estabilizaÇÃo do composto Óleo lubrificante … · de 1:1 e 5:1. para o experimento, foram...

ANDERSON SOARES PIRES

ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE SINTÉTICO X Salvinia sp.

CANOAS, 2007


ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE SINTÉTICO X Salvinia sp.

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas – Bacharelado como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas, sob orientação do Prof. Ms. Giovani André Piva.

CANOAS, 2007

2

TERMO DE APROVAÇÃO


ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE

SINTÉTICO X Salvinia sp.

Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, pelo

avaliador:

Prof. Ms. Giovani André Piva Unilasalle

Canoas, 13 de julho de 2007.

3

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador e amigo, Prof. Ms. Giovani André Piva pelo constante

incentivo, sempre indicando a direção a ser tomada nos momentos de maior

dificuldade. Agradeço, principalmente, pela confiança, mais uma vez depositada.

A todos os professores, funcionários, colegas e todos aqueles que, direta ou

indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho, dando-me força e

incentivo, em especial a colega Karina Minozzo.

À Agnes pelo apoio incondicional, paciência, compreensão, incentivo em todos

os momentos, e principalmente por me fazer acreditar que no final tudo dá certo.

Aos meus pais, Adão Jair S. Pires e Marinês Pires, fica a minha consideração e

reconhecimento, por serem pessoas imprescindíveis, insubstituíveis em minha vida e

por estarem sempre ao meu lado.

4

RESUMO

Com o intuito de dar uma solução para um destino “ecologicamente correto”, ao resíduo fruto da aplicação do pó da macrófita aquática Salvinia sp. em ambientes contaminados por óleo lubrificante usado (OLU), buscou-se através de biorremediação, aplicando técnica de bioenriquecimento, estimular a fixação do poluente no húmus, buscando a atoxidade do óleo no solo. Para isso, uma coleção de culturas de fungos foi elaborada atrás da cepa com maior capacidade de realizar a tarefa, meio de cultura alternativo contendo soro de queijo foi utilizado para diminuir gastos e propor uma alternativa para este efluente. O composto OLU x Salvinia sp. foi elaborado a partir da mistura do óleo com o pó de Salvinia obtido por secagem a 60 °C e posterior moagem, nas proporções de 1:1 e 5:1. Para o experimento, foram adicionados ao composto, 240 g de solo e cultivares de Pisolithus tinctorius previamente elaborados. O tratamento se realizou durante trinta dias, ao final, bioensaios com Lactuca sativa (alface) demonstraram que foi possível, através da metodologia aplicada, a estabilização da amostra contendo 10 g de óleo (ensaio 1), porém o mesmo sucesso não se obteve com 50 g de óleo (ensaio 2). Palavras-chave: bioenriquecimento, Pisolithus tinctorius, bioensaio, podridão branca.

5

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................6

2 BIORREMEDIAÇÃO......................................................................................................9

2.1 Bioenriquecimento..................................................................................................10

3 FUNGOS......................................................................................................................12

3.1 Fungos Filamentosos.............................................................................................12

3.2 Fungos de Podridão Branca...................................................................................13

3.3 Exigências nutricionais..........................................................................................14

4 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS..........................................................................................16

5 METODOLOGIA..........................................................................................................17

5.1 Escolha das espécies.............................................................................................17

5.1.1 Análise estatística..................................................................................................18

5.2 Ensaio com o composto OLU................................................................................18

5.3 Avaliação da toxicidade do solo com sementes de Lactuca sativa...................19

5.3.1 Análise estatística...................................................................................................19

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................20

6.1 Seleção das cepas fúngicas...................................................................................20

6.1.1 Análise estatística da comparação de ganho de biomassa...................................20

6.2 Aplicação no composto Salvinia X Óleo lubrificante usado...............................22

6.3 Teste de Toxicidade................................................................................................23

6.3.1 Análise estatística do teste de toxicidade...............................................................23

7 CONCLUSÕES............................................................................................................26

REFERÊNCIAS...............................................................................................................27

APÊNDICE A - Batata dextrose ágar (BDA)...................................................................30

APÊNDICE B - Meio de cultura batata dextrose ágar resorcinol (BDAR).......................31

APÊNDICE C – Meio de cultura peptona dextrose (PD).................................................32

APÊNDICE D - Meio de cultura Soro de Queijo..............................................................33

6

1 INTRODUÇÃO

O descarte indiscriminado de óleo lubrificante em sistemas hídricos pode trazer

inúmeros danos à natureza e em conseqüência à humanidade.

O óleo lubrificante é um derivado do refino do petróleo composto por substâncias

aromáticas que podem causar nos seres vivos intoxicação, hemorragia de órgãos

internos, complicações circulatórias, dermatites, tumores e até incorporação no tecido

adiposo, por bioacumulação (processo através do qual os seres vivos absorvem e

retêm substâncias químicas no seu organismo), em animais marinhos filtradores. Pode,

inclusive, contaminar o leite materno de mamíferos (DOMINGUES; BIDOIA, 2006,

p.71).

O consumo anual de óleo lubrificante no Brasil, é de cerca de 900.000 m³, o que

gera 250 a 300.000 m³ de óleo usado, sendo re-refinado apenas 110.000 m³. O

restante é geralmente despejado diretamente na natureza ou queimado (LOPES;

BIDOIA, 2005, p.47).

Embora o óleo lubrificante usado represente uma porcentagem ínfima do lixo, o

seu impacto no ambiente é muito grande, principalmente nos corpos d’água. Conforme

Bidoia e Domingues (2004, p.302) 1 litro de OLU polui 1 milhão de litros de água,

formando, em alguns dias, uma fina camada sobre a superfície de 1.000 m² que

bloqueia a passagem da luz e de ar, resultando no esgotamento do oxigênio na água,

devido a respiração dos microrganismos, dos animais e das plantas.

