Carla Andrea Alonso Arribas

Carmen Torres Manrique

Facultad de Ciencia y Tecnología

Agricultura y Alimentación

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TESIS DOCTORAL

Curso Académico

Epidemiología molecular en Escherichia coli procedentede fauna salvaje : resistencia antimicrobiana, virulencia y

diversidad y diversidad genética

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2019

publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es

Epidemiología molecular en Escherichia coli procedente de fauna salvaje :resistencia antimicrobiana, virulencia y diversidad y diversidad genética, tesisdoctoral de Carla Andrea Alonso Arribas, dirigida por Carmen Torres Manrique (publicada

por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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Tesis presentada como compendio de publicaciones. La edición en abierto de la misma NO incluye las partes afectadas por cesión de derechos

UNIVERSIDAD DE LA RIOJA

DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA Y ALIMENTACIÓN ÁREA DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Epidemiología molecular en Escherichia coli procedente de fauna salvaje: resistencia

antimicrobiana, virulencia y diversidad genética

Molecular epidemiology of Escherichia coli from wildlife: antimicrobial resistance, virulence and

genetic diversity

Carla Andrea Alonso Arribas

Logroño, 2018

Departamento de Agricultura y Alimentación

Área de Bioquímica y Biología Molecular

TESIS DOCTORAL

Epidemiología molecular en Escherichia coli procedente de fauna salvaje: resistencia antimicrobiana, virulencia y diversidad genética

Molecular epidemiology of Escherichia coli from wildlife: antimicrobial resistance, virulence and genetic diversity

Memoria presentada por CARLA ANDREA ALONSO ARRIBAS para optar al grado de Doctora con la Mención Internacional por la Universidad de La Rioja

Logroño, Noviembre 2018

Departamento de Agricultura y Alimentación

Área de Bioquímica y Biología Molecular

Dra. CARMEN TORRES MANRIQUE, Catedrática del Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de La Rioja.

Por la presente declara que,

La memoria titulada “Epidemiología molecular en Escherichia coli procedente de fauna salvaje: resistencia antimicrobiana, virulencia y diversidad genética”, que presenta Dña. CARLA ANDREA ALONSO ARRIBAS, Licenciada en Biología y Bioquímica por la Universidad de Navarra, ha sido realizada en el Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de La Rioja, bajo su dirección, y reúne las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor.

Lo que hace constar en Logroño, a 29 de noviembre de 2018.

Fdo.: Carmen Torres Manrique

Yo soy de los que piensan que la ciencia tiene una gran belleza. Un científico en su

laboratorio no es sólo un técnico, también es un niño colocado ante fenómenos

naturales que lo impresionan como un cuento de hadas.

Marie Curie

La ciencia y la vida no pueden ni deben estar separadas. Para mí la ciencia da una

explicación parcial de la vida. Tal como es se basa en los hechos,

la experiencia y los experimentos…

Estoy de acuerdo en que la fe es fundamental para tener éxito en la vida, pero no

acepto tu definición de fe, la creencia de que hay vida tras la muerte.

En mi opinión, lo único que necesita la fe es el convencimiento de que esforzándonos

en hacer lo mejor que podemos nos acercaremos al éxito,y que el éxito de nuestros

propósitos, la mejora de la humanidad de hoy y del futuro, merece la pena

conseguirse.

Rosalind Franklin

Estas son las últimas líneas que escribo en esta tesis. Y, curiosamente, también cuestan…

Lógicamente dar las gracias es una necesidad, nace, pero al hacerlo vienen a la memoria todos

los momentos vividos a lo largo de estos últimos años y me resulta difícil no emocionarme. Para

mí, una persona apasionada y un poco obsesiva por su trabajo, la tesis ha sido una experiencia

intensa. Me ha permitido amar más la Microbiología, algo que ya empezó a seducirme en la

Universidad y a conquistarme durante la residencia. Ahora tengo una perspectiva mucho más

amplia y mayores ansias de saber. La tesis también me ha enseñado, aunque sigo aprendiendo, a

tolerar mejor las frustraciones. Experimentos que salen a la quinta (siendo optimistas),

contaminaciones que te desbaratan cualquier planificación, tardes y findes “divertidos” con E.

coli en vez de con tus amigas o pareja, por no hablar de esos emails en los que la palabra

rejected parece estar escrita en arial 32, negrita y subrayada… Aprendes casi tanto de ciencia

como a superar tus propios límites. Pero acumulas tantas experiencias… Conoces lugares y

personas que enriquecen tu vida, que te ayudan y alientan. A todas ellas les doy las gracias, pues

son la parte más bonita de esta etapa.

A mi directora de tesis, Carmen, por guiarme en este camino con ese entusiasmo, optimismo,

ilusión y amor por el trabajo que tanto te caracterizan. Por tener las puertas del despacho

siempre abiertas para escucharnos, por transmitirme seguridad con mis miedos o propuestas, y

por ilusionarte y ensalzar siempre nuestros pequeños éxitos. Muchas gracias por darme tu apoyo

y confianza; por hacer de mí la investigadora en la que me he convertido.

A Fernanda, Myriam, Carmen Tenorio y Marta, por ayudarme con las prácticas y estar siempre

dispuestas a resolver mis dudas docentes, por mantenernos informadas de la vida universitaria y,

especialmente a Fernanda, por preocuparte de nuestra seguridad en el laboratorio. A Susana y

Carmen Olarte, contagiáis esa alegría tan necesaria. Siempre es un placer trabajar con vosotras.

A Toño, porque sin él los miles de trámites con los que he tenido que lidiar hubieran sido

infinitamente más complicados. Gracias por hacer siempre todo lo posible por ayudarme. A

Rosa y Mamen, por nuestras risas y confidencias, y ¡por recordarme que ya era hora de comer!

Yoly, Bea y Lidia, cómo olvidar todos los buenos ratos que hemos compartido en congresos y

cursos… Gracias por hacerme sentir una más de vuestro equipo. También por estar siempre

dispuestas a echarme una mano cuando tenía dudas o me faltaba material.

A todos los investigadores que han colaborado para que esta tesis viera la luz y de los que he

aprendido tanto. Gracias a David González, Francisco Ruiz, Carmen Simón y Leticia Alcalá por

encargaros de los laboriosos muestreos y poner a mi disposición todo vuestro conocimiento

veterinario. A Jorge Blanco, Azucena Mora y Dafne Díaz, por ayudarme tan intensamente en la

caracterización de las cepas STEC/EPEC y resolver todas mis dudas. A Fernando de la Cruz y

María de Toro, por darme la oportunidad de acceder a la tecnología WGS, por brindarme

siempre amablemente vuestro conocimiento y abrir mi mente a nuevas formas de explorar el

mundo bacteriano. María, muchas gracias por tu tiempo, comprensión y paciencia.

Many thanks to Prof. Dr. Stefan Schwarz for hosting me in your research group at Friedrich-

Loeffler-Institut in Neustadt-Mariensee. It has been a great pleasure and good fortune to work

and learn from you. My special thanks to Geovana, without your invaluable help I would not

have been able to finish this project. Thanks for never getting tired of fielding all my questions

but also, and especially, for your warmth and kindness. Andrea, Kristina, Roswitha, Ute, Lisa

and all members of the group, thanks a lot for your fond welcome and support during my time at

your lab. Thank you Amanda, Rolf, Roberto, Ayan, Diego, Jun and Sandra for coming into my

life, turning our house into a home and sharing plenty of laughs and good times together. I

really hope to see you all again!!

Gracias a Daniela y Paula, por acogerme en el Dpto. de Microbiología e Inmunología de la

Universidad de Buenos Aires, por hacerme sentir como un miembro más del equipo y

transmitirme esa pasión por los integrones. Me quedé con ganas de más. A mi valiente Angie,

Marian, Gise, Sabri, Fernando, Flor, Luciana, Vero... por vuestro cariño y amistad. Rememoro

esos “majos” o “madre del amor” con vuestro envidiable acento en el que todo suena major.

¡Qué risas! Y siempre me dejabais con ganas del segundo beso… Gracias por vuestro calor, por

esos momentos de mates o cerves tan únicos, por luchar juntos por la ciencia, ¡y hasta por

salvarme de la luz UV! Sé que nos volveremos a ver al otro lado del charco, aunque sabéis que

en éste también tenéis un hogar.

Al Ministerio de Economía y Competitividad, por financiar mi recorrido investigador y darme

la posibilidad de realizar las dos estancias en el extranjero que tanto me han enriquecido a nivel

científico y personal. Ojalá nuestro país no deje de invertir en ciencia. He conocido tantos

científicos y compañeros increíbles que hacen tanto con tan poco… Merece la pena seguir

apostando, porque la ciencia es la traslación de la curiosidad humana y, como tal, es fuente de

conocimiento y riqueza. #SinCienciaNoHayFuturo.

Gracias también a todos los compañeros de México, Portugal, Túnez, Argelia… con los que

hemos tenido la oportunidad de trabajar codo con codo. A mi veci Gerardo, Elena, Isabel,

Marga, Elaa, Layla, Farah, Houssem, Raoudha, Olfa, Sarra, Farida y tantos más… Por

ofrecernos vuestra amistad, por haber compartido ideas y risas en una mezcla loca de idiomas, y

por hacer del labo un lugar en el que todos aprendimos de todos.

Ufff… Y llega lo mejor de esta experiencia… ¡Porque he tenido los mejores compañeros del

mundo mundial! Llamarlos compañeros se queda corto… sois amigos, en mayúsculas. Nuestra

cuadrilla ha ido creciendo y enriqueciéndose con cada uno de vosotros. El ambiente de trabajo

del labo 229 ha sido mágico. Ese buen rollo… todos siempre dispuestos a echarnos una mano.

Y fuera… las mejores laureles, burguerheims, scape rooms, noches, excursiones, despedidas,

bodas y demás celebraciones. ¡¡¡Que nunca acaben!!! Gracias a Paula, Carmencita, Miri, Sara,

Laura, Dani, Vane, Femi, Nere, Roci, Quique, Alberto, Filipe, Marina y Rosa. Todo lo que

hemos compartido y avanzado juntos en estos ya casi 5 años… Unos han pasado de ser main

planners y alma de fiesta a muy pronto responsables papis; otr@s de buen@s alumn@s a

estupend@s profes (hay esperanza en la juventud del mañana!); las más peques nos han

contagiado su ilusión, dulzura y estilo (quiero unicornios y consejos de por vida Laura!) y

nuestras parejas, que muchas veces hemos visto nacer, son ya parte de esta familia. A todos,

GRACIAS. Llenáis de felicidad cada recuerdo de esta etapa. Miri, Pau y Carmencita, sin

vuestro apoyo, bondad y cariño incondicionales este camino hubiera sido más empinado. Sabéis

que os admiro y quiero un montón. Sara y Pau, ¡lo estamos consiguiendo juntas!

Gracias a mis amigas de siempre, porque han sufrido cada uno de mis traspiés y celebrado como

propios mis pequeños logros. Porque nunca me han dejado caer. Os tengo presentes a todas,

sólo que a algunas os ha tocado padecerme más de cerca durante esta etapa. Gracias infinitas a

Erena, mi hermana de alma, siempre serás un ejemplo para mí. A Andrea, Rosi y Patri, qué

haría yo sin vosotras… mis duendes, siempre a mi lado. ¡Sueño con ponerle la guinda a esta

aventura con uno de nuestros mojitos en Gorraiz!. A Rakel, Luci y Aran, la “innombrable” ya

está viendo la luz… A Bea, desde la uni lo que ha llovido… ¡y siempre que escribo quisiera

verte entrar con uno de tus bailes por la puerta de mi habitación!

Dante, no concibo esta etapa sin tu luz. Has sido mi protagonista emocional, mi mejor

descubrimiento (y además, literalmente, científico), mi apoyo incondicional, el mejor consejero.

Has confiado en mí, siempre más que yo misma. Has sido paciente y comprensivo,

mostrándome siempre el lado bonito de las cosas. He tenido la suerte de poder compartir

contigo todas mis dudas e ilusiones profesionales y personales. Y todo esto, la mayor parte del

tiempo, a miles de kilómetros de distancia. Pero te he sentido tan cerca… Hemos superado mil

obstáculos, juntos, de la mano, y sólo espero que consigamos seguir haciéndolo durante muchos

años más. Te quiero. Gracias también a mi familia argentina (Gloria, Carlos, Marco y Franco),

porque siempre he sentido vuestro apoyo y cariño.

Y, por último, si bien son lo primero, a mi familia. A Adriana y Víctor, porque lleváis media

vida aguantado los rollos científicos de la chapas de vuestra hermana mayor. Desde la

evolución del sistema nervioso de los seres vivos hasta la problemática de la resistencia

antimicrobiana. Y, aunque sé que no están dentro de vuestros ítems favoritos, siempre me

habéis escuchado pacientes y, al menos disimulando bien, con cierto interés. Una de las

mayores suertes de mi vida sois vosotros, pues sois mi eterno apoyo. Y, la verdad, no hay

personas con las que pueda llegar a reirme más. Gracias por aguantarme también en los

momentos de crisis, ya que soléis ser esa primera llamada de auxilio. En fin, ¡gracias a aita y a

ama por haceros existir! Mis padres, no sé por donde empezar… Gracias por quererme tanto,

por ser el mejor y más fiel apoyo en cada etapa de mi vida. Gracias por haber priorizado

siempre nuestra educación y bienestar, aunque eso os supusiera prescindir de muchas

comodidades. Gracias por darnos alas para dibujar nuestro futuro con libertad y, al mismo

tiempo, brindarnos siempre una raíz sólida que nos sostiene y alienta. Gracias eternas por creer

en mí como nadie y por enseñarme el valor del esfuerzo, el trabajo y la perseverancia. Os quiero

mucho, y esta tesis es tan mía como vuestra.

A MIS PADRES

ÍNDICE

ABREVIATURAS .................................................................................................................. I

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... III

LISTA DE TABLAS .............................................................................................................IX

RESUMEN ............................................................................................................................ 11

SUMMARY ........................................................................................................................... 15

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 19

1. La problemática de la resistencia a los antibióticos .......................................................... 21

2. Escherichia coli .............................................................................................................. 24

2.1. Características generales ........................................................................................... 24

2.1. Genoma y plasticidad genética .................................................................................. 25

2.3. Estructura poblacional y filogenia molecular ............................................................. 28

2.4. Patotipos .................................................................................................................. 30

2. 4. 1. Cepas patógenas intestinales de E. coli (E. coli diarrogénicas) .............................. 30

2. 4. 2. Cepas patógenas extraintestinales de E. coli (ExPEC) .......................................... 32

3. Mecanismos generales de resistencia a antibióticos .......................................................... 33

4. Antibióticos β-lactámicos ................................................................................................ 35

4. 1. Mecanismos de acción y resistencia ......................................................................... 35

4. 2. β-lactamasas ............................................................................................................ 36

4.3. Grupo clonal ST131.................................................................................................. 41

5. Mecanismos de acción y resistencia a otros antibióticos ................................................... 44

5.1. Quinolonas ............................................................................................................... 44

5.2. Aminoglucósidos ...................................................................................................... 47

5.3. Tetraciclinas ............................................................................................................. 48

5.4. Cloranfenicol ............................................................................................................ 49

5.5. Sulfamidas y trimetoprim ......................................................................................... 50

6. Elementos genéticos de adquisición y diseminación de genes de resistencia ..................... 51

6.1. Elementos transponibles ........................................................................................... 52

6.2. Integrones................................................................................................................. 54

6.3. Plásmidos ................................................................................................................. 59

7. Sistemas CRISPR/Cas ..................................................................................................... 63

Justificación temática de la tesis .......................................................................................... 65

OBJETIVOS ......................................................................................................................... 67

OBJECTIVES ....................................................................................................................... 71

RESULTADOS ..................................................................................................................... 75

CAPÍTULO 1 . Estructura poblacional y caracterización de la resistencia/virulencia en cepas de E. coli procedentes de fauna salvaje (Castilla La Mancha y Andalucía).................. 79

ARTÍCULO 1 ................................................................................................................ 85 Alonso CA, González-Barrio D, Tenorio C, Ruiz-Fons F, Torres C. 2016. Antimicrobial resistance in faecal Escherichia coli isolates from farmed red deer and wild small mammals. Detection of a multiresistant E. coli producing extended-spectrum beta-lactamase. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 45, 34-39.

ARTÍCULO 2 ................................................................................................................ 93 Alonso CA, González-Barrio D, Ruiz-Fons F, Ruiz-Ripa L, Torres C. 2017. High frequency of B2 phylogroup among non-clonally related fecal Escherichia coli isolates from wild boars, including the lineage ST131. FEMS Microbiol. Ecol. 93 (9).

CAPÍTULO 2. Diversidad genética y caracterización de la resistencia en cepas de E. coli procedentes de fauna salvaje (Pirineo Aragonés y La Rioja)........................................ 101

ARTÍCULO 3 .............................................................................................................. 107 Alcalá L*, Alonso CA*, Simón C, González-Esteban C, Orós J, Rezusta A, Ortega C, Torres C. 2016. Wild birds, frequent carriers of extended-spectrum β-lactamase (ESBL) producing Escherichia coli of CTX-M and SHV-12 types. Microb. Ecol. 72, 861-869.

ARTÍCULO 4 .............................................................................................................. 119 Alonso CA, Alcalá L, Simón C, Torres C. 2017. Novel sequence types of extended-spectrum an acquired AmpC beta-lactamase producing Escherichia coli and Escherichia clade V isolated from wild mammals. FEMS Microbiol. Ecol. 93 (8).

CAPÍTULO 3. Elementos genéticos involucrados en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos .................................................................................................... 135

ARTÍCULO 5 .............................................................................................................. 141 Alonso CA, Michael GB, Li J, Somalo S, Simón C, Wang Y, Kaspar H, Kadlec K, Torres C. 2017. Analysis of blaSHV-12 carrying Escherichia coli clones and plasmids from human, animal and food sources. J. Antimicrob. Chemother. 72, 1589-1596.

ARTÍCULO 6 .............................................................................................................. 159 Alonso CA, Cortés-Cortés G, Maamar E, Massó M, Rocha-Gracia RC, Torres C, Centrón D, Quiroga MP. 2018. Molecular diversity and conjugal transferability of class 2 integrons among Escherichia coli isolates from food, animal and human sources. Int. J. Antimicrob. Agents. 51, 905-911.

Anexo. Ensayos de escisión de cassettes del integrón de clase 2, mediados por intI1 .......... 173

CAPÍTULO 4. Fauna salvaje como potencial reservorio de patotipos STEC y EPEC ........ 183

ARTÍCULO 7 .............................................................................................................. 187 Alonso CA, Mora A, Díaz D, Blanco M, González-Barrio D, Ruiz-Fons F, Simón C, Blanco J., Torres C. 2017. Occurrence and characterization of stx and eae-positive Escherichia coli isolates from wildlife, including a typical EPEC strain from a wildboar. Vet. Microbiol. 207, 69-73.

CAPÍTULO 5. Estudio de cepas comensales de E. coli desde un abordaje genómico ........ 201

ARTÍCULO 8 .............................................................................................................. 207 Genomic insights into drug resistance and virulence platforms, CRISPR/Cas systems and phylogeny of commensal E. coli from wildlife. (en preparación)

DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 243

Capítulos 1 y 2 .................................................................................................................. 245

Capítulo 3 ......................................................................................................................... 272

Capítulo 4 ......................................................................................................................... 280

Capítulo 5 ......................................................................................................................... 287

CONCLUSIONES .............................................................................................................. 295

CONCLUSIONS ................................................................................................................. 299

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 303

ANEXOS ............................................................................................................................. 345

ANEXO 1. Nuevos ST y pST descritos en esta tesis .......................................................... 347

ANEXO 2. Cebadores diseñados en esta tesis .................................................................... 348

ANEXO 3. Secuencias nucleotídicas incluidas en GenBank o EMBL ................................ 349

ANEXO 4. Genomas de referencia usados en el árbol de SNPs ......................................... 350

ANEXO 5. Artículo de revisión......................................................................................... 356 Alonso CA, Zarazaga M, Ben Sallem R, Jouini A, Ben Slama K, Torres C. 2017. Antibiotic resistance in Escherichia coli in husbandry animals: the African perspective. Lett. Appl. Microbiol. 64, 318-334.

I

ABREVIATURAS

aEPEC E. coli enteropatógena atípica

BFP Bundle-forming pilus

BLEE β-lactamasa de especto extendido

CC Complejo clonal

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI Concentración Mínima Inhibitoria

CS Conserved segment

DAEC E. coli con adherencia difusa

DPMT Degenerate primer MOB typing

DR Repeticiones directas

EAEC E. coli enteroagregativa

EIEC E. coli enteroinvasiva

EPEC E. coli enteropatógena

ETEC E. coli enterotoxigénica

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

ExPEC E. coli patógeno extraintestinal

GC Genes cassettes

ICE Elementos conjugativos integrativos

IRL Left inverted repeat

IRR Right inverted repeat

IS Secuencia de inserción

QRDR Quinolone resistance determining region

LEE Isla de patogenicidad de borrado de enterocitos

MDR Multidrogo resistente

MLST Multilocus sequence typing

MLEE Multilocus enzyme electrophoresis

OIE Organización Mundial de Sanidad Animal

OMS Organización Mundial de la Salud

II

pAmpC AmpC plasmídica

PBRT Plasmid-based replicon typing

PCR Polymerase chain reaction

PFGE Pulsed field gel electrophoresis

pMLST Plasmid multilocus sequence typing

PMQR Plasmid-mediated quinolone resistance

pST Secuencia tipo plasmídica

SE-PAI Isla de patogenicidad codificante de la subtilasa

SI Superintegrones

SNP Single Nucleotide Polymorphism

ST Secuencia tipo

STEC E. coli productora de toxina Shiga

SUH Síndrome urémico hemolítico

tEPEC E. coli enteropatógena típica

TGH Transferencia genética horizontal

Tn Transposón

WGS Whole genome sequencing

III

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Dispersión de la resistencia a antimicrobianos en el entorno (Adaptado de

Arnold et al. 2016).

Figura 2. Distribución del ADN exógeno adquirido mediante TGH en genomas de

distintas especies bacterianas. En azul, el genoma nativo; en amarillo, el ADN exógeno

correspondiente a elementos genéticos movilizables, incluyendo transposones y

bacteriófagos; en rosa, otras secuencias de ADN exógeno. El porcentaje total de ADN

exógeno se muestra a la derecha de cada barra (Ochman et al. 2010).

Figura 3. Mecanismos de adquisición de genes de resistencia a antibióticos (Alekshun y

Levy, 2007).

Figura 4. Patotipos de E. coli diarrogénicas (Kaper et al. 2004).

Figura 5. Factores de virulencia de E. coli uropatógena (Lüthje y Brauner, 2014).

Figura 6. Principales dianas de acción de los antimicrobianos y mecanismos de

resistencia desarrollados por las bacterias (Wright, 2010).

Figura 7. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos (Suárez y Gudiol, 2009).

Figura 8. Diagrama que representa los distintos grupos o clusters en los que se dividen

las enzimas CTX-M, elaborado a partir de la comparación de las secuencias

aminoacídicas de las CTX-M y proteínas afines de Kluyvera spp., disponibles en la web

Lahey Clinic (www.lahey.org/Studies/) y en la base de datos RED-DB

(www.fibim.unisi.it/REDDB/). El tamaño de los triángulos del final de las ramas es

proporcional al número de variantes dentro de cada grupo (D’Andrea et al. 2013).

Figura 9. Estructura poblacional de E. coli ST131. Los colores muestran la resistencia

típicamente asociada (no exclusiva) a los diferentes subclones. TMP-SMZ

(trimetoprim-sulfametoxazol), FQ (fluoroquinolonas).

Figura 10. Elementos genéticos involucrados en la adquisición/diseminación de genes

de resistencia. Los elementos superpuestos indican relación física o funcional (Boerlin y

Reid-Smith, 2008).

Figura 11. Tipos de elementos transponibles de acuerdo con su estructura. Triángulos

morados: Repeticiones directas (DR); Rectángulos rayados: Repeticiones invertidas

IV

(IRs); Rectángulos rosas: genes codificantes de la transposasa; Rectángulo azul-

grisáceo: gen codificante de la resolvasa; Rectángulo azul cielo: genes de resistencia;

Rectángulo gris oscuro: sitio res.

Figura 12. Estructura y funcionamiento del integrón de clase 1. Inserción y escisión de

genes cassettes mediante recombinación sitio-específica mediada por la integrasa.

Figura 13. Modelo evolutivo del integrón de clase 2. A) Integrón de clase 2 ancestral,

portador de una integrasa funcional. LexA se une a su promotor y reprime la expresión

de los genes cassettes. Los promotores Pc2 pertenecen a las variantes de alta fuerza

promotora (Pc2AV1, Pc2BV1), lo que promueve la expresión de los genes cassettes. B)

El promotor de LexA evoluciona evitando la unión de LexA y desreprimido la

integrasa, que se expresa constitutivamente (aumentando el coste biológico del

integrón). Este alto coste biológico se compensará a través de mutaciones. C) Aparece

una mutación en intI2 que origina una integrasa no funcional, lo que rebaja el coste

biológico del integrón de clase 2 (estructura altamente prevalente). D) Se producen

mutaciones en las regiones promotoras que originan promotores débiles (Pc2AV2,

Pc2BV2), lo que disminuye la expresión de la integrasa funcional (estructura poco

prevalente) (Jové et al. 2010).

Figura 14. Estructura general del integrón de clase 2. El asterisco indica que el gen

intI2 codifica una proteína truncada. La región conservada 3’ contiene el módulo de

transposición del Tn7, que permite la movilización del integrón.

