta natureza em abelhas euglossine.

Neste estudo, foram investigados se os mecanismos que regulam a estrutura social nas

famílias de Euglossa melanotricha são influenciados pelo parentesco. Para a investigação

desses mecanismos, o parentesco genético entre as fêmeas adultas nas famílias de Euglossa


melanotricha foi determinado; e variáveis preditas pelos modelos de assimetria que envolve

frequências de atos agressivos, canibalismo do ovo e a produtividade total foram

correlacionadas com o parentesco (r). A previsão do estudo é que famílias pequenas fundadas

por uma única fêmea que tenha acasalado apenas uma vez (monoginia/monoandria), mas que

são mantidas por sucessivas gerações pela associação entre fêmeas totipotentes, apresentem

um sistema social regulado por interações de dominância e subordinação em que o parentesco

é um dos mecanismos para resolução dos conflitos sobre a reprodução.

3.2 Objetivos

O objetivo principal deste estudo foi testar as predições de interesse genético

analisando se as relações de parentesco entre os indivíduos das famílias de Euglossa

melanotricha são determinantes para organização social da espécie. Uma das formas de testar

estas predições constitui um dos objetivos específicos deste estudo que foi testar se há

correlação entre a variação de parentesco (r) e a partilha da reprodução entre fêmeas

associadas.

As questões específicas que nortearam este estudo foram:

1. Qual o parentesco genético intracolonial?

2. Conflitos sobre a reprodução mediados pelas interações de dominância são

influenciados pelo parentesco entre as fêmeas?

3. Conflitos sobre a partilha na reprodução e na produção de machos têm relação com

o parentesco?

4. Como os conflitos são resolvidos?


3.3 Materiais e Métodos

3.3.1 Coleta de material

Neste estudo, 42 famílias genéticas de Euglossa melanotricha foram analisadas a

partir do monitoramento de 14 ninhos durante as fases de fundação (n = 12 famílias) e durante

os sucessivos processos de reutilização desses ninhos (n = 30 famílias). Foram designadas

como famílias genéticas as famílias formadas durante as fundações de ninhos (F = fêmea

fundadora e sua prole), e as famílias dos processos de reutilização de ninhos (FR = fêmeas

associadas no ninho natal ou fêmeas residentes e invasoras e sua prole).

Como já foi mencionado no capítulo 2 desta tese, um processo de reutilização de

ninho (R) é iniciado quando pelo menos duas fêmeas da mesma ou de diferentes gerações

reutilizam os ninhos, ou ainda, quando novas associações são formadas por fêmeas invasoras

e residentes. A partir dos dados comportamentais e testes experimentais previamente

realizados no capítulo 2 desta tese, foram analisados o parentesco genético das famílias das

fêmeas fundadoras (n = 12 famílias) e dos pares de fêmeas em cada processo de reutilização

de ninhos (n= 30 famílias). Em cada família, os pares de fêmeas adultas foram coletados após

o período de nidificação - fase de inatividade dessas fêmeas nos ninhos (ver descrição em

Materiais e Métodos no capítulo 2 desta tese) e a prole dessas fêmeas (machos e fêmeas)

foram coletadas ao emergir. Em casos raros, amostras de imaturos foram analisadas quando

imagos não completaram o desenvolvimento até a fase adulta.

O tamanho amostral de cada família variou entre 6 e 15 indivíduos, incluindo machos

e fêmeas recém emergidos, imaturos e fêmeas adultas. Ao todo foram coletados 425

indivíduos, 159 machos e 266 fêmeas (Tabela 11).

As pernas medianas das fêmeas fundadoras, dominantes e subordinadas (invasoras e

residentes) que foram submetidas ao banho em hexano para análise do perfil químico foram

submetidas a três repetidas lavagens em álcool absoluto para remoção do hexano. As pernas


medianas do lado direito dessas fêmeas e de toda a prole coletada, incluindo machos e fêmeas

recém-emergidos, foram estocadas em frascos com álcool absoluto e mantidas no refrigerador

a 4ºC. O restante do material corporal foi armazenado em frascos com álcool absoluto nas

mesmas condições de temperatura.

3.3.2 Coleta de dados

Os dados comportamentais dos pares de fêmeas adultas coletados em cada família de

Euglossa melanotricha (n = 30 famílias de reativação em 14 ninhos), incluindo as frequências

das interações de dominância e canibalismo dos ovos (Tabela 2; Capítulo 2 desta tese), foram

correlacionados com as análises do parentesco genético entre essas fêmeas. As frequências

das interações e canibalismo dos ovos foram somadas, e as proporções calculadas para cada

par de fêmeas.

3.3.3 Extração do DNA e análise por microssatélite

As análises genéticas foram realizadas no Laboratório de Genética e Evolução de

Himenópteros (LGEH), Departamento de Genética e Evolução (DGE - UFSCar), sob a

supervisão do Prof. Dr. Marco Antônio Del Lama.

O DNA total foi extraído a partir da maceração das pernas do lado direito dos

indivíduos de Euglossa melanotricha sob nitrogênio líquido. O material foi então

acondicionado em tubos eppendorf, e em seguida, 400 µL de Chelex 10% foi adicionado em

cada tubo. A mistura foi incubada por 30 minutos a 56o C, vortexada por dez segundos,

fervida por cinco minutos e novamente vortexada, de acordo com o protocolo de Walsh et al

(1991). Os tubos foram centrifugados por três minutos a 14000 rpm. A fração sobrenadante

foi retirada para a utilização na reação de PCR e transferida para tubos autoclavados. Os tubos

com o material foram então estocados em freezer, para armazenamento.


Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações (F) e reativações de ninhos (FR) de Euglossa melanotricha.

Indivíduos

Recém-emergidos e imaturos Ninhos Famílias

Machos Fêmeas Fêmeas adultas

Total

N1F 3 4 1 8

N2F 3 5 1 9

N3F 4 5 1 10

N4F 2 4 1 7

N5F 5 6 1 12

N6F 3 4 1 8

N7F 4 6 1 11 N8F 4 5 1 10 N9F 3 5 1 9

N10F 4 5 1 10

N11F 3 3 1 7

Fundações

N12F 2 3 1 6

N1FR1 5 7 2 14

N1FR2 4 3 2 9

N2FR1 4 5 2 11

N2FR2 4 4 2 10

N2FR3 4 3 2 9

N3FR1 3 4 2 9

N4FR1 4 5 2 11

N5FR1 5 3 2 10

N6FR1 3 2 2 7

N6FR2 4 4 2 10

N6FR3 3 3 2 8

N6FR4 5 6 2 13

N7FR1 4 3 2 9

N7FR2 3 4 2 9

N7FR3 5 7 2 14

N8FR1 3 5 2 10

N8FR2 3 4 2 9

N9FR1 3 5 2 10

N9FR2 4 4 2 10

N10FR1 5 8 2 15

N10FR2 4 8 2 14

Reutilizações

N10FR3 6 6 2 14 Continuação...


Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações (F) e reativações de ninhos (FR) de Euglossa melanotricha.

Indivíduos

Recém-emergidos e imaturos Fêmeas adultas Ninhos

Machos Fêmeas Total

N10FR4 4 5 2 11

N11FR2 4 4 2 10

N11FR3 5 4 2 11

N12FR2 3 4 2 9

N12FR3 4 4 2 10

N13FR2 4 5 2 11

Reativações

N14FR2 3 4 2 9

N14FR3 4 6 2 12

Total Geral 159 194 72 425

Foram utilizados 11 primers para amplificação de locos microssatélites (Tabela 12):

sete originalmente descritos para Euglossa cordata (Egc 17, Egc 18, Egc 24, Egc 26, Egc 35,

Egc 37, Egc 51; Souza et al 2007), e quatro desenhados para Euglossa annectans (Ann 03,

Ann 04, Ann 24 e Ann 37; Paxton et al 2009). As reações de PCR foram realizadas com

125µM de cada dNTP, 1,75mM de MgCl2, 1µL de tampão Invitrogen 10X, 1U de Platinum

Taq DNA polimerase (Invitrogen), 0,53µM de cada primer, 1µL de DNA extraído e água para

completar 10µL. A amplificação ocorreu em termociclador Applied Veriti (Applied

Biosystems) envolvendo os seguintes passos: um passo inicial de desnaturação a 94°C por

três minutos, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94°C (desnaturação), 20 segundos na

temperatura de hibridização específica para cada loco por Souza et al (2007) e Paxton et al

(2009) (Tabela 12), e um minuto a 72°C (extensão). A reação foi finalizada com um passo de

extensão a 70°C por 30 minutos. Após as amplificações, os produtos da PCR foram diluídos

25 vezes. Em seguida, 2 µL da diluição foram adicionados à mistura de 7,75 µL de Tween

0,1% e 0,25 µL da diluição padrão de tamanho ET 550-R MegaBace.


A genotipagem foi feita através de corridas em sequenciador automático MegaBace-1000

(GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). O tamanho dos alelos foi obtido pela leitura

dos picos de genotipagem no programa MegaBace Fragment Profiler versao 1.2 (GE Healthcare),

os quais foram comparados com os picos exibidos pelo marcador de tamanho ET550-R.

Tabela 12. Microssatélites utilizados, sequências e temperaturas de hidridação (TH) dos primers e suas referências. F: forward; R: reverse.

Microssatélite Sequência do primer (5' → 3') TH (°C) Referência

F: AGAGGAGGGTCCAGGAAAGA Egc 17

R: ACCAGGCGTTCTCATCAAGT 54

Souza et al 2007

F: TGATACAGGTCGGCGTAAAA Egc 18

R: GGTAACTCCGTCGCGAACTA 58

Souza et al 2007

F: AGGAGAACCGAACAGCGATA Egc 24

R: CCGAGCTTTTTCTTCCCTCT 56

Souza et al 2007

F: GCCGAACAAACATCTCGTCT Egc 26

R: CGGAACTTTGATATCGTCGAG 56

Souza et al 2007

F: GATCACGAAACGGTGTAAAGTC Egc 35

R: CTTTCTTCGGATTCGGACTG 54

Souza et al 2007

F: ATCCTCCTCTTCGTGGTCCT Egc 37

R: GGCAAAACTTCCGCTTGATA 56

Souza et al 2007

F: GGAATGGGATTCATTCAGCA Egc 51

R: CGAAAGGTCGACAAACCAAT 54

Souza et al 2007

F: GATCAGGAATCCCCAAAACG Ann03

R: CATAATCGTGCAACGTTCCTT 60

Paxton et al 2009

F: CGCGCCCATTCTATTTACAG Ann04

R: GCGCTATCTCCGAATCATTG 54

Paxton et al 2009

F: GTCGGACATTAGGGTGATGG Ann24

R: TCCGTTTGAATCTGTGGTCTC 56

Paxton et al 2009

F: CGTTCGAAGGAGAGAACGAC Ann37

R: CGGGATACAGGAAAGGAGAG 56

Paxton et al 2009


Como forma de aumentar a confiabilidade da genotipagem, 30% das amostras foram

‘retipadas’, especialmente amostras de fêmeas invasoras, onde dúvidas na genotipagem

podiam dificultar a determinação do parentesco. Essa cautela metodológica, associada a

amplificação bem sucedida dos machos amostrados e a ausência de machos diplóides tornou

desnecessária a utilização de métodos de correção e detecção de alelos nulos usualmente

empregados em análises com microssatélites.

3.3.4 Análise dos dados microssatélites

Para testar se ocorreram desequilíbrios de ligação entre pares de loci analisados nas

famílias de Euglossa melanotricha, foi utilizado o programa Genepop (Raymond & Rousset

1995) (http://genepop.curtin.edu.au/), usando somente os dados dos machos haplóides uma

vez que o programa não permite uma análise conjunta de dados haplóides e diplóides. Para

este teste, foi aplicado ao valor crítico P, a correção de Benjamini & Yekutieli (2001).

Segundo Narum (2006), este teste pondera melhor os erros do tipo I (rejeitar a hipótese nula

sendo ela verdadeira - aceitar uma diferença que não existe) e do tipo II (não rejeitar a

hipótese nula sendo ela falsa - não reconhecer uma diferença quando ela existe); quando

comparado com a correção de Bonferroni, cujo valor crítico se aproxima rapidamente de zero,

aumentando a probabilidade de cometer um erro do tipo II.

A análise da diversidade alélica foi feita por loco através de um pacote padrão de

análises descritivas usando o programa ‘Microsatellite Analyzer (MSA) 4.05’ (Dieringer &

Schlotterer 2003). Este programa fornece a opção da análise conjunta de dados haplóides e

diplóides. Todos os machos foram incluídos na análise, e para evitar pseudoreplicação, uma

fêmea de cada família, ou seja, fêmeas teoricamente não relacionadas foram inseridas, exceto

nas famílias com mais de uma fêmea não relacionada, especialmente nos casos de invasões,

onde pelo menos duas fêmeas de cada família foram incluídas.


3.3.5 Estimativa da frequência de acasalamento

Inicialmente, um teste de atribuição das fêmeas reprodutivas como mães da sua prole

foi feito através da inspeção visual da segregação mendeliana dos genótipos nas famílias de

fundações (n= 12); todas as filhas atribuídas a uma mãe tinham que carregar um único alelo

materno em cada loco, e todos os filhos um dos dois alelos da mãe em cada loco. Sob

monoandria, toda a prole de fêmeas de uma mesma mãe deve ter o mesmo alelo paterno em

cada loco. A atribuição a partir da inspeção visual foi facilitada pelo sistema haplodiplóide de

determinação sexual, dado que a partir do alelo comum as filhas ou “irmãs completas” foi

possível determinar o alelo do pai.

Para dar suporte a determinação do pedigree baseado na inspeção visual dos genótipos

foi utilizado o programa Kinship 1.3.1 (Goodnight & Queller 1999), (http://www.gsoftnet.

usp/GSoft.html#Kinanchor). Genótipos das fêmeas de cada família foram analisados

separadamente em um grupo. Inicialmente, foi feito um teste de atribuição para determinação

da maternidade a uma ou mais fêmeas adultas presentes na família no momento da

amostragem. Especificamente, foi testado se o genótipo de cada fêmea permitia a rejeição da

hipótese nula (nenhuma relação com a prole de fêmeas; r = 0) em favor da hipótese

alternativa da relação mãe-filha (r = 0,5).

Na etapa seguinte, foi testado se o genótipo da prole de fêmeas permitia rejeitar a

hipótese nula de que eram meio-irmãs (r = 0,25, como esperado para mais de um

acasalamento da mãe) em favor da hipótese alternativa de que elas eram irmãs completas (r =

0,75, como esperado para um único acasalamento). As comparações foram feitas aos pares

com 1.000 simulações entre elas. Com a função de parentesco do Kinship 1.3.1 foi feito o

cálculo de parentesco (r) entre todas as fêmeas para gerar o valor médio de parentesco entre

uma mãe e sua prole de fêmeas e entre toda a prole de fêmeas.


3.3.6 Análise do parentesco (r)

O parentesco entre os pares de fêmeas associadas de Euglossa melanotricha foi

estimado a partir dos dados genotípicos usando o programa Relatedness 5.0.8 (Goodnight &

Queller 1989). As famílias foram ponderadas igualmente e os desvios padrão do parentesco

foram estimados pelo método Jackknifing sobre loci (para o parentesco dentro das famílias).

3.3.7 Razão sexual

A razão sexual da prole foi calculada pela divisão do número de fêmeas pelo total de

indivíduos (machos + fêmeas) (Silveira Neto et al 1976). Para verificar a existência de

conflitos potenciais, a razão sexual foi determinada pela proporção de machos que emergiram

dos ovos das subordinadas e das dominantes.

3.3.8 Medida da assimetria reprodutiva

O grau de assimetria reprodutiva foi calculado com base no índice B de Nonacs (2000)

usando o programa ‘Skew Calculator 2003’ (Nonacs 2003). Este índice corrige variações em

grupos de diferentes tamanhos e ajusta o intervalo de tempo das interações, de modo que a

assimetria não é influenciada pela ausência da reprodução em caso de morte ou

desaparecimento de um indivíduo. Este índice indica valor zero para distribuição randômica

da reprodução, enquanto valores positivos indicam alta assimetria reprodutiva e valores

negativos baixa assimetria com relação ao que se espera ao acaso (Nonacs 2000). A avaliação

da assimetria reprodutiva foi sobre a produção total da prole devido ao pequeno tamanho das

famílias de Euglossa melanotricha (Tabela 4).


3.3.9 Análise das variáveis preditas pelos modelos de assimetria reprodutiva

As predições dos modelos de assimetria reprodutiva foram testadas nas famílias de

Euglossa melanotricha a partir da análise das seguintes variáveis associadas com assimetria:

parentesco, frequência de canibalismo dos ovos, interações agressivas ou de dominância e

produção total do grupo (Tabela 10).

3.3.10 Análise estatística

Nas análises de parentesco foram utilizados os testes de Correlação de Spearman para

determinação do grau de associação entre duas variáveis. O nível de significância considerado

foi de 5% e as análises foram feitas no programa Statistica 6.0. Para alguns dados, os valores

das médias ± desvio padrão foram apresentados.

3.4 Resultados

3.4.1 Análise dos dados de microssatélites

Para análise da variação alélica dos loci, toda a prole de machos das famílias de

Euglossa melanotricha (n = 159) foi genotipada. Esses dados foram agrupados com os

genótipos de um conjunto de fêmeas não relacionadas. Tal conjunto foi formado por uma

fêmea de cada família de fundações (n=12 fêmeas) e de reativações sem invasões (n=18

fêmeas); e por duas fêmeas de cada família das reativações com invasões (n = 24 fêmeas),

totalizando 54 fêmeas genotipadas para esta análise (Tabela 13).


Os 11 loci microssatélites demonstraram alta variabilidade, como indicado pelo grande

número de alelos únicos por loco e pela elevada heterozigosidade esperada (He) (Tabela 13).

Como resultado da alta variabilidade dos marcadores usados, a probabilidade de erro na

genotipagem ou erro de detecção (dp) foi muito baixa. Além disso, os loci não estavam em

desequilíbrio de ligação (p > 0,01 para todas as 54 comparações entre pares ou ‘pairwise’,

aplicando a correção de Benjamini & Yekutieli, 2001), e não exibiram desvio significativo de

equilíbrio de Hardy-Weinberg (p > 0,05).

3.4.2 Frequência de acasalamento

Em cada uma das famílias de fundações analisadas (n = 12), uma única fêmea adulta

fecundada por um único macho foi claramente identificada como mãe de toda a prole, tanto

pela inspeção visual quanto pela análise do parentesco (r) (Anexos de I a XXII; Tabela 14).