A poluição por OLU no solo também é muito grave, pois pode afetar diretamente

a comunidade dos organismos do solo devido ao efeito tóxico dessas substâncias, que

pode causar mudanças no metabolismo, crescimento, desenvolvimento, longevidade e

7

alterações genéticas. Podem ocorrer, também, alterações no equilíbrio ecológico do

solo, como mudanças nas relações entre presa e predador, modificando toda a teia

alimentar e impactando as funções dos ecossistemas terrestres (EDWARDS apud

MORAIS, 2005, p.7).

A presença do poluente no solo representa também, risco potencial para as

águas subterrâneas e superficiais, devido aos processos de erosão e lixiviação que os

solos estão sujeitos (MORAIS, 2005, p.7).

Muitas técnicas são usadas para remediar ambientes contaminados por óleos,

entre elas, métodos físicos e químicos, como barreiras de contenção, aparelhos de

sucção, absorventes e outros (CRAPEZ et al., 2002, p.34), todavia, a recuperação

mecânica do óleo por sorventes é uma das respostas ao derramamento mais utilizadas

(RIBEIRO; RUBIO, apud ANNUNCIADO, 2005, p.1).

Os materiais sorventes como a biomassa processada de algumas plantas

aquáticas, podem estar disponíveis na forma de particulados secos ou empacotados

em forma de barreiras, travesseiros, mantas e almofadas. O uso de cada formato

disponível para estes mesmos sorventes, varia conforme a situação do derramamento,

ou seja, sorventes na forma de almofadas e travesseiros são aplicados em

derramamentos terrestres, enquanto que os mesmos materiais sorventes em forma de

mantas e barreiras são recomendados para recuperação em corpos hídricos

(ANNUNCIADO, 2005, p.1).

A grande maioria dos sorventes comerciais industriais, atualmente disponíveis no

mercado, são importados e caros. Vários sistemas comerciais vêm sendo

desenvolvidos para o controle desses derramamentos, incluindo o uso de fibras

vegetais como sorventes, como é o caso do uso da macrófita aquática Salvinia sp.

(ANNUNCIADO, 2005, p.3).

O problema de utilizar sorventes em locais contaminados por óleo é que esta

técnica é baseada na simples extração do contaminante do ambiente. O destino final do

resíduo óleo x sorvente, geralmente, é a inadequada disposição em aterros sanitários

ou a incineração que, segundo Ururahy et al. (apud MORAIS, 2005, p.2.), pode, além

de poluir o ar, possuir a ameaça da persistência de hidrocarbonetos poliaromáticos.

8

Camilo et al. (2003, p.6) afirmam que o processo de incineração, no Brasil, tem o

conceito de poluidor, prejudicial ao meio ambiente e nocivo à saúde, além disso, a

incineração possui um custo elevado, exige mão-de-obra qualificada e apresenta

problemas operacionais.

A solução proposta neste trabalho é dar um destino, ecologicamente correto,

para o resíduo resultante da aplicação da macrófita aquática Salvinia sp. em ambientes

contaminados por OLU. Para isso, desenvolveu-se uma metodologia, na qual, utilizou-

se um processo de biorremediação, ou seja, uma estimulação de processos naturais,

através do uso de microrganismos, com o objetivo de estimular a fixação do composto

OLU x Salvinia sp. no húmus.

Os microrganismos são os principais responsáveis pela conversão dos

elementos químicos carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo em formas que

podem ser utilizadas pelas plantas e pelos animais, também, desempenham um papel

essencial no retorno do dióxido de carbono para a atmosfera quando decompõem

detritos orgânicos, plantas e animais mortos (TORTORA et al. 2000, p.16).

Os organismos escolhidos para a investigação foram fungos filamentosos de

podridão branca, pois, a função destes organismos na natureza é o decaimento das

fibras vegetais ricas em lignina, o que justifica o grande uso deles em estudos de

biorremediação de águas e solos contaminados por substâncias xenobióticas com

estrutura semelhante à dos lignocompostos.

Uma vez que se sabe, através de literatura, o poder de degradação da matéria

orgânica vegetal e de derivados do petróleo por fungos filamentosos de podridão

branca, pode ser montada a hipótese de que a mistura destes dois elementos, também

pode ser degradada de maneira eficiente por estes microrganismos.

9

2 BIORREMEDIAÇÃO

O tratamento de efluentes fenólicos por meios físicos e químicos convencionais

é, geralmente, inviável pelo alto custo (BOMAN et al. apud PIVA, 2005, p.252). A

detoxificação destes efluentes produzidos pelas indústrias de conversão de carvão, de

corantes e têxtil, de polpa e papel e petroquímica, entre outras, é necessária devido à

toxidez para mamíferos, aves e peixes. Métodos biológicos têm sido considerados

como alternativa (BOLLAG et al. apud PIVA, 2005, p.252).

Alguns microrganismos têm a capacidade de metabolizar ou processar

quimicamente substâncias como: metais pesados, enxofre, gás nitrogênio, petróleo,

mercúrio, etc, pois eles são capazes de utilizar poluentes como fonte de energia, ou

podem produzir enzimas que convertem toxinas em substâncias menos nocivas. A

utilização deste processo é conhecida como biorremediação (TORTORA, 2000, p.17).

A transformação de um composto orgânico em outro composto com estrutura

molecular diferente, ocorrendo a perda de alguma propriedade característica da

substância inicial, se denomina biotransformação (MORAIS, 2005, p.8).

A tecnologia de biorremediação usa, com o intuito de remover poluentes, o

potencial fisiológico de microrganismos, pois eles são capazes de transformar petróleo

e seus derivados em biomassa, água, dióxido de carbono e outros compostos.

(CRAPEZ et al., 2002, p. 36).

O processo de biorremediação é uma metodologia atrativa e confiável para o

tratamento de solos e cursos d´água contaminados, considerada muito eficiente, além

de econômica, versátil e principalmente por causar uma menor perturbação ao

10

ambiente, já que é um sistema de estimulação de processos naturais de remediação

(CORSEUIL et al., 1997, p.51).