Figura 15. Organización modular de un plásmido conjugativo y un plásmido

movilizable. Los genes aparecen coloreados en base al módulo funcional al que

pertenecen. El módulo de propagación se divide en dos colores: en rojo, la región

involucrada en el procesamiento del ADN para su conjugación; en naranja, la

responsable de la síntesis del sistema de secreción de tipo IV (Garcillán-Barcia et al.

2011).

Figura 16. Correspondencia entre clases MOB e Inc/REP. En ausencia de un grupo de

replicación definido como grupo de incompatibilidad, se indica un plásmido prototipo

(Alvarado et al. 2012).

Figura 17. Diagrama que muestra el flujo de trabajo desarrollado en esta tesis doctoral.

V

Figura 18. Gel PFGE-S1 para determinar el número y tamaño de los plásmidos en las 3

cepas BLEE/pAmpC y sus correspondientes transconjugantes (TC). 1 y 8, MidRange I

PFG Marker (New Englands Biolabs®); 2, C7389; 3, TC7389; 4, C8395; 5, TC8395; 6,

C7577; 7, TC7577.

Figura 19. Dendograma generado con el algoritmo UPGMA a partir del perfil de

bandas obtenido tras analizar por XbaI-PFGE el ADN total de las 23 cepas portadoras

del gen blaSHV-12 incluídas en este estudio.

Figura 20. Perfiles de restricción (RFLP) de los plásmidos portadores del gen blaSHV-12

tras digestión con las endonucleasas EcoRI, HindIII y BamHI. (A) Plásmidos IncI1 de

las cepas C7385 (calle 1), C7394 (calle 2) y C7401 (calle 3); (B) Plásmidos IncK de las

cepas C4748 (calle 4), C4745 (calle 5), C2575 (calle 6). Las calles indicadas con la letra

“L” contienen el marcador de peso molecular (1 kb plus DNA Ladder; Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA).

Figura 21. Mapa circular del plásmido IncI1 pCAZ590 (número de acceso LT669764).

Algunos genes relevantes aparecen nombrados. Del interior al exterior, el segundo

anillo muestra los fragmentos de genes truncados, el tercer y cuarto anillo representan

las secuencias codificantes en sentido forward y reverse, respectivamente. Los genes

aparecen coloreados de acuerdo a su funcionalidad (ver leyenda). El anillo más externo

señala los diferentes módulos funcionales del plásmido.

Figura 22. Ilustración lineal del complejo de multiresistencia del plásmido pCAZ590 y

análisis comparativo con respecto a Tn21 (número de acceso AF071413) y Tn1721

(número de acceso X61367). La secuencia se muestra de acuerdo a la orientación

descrita para Tn21 y Tn1721, aunque el complejo en pCAZ590 se encuentra en

orientación inversa. Las regiones codificantes aparecen como flechas coloreadas

siguiendo la leyenda de la ilustración del plásmido circular pCAZ590. Las secuencias

de inserción (IS) se muestran con bordes rectangulares. Las líneas verticales representan

las repeticiones invertidas (IR) de elementos IS y transposones.

Figura 23. Representación esquemática del nuevo entorno genético del gen blaSHV-12,

presente en la cepa de E. coli 101689 (número de acceso LT621755). El fragmento de

ADN insertado, que trunca el gen putativo deoR, da lugar a una estructura de transposón

compuesto. Los dos elementos IS26 se muestran con bordes rectangulares y las líneas

verticales representan las repeticiones invertidas (IRR, IRL).

VI

Figura 24. Esquema de las regiones amplificadas con los distintos sets de cebadores. La

longitud esperada (en pares de bases) para cada amplicón, se muestra detrás de la región

acotada por cada par de cebadores.

Figura 25. Esquema general del procedimiento seguido en el ensayo de escisión in vivo

de cassettes del integrón de clase 2, mediado por la integrasa de clase 1.

Figura 26. Geles de agarosa que muestran el resultado de la región amplificada con los

cebadores 125’CS/SatR (a) y SatF/123’CS (b) en las colonias obtenidas tras el ensayo

de escisión. Las calles numeradas del 1 al 30 muestran el resultado de la amplificación

en las colonias transformadas y sometidas al ensayo de escisión, CN indica control

negativo (sin ADN), λ el marcador de peso molecular y pn436 el resultado de la

amplificación en la cepa sin transformar con el plásmido pMI1-1.

Figura 27. Gel de agarosa que muestra los amplicones obtenidos tras someter a PCR

con los cebadores RVIntI2-F/RVIntI2-R algunas de las colonias obtenidas tras los

ensayos de escisión (pn436-13, pn436-1, pn436-2, pn436-4 y pn436-5). En las calles 6 y

7 se observan las bandas del tamaño esperado en ausencia de escisión (cepa pn436, sin

transformar). En la calle 8 el control negativo (sin ADN).

Figura 28. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los únicos 2 fragmentos de

diferente tamaño observados tras la PCR RVIntI2-F/RVIntI2-R realizada a las colonias

sometidas al ensayo de escisión. A) Secuencia nucleotídica de la región variable del

integrón de clase 2 presente en la colonia pn436-4 (no se observa escisión); B)

Secuencia nucleotídica de la región variable del integrón de clase 2 presente en la

colonia pn436-5 (se observa la ausencia de gen cassette aadA1). En negrita y subrayado

se muestra la secuencia resultante tras la recombinación attC x attC.

Figura 29. En la parte superior se muestra un esquema del integrón de clase 2,

destacándose mediante líneas discontinuas los ORFs y mediante líneas continuas los

attC, conteniendo los sitios core R y L de unión a la integrasa (rectángulos azules y

grises). Debajo, la estructura en tallo-bucle de los attCs (hebra inferior) de los cassettes

sat2 y aadA1. Los sitios de unión a la integrasa aparecen recuadrados y, en su interior,

las regiones R1-R2 y L1-L2. Los rayos señalan el punto de corte de la integrasa de clase

1. A la izquierda, proceso de escisión del cassette aadA1 (según el mecanismo

propuesto por MacDonald et al. 2006). La hebra inferior que contiene los attCs

(generados gracias a un intermediario de conjugación o replicación) se pliega formando

VII

un sustrato de estructura conservada. Dos monómeros de la integrasa (óvalos amarillo y

turquesa) se unen a los sitios R y L. La integrasa produce un corte en R1 (entre los

residuos C y A), posibilitando la recombinación que se resuelve gracias a distintos

componentes celulares.

Figura 30. Patrones de PFGE obtenidos tras la digestión con XbaI del ADN genómico

de las cepas STEC y EPEC aisladas de fauna salvaje (n=23). La asociación entre

serotipo, genes de virulencia, fenotipo de resistencia y filogrupo se muestra en la tabla

de la derecha. aNo testado; bLas cepas inicialmente clasificadas como no móviles

(HNM) o no tipables (HNT) por la técnica de seroaglutinación, se testaron por PCR

para confirmar la presencia/ausencia de genes flagelares. Los resultados derivados de la

PCR se muestran entre corchetes, [H]; cAMP: Ampicilina, TE: Tetraciclina; SXT:

Trimetoprim-sulfametoxazol.

Figura 31. Árbol filogenético construido con el método Neighbor-Joining a partir de la

secuencia aminoacídica correspondiente a la región interna variable del operón stxAB2

(incluyendo la región intergénica).

Figura 32. Número y animales (aves y mamíferos) portadores de E. coli BLEE/AmpC,

así como distribución y tipo de variantes implicadas.

Figura 33. Distribución de enzimas BLEE en nuestra colección de cepas de E. coli

aisladas de fauna salvaje, en otra colección de Galicia (Viso, 2017) y en cepas de

distintos orígenes aisladas en La Rioja (Somalo, 2013).

Figura 34. Esquema Full goeEBURST (software Phyloviz) que relaciona los STs

obtenidos con el origen de las cepas de E. coli BLEE/pAmpC (fauna salvaje, humanos,

perros, alimentos). Cada nodo representa un ST y su tamaño es proporcional al número

de cepas pertenecientes al mismo. Aparecen unidos los nodos que presentan hasta 6

alelos distintos, siendo independientes aquellos que muestran los 7 loci diferentes.

Figura 35. Distribución de genes bla en función del ST en cepas de E. coli procedentes

de fauna silvestre.

Figura 36. Distribución filogenética de las cepas de E. coli aisladas de mamíferos

salvajes en relación a su fenotipo de resistencia. El análisis filogenético en mamíferos

(artículos 1, 2 y 4) se llevó a cabo según el esquema ampliado de Clermont et al. 2013

(filogrupos A, B1, B2, C, D, E, F y clados crípticos).

VIII

Figura 37. Distribución filogenética de las cepas de E. coli con genotipo BLEE y/o

AmpC aisladas de aves salvajes. El análisis de los grupos filogenéticos, en el artículo 3,

se realizó siguiendo el esquema clásico de Clermont et al. 2003 (filogrupos A, B1, B2,

D).

IX

LISTA DE TABLAS

Table 1. Clasificación de las β-lactamasas (Mosquito et al. 2011).

Tabla 2. Mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas asociados a cambios en la CMI

de ciprofloxacino en E. coli (Adaptado de Yanat et al. 2017).

Tabla 3. Fenotipos de resistencia asociados a enzimas modificantes de aminoglucósidos

en E. coli (Adaptado de Martínez-Martínez y Ruiz de Alegría, 2009).

Tabla 4. Determinantes de resistencia a tetraciclina (Nguyen et al. 2014).

Tabla 5. Elementos genéticos de adquisición y transferencia de genes.

Tabla 6. Características de las cepas de E. coli portadoras de integrones de clase 2

incluídas en este estudio (n=35).

Tabla 7. Cebadores usados en el ensayo de escisión realizado en la Universidad de

Buenos Aires.

Tabla 8. Cebadores usados en la Universidad de La Rioja para amplificar y secuenciar

la región variable del integrón de clase 2 de las cepas obtenidas tras el ensayo de

escisión.

Tabla 9. Cebadores empleados en la identificación de E. coli y la caracterización de la

virulencia.

Tabla 10. Características fenotípicas y genotípicas de las cepas E. coli aisladas de

heces/intestino de mamíferos silvestres que mostraron resistencia a ≥1 de los

antimicrobianos testados.

Tabla 11. Características fenotípicas y genotípicas de las 21 cepas de E. coli aisladas de

fauna silvestre (aves y mamíferos) que mostraron resistencia a cefalosporinas de

espectro extendido.

Tabla 12. Revisión de la prevalencia, variantes enzimáticas y secuencias tipo de las

cepas E. coli BLEE/pAmpC reportadas en aves salvajes hasta diciembre de 2017. En

negrita la variante BLEE/pAmpC predominante. En azul, los ST detectados en las cepas

de nuestra colección. En azul y subrayado, el ST131.

Tabla 13. Revisión de la prevalencia, variantes enzimáticas y secuencias tipo de las

cepas E. coli BLEE/pAmpC reportadas en mamíferos salvajes hasta diciembre de 2017.

X

En negrita la variante BLEE/pAmpC predominante. En azul, los ST detectados en las

cepas de nuestra colección. En azul y subrayado, el ST131.

Tabla S1. Nuevos ST descritos en esta tesis y registrados en las bases de datos públicas.

Tabla S2. Nuevos pST (plasmid ST) descritos en esta tesis y registrados en las bases de

datos públicas.

Tabla S3. Listado de cebadores diseñados en esta tesis para la amplificación de

secuencias específicas.

Tabla S4. Números de acceso y características de las secuencias nucleotídicas incluídas

en el EMBL o GenBank.

Tabla S5. Información sobre las secuencias genómicas descargadas de la base de datos

del NCBI para la construcción del arból filogenético basado en los SNP del core.

11

RESUMEN

12

13

Resumen

En 2014 la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó el primer informe

mundial sobre la situación de la resistencia a los antibióticos. En él destacaba la necesidad de un

abordaje urgente del problema, con un enfoque One Health, que contribuyese a la protección de

la Salud Pública por medio del control de la resistencia en la población humana, animal y el

medio ambiente. Según la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), cerca del 60% de

los patógenos humanos son de origen animal. Pero la resistencia a antibióticos no se limita a las

bacterias causantes de procesos infecciosos, también afecta a aquellas no patógenas presentes en

diversos nichos ecológicos. Estas bacterias comensales representan igualmente una amenaza,

pues pueden constituir un reservorio importante de genes de resistencia y virulencia. Esta tesis

pretende brindar nuevos datos acerca del grado de diseminación de E. coli resistente a los

antibióticos en fauna silvestre, caracterizar los clones circulantes y su potencial epidémico,

analizar los mecanismos y plataformas genéticas implicadas en el flujo humano-animal-medio

ambiente e identificar reservorios salvajes de cepas con potencial zoonótico.

Los capítulos 1 y 2 abordan la estructura poblacional y la caracterización molecular de

la resistencia en E. coli de fauna salvaje. Se observa una baja-moderada frecuencia de detección

de cepas resistentes a los antibióticos en mamíferos (11.1%), predominando la resistencia a

agentes clásicos como tetraciclinas, penicilinas y sulfonamidas. Destaca la alta prevalencia de E.

coli BLEE/AmpC en aves (16%), siendo SHV-12 la principal variante implicada, seguida de

CTX-M-1, CTX-M-14 y CMY-2. El 82% de las cepas BLEE aisladas de fauna silvestre

mostraron un genotipo multirresistente, muchas veces en relación con la portación de integrones

de clase 1 conteniendo complejos arreglos de genes cassettes. Aunque la resistencia a

quinolonas estuvo mayormente mediada por mutaciones cromosómicas en GyrA/ParC,

detectamos el gen qnrS1 en una cepa de lechuza. Los genes codificantes de BLEE y AmpC

plasmídicas fueron transferibles por conjugación, estableciéndose las asociaciones blaCTX-M-

1/IncN, blaSHV-12/IncI1 y blaCMY-2/IncI1. Los resultados avalan el flujo bidireccional de la

resistencia y la existencia de linajes exitosos en la diseminación de genotipos BLEE/AmpC ya

que, si bien describimos nuevas secuencias tipo en fauna silvestre (ST4564, ST4954, ST4996,

ST7624, ST7629, ST7630, ST7631, ST7632), muchos de los clones son también frecuentes en

humanos, animales domésticos y alimentos (ST131, ST10, ST155, ST224, ST38, ST57). Se

detectaron clados crípticos de Escherichia en algunos mamíferos silvestres, con especial

relevancia de una cepa perteneciente al clado V, portadora de blaCTX-M-14 y diversos factores de

virulencia.

El capítulo 3 se centra en el estudio de elementos genéticos involucrados en la

selección, persistencia y dispersión de la resistencia entre distintos ecosistemas (humanos,

animales domésticos, fauna silvestre, alimentos). Respecto a la transferencia horizontal del gen

blaSHV-12, destacó la frecuente implicación de plásmidos IncI1, prevaleciendo el subtipo pST3 en

14

Resumen

aves de corral y el pST26 (y derivados del CC26) en cepas de orígenes muy variados.

Describimos el complejo de resistencia Tn21-blaSHV-12-∆Tn1721, conteniendo el integrón

atípico IntI1-estX-psp-aadA2-cmlA1-aadA1-qacI-IS440-sul3 y el gen tet(A), y su implicación

en la diseminación de SHV-12. Los ensayos de restricción sugieren que la adquisición de

blaSHV-12 por parte del clon pandémico ST131 podría deberse a la transferencia lateral de

plásmidos IncK desde cepas locales no-ST131. Identificamos un plásmido IncX3, no tipable por

PBRT, conteniendo los genes qnrS1 y blaSHV-12, este último integrado en una nueva estructura

tipo transposón compuesto que podría facilitar su movilización en bloque. Por otro lado, se

estudió la localización y organización genética de los integrones de clase 2 en E. coli de

distintos orígenes y áreas geográficas. Su estructura se mantenía altamente conservada,

mostrando escasa diversidad de genes cassettes. Las variaciones se debían fundamentalmente a

la integración de ISs a diferentes niveles, lo que podría modular la expresión y movilización de

genes adyacentes o influir en su localización genómica y capacidad de diseminación. Los

integrones de clase 2 se hallaron mayoritariamente localizados a nivel cromosómico en el sitio

attTn7, adyacente al gen esencial glmS. Sólo unos pocos fueron transferibles por conjugación, y

en ningún caso ésta implicó movilización de genes bla. Los ensayos funcionales preliminares

muestran que la integrasa de tipo 1 es capaz de escindir eficazmente el cassette aadA1

localizado en la región variable del integrón de clase 2.

En el capítulo 4 se investigó el papel epidemiológico de la fauna silvestre en el

mantenimiento y diseminación de E. coli verotoxigénico (STEC) y enteropatógeno (EPEC).

Entre las cepas STEC de animales salvajes destacó el genotipo stx2b/subAB2/ehxA y se

identificaron hasta 9 seropatotipos asociados a síndrome urémico hemolítico (seropatotipos B -

O145:[H28]- y C -O22:H8, O128:[H2]-) y diarrea (seropatotipo D -O110:H28, O146:H21,

O146:[H28], ONT:H8-) en humanos. Se detectó una cepa tEPEC en un jabalí, con un serotipo y

perfil de virulencia (O49:[H10] eae-κ) descrito en cepas aisladas de pacientes con diarrea. Los

rumiantes silvestres (muflones y ciervos), así como los jabalíes, actúan como importantes

reservorios de STEC y EPEC.

En el último capítulo se estudió el genoma accesorio y el genoma core de 38 cepas

comensales de E. coli por WGS. Analizamos los sistemas CRISPR/Cas bacterianos, así como

los módulos de resistencia y virulencia, los cuales generalmente conservaban estructuras

previamente descritas en cepas del entorno humano. Los datos de WGS y la reconstrucción del

genoma bacteriano por PLACNETw nos permitió estudiar la población de plásmidos pequeños

y tipar todos los replicones, lo que nos brindó más información que las metologías

convencionales. Nuestros resultados sugieren la existencia de un flujo continuo de bacterias

entre los ecosistemas humano y natural, más que una microevolución paralela asociada al nicho

u hospedador.

15

SUMMARY

16

17

Summary

In 2014, the World Health Organization published the first global report on Surveillance

of Antimicrobial resistance. It addressed the urgent need to come up with a coordinated set of

strategies to fight the problem in a One Health approach, which contributes to protect the public

health through the control of antibiotic resistance at the interface between humans, animals and

the environment. According to the World Organisation for Animal Health, about 60% of human

pathogens are of animal origin. However, antimicrobial resistance is not limited to bacteria

causing infectious diseases, it also affects those non-pathogenic ones occupying diverse

ecological niches. Thus, commensal bacteria are also a threat, since they can act as important

reservoirs of resistance and virulence genes. This thesis aims at exploring the extent of

antimicrobial resistant E. coli in wildlife, the major circulating clones, the mechanisms and

genetic platforms involved in the flow of resistance genes between humans, animals, and the

environment, and potential wild reservoirs of zoonotic E. coli pathotypes.

In the first and second chapters, population structure and antimicrobial resistance of E.

coli from wildlife were investigated. A low to moderate frequency of antibiotic resistant strains

was observed in mammals (11.1%), predominantly against old agents such as tetracyclines,

penicillins and sulfonamides. The prevalence of ESBL/AmpC-producing E. coli was high

among birds (16%), with SHV-12 as the main enzyme variant, followed by CTX-M-1, CTX-M-

14 and CMY-2. Eighty-two percent of the ESBLs from wildlife showed a multi-resistant

genotype, often in relation to the carriage of class 1 integrons containing long arrays of gene

cassettes. Although quinolone resistance was mainly due to chromosomal mutations in

GyrA/ParC, a qnrS1 gene was identified in an E. coli from a barn owl. All the ESBL and

plasmid-mediated AmpC encoding genes were transferable by conjugation, and we observed

some associations like blaCTX-M-1/IncN, blaSHV-12/IncI1 or blaCMY-2/IncI1. Although some

ESBL/AmpC-producing E. coli lineages were first described in wildlife (ST4564, ST4954,

ST4996, ST7624, ST7629, ST7630, ST7631, ST7632), most of the isolates belonged to clones

frequently detected among humans, domestic animals and food (ST131, ST10, ST155, ST224,

ST38, ST57), which support the existence of successful lineages strongly associated with the

bidirectional dissemination of ESBL/AmpC genes. Cryptic Escherichia clades were identified

in various wild mammals, highlighting the detection of a clade V member carrying blaCTX-M-14

and different virulence factors.

The third chapter focused on the analysis of distinct genetic elements involved in the

selection, persistence and spread of resistance determinants among E. coli from different

ecosystems (humans, domestic animals, wildlife, food). The first paper provides insights into

the molecular background of plasmids and additional genetic platforms associated with the

dissemination of SHV-12 encoding gene. The horizontal transfer of blaSHV-12 was mainly driven

by IncI1 plasmids, with the pST3 subtype prevailing in poultry and the pST26 (and other CC26

18

Summary

associated subtypes) being equally distributed among isolates from various origins. The

complete sequencing of an IncI1 plasmid revealed the presence of a Tn21-blaSHV-12-∆Tn1721

resistance complex, containing the atypical intI1-estX-psp-aadA2-cmlA1-aadA1-qacI-IS440-

sul3 integron and the tet(A) gene, which seems to play an important role in the spread of SHV-

12. Restriction analysis of IncK plasmids suggest the occurrence of horizontal blaSHV-12 events

from local non-ST131 isolates to the pandemic ST131 clone. We identified an IncX3 plasmid,

not typeable by PBRT, co-harbouring qnrS1 and blaSHV-12 genes, the latter one integrated in a

composite transposon structure that could facilitate the en-bloc mobilization of the ESBL. The

second paper aimed at gaining knowledge about the location and genetic organization of class 2

integrons in E. coli from different hosts and countries. Although a low diversity of gene

cassettes was shown, many novel structures were identified due to the integration of IS at

different sites. These IS elements might modulate the expression and movilization of adjacent

genes, or even define the genomic location and dissemination capability of class 2 integrons.

Most class 2 integrons were chromosomally inserted at the attTn7 site, adjacent to the essential

glmS gene. Only a few were transferable by conjugation and the comobilization of BLEE genes

was never involved in the process. Preliminary functional assays showed that class 1 integrase

was capable of efficiently excising the aadA1 cassette found in the variable region of class 2

integrons.

In the fourth chapter, the epidemiological role of wildlife in the maintenance and

dissemination of enteropathogenic (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli (STEC) was

investigated. Among STEC recovered from wild animals, the stx2b/subAB2/ehxA virulence

profile was the most common and 9 isolates belonged to seropathotypes frequently associated

with hemolytic uremic syndrome (seropathotypes B -O145:[H28] - and C -O22:H8, O128:[H2]

-) or diarrhea (seropathotype D -O110:H28, O146:H21, O146:[H28], ONT:H8-) in humans.We

first reported a wild boar as carrier of a bfpA-positive O49:[H10] eae-κ strain of the same

characteristics as tEPEC isolated from human diarrhea. Wild ruminants (deer and mouflon), as

well as wild boar, act as important reservoirs of potentially pathogenic STEC and EPEC.

In the final chapter, we studied by WGS the accessory and core genome of 38

commensal E. coli strains from wildlife. We analyzed the CRISPR/Cas systems as well as the

resistance and virulence modules, which show similar genetic structures and organizations than

those reported in strains from the human setting. WGS enabled a more consistent

characterization of the composition and diversity of the plasmidome, facilitating the study of

small replicons, the differentiation of extra-chromosomal phages or phage-like elements and the

detection of non-typeable plasmids. Our results suggest an ongoing flow of both mobile

elements and E. coli lineages between human and natural ecosystems, rather than the occurrence

of a parallel microevolution in the gut of wild animals.

19

INTRODUCCIÓN

20

21

Introducción

1. LA PROBLEMÁTICA DE LA RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS

El fortuito hallazgo de la penicilina por Alexander Fleming y el importante papel

de los científicos Howard Florey y Ernst Chain en su purificación y desarrollo como

fármaco, marcaron uno de los mayores hitos en la historia de la Medicina. Desde su

introducción en clínica en 1941, este antibiótico contribuyó a salvar millones de vidas y

aumentó en varios años la esperanza de vida de la población. A partir de este

descubrimiento, uno de los más transcendentales del siglo XX, la industria farmacéutica

se propuso buscar nuevas sustancias activas frente a infecciones muy diversas. Así, en

las décadas subsiguientes, se hallaron numerosos compuestos naturales con actividad

antibiótica pertenecientes a diferentes familias (β-lactámicos, macrólidos,

aminoglucósidos, tetraciclina...) y se investigó en la obtención de antimicrobianos

sintéticos (p. ej. quinolonas). De hecho, a partir del estudio de la estructura de la

penicilina, compuesta por un anillo β-lactámico unido a otro de tiazolidina, se pudieron

desarrollar penicilinas sintéticas y semisintéticas lo que dio lugar al extenso grupo de

los β-lactámicos. Con el advenimiento de los antibióticos, entre los años 1950 y 1960,

algunos científicos llegaron a considerar que estaban ante “el fin de las enfermedades

infecciosas”.

Sin embargo, la edad de oro de los antibióticos, tal y como predecía la teoría de

la evolución, duró poco. Las bacterias, como cualquier otro organismo vivo,

evolucionan cuando se introduce una presión selectiva (p. ej. los antibióticos), dadas las

condiciones de tiempo, herencia y variabilidad. El empleo generalizado e

indiscriminado de antibióticos tanto en medicina humana como en agricultura y

ganadería ha acelerado la aparición, selección y diseminación de bacterias resistentes a

dichos compuestos.