Nas famílias de reativações (n = 30) a frequência de acasalamento foi estimada pelo

parentesco entre os pares de fêmeas adultas (Tabela 14). A análise não foi feita a partir do

parentesco de cada fêmea adulta com sua prole porque em 12 famílias de reativações (40%, n

= 30), uma das fêmeas produziu somente machos dificultando a análise do parentesco a partir

da comparação dos genótipos entre irmãs completas.


Tabela 13. Diversidade alélica para as famílias de Euglossa melanotricha, com o número de machos e fêmeas genotipados por loco.

Nº de indivíduos genotipados Loci Machos Fêmeas

Heterozigosidade esperada (He)

Tamanho médio dos alelos (pb)

Alelos observados

Variação da frequência alélica

Egc 17 158 54 0,848 223 9 0,258 - 0,003

Egc 18 156 54 0,885 183 11 0,212 - 0,011

Egc 24 156 54 0,890 203 10 0,134 - 0,003

Egc 26 157 54 0,926 172 17 0,140 - 0,022

Egc 35 154 54 0,868 164 9 0,212 - 0,003

Egc 37 153 54 0,898 196 14 0,167 - 0,003

Egc 51 151 54 0,806 226 7 0,282 - 0,056

Ann03 155 54 0,872 175 12 0,180 - 0,008

Ann04 157 54 0,859 121 11 0,210 - 0,016

Ann24b 156 54 0,896 174 11 0,148 - 0,027

Ann37b 155 54 0,900 171 12 0,129 - 0,005

Nas famílias de reativações, com exceção dos casos em que ocorrem invasões

(N9/FR2, N10/FR1, N10/FR2, N10/FR3, N10/FR4, N11/FR2, N11/FR3, N12/FR2, N12/FR3, N13/FR2,

N14/FR2, N14/FR3), todas as fêmeas adultas de uma mesma família tinham genótipos

consistentes com parentesco mãe-filha (r = 0,5) e irmãs-completas (r = 0,75), confirmando a

hipótese de monoandria (Tabela 15). Adicionalmente, a partir da análise mendeliana foi

possível atribuir em 19 famílias (63%, n = 30), o genótipo dos pais a partir da comparação dos

genótipos de irmãs completas produzidas por cada fêmea adulta (Ver Anexos I-XLII).


Tabela 14. Parentesco entre as fêmeas de Euglossa melanotricha nas relações entre mãe e filhas e entre irmãs completas nas famílias de fundações (n = 12 ninhos)

Parentesco genético entre mãe e filhas Parentesco genético entre irmãs completas

Prole de machos Prole de

fêmeas Nível de significância

Média de r ± DP

Comparações 'pairwise' entre filhas

Nível de significância

Média de r ± DP

NF1 4 P < 0,001 0,52 ± 0,04 6 P < 0,001 0,76 (± 0,11) 3

NF2 5 P < 0,001 0,50 ± 0,00 10 P < 0,001 0,70 (± 0,10) 3

NF3 5 P < 0,001 0,54 ± 0,03 10 P < 0,001 0,77 (± 0,08) 4

NF4 4 P < 0,001 0,49 ± 0,01 6 P < 0,001 0,75 (± 0,09) 2

NF5 6 P < 0,001 0,50 ± 0,00 15 P < 0,001 0,74 (± 0,04) 5

NF6 4 P < 0,001 0,54 ± 0,04 6 P < 0,001 0,73 (± 0,11) 3

NF7 6 P < 0,001 0, 50± 0,00 15 P < 0,001 0,75 (± 0,08) 4

NF8 5 P < 0,001 0,50 ± 0,00 10 P < 0,001 0,73 (± 0,09) 4

NF9 5 P < 0,001 0,51 ± 0,02 10 P < 0,001 0,75 (± 0,11) 3

NF10 5 P < 0,001 0,53 ± 0,02 10 P < 0,001 0,84 (± 0,12) 4

NF11 3 P < 0,001 0,45 ± 0,04 3 P < 0,001 0,77 (± 0,09) 3

NF12 3 P < 0,001 0,55 ± 0,04 3 P < 0,001 0,87 (± 0,08) 2

Famílias com uma fêmea reprodutiva - hipótese nula: a prole de fêmeas não tem parentesco com a fêmea reprodutiva (r = 0) versus a hipótese alternativa de que a prole de fêmeas é filha desta fêmea (r = 0,5). Monoandria - hipótese nula: as fêmeas descendentes são meio-irmãs (r = 0,25) versus a hipótese alternativa de serem irmãs completas (r = 0,75). A média de parentesco (r) foi calculada de acordo com Queller & Goodnight (1989); e o erro padrão (SE) de r foi obtido por jakknifing; o número da prole de machos foi dado também.

3.4.3 Proporção sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas nas famílias de

Euglossa melanotricha

As famílias de Euglossa melanotricha foram agrupadas de acordo com o parentesco,

sendo os grupos formados pelos pares de fêmeas adultas e sua prole (Tabela 16).

A proporção da prole atribuída as dominantes nas famílias do grupo 1 (irmãs), foi de

34 fêmeas para 25 machos (78%, n = 70 indivíduos), ou 1,36: 1 numa razão de 0,44 machos,

o que não diferiu de 1:1 (�2(1) = 0,02, p > 0,05). E a proporção da prole que emergiu dos ovos

das subordinadas foi de 2 fêmeas para 9 machos (22%, n = 70 indivíduos), ou 0,22: 1, numa

razão de 0,78 machos, o que diferiu de 1:1 (�2 (1)= 0,21, p < 0,05; Tabela 16, Figura 18).


Tabela 15. Estimativas de parentesco (r) entre categorias de fêmeas adultas em cada família de reativação de Euglossa melanotricha (n = 30 famílias).

Fêmeas adultas Comparações Média de r Prole de

fêmeas Prole de machos

N1FR1 2 Irmãs 0,81 6 5

N1FR2 2 Irmãs 0,72 3 3

N2FR1 2 Irmãs 0,81 5 3

N2FR2 2 Irmãs 0,79 4 4

N2FR3 2 Irmãs 0,91 3 4

N3FR1 2 Irmãs 0,81 4 3

N4FR1 2 Irmãs 0,86 5 4

N5FR1 2 Mãe-filha 0,54 3 5

N6FR1 2 Irmãs 0,74 2 3


N6FR3 2 Irmãs 0,72 3 3








N9FR2 2 Residente-invasora -0,12 4 4












Com exceção das famílias com invasões, todas as fêmeas em uma família tiveram genótipos consistentes com o parentesco mãe-filha ou irmãs-completas. Os genótipos da prole de fêmeas e machos foram usados para gerar o sumário do parentesco par a par por família. Contudo, somente o resultado entre os pares de fêmeas reprodutivas foi considerado nesta análise.


Nas famílias do grupo 2 (mãe e filha), a proporção da prole para dominantes foi de 36

fêmeas para 19 machos (72%, n = 76 indivíduos), ou 1,89: 1 numa razão de 0,65 para fêmeas,

o que diferiu de 1:1 (�2(1) = 0,85, p < 0,05), enquanto para as subordinadas a proporção foi de

5 fêmeas para 16 machos (28%, n = 76 indivíduos), ou 0,31: 1, numa razão de 0,72 machos, o

que também diferiu de 1:1 (�2 (1)= 0,38, p < 0,05; Tabela 16, Figura 18).

Nas famílias do grupo 3 (fêmeas não aparentadas), a proporção da prole atribuída as

invasoras dominantes foi de 32 fêmeas para 23 machos (53%, n = 112 indivíduos), ou 1,39: 1

numa razão de 0,42 machos, o que não diferiu de 1:1 (χ2(1) = 0,71, p >0,05). Enquanto a

proporção da prole atribuída as dominantes residentes foi de 30 fêmeas para 27 machos (47%,

n = 112 indivíduos), ou 1,11: 1, numa razão de 0,53 machos, não diferindo também de 1:1 (χ2

(1)= 0,87, p > 0,05; Tabela 16, Figura 18).

O resultado da análise da proporção de machos produzidos pelas subordinadas nos

diferentes grupos parentais mostrou correlação positiva entre a razão para produção de

machos e o parentesco (r) das fêmeas adultas (Spearman: r = 0, 417, p = 0, 021; Figura 17). A

razão sexo assimétrica para machos atribuídos as fêmeas subordinadas aumenta com o

parentesco entre as fêmeas adultas (Figura 18).

Adicionalmente, quando a análise foi feita por família considerando a produção total

das fêmeas adultas (dominantes e subordinadas), a proporção sexual não diferiu de 1:1. Nas

famílias do grupo 1 (irmãs), a proporção foi de 34 machos para 36 fêmeas, numa razão de

0,51 fêmeas, ou 1:1 (χ2(1) = 0,13, p > 0,05); nas famílias do grupo 2 (mãe-filha), a proporção

foi de 34 machos para 42 fêmeas, numa razão de 0,55 fêmeas, também não diferindo de 1:1

(χ2(1) = 0,02 p > 0,05); e da mesma maneira, nas famílias do grupo 3 (não aparentadas) a

proporção foi de 50 machos para 62 fêmeas, numa razão de 0,55 fêmeas, não diferindo de 1:1

(χ2(1) = 0,23, p > 0,05).


3.4.4 Assimetria reprodutiva

O nível de assimetria reprodutiva nas famílias de reativações de ninhos foi altamente

variável. Os valores medidos pelo índice de assimetria B (Nonacs 2003) variaram entre –

0,062 e 0,400 (média = 0,051, p = 0,002, n = 30; Anexo XLIII). A assimetria reprodutiva

diferiu significativamente entre os grupos de fêmeas aparentadas (irmãs e mãe-filha) e não

aparentadas (residente-invasora). No grupo entre irmãs a assimetria média de B ± erro padrão

foi de 0,15 ± 0,02 e no grupo mãe-filha foi 0,07 ± 0,03, enquanto em residente-invasora foi de

0,04 ± 0,02 (irmãs vs residente-invasora, teste t = 8,27, p < 0,001; mãe-filha vs residente-

invasora, teste t = 3,19, p < 0,001).

3.4.5 Análise combinada:

3.4.5.1 Assimetria reprodutiva versus parentesco, policiamento do ovo e agressão

A média de parentesco entre fêmeas adultas foi de r ± desvio padrão = 0,79 ± 0,02

para as famílias de irmãs; 0,54 ± 0,02 para famílias de mãe-filha; e de -0,10 ± 0,01 para as

famílias de residente-invasora; Tabela 15, Figura 18.

Em todas as famílias, a assimetria reprodutiva foi positivamente correlacionada com o

parentesco (r) (Spearman: r = 0,7193, p < 0,0001; Figura 19a). A correlação também foi positiva

quando foram relacionados os índices de assimetria reprodutiva (B) das fêmeas adultas pela

frequência de ovos policiados pelas fêmeas dominantes (Tabela 17) (Spearman: r = 0,8432, p <

0,0001; Figura 19b). Outra variável testada foi a proporção de interações agressivas exibida pelas

fêmeas dominantes. O número total de interações agressivas foi de 1424 (36%, n = 3965), com

uma média ± desvio padrão de 47,5 ± 13,04 interações por família (Tabela 2; Capítulo 2). O

resultado mostrou que a assimetria reprodutiva (B) foi positivamente correlacionada com a

frequência de interações agressivas (Spearman: 0,517, p = 0,0034; Figura 19c).


Tabela 16. Número total da prole e a proporção de machos produzidos por cada fêmea reprodutiva nas famílias de reutilização de ninhos de Euglossa melanotricha, agrupadas de acordo com o parentesco.

Grupo 1: Irmãs Dominante Subordinada

Ninhos/Família

Machos Fêmeas Proporção sexual (machos) Machos Fêmeas Proporção sexual

(machos)

N1FR1 4 6 0,40 1 1 0,50 N1FR2 3 2 0,60 1 1 0,50

N2FR1 3 5 0,38 1 0 1,00 N2FR2 3 4 0,43 1 0 1,00 N2FR3 3 3 0,50 1 0 1,00 N3FR1 2 4 0,33 1 0 1,00 N4FR1 2 5 0,29 2 0 1,00 N6FR1 3 2 0,60 0 0 0,00 N6FR3 2 3 0,40 1 0 1,00 Média 0,44 0,78 Grupo 2: Mãe e filha N5FR1 3 2 0,60 2 1 0,67 N6FR2 2 4 0,33 2 0 1,00 N6FR4 3 5 0,38 2 1 0,67 N7FR1 2 3 0,40 2 0 1,00 N7FR2 1 4 0,20 2 0 1,00 N7FR3 3 6 0,33 2 1 0,67 N8FR1 1 5 0,17 1 1 0,50 N8FR2 2 3 0,40 1 1 0,50 N9FR1 2 4 0,33 1 1 0,50 Média 0,35 0,72 Grupo 3: Fêmeas não aparentadas (residente e invasora) N9FR2 2 2 0,50 2 2 0,50 N10FR1 3 2 0,60 2 6 0,25 N10FR2 2 2 0,50 2 6 0,25 N10FR3 3 2 0,60 3 4 0,43 N10FR4 2 2 0,50 2 3 0,40 N11FR2 2 3 0,40 2 1 0,67 N11FR3 2 3 0,40 3 1 0,75 N12FR2 1 3 0,25 2 1 0,67 N12FR3 1 3 0,25 3 1 0,75 N13FR2 2 3 0,40 2 2 0,50 N14FR2 1 3 0,25 2 1 0,67 N14FR3 2 4 0,33 2 2 0,50 Média 0,42 0,53


-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Parentesco (r) entre fêmeas adultas

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Prop

orçã

o de

mac

hos p

rodu

zido

s pel

as su

bord

inad

as

Figura 17. Correlação entre a proporção de machos produzidos pelas fêmeas subordinadas e o parentesco (r) entre as fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30).

r = 0,79

Irmãs

58%

42%

r = 0,54

Mãe -filha

29%

71%

r = -0,10

Não relacionadas

78%

22%

Dominant Subordinate

72%

28%

Dominant Subordinate

19%

81%FêmeasMachos

66%

34%

Fêmeas

Machos

47%

53%

Dominant Invader

64%

36%

FêmeasMachos

53%47%


Dominante


Invasora

Figura 18. Esquema ilustrado da estrutura sócio-genética de Euglossa melanotricha, incluindo a média do parentesco entre os pares de fêmeas em cada família por grupo parental (irmãs, mãe e filha e fêmeas não relacionadas), a distribuição da reprodução a proporção sexual da prole dessas fêmeas.


3.4.5.2. Parentesco versus produtividade total

A variação no parentesco não afetou a produtividade total das famílias: fêmeas adultas

aparentadas (irmãs: 7,7 ± 0,68 indivíduos produzidos, n = 9 famílias, mãe-filha: 8,44 ± 0,60

indivíduos produzidos, n = 9; Tabela 16) não foram significativamente mais produtivas (irmãs

vs não aparentadas: teste t = - 1,73, p = 0,53; mãe-filha vs não aparentadas: teste t = -1,03, p =

0,27) do que duas fêmeas não aparentadas (residente-invasora: 9,33 ± 0,67 indivíduos

produzidos, n = 12). A produtividade total então não foi correlacionada com a assimetria

reprodutiva (r = - 0,22, p = 0,23) ou com o parentesco (Spearman r = - 0,28, p = 0,12, n = 30).


a)

b) c) Figura 19. a) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e o parentesco (r) das fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30). b) Correlação entre a assimetria reprodutiva (B) e a frequência de policiamento dos ovos feito pelas fêmeas dominantes. c) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e a frequência de interações agressivas realizadas pelas fêmeas dominantes. Cada símbolo representa uma família.

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Parentesco (r) entre as fêmeas adultas

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ass

imet

ria re

prod

utiv

a (B

)

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Frequência de policiamento dos ovos

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ass

imet

ria re

prod

utiv

a (B

)

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Proporção de intervenções agressivas

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ass

imet

ria re

prod

utiv

a (B

)

Não relacionadas Mãe-filha Irmãs


Tabela 17. Número de oviposições feitas pelas subordinadas e a frequência de ovos comidos pelas dominantes em cada família de Euglossa melanotricha agrupadas de acordo com o parentesco.

Grupo 1: Relação entre Irmãs

Oviposições feitas pelas subordinadas

Ovos comidos pelas dominantes Ninhos/Família

N N Frequência

N1FR1 12 10 0,83 N1FR2 7 5 0,71 N2FR1 9 8 0,89 N2FR2 8 7 0,88 N2FR3 7 6 0,86 N3FR1 7 6 0,86 N4FR1 9 7 0,78 N6FR1 5 5 1,00 N6FR3 6 5 0,83 Média 7,8 6,6 0,85 Grupo 2: Relação entre Mãe e filha N5FR1 8 5 0,63 N6FR2 8 6 0,75 N6FR4 11 8 0,73 N7FR1 7 5 0,71 N7FR2 7 5 0,71 N7FR3 12 9 0,75 N8FR1 8 6 0,75 N8FR2 7 5 0,71 N9FR1 8 6 0,75 Média 8,4 6,1 0,72 Grupo 3: Relação entre fêmea Residente e Invasora N9FR2 8 4 0,50 N10FR1 13 8 0,62 N10FR2 12 8 0,67 N10FR3 12 7 0,58 N10FR4 9 5 0,56 N11FR2 8 3 0,38 N11FR3 9 4 0,44 N12FR2 7 3 0,43 N12FR3 8 4 0,50 N13FR2 9 4 0,44 N14FR2 7 3 0,43 N14FR3 10 4 0,40 Média 9,3 4,8 0,50


3.5 Discussão

3.5.1 Análise de microssatélites

A excelente resolução dos marcadores microssatélites permitiu a inclusão dos imaturos

na análise, sendo possível determinar com precisão a produção total das famílias e a razão

sexual da prole. Além disso, foi possível corrigir erros de aferição das observações

comportamentais relacionadas a frequência de policiamento reprodutivo.

A importância de bons marcadores foi evidenciada em estudos com Lasioglossum

malachurum (Soro et al 2009), e em outros estudos com espécies de himenópteros

primitivamente sociais, onde foram frequentes comutação de fêmeas entre ninhos ou

usurpação de ninhos por fêmeas invasoras (Queller et al 2000, Zanette & Field 2008) .