A biorremediação ocorre naturalmente, até certo ponto, se as condições forem

aeróbicas. Porém, os microrganismos geralmente obtêm seus nutrientes em solução

aquosa, e produtos à base de óleo são relativamente insolúveis, o que dificulta o

processo natural. Além disso, hidrocarbonetos de petróleo são deficientes em

elementos essenciais como nitrogênio e fósforo. A aplicação desses elementos em uma

biorremediação de derramamentos de óleo melhora bastante a camada subsuperficial,

porém, sob as camadas superficiais, onde as condições são anaeróbicas, o óleo

freqüentemente permanece por períodos mais longos (TORTORA, 2000, p.772).

A aplicação de biorremediação em ambientes contaminados multiplica a

capacidade de depuração do ambiente, além de permitir o restabelecimento da vida

animal e vegetal e o mapeamento de áreas de risco. (CRAPEZ et al., 2002 p.37).

Em um processo de biorremediação podem ser utilizados microrganismos

nativos ao ambiente ou pode ser feita a introdução de novos organismos que foram

selecionados para se desenvolverem em certos poluentes. A adição desses micróbios

especializados é denominada bioaumento (TORTORA, 2000, p.772).

No presente trabalho são realizados experimentos de biorremediação com

técnicas de bioenriquecimento para investigar se a hipótese levantada é viável.

2.1 Bioenriquecimento

Em ambientes contaminados, os micróbios degradadores do poluente e os não

degradadores convivem juntos, de uma forma em que a depuração natural se mantém

lenta demais. Bioenriquecimento (ou bioaumento) é a inoculação de microrganismos

exógenos (de outro ecossistema) com o objetivo de acabar com o equilíbrio

(homeostase) entre as colônias nativas (FURTADO, 2001, p.3). O bioenriquecimento é

o processo responsável pela multiplicação dos microrganismos em laboratório, visando

incrementar a capacidade biodegradadora quando aplicados nas áreas poluídas. Após

serem multiplicados, microrganismos específicos com habilidades catalíticas desejáveis

para a degradação do poluente, são introduzidos no meio para competir por energia e

11

alimento com as colônias não degradadoras e para ajudar as efetivas na

metabolização, causando assim o desequilíbrio do ambiente natural. (FURTADO, 2001,

p. 3); (BALBA et al. apud MORAIS, 2002, p.15).

Outro processo compartilha este objetivo, a bioestimulação, porém consiste no

controle de fatores abióticos para que ocorra o aumento da taxa de biodegradação do

poluente por microrganismos endógenos, seja adição de nutrientes inorgânicos

(normalmente nitrogênio e fósforo), aceptores de elétrons (oxigênio) ou substratos

orgânicos (BALBA et al., apud MORAIS, 2002, p.16).

Esta técnica foi escolhida, pois a hipótese é utilizar (adicionar) fungos

filamentosos de podridão branca no poluente, isto porque, segundo Piva (2005, p.251)

estes fungos são grandes produtores de lacase, uma enzima da classe das

fenoloxidases, cuja função é degradar a lignina, polímero complexo de compostos

aromáticos muito resistente a degradação encontrado na madeira. Compostos

semelhantes aos resultantes da quebra da lignina são encontrados em alguns efluentes

industriais.

12

3 FUNGOS

Os fungos obtêm sua alimentação a partir da matéria orgânica inanimada ou

nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos. São importantes na cadeia alimentar

porque atuam como saprófitas, decompõem resíduos complexos de plantas e animais,

transformando-os em formas químicas mais simples, que retornam ao solo, reciclando

desta forma elementos vitais. Tais substâncias são, então, absorvidas por vegetais.

Desse modo, a atividade fúngica é amplamente responsável pela fertilidade do solo

(PELCZAR et al., 1980 p.61).

Através da parede celular é que todos os nutrientes são absorvidos e todos os

produtos em excesso ou residuais são excretados. Os substratos devem primeiro ser

degradados a uma forma na qual possam ser absorvidos através da parede celular. É

através da ação de suas enzimas que os fungos decompõem as partes duras das

plantas e algumas destas enzimas são produzidas em quantidades consideráveis

extracelularmente (NOBLE; NAIDOO, 1981, p.1).

3.1 Fungos Filamentosos

Quando cultivados em meios adequados, ou seja, com condições e nutrientes

necessários para o crescimento desses, muitos fungos produzem longos filamentos

ramificados. Estes fungos são comumente denominados filamentosos, cada filamento é

uma hifa (JAWETZ et al., 1984, p.270).

As hifas crescem por alongamento das extremidades. Cada parte de uma hifa é

capaz de crescer, e quando um fragmento é quebrado, esse pode se alongar para

13

formar uma nova hifa. Em laboratório, os fungos geralmente crescem a partir de

fragmentos obtidos de um talo do fungo (TORTORA et al., 2000, p.335).

Quando as condições ambientais são favoráveis, as hifas crescem formando

uma massa filamentosa chamada de micélio (visível a olho nu) (TORTORA et al., 2000,

p.336).

O micélio fica imerso em matéria orgânica em decomposição, no solo ou nos

tecidos de organismos vivos, suas células liberam enzimas que digerem o substrato e

absorvem pequenas moléculas que servem como nutrientes (BLACK, 2002, p.256).

Este tipo de fungo, há muito tempo, vem sendo utilizado em biotecnologia,

engenharia genética e no controle biológico de pragas (TORTORA et al., 2000, p.335) e

segundo RISER-ROBERTS (apud KATAOKA, 2000, p.64) fungos filamentosos são

mais hábeis em degradar ou transformar hidrocarbonetos de estrutura complexa e de

cadeia longa do que bactérias.