Los antibióticos pueden emplearse en los animales criados para consumo

humano con fines terapéuticos y preventivos, pero también como factores promotores

del crecimiento. Este último uso implica la difusión de concentraciones subterapéuticas,

lo que asociado con tiempos de exposición prolongados, favorece la selección de cepas

bacterianas resistentes. La Unión Europea prohibió el empleo de antibióticos como

factores promotores del crecimiento animal en el año 2006, pero este ejemplo no ha sido

seguido en muchas otras regiones del mundo (Alonso et al. 2017). Además, el uso de

antibióticos en animales, lejos de reducirse, muestra una clara tendencia a aumentar

22

Introducción

debido al incremento en la demanda de consumidores, lo que promueve un mayor

desarrollo de la ganadería intensiva (Van Boeckel et al. 2015). Según un informe de la

Agencia Europea del Medicamento, España fue de 2010 a 2015 el segundo país de la

Unión Europea, sólo por detrás de Chipre, donde más antibióticos se emplearon en la

cría de ganado (402 mg/kg de carne producido). Afortunadamente, los primeros datos

publicados tras la implantación en junio de 2014 de un plan nacional para combatir la

resistencia mostraron un modesto pero significativo descenso del 4% en el consumo de

antibióticos en 2015 con respecto al año anterior (EMA/ESVAC, 2017).

Son numerosos los estudios epidemiológicos de resistencia llevados a cabo en el

entorno humano y ganadero, sometidos a una alta presión selectiva. En ambos casos

existen evidencias científicas que confirman que la exposición a antibióticos conlleva

un incremento en la incidencia de bacterias resistentes (Baron et al. 2014; Chantziaras et

al. 2014; Chiotos et al. 2017). Sin embargo, los estudios en el ecosistema ambiental y

fauna salvaje siguen siendo limitados.

En los últimos años, la explosión demográfica ha llevado a un proceso de

sinantropización que ha afectado tanto a la vegetación como a la fauna circundante.

Además, al igual que en otras partes de Europa, en la Península Ibérica se ha

experimentado un importante crecimiento poblacional de algunas especies de

mamíferos silvestres, como ciervos y jabalíes (Ruiz-Fons, 2017). Ambos fenómenos, y

las consecuencias que subyacen de los mismos (mayor contacto de los animales salvajes

con pastos, zonas de cultivo o vertederos, invasión de zonas naturales por asentamientos

humanos y actividades lúdicas, consumo de carne de caza, contaminación de los ríos

por vertidos de aguas residuales, empleo de residuos orgánicos del ganado como abono

natural…), contribuyen a aumentar las vías de diseminación y el intercambio de

bacterias resistentes entre los ecosistemas humano y ambiental. Además, los propios

agentes antimicrobianos pueden ser excretados al medio ambiente en su forma activa y

persistir en él, contribuyendo así a la selección de bacterias resistentes en la naturaleza

(Karprzyk et al. 2009).

Pero no sólo el contacto antrópico favorece la selección de mecanismos de

resistencia en las bacterias de origen ambiental, también es necesario considerar las

presiones selectivas propias de este medio. No hay que olvidar, que muchos antibióticos

son producidos por microorganismos ambientales. Al igual que los antibióticos, los

metales pesados son también compuestos que se encuentran en la naturaleza. Los

23

Introducción

elementos genéticos implicados en la resistencia a estos agentes están presentes de

forma intrínseca en bacterias como Ralstonia metallidurans, adaptada a sobrevivir en

ambientes ricos en metales pesados (p. ej. suelos volcánicos) (Mergeay et al. 2003). De

la misma forma, el origen de algunos de los genes de resistencia a antibióticos de mayor

implicación en la clínica ha evolucionado a partir de los genes localizados a nivel

cromosómico en bacterias ambientales (D’Costa et al. 2006). En ambos casos, la

presión selectiva, ejercida en gran medida por la contaminación antropogénica, ha

favorecido que estos determinantes de resistencia a metales y antibióticos se encuentren

en elementos genéticos móviles (p. ej. plásmidos), lo que favorece la existencia de

fenómenos de corresistencia y la dispersión de estos genes entre diferentes poblaciones

bacterianas (Martínez, 2009).

En definitiva, la interconexión de los diferentes ecosistemas requiere de una

armonización mundial y multisectorial de las medidas a tomar para combatir la

problemática de la resistencia a antibióticos (Figura 1). De ahí nace el concepto de

“One Health” (Una Salud), que promueve la coordinación de las políticas de Salud

Pública, Sanidad Ambiental y Medio Ambiente. La OMS, en la 68ª Asamblea Mundial

de la Salud celebrada en mayo de 2015, adoptó un Plan de Acción Global para hacer

frente al alarmante incremento de la resistencia a los antibióticos respaldado por la

Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la

OIE (WHO, 2015). En este informe, entre las medidas a adoptar, se promueve la de

impulsar estudios de vigilancia y seguimiento de resistencias a los antibióticos en

bacterias patógenas, zoonósicas e indicadoras.

Figura 1. Dispersión de la resistencia a antimicrobianos en el entorno (Adaptado de Arnold et al. 2016).

24

Introducción

Expertos y sociedades científicas coinciden y alertan en la necesidad de evaluar

y analizar en profundidad este fenómeno de la resistencia en bacterias de distintos

ecosistemas con el objetivo de conocer de forma global el grado de diseminación de las

bacterias resistentes y los mecanismos genéticos implicados. Escherichia coli, como

representante de la familia de las Enterobacterias, es considerada una excelente bacteria

indicadora en estudios epidemiológicos comparativos ya que está presente en todos los

ecosistemas (humano, animal, medio ambiente) y puede actuar igualmente como

organismo comensal o patógeno (van den Bogaard y Stobberingh, 2000).

2. ESCHERICHIA COLI

2.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES

Escherichia coli fue descrita por primera en 1885 por el pediatra alemán

Theodor Von Escherich (Escherich, 1885), tras aislarla de las heces de un niño sano. Es

un bacilo Gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, anaerobio

facultativo, oxidasa negativo, indol positivo y capaz de fermentar la glucosa y la lactosa

(Murray et al. 2006a). El extenso conocimiento que disponemos de su genética,

fisiología e historia natural, junto al hecho de ser una bacteria fácilmente cultivable, de

crecimiento rápido y relevante desde el punto de vista clínico han hecho que E. coli sea

considerada como el organismo procariota modelo en estudios moleculares y evolutivos

(Hartl y Dykhuizen, 1984).

Esta bacteria es un representante importante de la microbiota intestinal

facultativa normal de los seres humanos e interviene en el estado de salud del huésped

mediante su contribución en la absorción de nutrientes, en la síntesis de vitaminas K y B

o en la resistencia a la colonización por microorganismos patógenos. Es una de las

primeras especies bacterianas en colonizar al recién nacido a partir del tracto urogenital

de la madre durante el parto. Las colonizaciones posteriores se deben a bacterias del

ambiente o procedentes de los alimentos ingeridos (Hartl y Dykhuizen, 1984).

Escherichia coli también se encuentra en el tubo digestivo de la mayoría de los

animales, si bien su densidad varía en función del tamaño, morfología intestinal, dieta,

tiempo de retención de la ingesta y microbiota comensal del huésped (Tenaillon et al.

2010). En humanos, el contenido de E. coli por gramo de heces oscila entre 10-7-10-9,

siendo en animales domésticos algo inferior (10-4-10-7). Las bacterias son excretadas al

25

Introducción

medio ambiente, de ahí que su aislamiento en las aguas sea considerado un indicador de

contaminación fecal. El agua, el suelo y los sedimentos siempre han sido considerados

un “hábitat secundario” para E. coli, entendiéndose éste como menos importante que el

nicho intestinal. Sin embargo, son numerosos los trabajos publicados recientemente que

indican que algunas cepas pueden sobrevivir periodos prolongados y multiplicarse en el

medio ambiente (Jang et al. 2017).

Las cepas comensales de E. coli carecen de rasgos especializados de virulencia y

raramente causan enfermedad, excepto en presencia de factores agravantes como

dispositivos médicos (p. ej. catéteres urinarios), estado de inmunodepresión del huésped

o rotura de la barrera anatomofuncional del tracto intestinal (p. ej. peritonitis) (Kaper et

al. 2004; Russo et al. 2009). Sin embargo, también existen cepas de E. coli que han

adquirido, principalmente mediante eventos de transferencia genética horizontal,

diversos factores de virulencia que les han permitido adaptarse a nuevos nichos y causar

enfermedad. Algunas combinaciones exitosas de factores de virulencia han persistido

dando lugar a diferentes patotipos de E. coli, que cuando causan infección en el ser

humano generan 3 principales síndromes clínicos: diarrea, infección del tracto urinario y

sepsis/meningitis (Kaper et al. 2004; Russo y Johnson, 2009).

2.1. GENOMA Y PLASTICIDAD GENÉTICA

El genoma completo de E. coli (E. coli K12) se publicó por primera vez en

septiembre de 1997 (Blattner et al. 1997). Desde entonces, se han secuenciado y

registrado en las bases de datos públicas varios miles de genomas de E. coli de orígenes

muy variados. Teniendo en cuenta estos datos se calcula que el tamaño del genoma

completo de esta especie varía ampliamente entre 4,6 y 5,9 Mpb, y contiene de 4200 a

5500 genes (Robins-Browne et al. 2016).

Conforme más genomas se vayan secuenciando, el genoma core de esta especie

(batería de genes cromosómicos esenciales presentes en todas las cepas), que

actualmente se compone de algo menos de 1500 genes, se irá reduciendo. El conjunto

de genes restantes, implicados en la adaptación de la bacteria al medio (p. ej.

determinantes de virulencia, resistencia adquirida, fagos…), se conoce como genoma

accesorio o “prescindible”. El pangenoma actual de E. coli (colección total de genes

identificados en una especie) se compone de alrededor de 22000 genes, una cifra que

26

Introducción

probablemente irá en aumento con la obtención de nuevas secuencias genómicas en los

próximos años (Robins-Browne et al. 2016).

Escherichia coli es una de las bacterias más versátiles que existen y se emplea

como modelo en estudios evolutivos de procariotas (Lawrence y Ochman, 1998;

Touchon et al. 2009; Tenaillon et al. 2016). La enorme plasticidad de su genoma le ha

permitido adaptarse a diversos nichos ecológicos y a las particulares condiciones

intestinales de cada huésped (humano, mamífero, ave…), definiéndose así distintos

ecotipos. Del mismo modo, como mencionamos anteriormente, también se han descrito

diversos patotipos capaces de causar enfermedad tanto en humanos como en animales.

Y por supuesto, otro ejemplo claro de adaptación genética y selección natural es el que

tiene lugar en la microbiota intestinal tras la presión selectiva ejercida por la exposición

a antibióticos.

A diferencia de los organismos eucariotas pluricelulares, las bacterias no tienen

la capacidad de introducir variabilidad en su material genético mediante el eficiente

proceso de la reproducción sexual. Sin embargo, disponen de otros mecanismos para

mejorar su acervo genético: a) cambios en la secuencia de nucleótidos del genoma

(mutaciones), b) remodelaciones del genoma mediante recombinación y, c)

adquisición de genes exógenos mediante transferencia genética horizontal (TGH). El

genoma core bacteriano evoluciona principalmente por fenómenos de mutación y

recombinación, mientras que el genoma accesorio es además objeto de eventos de TGH

(Touchon et al. 2009).

En poblaciones naturales aparecen frecuentemente bacterias con una elevada

tasa de mutación espontánea. Muchas de estas bacterias con fenotipo mutador son

defectivas en el sistema MMR (mismatch repair system o sistema de reparación de

errores) o en genes del sistema GO (encargado de reparar lesiones en el ADN originadas

por la incorporación de 8-oxo-dGTP), si bien pueden estar implicados muchos otros

mecanismos genéticos (Horst et al. 1999; Maki, 2002).

La TGH, que involucra la movilización de elementos genéticos entre bacterias,

tiene un profundo impacto en la evolución bacteriana y es el mecanismo más importante

en la diseminación de la resistencia a antibióticos. Se ha estimado que entre el 10 y el

16% del cromosoma de E. coli surgió a través de eventos de TGH (Ochman et al. 2010)

(Figura 2).

27

Introducción

Existen 3 mecanismos principales de adquisición de material genético exógeno:

la conjugación, la transformación y la transducción (Figura 3). La conjugación

bacteriana es el proceso por el que plásmidos y transposones conjugativos se transfieren

desde la célula dadora a la célula receptora a través de contacto directo mediante los pili

sexuales. Algunos plásmidos pequeños (plásmidos movilizables), así como fragmentos

de ADN cromosómico, también pueden ser movilizados de una bacteria a otra mediante

los plásmidos conjugativos (Ochman et al. 2010). La conjugación es el mecanismo más

importante de transferencia de genes de resistencia a antibióticos, por su frecuencia y

sus consecuencias epidemiológicas (Martínez-Martínez et al. 2010). La transformación

es el proceso por el cual ADN desnudo procedente del medio se incorpora a una

bacteria receptora competente y se lleva a cabo una recombinación genética (Ochman et

al. 2010). Algunas especies bacterianas, como Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus

influenzae, presentan una capacidad natural de captación de ADN exógeno, mientras

que en otras, como Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae, la competencia

aparece al final de la fase logarítmica de crecimiento. En la mayoría de las bacterias,

carentes de la capacidad natural de captar ADN, puede recurrirse a métodos químicos o

de electroporación (empleo de pulsos de alto voltaje) para introducir plásmidos y otras

moléculas de ADN en su interior (Murray et al. 2006a; Ochman et al. 2010). Por

último, la transferencia genética por transducción esta mediada por virus bacterianos

(bacteriófagos). Cada bacteriófago posee un rango acotado de huéspedes bacterianos,

por lo que este fenómeno está normalmente restringido a especies cercanamente

relacionadas (Ochman et al. 2010).

Figura 2. Distribución del ADN exógeno adquirido mediante TGH en genomas de distintas especies bacterianas. En azul, el genoma nativo; en amarillo, el ADN exógeno correspondiente a elementos genéticos movilizables, incluyendo transposones y bacteriófagos; en rosa, otras secuencias de ADN exógeno. El porcentaje total de ADN exógeno se muestra a la derecha de cada barra. (Ochman et al.2010).

28

Introducción

Los fenómenos de mutación y TGH pueden actuar de forma sinérgica. Algunos

genes de resistencia, como los que codifican β-lactamasas de espectro extendido,

pueden incorporarse en la bacteria a través de mecanismos de TGH y, mediante eventos

de mutación, pueden modificarse y producir variantes más resistentes (Blázquez et al.

2000).

2.3. ESTRUCTURA POBLACIONAL Y FILOGENIA MOLECULAR

Los primeros intentos para determinar la diversidad y estructura poblacional de

E. coli se llevaron a cabo mediante la técnica de serotipado (Tenaillon et al. 2010). Este

método permite la diferenciación de cepas de E. coli en base a sus antígenos de

superficie (antígenos somáticos O, capsulares K y flagelares H). El primer esquema de

clasificación fue propuesto por Kauffmann en 1940 (Kauffmann, 1947) y desarrollado

posteriormente por Orskov (Orskov y Orskov, 1984). La identificación de antígenos O y

H se realiza por técnicas clásicas de aglutinación, si bien en los últimos años han

aparecido alternativas basadas en técnicas de PCR (Iguchi et al. 2015). La

determinación de antígenos K, en cambio, se realiza por contrainmunoelectroforesis y

no suele llevarse a cabo de manera rutinaria. Así, normalmente, el serotipo se expresa

con la combinación O:H.

Figura 3. Mecanismos de adquisición de genes de resistencia a antibióticos (Alekshun y Levy, 2007).

29

Introducción

Posteriormente, se aplicaron en E. coli técnicas de genética de poblaciones

eucariotas, como la multilocus enzyme electrophoresis o MLEE, que permite

caracterizar las cepas en base a diferencias en la movilidad electroforética de diversas

enzimas metabólicas.

Considerando estas primeras metodologías de tipado se postuló que E. coli se

componía de clones o linajes genéticos estables formados por individuos prácticamente

idénticos, en los que los fenómenos de recombinación eran inexistentes o sucedían con

una muy baja frecuencia (Tenaillon et al. 2010). Sin embargo, con el advenimiento en

1980 de las primeras secuencias de genes y, más adelante, el análisis de genomas

completos, se demostró el importante rol de la recombinación en la evolución genómica

de E. coli (Touchon et al. 2009; Tenaillon et al. 2010).

La búsqueda de métodos de tipificación más precisos se vio reflejada en la

emergencia, a finales de los 90, de la técnica de tipado de secuencias múltiples de loci o

multilocus sequence typing (MLST) (Enright y Spratt, 1999). Esta técnica, se basa en el

análisis de las secuencias pertenecientes a fragmentos de genes housekeeping. Cambios,

incluso de una sola base en uno de los locus, constituyen un alelo diferente. A cada

alelo distinto de un locus se le asigna un número, de tal manera que el conjunto de

alelos de los loci analizados da lugar a una combinación o perfil alélico (numérico), que

se traduce en una secuencia tipo (ST). Esta metodología se aplica a diversas especies

bacterianas. En el caso de E. coli existen 3 esquemas distintos, pero bien

correlacionados, que se distinguen por el número y tipo de genes housekeeping

involucrados en la determinación del ST (Reid et al. 2000; Escobar-Páramo et al.

2004a; With et al. 2006). En esta tesis, empleamos el esquema Achtman (With et al.

2006), basado en el estudio de fragmentos de los siguientes 7 genes: adk, fumC, icd,

gyrB, mdh, purA y recA.

En el año 2000, Clermont y colaboradores desarrollaron una técnica de PCR-

triplex que facilitaba la clasificación de las cepas de E. coli en 4 grupos filogenéticos

principales (A, B1, B2, D) (Clermont et al. 2000). Estos filogrupos habían sido

previamente definidos tras la aplicación de la técnica MLEE (anteriormente descrita y

de mayor complejidad) a una colección de cepas patógenas y comensales aisladas de

humanos y animales (Ochman y Selander, 1984; Herzer et al. 1990). Se observó que las

cepas de E. coli causantes de patología extra-intestinal se asociaban mayormente al

filogrupo B2 y, en menor medida al D, mientras que la mayoría de las cepas comensales

30

Introducción

pertenecían al filogrupo A (Bingen et al. 1998; Boyd y Hartl, 1998; Picard et al. 1999).

En 2013, cuando ya se disponía de numerosas cepas secuenciadas o tipadas por MLST,

Clermont y colaboradores desarrollaron una PCR-multiplex tras redefinir la estructura

poblacional de E. coli en 7 filogrupos (A, B1, B2, C, D, E y F) (Clermont et al. 2013).

Además, señalaron la existencia de cepas bioquímica y fenotípicamente indistinguibles

de E. coli pero genéticamente distantes, a las que denominaron clados crípticos de

Escherichia (clados I, II, III, IV y V) (Clermont et al. 2011).

2.4. PATOTIPOS

2. 4. 1. Cepas patógenas intestinales de E. coli (E. coli diarrogénicas)

Actualmente, se distinguen 6 patotipos de E. coli intestinal (Figura 4):

A) E. coli enteropatógena (EPEC): Estas cepas causan enfermedad sobretodo en niños

pequeños, incluidos los recién nacidos. La infección se caracteriza por la adhesión

bacteriana a las células epiteliales del intestino delgado con la destrucción posterior

de las microvellosidades (lesión histopatológica A/E, attaching and effacing o unión

y borrado). Se caracterizan por la presencia del locus LEE de la isla de

patogenicidad de borrado de enterocitos que codifica la intimina (eae) (Russo y

Johnson, 2009; Robins-Browne et al. 2016). El BFP (bundle-forming pilus) es otro

determinante de virulencia involucrado en enfermedad en humanos, aunque algunas

cepas pueden carecer de él. Las cepas carentes del factor BFP se denominan EPEC

atípicas y presentan un grado variable de virulencia (Ingle et al. 2016).

B) E. coli productora de toxina shiga, verotoxigénica o enterohemorrágica

(STEC/VTEC/EHEC): Son las cepas que causan con mayor frecuencia enfermedad

en los países desarrollados. La gravedad de la enfermedad producida por este

patotipo varía desde una diarrea leve hasta colitis hemorrágica y síndrome urémico

hemolítico. Se caracterizan por la producción de 2 tipos de citotoxinas denominadas

toxinas Shiga 1 (Stx1) y 2 (Stx2). Los rumiantes domésticos actúan como reservorio

importante de cepas STEC (Russo y Johnson, 2009).

C) E. coli enterotoxigénica (ETEC): Es la primera causa de diarrea endémica en países

tropicales o en desarrollo (Russo y Johnson, 2009). ETEC sintetiza dos clases de

enterotoxinas: toxinas termolábiles (LT-I, LT-II) y termoestables (STa, STb).

Muchas de las cepas ETEC aisladas de pacientes con diarrea producen STa,

generalmente en combinación con LT (Qadri et al. 2005).

31

Introducción

D) E. coli enteroagregativa (EAEC): Se asocia fundamentalmente a diarrea infantil en

países en desarrollo y diarrea del viajero. Las cepas EAEC exhiben un patrón

“enladrillado” de adherencia a las células epiteliales, mediado por fimbrias de

adherencia agregativa (AAF/I-III) codificadas en un plásmido (pAA). Otros factores

de virulencia como la citotoxina Pet, la enterotoxina EAST-1 o la toxina ShET1

parecen también estar involucrados en la patogenicidad de estas cepas (Croxen et al.

2013).

E) E. coli enteroinvasica (EIEC): Presenta una estrecha relación con las propiedades

fenotípicas y patogénicas de Shigella (Murray et al. 2006). Un grupo de genes

transportados en un plásmido (pInv) median en la invasión del epitelio colónico

(Croxen et al. 2013).

F) E. coli con adherencia difusa (DAEC): Algunas cepas DAEC pueden ocasionar

enfermedad diarreica en niños de 2 a 6 años de países en desarrollo. El factor de

virulencia que les define es la expresión de la adhesina AIDA-I, aunque su fenotipo

aún no está muy bien definido.

Figura 4. Patotipos de E. coli diarrogénicas (Kaper et al. 2004).

32

Introducción

2. 4. 2. Cepas patógenas extraintestinales de E. coli (ExPEC)

Las cepas de E. coli con especial capacidad para causar infecciones

extraintestinales en humanos, se encuentran generalmente en el tracto intestinal y no

causan gastroenteritis. E. coli es el agente etiológico más frecuente en infecciones del

tracto urinario (ITU), bacteriemia y sepsis adquirida en la comunidad, y constituye

también la primera causa de meningitis neonatal. Asimismo, se ha aislado de forma

recurrente en pacientes con neumonía nosocomial e infección intraabdominal y,

ocasionalmente, en cuadros de osteomielitis e infección de piel y partes blandas

(Johnson y Russo, 2002).

Las cepas ExPEC exhiben una amplia gama de factores de virulencia que

contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenicidad, permitiéndoles colonizar la

mucosa del huésped, evadir sus mecanismos de defensa, captar nutrientes esenciales

como el hierro, dañar e invadir las células, y estimular una respuesta inflamatoria en el

huésped. Para ello estas cepas emplean factores, generalmente codificados y agrupados

en islas de patogenicidad, como adhesinas (fimbria tipo 1, fimbria tipo P, fimbria tipo S,

adhesinas Afa/Dr…), toxinas (α-hemolisina, toxina Sat, factor citotóxico necrosante…),

sideróforos o moléculas quelantes del hierro, invasinas y proteínas de resistencia al

suero y a la fagocitosis (cápsula, endotoxina o LPS, lipoproteínas TraT e Iss…). Sin

embargo, no se puede establecer una relación directa entre determinados factores de

virulencia y una patología específica (Lüthje y Brauner, 2014).

Figura 5. Factores de virulencia de E. coli uropatógena (Lüthje y Brauner, 2014).

33

Introducción

3. MECANISMOS GENERALES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS

Se ha estimado que en Europa mueren anualmente alrededor de 25.000 personas

como consecuencia de infecciones relacionadas con microorganismos resistentes, lo que

a su vez conlleva unos costes sanitarios de 1.5 billones de euros anuales (Blair et al.

2015). Al aumento en la prevalencia de bacterias multirresistentes, se suma la

ralentización en el desarrollo de nuevos antimicrobianos que ha tenido lugar en los

últimos años.

Las bacterias pueden presentar una resistencia natural o intrínseca, cuando

carecen de la diana de acción frente a un antibiótico (p. ej. la falta de pared celular en

Mycoplasma en relación con los beta-lactámicos) o como consecuencia de otras

características funcionales o estructurales inherentes a la especie. Sin embargo, y lo

realmente preocupante desde el punto de vista clínico, es la resistencia adquirida de las

bacterias como consecuencia de la modificación de su carga genética, bien por

mutaciones cromosómicas o por mecanismos de TGH. La primera puede conllevar la

selección de mutantes resistentes (rifampicina, macrólidos), pero la segunda implica

graves consecuencias debido a que es, por definición, una resistencia transmisible

(Daza, 1998).

Para inhibir el crecimiento bacteriano, los antibióticos deben primero atravesar

la pared celular sin ser metabolizados intrínsecamente y, posteriormente, alcanzar sus

sitios diana a una concentración suficiente como para ejercer su acción. Los antibióticos

actúan a distintos niveles e interfieren en procesos metabólicos esenciales para la

supervivencia de la bacteria, inhibiendo la síntesis de la pared celular, la síntesis de la

membrana citoplasmática, la síntesis de proteínas o los ácidos nucleicos (replicación,

transcripción) (Figura 6). Desde un punto de vista bioquímico, los mecanismos por los

cuales las bacterias desarrollan resistencia a los antibióticos pueden dividirse en: a) los

que alteran la diana de acción del antibiótico y, b) los que modifican la concentración

del propio antibiótico (Martínez, 2014) (Figura 6).

A) Mecanismos que alteran la diana de acción del antibiótico:

Mutaciones en el sitio diana; p. ej. mutaciones en las topoisomerasas (GyrA y ParC)

asociadas a resistencia frente a quinolonas.

34

Introducción

Figura 6. Principales dianas de acción de los antimicrobianos y mecanismos de resistencia desarrollados por las bacterias (Wright, 2010).

Modificación enzimática de la diana; p. ej. modificación de las enzimas PBPs de la

pared celular que impiden la fijación del antibiótico beta-lactámico.