As observações comportamentais das fêmeas adultas de Euglossa melanotricha a partir do

registro de imagens (vídeo transmissão), combinadas com o parentesco, foram fundamentais para

o conhecimento das variáveis que influenciaram na estrutura social, bem como nas respostas a

estas variáveis. Sumner et al (2007) em estudos com a vespa Polistes canadensis também

demonstraram a importância em se combinar dados para determinação de um completo e robusto

pedigree. Estes autores usaram equipamentos de rádio transmissão nas fêmeas para combinar

dados das frequências de comutação entre ninhos e análise de parentesco.

3.5.2 Frequência de acasalamento nas famílias de Euglossa melanotricha

Os resultados sobre a frequência de acasalamento demonstraram forte evidência para

predominância de acasalamento único ou monoandria em Euglossa melanotricha. Resultado

semelhante foi demonstrado em estudos sobre as estimativas de acasalamento nas espécies Euglossa

hemichlora, E. viridissima e E. sp. ‘2dentate’ (Zimmermann et al 2009) sugerindo que monoandria

pode ser comum ao gênero e possivelmente para as abelhas euglossine (Tribo Euglossini.


De fato, dentre os corbiculados, informações sobre a frequência de acasalamento eram

ausentes ou escassas somente para as abelhas euglossine, reforçando a importância deste

estudo. Assim, embora a relação filogenética exata para abelhas corbiculadas ainda seja

controversa (Ascher et al 2001, Kawakita et al 2008), monoandria em abelhas euglossine

confirma a previsão de que acasalamento único foi a condição ancestral em todos os táxons

desse clado (Boomsma 2007, Hughes et al 2008).

A teoria da seleção parental prevê que acasalamento único promove a evolução de

eussocialidade, porque aumenta o parentesco genético entre as filhas e, consequentemente, o

seu incentivo para cooperar (Cole 1983, Boomsma 2007). Isto é sugerido porque os

indivíduos não reprodutivos podem ganhar maior aptidão inclusiva ajudando a parentes

(Hamilton 1964, Queller & Strassmann 1998).

Acasalamento único em Euglossa melanotricha pode afetar a estrutura social e

genética das famílias de vários modos. Essa condição, conforme previsto pela teoria da

seleção parental, contribui para elevar o parentesco nas famílias, o que é particularmente

interessante quando se tem mais de uma fêmea adulta numa relação de dominância e

subordinação.

3.5.3 Razão sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas de Euglossa

melanotricha

A análise comparativa da proporção sexual numérica da prole das dominantes e

subordinadas mostrou que apenas no grupo mãe-filha a produção das dominantes foi em favor

de fêmeas (1,89: 1), numa razão de 0,65; enquanto no grupo de irmãs e fêmeas não

aparentadas a proporção não diferiu de 1:1 (Tabela 16). Essa assimetria da razão sexual nas

famílias do grupo mãe-filha pode está relacionada com a frequência de parasitas de ninho.


Nas famílias desse grupo, 15 células foram parasitadas por Anthrax oedipus (Diptera,

Bombyliidae) e Aximopsis masneri (Hymenoptera, Eurytomidae). A distribuição das famílias

e o número de células parasitadas foram: N5FR1(=2 células parasitadas), N6FR2(=2),

N6FR4(=2), N7FR1(=2), N7FR2(=2), N7FR3(2), N8FR1(=1), N8FR2(=1), N9FR1(=1).

A análise comparativa da proporção da prole atribuída as subordinadas mostrou que

nos grupo irmãs e mãe-filha a proporção sexual numérica diferiu de 1:1, numa razão de 0,78

machos no grupo de irmãs; 0,72 machos no grupo mãe-filha, ao passo que no grupo de

fêmeas não aparentadas a razão foi de 0,53 machos, não diferindo de 1:1. Esse resultado está

de acordo com as predições da teoria de parentesco sobre a produção de machos,

considerando que as subordinadas são mais relacionadas com seus filhos (r = 0,5) do que com

os filhos de suas irmãs, seus sobrinhos (r = 0, 375) e com os filhos da sua mãe, seus irmãos (r

= 0,25) (Figura 18) (Hamilton 1964).

Contudo, a mesma explicação não se aplica a ausência de assimetria na proporção

sexual nas famílias do grupo de fêmeas não relacionadas. Nestas condições, na ausência do

elevado parentesco (r) que constitui a garantia do ganho genético indireto, as subordinadas

podem ter incentivos extras sobre a reprodução para permanecerem no ninho, além do

incentivo do ganho genético direto pela reprodução tardia, no caso de morte ou

desaparecimento da dominante (Reeve & Shen 2013).

Em todo caso, quando a análise foi feita a partir da produção total das famílias, a razão

foi de 0,55 fêmeas, não diferindo de 1:1. Segundo Trivers & Hare (1976), a previsão para

espécies com único acasalamento onde as subordinadas não se reproduzem, mas são capazes

de manipular a reprodução em favor do seu ganho genético (aptidão inclusiva), é de uma

assimetria sexual em favor de três fêmeas para cada macho produzido (3:1).

Alternativamente, assim como ocorre nas famílias de Euglossa melanotricha, se o controle for


exclusivamente da rainha ou dominante, a razão sexual esperada é de 0,5, assim como para a

população em equilíbrio (Fonseca 2000, Gardner et al 2012).

3.5.4 Parasitismo e a razão sexual da prole

A ocorrência de Anthax oedipus, uma espécie de mosca parasitóide de larva, têm sido bem

documentada, principalmente em ninhos das abelhas do gênero Centris (Aguiar & Garófalo

2006), Tetrapedia (Gazola & Garófalo 2009) e Euglossa (Augusto & Garófalo, 2004, 2010,

Andrade-Silva & Nascimento 2012). A fêmea deposita seus ovos na célula ainda na fase de

aprovisionamento. Descrições comportamentais de parasitas de ninho e a influencia da frequência

de parasitismo sobre a razão sexual da prole do hospedeiro ainda são escassos, contudo, estudos

com a abelha Calliopsis pugionis mostrou que a razão sexual de colônias parasitadas foi

significativamente influenciada pela taxa de parasitismo (Danforth & Visscher 1993).

A espécie de vespa parasita Aximopsis masneri foi recentemente descrita por Gates

(2009) associada a ninhos de Euglossa variabilis e Euglossa cybelia . A fêmea deposita seus

ovos em células recém operculadas fazendo um pequeno furo lateral. Em média, 30 ovos são

depositados por célula. Apesar da ausência de relatos na literatura sobre a preferência sexo-

assimétrica desse parasita, se as fêmeas selecionarem as células por tamanho e se essa

variável estiver relacionada ao sexo da larva do hospedeiro, a frequência de parasitismo pode

causar assimetria na razão sexual.

3.5.5 Assimetria reprodutiva e o parentesco das fêmeas adultas em Euglossa melanotricha

Estudos da assimetria sobre a reprodução em famílias do gênero Euglossa são

complicados, devido, principalmente, as constantes mudanças no quadro social das famílias


em razão da morte ou desaparecimento das fêmeas adultas, ou a comutação de fêmeas entre

ninhos (Augusto & Garófalo, 2004, 2010). Contudo, neste estudo, a combinação dos dados

comportamentais com as análises de parentesco permitiu determinar o número e, na maioria

dos casos, também a identidade, de todas as fêmeas adultas de uma família.

Em Euglossa melanotricha, a participação das subordinadas na reprodução variou

entre 22% (16, n = 70 indivíduos) nas famílias de irmãs, 28% (21, n = 76) nas famílias de

mãe-filha, e 53% (55, n = 112) nas famílias de fêmeas não aparentadas (Tabela 16, Figura

18). Estes resultados demonstraram claramente a correlação positiva e significativa entre

assimetria reprodutiva e o parentesco (r) (Figura 19a).

Tais resultados estão de acordo com as predições dos modelos de concessão, dado que

embora a dominante tenha controle sobre a reprodução, concessões podem ser feitas a outra

fêmea em troca da sua cooperação (Vehrencamp 1983, Reeve 1991). Essas concessões variam

de acordo com o parentesco (r), de maneira que as fêmeas concedem menos as subordinadas

aparentadas do que as não aparentadas (Figura 18). Assim, o elevado parentesco reduz o

incentivo a disputas pela dominância, e as subordinadas podem permanecer no ninho pelo

ganho genético indireto ao cooperar com parentes (Monnin & Peeters 1997). De maneira

inversa, concessões maiores sobre a reprodução direta devem ser dadas a subordinadas não

aparentadas como incentivo para permanecerem, além do incentivo ao ganho direto pela

reprodução tardia ao substituírem a dominante (Reeve & Shen 2013).

Até o momento, poucos estudos com insetos sociais demonstraram correlação positiva

entre assimetria reprodutiva e parentesco. Os estudos foram feitos com as vespas Polistes

fuscatus, (Reeve et al 2000) e Microstigmus nigrophthalmus (Lucas et al 2011), embora na

abelha Lasioglossum malachurum os resultados apontaram correlação positiva, dado o

incentivo maior sobre a reprodução que as dominantes concederam as subordinadas pouco

aparentadas em relação as aparentadas (Paxton et al 2002).


Em contraste, correlações negativas entre parentesco e assimetria foram encontrados nas

formigas Leptothorax rugatulus (Rüppell et al 2002) e Formica fusca (Hannonen & Sundström

2003) e na abelha alodapine Exoneura robusta (Langer et al 2004, 2006). E, possivelmente, na

vespa Polistes bellicosus (Field et al 1998), onde o parentesco foi correlacionado com a proporção

da reprodução da dominante, mas não com o índice de assimetria.

Na abelha Exoneura nigrescens, por exemplo, Langer et al (2004, 2006)

demonstraram que o grau de assimetria reprodutiva foi determinado primariamente pela

competição individual entre os membros do grupo de acordo as predições do modelo de cabo

de guerra (tug-of-war). O estudo com Exoneura nigrescens foi o primeiro a ter sucesso em

manipular experimentalmente o parentesco entre os membros de um grupo em ambiente

natural, em que três parâmetros envolvidos nos modelos da assimetria reprodutiva

(parentesco, produtividade e ganho genético) foram avaliados.

Outros estudos não encontraram relação entre parentesco e assimetria reprodutiva. Por

exemplo, nas formigas: Myrmica tahoensis: Evans 1996; Pachycondyla inversa: Heinze et al

2001; Pheidole pallidula: Fournier et al 2004; Leptothorax acervorum: Hammond et al 2006,

e nas vespas: Polistes carolina: Seppä et al 2002; Liostenogaster flavolineata: Sumner et al

2002; Polistes aurifer: Liebert et al 2005; Polistes dominulus: Liebert & Starks 2006, Polistes

atrimandibularis: Fanelli et al 2005; e Polistes alternata: Bolton et al 2006). No entanto,

estes resultados devem ser discutidos com cautela. A maioria desses estudos demonstrou

pouca variação do parentesco e/ou assimetria, razão pela qual é possível inferir que a ausência

de correlação com parentesco pode ter sido associada ao baixo poder estatístico dos testes.

Nas famílias de Euglossa melanotricha, outras variáveis como a frequência de

canibalismo dos ovos e de interações agressivas relacionadas a assimetria reprodutiva também

foram testadas. Os resultados mostraram significativa correlação positiva entre essas variáveis

e a assimetria reprodutiva (Figura 19b e 19c).


Reeve (1991) e Reeve & Ratnieks (1993) sugeriram que quando a partilha sobre a

reprodução é muito desigual (elevada assimetria), as subordinadas tem um incentivo maior

para ‘testar’ a dominante e tentar ganhar mais usurpando a sua posição. Assim é esperado que

o conflito seja resolvido a partir de mecanismos tais como o canibalismo do ovo e interações

agressivas realizadas pela dominante.

As interações agressivas podem exercer meios sutis de controle reprodutivo através do

aumento dos custos da reprodução de outras fêmeas, aumentando, por exemplo, a pressão

sobre a realização de outras tarefas, como o forrageamento, ou ainda, constituir uma ameaça

constante de despejo quando as fêmeas tentam produzir (Cant & Young 2013).

De fato, os conflitos sobre a reprodução podem resultar em fêmeas que desafiam a

dominante reprodutiva (Nakata & Tsuji 1996, Monnin et al 2002). Nestes casos, tanto o

parentesco quanto a coerção podem resolver o conflito entre fêmeas totipotentes. Contudo,

embora esses fatores possam ajudar a resolver o conflito, o efeito é limitado porque mesmo

com altas taxas de parentesco, algumas operárias participam da produção do ninho. A prova

de que a relação de parentesco pode aumentar a produção das operárias foi demonstrado em

Bombus terrestris e B. occidentalis, em que operárias invasoras com fêmeas não aparentadas

foram mais susceptíveis para reproduzir (Birmingham et al 2004, Lopez-Vamonde et al 2004).

Em alguns táxons, o parentesco sozinho é apenas parcialmente eficaz. Nas colônias de

formigas órfãs de Dinoponera quadríceps, por exemplo, testes com base no modelo de

aptidão inclusiva previam que cerca de cinco operárias participassem de uma hierarquia de

dominância se elas fossem sobrinhas (r = 0,375), mas apenas quatro deviam fazê-lo se fossem

irmãs-completas (r = 0,75) (Monnin et al 1997). Assim, apesar do parentesco diminuir o

conflito, não o reduz a zero.

Resolução de conflitos mais eficaz ocorre se os indivíduos podem ser coagidos para

não procriar. Tal coerção pode assumir várias formas. Em D. quadríceps , as operárias podem


não ser impedidas de participar de uma hierarquia de dominância, mas, se uma operária beta

desafia a alfa e tenta assumir a sua posição na colônia, essa substituição é impedida com

punição (Nakata & Tsuji 1996). A alfa sinaliza com pistas químicas e induz as operárias de

hierarquias inferiores a punir a desafiadora. A punição que envolve imobilização por um

longo período pode resultar na morte e na perda da condição reprodutiva da fêmea

desafiadora.

Uma forma de coerção interessante ocorre em formigas órfãs de Diacamma (Ratnieks

& Reeve 1992). As operárias dessa espécie têm um par de apêndices torácicos ou gemas que

de algum modo são necessários para o acasalamento. No entanto, a menos que seja necessário

um novo reprodutor, a gemas de operárias recém-emergidas são mordidas por companheiras

de ninhos com a intenção de reduzir as chances da sua reprodução (Monnin et al 2002).

Nas famílias de Euglossa melanotricha, a variável produtividade total não diferiu

significativamente entre os grupos de irmãs: média ± desvio padrão = 7,7 ± 0,68, n = 9

famílias, mãe-filha = 8,44± 0,60, n= 9, e não aparentadas: 9,33 ± 0,67, n = 12. Assim, esta

variável não foi correlacionada significativamente com a assimetria reprodutiva ou

parentesco. A ausência de correlação destas variáveis é prevista pelos modelos de concessão

porque as fêmeas não alocam energia para competição reprodutiva. Sendo o controle feito por

uma única fêmea, a produção é independente do parentesco entre as fêmeas adultas (Reeve &

Shen 2013).

Os resultados do estudo com Euglossa melanotricha suportam quatro das seis

predições dos modelos de concessão (Tabela 18), em que uma dominante tem controle sobre a

reprodução; sendo a partilha da reprodução, portanto, resultado das concessões da dominante

a outra fêmea em troca da sua cooperação.


Tabela 18. Associação observada e prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria reprodutiva

Associação entre as variáveis Modelo de Concessão

Modelo de Cabo-de-guerra

Dados observados

Assimetria reprodutiva vs parentesco (r) entre fêmeas adultas + Nenhum ou - +

Assimetria reprodutiva vs agressão + Nenhum ou - +

Assimetria reprodutiva vs policiamento do ovo + Nenhum ou - + Assimetria reprodutiva vs o sucesso da nidificação solitária (Subordinada) - Nenhum Não

testado Assimetria reprodutiva vs os benefícios da nidificação em grupo + Nenhum Não

testado Parentesco vs produtividade total do grupo Nenhum + Nenhum

+ = correlação positiva; - = correlação negativa; vs = versus Fonte: Field et al 1998, Reeve & Shen 2013

Inversamente, não há suporte para a visão alternativa da partilha da reprodução por

competição como prevista pelo modelo de cabo de guerra. Este modelo prevê que as

interações agressivas são realizadas por dominantes e subordinadas, e essas intervenções

podem levar a uma diminuição na assimetria reprodutiva. Neste modelo, a luta é assumida

como sendo o meio pelo qual as subordinadas obtêm a sua reprodução: aquelas que não lutam

não vão reproduzir (Reeve et al 2000).

De modo geral, este estudo enfatiza a relativa complexidade do repertório

comportamental dos insetos e sua capacidade de modular seu nível de esforço reprodutivo de

acordo com atributos sociais, tais como a relação dos outros membros do grupo.

Este estudo representa a primeira investigação sobre assimetria reprodutiva em uma

espécie de abelha euglossine. E ainda, fornece evidências a rara situação de correlação positiva

entre assimetria reprodutiva e parentesco previsto pelos modelos de concessão. Tais modelos têm

formado a base para a grande parte dos trabalhos teóricos, contudo, poucos testes empíricos

apoiam suas predições (Field & Cant 2009, Seppä et al 2012, Reeve & Shen 2013). Os resultados

indicam uma hierarquia social em Euglossa melanotricha mantida pelo chamado ‘contrato social’

com relação ao esforço reprodutivo (Figura 18). Mais estudos com outras espécies do gênero

Euglossa são necessários para determinar se tais contratos são típicos neste gênero.