3.2 Fungos de Podridão Branca

Os fungos responsáveis pela decomposição da lignina, chamados fungos de

podridão branca devido à cor que a madeira adquire após sua atuação (PIVA, 2005,

p.251), são os que apresentam um maior potencial de aplicação biotecnológica. A

podridão branca resulta numa madeira que pode se desintegrar até uma consistência

fibrosa, devido ao ataque da lignina e celulose (NOBLE; NAIDOO, 1981, p.35).

Conforme Yateem et al. (apud MORAIS, 2002, p.10) fungos de podridão branca

podem ser utilizados nos processos de biorremediação devido a sua capacidade em

degradar compostos que não são facilmente utilizados por bactérias, isto é devido à

produção de enzimas extracelulares conhecidas como peroxidases e lacases, que são

responsáveis pela quebra da lignina.

A lignina não tem definição de estrutura química, apresentando muitos anéis

aromáticos. A variação da estrutura química da lignina se modifica devido a espécie

vegetal e as mudanças ambientais, o que provoca também, mudanças de vários tipos

nas próprias madeiras. Desse modo, as enzimas ligninolíticas não apresentam

especificidade de substrato para poderem decompor a molécula de lignina. Sendo

14

assim, podem atacar compostos orgânicos poluentes que apresentam estrutura química

semelhante a da lignina, graças a essa inespecificidade. Na natureza os fungos

degradam a lignina para alcançarem a celulose, sua principal fonte de alimento

(HIGUCHI, Apud FASANELLA, 2005, p.41).

Em processos de oxidação de muitos compostos (principalmente de compostos

fenólicos) a lacase apresenta uma grande especificidade para um grande número de

efluentes industriais (PIVA, 2005, p.251). Alguns fungos de podridão branca como:

Trametes versicolor (Linnaeus ex Fries) Pilát e Pycnoporus sanguineus (Linnaeus ex

Fries) Murrill, espécies comuns no Rio Grande do Sul, são conhecidos por degradar

vários tipos de corantes têxteis. Estes fungos possuem a capacidade de mineralizar

(transformar até água e CO2), uma variedade de poluentes resistentes à degradação

(ESPOSITO et al, 2004, p.341).

3.3 Exigências nutricionais

Os fungos são organismos que usam moléculas orgânicas como fonte de

carbono e energia e assim como as bactérias, absorvem nutrientes ao invés de ingeri-

los, como fazem os animais (TORTORA et al., 2000, p.338). A absorção é auxiliada por

enzimas secretadas no meio, que quebram as moléculas orgânicas em porções

menores que podem ser transportadas mais facilmente para dentro da célula.

(PELCZAR et al., 1996, p.153). Essas características permitem que os fungos se

desenvolvam em diversos substratos.

A determinação da fonte de nitrogênio é essencial para o processo de

biorremediação, pois o nitrogênio está intimamente relacionado ao metabolismo dos

microrganismos. Além disso, para que 100 unidades de carbono sejam degradadas,

são necessárias em média, de 3 a 4 unidades de nitrogênio (PUTZLE, 2002, p.630).

O carbono, também, é um dos elementos mais importantes para o crescimento

microbiano. Ele é essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos

necessários para a viabilidade celular, sendo considerado o elemento estrutural básico

para os seres vivos (TORTORA et al., 2000, p.159).

15

O oxigênio é um fator decisivo para se iniciar e se sustentar uma biorremediação

(CRAPEZ et al., 2002, p.34), além disso, há outros elementos que são essenciais para

o crescimento celular, como o enxofre e o fósforo. (TORTORA et al., 2000, p.159).

Os fungos de podridão branca não são exigentes quanto ao meio de cultura,

podendo ser cultivados em rejeitos industriais que apresentem os nutrientes

necessários (PIVA, 2005, p.251). Piva (1994, p.59) demonstrou ser viável a utilização

do soro de queijo como meio de cultivo para fungos de podridão branca, tendo como

resultados ganhos de biomassa superior aos meios de culturas usualmente utilizados

em estudos de biorremediação. O soro de queijo possui de 4 a 5% de lactose, além de

proteínas, ácidos orgânicos, vitaminas e sais minerais (K, P, Ca, Mg e Na) (NITSCHKE

apud PIVA, 1994, p.17). A lactose serve como fonte de carbono na produção de

fenoloxidases por fungos de podridão branca (SANDHU; ARORA apud PIVA, 1994,

p.17). A grande vantagem na utilização do meio de cultura contendo soro de queijo é o

baixo custo e por ser um resíduo industrial, torna-se saudável ao ambiente reutilizá-lo.

16

4 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS

Caracteristicamente, a matéria orgânica do solo é de origem vegetal, contendo

lignina, celulose, carboidratos e substâncias húmicas (PIVA, 1994, p.4). As substâncias

húmicas são formadas pela decomposição microbiana de plantas e substâncias

animais, transformando a matéria orgânica em substâncias quimicamente estáveis

(LARCHER, 2000, p.9; EMBRAPA, 2004). Segundo Rocha et al. (2004, p.125) as

substâncias húmicas possuem estrutura química complexa, compondo um grupo de

compostos heterogêneos. Elas representam a principal forma de matéria orgânica

distribuída no planeta. São encontradas em solo, águas naturais, pântanos, turfas,

sedimentos aquáticos e marinhos.

A fase de transformação da matéria orgânica em substâncias húmicas é

denominada fase de humificação (Ambiente Brasil, 2006). Segundo Larcher (2000, p.9),

onde a matéria orgânica e o húmus se decompõem mais lentamente a planta se adapta

para um crescimento mais lento. A transformação da matéria orgânica do solo em

substâncias húmicas permite que os microrganismos liberem, lentamente, os nutrientes

do húmus que são utilizados pelas raízes das plantas, pois o húmus é um tipo de

matéria orgânica mais resistente à decomposição pelos microorganismos (AMBIENTE

BRASIL, 2006).