Protección de la diana de acción; p. ej. genes qnr, que codifican la síntesis de un

polipéptido que protege a la ADN-girasa y la topoisomeras IV de la inhibición por

quinolonas.

B) Mecanismos que modifican la concentración del propio antibiótico:

Cambios en la permeabilidad de la membrana externa. En comparación con las

bacterias Gram positivas, las Gram negativas son intrínsecamente menos

permeables a muchos antibióticos. Esta permeabilidad se ve afectada,

fundamentalmente, por alteración o pérdida de porinas.

Bombas de expulsión o eflujo. Operan tomando el antibiótico del espacio

periplásmico y expulsándolo al exterior, evitando que éste alcance su sitio de acción.

Inactivación enzimática de los antibióticos. Las bacterias pueden expresar enzimas

capaces de alterar la estructura del antibiótico, haciendo que éste pierda su

funcionalidad (p. ej. β-lactamasas, enzimas modificadoras de los aminoglucósidos).

Una misma bacteria puede desarrollar o adquirir varios mecanismos de

resistencia frente a uno o muchos antibióticos, de la misma forma que un mismo

antibiótico puede ser inhibido por distintos mecanismos.

35

Introducción

4. ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS.

4. 1. MECANISMOS DE ACCIÓN Y RESISTENCIA

Los β-lactámicos son los antibióticos más empleados tanto en el ámbito

hospitalario como en el comunitario, y se caracterizan por la presencia del denominado

anillo β-lactámico, constituido por la condensación de alanina y β-dimetilcisteína.

Además, éste determina el mecanismo de acción (inhibición de la síntesis de la pared

celular), la escasa toxicidad directa (actúa sobre la pared celular bacteriana, ausente en

células eucariotas) y el principal mecanismo de resistencia (producción de β-

lactamasas) de esta familia de antibióticos (Suárez y Gudiol, 2009). Los β-lactámicos se

clasifican en cinco grandes grupos atendiendo a su estructura química: penicilinas,

cefalosporinas, carbapenemas, monobactámicos e inhibidores de las β-lactamasas

(Figura 7).

Son agentes bactericidas que ejercen su actividad inhibiendo la última etapa de

la síntesis de la pared celular y produciendo la activación de enzimas autolíticas que

destruyen la bacteria. Actúan como análogos estructurales del sustrato natural (D-alanil-

D-alanina) de las transpeptidasas y carboxipeptidasas, uniéndose a las PBPs (penicillin

Figura 7. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos (Suárez y Gudiol, 2009).

36

Introducción

binding proteins) específicas de la pared celular bacteriana e inhibiendo así la formación

de puentes entre las cadenas de peptidoglucano. Dado que los β-lactámicos ejercen su

acción inhibiendo la síntesis de la pared celular, estos antibióticos sólo actúan frente a

bacterias que se encuentran en fase activa de multiplicación (López-Medrano et al.

2002; Suárez y Gudiol, 2009).

Las bacterias adquieren resistencia a los antibióticos β-lactámicos a través de 4

mecanismos principales: a) Hidrólisis del antibiótico mediante β-lactamasas; b) Baja

actividad de la unión a PBP; c) Imposibilidad de los antibióticos de atravesar la

membrana externa que recubre la capa de peptidoglucano en bacterias Gram negativas;

d) Expulsión activa del antibiótico. De estos cuatro mecanismos de acción, el principal

es la producción de β-lactamasas, especialmente en bacterias Gram negativas.

4. 2. β-LACTAMASAS

Las β-lactamasas hidrolizan de forma irreversible el anillo β-lactámico, común a

todos los antibióticos de esta familia, inactivando la acción del fármaco. Desde su

descripción en 1940 en una cepa de Staphylococcus aureus (Abraham y Chain, 1940),

se han descrito más de 900 β-lactamasas diferentes. Algunas son específicas frente a

penicilinas (penicilinasas), cefalosporinas (cefalosporinasas) o carbapenémicos

(carbapenemasas), mientras que otras poseen un amplio espectro de actividad, pudiendo

llegar a inactivar la mayoría de los antibióticos β-lactámicos (Murray et al. 2006b).

Actualmente, existen 2 sistemas de clasificación de β-lactamasas que están bien

correlacionados (Tabla 1):

Clasificación molecular de Ambler (Ambler, 1980): Divide estas enzimas en 4

grupos (A, B, C y D) en función de su secuencia aminoacídica y de los mecanismos

de interacción enzima-sustrato. Las β-lactamasas de clase A, C y D son serin-

betalactamasas (contienen una serina en su centro activo) y las de clase B, metalo-

betalactamasas (dependientes de zinc).

Clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros: Basada en las características

bioquímicas, estructurales y funcionales de las β-lactamasas. Fue propuesta por

Bush en 1985, revisada por Bush, Jacoby y Medeiros en 1995 y actualizada por

Bush y Jacoby en 2010 (Bush et al. 1995; Bush y Jacoby, 2010).

37

Introducción

La primera evidencia de la presencia de una β-lactamasa en E. coli se remonta a los

años 60, cuando se caracterizó la enzima TEM-1 (Datta y Kontomichalou, 1965). Esta

enzima, al igual que SHV-1, es una penicilinasa producida por numerosos bacilos

Gram negativos y dotada de actividad mínima frente a las cefalosporinas. A partir de

entonces, principalmente en la década de los 70 y 80, se desarrollaron y emplearon

intensamente en clínica las cefalosporinas y los inhibidores de beta-lactamasas (ácido

clavulánico, tazobactam y sulbactam), favoreciendo la selección y emergencia de cepas

productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) y de β-lactamasas

resistentes a la acción de los inhibidores de β-lactamasas (enzimas IRT, inhibitor-

resistant TEM mutant). Estas enzimas, con un mayor espectro de acción, derivan en

muchos casos de los genes blaTEM-1, blaTEM-2 y blaSHV-1, por acumulación de mutaciones

puntuales que alteran la configuración aminoacídica alrededor del sitio activo.

Tabla 1. Clasificación de las β-lactamasas (Mosquito et al. 2011).

38

Introducción

Las BLEE se definen como enzimas capaces de hidrolizar las penicilinas, todas

las cefalosporinas (menos las cefamicinas) y los monobactámicos, pero no los

carbapenémicos. La primera enzima capaz de hidrolizar las cefalosporinas de más

amplio espectro se describió en Alemania en 1983, denominándose SHV-2 (Knothe,

1983; Kliebe et al. 1985). Un año después, en Francia, se detectó TEM-3, que

presentaba un espectro de actividad similar (Sirot et al. 1987). No fue hasta 1987

cuando se reportaron en K. pneumoniae las primeras enzimas de tipo CTX-M

(concretamente CTX-M-1), cuya denominación surgió por su actividad preferente por la

cefotaxima (Sirot et al. 1987). Dos años más tarde, la enzima CTX-M-1 fue detectada

en una cepa de E. coli procedente de un paciente hospitalizado en Francia (Bernard et

al. 1992).

Hasta finales de los 90, las BLEEs de tipo SHV y TEM eran las más prevalentes

y se asociaban más frecuentemente a infecciones nosocomiales causadas por K.

pneumoniae. Sin embargo, ya en la primera década del s.XXI, fueron emergiendo las

CTX-M, y E. coli fue convirtiéndose en la principal bacteria portadora de BLEE, con el

consiguiente aumento de su incidencia en infecciones comunitarias. Actualmente, las

BLEE de tipo CTX-M son las predominantes en la mayor parte del mundo, no sólo en

cepas patógenas y comensales de humanos (D’Andrea et al. 2013; Valentín et al. 2014),

sino también de animales de compañía (Costa et al. 2004; Carattoli et al. 2005a,

Valentín et al. 2014), animales de granja (Briñas et al. 2003; Briñas et al. 2005; Costa et

al. 2009; Carneiro et al. 2010; Gonçalves et al. 2010; Valentín et al. 2014; Michael et

al. 2015; Alonso et al. 2017) y animales silvestres (Guenther et al. 2011).

Las CTX-M pertenecen a una línea bastante heterogénea de serin-betalactamasas

de la clase A de Ambler. Se agrupan en 6 clusters principales (CTX-M-1, CTX-M-2,

CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 y KLUC), que difieren entre sí en ≥10% de los

residuos aminoacídicos (Cantón y Coque, 2006) (Figura 8). A diferencia de las BLEEs

de tipo TEM y SHV, que evolucionaron por acumulación de mutaciones en las β-

lactamasas clásicas, las enzimas CTX-M derivan de la β-lactamasa cromosómica de

distintas especies del género Kluyvera spp. (Cantón et al. 2012). Se ha propuesto que la

diseminación mundial y persistencia de los genes blaCTX-M se debe a la confluencia de

distintos factores: i) su localización en elementos genéticos móviles o movilizables; ii)

la fácil co-selección fruto de su asociación a genes de resistencia frente a otros

antibióticos de relevancia clínica; y iii) su presencia en clones altamente epidémicos.

39

Introducción

Con respecto a este último punto, cabe destacar la contribución del clon pandémico de

E. coli ST131 en la rápida emergencia global de las enzimas CTX-M-15 y, en menor

medida, CTX-M-14 (Rogers et al. 2011; Nicolas-Chanoine et al. 2014). Los complejos

clonales ST405 y ST38 también se han visto involucrados en la diseminación de

enzimas CTX-M, fundamentalmente de las variantes CTX-M-15, CTX-M-9 y CTX-M-

14 (Nasser y Sundsfjord, 2011). Además, E. coli ST10, principalmente comensal pero

también responsable de infecciones intraintestinales y extraintestinales, se ha asociado

con la emergencia en distintos ecosistemas de variantes pertenecientes a los grupos

CTX-M-1, CTX-M-2 y CTX-M-9 (D’Andrea et al. 2013).

A diferencia de las BLEE, las β-lactamasas de tipo AmpC o cefalosporinasas

se caracterizan por conferir resistencia a penicilinas, cefamicinas (cefoxitina, cefotetán),

cefalosporinas de hasta 3ª generación e inhibidores de β-lactamasas. Sin embargo, no

afectan a cefepima y carbapenémicos. Estas enzimas aparecen codificadas en el

cromosoma de numerosas especies de Enterobacterias (Proteus spp., Citrobacter

freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Morganella morganii…) y en

Pseudomonas aeruginosa, y son de naturaleza inducible. Esto significa que

normalmente se producen a bajos niveles de manera natural y aumentan su síntesis en

presencia de inductores (antibióticos β-lactámicos). Mutaciones en los genes

reguladores de ampC (ampR, ampD) dan lugar a cepas desreprimidas o

Figura 8. Diagrama que representa los distintos grupos o clusters en los que se dividen las enzimas CTX-M, elaborado a partir de la comparación de las secuencias aminoacídicas de las CTX-M y proteínas afines de Kluyvera spp., disponibles en la web Lahey Clinic (www.lahey.org/Studies/) y en la base de datos RED-DB (www.fibim.unisi.it/REDDB/). El tamaño de los triángulos del final de las ramas es proporcional al número de variantes dentro de cada grupo (D’Andrea et al. 2013).

40

Introducción

hiperproductoras de esta enzima. Por su parte, E. coli también presenta una β-lactamasa

AmpC cromosómica, pero es constitutiva (no inducible) (Navarro et al. 2002). Su nivel

de expresión es normalmente muy bajo debido a un promotor poco eficaz y a la

ausencia de ampR, por lo que E. coli no muestra un fenotipo resistente de manera

natural. Sin embargo, se han descrito mutaciones en el promotor del gen cromosómico

ampC (las más importantes en las posiciones -32 y -42), que desencadenan una

hiperproducción de esta β-lactamasa (Caroff et al. 2000). Además, en E. coli y también

en algunas cepas que no expresan de forma natural AmpC cromosómica (como

Klebsiella spp. y Salmonella spp.), se han encontrado enzimas AmpC mediadas por

plásmidos (Philippon et al. 2002). Hasta la fecha se han descrito más de 20 familias de

AmpC plasmídicas, entre las que destacan ACC, FOX, MOX, CMY, DHA y EBC. De

éstas, 5 variantes son de expresión inducible: DHA-1, DHA-2, ACT-1, CMY-12 y CFE-

1 (Schmidtke y Hanson, 2006).

Tanto las BLEE como las AmpC presentan una pobre actividad hidrolítica frente

a los carbepenémicos, excepto cuando se suman otros mecanismos de resistencia como

la pérdida o alteración de porinas, cuya acción sinérgica puede determinar una

considerable resistencia a estos antibióticos de última generación (Martínez-Martínez et

al. 1999). Sin embargo, la estrategia bacteriana más importante frente a los

carbapenémicos es la producción de carbapenemasas. Además de carbapenémicos,

este tipo de β-lactamasas pueden hidrolizar también otros antibióticos β-lactámicos,

aunque el espectro concreto de sustratos afectados dependerá de la enzima considerada.

Actualmente, las carbapenemasas más importante de clase A son las KPC, las de clase

B son las de tipo VIM, NDM e IMP, y las de clase D, OXA-48 y afines (Cercenado,

2015).

La enzima KPC se describió por primera vez en 1996 en una cepa de K.

pneumoniae en EEUU (Yigit et al. 2001) y, actualmente, es una de las carbapenemasas

con mayor distribución a nivel mundial. La producción de KPC se ha detectado

mayormente en K. pneumoniae, pero también en E. coli, C. freundii, S. marcescens,

Enterobacter spp. y Pseudomonas spp. (Martínez-Martínez y González-López, 2014).

Las enterobacterias productoras de KPC muestran alta resistencia a penicilinas y

cefalosporinas, y baja-moderada resistencia a carbapenémicos. La actividad de los

inhibidores de β-lactamasas sobre estas enzimas es también muy débil, si bien la

introducción reciente del avibactam, en combinación con la ceftazidima, ha demostrado

41

Introducción

una buena eficacia de inhibición frente a las KPC, OXA-48 y las BLEE (Shields et al.

2015). El gen blaKPC aparece típicamente embebido en el transposon Tn4401, el cual a

su vez se ha detectado en una gran variedad de plásmidos pertenecientes a diferentes

grupos de incompatibilidad (IncFIIK, IncA/C, IncN, IncI2, IncX, IncR y ColE)

(Martínez-Martínez y González-López, 2014).

Las carbapenemasas de clase B (metalo-betalactamasas) hidrolizan todos los

antibióticos β-lactámicos excepto los monobactámicos, mediante un mecanismo

dependiente de zinc (lo que hace que sean inhibidas por quelantes como el EDTA). No

son sustrato de los inhibidores de β-lactamasas y están frecuentemente presentes en

cepas productoras de BLEE. Dentro de este grupo, NDM-1 presenta menor actividad

hidrolítica que IMP-1 o VIM-2, lo que contrarresta con el hecho de que el gen

codificante de NDM-1 se localiza en plataformas genéticas altamente eficaces. Los

genes blaVIM y blaIMP aparecen como elementos movilizables (genes cassettes)

insertados en integrones de clase 1 o 3, los cuales, a su vez, están a menudo asociados a

transposones y a plásmidos conjugativos, aunque también pueden localizarse en el

cromosoma bacteriano (Zhao et al. 2009; Papagiannitsis et al. 2015).

La carbapenemasa OXA-48 se detectó por primera vez Turquía, en una cepa de

K. pneumoniae (Poirel et al. 2004). El gen blaOXA-48 se encuentra habitualmente

embebido en Tn1999, localizado en plásmidos IncL/M (Poirel et al. 2012).

4.3. GRUPO CLONAL ST131

En el año 2004 se publicó un estudio llevado a cabo en Reino Unido con una

amplia colección de cepas clínicas de E. coli productoras de CTX-M de origen

nosocomial y comunitario. Mediante PFGE se observó que muchas de ellas, portadoras

de la variante CTX-M-15, se agrupaban en 5 clusters principales que compartían un

78% de identidad (Woodford et al. 2004). En 2007 se publicó otro estudio similar en

Canadá, en el que muchas cepas portadoras de CTX-M-15 parecían también agruparse

en 2 clusters relacionados entre sí (15A, 15AR) (Pitout et al. 2007). Algunos de estos

aislamientos formaron parte de estudios posteriores en los que se compararon

colecciones de E. coli CTX-M-15 positivas de diferentes países (España, Francia,

Portugal, Canadá, Suiza, Líbano, India, Kuwait y Corea del Sur). Un hecho remarcable

fue la detección del grupo clonal ST131 en cepas provenientes de todos ellos (Coque et

al. 2008; Nicolas-Chanoine et al. 2008). Los 5 clusters con evidente relación del estudio

42

Introducción

del Reino Unido también se asociaron finalmente a este grupo clonal (Lau et al. 2008).

Todos los aislamientos de E. coli ST131 multirresistentes, pertenecieron al serotipo

O25b:H4, al grupo filogenético B2 y portaban el gen blaCTX-M-15 en plásmidos IncF

(Coque et al. 2008; Nicolas-Chanoine et al. 2008).

Desde entonces, se han reportado a nivel mundial numerosos casos de E. coli

ST131 relacionados con la diseminación de la enzima CTX-M-15 en el entorno

hospitalario, comunitario y veterinario (Mathers et al. 2015a). Además de CTX-M-15,

se ha observado que E. coli ST131 también puede contener plásmidos IncF portadores

de otras variantes, como CTX-M-14 o SHV-12 (Kim et al. 2011; Coelho et al. 2011;

Nicolas-Chanoine et al. 2014), al igual que distintas familias de plásmidos (IncI1, IncN,

IncA/C..) involucradas en la diseminación de otras BLEE (CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-

M-65..), cefalosporinasas (CMY-2) e, incluso, carbapenemasas (NDM, OXA-48…)

(Nicolas-Chanoine et al. 2014; de Toro et al. 2017).

Con respecto a la distribución de factores de virulencia en cepas E. coli ST131,

si bien se han identificado múltiples perfiles, numerosos estudios coinciden en la

significativa asociación existente entre este grupo clonal y la presencia de los siguientes

11 genes: fimH, sat, fyuA, kpsMII, usp, malX, iha, ompT, iucD, iutA y tratT (Johnson et

al. 2010; Lavigne et al. 2012; van der Bij et al. 2012). Es llamativa la baja prevalencia

en E. coli ST131 de algunos factores de virulencia relacionados con ExPEC

pertenecientes a otras líneas genéticas, como pap, cnf1, y hlyA.

Precisamente, en base al gen de virulencia fimH, uniformemente presente en

todas las cepas ST131, y a un fragmento interno del gen fumC, Weissman y

colaboradores describieron un esquema de tipificación muy útil para identificar

subclones dentro de los grupos clonales de las cepas ExPEC (Weissman et al. 2012).

Tras aplicar este método a una extensa colección de cepas E. coli ST131, Johnson y

colaboradores identificaron 7 subclones en función al alelo fimH (H15, H22, H27, H30,

H35, H41 y H94) (Johnson et al. 2013). Analizando la asociación de cada uno de ellos

con respecto a la resistencia a fluoroquinolonas y al año de aislamiento, se observó que

durante el primer periodo de estudio (1967-1999) sólo se detectaron cepas sensibles a

fluoroquinolonas, mayoritariamente pertenecientes a los subclones H22 y H35. Sin

embargo, entre 2000 y 2005 emergieron los aislamientos resistentes, casi

exclusivamente asociados a H30. En el último periodo, este subclon continuó en

ascenso englobando a más del 97% de las cepas de E. coli ST131 resistentes a

43

Introducción

fluoroquinolonas (Johnson et al. 2013). Estudios filogenéticos posteriores, basados en

técnicas de WGS (whole genome sequencing) y análisis de SNPs (Single Nucleotide

Polymorphism), determinaron que las cepas fimH30 resistentes a fluoroquinolonas

BLEE negativas (denominadas H30R) se agrupaban en un cluster diferente al de las

cepas resistentes a fluoroquinolonas productoras de CTX-M-15 (H30Rx) (Price et al.

2013). Ambas, evolucionaron a partir de un ancestro común sensible a fluoroquinolonas

(H30) (Figura 9). De esta forma se confirmó que el aumento de la incidencia de CTX-

M-15 y resistencia a fluoroquinolonas en el grupo clonal ST131 y, por ende, en la

especie E. coli, se debe fundamentalmente a una expansión clonal y no tanto a eventos

de TGH (Price et al. 2013; Petty et al. 2014).

Aunque la mayor parte de las cepas de E. coli ST131 se engloban dentro del

serotipo O25b:H4, existe un reducido subconjunto que pertenece al serotipo O16:H5.

Los aislamientos del linaje O16 ST131 contienen el alelo fimH41, y presentan una alta

prevalencia de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol y gentamicina, y baja a

fluoroquinolonas y BLEEs (ocasionalmente, CTX-M-14) (Banerjee y Johnson, 2014;

Peirano et al. 2014). Sin embargo, la mayor parte de las cepas O25b:H4 ST131

pertenecen al subclon fimH30, seguido del fimH22 y fimH35 (Peirano et al. 2014)

(Figura 9).

Figura 9. Estructura poblacional de E. coli ST131. Los colores muestran la resistencia típicamente asociada (no exclusiva) a los diferentes subclones. TMP-SMZ (trimetoprim-sulfametoxazol), FQ (fluoroquinolonas).

44

Introducción

5. MECANISMOS DE ACCIÓN Y RESISTENCIA A OTROS

ANTIBIÓTICOS

5.1. QUINOLONAS

Las quinolonas constituyen una familia de compuestos sintéticos obtenidos a

partir de la cloroquina, siendo su primer integrante el ácido nalidíxico. A través de los

años, este antimicrobiano ha sido modificado con el objetivo de obtener un espectro

más amplio de cobertura y mejores propiedades farmacocinéticas. Las primeras

fluoroquinolonas surgieron tras la adición de un grupo fluoruro al anillo central,

normalmente en la posición 6. Actualmente existen cuatro generaciones de quinolonas,

entre las que destacan, además del ácido nalidíxico, el ciprofloxacino, levofloxacino,

ofloxacino y moxifloxacino.

Las quinolonas ejercen su acción formando complejos ternarios con el ADN y

sus dos enzimas diana, la ADN girasa y la topoisomerasa IV, implicadas en los procesos

de replicación, recombinación y transcripción del ADN. Estas enzimas presentan una

estructura tetramérica similar, compuesta por dos subunidades A y dos subunidades B,

codificadas respectivamente por los genes gyrA y gyrB en el caso de la ADN girasa, y

parC y parE en el caso de la topoisomerasa IV (Álvarez-Hernández et al. 2015).

Las quinolonas son, junto con los β-lactámicos, los antibióticos de mayor uso en

clínica, y las tasas de resistencia a los mismos han aumentado mucho en los últimos

años. La resistencia a quinolonas se alcanza principalmente mediante 3 mecanismos

(Tabla 2):

Mutaciones cromosómicas en los genes de las topoisomerasas (región QRDR,

quinolone resistance determining region): De entre las diferentes mutaciones

asociadas a resistencia descritas en la región QRDR, aquellas que ocurren en los

codones Ser83 y Asp87 en GyrA, y Ser80 y Glu84 en ParC son las más

frecuentemente observadas. Estas mutaciones dan lugar a topoisomerasas con menor

afinidad por las quinolonas, lo que se traduce en un aumento de los valores de CMI

de todos estos compuestos. El nivel de resistencia es variable, dependiendo de la

diana afectada y del número de sustituciones aminoacídicas acumuladas. En general,

en E. coli, un único cambio aminoacídico en GyrA es suficiente para originar un alto

nivel de resistencia al ácido nalidíxico y una disminución de la sensibilidad a

45

Introducción

fluoroquinolonas. Sin embargo, para obtener un alto nivel de resistencia a estas

últimas, se requiere la presencia de un segundo cambio en GyrA y/o ParC (Ruiz,

2003).

Disminución en la acumulación del antibiótico en el interior de la célula: Se

puede dar por la sobreexpresión de bombas de eflujo (p. ej. AcrAB-TolC en

enterobacterias) o por la disminución de la permeabilidad de la membrana externa

(por mutaciones que afectan a las porinas o por alteraciones del lipopolisacárido).

Genes de resistencia a quinolonas mediados por plásmidos (PMQR, plasmid-

mediated quinolone resistance): Desde 1998 se empezaron a describir mecanismos

de resistencia de origen plasmídico, como la protección de la diana por proteínas

Qnr (Martínez-Martínez et al. 1998), la modificación de las quinolonas por la

enzima AAC(6’)-Ib-cr (Robicsek et al. 2006a) o las bombas de eflujo QepA

(Yamane et al. 2007) y OqxAB (Kim et al. 2009).

- Proteínas Qnr: Pertenecen a la familia de los pentapéptidos repetidos y se

caracterizan por presentar repeticiones en tándem de una serie semiconservada

de 5 aminoácidos [Ser, Thr, Ala o Val] [Asp o Asn] [Leu o Phe] [Ser, Thr o Arg]

[Gly]. Hasta la fecha, se han descrito 6 tipos de genes qnr: qnrA, qnrB, qnrC,

qnrD, qnrS y qnrCV (Cavaco et al. 2009; Wang et al. 2009; Pons et al. 2013),

distinguiéndose dentro de cada familia diversos alelos en función de su

porcentaje de homología con el gen inicial. La proteína Qnr actúa uniéndose a la

ADN girasa e inhibe la interacción de esta última con el ADN. De esta forma se

reduce la posibilidad de que la quinolona reconozca su diana, que es el complejo

girasa-ADN (Tran y Jacoby, 2002; Tran et al. 2005). El nivel de resistencia que

se genera es moderado y, según los puntos de corte de la CLSI para

enterobacterias, por sí sólo no produce plena resistencia. Sin embargo, la

presencia de qnr facilita la selección de resistencias de alto nivel a quinolonas.

Se ha visto que cuando qnr se expresa en una cepa deficiente en porinas, las

CMI para ciprofloxacino, levofloxacino y moxifloxacino aumentan de 8 a 32

veces (Rodríguez-Martínez, 2005).