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ANEXOS

Anexos | 136

Anexo I. Ninho 1/Família 1 (NF1) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria)

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 217 221 179 197 208 211 161 167 161 163 171 177 223 229 166 168 124 122 157 165 161 171 ♀ 223 221 193 197 206 211 157 167 159 163 169 177 221 229 174 168 126 122 167 165 175 171 ♀ 223 221 179 197 208 211 161 167 161 163 171 177 223 229 174 168 126 122 167 165 175 171 ♂ 217 193 206 157 161 169 223 174 124 157 161 ♂ 217 193 206 157 159 169 221 166 124 157 161 ♂ 217 179 208 161 161 171 223 166 124 157 161 ♀ 217 221 193 197 208 211 157 167 161 163 171 177 221 229 166 168 126 122 157 165 161 171 ♀ Mãe 217 223 179 193 206 208 157 161 159 161 169 171 221 223 166 174 124 126 157 167 161 175 ♂ Pai 221 197 211 167 163 177 229 168 122 165 171 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 137

Anexo II. Ninho 2/Família 2 (NF2) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b

♀ 219 223 179 193 204 208 167 157 161 159 169 167 226 223 172 166 126 124 197 155 169 175 ♀ 226 223 197 193 211 208 159 157 161 159 169 167 226 223 174 166 126 124 195 155 169 175 ♀ 226 223 179 193 204 208 167 157 161 159 177 167 226 223 174 166 126 124 197 155 177 175 ♂ 219 179 211 167 161 177 221 172 122 197 177 ♂ 226 197 211 159 167 169 221 172 126 197 169 ♂ 226 179 211 159 167 177 221 174 126 197 169 ♀ 219 223 179 193 204 208 167 157 161 159 177 167 221 223 174 166 126 124 195 155 177 175 ♀ 226 223 197 193 211 208 159 157 161 159 169 167 221 223 174 166 126 124 197 155 177 175

♀ Mãe 219 226 179 197 204 211 159 167 161 167 169 177 221 226 172 174 122 126 195 197 169 177 ♂ Pai 223 193 208 157 159 167 223 166 124 155 175

Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 138

Anexo III. Ninho 3/Família 3 (NF3) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 217 226 193 165 202 195 155 161 161 167 169 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179 ♀ 211 226 193 165 202 195 159 161 161 167 167 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179 ♂ 211 193 206 155 171 169 221 176 126 191 175 ♂ 211 193 206 155 171 167 221 166 124 195 161 ♀ 211 226 193 165 206 195 159 161 171 167 167 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179 ♀ 217 226 167 165 206 195 159 161 171 167 167 179 221 226 166 174 124 122 191 165 175 179 ♂ 217 193 202 155 171 169 221 176 126 191 175 ♀ 211 226 167 165 202 195 159 161 171 167 167 179 221 226 176 174 126 122 191 165 175 179 ♂ 211 193 206 155 161 169 221 176 126 195 175 ♀ Mãe 211 217 167 193 202 206 155 159 161 171 167 169 221 229 166 176 124 126 191 195 161 175 ♂ Pai 226 165 195 161 167 179 226 174 122 165 179 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 139

Anexo IV. Ninho 4/Família 4 (NF4) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria). Indivíduos Locos

Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b

♀ 223 217 167 165 206 195 157 153 157 169 153 157 223 226 166 174 126 126 167 165 165 161

♀ 219 217 167 165 208 195 151 153 157 169 153 157 223 226 172 174 126 126 167 165 171 161

♀ 223 217 167 165 206 195 151 153 157 169 161 157 221 226 166 174 126 126 179 165 165 161

♂ 219 167 206 151 163 153 221 166 122 179 165

♀ 219 217 197 165 208 195 151 153 157 169 153 157 223 226 166 174 126 126 179 165 171 161

♂ 219 197 208 151 157 161 221 166 122 179 165

♀ Mãe 219 223 167 197 206 208 151 157 157 163 153 161 221 223 166 172 122 126 167 179 165 171

♂ Pai 217 165 195 153 169 157 226 174 126 165 161 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 140

Anexo V.

Ninho 5/Família 5 (NF5) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 169 163 157 161 226 229 168 176 124 122 193 191 161 175 ♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 169 163 157 161 226 229 168 176 124 122 193 191 161 175 ♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 174 163 163 161 223 229 168 176 124 122 195 191 161 175 ♂ 217 195 211 163 174 157 226 174 126 193 171 ♂ 217 195 211 163 174 157 223 174 126 195 171 ♀ 211 223 191 177 211 208 163 159 169 163 163 161 226 229 174 176 126 122 193 191 171 175 ♂ 217 195 195 155 169 163 226 168 124 195 161 ♂ 211 195 195 155 169 157 226 168 124 193 161 ♀ 217 223 191 177 211 208 155 159 169 163 157 161 226 229 174 176 126 122 193 191 161 175 ♀ 217 223 191 177 211 208 163 159 174 163 163 161 223 229 174 176 124 122 193 191 161 175 ♂ 211 191 211 163 174 163 226 174 126 195 161 ♀ Mãe 211 217 191 195 195 211 155 163 169 174 157 163 223 226 168 174 124 126 193 195 161 171 ♂ Pai 223 177 208 159 163 161 229 176 122 191 175 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 141

Anexo VI. Ninho 6/Família 6 (NF6) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 226 219 177 167 193 195 161 163 163 161 175 171 229 221 174 168 122 124 193 195 171 157 ♀ 226 219 177 167 193 195 161 163 163 161 175 171 229 221 174 168 122 124 197 195 171 157 ♂ 226 177 193 161 167 175 223 174 126 197 171 ♂ 226 179 198 165 167 180 229 176 126 197 169 ♀ 229 219 177 167 198 195 165 163 167 161 175 171 229 221 176 168 122 124 193 195 169 157 ♂ 226 179 198 161 163 180 223 174 122 193 171 ♀ 229 219 179 167 193 195 161 163 167 161 180 171 223 221 174 168 122 124 193 195 171 157 ♀ Mãe 226 229 177 179 193 198 161 165 163 167 175 180 223 229 174 176 122 126 193 197 171 169 ♂ Pai 219 167 195 163 161 171 221 168 124 195 157


Anexos | 142

Anexo VII. Ninho 7/Família 7 (NF7) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 219 229 179 177 198 208 175 161 163 175 169 173 221 229 176 172 120 118 193 197 157 169 ♀ 219 229 179 177 198 208 175 161 173 175 169 173 221 229 168 172 120 118 191 197 157 169 ♀ 219 229 193 177 204 208 175 161 173 175 171 173 226 229 176 172 124 118 191 197 161 169 ♂ 223 193 204 173 173 171 226 176 124 191 161 ♂ 219 193 198 173 163 169 221 168 124 193 157 ♀ 223 229 179 177 204 208 173 161 163 175 171 173 226 229 176 172 124 118 191 197 161 169 ♀ 219 229 193 177 204 208 175 161 173 175 171 173 221 229 176 172 120 118 191 197 161 169 ♀ 223 229 193 177 204 208 175 161 163 175 169 173 221 229 176 172 120 118 193 197 161 169 ♂ 219 179 198 173 163 171 226 176 124 193 157 ♂ 223 179 204 175 173 169 226 168 124 193 161 ♀ Mãe 219 223 179 193 198 204 173 175 163 173 169 171 221 226 168 176 120 124 191 193 157 161 ♂ Pai 229 177 208 161 175 173 229 172 118 197 169 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 143

Anexo VIII. Ninho 8/Família 8 (NF8) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria). Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 168 172 120 124 161 157 167 175 ♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 174 172 120 124 165 157 167 175 ♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 174 172 118 124 161 157 167 175 ♀ 217 219 179 191 195 208 169 177 174 161 171 163 229 221 168 172 118 124 165 157 167 175 ♂ 221 195 195 169 174 171 226 174 118 165 177 ♂ 221 195 193 175 174 171 226 174 120 165 177 ♂ 217 195 193 175 163 165 229 168 120 161 167 ♀ 217 219 179 191 195 208 175 177 163 161 171 163 226 221 168 172 118 124 161 157 167 175 ♂ 221 195 193 169 163 171 229 168 118 161 177 ♀ Mãe 217 221 179 195 193 195 169 175 163 174 165 171 226 229 168 174 118 120 161 165 167 177 ♂ Pai 219 191 208 177 161 163 221 172 124 157 175 Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.

Anexos | 144

Anexo IX. Ninho 9/Família 9 (NF9) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 211 229 177 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 176 170 122 118 179 191 165 171 ♀ 211 229 177 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 176 170 122 118 165 191 179 171 ♀ 211 229 179 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 174 170 122 118 179 191 179 171 ♂ 211 177 204 171 171 177 226 176 126 165 165 ♀ 211 229 179 195 202 198 173 175 171 159 177 171 221 223 176 170 122 118 179 191 165 171 ♀ 219 229 177 195 204 198 173 175 171 159 169 171 226 223 176 170 126 118 179 191 179 171 ♂ 211 177 204 173 163 169 226 174 126 165 179 ♂ 211 177 202 171 163 177 226 176 122 165 179

♀ Mãe 211 219 177 179 202 204 171 173 163 171 169 177 221 226 174 176 122 126 165 179 165 179 ♂ Pai 229 195 198 175 159 171 223 170 118 191 171


Anexos | 145

Anexo X.


Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 223 226 167 191 195 201 167 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 179 167 167 171 ♀ 223 226 167 191 195 201 167 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 193 167 167 171 ♀ 229 226 167 191 195 201 171 169 159 161 169 177 223 226 168 172 122 124 193 167 169 171 ♂ 229 177 195 167 163 173 223 170 118 193 167 ♀ 223 226 167 191 198 201 171 169 159 161 173 177 223 226 170 172 122 124 193 167 167 171 ♀ 223 226 167 191 198 201 171 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 179 167 169 171 ♂ 229 167 198 167 163 169 221 168 122 193 169 ♂ 223 177 195 167 159 173 221 170 118 179 167 ♂ 223 177 195 171 159 173 223 168 118 193 167

♀ Mãe 223 229 167 177 195 198 167 171 159 163 169 173 221 223 168 170 118 122 179 193 167 169 ♂ Pai 226 191 201 169 161 177 226 172 124 167 171


Anexos | 146

Anexo XI.


Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 219 232 193 179 193 208 169 175 171 163 173 171 217 229 166 170 120 126 167 155 163 169 ♀ 229 232 193 179 193 208 173 175 171 163 177 171 217 229 166 170 120 126 167 155 163 169 ♂ 219 193 195 173 174 177 217 166 124 179 171 ♀ 229 232 197 179 193 208 173 175 174 163 173 171 221 229 172 170 120 126 179 155 171 169 ♂ 229 197 195 169 171 177 221 172 124 167 171 ♂ 219 197 195 169 174 177 217 166 124 167 163

♀ Mãe 219 229 193 197 193 195 169 173 171 174 173 177 217 221 166 172 120 124 167 179 163 171 ♂ Pai 232 179 208 175 163 171 229 170 126 155 169


Anexos | 147

Anexo XII.


Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 229 219 177 179 202 195 169 191 159 167 167 175 223 221 168 174 118 124 195 165 171 167 ♀ 229 219 177 179 202 195 169 191 163 167 167 175 223 221 168 174 118 124 195 165 177 167 ♂ 232 191 204 171 163 169 226 176 124 195 177 ♂ 232 191 202 171 159 167 226 168 118 197 177 ♀ 229 219 177 179 204 195 169 191 163 167 169 175 226 221 168 174 118 124 197 165 171 167

♀ Mãe 229 232 177 191 202 204 169 171 159 163 167 169 223 226 168 176 118 122 195 197 171 177 ♂ Pai 219 179 195 191 167 175 221 174 124 165 167


Anexos | 148

Anexo XIII. Ninho 1/Família 13 (N1FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).

Indivíduos Locos Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♂ 217 193 211 157 159 169 223 166 122 161 171 ♂ 217 197 211 157 161 171 223 166 124 167 171 ♀ 223 217 179 167 204 206 157 169 161 165 169 173 226 221 174 176 124 118 165 191 175 177 ♀ 217 229 193 165 204 208 167 159 161 163 169 177 226 221 174 168 124 126 161 157 175 169 ♂ 219 170 211 157 167 171 232 174 128 165 175 ♀ 223 229 197 165 211 208 157 159 159 163 169 177 226 229 166 168 122 126 161 157 171 169 ♀ 217 229 193 165 211 208 167 159 159 163 169 177 223 229 174 168 122 126 161 157 171 169 ♀ 217 229 197 165 204 208 157 159 159 163 171 177 223 229 166 168 124 126 161 157 171 169 ♀ 223 229 197 165 211 208 157 159 159 163 169 177 226 229 166 168 122 126 161 157 171 169 ♀ 217 229 193 165 204 208 157 159 161 163 169 177 223 229 174 168 122 126 167 157 175 169 ♂ 223 197 211 167 161 169 226 166 122 167 175 ♂ 217 197 204 157 159 171 223 166 124 167 171

♀Irmã (D) 217 223 197 193 204 211 157 167 159 161 169 171 223 226 166 174 122 124 161 167 171 175 ♂ Pai 229 165 208 159 163 177 229 168 126 157 169

♀Irmã (S) 219 223 193 179 204 211 157 161 161 167 169 171 226 232 174 166 124 128 161 165 171 175 ♂ Pai 217 167 206 169 165 173 221 176 118 191 177

Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 149

Anexo XIV. Ninho 1/Família 14 (N1FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♂ 219 181 193 159 163 175 221 172 128 191 175 ♂ 219 179 195 173 167 169 221 176 132 191 179 ♀ 226 211 179 167 195 204 159 151 163 171 177 173 221 232 176 182 128 109 191 193 179 175 ♀ 226 221 181 177 193 201 159 149 163 155 175 179 223 217 172 188 124 118 197 152 175 171 ♂ 229 179 193 163 163 175 223 186 128 191 179 ♂ 229 179 193 163 163 175 223 186 128 191 179 ♀ 219 221 179 177 193 201 159 149 167 155 169 179 223 217 172 188 128 118 191 152 175 171

♀ Irmã (D) 219 226 179 181 193 195 159 173 163 167 175 169 221 223 172 176 128 132 191 197 175 179 ♂ Pai 221 177 201 149 155 179 217 188 118 152 171

♀Irmã (S) 226 229 181 179 193 195 159 163 163 167 175 177 221 223 176 186 128 132 191 195 179 181 ♂ Pai 211 167 204 151 171 173 232 182 109 193 175

Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 150

Anexo XV. Ninho 2/Família 15 (N2FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 217 223 183 181 204 202 177 175 169 161 171 175 229 235 170 176 120 132 155 193 175 191

♀ 217 223 183 181 204 202 177 175 179 161 177 175 229 235 170 176 120 132 155 193 181 191

♂ 217 189 204 191 174 177 232 182 122 157 181

♂ 217 189 204 191 174 177 232 182 122 157 181

♂ 219 189 204 191 174 171 229 170 120 155 181

♀ 219 223 183 181 208 202 177 175 169 161 171 175 229 235 182 176 120 132 157 193 175 191

♀ 219 223 183 181 208 202 191 175 169 161 171 175 232 235 170 176 122 132 155 193 181 191

♂ 221 193 204 188 169 177 229 186 120 155 181

♀ 217 223 189 181 204 202 177 175 174 161 177 175 232 235 170 176 120 132 155 193 175 191 ♀ Irmã (D) 217 219 183 189 204 208 177 191 169 174 171 177 229 232 170 182 120 122 155 157 175 181

♂ Pai 223 181 202 175 161 175 235 176 132 193 191 ♀Irmã (S) 219 221 183 193 204 208 188 191 169 171 177 179 229 232 182 186 120 122 155 157 181 191 ♂ Pai*

Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de irmãs completas para identificação do alelo.

Anexos | 151

Anexo XVI. Ninho 2/Família 16 (N2FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 223 217 177 183 209 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 118 124 191 195 167 181 ♀ 223 217 177 183 211 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 126 124 197 195 179 181 ♂ 226 195 211 163 171 167 229 182 126 191 167 ♂ 223 177 211 157 171 149 229 172 126 191 167 ♀ 226 217 177 183 209 204 163 171 171 155 167 151 221 232 182 186 118 124 191 195 179 181 ♀ 223 217 195 183 211 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 118 124 197 195 179 181 ♂ 226 195 209 163 171 167 221 172 126 191 179 ♂ 223 191 211 157 174 149 229 172 128 191 171

♀ Irmã (D) 223 226 177 195 209 211 157 163 161 171 149 167 221 229 172 182 118 126 191 197 167 179 ♂ Pai 217 183 204 171 155 151 232 186 124 195 181

♀Irmã (S) 223 226 177 191 209 211 157 163 171 174 149 167 229 235 172 182 118 128 191 197 167 171 ♂ Pai*


Anexos | 152

Anexo XVII. Ninho 2/Família 17 (N2FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 211 221 195 189 202 211 171 173 157 169 173 149 232 221 170 188 124 130 155 197 163 179 ♂ 211 195 209 171 157 173 223 170 124 161 181 ♂ 223 179 202 171 163 179 232 170 124 161 181 ♂ 223 179 202 188 157 179 232 174 128 161 181 ♀ 211 221 179 189 209 211 188 173 163 169 173 149 232 221 170 188 124 130 155 197 163 179 ♀ 211 221 189 189 202 211 171 173 157 169 179 149 223 221 174 188 124 130 161 197 181 179 ♂ 211 183 202 165 163 173 235 170 132 155 163

♀ Irmã (D) 211 223 179 195 202 209 171 188 157 163 173 179 223 232 170 174 124 128 155 161 163 181 ♂ Pai 221 189 211 173 169 149 221 188 130 197 179

♀Irmã (S) 211 223 179 183 202 209 163 165 156 163 173 179 223 235 170 174 124 132 155 161 163 181 ♂ Pai*


Anexos | 153

Anexo XVIII. Ninho 3/Família 18 (N3FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 219 223 183 193 206 198 153 177 174 171 175 169 226 229 168 186 118 120 191 157 167 191

♂ 219 183 206 165 174 175 235 182 118 191 179

♂ 219 197 208 165 174 175 226 182 118 193 179

♀ 226 223 197 193 208 198 165 177 169 171 179 169 226 229 182 186 122 120 191 157 179 191

♀ 226 223 183 193 206 198 153 177 169 171 179 169 226 229 182 186 122 120 193 157 167 191

♀ 219 223 197 193 208 198 165 177 169 171 179 169 235 229 168 186 118 120 191 157 167 191

♂ 229 197 206 179 169 171 226 182 124 193 179 ♀ Irmã (D) 219 226 183 197 206 208 153 165 169 174 175 179 226 235 168 182 118 122 191 193 167 179 ♂ Pai 223 193 198 177 171 169 229 186 120 157 191 ♀Irmã (S) 226 229 183 197 206 208 153 179 169 174 175 171 226 235 168 182 122 124 191 193 167 179 ♂ Pai*


Anexos | 154

Anexo XIX. Ninho 4/Família 19 (N4FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 229 226 165 167 208 206 153 157 159 174 157 161 221 226 166 172 124 122 165 179 177 165 ♂ 223 197 193 151 161 157 223 174 124 167 177 ♀ 223 226 165 167 193 206 151 157 161 174 157 161 221 226 174 172 126 122 167 179 177 165 ♀ 229 226 197 167 193 206 151 157 159 174 153 161 221 226 166 172 124 122 167 179 181 165 ♀ 229 226 165 167 193 206 151 157 161 174 157 161 223 226 166 172 124 122 165 179 181 165 ♀ 223 226 197 167 208 206 153 157 161 174 153 161 223 226 174 172 126 122 167 179 177 165 ♂ 223 165 208 153 159 157 223 174 124 165 _ ♂ 223 181 208 151 167 153 221 176 128 167 179 ♂ 223 181 208 161 161 153 223 166 124 165 179

♀ Irmã (D) 223 229 165 197 193 208 151 153 159 161 153 157 221 223 166 174 124 126 165 167 177 181 ♂ Pai 226 167 206 157 174 161 226 172 122 179 165

♀Irmã (S) 223 229 165 181 193 208 151 161 161 167 153 157 221 223 166 176 124 128 165 167 179 181 ♂ Pai* _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

- missing data; representado em vermelho à prole atribuído a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de irmãs completas para identificação do alelo.