Piva (1994, p.56) cita diversos autores que descreveram a estabilização de

fenóis tóxicos mediada pela lacase através da ligação a ácidos húmicos, determinando

assim, a importância que os fungos de podridão branca têm na formação da parte

orgânica do solo.

17

5 METODOLOGIA

A coleta de corpos frutificativos de fungos macroscópicos, juntamente com

amostras de micélio e a observação de seus comportamentos no ambiente natural para

o registro de dados, com fins de coleção, foi realizada na Quinta São José, propriedade

lassalista localizada em Nova Santa Rita/RS. A coleta do corpo frutificativo juntamente

com a amostra do micélio é fundamental, pois é principalmente nele que está baseada

a taxonomia dos fungos macroscópicos. A coleta e a classificação taxonômica seguiram

conforme recomendado por (GUERRERO; HOMRICH, 1983, p.19).

A coleção de culturas foi realizada com o meio BDA (Batata-Dextrose, Ágar –

Apêndice A), onde foram inoculados os micélios fúngicos coletados. Após sete dias de

cultivo, as culturas foram repicadas para meio BDAR (Apêndice B) contendo resorcinol

a 5% (indutor de fenoloxidases).

Antes de ser incorporado à coleção, cada corpo frutificativo passou por um

processo de secagem em estufa a temperatura de 40°C durante 3-5 dias dependendo

das condições.

Uma vez identificados os fungos, preparadas e armazenadas as culturas e

frutificações, foram incorporadas à coleção científica de fungos macroscópicos, que se

encontra no Museu de Ciências Naturais do Unilasalle, juntamente com seus dados de

coleta.

5.1 Escolha das espécies

Depois de sete dias de cultivo, foram realizadas observações e a verificação do

18

crescimento das culturas com o objetivo de concluirmos quais as espécies com maior

potencial na produção de fenoloxidases. Esta seleção foi feita qualitativamente de

acordo com o teste de Bavendamm, com modificações (PIVA, 1994, p.29).

O teste de Bavendamm consiste na alteração de cor do meio de cultura, esta

troca de cor demonstra que no meio há fenoloxidases ativas, através dele foram

classificados qualitativamente os produtores de fenoloxidases, assim como proposto por

Silveira e Guerrero (apud PIVA, 1994, p.37). Os melhores produtores foram

selecionados pela avaliação da intensidade da cor âmbar, característica da reação,

assim como realizado por Conceição et al. (2005, p.103), as espécies selecionadas

foram cultivadas em meio PD (Peptona Dextrose – Apêndice C) para comparação do

ganho de biomassa.

Para iniciar o cultivo líquido foram inoculados discos de 1cm de diâmetro de

cultura em meio BDA em Frascos de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade, contendo

250 ml de meio PD. As culturas foram incubadas durante 21 dias a 28°C com

amostragens a cada 7 dias. As amostragens consistiram na filtragem em filtro para café

no 102, marca Mellita, para obtenção do micélio fresco. Para a pesagem e cálculo do

crescimento micelial, o micélio foi seco por 24 h em estufa marca De Leo a 40°C.

Após a escolha da espécie, a mesma foi cultivada em meio soro de queijo (MSQ

– Apêndce D) para ser aplicada ao composto OLU x Salvinia sp.

5.1.1 Análise estatística

Os resultados do experimento comparativo entre ganhos de biomassa entre

diferentes espécies, foram submetidos á análise de variância ANOVA para fator único,

com grau de significância de 5%, com auxílio do software Microsoft Excel.

5.2 Ensaio com o composto OLU

O composto OLU x Salvinia sp. foi recebido dos experimentos com adsorção

deste tipo de óleo por Salvinia sp. realizado pela colega Karina Minozzo em seu

trabalho de conclusão de curso. Foram recebidas amostras de 10 g de pó de Salvinia

19

sp. lavada secada e moída contendo 10 e 50 g de óleo cada amostra para ensaio,

foram adicionadas em garrafas PET de 2 L, as culturas fúngicas em 240 g de solo

(cinzas, turfa, húmus de minhoca) e amostra de composto OLU x Salvinia. Os

experimentos foram realizados com controle sem inóculo.

Após 30 dias de tratamento, as garrafas foram mantidas invertidas em suporte

universal, com a tampa aberta, para escoamento da parte líquida.

5.3 Avaliação da toxicidade do solo com sementes de Lactuca sativa

O método empregado baseou-se em bioensaios conforme descrito em Duka

(apud MONTEIRO et al., 2002, p. 05). Após o tratamento de 30 dias, foi adicionada

água mineral a cada garrafa plástica contendo solo, na proporção 4:1 de água mineral e

solo. O material foi deixado para sedimentar por 24 horas, ao final das quais, foi retirado

o sobrenadante. Essa solução foi utilizada sem diluição para regar as sementes de

Lactuca sativa. Placas de Petri contendo papel filtro receberam 5 ml desta solução e 10

sementes de L. sativa. Para cada solução foram utilizadas seringas distintas para evitar

a contaminação de uma amostra na outra. Foram feitas duas réplicas, inclusive para o

controle. Em seguida, as placas foram envoltas com folha de alumínio e incubadas para

exposição de 120 horas. Terminado o teste, as plântulas foram medidas com auxílio de

régua.

5.3.1 Análise estatística

Os resultados do experimento de toxicidade foram submetidos á análise de

variância ANOVA para fator único, com grau de significância de 5%, com auxílio do

software Microsoft Excel.

20

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Seleção das cepas fúngicas

Foram coletados fungos de diferentes espécies como Geastrum sp., Picnoporus

sanguineus, Lentinus crinitus, Coprinus sp.,Macrolepiota bonaerensis, Marasmius spp.,

Polyporus sp., Cymatoderma caperatum, Pisolithus tinctorius, Ganoderma applanatum,

Trametes versicolor, Trametes villosa, Gymnopilus pampeanus, Amanita muscaria,

Schizophyllum commune, Auricularia fuscosuccinea e outras. Todas passaram pela

reação de Bavendamm, porém as que apresentaram resultados mais atraentes foram

Picnoporus sanguineus e Pisolithus tinctorius, pois foram as culturas que apresentaram

uma maior alteração de cor depois da aplicação de indutor para fenoloxidases na

cultura.