- Enzima AAC(6’)-Ib-cr: En 2005 se demostró que mutaciones puntuales en dos

posiciones (Trp102Arg y Asp179Tyr) de la enzima AAC(6’)-Ib (responsable de

la resistencia a tobramicina, amikacina y kanamicina), determinaban la

46

Introducción

reducción de la susceptibilidad (3-4 veces) a algunas fluoroquinolonas. Esta

nueva variante de la aminoglucósido acetiltransferasa, denominada AAC(6’)-Ib-

cr (de ciprofloxacin resistance), produce una N-acetilación en el sustituto de

piperazinil de algunas quinolonas, como ciprofloxacino y norfloxacino

(Robicsek et al. 2006b).

- Bombas de eflujo QepA y OqxAB: En 2007, se identificó el gen plasmídico

qepA en dos cepas de E. coli en Japón y Bélgica (Perichon et al. 2007; Yamane

et al. 2007). Este gen codifica una bomba de eflujo, QepA (quinolone efflux

pump), que confiere resistencia a quinolonas hidrofílicas como ciprofloxacino,

norfloxacino y enrofloxacino (aumentos de 8 a 32 diluciones en la CMI).

Recientemente se han descrito además de qepA1 (Rocha-Gracia et al. 2010)

otras variantes (qepA2, qepA3), como consecuencia de sustituciones

aminoacídicas (Cattoir et al. 2008; Wang et al. 2015). Asimismo, OqxAB es otra

bomba de eflujo, codificada por los genes plasmídicos oqxA y oqxB, capaz de

conferir resistencia de alto nivel a olaquindox (usado como promotor de

crecimiento en animales) y un aumento muy moderado de las CMI de ácido

nalidíxico y ciprofloxacino. Se describió por primera vez en 2004 en cepas de E.

coli de origen porcino (Hansen et al. 2004), pero no fue hasta 2009 cuando se

publicó el primer aislamiento humano de E. coli portador del oqxAB en Corea

(Kim et al. 2009). Sin embargo, estos genes también pueden encontrarse en el

cromosoma de K. pneumoniae con diferentes niveles de expresión (Ruiz et al.

2012; Rodríguez-Martínez et al. 2013).

Tabla 2. Mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas asociados a cambios en la CMI de ciprofloxacino en E. coli (Adaptado de Yanat et al. 2017).

Mecanismo de resistencia a quinolonas Aumento diluciones (CMI ciprofloxacino)

Una sustitución en GyrA 10-16

Dos sustituciones en GyrA + Una sustitución en ParC 60

Sobreexpresión de bombas de eflujo 4-8

Pérdida de porinas 4

qnr 32-64

aac(6')-Ib-cr 4

qepA 32

oqxAB 16

47

Introducción

5.2. AMINOGLUCÓSIDOS

Los aminoglucósidos son antibióticos naturales o semisintéticos, principalmente

bactericidas, que actúan uniéndose a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano

impidiendo la correcta síntesis proteica. Amikacina, gentamicina y tobramicina son los

agentes más empleados en el tratamiento de infecciones sistémicas producidas por

bacterias Gram negativas. La resistencia de las enterobacterias frente a estreptomicina y

kanamicina es amplia. La actividad de los aminoglucósidos es menor frente a bacterias

Gram positivas y el tratamiento de las infecciones causadas por estreptococos y

enterococos requiere de la administración conjunta de un aminoglucósido y un inhibidor

de la síntesis de la pared celular que facilite la captación del primero. Estos antibióticos

no son activos frente a bacterias anaerobias ya que su paso a través de la membrana

plasmática es un proceso aerobio dependiente de energía (Murray et al. 2006b).

La resistencia adquirida de una bacteria a los aminoglucósidos puede ser debida

a 3 mecanismos: a) Alteración del sitio blanco por mutaciones a nivel ribosómico o

metilación postranscripcional del ARN 16S por de metilasas ArmA, Rmt o NpmA

(Galimand et al. 2003; Doi et al. 2004; Wachino et al. 2007); b) Disminución de la

acumulación intracelular del antibiótico y, c) Inactivación del antibiótico por enzimas

modificantes de aminoglucósidos. Este último mecanismo es el más frecuentemente

implicado en la resistencia a los aminoglucósidos. Se han descrito tres tipos de enzimas

modificantes que aparecen habitualmente codificadas en integrones y transposones: las

acetiltransferasas (AAC) que acetilan un grupo amino del antibiótico, las

fosfotransferasas (APH) que fosforilan un grupo hidroxilo y las

nucleotidiltransferasas (ANT) que adenilan un grupo hidroxilo (Mella et al. 2014).

Cada enzima inactivante reconoce un cierto tipo de aminoglucósido, lo que se traduce

en un fenotipo de resistencia concreto (Tabla 3).

Tabla 3. Fenotipos de resistencia asociados a enzimas modificantes de aminoglucósidos en E. coli (Adaptado de Martínez-Martínez y Ruiz de Alegría, 2009).

Fenotipo de resistencia Enzima modificante Estreptomicina APH(3'') Gentamicina AAC(3)-I Kanamicina, amikacina APH(3')-IV Estreptomicina, espectinomicina ANT(3'') Kanamicina, neomicina APH(3’)-I o APH(3’)II Kanamicina, tobramicina, amikacina ANT(4’)-II Kanamicina, gentamicina, tobramicina ANT(2’’)-I Kanamicina, gentamicina, tobramicina, netilmicina AAC(3)-II o AAC(3)-IV Kanamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina AAC(6’)-I Gentamicina, tobramicina, netilmicina, neomicina AAC(2’)

48

Introducción

5.3. TETRACICLINAS

Las tetraciclinas son antimicrobianos de amplio espectro, con actividad frente a

numerosas bacterias Gram positivas y Gram negativas, microorganismos atípicos

(Chlamydia spp., Micoplasma spp., Borrelia spp…) y algunas micobacterias. El primer

antibiótico de esta familia (la clortetraciclina) se detecta en el año 1948, obtenido a

partir de un cultivo de Streptomyces aureofaciens. Dos años más tarde, se aísla la

oxitetraciclina de S. rimosus. A partir de ese momento, gracias a los avances en el

campo de la bioquímica, se logran sintetizar nuevos compuestos como la tetraciclina,

democlociclina, metaciclina, doxiciclina o minociclina. Las glicilciclinas, que surgen de

la modificación en la posición 9 del anillo tetracíclico, constituyen un grupo más

reciente y activo cuyo prototipo es la tigeciclina.

Las tetraciclinas son mayormente bacteriostáticas y ejercen su acción

inhibiendo, de forma reversible, la síntesis de proteínas. Se ligan a la subunidad 30S de

los ribosomas, impidiendo la entrada del aminoacil ARNt al sitio aceptor del complejo

ARNm-ribosoma y evitando así la incorporación de nuevos aminoácidos a la cadena

polipeptídica.

Hasta mediados de la década de los 50, como sugieren algunos estudios, la

mayoría de las enterobacterias comensales y patógenas eran sensibles a las tetraciclinas

(Hughes y Datta, 1983). Sin embargo, el uso masivo de estos fármacos en medicina

humana, veterinaria y agricultura ha acelerado la emergencia de resistencias.

Actualmente se sabe que los principales mecanismos implicados en la resistencia de las

bacterias a tetraciclinas son los siguientes: a) bombas de eflujo; b) protección

ribosomal; c) inactivación enzimática y, d) mutaciones en el ARN ribosomal 16S.

El mecanismo de resistencia adquirido más prevalente son las bombas de eflujo,

de las que se han descrito al menos 28 (Tabla 4) (Nguyen et al. 2014). Los genes tet de

eflujo codifican proteínas Tet asociadas a membranas que expulsan las tetraciclinas

de la célula, disminuyendo la concentración intracelular del antibiótico y protegiendo

así a los ribosomas. Las bombas de eflujo se han dividido en 7 grupos de acuerdo a su

secuencia aminoacídica y al número de dominios que atraviesan la membrana (9-14).

Las más prevalentes son las del grupo 1, que presentan 12 dominios transmembrana e

incluyen a Tet(A) y Tet(B), las bombas de expulsión de tetraciclina más frecuentes en

Gram negativos (Grossman, 2016). Ambas reconocen tetraciclina, minociclina y

49

Introducción

doxiciclina y, aunque Tet(B) no afecta a tigeciclina, la sobreexpresión de Tet(A)

aumenta considerablemente su CMI (Grossman et al. 2012).

El segundo mecanismo más importante de resistencia a tetraciclinas es la

expresión de genes que codifican proteínas de protección ribosomal, siendo las más

prevalentes Tet(O) y Tet(M). Estas proteínas se unen al ribosoma, en un sitio diferente

al reconocido por el antibiótico, pero promueven un cambio conformacional en el

mismo que impide la unión de la tetraciclina (Connell et al. 2003).

5.4. CLORANFENICOL

El cloranfenicol se aisló por primera vez en 1947 a partir Streptomyces

venezuelae. Debido a su relativa simplicidad estructural, desde 1950 se obtiene por

síntesis química. A pesar de ser un antibiótico con un amplio espectro de acción, su

elevada toxicidad en humanos y en animales ha conllevado a reducir significativamente

su uso. El florfenicol, un derivado fluorado del cloranfenicol, es otro compuesto

aprobado exclusivamente para su empleo en animales de consumo.

El cloranfenicol actúa inhibiendo la síntesis de proteínas mediante la prevención

de la elongación de la cadena polipeptídica. Su actividad bacteriostática se debe a la

unión reversible que establece con la peptidiltransferasa de la subunidad ribosomal 50S.

El principal mecanismo de resistencia frente al cloranfenicol es el de la

inactivación enzimática por acetilación, mediado por los diferentes tipos de

cloranfenicol acetiltransferasas (CAT) descritos. Estas enzimas, habitualmente

Tabla 4. Determinantes de resistencia a tetraciclina (Nguyen et al. 2014).

50

Introducción

codificada por genes plasmídicos, reaccionan con el grupo hidroxilo del alcohol

primario del cloranfenicol. La reacción queda impedida frente al florfenicol, ya que en

este compuesto el grupo hidroxilo es sustituido por un átomo de flúor no acetilable.

Además, la resistencia a cloranfenicol también puede darse por exportadores

específicos codificados por genes como cmlA o floR (este último también confiere

resistencia al florfenicol), que expulsan el antibiótico de la célula (Schwarz et al. 2004).

5.5. SULFAMIDAS Y TRIMETOPRIM

Las sulfamidas son compuestos sintéticos derivados de la sulfanilamida, el

primer miembro de la familia en mostrar actividad antimicrobiana. Desde 1935 se

emplearon extensamente en medicina y veterinaria, lo que favoreció la rápida aparición

de resistencias. Este factor, junto con la descripción de efectos secundarios indeseables

observados en pacientes tratados y la aparición de nuevos antibióticos, ha hecho que en

la actualidad su uso no esté muy extendido (Sköld, 2000). Sulfamidas como el

sulfametoxazol, por sí solas bacteriostáticas, se emplean frecuentemente en

combinación con diaminopirimidinas como el trimetoprim. La asociación de ambos

compuestos (cotrimoxazol) presenta una acción sinérgica bactericida.

Tanto las sulfamidas como el trimetoprim actúan sobre la ruta del metabolismo

del ácido fólico, esencial en la producción de purinas y la síntesis de ácidos nucleicos.

Las sulfamidas inhiben competitivamente a la enzima dihidropteroato sintasa, debido a

la analogía estructural que presentan con su sustrato natural, el p-aminobenzoico

(PABA). El trimetoprim actúa inhibiendo otra enzima, la dihidrofolato reductasa, que

permite la oxidación del ácido dihidrofólico al tetrahidrofólico (Mosquito et al. 2011).

La resistencia a sulfamidas se produce, principalmente, por genes que codifican

formas mutantes de la enzima dihidropteroato sintasa que no pueden ser inhibidas por el

antibiótico (sul1, sul2, sul3). Estos genes se hallan habitualmente incluidos en

integrones, transposones y/o plásmidos (Sköld, 2000; Mosquito et al. 2011).

Entre los mecanismos de resistencia adquirida al trimetoprim, el más extendido

es también la presencia de genes transferibles que codifican diferentes formas de la

enzima dihidrofolato reductasa (genes dfr). Se conocen más de 25 genes dfr diferentes,

subdivididos en dos grupos principales (dfrA y dfrB) en función de su secuencia

aminoacídica (Kehrenberg y Schwarz, 2005). Muchos de ellos aparecen como genes

cassettes formando parte de la región variable de los integrones.

51

Introducción

6. ELEMENTOS GENÉTICOS DE ADQUISICIÓN Y DISEMINACIÓN DE

GENES DE RESISTENCIA

Como ya se ha comentado, la TGH involucra la movilización de elementos

genéticos entre bacterias, lo que implica un profundo impacto en la evolución

bacteriana. Es uno de los principales mecanismos responsables de la adquisición de

nuevas rutas metabólicas en los microorganismos y de la rápida adaptación de éstos a

nuevos nichos ecológicos y a condiciones ambientales de estrés (Top y Springael,

2003). La TGH no está solamente involucrada en la diseminación de genes de

resistencia a antibióticos, sino también en la transmisión de genes relacionados con la

patogenicidad (Gyles y Boerlin 2014), la degradación de compuestos xenobióticos

(pesticidas, metales pesados…) (Top y Springael, 2003) o el desarrollo de complejos

procesos celulares como la fijación del nitrógeno (Bolhuiset al. 2010) o la fotosíntesis

(Raymond, 2009). Entre los elementos genéticos involucrados en la adquisición y la

transferencia de genes se encuentran las secuencias de inserción (IS), transposones,

plásmidos, elementos conjugativos integrativos (ICE), islas genómicas, integrones

(genes cassettes) y bacteriófagos. Las principales características de todos ellos se

resumen en la Tabla 5. Algunos de estos elementos, como transposones e integrones,

están más implicados en la movilidad intracelular entre cromosomas y replicones

(plásmidos, fagos). Otros, como plásmidos, bacteriófagos o ICEs, en el intercambio

intercelular de genes (Figura 10).

Figura 10. Elementos genéticos involucrados en la adquisición/diseminación de genes de resistencia. Los elementos superpuestos indican relación física o funcional (Boerlin y Reid-Smith, 2008).

52

Introducción

Tabla 5. Elementos genéticos de adquisición y transferencia de genes.

Elemento genético Características principales Secuencias de inserción (IS)

Los elementos de transposición más sencillos encontrados en procariotas. Son unidades autónomas que sólo portan el gen que codifica la transposasa, lo que posibilita la movilización de la misma. Están flanqueadas por 2 extremos cortos repetidos (10-40 pb), pero en sentido inverso. Al igual que los transposones, pueden encontrarse integradas en cromosoma o plásmidos. Las IS pueden contener promotores completos o parciales, a menudo ubicados en los extremos, que les permiten aumentar la expresión de los genes vecinos.

Transposones Además de los genes necesarios para su movilización, portan genes que codifican funciones adicionales (habitualmente resistencia a antibióticos, pero también otras).

Plásmidos Moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal con capacidad de replicación autónoma, autotranferibles o movilizables.

Elementos conjugativos integrativos (ICE)

Se encuentran integrados en el cromosoma, pero retienen la habilidad de escindirse, formar un intermediario circular covalentemente cerrado y transferirse a otra célula bacteriana en la cual generalmente se insertan en el cromosoma.

Islas genómicas Largas regiones cromosómicas adquiridas por TGH, flanqueadas por secuencias cortas repetidas (16-20 pb) que actúan como secuencias diana de enzimas que permiten la escisión de la isla genómica. Se insertan preferentemente cerca de ciertos determinantes cromosómicos (p. ej. genes que codifican tARN) y entre los genes que incluyen se encuentran aquellos que codifican una enzima de tipo integrasa. Se las clasifica en varios tipos en función de la ventaja adaptativa que confieren a la cepa que las alberga: islas de patogenicidad, de simbiosis, metabólicas, o de resistencia.

Integrones Elementos que contienen los determinantes genéticos para mediar la recombinación sitio-específica que les permite capturar cassettes génicos móviles.

Bacteriófagos Virus bacterianos. Su genoma puede integrase en el cromosoma bacteriano (profago) replicándose a la vez que lo hace la bacteria, obien puede mantenerse estable en forma de plásmido, replicándose de forma independiente.

A continuación, se describen en mayor profundidad los elementos genéticos más

estudiados en esta tesis en relación con la adquisición y diseminación de genes de

resistencia a antibióticos: IS, transposones, integrones y plásmidos.

6.1. ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Son secuencias de ADN que poseen la capacidad intrínseca de cambiar de

posición dentro del genoma y replicarse con él. De acuerdo con su mecanismo de

transposición se clasifican en:

Retrotransposones: Utilizan un intermediario de ARN en su movilización

intracelular.

Secuencias de inserción y transposones: Se transponen directamente a través de

una molécula de ADN. Por su especial mención en esta tesis, nos centraremos en la

descripción de estos últimos.

53

Introducción

Las IS y los transposones suelen movilizarse por un evento de recombinación no

homóloga, en el cual hay ruptura de enlace y formación de enlaces fosfodiéster. Si bien

muchos elementos se insertan en lugares muy diversos dentro del genoma bacteriano (p.

ej. Tn5), otros poseen una clara tendencia a insertarse en determinadas regiones,

mediante un mecanismo de inserción sitio específico (p. ej. Tn7) (Gay et al. 1986).

Los transposones codifican una enzima o complejo enzimático denominado

transposasa, encargada de catalizar la transposición, reconociendo tanto el sitio blanco

como los extremos del transposón. La transposición puede ser de tipo conservativa (el

transposón salta de un lado a otro, dejando un huevo en el ADN donante) o replicativa

(existen 2 copias del transposón, una en el donante y otra en el receptor, y se lleva a

cabo mediante la formación de un cointegrado) (Patel, 2016).

Los elementos transponibles son capaces de causar mutaciones por inserción,

duplicaciones y reordenaciones en el genoma o de favorecer la diseminación de genes

de resistencia/virulencia entre especies. A continuación, se describen algunos de los más

relevantes (Figura 11):

Secuencias de inserción: Son elementos transponibles pequeños (0.5-2 kb), los

primeros reconocidos en bacterias. Sólo portan el gen que codifica la transposasa y

están flanqueadas por secuencias cortas repetidas en orden inverso denominadas

IRR e IRL (Right Inverted Repeat y Left Inverted Repeat). Cuando una IS transpone,

aparece una pequeña repetición directa de la secuencia diana (DR), de 2 a 14 pb,

flanqueando las IRR e IRL. Algunas IS pueden contener promotores completos o

parciales, a menudo ubicados en sus extremos y en una orientación hacia afuera, que

promueven la expresión de los genes vecinos (Depardieu et al. 2007). Se han

descrito 26 familias que engloban las distintas IS identificadas tanto en bacterias

Gram negativas como en Gram positivas (https://www-is.biotoul.fr).

Transposones compuestos: Son de mayor tamaño y están conformados por una

región central que contiene uno o más determinantes de diversa naturaleza,

flanqueados por dos elementos IS que pueden orientarse en la misma dirección o en

dirección invertida. Las secuencias de inserción son las que codifican la actividad

transposasa, facilitando la movilización del transposón. En ocasiones los elementos

IS flanqueadores son idénticos, como es el caso del transposón Tn9 (repeticiones

directas de IS1, codifica resistencia a cloranfenicol) y de Tn903 (repeticiones

54

Introducción

Figura 11. Tipos de elementos transponibles de acuerdo con su estructura. Triángulo morado: repetición directa (DR); rectángulo rayado: repetición invertida (IR); rectángulo rosa: gen de la transposasa; rectángulo gris claro: gen de la resolvasa; rectángulo azul: gen de resistencia; rectángulo gris oscuro: sitio res.

invertidas de IS903, codifica resistencia a kanamicina) (Alton y Vapnek, 1979;

Grindley y Joyce, 1980). Otras veces, como en Tn5 o Tn10, los elementos IS están

relacionados, pero no son idénticos (Haniford, 2006).

Transposones no compuestos: De estructura más compleja que los anteriores y

mayor importancia clínica debido a su extremada eficiencia en la diseminación de

genes de resistencia a antibióticos, metales pesados y determinantes de

patogenicidad. Presentan largas secuencias repetidas en los extremos, pero no se

encuentran flanqueados por ISs. Poseen al menos un gen que codifica una

transposasa (tnp), un sitio res (involucrado en la resolución del intermediario

cointegrado) y una recombinasa sitio-específica llamada resolvasa (tnpR). Algunos

representantes de este grupo son los transposones Tn3 y Tn21, implicados en la

diseminación de múltiples genes de resistencia (Bennett, 2008).

6.2. INTEGRONES

Aunque ya en la década de los 70 se conocía que la multirresistencia podía

deberse a la integración de genes mediada por plásmidos o transposones, no fue hasta

finales de los 80 cuando se reconocieron los integrones como importantes plataformas

genéticas involucradas en la adquisición (y escisión) de genes de resistencia (Stokes y

Hall, 1989). Inicialmente se describieron en aislamientos clínicos, y más tarde se

reportaron también en bacterias ambientales (Boucher et al. 2007). Actualmente se sabe

que los integrones se hallan ampliamente distribuidos en distintos nichos ecológicos y

géneros bacterianos, fundamentalmente en enterobacterias y bacilos Gram negativos no

fermentadores, pero también en algunas especies de bacterias Gram positivas como

Corynebacterium glutamicum (Nesvera et al. 1998) y Staphylococcus aureus (Xu et al.

2007).

55

Introducción

La definición más divulgada de integrón es aquella que lo describe como un

elemento dinámico que contiene los determinantes genéticos para mediar la

recombinación sitio-específica que le permite capturar los cassettes génicos móviles

(Hall y Collis, 1995). Su estructura básica consta de 3 elementos indispensables para la

captura y expresión de los genes cassettes: el gen de la integrasa (intI), un sitio

adyacente de recombinación (attI) y al menos un promotor encargado de la expresión de

los genes cassettes incorporados en la región variable. En general, el gen intI y el sitio

attI próximo, reciben el nombre de segmento conservado 5´ (5´-CS).

Los genes cassettes son elementos móviles que codifican diferentes funciones

(patogenicidad, metabolismo, resistencia a metales o antibióticos...). Pueden encontrarse

libres en el citoplasma, como moléculas de ADN circulares no replicativas, o integrados

en la estructura del integrón. Su integración y escisión es dependiente de la integrasa y

de regiones de recombinación específicas ubicadas en la estructura del integrón, los

sitios attI y attC (o elementos de 59 pb). La integrasa reconoce los sitios attC y cataliza

los procesos de recombinación sitio-específica, ya sea integración o escisión entre attI x

attC o entre attC x attC (Figura 12) (Stokes et al. 1997). También ha sido documentada

la recombinación integrativa entre dos sitios attI e incluso entre lugares secundarios y

attC o attI, aunque esto ocurre de forma infrecuente (Recchia et al. 1994). Cuando el

sitio attC se encuentra en forma de cadena simple, debido a la particularidad de su

secuencia palindrómica, puede plegarse adquiriendo una estructura secundaria estable

en forma de tallo-bucle (Bouvier et al. 2005). Dos bases extra-helicoidales de esta

estructura (generalmente una G y una T) colaboran con la afinidad de la integrasa y

determinan la orientación en la que se inserta el gen cassette en el sitio blanco

(MacDonald et al. 2006).

La integración de los cassettes en la región variable del integrón parece estar

mediada por dos mecanismos moleculares: a) escisión, circularización e inserción del

cassette en el sitio attI o attC; b) formación y resolución de cointegrados entre dos

replicones portadores de integrones presentes en la misma bacteria. Las concentraciones

intracelulares de integrasa y la fase de crecimiento bacteriano determinan el tipo de

evento de recombinación que tiene lugar (Shearer y Summers, 2009).

Los genes cassettes, por lo general, carecen de una secuencia promotora. Su

transcripción está regulada por el promotor Pc localizado en la región 5’-CS del

integrón. Se ha demostrado que aquellos que se encuentran más cercanos al promotor Pc

56

Introducción

son más eficientemente transcritos. Existen, aunque son escasos, genes cassettes que

contienen un promotor propio. Algunos ejemplos son cmlA, qacE y qacG o el cassette

fusionado oxa10-aadA1 (Bissonnette et al. 1991; Naas et al. 2001; Di Conza y Gutkind,

2010).

Las integrasas de integrones pertenecen a la familia de las tirosinas

recombinasas y, como tal, poseen todas las regiones conservadas que caracterizan a esta

familia (los residuos invariables RHRY y los motivos conservados correspondientes a

las cajas I y II y los parches I, II y III). Sin embargo, el análisis funcional de IntI1 y la

comparación de su secuencia aminoacídica con la de otras integrasas de integrones y

tirosina recombinasas, demostró que las primeras presentan un motivo conservado

adicional (secuencia ALER), cercano al parche III. Este motivo ALER, propio de las

integrasas de integrones, parece ejercer un importante papel en la actividad recombinasa

y el reconocimiento de los sitios attC y attI (Messier y Roy, 2001).

Actualmente, se reconocen 2 principales grupos de integrones: los

superintegrones (SI) y los integrones móviles. Los SI están localizados en el cromosoma

de bacterias ambientales como Vibrio spp. y Xanthomonas spp., son aparentemente

inmóviles, y se caracterizan por presentar un gran número genes cassettes (entre 20 y

200), que generalmente codifican proteínas de función desconocida, y muestran una

elevada homología (>80%) entre sus sitios attC. Por el contrario, los integrones móviles

se encuentran ligados a transposones, plásmidos o islas genómicas que facilitan su

movilización intra e intercelular. Además, contienen un menor número de genes

cassettes (<8), mayoritariamente relacionados con resistencia a antibióticos y

desinfectantes, cuyos attCs presentan una secuencia muy variable (Rowe-Magnus et al.