Anexos | 155

Anexo XX. Ninho 5/Família 20 (N5FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (Mãe e filha) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 211 223 167 177 208 204 159 171 167 155 175 173 229 232 177 185 120 132 195 197 177 191 ♂ 211 167 211 159 171 175 226 177 128 191 181 ♂ 217 179 211 159 171 173 226 177 128 191 181 ♀ 217 223 179 177 211 204 161 171 171 155 173 173 226 232 179 185 128 132 191 197 181 191 ♂ 211 179 211 161 167 173 229 179 120 191 181 ♂ 211 165 _ 161 167 173 226 185 120 191 _ ♀ 211 226 167 189 208 202 161 155 167 169 173 165 226 235 177 179 132 130 191 193 191 175 ♂ 211 167 204 171 155 173 232 177 132 197 177

♀ Mãe 211 217 167 179 208 211 159 161 167 171 173 175 226 229 177 179 120 128 191 195 177 181 ♂ Pai 223 177 204 171 155 173 232 185 132 197 191 ♀Filha 211 223 167 177 208 204 161 171 167 155 175 173 226 232 177 185 120 132 191 197 177 191 ♂ Pai 226 189 202 155 169 165 235 179 130 193 175

- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 156

Anexo XXI. Ninho 6/Família 21 (N6FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).


♀ 211 221 189 165 206 204 173 175 174 169 149 169 229 223 177 167 118 109 157 179 181 161

♂ 211 177 202 155 _ 167 217 186 118 157 191

♂ 211 189 198 155 171 149 217 177 118 157 191

♀ 226 221 189 165 202 204 155 175 159 169 167 169 229 223 186 167 120 109 195 179 191 161

♂ 226 177 202 155 171 149 217 186 120 195 181 ♀Irmã (D) 211 226 177 189 198 202 155 173 159 171 149 167 217 229 177 186 118 120 157 195 181 191 ♂ Pai 221 165 204 175 169 169 223 167 109 179 161

♀Irmã S* 226 229 177 189 198 202 155 173 169 171 167 171 217 229 177 186 118 120 157 177 181 191

- missing data; representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não há prole atribuída a fêmea subordinada.

Anexos | 157

Anexo XXII. Ninho 6/Família 22 (N6FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 223 232 179 195 193 211 175 153 167 155 169 151 226 229 167 179 111 118 195 165 177 181

♀ 223 232 193 195 193 211 191 153 171 155 169 151 226 229 177 179 111 118 195 165 191 181

♂ 226 193 206 191 171 179 226 177 111 197 191

♀ 223 232 193 195 193 211 175 153 171 155 169 151 217 229 177 179 109 118 197 165 191 181

♂ 223 179 193 191 167 169 229 167 111 195 177

♀ 223 232 193 195 206 211 191 153 167 155 179 151 217 229 177 179 111 118 197 165 191 181

♂ 223 179 211 153 167 151 226 177 109 197 177

♂ 232 179 211 153 155 151 229 177 109 197 177 ♀ Mãe 223 226 179 193 193 206 175 191 167 171 169 179 217 226 167 177 109 111 195 197 177 191 ♂ Pai 232 195 211 153 155 151 229 179 118 165 181 ♀Filha 223 232 179 195 206 211 175 153 167 155 151 179 226 229 177 179 109 118 165 197 177 181 ♂ Pai*

Representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe) do ninho, e em verde a prole atribuída a sua irmã subordinada (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. .* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada em razão da ausência de irmãs completas.

Anexos | 158

Anexo XXIII. Ninho 6/Família 23 (N6FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 211 223 181 189 201 193 171 191 171 167 149 167 221 226 174 172 122 120 197 155 165 181

♂ 211 183 201 188 _ 161 221 174 122 197 165

♂ 211 181 201 171 171 161 223 174 122 197 169

♀ 217 223 181 189 195 193 171 191 159 167 161 167 221 226 176 172 126 120 193 155 169 181

♀ 217 223 181 189 195 193 171 191 159 167 161 167 223 226 174 172 126 120 193 155 169 181

♂ 211 183 197 171 161 167 223 174 124 193 165 ♀Irmã (D) 211 217 181 183 195 201 171 188 159 171 161 165 221 223 174 176 122 126 193 197 165 169 ♂ Pai 223 189 193 191 167 167 226 172 120 155 181 ♀Irmã (S) 211 217 181 183 195 197 171 188 159 161 165 167 221 223 174 176 122 124 193 197 165 169 ♂ Pai*

- missing data; representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada em razão da ausência de irmãs completas.

Anexos | 159

Anexo XXIV. Ninho 6/Família 24 (N6/FR4) – Quarta Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 229 226 195 189 206 198 159 173 161 163 169 180 229 226 182 188 109 118 167 179 179 175

♀ 229 226 195 189 202 198 188 173 161 163 169 180 223 226 176 188 109 118 167 179 181 175

♀ 235 226 165 189 206 198 188 173 161 163 173 180 223 226 176 188 113 118 152 179 181 175

♀ 235 226 165 189 202 198 159 173 155 163 173 180 229 226 176 188 109 118 152 179 _ _

♂ 229 165 202 159 161 _ _ 176 113 167 179

♂ 229 165 202 159 155 _ _ 176 113 167 179

♂ 229 195 206 161 155 169 223 182 113 152 179

♀ 229 232 189 183 202 208 159 163 155 171 173 177 229 235 176 186 113 124 179 191 179 169

♂ 226 189 202 159 155 180 229 176 118 152 175

♂ 229 189 202 173 163 _ 229 188 118 152 175

♀ 229 226 165 189 202 198 188 173 161 163 169 180 229 226 182 188 113 118 152 179 179 175 ♀ Mãe 229 235 165 195 202 206 159 188 155 161 173 169 223 229 176 182 109 113 152 167 179 181 ♂ Pai 226 189 198 173 163 180 226 188 118 179 175 ♀Filha 229 226 165 189 202 198 159 173 155 163 173 180 229 226 176 188 113 118 152 179 179 175 ♂ Pai 232 183 208 163 171 177 235 186 124 191 169

- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 160

Anexo XXV. Ninho 7/Família 25 (N7FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 229 219 179 177 204 202 173 151 169 174 173 169 223 226 166 182 113 122 155 167 169 191

♀ 229 219 179 177 208 202 173 151 169 174 179 169 223 226 168 182 113 122 155 167 169 191

♂ 229 195 204 177 169 173 223 166 113 152 179

♀ 232 219 179 177 204 202 177 151 159 174 173 169 223 226 168 182 111 122 155 167 169 191

♂ 223 195 204 177 169 179 229 166 111 153 179

♂ 232 177 208 151 169 173 223 168 111 155 179

♂ 232 179 208 151 169 173 223 168 111 167 179 ♀ Mãe 229 232 179 195 204 208 173 177 159 169 173 179 223 229 166 168 111 113 152 155 169 179 ♂ Pai 219 177 202 151 174 169 226 182 122 167 191 ♀Filha 232 219 179 177 208 202 173 151 169 174 173 169 223 226 168 182 111 122 155 167 179 191 ♂ Pai*

- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. * Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.

Anexos | 161

Anexo XXVI. Ninho 7/Família 26 (N7FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 223 219 181 189 201 189 171 191 167 161 175 179 217 226 168 177 118 122 195 157 171 169

♀ 223 219 181 189 201 189 171 191 171 161 175 179 217 226 168 177 118 122 195 157 181 169

♂ 217 183 201 188 _ 175 229 168 126 197 181

♀ 223 219 181 189 209 189 171 191 171 161 177 179 217 226 170 177 126 122 179 157 181 169

♂ 223 189 189 188 161 175 226 177 126 195 171

♀ 217 219 181 189 209 189 171 191 169 161 177 179 217 226 170 177 118 122 179 157 171 169

♂ 223 189 201 191 161 175 229 168 122 195 171 ♀ Mãe 217 223 181 183 201 209 171 188 169 171 175 177 217 229 168 170 118 126 179 195 171 181 ♂ Pai 219 189 189 191 161 179 226 177 122 157 169 ♀Filha 223 219 181 189 201 189 188 191 169 161 175 179 229 226 168 177 126 122 195 157 171 169 ♂ Pai*

- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.

Anexos | 162

Anexo XXVII. Ninho 7/Família 27 (N7FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).

Indivíduos Locos

Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b ♀ 229 211 195 189 209 193 169 188 159 155 151 163 217 223 170 176 109 113 191 161 171 175

♀ 229 211 195 189 211 193 169 188 163 155 151 163 217 223 170 176 109 113 191 161 171 175

♂ 229 183 211 171 163 151 221 172 111 191 171

♀ 229 211 183 189 211 193 171 188 159 155 161 163 221 223 172 176 109 113 197 161 171 175

♀ 229 211 185 189 211 193 171 188 163 155 161 163 _ _ 172 176 111 113 191 161 169 175

♂ 221 195 211 169 163 161 217 172 109 191 169

♀ 229 211 195 189 209 193 169 188 163 155 161 163 217 223 172 176 111 113 197 161 171 175

♂ 221 183 209 171 163 151 217 170 111 191 169

♀ 221 211 195 189 209 193 169 188 159 155 161 163 217 223 _ _ 109 113 197 161 171 175

♀ 221 217 195 181 211 195 188 169 155 157 151 167 221 226 170 174 111 120 197 179 171 177

♂ 221 189 211 188 155 _ 221 176 111 197 171

♂ 221 189 211 188 159 163 221 170 111 161 171 ♀ Mãe 221 229 195 183 209 211 169 171 159 163 151 161 217 221 170 172 109 111 191 197 169 171 ♂ Pai 211 189 193 188 155 163 223 176 113 161 175 ♀Filha 221 211 195 189 211 193 169 188 159 155 151 163 221 223 170 176 111 113 197 161 171 175 ♂ Pai 217 181 195 169 157 167 226 174 120 179 177


Anexos | 163

Anexo XXVIII. Ninho 8/Família 28 (N8FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 221 229 191 193 204 208 181 177 157 155 173 179 222 235 168 172 128 118 191 197 177 191

♂ 221 191 204 181 169 173 217 _ 128 195 177

♀ 232 229 191 193 206 208 181 177 157 155 173 179 171 179 168 172 130 118 195 197 177 191

♀ 232 229 183 193 204 208 188 177 157 155 171 179 223 235 174 172 130 118 191 197 179 191

♂ 229 193 204 181 155 171 223 172 128 197 191

♀ 232 229 191 193 206 208 181 177 169 155 171 179 223 235 174 172 130 118 195 197 177 191

♂ 223 193 204 181 157 171 235 172 128 191 191

♀ 232 229 191 193 204 208 188 177 157 155 173 179 217 235 168 172 130 118 191 197 179 191 ♀ Mãe 221 232 183 191 206 204 181 188 157 169 171 173 217 223 168 174 128 130 191 195 177 179 ♂ Pai 229 193 208 177 155 179 235 172 118 197 191 ♀Filha 223 229 183 193 204 208 181 177 157 155 171 179 223 235 174 172 128 118 191 197 177 191 ♂ Pai*

- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. * Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.

Anexos | 164

Anexo XXIX. Ninho 8/Família 29 (N8FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 219 217 178 197 193 189 169 165 167 171 169 161 223 221 168 174 124 120 157 155 165 177

♂ 219 193 195 169 161 163 229 168 124 157 165

♂ 229 193 195 173 161 169 223 168 126 167 165

♀ 229 217 193 197 193 189 169 165 167 171 163 161 223 221 168 174 126 120 157 155 175 177

♀ 229 223 178 191 195 201 169 167 161 155 161 165 223 226 176 172 124 122 167 161 175 169

♂ 229 178 195 169 161 161 223 174 120 167 175

♀ 229 217 193 197 195 189 173 165 167 171 169 161 229 221 176 174 126 120 157 155 165 177 ♀ Mãe 219 229 178 193 193 195 169 173 161 167 163 169 223 229 168 176 124 126 157 167 165 175 ♂ Pai 217 197 189 165 171 161 221 174 120 155 177 ♀Filha 229 217 178 197 195 189 169 165 161 171 169 161 223 221 176 174 124 120 167 155 175 177 ♂ Pai 223 191 201 167 155 165 226 172 122 161 169


Anexos | 165

Anexo XXX. Ninho 9/Família 30 (N9FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 211 223 179 177 208 195 159 163 161 167 165 173 223 229 168 176 124 122 165 191 165 175

♀ 211 223 167 177 208 195 159 163 157 155 169 173 223 229 168 176 124 122 195 191 165 175

♂ 217 167 208 155 161 165 226 168 126 195 177

♀ 217 223 167 177 211 195 155 163 159 167 165 173 226 229 168 176 126 122 165 191 177 175

♂ 217 179 211 159 159 165 223 168 124 195 165

♀ 223 221 177 171 208 204 163 167 159 165 165 171 226 221 176 172 124 120 191 161 175 161

♂ 223 177 195 163 167 173 226 176 124 191 177

♀ 211 223 179 177 208 195 159 163 161 167 165 173 226 229 174 176 126 122 193 191 177 175 ♀ Mãe 211 217 167 179 208 211 155 159 159 161 165 169 223 226 168 174 124 126 193 195 165 177 ♂ Pai 223 177 195 163 167 173 229 176 122 191 175 ♀Filha 211 223 167 177 208 195 159 163 159 167 165 173 226 229 174 176 124 122 193 191 177 175 ♂ Pai 221 171 204 167 165 171 221 172 120 161 161


Anexos | 166

Anexo XXXI. Ninho 9/Família 31 (N9FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 223 221 179 191 206 211 157 167 169 155 171 175 221 232 166 171 122 118 167 161 161 171

♀ 217 221 179 191 206 211 157 167 157 155 169 175 221 232 174 171 124 118 157 161 179 171

♂ 217 193 208 161 _ 171 223 174 124 157 179

♂ 217 193 206 157 169 171 223 174 122 157 161

♀ 226 223 167 195 195 202 171 188 169 155 171 173 226 221 168 174 126 120 157 195 161 177

♀ 219 223 197 195 204 202 171 188 157 155 171 173 226 221 168 174 124 120 165 195 175 177

♂ 226 197 195 171 157 171 223 166 124 157 161

♂ 226 197 204 171 157 171 223 166 124 165 161 ♀Residente (D1) 217 223 179 193 206 208 157 161 157 169 169 171 221 223 166 174 122 124 157 167 161 179

♂ Pai 221 191 211 167 155 175 232 171 118 161 171 ♀Invasora (D2) 219 226 167 197 195 204 169 171 157 169 171 177 223 226 166 168 124 126 157 165 161 175

♂ Pai 223 195 202 188 155 173 221 174 120 195 177

- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe Residente) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmeas invasora (♀Invasora). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 167

Anexo XXXII. Ninho 10/Família 32 (N10FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♂ 219 179 198 161 163 153 226 166 120 157 167

♀ 219 229 179 191 198 193 157 167 169 171 153 177 226 223 166 179 120 124 157 161 169 171

♀ 223 229 193 191 198 193 157 167 163 171 153 177 226 223 166 179 122 124 157 161 169 171

♂ 223 193 198 161 169 180 229 166 122 157 167

♂ 223 193 201 157 169 180 226 174 120 157 169

♀ 211 226 177 181 195 195 163 167 159 169 171 175 223 226 168 176 122 126 197 195 161 169

♀ 211 226 179 181 195 195 171 167 159 169 171 175 223 226 168 176 122 126 197 195 161 169

♀ 223 226 179 181 193 195 171 167 161 169 171 175 221 226 174 176 124 126 193 195 157 169

♂ 223 179 193 171 161 _ 221 174 122 _ 157

♂ 223 177 195 171 161 173 223 168 122 193 157

♀ 211 226 177 181 193 195 163 167 159 169 171 175 221 226 174 176 124 126 193 195 157 169

♀ 223 226 177 181 193 195 171 167 161 169 173 175 221 226 174 176 _ _ 197 195 157 169

♀ 211 226 177 181 195 198 171 167 161 169 171 175 223 226 168 176 124 126 193 195 161 169 ♀Residente (D1) 219 223 179 193 201 198 157 161 163 169 153 180 226 229 166 174 120 122 157 167 167 169

♂ Pai 229 191 193 167 171 177 223 179 124 161 171 ♀Invasora (D2) 211 223 177 179 195 193 163 165 159 161 171 173 221 223 168 174 122 124 193 197 157 161

♂ Pai 226 181 195 167 169 175 226 176 126 195 169


Anexos | 168

Anexo XXXIII. Ninho 10/Família 33 (N10FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♂ 219 165 202 167 159 169 217 166 _ 155 167

♀ 232 226 191 167 202 204 173 177 159 167 169 181 221 226 166 171 122 126 155 193 175 169

♀ 219 226 191 167 208 204 173 177 171 167 169 181 221 226 166 171 124 126 155 193 175 169

♂ 219 165 202 167 171 171 _ 166 124 155 175

♀ 226 229 167 177 198 193 169 175 159 169 175 179 223 232 172 176 120 122 167 165 161 163

♀ 226 229 197 177 195 193 171 175 159 169 173 179 226 232 172 176 118 122 161 165 161 163

♀ 226 229 167 177 195 193 169 175 161 169 173 179 226 232 172 176 118 122 161 165 161 163

♂ 235 167 198 171 161 173 223 172 120 167 169

♂ 235 167 198 171 161 _ 223 174 118 167 169

♀ 235 229 197 177 198 193 171 175 159 169 173 179 226 232 172 176 120 122 161 165 171 163

♀ 235 229 167 177 195 193 169 175 161 169 175 179 226 232 174 176 120 122 161 165 171 163

♀ 235 229 197 177 198 193 171 175 161 169 175 179 _ _ 172 176 120 122 161 165 171 163 ♀Residente (D1) 219 232 165 191 202 208 167 173 159 171 169 171 217 221 166 170 122 124 155 179 167 175