6.1.1 Análise estatística da comparação de ganho de biomassa

As tabelas 1, 3 e 5 fornecem o peso seco obtido de cada amostragem nos

seguintes períodos: 7, 14 e 21 dias, respectivamente. As tabelas foram submetidas a

análise de variância ANOVA determinando que a variação dentro de cada amostragem

ocorreu devido à fatores aleatórios.

Os dados da tabela 2 indicam que na amostragem de 7 dias o ganho de

biomassa entre as duas espécies apresentaram médias equivalentes, para significância

de 5%. O mesmo não ocorreu nas amostragens de 14 e 21 dias, onde Pisolithus

21

tinctorius apresentou um ganho de biomassa superior a significância de 5%, conforme

mostra as tabelas 4 e 6.

Tabela 1 - Comparação do ganho de biomassa após 7 dias, em meio PD líquido.

Peso seco em gramas.

P. sanguineus P. tinctorius

7 dias 0,35 0,61 0,42 0,68 0,33 MÉDIA 0,37 0,65

Tabela 2 – Análise ANOVA para um fator das amostras P. tinctorius e P. sanguineus

após 7 dias.

Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico

Entre grupos 0,062016667 1 0,062016667 15,3127572 0,159278387 161,4476387 Dentro dos grupos 0,00405 1 0,00405 Total 0,066066667 2




14 dias 0,68 1,43 0,45 1,12 0,52 1,11 MÉDIA 0,55 1,22

Fonte: Autoria própria


após 14 dias.




22




21 dias 0,60 1,26 0,57 1,18 0,54 1,39 MÉDIA 0,57 1,28



após 21 dias.




Este resultado motivou a escolha da espécie P. tinctorius a ser aplicada ao

composto OLU x Salvinia sp.

Como o presente trabalho constituiu-se de biorremediação de solos, um fator que

pesou na decisão de qual espécie a ser utilizada, foi o fato de Pisolithus tinctorius ser

uma espécie encontrada no solo, geralmente associada a vegetais superiores em forma

de micorriza, conforme (KRÜGNER; TOMAZELLO FILHO, 1980, p.42). É provável que

ela tenha mais afinidade com o solo do que Picnoporus sanguineus, pois, segundo

(GUERRERO; HOMRICH, 1983, p.51) é uma espécie comumente encontrada em

troncos de árvores, com frutificação em formato de “orelha-de-pau”.

6.2 Aplicação no composto Salvinia X Óleo lubrificante usado

O fungo escolhido foi, então, cultivado em MSQ durante 14 dias, antes da

aplicação no composto Salvinia X OLU. Após os sete primeiros dias da inoculação do

fungo no composto, observou-se uma grande massa micelial que envolveu todas as

amostras. Uma amostra desta massa micelial foi cultivada em meio BDA (Batata,

Dextrose, Ágar). Ao mesmo tempo, uma cultura de P. tinctorius foi repicada também

23

para meio BDA. Após cinco dias, observaram-se os cultivos e se verificou visualmente

que se tratava da mesma espécie, o que demonstra que quem atuou no composto foi P.

tinctorius realmente. Assim, se pode descartar a hipótese de uma contaminação por

outra espécie que pudesse ter inibido a ação da espécie investigada.

6.3 Teste de Toxicidade

6.3.1 Análise estatística do teste de toxicidade

A tabela 7 fornece as medidas obtidas nas amostras Controle, e adicionadas de

10 g e 50 g de OLU. A tabela foi submetida a análise de variância ANOVA

determinando que a variação dentro de cada amostragem ocorreu devido à fatores

aleatórios.

Os dados da tabela 8 indicam que a amostra com concentração de 10 g de OLU

apresentou médias de crescimento equivalente, para significância de 5%. Pôde-se

observar que as médias de crescimento mantiveram-se semelhante ao controle. O

mesmo não ocorre quando o controle é comparado a amostra com concentração de 50

g de OLU, conforme tabela 9.

Tabela 7 – Tamanho em cm das plântulas de alface (L. sativa) regadas com água

mineral após contato de 24 horas aos compostos.

Amostra Controle 10 g 50 g

1 3,4 5,8 3,7 2 5,9 5,4 4,1 3 7,4 5,7 4,4 4 5,4 5,9 2,8 5 5,7 4,9 3,7 6 5,7 5,6 4,2 7 5,2 5,4 2,9 8 5,8 5,4 4,1 9 6,2 5,7 4,1 10 4,9 5,5 2,5 11 5,7 5,8 3,8 12 6,9 5,1 4,3 13 4,7 5,4 4,3

24

14 5,4 5,7 3,7 15 6,8 4,9 4,1 16 5,2 5,2 3,7 17 5,7 5,8 3,5 18 6,8 5,3 4,8 19 4,9 4,8 3,8 20 9,3 4,9 3,6 21 5,6 4,9 4,8 22 5,0 3,9 4,1 23 5,7 5,5 4,0 24 6,4 5,4 4,2 25 5,3 3,9 4,4 26 3,4 5,5 4,1 27 6,3 5,4 3,9 28 2,2 5,3 4,6 29 4,4 3,5 30 3,6

MÉDIA 5,56 5,29 3,91 Fonte: Autoria própria

Tabela 8 – Análise ANOVA para um fator da amostra Controle comparada com amostra

com 10 g de OLU.




Tabela 9 – Análise ANOVA para um fator da amostra Controle comparada com amostra

com 50 g de OLU.