2002; Mazel, 2006; Stalder et al. 2012). Dentro de este grupo de integrones móviles o

de resistencia, se conocen 5 clases distinguibles en base a la secuencia aminoacídica de

la integrasa (clase 1 -intI1-, clase 2 -intI2-, clase 3 -intI3-, clase 4 -intI9- y clase 5 –

intIHS-) (Cambray et al. 2011; Stalder et al. 2012). Los más prevalentes, y de mayor

relevancia clínica, son los integrones de clase 1 y 2 (Stalder et al. 2012).

Los integrones de clase 1 están asociados a transposones funcionales y no

funcionales derivados de Tn402, que han sido embebidos en plásmidos y elementos

transponibles de la familia Tn3, asegurando su dispersión (Stalder et al. 2012). Se

caracterizan por presentar la secuencia 5’-CS ya descrita y, en la mayor parte de los

casos, una región conservada 3’ (3’-CS) compuesta por los genes qacE∆1 y sul1, que

57

Introducción

confieren resistencia a compuestos de amonio cuaternario y sulfamidas,

respectivamente, y un marco de lectura abierto de función desconocida (orf5) (Figura

12). Existen, sin embargo, integrones defectivos en la región 3’-CS y, otros, asociados a

la estructura qacH-IS440-sul3 (Sáenz et al. 2010). El análisis detallado del promotor Pc

de los integrones de clase 1, localizado dentro del gen intI1, ha permitido identificar la

existencia de al menos 10 variantes, con diferente fuerza promotora, en función de la

secuencia de los hexámeros -35 y -10. En ocasiones puede existir un segundo promotor

(P2), localizado en la región attI, creado por la inserción de 3 residuos de guanina que

incrementan el espacio entre los sitios -35 y -10. La presencia de un promotor P2 activo,

frecuentemente asociado a un promotor PC débil, aumenta significativamente la

expresión de los genes cassettes. Además, la fuerza de estos promotores muestra una

correlación con la capacidad de la integrasa de clase 1 para escindir cassettes génicos: a

mayor fuerza promotora, menor es la actividad de escisión de la integrasa (la capacidad

de integración no se ve modificada) (Jové et al. 2010).

Los integrones de clase 2 se hallan mayormente embebidos en transposones

Tn7 y derivados. La integrasa intI2 presenta un 40% de homología con intI1 y se

caracteriza porque, generalmente, posee un codón de terminación en posición 179. Esto

origina una proteína truncada, no funcional, que justificaría el bajo número de arreglos

observados en la zona variable de los integrones de clase 2 (Hansson et al. 2002).

Figura 12. Estructura y funcionamiento del integrón de clase 1. Inserción y escisión de genes cassettes mediante recombinación sitio-específica mediada por la integrasa.

58

Introducción

Excepcionalmente se han descrito integrasas funcionales de clase 2, carentes del codón

de terminación prematuro (Barlow y Gobius, 2006; Márquez et al. 2008; Rodríguez-

Minguela et al. 2009; Wei et al. 2014). La inserción/escisión de genes cassettes en la

región variable de los integrones de clase 2 parece estar fundamentalmente mediada por

la actividad de otras integrasas presentes en la célula (p. ej. IntI1) (Hansson et al. 2002).

Recientemente, se ha observado que la coexistencia de 2 promotores activos,

localizados en la región attI, regula la expresión de los genes cassettes en los integrones

de clase 2 (Jové et al. 2017). Estos promotores puedes ser fuertes (Pc2AV1, Pc2BV1) o

débiles (Pc2AV2, Pc2BV2), si bien se sabe que las variantes débiles se hayan siempre

asociadas y están presentes exclusivamente en integrones que contienen una integrasa

de clase 2 funcional (Jové et al. 2017). La relación fuerza promotora/funcionalidad de la

integrasa y el descubrimiento reciente de que, a diferencia de lo que ocurre en los

integrones de clase 1, la expresión de los cassettes en los integrones de clase 2 es

independiente de la respuesta SOS (y, por tanto, del represor LexA), ha llevado a

plantear un modelo evolutivo para estos últimos (Figura 13).

Figura 13. Modelo evolutivo del integrón de clase 2. A) Integrón de clase 2 ancestral, portador de una integrasa funcional. LexA se une a su promotor y reprime la expresión de los genes cassettes. Los promotores Pc2 pertenecen a variantes de alta fuerza promotora (Pc2AV1, Pc2BV1), lo que promueve la expresión de los genes cassettes. B) El promotor de LexA evoluciona evitando la unión de LexA y desreprimidola integrasa, que se expresa constitutivamente (aumentando el coste biológico del integrón). Este alto coste se compensará a través de mutaciones. C) Aparece una mutación en intI2 que origina una integrasa no funcional, lo que rebaja el coste biológico del integrón (estructura altamente prevalente). D) Se producen mutaciones en las regiones promotoras que originan promotores débiles (Pc2AV2, Pc2BV2), lo que disminuye la expresión de la integrasa funcional (estructura poco prevalente) (Jové et al. 2017).

59

Introducción

Figura 14. Estructura general del integrón de clase 2. El asterisco indica que intI2 codifica una proteína truncada. La región 3’-CS contiene el módulo de transposición de Tn7.

Con respecto a la región 3’-CS, los integrones de clase 2 presentan un módulo de

transposición constituido por 5 genes (tnsA, tnsB, tnsC, tnsD, tnsE) implicados en la

movilización de estos integrones mediante 2 vías principales. La transposición dirigida

por tnsD reconoce una secuencia específica localizada en el cromosoma bacteriano

(sitio attTn7), mientras que la mediada por tnsE moviliza preferentemente los

integrones a plásmidos conjugativos y bacteriófagos (Parks y Peters, 2007) (Figura 14).

6.3. PLÁSMIDOS

Los plásmidos son moléculas de ADN bicatenario extracromosómico capaces de

replicarse de forma autónoma. No contienen genes esenciales para la supervivencia del

hospedador, sino aquellos que le confieren alguna ventaja adaptativa, como

determinantes de resistencia a antibióticos, metales pesados, virulencia o bacteriocinas.

Los plásmidos adquieren estos genes a través de elementos genéticos móviles (IS,

transposones) y promueven su diseminación entre bacterias de diferentes especies,

géneros e incluso reinos, en función de la amplitud del rango de hospedadores y de la

eficacia conjugativa específica del plásmido (Carattoli, 2013). Son muy variables en

tamaño (>1-400 kb) y número de copias (1-30 copias/célula), y están presentes en

bacterias de todos los linajes y comunidades, incluyendo ambientes terrestres, marinos y

clínicos (Bennett, 2008).

Los plásmidos presentan una estructura modular en la que los genes se agrupan

formando regiones funcionales (Norman et al. 2009; Garcillán-Barcia et al. 2011).

Constan de un esqueleto conservado o backbone que contiene los determinantes

encargados de la replicación, propagación y mantenimiento del plásmido, en

combinación con una región variable o de adaptación compuesta por un mosaico de

elementos transponibles asociados a genes que confieren alguna ventaja adaptativa a la

bacteria huésped (Norman et al. 2009) (Figura 15).

60

Introducción

El módulo de replicación es la única región esencial del plásmido y agrupa los

genes y secuencias específicas involucradas en la replicación y el control del número de

copias. Sus componentes básicos son: a) el origen de replicación (ori), b) los genes cop

e inc relacionados con el control del inicio de la replicación y, c) los genes rep

codificantes de las proteínas iniciadoras. Existen 2 mecanismos de replicación

plasmídica: la replicación tipo theta (θ) (más prevalente en proteobacterias) y la

replicación por círculo rodante (frecuente en bacterias Gram positivas) (Garcillán-

Barcia et al. 2011).

La clasificación de los plásmidos según el grupo de incompatibilidad (Inc)

(plasmid-based replicon typing, PBRT) se realiza, precisamente, por un sistema de

tipado por PCR basado en la identificación y amplificación de secuencias relacionadas

con este módulo de replicación (Carattoli et al. 2005b). La técnica se fundamenta en la

evidencia de que dos plásmidos con el mismo replicón no pueden coexistir en la misma

célula (son incompatibles). Aunque no exento de limitaciones (plásmidos

multirreplicón, mutaciones puntuales que convierten plásmidos relacionados en

compatibles, mecanismos alternativos de replicación) (Fernández-López et al. 2017),

actualmente este sistema se considera el método estándar para la identificación de

Figura 15. Organización modular de un plásmido conjugativo y un plásmido movilizable. Los genes aparecen coloreados en base al módulo funcional al que pertenecen. El módulo de propagación se divide en dos colores: en rojo, la región involucrada en el procesamiento del ADN para su conjugación; en naranja, la responsable de la síntesis del sistema de secreción de tipo IV (Garcillán-Barcia et al. 2011).

61

Introducción

plásmidos en enterobacterias y Acinetobacter (Carattoli et al. 2013). Para algunas

familias de replicones (IncI1, IncF, IncHI1, IncHI2, IncN) se han desarrollado técnicas

de subtipado como el pMLST (plasmid MLST), basada en la amplificación y

secuenciación de regiones plasmídicas conservadas (http://pubmlst.org/plasmid/)

(García-Fernández et al. 2008).

El módulo de propagación o conjugación agrupa los genes implicados en la

movilización intercelular del plásmido. En el proceso conjugativo intervienen proteínas

cuyos genes se organizan en 3 módulos especializados: a) el relaxosoma, formado por la

proteína iniciadora (relaxasa) y otras que preparan el ADN en el origen de transferencia

(oriT) para ser transferido, b) el sistema de secreción tipo IV (T4SS, type IV secretion

system), un complejo multiprotéico anclado a la membrada capaz de transportar el ADN

de una célula a otra y, c) la proteína acopladora, que conecta el T4SS con el relaxosoma

(Smillie et al. 2010). En función de este módulo, se diferencian 2 tipos de plásmidos:

Plásmidos conjugativos o autotransferibles: portadores de todos los genes

implicados en la conjugación. Suelen tener un tamaño >30 kb y presentar un bajo

número de copias por célula. P. ej. IncN, IncP o IncA/C (plásmidos promiscuos o de

amplio rango de hospedadores); IncF, IncI, IncX, IncHI2 (espectro reducido a la

familia Enterobacteriaceae).

Plásmidos movilizables: portadores solamente del oriT y del gen codificante de la

relaxasa. Únicamente se transfieren de una bacteria a otra cuando en la donadora

existe otro plásmido o elemento conjugativo que aporta el resto de la maquinaria

(T4SS y proteína acopladora). Suelen ser de menor tamaño que los anteriores (<15

kb) y aparecen en alto número de copias. Ej. ColE, IncQ.

Considerando que la relaxasa es un elemento crucial del relaxosoma para la

iniciación de la transferencia del ADN, común tanto en plásmidos conjugativos como

movilizables, se ha propuesto otro método para el tipado de plásmidos en base a este

criterio. La técnica, conocida como Degenerate Primer MOB Typing o DPMT, emplea

19 pares de cebadores degenerados para amplificar e identificar secuencias de las

distintas relaxasas presentes en los plásmidos de γ-proteobacterias (Alvarado et al.

2012). Una de las ventajas más destacables de este método es que permite detectar

incluso aquellos plásmidos no asignables a ningún grupo de incompatibilidad. Sin

embargo, como limitación, no permite identificar los plásmidos no transmisibles

62

Introducción

carentes de genes de movilidad (Garcillán-Barcia et al. 2011; Alvarado et al. 2012).

Cabe señalar, que ambos métodos de tipado plásmídico (PBRT y DPMT) presentan una

buena correlación y, lejos de ser excluyentes, se consideran complementarios, ya que

permiten analizar distintas propiedades de los plásmidos (Figura 16) (Alvarado et al.

2012; Carattoli, 2013).

El módulo de estabilidad se encarga de mantener un número estable de copias y

de asegurar una correcta herencia de los plásmidos. Para ello existen tres principales

estrategias: a) mecanismos de resolución de multímeros, b) sistemas de partición activa

y, c) sistemas de adicción, muerte post-segregacional o toxina-antitoxina (T-A)

(Norman et al. 2009). Los primeros, presentes en plásmidos con replicación θ, son

necesarios para resolver dímeros o multímeros consecuencia de la recombinación entre

diferentes copias del plásmido. Además, los plásmidos con bajo número de copia, para

prevenir que la descendencia pierda el plásmido por azar tras la división celular y

aparezcan células libres de plásmido, necesitan otros mecanismos que aseguren que éste

Figura 16. Correspondencia entre clases MOB e Inc/Rep. En ausencia de un grupo de replicación definido como grupo de incompatibilidad, se indica un plásmido prototipo (Alvarado et al. 2012).

63

Introducción

pase a la descendencia (partición activa) o que eliminen las células hijas que lo han

perdido (sistemas T-A). Los sistemas de partición, mediados generalmente por dos

proteínas y uno o más sitios par, actúan de manera similar al sistema mitótico en células

eucariotas segregando equitativamente las copias del plásmido entre las células hijas

(Baxter y Funnell, 2014). Los sistemas T-A buscan eliminar la competencia ecológica

que suponen las poblaciones bacterianas carentes del plásmido en cuestión. Se

diferencian en dos grupos principales en función de la naturaleza de la antitoxina que

empleen. Así, ésta puede ser un ARN antisentido que hibrida con el ARNm de la toxina

impidiendo su traducción (ej. sistema hok/sok) o, más frecuentemente, una proteína que

se une con alta afinidad a la toxina (relBE, vapBC, hicAB, ccdAB…) (Gerdes y

Maissoneuve, 2012).

El módulo de establecimiento, esencial para el mantenimiento del plásmido en el

medio natural, se localiza en la región líder, la primera en entrar a la célula receptora

durante la conjugación. Contiene sistemas anti-restricción, que protegen de las

endonucleasas de restricción codificadas por el huésped, y mecanismos que minimizan

la activación de la respuesta SOS del anfitrión (genes psiB, ssb, ardA o sog) (Norman et

al. 2009).

Finalmente, el módulo de adaptación, el más variable, contiene los genes que

facilitan que el hospedador pueda adaptarse a nichos y condiciones específicas (genes

de virulencia, resistencia a antibióticos, metales pesados…). La adquisición de estos

determinantes va asociada a secuencias de inserción, transposones e integrones,

altamente frecuentes en el módulo de adaptación. En muchos casos, estos elementos

accesorios de origen foráneo pueden reconocerse por la significativa diferencia en

contenido G+C que presentan con respecto al esqueleto del plásmido.

7. SISTEMAS CRISPR/Cas

El descubrimiento de las repeticiones CRISPR (clustered, regularly interspaced,

short palindromic repeats) fue descrito a finales de los 80 en Bacteria y, unos años más

tarde, en Archaea (Ishino et al. 1987; Mojica et al. 1993). Los CRISPRs son

repeticiones directas de entre 21-47 pb de longitud que quedan separadas por secuencias

cortas llamadas espaciadores. Algunos de estos espaciadores presentan alta homología

con secuencias pertenecientes a elementos genéticos móviles, tales como plásmidos o

64

Introducción

bacteriófagos. Los loci CRISPR suelen presentan una region rica en adeninas y timinas

en uno de sus extremos, a la que se conoce como leader. Éste contiene el promotor que

dirige la transcripción del array CRISPR y proporciona una señal de reconocimiento

para la adquisición de nuevos espaciadores.

Frecuentemente, los arrays CRISPR aparecen asociados a genes que codifican

nucleasas, los llamados genes cas. Por lo tanto, un sistema CRISPR/Cas completo estará

constituido por al menos un array de CRISPR-espaciadores, una region leader y un set

de genes cas. Aunque se han propuesto diferentes roles biológicos, diversos estudios

funcionales han demostrado que CRISPR/Cas actúa como un sistema immune

adaptativo y hereditario en procariotas, capaz de reconocer y neutralizar ADN exógeno.

A grandes rasgos, el proceso implica 3 etapas principales (Makarova et al.

2015):

- Adquisión: Supone la incorporación de secuencias de ADN exógeno

(protoespaciadores) a modo de espaciadores en el array de CRISPR. En esta

etapa desempeñan un importante papel las proteínas Cas1 y Cas2, que reconocen

una secuencia corta (secuencia PAM-protospacer adjacent motif-) en el ADN

precursor del espaciador. Estos espaciadores servirán de memoria para actuar

como dianas de defensa frente a virus y/o plásmidos invasores.

- Expresión: El locus CRISPR se transcribe a partir del leader, formándose un

pre-crRNA, que es procesado por una de las proteínas Cas y madura para

producir unas moléculas llamadas crRNAs.

- Interferencia: Los crRNA, ayudados por las proteínas Cas, funcionan como

guías para reconocer y producir un corte en el DNA invasor.

En la especie E. coli existen 2 sistemas monofiléticos de CRISPR/Cas: I-E y I-F. El

subtipo I-E está formado por dos arrays CRISPR (CRISPR-1, CRISPR-2) y un set de 8

genes cas, mientras que el subtipo I-F presenta 6 genes cas flanqueados por los

CRISPR-3 y CRISPR-4. Los ensayos de regulación del sistema CRISPR/Cas I-E en E.

coli K-12 han demostrado que, en condiciones de laboratorio, éste aparece reprimido

como consecuencia de la proteína H-NS, y que es posible activarlo mediante LeuO

(Westra et al. 2010). Sin embargo, el sistema I-F parece expresarse de forma

constitutiva en condiciones óptimas de laboratorio, interfiriendo la entrada de DNA

exógeno (Almendros et al. 2012).

Justificación

65

JUSTIFICACIÓN TEMÁTICA DE LA TESIS

Como se mencionó anteriormente, la resistencia a los antibióticos se ha

convertido en una seria amenaza para la Salud Pública a nivel mundial, que trae consigo

importantes fracasos terapéuticos en medicina, contribuyendo al aumento de la

morbilidad y mortalidad de los pacientes. En 2014, coincidiendo con el año de inicio de

esta tesis, la OMS publicó el primer informe de carácter mundial sobre la situación de la

resistencia a los antibióticos (WHO, 2014). En él se destacaba, entre otras bacterias, a E.

coli resistente a cefalosporinas de 3ª generación y fluoroquinolonas, por su significativo

incremento en los últimos años y las graves consecuencias que esto conlleva a nivel

clínico.

Pero la resistencia a los antibióticos es un problema global que no se limita

exclusivamente a las bacterias causantes de procesos infecciosos, sino que afecta

también a bacterias no patógenas presentes en diversos nichos ecológicos del entorno

humano, animal y ambiental. Estas bacterias comensales representan igualmente una

amenaza, ya que constituyen un reservorio importante de genes de resistencia y

virulencia. Así, debido a la facilidad con la que los microorganismos intercambian

material genético a través de eventos de transferencia horizontal fundamentalmente

mediada por plásmidos, estos determinantes de resistencia pueden ser movilizados a

otras bacterias patógenas de la misma o, incluso, distinta especie.

Escherichia coli se considera, por su versatilidad genética y amplia distribución

en diversos nichos, un excelente indicador en estudios epidemiológicos de resistencia a

antibióticos (Guenther et al. 2011). La mayoría de estos trabajos se han focalizado en el

ámbito clínico humano, seguido del ganadero (animales de producción y alimentos

derivados), sectores en los que el uso masivo de antibióticos está muy extendido. Sin

embargo, poco se sabe aún respecto a la resistencia en hospedadores expuestos a priori

a una menor presión selectiva, como son los animales de vida libre.

Esta tesis doctoral se enmarca en el Proyecto Nacional SAF2012-35474, titulado

“Resistencia bacteriana a antimicrobianos en ambiente y en fauna salvaje. Mecanismos

de resistencia y líneas genéticas emergentes e implicaciones en salud humana”. Los

datos que de ella se derivan pretenden brindar un enfoque global del grado de

diseminación de E. coli resistente a los antibióticos (con especial énfasis en cepas

66

Justificación

resistentes a cefalosporinas de espectro extendido) en fauna salvaje. Además, en esta

tesis se profundiza en los mecanismos y determinantes genéticos involucrados en los

fenotipos resistentes de E. coli, así como en los clones circulantes y las plataformas

genéticas implicadas en el flujo de genes de resistencia entre el ecosistema salvaje,

ganadero y humano. Igualmente, se identifican reservorios naturales de cepas de E. coli

potencialmente virulentas para el hombre y se estudia la relación entre los factores de

virulencia y resistencia a los antimicrobianos.

La Figura 17 muestra el flujo de trabajo llevado a cabo en esta tesis doctoral y

refleja la interacción y coordinación de las distintas tareas de investigación

desarrolladas, con el fin último de conocer el rol que ejerce la fauna salvaje en el

mantenimiento y diseminación de genes de virulencia y resistencia a antibióticos.

Figura 17. Diagrama que muestra el flujo de trabajo desarrollado en esta tesis doctoral.

67

OBJETIVOS

68

69

Capítulos 5

Los objetivos de esta tesis son:

11.. Estudiar la diversidad genética y las bases moleculares de la resistencia

antimicrobiana en cepas comensales de E. coli de aves y mamíferos salvajes

procedentes de distintas regiones de España.

22.. Analizar distintas plataformas genéticas implicadas en la diseminación intra- e

interbacteriana de genes de resistencia a antibióticos en cepas de E. coli de diversos

orígenes.

2.1. Plásmidos portadores del gen codificante de la β-lactamasa SHV-12.

2.2. Integrones de clase 2.

33.. Estudiar la prevalencia y características genéticas de los patotipos STEC (E. coli

productor de toxina Shiga) y EPEC (E. coli enteropatógena) procendentes de fauna

salvajes.

44.. Analizar in silico los sistemas CRISPR/Cas, el plasmidoma, el resistoma y el

viruloma de 38 cepas comensales de E. coli de fauna salvaje secuenciadas por WGS.

Evaluar la existencia de mutaciones adaptativas asociadas al hospedador mediante el

estudio de la relación filogenética de cepas de E. coli de distintos orígenes en base a

los SNPs en el genoma core.

Capítulos 1 y 2 – Artículos 1, 2, 3 y 4

Capítulo 3 – Artículos 5 y 6

Capítulo 4 – Artículo 7

Capítulo 5 – Artículo 8 (en preparación)

70

71

OBJECTIVES

72

73

Capítulos 5

The main objetives of this tesis are:

11.. To study the genetic diversity and the molecular basis of antimicrobial resistance in

commensal E. coli from wild birds and mammals sampled in different regions of

Spain.

22.. To analyze distinct genetic platforms involved in the intra- and interbacterial spread

of antimicrobial resistance in E. coli strains from different origins and geographic

locations.

2.1. Plasmids carrying SHV-12 β-lactamase enconding gene.

2.2. Class 2 integrons.

33.. To determine the prevalence and genetic features of STEC (Shiga toxin-producing

E. coli) and EPEC (enteropathogenic E. coli) pathotypes identified among wildlife

hosts.

44.. To study by in silico approaches the CRISPR/Cas systems, the plasmidome, the

resistome and the virulome of 38 comensales E. coli strains using WGS data. To

evaluate the occurrence of potential adaptive mutations associated to the host by

analyzing the phylogenetic relations of E. coli from different origins based on core

genome SNPs.

Chapters 1 and 2 – Papers 1, 2, 3 and 4

Chapter 3 – Papers 5 and 6

Chapter 4 – Paper 7

Chapter 5 – Paper 8 (manuscript)

74

75

RESULTADOS

76

77

78

79

CAPÍTULO 1

Estructura poblacional y caracterización genética de la

resistencia/virulencia en cepas de E. coli procedentes de fauna salvaje

(Castilla La Mancha y Andalucía)

80

Capítulo 1

81

Tal y como se ha descrito, la resistencia a los antibióticos es un problema global

que afecta a todos los ecosistemas (humano, animal, medio ambiente), relacionados

entre sí y, por tanto, debe ser analizado desde un enfoque interdisciplinar (concepto de

One Health). Sin embargo, la mayor parte de los estudios epidemiológicos llevados a

cabo al inicio de esta tesis se centraban en el entorno humano, doméstico y ganadero.

Trabajos previos llevados a cabo por nuestro grupo alertaban sobre la emergencia de

mecanismos de resistencia de relevancia clínica en bacterias comensales de animales de

granja y alimentos derivados (Jouini et al. 2009; Gómez-Sanz et al. 2010). Los estudios

en muestras ambientales y de fauna salvaje eran aún escasos. De hecho, el primer

reporte de bacterias productoras de BLEE en fauna salvaje data de 2006 (Costa et al.

2006). En esta publicación, en la que nuestro grupo colaboró estrechamente con

investigadores portugueses, se describieron por primera vez distintas variantes de

enzimas BLEE y determinantes de resistencia a otras familias de antibióticos de

relevancia clínica en mamíferos y aves salvajes procedentes de parques naturales del

centro y norte de Portugal. Estudios posteriores han evidenciado la presencia de

bacterias resistentes incluso en animales que habitan lugares remotos sometidos a una

presión antropogénica prácticamente nula (Sjölund et al. 2008; Hernández et al. 2010).

Sin embargo, aun son escasas las investigaciones en el ecosistema natural, tan

necesarias para comprender el flujo de bacterias resistentes y de genes de resistencia

entre el entorno humano y natural, la posible existencia de bioindicadores de

contaminación ambiental de origen antropogénico o el rol de la fauna salvaje como

reservorio natural de genes o líneas genéticas bacterianas asociadas a resistencia o

virulencia.

Así, con el objetivo de aportar nuevos datos, los dos primeros capítulos de esta

tesis engloban trabajos de epidemiología molecular en aislamientos de E. coli obtenidos

de diversas especies de mamíferos y aves salvajes que habitan distintas regiones de

España. Este primer capítulo, se focaliza en el estudio de la prevalencia de resistencia

antimicrobiana, mecanismos genéticos implicados y estructura poblacional en cepas

comensales de E. coli de distintas especies de mamíferos sanos procedentes de Castilla

La Mancha y Andalucía. La recogida de las muestras fue llevada a cabo por los Dres

Jose Francisco Ruiz Fons y David González Barrio, del Instituto de Investigación en

Recursos Cinegéticos (CSIC-UCLM-JCCM) de Ciudad Real, siendo posteriormente

remitidas a la Universidad de La Rioja para su procesamiento.