♂ Pai 226 167 204 177 167 181 226 171 126 193 169 ♀Invasora (D2) 226 235 167 197 198 195 169 171 161 167 173 175 223 226 172 174 118 120 161 167 169 171

♂ Pai 229 177 193 175 163 179 232 176 122 165 163


Anexos | 169

Anexo XXXIV. Ninho 10/Família 34 (N10FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♂ 223 189 195 169 171 _ 221 _ 118 157 171

♂ 223 177 198 177 171 169 221 166 _ 179 _

♀ 223 211 177 181 195 193 169 175 159 161 169 177 223 217 172 176 124 122 191 167 161 165

♀ 223 211 189 181 195 193 169 175 171 161 169 177 223 217 172 176 126 122 179 167 161 165

♂ 229 177 198 169 171 175 223 166 126 191 167

♀ 229 219 179 183 193 204 169 171 163 159 171 181 223 226 172 174 118 120 157 179 161 175

♀ 226 219 179 183 202 204 188 171 163 159 171 181 223 226 172 174 118 120 157 179 161 175

♀ 223 219 179 183 202 204 169 171 167 159 167 181 223 226 172 174 124 120 167 179 171 175

♂ 223 191 202 169 167 171 229 168 124 157 177

♂ 223 191 202 169 167 167 229 168 124 157 177

♂ 229 179 193 188 163 167 223 168 124 167 171

♀ 223 219 181 183 193 204 169 171 163 159 167 181 223 226 172 174 124 120 157 179 171 175 ♀Residente (D1) 219 223 177 189 195 198 169 177 159 171 169 175 221 223 166 172 124 126 179 191 161 167

♂ Pai 211 181 193 175 161 177 217 176 122 167 165 ♀Invasora(D2) 223 229 179 191 193 202 169 188 163 167 167 171 223 229 168 172 118 124 157 167 171 177

♂ Pai 219 183 204 171 159 181 226 174 120 179 175


Anexos | 170

Anexo XXXV. Ninho 10/Família 35 (N10FR4) – Quarta Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♂ 223 179 198 171 167 169 _ 167 120 193 175

♀ 223 232 189 171 198 191 171 163 174 155 169 173 221 229 167 185 120 118 193 195 175 173

♂ 223 189 198 _ 167 177 221 167 126 197 _

♀ 219 232 189 171 206 191 171 163 174 155 169 173 221 229 167 185 126 118 193 195 175 173

♀ 221 211 167 189 202 195 169 188 169 159 173 179 217 232 166 170 118 130 157 165 179 191

♀ 221 211 167 189 202 195 169 188 161 159 173 179 223 232 166 170 111 130 157 165 179 191

♀ 235 211 167 189 202 195 169 188 161 159 173 179 223 232 166 170 111 130 152 165 181 191

♂ 221 183 202 173 169 180 217 172 111 157 179

♂ 221 167 202 169 169 180 223 166 111 157 179 ♀Residente (D1) 219 223 189 179 198 206 171 191 167 174 169 177 221 226 167 179 120 126 193 197 175 179

♂ Pai 232 171 191 163 155 173 229 185 118 195 193 ♀Invasora (D2) 221 235 167 183 202 208 169 173 161 169 173 180 217 223 166 172 111 118 152 157 179 181

♂ Pai 211 189 195 188 159 179 232 170 130 165 191

- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe ResidenteD1) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora que assumiu a dominância (♀Invasora D2). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 171

Anexo XXXVI. Ninho 11/Família 36 (N11FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 223 232 167 165 202 204 188 169 167 169 167 163 223 217 170 172 128 113 157 167 163 181

♀ 223 232 197 165 202 204 191 169 167 169 177 163 223 217 174 172 122 113 157 167 163 181

♂ 223 167 204 191 169 177 226 170 122 157 175

♀ 226 232 167 165 202 204 191 169 169 155 177 163 226 217 170 172 122 113 152 167 175 181

♂ 226 167 193 188 169 177 223 174 128 157 175

♀ 221 223 177 181 193 195 175 171 163 161 169 174 221 226 174 181 130 128 161 157 191 169

♂ 221 179 198 175 163 169 217 168 126 165 191

♂ 221 _ 198 177 163 171 217 _ 126 161 191 ♀Residente (D) 223 226 167 197 202 208 188 191 167 169 167 177 223 226 170 174 122 128 152 157 163 175

♂ Pai 232 165 204 169 155 163 217 172 113 167 181 ♀Invasora (S) 221 229 177 179 193 198 175 177 157 163 169 171 219 221 168 174 126 130 161 165 175 191

♂ Pai 223 181 195 171 161 174 226 181 128 157 169

- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.

Anexos | 172

Anexo XXXVI. Ninho 11/Família 37 (N11FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179

♂ 223 191 204 161 161 173 221 170 126 165 177

♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179

♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179

♂ 223 191 204 161 161 171 221 170 126 165 177

♂ 219 177 195 191 163 171 217 176 122 155 177

♂ 219 177 195 191 163 171 217 176 122 155 177

♂ 219 177 195 191 163 171 217 174 122 155 177

♀ 219 223 167 179 198 193 165 161 163 165 171 171 229 226 176 188 126 128 161 157 177 191 ♀Residente (D) 211 223 165 191 193 204 161 168 159 161 173 182 221 226 172 170 118 126 152 165 169 177

♂ Pai 229 167 198 171 169 175 223 176 120 161 179 ♀Invasora (S) 219 221 167 177 195 198 165 191 163 171 171 177 217 229 174 176 126 122 155 161 177 181

♂ Pai 223 179 193 161 165 171 226 188 128 157 191


Anexos | 173

Anexo XXXVIII. Ninho 12/Família 38 (N12FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 229 221 167 165 206 201 188 177 169 159 157 153 221 226 170 170 130 126 165 165 167 181

♂ 229 167 208 191 169 157 221 170 130 165 167

♀ 229 221 167 165 206 201 191 177 169 159 151 153 221 226 170 170 122 126 165 165 171 181

♀ 235 221 167 165 206 201 191 177 169 159 151 153 223 226 170 170 122 126 165 165 167 181

♂ 223 177 198 161 171 177 232 172 109 161 181

♂ 223 177 202 167 171 177 217 172 109 _ 181 ♀ 223 219 177 171 202 195 161 163 169 165 177 161 217 235 182 185 109 113 161 151 191 175

♀Residente (D) 229 235 167 177 206 208 188 191 169 174 151 157 221 223 170 174 122 130 155 167 167 171 ♂ Pai 221 165 201 177 159 153 226 170 126 165 181

♀Invasora (S) 217 223 163 177 198 202 161 167 169 171 177 177 217 232 172 182 109 111 161 161 181 191 ♂ Pai 219 171 195 163 165 161 235 185 113 151 175


Anexos | 174

Anexo XXXIX. Ninho 12/Família 39 (N12FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 226 232 191 165 202 208 188 177 167 171 149 151 232 223 172 174 124 128 165 155 171 177

♂ 219 191 202 175 167 157 232 172 124 165 171

♀ 219 232 195 165 206 208 175 177 161 171 157 151 232 223 176 174 130 128 165 155 175 177

♀ 219 232 191 165 202 208 175 177 161 171 157 151 232 223 176 174 124 128 197 155 175 177

♂ 221 _ 193 _ 161 180 221 182 120 155 179

♂ 221 177 193 153 163 180 217 188 122 157 179

♂ 229 177 193 153 163 173 221 182 122 157 191

♀ 229 235 177 181 198 195 155 157 163 174 180 153 217 229 182 186 120 118 157 161 179 175 ♀Residente (D) 219 226 191 195 202 206 175 188 161 167 149 157 217 232 172 176 124 130 165 197 171 175

♂ Pai 232 165 208 177 171 151 223 174 128 155 177 ♀Invasora (S) 221 229 177 179 193 198 153 155 161 163 173 180 217 221 182 188 120 122 155 157 179 191

♂ Pai 235 181 195 157 174 153 229 185 118 161 175


Anexos | 175

Anexo XL. Ninho 13/Família 40 (N13FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 223 226 167 179 195 211 177 188 163 174 173 175 221 223 174 172 118 126 191 197 167 171

♀ 223 226 167 179 201 211 177 188 163 174 173 175 221 223 174 172 124 126 191 197 167 171

♂ 223 165 201 177 163 _ 217 174 124 193 175

♀ 232 226 167 179 201 211 191 188 163 174 173 175 221 223 166 172 _ _ 191 197 167 171

♂ 232 165 201 191 169 173 217 172 126 193 167

♂ 219 177 202 167 155 171 226 172 122 161 179

♂ 219 177 209 167 155 171 226 172 122 161 191

♀ 217 223 183 165 209 204 173 165 159 167 171 171 229 229 176 182 122 130 179 165 191 181

♀ 219 223 177 165 202 204 167 165 155 167 171 171 229 229 176 182 128 130 161 165 191 181 ♀Residente (D) 223 232 165 167 195 201 177 191 163 169 173 182 217 221 166 174 118 124 191 193 167 175

♂ Pai 226 179 211 188 174 175 223 172 126 197 171 ♀Invasora (S) 217 219 177 183 202 209 167 173 155 159 171 177 229 226 172 176 128 122 161 179 179 191

♂ Pai 223 165 204 165 167 171 229 182 130 165 181


Anexos | 176

Anexo XLI. Ninho 14/Família 41 (N14FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 211 219 197 193 211 209 165 173 169 171 151 151 223 232 166 170 118 130 155 152 181 171

♂ 211 197 211 165 169 151 235 232 166 124 155 181

♀ 211 219 195 193 201 209 165 173 174 171 163 151 223 232 172 170 118 130 157 152 _ _

♀ 211 219 197 193 201 209 149 173 169 171 163 151 223 232 170 170 118 130 157 152 191 171

♂ 223 183 198 167 174 171 _ 176 126 195 179

♂ 221 189 193 167 174 171 221 176 126 193 181

♀ 221 226 189 181 193 195 159 161 174 167 177 179 221 217 176 185 126 120 193 167 181 177 ♀Residente (D) 211 217 195 197 201 211 149 165 169 174 151 163 223 235 166 172 118 124 155 157 181 191

♂ Pai 219 193 209 173 171 151 232 170 130 152 171 ♀Invasora (S) 221 223 183 189 198 193 159 167 161 174 171 177 221 232 176 179 126 126 193 195 179 181

♂ Pai 226 181 195 161 167 179 217 185 120 167 177


Anexos | 177

Anexo XLII. Ninho 14/Família 42 (N14FR3) – Teceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole (monoandria).


♀ 211 235 181 183 209 202 167 155 169 159 173 180 226 221 176 174 126 109 157 167 181 171

♀ 211 235 181 183 209 202 167 155 169 159 177 180 226 221 182 174 126 109 157 167 130 109

♂ 229 181 209 151 163 177 226 _ 130 165 181

♀ 211 235 183 183 211 202 151 155 163 159 173 180 226 221 182 174 130 109 165 167 179 171

♀ 211 235 181 183 211 202 167 155 169 159 177 180 226 221 182 174 130 109 157 167 179 171

♂ 211 181 209 167 161 173 226 188 130 157 179

♂ 221 179 201 149 161 153 219 177 109 157 161

♂ 221 179 198 149 161 153 _ 168 109 165 _

♀ 221 223 179 191 198 204 159 151 171 167 157 151 229 226 168 179 118 126 165 167 157 169

♀ 221 223 189 191 198 204 149 151 171 167 157 151 229 226 177 179 118 126 157 167 157 169 ♀Residente (D) 211 229 181 189 209 211 151 167 163 169 173 177 226 232 182 188 122 130 179 191 179 181

♂ Pai 235 183 202 155 159 180 221 174 109 193 171 ♀Invasora (S) 221 221 179 189 198 201 149 159 161 171 153 157 219 229 168 177 109 118 157 165 157 161

♂ Pai 223 191 204 151 167 151 226 179 126 167 169


Anexos | 178

Anexo XLIII. Sumários dos valores da medida de assimetria reprodutiva gerados por família de reativação (n = 30) pelo programa Skew Calculator 2003 para oito índices de assimetria. O índice considerado nas análises deste estudo foi o índice B (Nonacs 2003).

Anexos | 179

Anexo XLIV. Manuscrito submetido a Animal Behaviour em Jan/2015: ANBEH-D-15-00021.

Reproductive regulation in an orchid bee: social context, fertility and chemical signaling

Aline Candida Ribeiro Andrade e Silvaa, Fábio Santos Nascimentoa, aLaboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais - Departamento de Biologia - FFCLRP – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil Correspondence: Aline Candida Ribeiro Andrade Silva ([email protected]) or Fábio Santos do Nascimento ([email protected]), Laboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais - Departamento de Biologia - FFCLRP – Universidade de São Paulo - Av. Bandeirantes, 3900, CEP. 14040-901 Ribeirão Preto - SP, Brasil.

Highlights

• We investigated the regulatory mechanisms of social behaviour in Euglossa melanotricha.

• We tested how reproductive dominance is established and maintained.

• Aggression affected the egg laying behaviour of subordinates, but did not inhibit their ovarian

development.

• Our results demonstrated clear benefits of the division of labor between females.

• The variation in the cuticular chemical profile reflected the social status of the females.

In social insects, the communication of social status helps individuals to evaluate each other’s

reproductive potential, thus reducing conflict. Queens communicate their status through chemical

signals and the responses of workers to these signals include the suppression of ovarian activation. In

most species of primitively social insects, dominant individuals indicate their status through

aggressive behaviour, which also inhibits reproduction in workers. In some species, which lack queen-

worker dimorphism, chemical signaling may act synergistically with agonistic interactions to establish

the division of labor between females. Here, we investigated which mechanisms are involved in

reproductive regulation in the orchid bee Euglossa melanotricha. Our long-term observations showed

that dominant females monopolized egg laying and were able to recognize the eggs of subordinates.

The overt aggression towards subordinates affected the egg laying behaviour of these females but did

not inhibit their ovarian development. We showed that dominants maintained their monopoly on

reproduction even after their experimental removal. When subordinates were removed, the

productivity of the nest was reduced significantly, indicating clear benefits of the division of labor

between females. We then analyzed the chemical cuticular profile of the females and showed that the

variation in the composition of hydrocarbons reflected the social status of the different individuals in

Euglossa melanotricha. The results of this study suggest that chemical signals evolved as honest

signals and workers restrain themselves to reproduce. This reduces reproductive options but increases

selection pressures on the workers to obtain indirect fitness.

Keywords: dominance behaviour, chemical signalling, status reproductive, Euglossa melanotricha,

social evolution.

Anexos | 180

The evolution of fertility signals in social species with reproductive division of labor provides a

mechanism for group members to evaluate an individual’s reproductive status (Smith, Hölldobler &

Liebig, 2009). In social insects, for example, the process by which the presence of a productive

breeder affects the behaviour of other group members has been previously described (Liebig, 2010;

Nunes et al., 2014). These studies have demonstrated that honest signaling among competing

individuals can increase colony fitness. However, conflicts are known to be more likely when rivals

are reproductively equivalent (Ratnieks, Foster & Wenseleers, 2006). Conflict can be expressed

through physical dominance, which is a fundamental aspect of the establishment of the division of

labor between breeders and non-breeders (Liebig, Peeters & Hölldobler, 1999). On the other hand,

overt dominance is potentially deleterious because individuals involved in agonistic interactions may

be less productive than non-competing ones (Gobin & Ito, 2003; Zanette et al., 2012).

In social insects, cuticular hydrocarbons (CHCs) constitute the main source of the signals used for

communication and chemical recognition (Blomquist & Bagnères, 2010). The occurrence of specific

chemical compounds on the cuticule, which can be used for communication of the activation of the

ovaries or social status have been reported in several studies (Nunes et al 2014; Teseo, Kronauer,

Jaisson & Cháline, 2013). Reproductive signaling is particularly important when a group of totipotent

fertile females dispute dominance (Zanette & Field, 2009). Empirical evidence indicates that the

unidirectional nature of the dominance hierarchy in primitively eusocial hymenopterans evolved from

the coercion and secondarily through odor recognition (e.g. Polistes, Downing & Jeanne, 1985;

Ropalidia, Premnath, Sinha & Gadagkar, 1996; Dinoponera, Monnin & Peeters, 1999; Bombus,

Amsalem & Hefetz, 2010).

According to the honest signal hypothesis, the odors emitted by reproductive females advertise

both mating status and fertility (Keller & Nonacs, 1993), and the response of the other members of the

group may be proportional to the reproductive status of the queen (Evison, Ferreira, d’Ettorre,

Fresneau & Poteaux, 2012). The etho-physiological effects of putative queen pheromones have been

demonstrated in workers of some species of ants, bees, and wasps (Holman, Jørgensen, Nielsen &

d’Ettorre, 2010; Nunes et al., 2014; van Oystaeyen et al., 2014; van Zweden, Bonckaert, Wenseleers &

d’Ettorre, 2014). Recent evidence also indicates that the cuticular hydrocarbons of the queen

Anexos | 181

pheromone are conserved over a range of eusocial taxa, suggesting that the fertility associated signals

is an ancestral trait, and was probably present in the ancestral solitary insects that gave rise to the

social insects (van Oystaeyen et al., 2014).

The orchid bees (tribe Euglossini) are considered a key group for the understanding of the

evolution of eusociality in the corbiculates (Apini + Meliponini + Bombini), because they present

from solitary, communal to primitively eusocial species (Augusto & Garófalo 2010; Cocom Pech,

May-Itza, Medina Medina & Quezada-Euan, 2008; Soucy, Giray & Roubik, 2003; Cardinal &

Danforth, 2011). Previous studies have speculated that solitary behaviour in the orchid bees would be

an evolutionary reversion, with some Euglossa species retaining some eusocial traits (Cameron 2003,

Cardinal et al., 2010). Other reports, however, state that eusociality was inherited from an eusocial

ancestor to all corbiculates (Zucchi, Sakagami & Camargo, 1969; Chavarría & Carpenter, 1994; Noll,

2002, Canevazzi & Noll, 2014). Therefore, the study of behavioural biology of orchid bees can

illuminate the interpretations of the evolution of eusociality in corbiculate bees.

Despite the existence of an extensive database for bumblebees (Ayasse et al., 1999), honeybees

(Wossler & Crewe, 1999) and stingless bees (Nunes et al., 2014), no evidence is available on the

possible chemical modulation of social relationships in bees of the genus Euglossa. In this study, we

investigated which factors contribute to the social structure of the nest of an orchid bee, Euglossa

melanotricha. We tested how reproductive dominance is established and maintained in these simple

societies. We predicted that, as in other primitively eusocial species, overt aggression towards

subordinate individuals affected egg laying behaviour of these females but did not inhibit their ovarian

development. In addition, we verified using a series of removal experiments whether dominant status

of individuals were reflected by their cuticular chemical profile.