Entre grupos 42,24446655 1 42,24446655 44,88174652 1,17139E-08 4,016195438 Dentro dos grupos 51,76816502 55 0,941239364 Total 94,01263158 56


25

A diminuição da toxicidade ocorreu, possivelmente, porque as enzimas fúngicas

agiram sobre o óleo, isto se deve ao fato do óleo possuir, em sua composição,

substâncias aromáticas semelhantes ao da lignina encontrada nas paredes das células

vegetais.

A técnica de bioaumento utilizada neste trabalho foi fundamental, pois trouxe

resultados mais positivos do que trabalhos semelhantes sem a utilização da técnica,

como nos trabalhos de Domingues et al. (2006, p.71) que ao investigar a

biodegradabilidade de OLU, sem bioenriquecimento, somente bioestimulação, obteve

como resultado a diminuição da toxicidade do solo somente após 60 dias de tratamento

e Lopes et al. (2005, p.47) utilizando meio aquoso, também sem bioenriquecimento,

obtiveram resultados semelhantes ao de Domingues et al.

O fato do teste de toxicidade mostrar que no ensaio 1, as mudas de alface se

desenvolveram como no solo sem poluente, não quer dizer que o mesmo tenha sido

totalmente degradado, o mais provável é que o poluente tenha se fixado no húmus,

passando para uma forma menos tóxica, pela a ação das fenoloxidases.

Segundo Aust (apud BALLAMINUT, 2007, p.10), a degradação da lignina por

fungos de podridão branca ocorre até sua concentração ser reduzida a níveis não

detectáveis, onde o produto final é CO2. Sendo este, o tipo de processo desejável para

os compostos xenobióticos.

A água mineral que permaneceu 24 horas no ensaio 2 demonstrou grande

quantidade de gotículas de óleo na superfície (Figura 1), o que corrobora com os

resultados do teste de toxicidade.

Figura 1: água que permaneceu 24 horas no composto com 50g de óleo. Fonte: Autoria própria

26

7 CONCLUSÕES

Com base nos resultados deste trabalho conclui-se que:

a) O meio soro de queijo se apresentou um meio de cultura eficiente;

b) A espécie Pisolithus tinctorius apresentou mais rendimento na produção de

biomassa do que Picnoporus sanguineus e secreção de fenoloxidases

semelhante, o que faz ela ter um maior potencial para aplicações em

biorremediação;

c) A espécie inoculada foi dominante e a responsável pela detoxificação do ensaio

1;

d) Utilizando a metodologia descrita é possível diminuir a toxicidade de 10 g de óleo

para 10 g de Salvinia sp. adicionado de 240 g de solo e 250 g de cultivo de

Pisolithus tinctorius;

e) Outros trabalhos são necessários para avaliação da quantidade exata de OLU

que pode ser estabilizado utilizando-se esta metodologia.

f) Também aconselha-se para próximos estudos, a investigação da composição

dos gases emitidos durante a biodegradação deste óleo e até que ponto esta

liberação é prejudicial ao ambiente.

27

REFERÊNCIAS AMBIENTE BRASIL. Coleta e Disposição Final do Lixo: Compostagem, 2006. Disponível em: <http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./residuos/ index.php3&conteudo=./residuos/lixo.html>. Acesso: 21/03/2007 ANNUNCIADO, Teoli Rodrigues. Estudo da Chorisia speciosa e outras fibras vegetais como sorventes para o setor de Petróleo. 2005. 106 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Programa Pós-Graduação em Engenharia. BALLAMINUT, Nara. Caracterização fisiológica do inóculo de Lentinus crinitus (L.) Fr. CCB274 empregado em biorremediação de solo. 2007. 163 f. Dissertação (mestrado) - Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio Ambiente, São Paulo. BIDOIA, Ederino Dino; DOMINGUES, Ricardo José. Estudo da Biodegradação de Efluente Oleoso Automotivo. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.71, 2004. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/ARQUIVOS/V71_supl_raib/ 302.pdf>. Acesso em: 20 jun. 2007. BLACK, Jacquelyn G. Microbiologia: Fundamentos e Pespectivas. 4ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S. A., 2002. CAMILO, Yaskara Mariana Vargas et al. Incineração. In: III Fórum De Estudos Contábeis (Área II - Meio Ambiente), Campinas, 2003. Disponível em: <http://www.ceset.unicamp.br/lte/Artigos/3fec2410.pdf >. Acesso em: 23 mar. 2007. CONCEIÇÃO, Douglas monte. Fungos Filamentosos isolados do Rio Atibaia, SP e Refinaria de Petróleo Biodegradadores de Compostos Fenólicos. Arquivos do Instituto de Biologia, São Paulo, v.72, n.1, p.99-106, jan./mar.2005. CORSEUIL, Henry Xavier et al. Contaminação de águas subterrâneas por derramamentos de gasolina: O problema é grave? Engenharia Sanitária e Ambiental, São Paulo, v.2, n.2, p.50-54, 1997. CRAPEZ, Mirian A. C. et al. Biorremediação – Tratamento para Derrames de Petróleo. Ciência Hoje, São Paulo, vol. 30, n. 179, p.32-37, jan/fev 2002.

