Espectroscopia de

luminescência molecular

Fotoluminescência e Quimiluminescência Fluorescência Molecular – Absorção de fótons → emissão de fótons Fosforescência – Absorção de fótons → emissão de fótons

Fotoluminescência

Qualitativa Quantitativo

Espectros característicos Baixos valores de limites de detecção (LOD ~ ppb)

Líquidos, sólidos e gasosos Ampla linearidade

Alta especificidade

Desvantagem

Os estados excitados são suscetíveis à desativação pelas colisões e outros processos, muitas moléculas não apresentam fluorescência ou fosforescência.

Por isso os métodos luminescentes quantitativos estão sujeito a sérios efeitos de interferência.

E comum utilizar esta técnica combinada com técnicas de separação como cromatografia e eletroforese.

Aplicações

Quimiluminescência– Excitação química → emissão de fótons.

Fluorescência x Fosforescência Fluorescência atômica – Sódio: 3s → 3p → 3s – Absorve 589 nm → emite 589 nm – Fluorescência ressonante Fluorescência molecular – fluoresceína: n → π* → n – Absorve 490 nm → emite 520 nm – Deslocamento de Stokes Fosforescência – antraceno: → π π* → π – Absorve 280 nm → emite 480 nm – perda de energia? Estados excitados Singleto e Tripleto

Diagrama de Níveis Energéticos de Moléculas Fotoluminescentes

Também chamado de diagrama Jablonski

Velocidade de absorção ocorre em cerca de 10-14 a 10-15s.

A emissão de fluorescência ocorre em 10-5 a 10-10s.

Já a emissão de fosforescência ocorre em um tempo de 10-4 a 10s.

Transição singleto para tripleto e improvável (proibida)

Processos de Desativação

A molécula excitada pode retornar ao seu estado fundamental pela combinação de varias etapas mecânicas.

Duas destas formas a fluorescência e a fosforescência envolve a emissão de radiação.

As outros processos de desativação são não radioativos.

Só será possível observar fluorescência e fosforescência se a trajetória para o estado fundamental seja aquela que minimiza o tempo de vida no estado excitado

Relaxação vibracional

Imediata (10-12 s) dissipação por vibração

Colisão com moléculas do solvente

Aumento mínimo de temperatura do sistema

Dissipação de energia = perda de energia ⇒

Deslocamento de Stokes

λemissão > λexcitação ∴ E emitida < E absorvida

Conversão interna Processo intermolecular. Proximidade entre níveis

eletrônicos excitado e níveis vibracionais de um estado eletrônico excitado de menor energia(níveis superpostos)

Resultado prático:

não importa qual λexcfluorescência ⇒ λem

Processos de Desativação

Conversão externa

Envolve transferência de energia da molécula excitada para moléculas de solvente.

Obviamente depende de condições intrínsecas ao solvente e fatores que aumentem ou diminuam o número de colisões:

Tipo de solventeTemperaturaViscosidade

Presença de supressores

Cruzamento intersistema

Ocorre com a inversão do spin de elétron excitado o que altera a multiplicidade da molécula.

A probabilidade desta transição depende da proximidade entre os níveis energéticos vibracionais.

Fosforescência

Transição triplete → singlete é menos provável que a transição singlete → singlete tempo de vida ∴médio grande.

Evento raro: observado em baixas temperaturas, solventes viscosos ou mesmo em sólidos.

Processos de Desativação

Rendimento Quântico

É a razão entre o número de moléculas luminescentes e o número total de moléculas excitadas; ou seja:

Levando em consideração a discussão feita sobre os processos de desativação sugere que o rendimento seja determinado pelas constantes de velocidade relativas para cada processo.

Variáveis que Afetam Luminescência

Fluorescência e estrutura Estruturas aromáticas condensadas e/ou com alto grau de

conjugação apresentam alta eficiência quântica Ex: Heterocíclicos: não fluorescem Heterocíclicos condensados fluorescem!

Heterocíclicos

Heterocíclicos Condensados

Variáveis que Afetam Luminescência

Fluorescência e estrutura A substituição em anéis aromáticos afetam a intensidade

relativa de fluorescência e os valores dos max de λabsorção/emissão

Variáveis que Afetam Luminescência

Fluorescência e estrutura Moléculas flexíveis tendem a relaxar por vibração A flexibilidade causa aumento da constante de conversão

interna (kci) o que leva a desativação não-radiativa.

φ ≅ 1 φ ≅ 0,2

Variáveis que Afetam Luminescência

Solvente e Temperatura Aumento de T ou diminuição de viscosidade do solvente

levam a um aumento no número de colisões e portanto aumenta a probabilidade por conversão externa (supressão colisional)

pH A fluorescência de compostos aromáticos com

funcionalidades ácidas ou básicas apresentam forte dependência com o pH

Ex.: anilina/anilínio e fenol/fenolato Obs: pKa de substâncias no estado excitado podem variar

de 3 a 4 unidades em relação ao estado fundamental

Variáveis que Afetam Luminescência

Oxigênio dissolvido Oxigênio e outras espécies paramagnéticas tendem a

diminuir a fluorescência pelo aumento do cruzamento intersistemas (fosforescência). Também é possível a oxidação da espécie fluorescente

Outras moléculas em solução Moléculas com átomos pesados (tetrabrometo de carbono

e iodeto de etila) aumentam a velocidade de inversão de spin.