METHODS

Life history

Euglossa melanotricha is a medium-sized bee (body length 13 mm) commonly found in open areas of

savanna habitat in Brazil and Bolivia (Nemésio, 2009). Solitary females found new nests, or females

Anexos | 182

can reuse an old nest, resulting in multi-female nests. Reused nests are occupied by two to five

females. All females can potentially mate and lay eggs, although only one female becomes the main

reproductive dominant (Andrade-Silva & Nascimento, 2012). A process of nest reuse (R) is initiated

when two newly emerged females remain in their natal nest and one begins to reproduce in it. The

duration of the reuse process (from when the new females started foraging for resin to their final

oviposition) ranged from 18 to 79 days (mean±SD: 46.4±14.9 days, N = 30 nests). Following reuse,

the females remained in the nest without engaging in any further outside activities. This period of

inactivity lasted from 15 to 63 days (mean±SD: 34.11±11.7 days). To control the number of females in

each reused nest, we removed the females during this period of inactivity, and waited for the next nest

reuse after emergence of new females.

Nests, bees and observation procedures

Fourteen multi female nests of E. melanotricha were housed in wooden boxes (12 x 10 x 8 cm)

covered with a glass lid. Each box had a circular opening of 1 cm in diameter that allowed the bees to

fly freely, following the same transfer protocol as that adopted by Andrade-Silva and Nascimento

(2012).

The nests were observed prior to the experiments in order to identify the roles of the different

occupants. From each nest, the observation sessions followed methods: all-events records in which we

recorded every performance of a selected set of behaviours by every individual and focal individual to

record the behavioural state of each individual. Both methods followed the same schedule: three times

a week during January 2013 and April 2013.

We registered behaviour continuously through a combination of digital video footage captured

using mini-cameras (Citrox 5001 color digital day/night). The cameras were positioned on the top of

glass lid, approximately 15 cm above the cells. We marked all bees on each nest with unique spots of

quick drying non-toxic colored paint (Magic®) on their thorax for individual identification.

Anexos | 183

During the course of study, we observed 12 nest invasions by foreign females. So, the distinct

groups of females – resident dominant vs subordinates, dominant invaders vs subordinate – were

analyzed separately.

We used the data for the focal individuals to compute the proportion of time spent by each bee in a

number of common behaviours, and data from all the events sessions to calculate the hourly rates of

the less common behaviours. We focused on the following behaviours:

(1) Dominance: ten pairs of females with a stable reproductive structure (i.e. one individual had

been dominant for several weeks) were videotaped for 24 h continuously (240 days; 5760 hours; LD

12:12 h). We focused on the performance of the dominant female, including behaviours as attacking

(overt unidirectional act in which the dominant bites or pulls the antennae, legs or wings of a

subordinate), heading (dominant bumps her head toward the subordinate’s abdomen), overflying

(short threaten flights on the subordinate without direct contact) and pursuing (dominant runs toward

the subordinates pushing her from the cells), and cannibalism of the subordinate’s eggs. We computed

the rates of dominant acts for each bee, after correcting for the proportion of time spent by bees at their

nests, on the given day. Results were analyzed using with Wilcoxon’s exact test.

(2) Non-dominance or non-aggressive behaviour: involved the active components of non-dominant

interactions of the pair, that is, antennating and approaching (dominant follows or touches the

subordinate without removing her from the cells). We computed the rates of non-dominance

interactions for each bee as evaluated to dominance behaviours.

(3) Subordinate behaviour: female hides under part of cells or escape to avoid confront.

(4) Other activities: the proportion of time that a bee engaged in activities such as foraging trips or

remained inside the nest engaging in activities such as resting (female stays motionless inside the

nest), self-grooming (both dominant and subordinate clean legs, antennae and wings), and cell

provisioning for egg laying (subordinates build a collar with resin on the edge of a food provisioned

cell, then she performs circular movements along the cell with the head and forelegs inside it, and

middle and hindlegs molding the cell shape).

Anexos | 184

Ethical note

We used 108 females in this study, 30 dominants, 30 subordinates, 12 invaders and 36

additional females removed during the experiments. Research was carried out under permission of

IBAMA (license number 19575).

Removal experiment 1: dominant individuals

We conducted the experimental sessions in five repetitions for each time interval (N = 10 nests; Table

A1 Supplementary material) between May 2013 and October 2013. Each repetition focused on a new

process of nest reuse, following the emergence of two new females. We manipulated the number of

females, so that only two were monitored in each experiment. In this case, females that emerged from

the nest after the identification of the resident pair of individuals were removed from the experiment

(one to three females per trial).

In each nest, the experimental sessions were conducted over three days, between 6 h and 18 h. On

the first day, we observed the nests as described above, without any manipulation. Ten of the 14 nests

had at least two newly emerged females during the monitoring.

From each nest, we removed the dominant on the second day morning, between 0500 h to 0600 h,

and observed the nest on that day, as described above. The dominant removed were maintained in

individual cages (size 3 plastic hair curlers, 2.8 x 6.3 cm). Each cage was provisioned with cotton

wool soaked in a 40% honey water solution in a 2 ml plastic tube. The dominants were reintroduced to

their nests in intervals that range between 12 to 72 hours.

We removed dominants to verify (1) the effects of their presence on the reproductive activity of

the subordinates and (2) recognition and cannibalism of the subordinates’ eggs after dominants’

reintroduction.

Removal experiment 2: subordinate individuals

Following the same procedure used for the removal of dominant individuals (Table A2,

Supplementary material) we conducted the experimental sessions in which the subordinate individual

Anexos | 185

was removed from ten nests, with five trials for each time interval. As described previously for the

dominant removal experiment, we initiated these experiments using pairs of reproductive females that

had restarted a nest. These experiments were conducted between November 2013 and April 2014.

After verifying the hierarchical order of the pair, we removed the subordinates permanently from each

nest to evaluate the effect of the presence of helpers on the productivity of the dominant females. To

evaluate the effect of the absence of the subordinate on productivity, we compared egg laying rates

before and after removal of the subordinate from each nest using a paired Wilcoxon test.

Ovarian development, mating status, and body size

We recorded during observation time of nests, twelve invasions by females that were successful to

replace dominant position. To evaluate whether body size conferred an advantage for invading

females, the body size of residents and invaders was measured and compared. For this, each individual

was placed in a metal restraining device covered with a glass plate. The intertegular distance of all the

individuals was measured from the photographs taken by a digital camera coupled to a Leica MZ16

stereomicroscope, using Leica Soft IM50 software. For the analysis, only the intertegular distance was

considered, as this is a standard parameter used in studies of Bombus (Couvillon, Fitzpatrick &

Dornhaus, 2010; Goulson et al., 2002) and solitary species (Cane, 1987).

Later, we euthanized bees by freezing them and carefully removed the ovaries from the resident

individuals in each nest in ringer solution and photographed the material under stereomicroscope. The

contents of the ovaries were quantified by counting the number of oocytes that were larger than 70%

the length of a mature egg (LME), and mature oocyte length (not including the adjoining trophocyte

chamber) was measured. The spermatheca was removed and placed on a slide in a 1:1 solution of

glycerin and alcohol (70%) for analysis of the contents.

Chemical analyses

The CHCs of each individual were sampled with a Supelco 7-µmpolydimethylsiloxane fiber, designed to

extract compounds of high molecular weight. Following the current rules for solid phase micro extractions

Anexos | 186

(SMPE) quantification (Romeo, 2009), we used the same conditions and a single fiber to analyze the

compounds from each individual. The bees were first anesthetized for five minutes in a refrigerator (4°C) until

complete immobilization. The fiber was carefully rubbed against the thorax and abdomen for 2 min, and then

desorbed in the injection port of a gas chromatograph for 4 min. Each sample was analyzed by gas

chromatography (GC) associated with mass spectrometry (MS) (SHIMADZU, model QP2010plus, Tokyo,

Japan). The apparatus was equipped with a DB-5MS capillary column, using helium as the carrier gas. The

temperature protocol was 150–280°C at a rate of 3°C/min (held for 15 min), and then raised to 300°C at

5°C/min and held for 15 min. Analyses were conducted in splitless mode, and individual mass spectra were

compared with Wiley library data (McLafferty, 2000) or standard synthetic compounds (n-C25 to n-C29,

Sigma-Aldrich). The double-bond positions of the alkenes were identified through the derivatization of the

hexane extracts obtained from five individuals of each group, based on the procedure described by Carlson,

Roan, Yost & Hector (1989).

Statistical analyses

We compared behavioural and physiology variables by using general linear mixed models,

GLMMs (Bolker et al., 2009). We first ran a GLMM to verify whether the level of aggression,

measured by the rate of aggressive behaviours per observed period, was influenced by reproductive

role, body size and/or ovarian development. We then tested whether egg cannibalism was also

regulated by dominance or body size. Each treatment was specified as the fixed effect, and the identity

of the nest as a random effect (Neter, Kutner, Wasserman, Nachtseim & Neter, 1996).

For the chemical analyses, principal components analysis (PCA) was used to identify the main

compound peaks for comparison. Compounds contributing less than 5 % to the first two PCA factors

were excluded from the statistical analysis. The relative concentrations of the compounds used in the

discriminant analysis were then readjusted to 100%. A stepwise forward discriminant analysis was

used to observe whether combinations of variables were characteristic of a given group of females. To

avoid errors in the compositional sample data, the area of each peak was transformed by the following

formula: Z = ln [Ap/g(Ap)], where Ap is the area of the peak, g (Ap) is the geometric mean for each

Anexos | 187

individual compound group, and Z is the transformed peak area (Aitchinson, 1986). All analyses were

run in Statistica 10.0 (Statsoft, Tulsa).

RESULTS

Dominance contests

During the 240 days of monitoring of the dominant/subordinate relationships, we recorded a total of

3965 agonistic events (a mean of 33.04 ± 30.57 per nest, N = 14 nests), which allowed us to determine

the hierarchical rank of the bees successfully. Significant unidirectional dominance was recorded in all

nests (Table A1 Supplementary material), in other words, only one individual in each nest presented

agonistic behaviour. Of the total number of events recorded, 2541 (64%) were classified as non-

aggressive and 1424 (36%) as aggressive or involving dominance (Table A1 Supplementary material).

The GLMM indicated that these hostile acts were typically mediated by the relative reproductive

roles of the females in the nests (F1, 59 = 237.66; p< 0.0001), rather than body size (F1, 59 = 0.94; p =

0.34) or ovarian development (F1, 59 = 0.15; p = 0.69). Aggressive encounters consisted in biting in

40% of events (296 of 745), pushing in 24% (182 of 745), overflying in 19% (138 of 745), and pursuit

in 17% (129 out of 745) of the recorded events.

The dominant females rarely interrupted egg laying by subordinates (18 of 463 laying events

(Table 1). The behavioural dominance, after egg laying by subordinate was followed by active

cannibalism eggs instead (185 out of 252; 73% of ovipositions). The GLMM also confirmed that

cannibalism of eggs could be predicted by dominance position (F1, 165 = 6.62; p< 0.05), rather than

body size (F1, 59 = 0.27, p = 0.60) or ovarian development (F1, 59 = 0.65; p = 0.42). The duration of

cannibalism eggs ranged from 758 s to 1301 s (mean± standard deviation = 999.00 ± 140.70 s; N =

65), and the events were invariably followed by egg-laying by the dominant female.

In 12 event invasions, one per nest, five invader females were significantly larger that dominant

residents; such invaders were able to overthrow reproductive dominance successfully (SI = successful

females, Figure 1). The other seven invaders females of the twelve had no difference of size from

Anexos | 188

dominant residents and remained in the nest performing subordinate activities (Unsuccessful invaders

= UI).

Ovarian development (LME) was greater in SI invaders (mean± standard deviation =

3.77±0.33mm) in comparison with resident dominant (RD: mean± standard deviation = 2.37 ± 0.21

mm; SI vs RD: t = 7.64, p<0.0001) but, dominant residents had no longer ovarioles than subordinates

did (S: mean±standard deviation = 2.25 ± 0.18 mm; RD vs Subordinates: t = 1.57, p = 0.12). Analyses

of the spermatheca of different individuals revealed that all females were inseminated.

Removal experiment 1: dominant individuals

Dominants that were removed for less than 36 h were able to recognize the cells containing the eggs of

subordinates in all nests (15 out 15 laid eggs in the period). In this case, after opening a cell and

ingesting the subordinate’s egg, the dominant female immediately laid her own egg in the cell.

However, females returning after periods longer than 36 h did not ingest the eggs laid by subordinates

and also were replaced by their former subordinates. The females that were replaced abandoned the

nest on average two days after the reintroduction (see Table A2 Supplementary material).

Removal experiment 2: subordinate individuals

In the absence of the subordinate, dominants began cell provisioning, but mean productivity was

significantly lower (4.8 ± 1.19 provisioned cells) than when the subordinates were present (8.4±1.97

provisioned cells: Wilcoxon rank sum test: T = 3, Z = 2.82, p = 0.002, N = 10 nests). Foraging trips

were restarted by dominants in the absence of subordinates (0.0 trips/h to 2.03±0.45 trips/h, N = 10

nests).

CHC profiles and social status

The analysis of the cuticular hydrocarbons revealed 63 peaks. Hydrocarbon chains varied from C20 to

C38. Linear alkanes were the most abundant compounds followed by alkenes, and mono- and

Anexos | 189

dimethyl-alkanes (Table A3 Supplementary material). The proportion of major compounds varied

significantly among the groups of analyzed females (n-alkanes: F1,104 = 139.71; p< 0.00001; alkenes:

F1,104 = 179.19; p< 0.00001; methyl-alkanes: F1,104 = 41.44; p< 0.00001; Figure 2). Dominant females

had more n-alkanes than subordinates, while subordinates presented significantly higher proportions of

alkenes and methyl-alkanes than dominants did.

Stepwise discriminant analysis separated females significantly by group (global model: Wilks’s λ

= 0.0297; F15,36 = 42.17; p < 0.00001; Fig. 3). The principal compounds separating the groups were n-

tricosane, 5-pentacosane, n-pentacosane, 5-methylpentacosane, n-hexacosane, 9-heptacosene, n-

heptacosane, 13- 11- 9-methylheptacosane, 9-nonacosene, n-nonacosane, and n-hetriacontane (Table

2). The classification matrix allocated 92.3% of the individuals tested to their predicted functional

roles (Table 3).

DISCUSSION

Reproductive dominance

In this study, the main results showed that dominant Euglossa melanotricha females monopolize

reproduction by coercion and egg oophagy. The occurrence of coercion in some Euglossa species is

expected because colonies are established by associations of two or three females, and also, that

competition between potential breeders is expected to occur in small societies, when egg laying by

competing females is likely. Thus, in terms of reproductive benefits, dominants would be selected to

recognize and remove the eggs of subordinates, given that they are more closely related to their own

brood (r = 0.5) than to those of a full sister (r = 0.375) or daughter, r = 0.25 (Ratnieks, Foster &

Wenseleers, 2006).

Dominance in E. melanotricha is expressed through direct aggression and active egg oophagy.

Interestingly, these behavioural traits clearly defined the division of labor and hierarchy between

breeders and non-breeders, although their outcomes did not affect the activation of the ovaries of the

subordinates. Founding colonies of primitively eusocial wasps usually present high rates of aggressive

interactions which result in one of the foundresses becoming the breeding queen, while reproduction

Anexos | 190

in the workers is suppressed physiologically (Reeve & Gamboa, 1983, 1987). In bees, substitution by

one of the older subordinates has been observed following the death or disappearance of the dominant

female in Euglossa cordata (Garófalo, 1985), Euglossa fimbriata (Augusto & Garófalo, 2009),

Evylaeus calceatus (Plateaux-Quénu, 1985), Dialictus lineatulus (Eickwort, 1986), Halictus

rubicundus (Soucy & Danforth, 2002), and Exoneura bicolor (Schwarz & O’Keefe, 1991). In fact,

conflicts are frequent between residents and invaders in Lasioglossum zephyrum, but never occur

when opponents are genetically related (Kukuk, Breed, Sobti & Bell, 1977). In Xylocopa sulcatipes,

reproductive partitioning among unrelated females involves coercion and egg policing by the

dominant female (Stark, Hefetz, Gerling & Velthuis, 1990). In other primitively eusocial species, such

as Lasioglossum villosulus, dominance disputes are common during the development of the nest, and

egg oophagy may be undertaken by the dominant and the subordinates (Plateaux-Quénu, 1989).

Dominant females that were removed from the nest between 12 and 36 h were subsequently able

to recognize the eggs of subordinates and eat them. This indicates that these incoming females did

regain their reproductive dominance. However, subordinates were more likely to take over the nest

when the dominant females were absent for longer than 36 h. These results demonstrated that the

presence of a dominant female might inhibit both direct reproduction and changes of chemical

hydrocarbon profiles of subordinates. Also, the removal of the subordinate affected dominants’

behavioural activities and nest productivity. Indeed, nest productivity, as measured by the number of

provisioned cells, was significantly reduced when the subordinates were removed from the nest,

indicating clear benefits of the division of labor between breeders and non-breeders. A number of

previous studies have shown that solitary nesting is adaptive only when reproductive incentives for

subordinates are greater than the potential of inheriting the dominant position in the natal nest (Reeve

& Gamboa, 1983).

In E. melanotricha, reproductive dominance did not suppress ovarian activity in the subordinates.

Therefore, while chemical signaling in this species is a reflection of social status, it is not linked to

insemination or ovary activation. Our data clearly showed that dominant females present higher

proportions of n-alkanes than subordinates. The effects of the social environment on the cuticular

Anexos | 191

profiles are particularly interesting here, given the apparently significant role of alkanes in suppressing

ovary activation in other bees (see van Oystaeyen et al., 2014).

The predominant compounds in the cuticle profile of the E. melanotricha females have also been

shown related to dominance in polistine wasps (Polistes fuscatus: Espelie et al., 1994; P. dominulus:

Bonavita-Cougourdan et al., 1991; Polistes dominula: Dapporto, Dani & Turillazzi, 2007; Polistes

satan: Tannure-Nascimento et al., 2008), bumblebees (Bombus terrestris: Sramkova et al., 2008) and

ponerine ants, in which the dominance hierarchy may be established before the development of the

reproductive signal (Cuvillier-Hot, Lenoir, Crewe, Malosse & Peeters, 2004). If chemical compounds

convey social status honestly, as in other insects, the potential risks of fighting could be reduced to

maintain the hierarchy of dominance (Monnin, 2006; Zanette et al., 2012).