82

Capítulo 1

En el primer trabajo, se aislaron y caracterizaron cepas de E. coli procedentes de

217 muestras fecales de ciervos criados en régimen semi-extensivo y pequeños

mamíferos que cohabitaban en el Parque Natural de Los Alcornocales (Cádiz). En el

segundo, se analizaron 80 aislamientos de E. coli recuperados de segmentos intestinales

con contenido fecal procedentes de jabalíes cazados en las provincias de Ciudad Real y

Toledo.

En general, en ambos trabajos destaca un bajo porcentaje de cepas resistentes a

los antimicrobianos testados (6.7% en ciervos y pequeños mamíferos; 7.5% en jabalíes),

en comparación con la alta prevalencia descrita en animales de granja, mascotas o aves

salvajes (ver capítulo 2, artículo 3). Entre las cepas de E. coli que mostraron resistencia

frente a uno o más antibióticos, aquellas portadoras de genes de resistencia a tetraciclina

[tet(A), tet(B)] fueron las predominantes, seguidas de otros determinantes genéticos que

codifican resistencia a sulfamidas (sul1, sul2, sul3) o ampicilina (blaTEM1a, blaTEM1b).

Cabe destacar, sin embargo, la detección de una cepa de E. coli multirresistente (≥ 3

familias de antibióticos) y productora de BLEE, portadora del gen blaCTX-M-1 y de un

integrón de clase 1 atípico (intI1-dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA1-aadA1-qacH-IS440-

sul3-orf1-mef(B)- IS26). Los ensayos de transferencia determinaron que el gen blaCTX-

M-1 se movilizaba en un plásmido conjugativo del grupo de incompatibilidad IncN. Esta

cepa se asignó al linaje ST224, frecuentemente asociado a fenotipos multirresistentes en

cepas de humanos y animales.

En cuanto a la estructura poblacional, la mayor parte de los aislamientos

comensales de E. coli procedentes de ciervos y conejos pertenecieron, como cabía

esperar, al grupo filogenético B1. Sin embargo, el filogrupo B2, frecuentemente

asociado a cepas ExPEC, destacó significativamente entre los E. coli comensales

aislados de jabalíes (47.5%). El análisis por PFGE de las cepas pertenecientes a este

subgrupo B2, demostró que su predominio no se debía a la expansión de uno o pocos

clones, sino que existía una amplia diversidad genética. Se identificaron clones

(ST1170/B2, ST681/B2, ST625/B2) frecuentemente asociados a patología

extraintestinal, fundamentalmente ITU, portadores de dos o más genes de virulencia.

Además, se detectó una cepa perteneciente al grupo clonal O25-ST131-subtipo fimH22,

carente de los factores de virulencia clásicos de ExPEC, pero portadora de otros

típicamente asociados a esta línea genética (usp, iutA, ompT, malX). A diferencia de lo

observado en el entorno clínico, ninguno de estos aislamientos de E. coli B2 portaba

genes de resistencia a antibióticos. Esto sugiere que los jabalíes pueden actuar como

Capítulo 1

83

reservorio de cepas potencialmente patógenas, con capacidad de adquirir determinantes

de resistencia a antibióticos por TGH en entornos sometidos a mayor presión selectiva.

En los artículos que se exponen a continuación, se detallan de manera

pormenorizada las cepas analizadas, la metodología y técnicas empleadas, los resultados

obtenidos y la relevancia y significado de los mismos desde una perspectiva global e

interdisciplinar:

ARTÍCULO 1: Alonso, C.A., González-Barrio, D., Tenorio, C., Ruiz-Fons, F.,

Torres, C. 2016. Antimicrobial resistance in faecal Escherichia coli isolates from

farmed red deer and wild small mammals. Detection of a multiresistant E. coli

producing extended-spectrum beta-lactamase. Comp. Immunol. Microbiol. Infect.

Dis. 45, 34-39.

ARTÍCULO 2: Alonso, C.A., González-Barrio, D., Ruiz-Fons, F., Ruiz-Ripa, L.,

Torres, C. 2017. High frequency of B2 phylogroup among non-clonally related

fecal Escherichia coli isolates from wild boars, including the lineage ST131. FEMS

Microbiol. Ecol. 93 (3).

84

Capítulo 1

Capítulo 1

85

ARTÍCULO 1

Capítulo 1

87

Capítulo 1

93

ARTÍCULO 2

Capítulo 1

95

101

CAPÍTULO 2

Diversidad genética y caracterización de

la resistencia en cepas de E. coli procedentes de fauna salvaje

(Pirineo aragonés y La Rioja)

Capítulo 2

103

En el Capítulo 2 se abarca la caracterización molecular de cepas de E. coli

procedentes de aves y mamíferos muestreados en Aragón y en La Rioja. Se presta total

(artículo 3) o especial atención (artículo 4) a las cepas productoras de BLEE y AmpC,

detectadas previamente por el grupo de la Dra. Carmen Simón, del Departamento de

Patología Animal e Ictiopatología de la Universidad de Zaragoza, y aportadas para su

completa caracterización en esta tesis. La determinación de las características genéticas

de estas cepas BLEE/AmpC mediante la identificación de las líneas genéticas asociadas,

el análisis fenotípico y genotípico de las corresistencias, la detección y caracterización

de integrones y el estudio del contenido y tipado plasmídico (artículo 4) fue llevado a

cabo en esta tesis.

Las aves, especialmente las migratorias, han ido adquiriendo especial relevancia

por el papel epidemiológico que ejercen en la propagación de la resistencia a los

antibióticos. La localización estratégica de la Península Ibérica entre dos continentes,

así como su clima templado, favorecen que sea lugar de paso y residencia temporal de

numerosas aves migratorias, lo que le confiere unas características privilegiadas para

llevar a cabo estudios como el que se expone a continuación (artículo 3).

Focalizándonos en el 16% de cepas E. coli BLEE o AmpC, pertenecientes a las

variantes SHV-12, CTX-M-1, CTX-M-14a y CMY-2 (una cepa hiperproductora de

AmpC por mutaciones en el promotor cromosómico), se observó un predominio del

grupo filogenético B1, seguido del D, A y B2. La única cepa perteneciente al filogrupo

B2 destacó por su pertenencia al clon epidémico ST131-fimH30, si bien portaba el gen

blaCTX-M-14a, el segundo más frecuentemente relacionado con este grupo clonal por

detrás de la variante CTX-M-15. Otras secuencias tipo asociadas a genotipos

BLEE/AmpC detectadas en nuestra colección de aves, como ST155, ST10 o ST38 son

con frecuencia identificadas en muestras clínicas. Los clones ST453/B1 (detectado en 3

cepas portadoras de blaSHV-12 procedentes de 3 especies distintas de aves) y ST744

(portador de blaCTX-M-1), en cambio, parecen estar mejor adaptados al ecosistema

ambiental. Cabe destacar que el 75% de las cepas BLEE/AmpC fueron

multirresistentes, en muchos casos en relación a la presencia de integrones de clase 1

portadores de diferentes arreglos de genes cassettes (dfrA1-aadA1; aac(6’)-Ib-catB3-

dfrA1; estX-psp-aadA2-cmlA1-aadA1). La corresistencia a tetraciclina mediada por

tet(A) o tet(B), y/o a aminoglucósidos (gentamicina y tobramicina), codificada

mayormente por aac(3)-II, también se detectó en muchos de los aislamientos. La

104

Capítulo 2

resistencia asociada a cefalosporinas y fluoroquinolonas, dos de las familias más

relevantes en medicina humana, se describió en el 87% de las cepas BLEE/AmpC. En

todos los casos, la resistencia a fluoroquinolonas involucró mutaciones en el residuo

S83L de la proteína GyrA cuando ésta fue de bajo nivel, o doble mutación en los

residuos S83L y D87N de GyrA y al menos una en ParC (S80I; S80I + E84V en un

caso) cuando la resistencia fue de alto nivel (CMI ciprofloxacino >2 μg/mL). Merece

especial mención, por su capacidad de diseminación horizontal, la detección del

determinante plasmídico qnrS1 en una cepa de E. coli procedente de una lechuza,

portadora también de doble mutación en GyrA (CMI ciprofloxacino =2 μg/mL). En

definitiva, los resultados de este estudio demuestran que las aves (especialmente

cigüeñas, milanos y buitres) actúan como importantes reservorios naturales de cepas

multirresistentes de E. coli BLEE/AmpC, y representan un claro eslabón en la

diseminación de la resistencia a antimicrobianos en la interfaz humano-medio ambiente.

Por otro lado, el segundo trabajo que conforma este capítulo incluye un total de

62 muestras fecales procedentes de muy variadas especies de mamíferos salvajes. El

porcentaje de bacterias resistentes al menos a un antibiótico fue mayor que los

observados en el Capítulo 1 (25.8%) y, dentro de este subgrupo, 5 cepas presentaron un

fenotipo multirresistente y 4 resistencia a cefalosporinas de 3ª generación (2 productoras

de BLEE, 1 productora de pAmpC y 1 hiperproductora por mutaciones en las

posiciones -42, -18, -1, +58 del promotor cromosómico de ampC). Las variantes

enzimáticas producidas por las cepas BLEE y pAmpC fueron SHV-12 (corzo), CTX-M-

14a (visón americano) y CMY-2 (erizo). De las 4 cepas resistentes a cefalosporinas de

3ª generación, 3 pertenecieron a secuencias tipo no registradas previamente en la base

de datos del MLST: ST4564 (blaCMY-2), ST4996 (hiperproductor cromosómico de

AmpC), y un nuevo ST sin número asignado por mutación puntual en el nucleótido 184

(T→A) del locus icd. La cepa de E. coli BLEE+, portadora del gen blaSHV-12, se asoció a

la secuencia tipo ST1128. El estudio del contenido plasmídico y su tipificación, así

como los ensayos de transferencia por conjugación, determinaron que el gen adquirido

blaCMY-2 era movilizado en un plásmido conjugativo de 95kb perteneciente al grupo de

incompatibilidad IncI1. Los genes blaSHV-12 y blaCTX-M-14a también fueron transferibles

por conjugación, pero no pudieron asociarse a un replicón determinado ya que en ambos

casos los transconjugantes adquirieron 2 plásmidos.

Capítulo 2

105

En cuanto a la distribución en filogrupos de la colección completa de E. coli

analizada, los resultados fueron los siguientes: filogrupo B1 (44,6%), filogrupo B2

(24,6%), filogrupo E (15,4%), filogrupo A (3,4%) y filogrupo F (3,1%). Un 7,7% de las

cepas se clasificaron como clados crípticos de Escherichia, es decir, cepas bioquímica y

fenotípicamente indistinguibles de E. coli, pero genéticamente distantes. Tres

aislamientos de heces de ratón se asignaron al clado IV y uno, perteneciente a un visón

americano y portador del gen blaCTX-M-14a, se asignó al clado V. Los clados crípticos de

Escherichia se definieron en 2009 y, aunque existen muy pocos estudios al respecto,

parecen corresponder a cepas mejor adaptadas al medio ambiente, fuera del nicho

extraintestinal (agua, suelo, sedimentos). Los animales salvajes podrían actuar como

huéspedes ocasionales por su estrecho contacto con el entorno natural. Atendiendo a la

bibliografía, esta es la primera descripción de un clado críptico de Escherichia portador

de un gen BLEE. La mayoría de las cepas crípticas de Escherichia (excepto el clado I)

se caracterizan por un bajo nivel de resistencia y virulencia, si bien el aislamiento

asignado al clado V en este estudio portaba el gen blaCTX-M-14a y los factores de

virulencia fimA, malX, aer y ompT. En definitiva, este trabajo demuestra que, si bien los

niveles de resistencia en mamíferos salvajes no son alarmantes, sí que pueden detectarse

mecanismos de relevancia clínica (BLEE, AmpC) en entornos con menor presión

antropogénica. Además, los animales salvajes pueden actuar como reservorio de nuevas

líneas genéticas (ST4564, ST4996) y cepas crípticas de Escherichia, capaces incluso de

portar genes codificantes de BLEEs.

A continuación, se recogen los trabajos publicados que constituyen el cuerpo

principal de este segundo capítulo. En ellos se expone, más detalladamente, la colección

de cepas de partida, la metodología empleada y los resultados obtenidos:

ARTÍCULO 3: Alcalá, L.*, Alonso, C.A.* (coautores), Simón, C., González-

Esteban, C., Orós, J., Rezusta, A., Ortega, C., Torres, C. 2016. Wild birds,

frequent carriers of extended-spectrum β-lactamase (ESBL) producing Escherichia

coli of CTX-M and SHV-12 types. Microb. Ecol. 72, 861-869.

ARTÍCULO 4: Alonso, C.A., Alcalá, L., Simón, C., Torres, C. 2017. Novel

sequence types of extended-spectrum and acquired AmpC beta-lactamase producing

Escherichia coli and Escherichia clade V isolated from wild mammals. FEMS

Microbiol. Ecol. 93 (8).

Corrigendum in: FEMS Microbiol. Ecol. 94, 2018.

106

Capítulo 2

Capítulo 2

107

ARTÍCULO 3

Capítulo 2

109

Capítulo 2

119

ARTÍCULO 4

Capítulo 2

121

130

Capítulo 2

Capítulo 2

131

Material suplementario al Artículo 4

Capítulo 2

133

1 2 3 4 5 6 7 8

48.5

97.0

145.5

194.0

242.5

48.5

15.0

97.0

145.5

194.0

242.5

Figura 18. Gel PFGE-S1 para determinar el número y tamaño de los plásmidos en las 3 cepas BLEE/pAmpC y sus correspondientes transconjugantes (TC). 1 y 8, MidRange I PFG Marker (New Englands Biolabas®); 2, C7389; 3, TC7389; 4, C8395; 5, TC8395; 6, C7577; 7, TC7577.

134

135

CAPÍTULO 3

Elementos genéticos involucrados en la diseminación de genes de resistencia a

antimicrobianos

137

Capítulo 3

La adquisición y diseminación de genes de resistencia a antibióticos y metales

pesados se ve favorecida por la asociación de éstos a elementos genéticos capaces de

movilizarlos intra e intercelularmente. En muchos casos, incluso, se observan

plataformas genéticas integradas en plásmidos conjugativos, constituidas por un

mosaico de elementos (IS, transposones, integrones) ligados a determinantes de

resistencia, lo que evidencia la plasticidad del genoma bacteriano y su capacidad para

adaptarse a las presiones ambientales. El capítulo 3 se centra en el estudio de distintos

elementos genéticos que median la movilización intracelular (integrones) e intercelular

(plásmidos) de distintos genes de resistencia y favorecen su diseminación entre

diferentes ecosistemas. Para ello, se seleccionaron algunas de las cepas aisladas de

animales salvajes y caracterizadas en capítulos anteriores, y se compararon con cepas de

otros orígenes (humanos, animales domésticos, animales de granja y alimentos).

El primer trabajo se focalizó en la caracterización de una colección de 23

aislamientos de E. coli portadores del gen blaSHV-12. Se estudió la diversidad clonal y

plasmídica en cepas productoras de esta β-lactamasa en distinos ecosistemas, con el fin

de indagar en los factores genéticos que contribuyen a su selección, persistencia y

dinamismo. La razón que motivó el desarrollo de este trabajo experimental fue triple: a)

la detección de una elevada tasa de E. coli portador de blaSHV-12 en aves salvajes; b) la

significativa prevalencia en nuestro país de esta variante de BLEE tanto en cepas

clínicas como en aislamientos derivados de animales de granja y alimentos; c) la

ausencia de estudios epidemiológicos comparativos que aporten datos sobre las

características genéticas que intervienen en la selección positiva de estas BLEE. El

estudio se llevó a cabo durante una estancia internacional en el Institut für

Nutztiergenetik Friedrich-Loeffler de Alemania, bajo la dirección del Dr. Stefan

Schwarz.

El tipado molecular de las 23 cepas portadoras de blaSHV-12 analizadas permitió

diferenciar 13 clones, siendo los predominantes ST23/A, ST57/D, ST453/B1, ST117/D

y ST405/D. Algunos aislamientos, procedentes de distintos orígenes, presentaron las

mismas características: ST23/A (humano, perro, aves de corral), ST117/D (carne de

pollo, ave de corral) y ST57/D (ave salvaje, carne de pollo). Las cepas asociadas al clon

ST57/D mostraron, además, un perfil de bandas XbaI-PFGE estrechamente relacionado.

En todos los casos, el gen blaSHV-12 fue transferible por conjugación o

transformación a cepas receptoras carentes de plásmidos (E. coli J53 y cepa electro-

138

Capítulo 3

competente TOP10). Se observó, que blaSHV-12 se localizaba en plásmidos de entre 30 y

120 kb pertenecientes a los grupos de incompatibilidad IncI1 (n=17), IncK (n=3) e IncF

(n=1). Dos de ellos no pudieron ser tipados por PBRT pero, en uno de los casos, la

disposición de la secuencia parcial del plásmido permitió clasificarlo como IncX3 a

través de su análisis posterior en el servidor PlasmidFinder. Importante destacar, por su

relevancia epidemiológica, que el replicón de 45 kb IncX3 portaba tanto blaSHV-12 como

el gen PMQR qnrS1, que confiere resistencia a fluoroquinolonas.

Una de las cepas aisladas de carne de pollo se asignó al clon epidémico

ST131/B2 y portaba 2 genes codificantes de BLEE (blaSHV-12 y blaCTX-M-1). Sin

embargo, cada uno se localizó en un replicón diferente (blaSHV-12 en un plásmido IncK

de 75 kb y blaCTX-M-1 en un plásmido IncF de 100 kb).

Cabe reseñar, que en el 74% de los casos la movilización del gen blaSHV-12

estuvo mediada por plásmidos IncI1, los cuales se subtiparon por pMLST. Así, se

obtuvieron 2 secuencias tipo nuevas (pST214 y pST215) asociadas a plásmidos IncI1

presentes en cepas de ave salvaje y humano, respectivamente, que se incorporaron a las

bases de datos públicas. Los subtipos plasmídicos IncI1-pST26 e IncI1-pST3 fueron los

más prevalentes. Es importante destacar, que el 76% de los plásmidos IncI1 portadores

de blaSHV-12, co-movilizaban un integrón de clase 1 asociado a sul3 que contenía 6 genes

cassettes en su región variable (estX-psp-aadA1-cmlA1-aadA1-qacI). En la mayoría de

los casos, también el gen tet(A) se co-transferia por conjugación. La secuenciación

completa por WGS de uno de estos plásmidos conjugativos IncI1 (número acceso:

LT669764), demostró la existencia de la plataforma genética Tn21-blaSHV-12-∆Tn1721

en el módulo de adaptación del plásmido, lo que explica la co-transferencia del integrón

de clase 1 atípico (localizado en Tn21) y el gen tet(A) (integrado en ∆Tn1721). La

presencia de este complejo genético de resistencia parece desempeñar un papel

importante en la diseminación del gen blaSHV-12 en distintos entornos, ya que promueve

su selección incluso en ausencia de la presión selectiva ejercida por antibióticos β-

lactámicos.

Por último, otro hallazgo relevante derivado de este estudio es la descripción de

un nuevo entorno genético de blaSHV-12. Los genes que, de forma muy conservada,

flanquean el gen blaSHV-12 son IS26 (aguas arriba) y deoR (aguas abajo). En una de las

cepas, se detectó la inserción de un segmento de ADN de 445 pb que truncaba el gen

deoR y era precedido por otro elemento IS26. Este nuevo entorno (IS26-blaSHV-12-

139

Capítulo 3

∆deoR-IS26), que registramos en la base de datos del EMBL (número de acceso:

LT621755), daba lugar a un transposón compuesto que podría llegar a facilitar la

movilización en bloque del gen codificante de la β-lactamasa SHV-12.

El segundo trabajo que compone este capítulo 3, se centra en el estudio de la

organización genética, localización y habilidad conjugativa de los integrones de clase 2

en cepas de E. coli de distintas fuentes (animales salvajes, mascotas, aves de corral,

humanos y alimentos) y orígenes geográficos (España, México, Túnez) (artículo 6). A

continuación, en el anexo, se expone brevemente el primer experimento llevado a cabo

para la puesta a punto de ensayos de escisión de cassettes génicos en integrones de clase

2, mediados por la integrasa IntI1, en cepas salvajes de E. coli. Hasta el momento, estos

ensayos funcionales se han realizado con plásmidos recombinantes que contienen el gen

cassette cuya escisión quiere ser evaluada y que se introducen por transformación en

cepas de laboratorio. Sin embargo, no hay datos de lo que ocurre en cepas salvajes.

Gran parte del desarrollo experimental se llevó a cabo en el Dpto. de Microbiología e

Inmunología de la Universidad de Buenos Aires (Argentina), gracias a la realización de

una segunda estancia internacional, bajo la supervisión de la Dra. D. Centrón.

En el estudio de cartografía genética se incluyeron 35 cepas de E. coli. Se

observó que la arquitectura y localización de los integrones de clase 2 estaba altamente

conservada con independencia del origen de la cepa (humano, animal, alimento). A

pesar de que sólo detectamos 3 arreglos de genes cassettes en la región variable (dfrA1-

sat2-aadA1, estX-sat2-aadA1 y sat2-aadA1), probablemente en relación con la unánime

presencia del codón STOP prematuro en la posición 179 del gen intI2, el 30% de los

integrones presentaron un elemento IS integrado en diferentes localizaciones. Cuatro de

estos integrones, descritos por primera vez en este trabajo, fueron completamente

secuenciados (~13000 pb) y registrados en las bases de datos EMBL e INTEGRALL

(números de acceso LT898484, LT898485, LT898486 y LT898487). Las IS que

albergaban pertenecían a diferentes familias (IS3, IS4, IS5 y IS21) y, en todos los casos,

mantenían su estructura completa intacta, incluyendo sus respectivas repeticiones

invertidas (IRR, IRL). Especial mención merece la detección de un elemento IS10

(familia IS4) inserto en el sitio attI2, entre los promotores Pc2B y Pc2C, de un integrón

de clase 2 aislado de una cepa procedente de carne de pollo en España. La secuencia

completa del integrón demostró ser idéntica a la de otro descrito recientemente en una

cepa de E. coli, perteneciente a la misma secuencia tipo (ST57), aislada de heces de

140

Capítulo 3

pollo en Portugal. La inserción de este elemento interrumpe el sitio attI2,

probablemente afectando a la expresión de los genes cassettes, y se reconstruye justo

por detrás de la secuencia diana de 9 pb que se duplica tras la integración de IS10 (5’-

CGGTAAGCA-3’). Esta corta secuencia muestra una alta identidad con la diana

consenso descrita para IS10, lo que sugiere que la integración de este elemento en el

sitio attI2 puede deberse a un evento de transposición sitio-específico.

En cuanto a su localización, el 80% de los integrones de clase 2 en E. coli

demostraron hallarse insertos en el sitio attTn7 localizado en el extremo 3’ del gen

cromosómico glmS. Un 29% de las cepas portadoras del arreglo clásico dfrA1-sat2-

aadA1 fueron transferibles por conjugación, lo que sugería su localización en plásmidos

u otros elementos conjugativos. Los transconjugantes obtenidos fueron resistentes a

trimetoprim y estreptomicina, en relación con la adquisición del integrón de clase 2, y

sólo en algunos casos mostraron corresistencia a sulfamidas, tetraciclina y/o

cloranfenicol.

Por último, el primer ensayo de escisión in vivo llevado a cabo en una cepa

salvaje de E. coli aislada de carne de pollo, sugiere que la integrasa IntI1 es capaz de

escindir eficazmente el cassette aadA1 localizado en la región variable del integrón de

clase 2. Estos resultados preliminares han de ser evaluados en un mayor número de

cepas.

A continuación, se presentan los 2 artículos que recogen de forma más extendida

los resultados arriba mencionados y algunos no incluidos en este breve resumen. El

ensayo funcional de escisión de cassettes se explica en un anexo, al final de este

capítulo.

ARTÍCULO 5: Alonso, C.A., Michael, G.B., Li, J., Somalo, S., Simón, C., Wang,

Y., Kaspar, H., Kadlec, K., Torres, C., Schwarz, S. 2017. Analysis of blaSHV-12-

carrying Escherichia coli clones and plasmids from human, animal and food

sources. J. Antimicrob. Chemother. 72, 1589-1596.

ARTÍCULO 6: Alonso, C.A., Cortés-Cortés, G., Maamar, E., Massó, M., Rocha-

Gracia, R.C., Torres, C., Centrón, D., Quiroga, M.P. 2018. Molecular diversity

and conjugal transferability of class 2 integrons among Escherichia coli isolates

from food, animal and human sources. Int. J. Antimicrob. Agents. 51, 905-911.

141

Capítulo 3

ARTÍCULO 5

143

Capítulo 3

151

Capítulo 3

Material suplementario al Artículo 5

153

Capítulo 3

Figu

ra 1

9. D

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154

Capítulo 3

Figu

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155

Capítulo 3

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156

Capítulo 3

Figu

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Capítulo 3

157

Figura 23. Representación esquemática del nuevo entorno genético del gen blaSHV-12,presente en la cepa de E. coli 101689 (número de acceso LT621755). El fragmento de ADN insertado, que trunca el gen putativo deoR, da lugar a una estructura de transposón compuesto. Los dos elementos IS26 se muestran con bordes rectangulares y las líneas verticales representan las repeticiones invertidas (IRR, IRL).