Ex: Acrilamida e proteínas

Intensidade de Fluorescência e concentraçãoA potência da emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de excitação que é absorvido pelo sistema.

F= K’ (P0 – P )P0 : potência do feixe radiante

P: potência após atravessar uma distância b do meio K´: constante dependente da eficiência quântica

Relacionando com a Lei de Beer:

Ao considerarmos : F = Kc ....Temos que um gráfico da potência da fluorescência de uma solução em função da concentração das espécies emitidas deve ser linear em baixas concentrações. ( A < 0,05 )

Desvios da linearidade: – Altas concentrações

– Auto-supressão – Auto-absorção

Espectros de emissão e excitação.

InstrumentaçãoComponentes de um espectofluorimetro:

Instrumentação - Componentes Fontes de Radiação

Lâmpadas: (custo) Lâmpada de vapor de mercúrio – várias linhas intensas

para promover a excitação – uso de filtros de absorção ou de interferência.

Lâmpada de arco de xenônio a alta pressão – fonte contínua ~ radiação do corpo negro.

Lasers: (sensibilidade) Lasers de corantes sintonizáveis bombeados por laser

pulsado de N2 ou laser Nd:YAG .

Instrumentação - Componentes

Filtros e Monocromadores – Filtros são comuns em fluorímetros enquanto que mono-

cromadores são essenciais em espectrofluorímetros

Transdutores (detectores) – Fotomultiplicadoras (PMT) ou contador de fótons – Arranjo de diodos e dispositivos de carga acoplada (CCD)

Instrumentação - Fluorímetros

Instrumentação – Espectrofluorimetro

Instrumentação – Instrumentos baseados em arranjos de detectores

Aplicações e Métodos de Fotoluminescência

Essencialmente Cátions

Moléculas Orgânicas:

Fluorescência nativaAgentes derivatizantes

Reagentes Fluorimetricos

Métodos Fosforimétricos

Aplicações variadas – Grande seletividade Bioquímica (ácidos nucléicos, proteínas, etc.) Indústria do petróleo (hidrocarbonetos poliaromáticos)

A fluorescência excitada por laser é particularmente importante para esse tipo de aplicação porque o feixe pode ser facilmente focalizado e um tamanho adequado ao diâmetro da coluna

Detecção da Fluorescência por cromatografia líquida

Medidas de Tempo de Vida

Possibilita análise qualitativa - Permite análise de mistura de

moléculas fluorescentes (com espectros similares)

Instrumentação mais sofisticada – Lasers – PMT de resposta rápida – Contadores de tempo de alta

sincronização

Métodos de Fluorescência por Imagem

Combinação da espectroscopia de fluorescência com a microscopia óptica para produzir imagens localizadas de fluoróforos em matrizes complexas tais como uma única célula.

Ex: neurobiologia Corante Fura-2 usado para monitorar a concentração de cálcio intracelular livre de acordo com estímulos farmacológicos ou elétricos.

Quimiluminescência É produzida quando uma reação química produz uma espécie eletronicamente excitada que emite luz quando retorna ao seu estado fundamental.

É encontrado em sistemas biológicos nos quais o processo é denominado bioluminescência.

QuimiluminescênciaA + B → C* D C* → C + h ν

Número limitado de reações – maiores exemplos vêm dos sistemas biológicos – bioluminescência: vagalumes (luciferase),

águas-vivas, crustáceos, etc. (altas profundezas) • Elevada seletividade esimplicidade instrumental • Atualmente apresenta grande importância biotecnológica – GFP – proteína fluorescente verde • Luminol

Aplicações Analíticas da Quimiluminescência Altamente sensíveis : baixos níveis de luz são

facilmente monitorados na ausência de ruído. Atenuação por radiação por filtro ou

monocromador não é necessário. Os limites de detecção são detectados pela pureza

d o reagente. Limites de Detecção típicos situam-se nas faixas de

ppb ou até ppm. A precisão das determinações varia dependendo da

instrumentação e do cuidado tomado na analise.

Espectrofluorometria como sistema de Detecção Acoplamento com métodos de separação em fase líquida: – HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência – µLC – cromatografia líquida capilar – CE – eletroforese capilar – LIF – fluorescência induzida a laser Maiores níveis de sensibilidade – 10-9 mol/L a 10-12mol/L – Detecção de uma única molécula

Sequenciamento de DNA – Resolução espectral + alta sensibilidade

Referência Bibliográfica: SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de

Química Analítica, Tradução da 8ª Edição norte-americana,Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.

Obrigado!!!

Integrantes:

Arthur Henrique de CastroPaula Loureiro Moura