28

DOMINGUES, Ricardo José; BIDOIA, Ederino Dino. Avaliação da biodegradação e do descarte de óleo lubrificante automotivo. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.68, (supl. 2), 2006. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/biologico/ v68_supl_raib/index.htm>. Acesso em: 20 jun. 2007. EMBRAPA. Arroz e Feijão Sistemas de Produção, n.4. Dez/2004. Versão eletrônica. Disponível em: <http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Feijao/ FeijaoVarzeaTropical/glossario.htm>. Acesso em: 22/03/2007 ESPOSITO, Elisa; SILVA, Manuela da. O Papel dos Fungos na Recuperação Ambiental. Fungos Uma Introdução à Biologia, Bioquímica e Biotecnologia, Caxias do Sul, p. 337-375, 2004. FASANELLA, Cristiane Cipola. Produção de biosurfactantes em quatro linhagens fúngicas com potencial para futuro processo de biorremediação em derramamentos de petróleo provenientes de refinarias. Monografia apresentada como requisito da Disciplina Estágio Supervisionado, para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas, Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos São João da Boa Vista, SP, 2005. FURTADO, Marcelo Rijo. Ataque microbiano remedia áreas contaminadas - Cresce o uso de aditivos de bactérias e fungos para tratar efluentes e biorremediar solos. Revista Química e Derivados. São Paulo, n. 389, Dez 2000/Jan 2001. Disponível em: <http://www.quimica.com.br/revista/qd389/biotecnologia1.htm>. Acesso em: 23 mar. 2007. GUERREIRO, Rosa T.; HOMRICH, Maria. H., Fungos Macroscópicos comuns no Rio Grande do Sul: guia para identificação. 1ª ed. Porto Alegre: Ed. Da Universidade, UFRGS, 1983. JAWETZ, Ernest; MELNICK, Joseph L.; ADELBERG, Edward A. Microbiologia Médica.15ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S. A., 1984. KATAOKA, Ana Paula Arruda Geraldes. Biodegradação de resíduos oleosos de refinaria de petróleo por microrganismos isolados de “landfarming”. 2000. 202f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências.

KRÜGNER, Tasso Leo; TOMAZELLO FILHO, Mário. Efeito dos Fungos ectomicorrízicos Pisolithus tinctorius e Thelephora terrestris e de fertilização mineral no crescimento e sobrevivência de Pinus caribaea var. bahamensis, em condições de campo, no litoral sul da Bahia. Instituto de Pesquisas e Estudos Florestais, Piracicaba, n.21, p.41-51, dez.1980.

LARCHER, Walter. Ecofisiologia vegetal. 1ª ed. São Carlos, SP : Rima Artes e Textos. 2000.

29

LOPES, Paulo Renato Matos; BIDOIA, Ederino Dino. Estudo da Biodegradação de Efluente Oleoso Automotivo de Diferentes Origens em Meio Aquoso. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 72, (supl. 1), 2005. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/arquivos/V72_supl_cicam/47.PDF>. Acesso em: 20 jun. 2007. MONTEIRO, Regina Teresa et al. Qualidade da água da sub-bacia do Rio Corumbataí – Projeto Políticas Públicas FAPESP. 2003. Disponível em: <http://watson.fapesp.br/PPub/Aprovado.htm> Acesso: 6 jun 2007. MORAIS, Eduardo Beraldo. Biodegradação de resíduos oleosos de refinaria de petróleo através do sistema de biopilhas. 2005. 73f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. NOBLE, William Charles; NAIDOO, Jay. Coleção Temas de Biologia: Os microrganismos e o Homem. 1ª ed. São Paulo: EDUSP, 1981.

PELCZAR, Michel J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2ª ed. São Paulo: Makron books, 1996. v.1.

PIVA, Giovani André. Coleta, conservação, seleção e cultivo de fungos basidiomicetos produtores de Fenol oxidases. Cadernos La Salle XI, canoas, V.2, nº 1, p. 251-264, 2005. PIVA, Giovani André. Avaliação da produção de biomassa e atividade da enzima lacase em quatro basidiomicetos. 1994. 96f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente) – Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.

PUTZKE, Jair; PUTZKE, Mariza Terezinha Lopes; Reino dos Fungos. 3ª ed. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 2002. v. 2. ROCHA, Júlio Cezar; ROSA, André Henrique; CARDOSO, Arnaldo Alves. Introdução à química ambiental. 1ª ed. Porto Alegre: Bookman, 2004. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.;CASE, Christine. Microbiologia. 6ª ed. Porto Alegre: Artemed, 2000.

30

APÊNDICE A – Meio de cultura batata dextrose ágar (BDA)

Ingredientes Concentração (g/l)

batata 200,0 g

dextrose 20,0 g

ágar 1,5 g

água destilada 1000,0 ml

pH=5,5 ± 0,2. Utilizar o caldo da fervura da batata em água. Autoclavar durante 15

minutos à 121°C.

31

APÊNDICE B – Meio de cultura batata dextrose ágar resorcinol (BDAR)


batata 200,0 g

dextrose 20,0 g

resorcinol 0,5 g

ágar 15,0 g


pH=5,5 ± 0,2. Utilizar o caldo da fervura da batata em água. Autoclavar durante 15

minutos à 121°C.

32

APÊNDICE C – Meio de cultura peptona dextrose (PD)


Peptona 5,0 g

dextrose 20,0 g


Autoclavar durante 15 minutos à 121°C.

33

APÊNDICE D - Meio de cultura soro de queijo (MSQ)

Meio de cultura soro de leite (MSL)


soro de queijo 500,0 ml


pH=5,5 ± 0,2. Para utilizar como meio sólido, adicionar 15 g/l de ágar. O soro de queijo

foi esterilizado (pH 5,5) em três estágios sucessivos de aquecimento à 95°C e repouso

de 24 horas.

O soro de queijo foi obtido no processo de confecção de queijo frescal utilizando-

se leite Nutrilat tipo C. Adicionou-se 1,5 ml de solução de coalho Top Therm por litro de

leite, previamente aquecido à 35 °C. Após agitar por dois minutos a solução com auxílio

de uma espátula esta permaneceu em repouso por 1 hora. Com auxílio de espátula,

cortou-se a massa resultante aguardou-se por 40 minutos para separar melhor o soro.

O soro de queijo foi extraído da massa com auxílio de peneira. A proteína restante foi

removida filtrando-se o soro após aquecê-lo por 15 minutos à 95°C em pH 4,8 e no pH

de cultivo.

estabilizaÇÃo do composto Óleo lubrificante … · de 1:1 e 5:1. para o experimento, foram...

Documents