Implications for the evolution of eusociality in orchid bees

Previous studies suggest that euglossine bees are predominantly solitary or communal, with only a few

species presenting rudimentary eusociality (reviewed in Cameron, 2004 and Dressler, 1982).

However, recent phylogenies indicate that eusociality evolved only once in the common ancestor of

the corbiculate apids, and was subsequently lost in the orchid bees (Cardinal & Danforth, 2011;

Canevazzi & Noll, 2014). The results of the present study provide new insights, and indicate that

elements of eusociality are well-defined in some euglossine bee species. For example, strong

correlation between cuticular profiles and the reproductive status of females have been demonstrated

in many eusocial Hymenoptera (reviewed in Liebig, 2010). However, in this study we showed that this

relationship in Euglossa melanotricha seems to be only partially evolved. Our data support that

dominance hierarchy was primarily established through behaviour, and then reinforced chemically.

Indeed, cuticular hydrocarbons mirror their social ranking, not a result of ovarian activation or its

regression. However, CHCs seem to be effective in keeping the reproductive dominance even in such

a kind of society as we observed in our removal experiments. These aspects of the results suggest that

the organization of typical simple societies such as Euglossa bees can be modulated by more complex

traits such as in advanced social insects.

Anexos | 192

Acknowledgements

The authors thank to Nicolas Châline, Editor Michelle Scott and two anonymous referees for their

important suggestions and improvements on the manuscript. We also thank I.C.C. Turatti for technical

assistance in chemical analyses, Sidnei Mateus for dissections, and Daniel Kronauer and Abraham

Hefetz for inspiring discussions on the study. This study was supported by FAPESP (ACRAS Proc.

2010/19490-0 and FSN Proc. 2010/10027-5).

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Anexos | 194

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Anexos | 195

Table 1 Number of ovipositions by subordinates that were completed or interrupted as a result of aggression by the dominant female.

Number of ovipositions associated with: Aggressions by the dominant Nest Reuse Number of ovipositions Oviposition interrupteda (%) Oviposition completed (%)

N1R1 12 0 12 N1R2 7 0 7 N2R1 9 0 9 N2R2 8 0 8 N2R3 7 2 5 N3R1 7 4 3 N4R1 9 0 9 N5R1 5 0 5 N6R1 6 0 6 N6R2 8 1 8 N6R3 8 0 8 N6R4 11 0 11 N7R1 7 0 7 N7R2 7 0 7 N7R3 12 0 12 N8R1 8 3 5 N8R2 7 2 5 N9R1 8 1 7 N9R2 8 0 8 N10R1 13 0 13 N10R2 12 0 12 N10R3 12 0 12 N10R4 9 0 9 N11R1 8 0 8 N11R3 9 0 9 N12R2 7 1 6 N12R3 7 1 6 N13R2 7 1 6 N14R2 7 1 6 N14R3 7 1 6 Total 252 18 234 aOviposition was stopped prematurely as evidenced by the immediate retraction of the subordinate’s abdomen from cell; no egg could ever be found inside these cells at subsequent checks of the combs

Anexos | 196

Table 2 Relative proportion (mean±s.d.) of the 11 peaks selected by discriminant analysis among dominant, dominant invader and subordinate Euglossa melanotricha females. Code KI Compounds Invader (SI= 5) Dominant (N=30) Subordinate (N=30) a10 2300 Tricosane C23 8.63 ± 1.44 6.03 ± 2.26 3.79 ± 2.00 b7 2485 5-Pentacosene C25 6.32 ± 0.15 10.00 ± 3.61 5.46 ± 1.91 c4 2500 Pentacosane C25 16.67 ± 0.15 9.66 ± 4.67 0.67 ± 0.54 d2 2541 5-Methyl C25 0.08 ± 0.03 0.05 ± 0.05 1.33 ± 0.67 e1 2600 Hexacosane C26 2.49 ± 0.20 2.45 ± 0.47 4.26 ± 2.79 f6 2670 9- Heptacosene C27 3.12 ± 1.29 3.07 ± 0.99 5.25 ± 2.02 g3 2700 Heptacosane C27 6.10 ± 0.28 2.99 ± 1.65 0.79 ± 0.35 h11 2727 13-; 11-; 9-Methyl C27 0.52 ± 0.11 0.62 ± 1.32 0.88 ± 0.66 i9 2876 9-Nonacosene C29 6.63 ± 0.56 7.90 ± 1.84 0.24 ± 0.04 j5 2900 Nonacosane C29 5.28 ± 0.49 3.31 ± 1.65 1.96 ± 1.88 k8 3100 Hentriacontane C31 0.57 ± 0.06 0.53 ± 0.35 1.32 ± 1.78 1-13The superscript numbers in the codes of the peaks correspond to the ranking of hydrocarbons found by stepwise discriminant analysis of females. The prominent peaks in bold were those who contributed significantly to discriminate between dominant and subordinate females. KI – Kovats index.

Anexos | 197

Table 3 Discriminant analysis of the cuticular chemical compounds recorded in the groups of successful invaders, resident dominants and subordinates Euglossa melanotricha females.

Association between groups of females Mahalanobis distance F p Invader x dominant 8.06 3.63 p < 0.00001 Invader x subordinate 43.76 18.82 p < 0.00001 Dominant x subordinate 29.91 16.83 p < 0.00001

Anexos | 198

Figure 1. Body size (Mean ±SD) of successful invader (SI, N=5), unsuccessful invader (UI, N=7) and resident dominant (RD, N= 12) females in the nests of Euglossa melanotricha. SI x UI: 14.95, p<0.0001, SI x RD: t = 16.85, p<0.0001, UI x RD: t = 1.35, p=0.19

1 mm

SI UI RD3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

Inte

rtegu

lar d

ista

nce

(mm

)

Anexos | 199

Invader + Dominant Subordinate-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Prop

ortio

n of

com

poun

ds (M

ean

± SD

)

Alkane Alkene Methyl-branched

Figure 2. Relative proportion of n-alkanes, alkenes, and methyl-branched between SI invader + dominants and subordinates females of Euglossa melanotricha. N = 30 dominants, 30 subordinates and 5 invaders. Alkanes: t = 11.82, p<0.0001; Alkenes: t = 13.38, p<0.0001; Branched alkanes: t = 6.43, p<0.0001

Anexos | 200

Figure 3. Discriminant analysis based on cuticular hydrocarbon (CHC) profiles of resident dominant (N = 30), SI invader (N = 5) and subordinate (N = 30) of fourteen nests of Euglossa melanotricha. Elipses encompass 95% of data.

-15 -10 -5 0 5 10 15

Root 1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

Roo

t 2

Inv ader Dominant Subordinate

Anexos | 201

Supplementary material

Table A1 Aggressive and non-aggressive behavioural events recorded for dominant and subordinate Euglossa melanotricha females and the number of eggs cannibalized in each nest. Nest Interactions Number of eaten eggs Reuse Non-Aggressive Aggressive

Dominance status

N1R1 79 59 10 Dominant 37 0 0 Subordinate N1R2 77 74 5 Dominant 15 0 0 Subordinate N2R1 82 68 8 Dominant 21 0 0 Subordinate N2R2 64 49 7 Dominant 11 0 0 Subordinate N2R3 57 75 6 Dominant 9 0 0 Subordinate N3R1 66 59 6 Dominant 13 0 0 Subordinate N4R1 46 42 7 Dominant 14 0 0 Subordinate N5R1 69 74 5 Dominant 23 0 0 Subordinate N6R1 64 36 5 Dominant 18 0 0 Subordinate N6R2 123 77 7 Dominant 25 0 0 Subordinate N6R3 125 44 6 Dominant 31 0 0 Subordinate N6R4 117 44 5 Dominant 39 0 0 Subordinate N7R1 78 55 5 Dominant 34 0 0 Subordinate N7R2 36 26 9 Dominant 19 0 0 Subordinate N7R3 33 30 6 Dominant 12 0 0 Subordinate N8R1 114 71 5 Dominant 41 0 0 Subordinate N8R2 103 81 6 Dominant 52 0 0 Subordinate N9R1 92 71 6 Dominant 63 0 0 Subordinate N9R2 42 45 5 Dominant 16 0 0 Subordinate N10R1 41 29 4 Dominant 17 0 0 Subordinate N10R2 44 35 10 Dominant 13 0 0 Subordinate N10R3 26 24 8 Dominant 20 0 0 Subordinate N10R4 41 34 7 Dominant 16 0 0 Subordinate N11R1 49 33 5 Dominant

Anexos | 202

23 0 0 Subordinate N11R3 39 35 8 Dominant 21 0 0 Subordinate N12R2 31 35 4 Dominant 9 0 0 Subordinate N12R3 28 27 5 Dominant 11 0 0 Subordinate N13R2 24 33 4 Dominant 8 0 0 Subordinate N14R2 59 27 6 Dominant 13 0 0 Subordinate N14R3 33 32 5 Dominant

15 0 0 Subordinate Total 2541 1424 185

Anexos | 203

Table A2

Results of the removal experiments: effect of the presence of Euglossa melanotricha dominant females on the interactions that occurred after their return to the ten nests.

After reintroduction:

Number of females Number of Experimental sessions trials Nest

reuse Dominant Subordinate

Time out of the nest (h)

Number of eggs eaten remained abandoned

1 N1/R1 1 1 12h 1 1 02 N2/R1 1 1 12h 1 1 03 N3/R1 1 1 12h 1 1 04 N4/R1 1 1 12h 1 1 0

1

5 N5/R1 1 1 12h 1 1 01 N6/R1 1 1 24h 1 1 02 N7/R1 1 1 24h 1 1 03 N8/R1 1 1 24h 1 1 04 N9/R1 1 1 24h 1 1 0

2

5 N10/R1 1 1 24h 1 1 01 N1/R2 1 1 36h 1 1 02 N2/R1 1 1 36h 1 1 03 N3/R2 1 1 36h 1 1 04 N4/R2 1 1 36h 1 1 0

3

5 N5/R2 1 1 36h 1 1 0 1 N6/R2 1 1 48h 0 0 1 2 N7/R2 1 1 48h 0 0 14 3 N8/R2 1 1 48h 0 0 1 4 N9/R2 1 1 48h 0 0 1 5 N10/R2 1 1 48h 0 0 1 1 N1/R3 1 1 60h 0 0 1 2 N2/R3 1 1 60h 0 0 15 3 N3/R3 1 1 60h 0 0 1 4 N4/R3 1 1 60h 0 0 1 5 N5/R3 1 1 60h 0 0 1 1 N6/R3 1 1 72h 0 0 1 2 N7/R3 1 1 72h 0 0 16 3 N8/R3 1 1 72h 0 0 1 4 N9/R3 1 1 72h 0 0 1 5 N10/R3 1 1 72h 0 0 1

Anexos | 204

Table A3

Relative proportions of cuticular hydrocarbons in resident dominant, invader (SI) and subordinate Euglossa melanotricha females. Bold letters represent the 11 peaks selected by the statistical analysis.

Dominant Invader Subordinate Nº peak KI

Compounds Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD

1 2000 Eicosane C20 0.36 ± 0.35 0.35 ± 0.26 0.44 ± 0.38 2 2091 7-Heneicosene C21 0.25 ± 0.07 0.22 ± 0.02 0.20 ± 0.07 3 2100 Heneicosane C21 0.21 ± 0.16 0.24 ± 0.03 0.37 ± 0.08 4 2200 Docosane C22 0.90 ± 0.65 0.97 ± 0.23 0.70 ± 0.68 5 2271 9- Tricosene C23 1.53 ± 0.48 1.24 ± 0.10 0.74 ± 0.04 6 2283 5- Tricosene C23 1.18 ± 0.84 1.20 ± 0.49 2.92 ± 1.64 7a 2300 Tricosane C23 6.03 ± 2.26 8.63 ± 1.44 3.79 ± 2.00 8 2374 9-Tetracosene C24 0.60 ± 0.23 0.65 ± 0.02 0.32 ± 0.05 9 2383 5-Tetracosene C24 0.78 ± 0.56 0.15 ± 0.05 0.86 ± 0.66

10 2400 Tetracosane C24 2.66 ± 0.20 2.16 ± 0.97 7.66 ± 2.48 11 2459 11-Pentacosene C25 0.15 ± 0.00 0.13 ± 0.01 2.42 ± 0.77 12 2479 7-Pentacosene C25 6.03 ± 2.08 6.24 ± 1.61 0.33 ± 0.08 13b 2485 5-Pentacosene C25 10.00 ± 3.61 6.32 ± 0.15 5.46 ± 1.91 14 2495 6,8-Dimethyl C24 _ _ 0.11 ± 0.03 15c 2500 Pentacosane C25 9.66 ± 4.67 16.67 ± 0.67 ± 0.54 16 2505 4,10- Dimethyl C24; 4.8- _ _ 0.36 ± 0.30 17 2530 13-; 11-; 9-Methyl C25 0.06 ± 0.05 0.06 ± 0.03 0.04 ± 0.04 18 2532 7-Methyl C25 0.05 ± 0.05 0.04 ± 0.04 0.04 ± 0.04 19d 2541 5-Methyl C25 0.05 ± 0.05 0.08 ± 0.03 1.33 ± 0.67 20 2552 9,13-Dimethyl C25 0.61 ± 0.56 0.59 ± 0.07 _ 21 2560 3-Methyl C25 0.91 ± 0.59 0.86 ± 0.04 0.74 ± 0.45 22 2565 9-Hexacosene C26 0.59 ± 0.42 0.58 ± 0.10 0.84 ± 0.94 23 2578 7-Hexacosene C26 0.09 ± 0.02 0.07 ± 0.02 2.27 ± 0.79 24 2585 5-Hexacosene C26 _ _ 1.45 ± 2.23 25e 2600 Hexacosane C26 2.45 ± 0.47 2.49 ± 0.20 4.26 ± 2.79 26 2603 6,8-Dimethyl C25 0.12 ± 0.06 0.10 ± 0.03 _ 27 2608 8,10-Dimethyl C25 0.13 ± 0.05 0.11 ± 0.02 _ 28 2632 12-. 10-Methyl C26 _ _ 0.19 ± 0.06 29 2643 3,5-Dimethyl C25 0.16 ± 0.23 0.13 ± 0.03 _ 30 2665 11- Heptacosene C27 _ _ 7.54 ± 3.94 31f 2670 9- Heptacosene C27 3.07 ± 0.99 3.12 ± 1.29 5.25 ± 2.02 32 2679 7- Heptacosene C27 1.62 ± 1.13 1.32 ± 0.26 3.92 ± 4.42 33 2686 5- Heptacosene C27 4.01 ± 1.24 3.70 ± 0.25 5.44 ± 3.32 34g 2700 Heptacosane C27 2.99 ± 1.65 6.10 ± 0.28 0.79 ± 0.35 35h 2727 13-; 11-; 9-Methyl C27 0.62 ± 1.32 0.52 ± 0.11 0.88 ± 0.66 36 2730 7-Methyl C27 0.04 ± 0.02 0.03 ± 0.02 0.04 ± 0.03 37 2745 5-Methyl C27 0.04 ± 0.04 0.03 ± 0.02 0.04 ± 0.03 38 2757 3-Methyl C27 2.49 ± 0.35 2.68 ± 1.11 0.31 ± 0.08 39 2765 9- Octacosene C28 0.29 ± 0.07 0.25 ± 0.33 0.48 ± 0.76 40 2678 7- Octacosene C28 0.24 ± 0.24 0.29 ± 0.08 1.66 ± 0.47 41 2800 Octacosane C28 0.56 ± 0.45 0.52 ± 0.04 0.27 ± 0.08 42 2864 11-Nonacosene C29 1.74 ± 0.42 1.47 ± 0.15 3.29 ± 2.69 43i 2876 9-Nonacosene C29 7.90 ± 1.84 6.63 ± 0.56 0.24 ± 0.04 44 2886 7-Nonacosene C29 _ _ 2.80 ± 2.26 45j 2900 Nonacosane C29 3.31 ± 1.65 5.28 ± 0.49 1.96 ± 1.88 46 2904 4,8-Dimethyl C28 _ _ 0.13 ± 0.07 47 2919 13-; 11-; 9-Methyl C29 0.27 ± 0.29 0.19 ± 0.09 0.55 ± 0.35 48 2926 7-Methyl C29 0.12 ± 0.11 0.11 ± 0.08 0.35 ± 0.27 49 2934 5-Methyl C29 0.05 ± 0.05 0.04 ± 0.03 0.04 ± 0.04

Anexos | 205

50 2958 3-Methyl C29 0.07 ± 0.06 0.05 ± 0.02 0.40 ± 0.35 51 2993 9-Triacontene C30 0.53 ± 0.35 0.35 ± 0.14 0.72 ± 0.62 52 3000 Triacontane C30 0.07 ± 0.06 0.09 ± 0.05 0.29 ± 0.30 53 3047 13- Hentriacontene C31 0.21 ± 0.03 0.20 ± 0.09 0.30 ± 0.16 54 3072 9- Hentriacontene C31 0.19 ± 0.24 0.23 ± 0.07 0.22 ± 0.14

55k 3100 Hentriacontane C31 0.53 ± 0.35 0.57 ± 0.06 1.32 ± 1.78 56 3173 3-Methyl C31 0.63 ± 0.57 0.48 ± 0.18 0.12 ± 0.11 57 3269 11-Tritriacontene C33 0.20 ± 0.16 0.21 ± 0.14 0.33 ± 0.23 58 3300 Tritriacontane C33 0.29 ± 0.32 0.20 ± 0.14 0.42 ± 0.30 59 3377 11-Tetriacontene C34 2.57 ± 0.25 2.40 ± 1.14 0.76 ± 0.70 60 3400 Tetriacontane C34 2.91 ± 0.75 2.63 ± 0.56 0.30 ± 0.01 61 3500 Pentatriacontane C35 1.52 ± 0.00 1.49 ± 0.38 0.35 ± 0.09 62 3600 Hexatriacontane C36 1.80 ± 0.00 1.69 ± 0.52 _ 63 3800 Octatriacontane C38 1.31 ± 0.00 1.39 ± 0.34 _

estrutura genética e sócio-etológica de euglossa ... · honestidade. ao dr. sidnei mateus...

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