158

Capítulo 3

Capítulo 3

159

ARTÍCULO 6

Capítulo 3

161

Capítulo 3

169

Material suplementario al Artículo 6

Capítulo 3

171

Tabla 6. Características de las cepas de E. coli portadoras de integrones de clase 2 incluídas en este studio (n=35).

Nº Cepa

Origen País Año Fenotipo de resistencia Estructura integrón clase 2a

Transferencia por conjugación

C1949 Carne de pollo España 2009 AMP, CTX, CAZ, NAL, STR, TMP, TET H – C4746 Carne de pollo España 2011 AMP, CTX, CAZ, CIP, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A + C4748 Carne de pollo España 2011 AMP, CTX, CAZ, CIP, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET J – Pn425 Carne de pollo España 2008 AMP, AMC, STR, SUL, SXT, TMP, TET Ñ ND Pn424 Carne de pollo España 2008 AMP, AMC, CAZ, FOXI, CIP, NAL, STR, SUL, SXT,

TMP, TET E –

Pn430 Carne de pollo España 2008 AMP, AMC, CTXI, FOXI, CIPI, NAL, STR, TMP N ND Pn432 Carne de pollo España 2008 AMP, AMC, CAZ, FOXI, STR, SUL, SXT, TMP, TET N ND Pn436 Carne de pollo España 2008 STR, SUL, SXT, TMP A + Co1 Carne de pollo España 1998 AMP, CIP, NAL, STR, CHL, SUL, SXT, TMP, TET A – Co6 Carne de pollo España 1998 AMP, NAL, STR, GEN, TOB, SUL, SXT, TMP B – Co7 Carne de pollo España 1998 CIP, NAL, STR, GEN, SUL, SXT, TMP, TET A – Co17 Carne de pollo España 1998 CIP, NAL, STR, CHL, SUL, SXT, TMP, TET Ñ ND Co18 Carne de pollo España 1998 AMP, STR, GEN, SUL, SXT, TMP, TET A – Co19 Carne de pollo España 1998 AMP, NAL, STR, CHL, SUL, SXT, TMP, TET A – C3309 Carne de cerdo México 2010 AMP, AMC, CTX, CAZ, FOX, CIP, NAL, STR, CHL,

SUL, SXT, TMP, TET I +

C8461 Gallina Túnez 2014 AMP, CTX, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET C + C6901 Gallina Túnez 2013 AMP, CTX, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A + C6924 Gallina Túnez 2013 AMP, CTX, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A – C6932 Gallina Túnez 2013 AMP, CTX, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A – C6935 Gallina Túnez 2013 AMP, CTX, CIP, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A – C8432 Gallina Túnez 2014 AMP, CTX, CIPI, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET C + C2575 Perro España 2009 AMP, CTX, CAZ, CIP, NAL, STR, SUL, SXT, TMP, TET A + C2583 Perro España 2009 AMP, CTX, CAZ, CIP, NAL, STR, GEN, SUL, SXT, TMP,

TET M –

C7204 Perro México 2012 AMP, AMC, CTX, FOX, CIP, NAL, STR, GEN, AMK, TOB, SUL, SXT, TMP, TET

I –

C7210 Tortuga México 2012 AMP, CTX, CIP, NAL, STR, GEN, CHL, SUL, SXT, TMP, TET

G –

C7218 Tortuga México 2012 AMP, CTX, CAZ, FOX, STR, CHL, TOB, SUL, SXT, TMP, TET

D +

C7577 Ciervo España 2014 AMP, CTX, CAZ, NAL, STR, TMP, TET F +

C7373 Gineta España 2014 STR, TMP A –

C7377 Cigüeña España 2014 AMP, CAZ, CIP, NAL, STR, CHL, SUL, SXT, TMP, TET K –

C6477 Gaviota España 2013 AMP, AMC, CTX, FOX, CIP, NAL, TET A –

C1550 Humano (heces) México 2007 AMP, CTX, CAZ, FOX, CIP, NAL, STRI, SUL, SXT, TMP A – Pn205 Humano (heces) España 2007 AMP, STR, CHL, SUL, SXT, TMP A – Pn253 Humano (heces) España 2007 AMP, STR, SUL, SXT, TMP, TET L – Pn288 Humano (sangre) España 2007 AMP, STR, SUL, SXT, TMP A – Pn110 Humano (sangre) España 2007 AMP, STRI, SUL, SXT, TMP, TET A –

AMP, ampicilina; CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; NAL, ácido nalidíxico; STR, estreptomicina; TMP, trimetoprim; TET, tetraciclina; CIP, ciprofloxacino; SUL, sulfonamidas; SXT, trimetoprim/sulfametoxazol; AMC, amoxicilina/ácido clavulánico; FOX, cefoxitina; CHL, cloranfenicol; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; AMK, amikacina; ND, no determinado. a Estas estructuras se corresponden con las representadas en la Fig. 2. del artículo 6. I Resistencia intermedia.

172

Capítulo 3

Capítulo 3

173

Anexo: Capítulo 3

Capítulo 3

175

ENSAYO DE ESCISIÓN DE CASSETTES DEL INTEGRÓN DE CLASE 2,

MEDIADO POR intI1.

Se llevó a cabo un ensayo de escisión in vivo de cassettes génicos del integrón de

clase 2, mediado por la integrasa de clase 1 (intI1) en una cepa de E. coli salvaje de

nuestra colección de la UR (Pn436). Esta cepa cumplía con los siguientes requisitos:

Presentaba un integrón de clase 2 con la estructura clásica en la región variable

(carecía de otras integrasas de integrón).

Era sensible a ampicilina (antibiótico empleado en la selección de los

transformantes).

Este primer ensayo sólo muestra los resultados preliminares obtenidos. El

objetivo fue poner a punto el procedimiento para, en un futuro próximo, comparar la

frecuencia y afinidad de escisión/inserción de los cassettes del integrón de clase 2 por

integrasas funcionales codificadas por los genes intI1 (integrasa de clase 1) e intI2

carente del codón de parada prematuro.

Para el desarrollo de este primer ensayo se empleó un plásmido recombinante

denominado pMI1-1, diseñado por el grupo de la Dra. Daniela Centrón (Quiroga, 2011).

El clon pMI1-1, además del gen de resistencia a ampicilina, portaba el gen de la

integrasa de clase 1 (intI1) y el sitio de recombinación attI. A continuación, se explica el

procedimiento llevado a cabo (Figura 25):

DÍA 1: Se cultivó la cepa salvaje conteniendo el integrón de clase 2 (E. coli Pn436) en 5

mL de caldo LB (Luria-Bertani). Se incubó a 37ºC en agitación durante 18 hs.

DÍA 2: Se prepararon las células competentes a partir de una alícuota del cultivo en LB.

Se electroporaron 50 μL del cultivo bacteriano con 2 μL de extracción plasmídica del

clon pMI1-1 (plásmido recombinante AMPR que contiene el gen intI1 y sitio attI). Se

plaqueó todo el contenido en una placa de LB Agar suplementada con ampicilina 100

μg/mL. Se incubó a 37ºC durante 18 hs.

DÍA 3: Se inoculó una colonia transformante en 5 mL de caldo LB suplementado con

amplicilina 100 μg/mL. Se incubó a 37ºC en agitación durante 18 hs.

DÍA 4: Se tomó una alícuota del cultivo (10%, 0.5 mL) para llevar a cabo del ensayo de

escisión propiamente dicho en 5 mL finales de caldo LB suplementado con ampicilina

176

Capítulo 3

Figura 24. Esquema de las regiones amplificadas con los distintos sets de cebadores. La longitud esperada (en pares de bases) para cada amplicón, se muestra detrás de la región acotada por cada par de cebadores.

100 μg/mL. Se incubó 3hs a 37ºC con agitación (hasta alcanzar una densidad óptica de

0.5). A continuación, para inducir la expresión del gen de la integrasa intI1, se adicionó

0.5 mM de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). El cultivo líquido se mantuvo

en incubación a 37ºC con agitación durante 18 hs.

DÍA 5: Se realizaron diluciones seriadas y se sembraron 5 μL en LB Agar suplementado

con ampicilina 100 μg/mL. Se incubaron las placas 18 hs a 37ºC.

DÍA 6: Se seleccionaron 30 colonias individuales y se extrajo su ADN por hervido

(100ºC, 8 minutos). Se realizaron amplificaciones por PCR de la región variable del

integrón de clase 2 (Figura 24) para confirmar la existencia/ausencia de escisión de

alguno de los genes cassettes empleando los sets de cebadores de la Tabla 7.

Tabla 7. Cebadores usados en el ensayo de escisión realizado en la Universidad de Buenos Aires.

DÍA 7: Se llevó a cabo la electroforesis en gel de agarosa con los amplicones obtenidos

en las PCR. En base a los resultados se calculó la frecuencia de escisión de cassettes.

Los productos de amplificación positivos se confirmaron por secuenciación. En nuestro

caso, la secuenciación se llevó a cabo en la Universidad de la Rioja, amplificando

nuevamente la región variable de algunas cepas seleccionadas aleatoriamente tras el

ensayo de escisión con los cebadores detallados en la Tabla 8.

Tabla 8. Cebadores usados en la Universidad de la Rioja para amplificar y secuenciar la región variable del integrón de clase 2 de las cepas obtenidas tras el ensayo de escisión.

Cebador Sitio Diana Secuencia (5'-3') Referencia Tamaño amplicón esperado para integrón de clase 2 clásico (In2-7)

125'CS intI2 TTTTTGTCGCATATCCGTG Ramírez et al. 2010satR sat2 TCATCCTGTGCTCCCGAG Ramírez et al. 2005satF sat2 TGAGCAGGTGGCGGAAAC Ramírez et al. 2005123'CS ybfB AGACTCGTAGCCCACTCGGT Ramírez et al. 2005

1467 pb

2436 pb

Cebador Sitio Diana Secuencia (5'-3') Referencia Tamaño amplicón esperado para integrón de clase 2 clásico (In2-7)

RVIntI2-F attI2 CGGGATCCCGGACGGCATGCACGATT White et al. 2001RVIntI2-R orfX GATGCCATCGCAAGTACGAG White et al. 2001

2213 pb

Capítulo 3

177

Figura 25. Esquema general del procedimiento seguido en el ensayo de escisión in vivo de cassettes del integrón de clase 2, mediado por la integrasa de clase 1.

Resultados preliminares:

Detectamos que la integrasa de clase 1 escinde el cassette aadA1 localizado en la

tercera posición de la región variable de los integrones de clase 2 con una muy alta

frecuencia (93.3%). La Figura 26.b., muestra la obtención de fragmentos de ~ 1647 pb

en 28 de las 30 colonias sometidas al ensayo de escisión, empleando la pareja de

cebadores SatF/123’CS, lo que es compatible con la escisión del gen cassette aadA1.

Figura 26. Geles de agarosa que muestran el resultado de la región amplificada con los cebadores 125’CS/SatR (a) y SatF/123’CS (b) en las colonias obtenidas tras el ensayo de escisión. Las calles numeradas del 1 al 30 muestran el resultado de la amplificación en las colonias transformadas y sometidas al ensayo de escisión, CN indica control negativo (sin ADN), λ el marcador de peso molecular y Pn436 el resultado de la amplificación en la cepa sin transformar con el plásmido pMI1-1.

178

Capítulo 3

En el gel de agarosa de la Figura 27, se pueden observar las bandas obtenidas

tras la amplificación de 5 de estas 30 colonias (Pn436-1, Pn436-2, Pn436-4, Pn436-5 y

Pn436-13; correspondientes a las calles 1, 2, 4, 5, y 13 de la Figura 26) con los

cebadores RVIntI2-F/RVIntI2-R, lo que sostiene el fenómeno de escisión en todas ellas

excepto Pn436-4 y Pn436-13.

Para confirmar estos hechos y analizar los sitios de corte de la integrasa de clase

1, se secuenciaron los amplicones de las 2 cepas que mostraron fragmentos compatibles

con el tamaño esperado para la RV del integrón de clase 2 clásico (dfrA1-sat2-aadA1;

Pn436-4 y Pn436-13) y algunas de las que presentaron bandas de menor tamaño

(Pn436-1, Pn436-2 y Pn436-5). La Figura 28 recoge las secuencias nucleotídicas

obtenidas con los cebadores RVIntI2-F/RVIntI2-R, donde se confirma la presencia (a) y

ausencia (b) del cassette aadA1. En el lado 5’ de la escisión, la integrasa de clase 1

realiza un corte entre los nucleótidos G y T de la secuencia G’TTAAAC, localizada en

la unión del sitio attC de sat2 con aadA1. En el lado 3’ de la escisión, IntI1 realiza el

corte en la unión del sitio attC de aadA1 y orfX, entre las bases G y T de la secuencia

G’TTAGAG. Ambos sitios de recombinación coinciden o difieren en una sola base con

la secuencia consenso conservada GTTRRRY (siendo “R” una purina e “Y” una

pirimidina) descrita en la mayoría de attCs (Hall et al. 1991). En la Figura 29 se

representa la estructura secundaria en tallo-bucle de los dos sitios attC, constituidos a

partir del plegamiento de la hebra inferior o complementaria (3’- 5’), involucrados en la

escisión del cassette. aadA1 del integrón de clase 2. La hebra inferior o complementaria

2213 pb

~ 1400 pb

Figura 27. Gel de agarosa que muestra los amplicones obtenidos tras someter a PCR con los cebadores RVIntI2-F/RVIntI2-R algunas de las colonias obtenidas tras los ensayos de escisión (Pn436-13, Pn436-1, Pn436-2, Pn436-4 y Pn436-5). En las calles 6 y 7 se observan las bandas del tamaño esperado en ausencia de escisión (cepa Pn436, sin transformar). En la calle 8 el control negativo (sin ADN).

Capítulo 3

179

Figura 28. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los únicos 2 fragmentos de diferente tamaño observados tras la PCR RVIntI2-F/RVIntI2-R realizada a las colonias sometidas al ensayo de escisión. A) Secuencia nucleotídica de la región variable del integrón de clase 2 presente en la colonia Pn436-4 (no se observan eventos de escisión); B) Secuencia nucleotídica de la región variable del integrón de clase 2 presente en la colonia Pn436-5 (se observa la ausencia del gen cassette aadA1). En negrita y subrayado se muestra la secuencia resultante tras la recombinación attC x attC.

180

Capítulo 3

Figu

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.

Capítulo 3

181

de los sitios attCs recombina con una frecuencia 103 veces superior que la hebra molde

(Bouvier et al. 2005). Así, en la Figura 29 se señala el punto de corte de la integrasa

IntI1 entre la C y la A del sitio R1 o sitio core invertido de ambos attCs. Igualmente se

esquematiza el potencial mecanismo de escisión del cassette aadA1, de acuerdo a la

propuesta de Macdonald et al. 2006.

En este primer ensayo, en el que se analizó la frecuencia de escisión de cassettes

mediada por IntI1 en 30 colonias transformadas con el plásmido recombinante pMI1-1,

sólo se observaron dos arreglos genéticos en la región variable del integrón de clase 2:

dfrA1-sat2-aadA1 (2 colonias) y dfrA1-sat2 (28 colonias). Al igual que estudios previos

realizados en cepas de laboratorio en las que se introdujeron plásmidos recombinantes

portadores del gen de la integrasa 1 y de distintos arreglos conteniendo los genes

cassettes dfrA1, sat2 y aadA1 cuya deleción se deseaba evaluar (Hansson et al. 2002),

nuestro ensayo sobre una cepa salvaje de E. coli portadora natural de un integrón de

clase 2 también muestra una clara predominanacia de la escisión, mediada por la

integrasa de clase 1, del gen cassette aadA1 (en comparación con sat2 y dfrA1). Sin

embargo, en nuestro ensayo, la frecuencia de escisión fue superior a la observada en

cepas de laboratorio (93.3% vs 73%). La ausencia de escisión de los genes cassettes

dfrA1 y sat2 observada en el presente estudio refleja la baja afinidad de la integrasa de

clase 1 por estos genes cassette del integrón de clase 2, pero no debe ser considerada en

términos absolutos. Son necesarios futuros ensayos que permitan el análisis de un

mayor número de colonias para determinar con exactitud la frecuencia de escisión de

estos cassettes localizados en la primera y segunda posición de la región variable de los

integrones de clase 2. Algunos estudios previos llevados a cabo en cepas de laboratorio

muestran que la integrasa de clase 1 es capaz de mediar la escisión de dfrA1 y sat2 con

frecuencias del ~1% y 5-13%, respectivamente (Hansson et al. 2002).

182

183

CAPÍTULO 4

Fauna salvaje como potencial reservorio

de patotipos STEC y EPEC

185

Capítulo 4

E. coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente a nivel

mundial capaz de ocasionar en los seres humanos desde una diarrea leve a colitis

hemorrágica, que puede progresar a síndrome urémico hemolítico acompañado de

anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia y fallo renal agudo. Este cuadro

clínico hace que las cepas pertenecientes a este patotipo también se conozcan como E.

coli enterohemorrágicas (EHEC). La mayor parte de la información disponible sobre

STEC corresponde al serotipo O157:H7, gracias a sus características bioquímicas

diferenciales, pero se han descrito más de 400 serotipos causantes de infecciones en

humanos. Los rumiantes domésticos, fundamentalmente ganado bovino, ovino y

caprino, son considerados los principales reservorios de este patógeno. Sin embargo,

también se han publicado brotes y casos esporádicos asociados al consumo de carne de

ciervo, o vegetales y frutas contaminadas con materia fecal de animales silvestres.

E. coli enteropatógena (EPEC) se asocia a brotes o casos aislados de diarrea, y

afecta principalmente a niños de entre 6 meses y 2 años. La adherencia entre la bacteria

y las células del epitelio intestinal, principal factor de patogenicidad de EPEC, requiere

de la síntesis de una proteína de membrana externa llamada intimina (codificada por el

gen eae). Las cepas EPEC se clasifican en típicas (tEPEC) o atípicas (aEPEC) en

función de sí, además de la intimina, presentan o carecen de pili BFP (bundle-forming

pilus). Los humanos se consideran el principal reservorio de tEPEC, mientras que las

aEPEC se han aislado tanto de humanos como de una amplia variedad de animales.

La dinámica de STEC y EPEC, en su relación reservorio-medio ambiente, no

está totalmente dilucidada. Por ello, en este capítulo se aborda el rol de los animales

silvestres como potenciales reservorios de estos patotipos de E. coli y se analiza el

serotipo, marcadores de virulencia, diversidad genética y fenotipo/genotipo de

resistencia asociado a estas cepas.

En este estudio, realizado en colaboración con el grupo del Prof. Dr. Jorge

Blanco del Laboratorio de Referencia de E. coli (LREC, Lugo), se incluyeron 326

aislamientos de E. coli, procedentes de muy diversas especies de mamíferos y aves

salvajes. El 4.3% (n=13) y 3.3% (n=10) de los animales portaron cepas STEC y EPEC,

respectivamente. Concretamente, estos patotipos se detectaron en 12 ciervos, 3

muflones, 6 jabalíes y 2 aves.

186

Capítulo 4

Entre las cepas STEC aisladas de fauna salvaje, 4 portaron los genes stx1 y stx2,

mientras que en las 9 restantes sólo se identificó el gen stx2. El subtipo de toxina más

prevalente fue stx2b. Entre los determinantes de virulencia asociados a la producción de

toxina(s) Shiga, eae (variante γ1) se detectó en una sola cepa procedente de un ciervo.

El gen codificante de la citotoxina SubAB, con predominio de la variante cromosómica

SubAB2, se identificó en 11 de las 13 STEC. Cabe destacar también la detección de

hasta 9 seropatotipos asociados a síndrome urémico hemolítico (seropatotipos B -

O145:[H28]- y C -O22:H8, O128:[H2]-) y diarrea (seropatotipo D -O110:H28,

O146:H21, O146:[H28], ONT:H8-) en humanos. Las cepas STEC identificadas en este

estudio mostraron una significativa heterogeneidad genética, mayor asociación al

filogrupo B1 y una alta sensibilidad a los antimicrobianos.

Entre las cepas EPEC destacó la gran diversidad de variantes de intimina

detectadas (β1, β2, γ1, ε1, ζ1, ι1-A, κ). Además, se identificó una cepa tEPEC, muy

poco común en animales, con un serotipo y perfil de virulencia (O49:[H10] eae-κ)

previamente descrito en cepas diarreogénicas aisladas de pacientes en el Hospital Lucus

Augusti (Lugo, Galicia).

Estos y otros resultados, así como su significado a nivel epidemiológico y sus

potenciales implicaciones en salud humana, se describen y discuten en el artículo que se

expone a continuación:

ARTÍCULO 7: Alonso, C.A., Mora, A., Díaz, D., Blanco, M., González-Barrio,

D., Ruiz-Fons, F., Simón, C., Blanco, J., Torres, C. Occurrence and

characterization of stx and/or eae-positive Escherichia coli isolated from wildlife,

including a typical EPEC strain from a wild boar. Vet. Microbiol. 207, 69-73.

187

Capítulo 4

ARTÍCULO 7

189

Capítulo 4

195

Capítulo 4

Material suplementario al Artículo 7

197

Capítulo 4

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Capítulo 4

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199

Capítulo 4

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200

201

CAPÍTULO 5

Estudio de cepas comensales de E. coli de

fauna salvaje desde un abordaje genómico

203

Capítulo 5

El rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación completa de genomas

(WGS) ha revolucionado en la última década los métodos de análisis genéticos. Entre

otras cosas, ha permitido el análisis computacional del genoma en su conjunto, en lugar

de analizar un gen o conjunto de genes cada vez. Gracias a una colaboración con el

grupo liderado por el Dr. Fernando de la Cruz del Instituto de Biomedicina y

Biotecnología de Cantabria (IBBTEC) y la Dra. María de Toro de la Plataforma de

Genómica y Bioinformática del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja

(CIBIR), tuvimos la oportunidad de secuenciar y analizar el genoma de 38 cepas

comensales de E. coli de nuestra colección de fauna salvaje. La selección de las cepas

fue aleatoria ya que nuestro principal objetivo fue arrojar más luz sobre la evolución y

adaptación del genoma accesorio y genoma core en el nicho intestinal de animales

salvajes. ¿Cuál es la composición y distribución real del plasmidoma de estas bacterias?

¿Cuál es el entorno genético y la localización de los determinantes de resistencia y

virulencia? ¿Se observan diferentes patrones en cuanto a la distribución de genes o de

sistemas inmunes bacterianos (CRISPR/Cas) en función del filogrupo? ¿Qué secuencias

reconocen estos sistemas CRISPR/Cas? ¿Existe una circulación de elementos genéticos

movilizables entre poblaciones bacterianas de distintos ecosistemas? El proceso de

adaptación al hospedador, ¿deja una huella genética en el genoma core bacteriano o, por

el contrario, la ausencia de mutaciones significativas refleja un flujo bacteriano continuo

entre el ecosistema humano y ambiental?

Para abordar éstas y otras cuestiones se secuenciaron en paralelo las librerías

generadas a partir de 38 cepas de E. coli en una plataforma Illumina HiSeq 2500,

obteniéndose lecturas pareadas de 100 pb. Después del filtrado por calidad y la limpieza

de adaptadores, las lecturas se incorporaron al programa PLACNETw. Tras curado

manual, PLACNETw facilitó la reconstrucción del genoma bacteriano y la

diferenciación de los diversos componentes (plásmidos, fagos extracromosómicos,

cromosoma) en base a su cobertura, ensamblado de lecturas en contigs, relación de los

contigs entre sí (scaffolding) y similitud con genomas de referencia. Posteriormente, las

secuencias de los distintos componentes se analizaron in silico utilizando las diversas

herramientas bioinformáticas que se detallan en el próximo manuscrito. También se

construyó un árbol generado a partir de los SNPs presentes en las regiones codificantes

del genoma core bacteriano. En el árbol se incluyeron las cepas de nuestra colección, así

como otras de diversos orígenes descargadas de la base de datos del NCBI.

204

Capítulo 5

Los sistemas CRISPR/Cas I-E y I-F, considerados un mecanismo bacteriano de

inmunidad adquirida que degrada secuencias de ADN invasivas, se encontraron

presentes en el 73.4% y 10.5% de las cepas, respectivamente. Los sistemas

CRISPR/Cas I-F, cuya funcionalidad ha sido demostrada, se hallaron en cepas del

filogrupo B2 y clado V y contenían proto-espaciadores con una alta homología (≥97%)

a secuencias plasmídicas e IS. Cabe destacar que, de las 5 secuencias de origen

plasmídico identificadas, 2 habían sido recientemente descritas en cepas de E. coli de

origen clínico y su presencia se relacionó antagónicamente con fenotipos

multirresistentes. Los sistemas CRISPR/Cas I-E mostraban una distribución más

heterogénea, estando presentes en cepas de los filogrupos A, B1, B2 y D, y se asociaron

principalmente a proto-espaciadores fágicos. Tal y como se observó en la colección

ECOR, la localización y organización de los proto-espaciadores en las regiones

CRISPR 1 y 2 se mantenía bastante conservada, detectándose clusters compartidos por

cepas pertenecientes a distintos filogrupos y STs. El análisis filogenético del set de

genes cas-E y cas-F demostró una mayor prevalencia del subtipo E1 (sistemas

CRISPR/Cas I-E) en nuestra colección de cepas y, por homología de secuencia, sugirió

la existencia de parentesco entre el sistema CRISPR/Cas I-F del clado V y el presente

en la especie Escherichia marmotae, recientemente descrita.

En cuanto a composición plasmídica, el 28.9% de las cepas albergaba replicones

de un tamaño inferior a 8.1 kb, frecuentemente indetectables mediante técnicas

convencionales como el S1-PFGE, que pudieron ser completamente secuenciados y

circularizados. Se detectó una gran diversidad filogenética, identificándose diferentes

combinaciones de relaxasas (MOBQ, MOBP5, MOBV) y replicasas, si bien varios

plásmidos sólo codificaban las proteínas necesarias para asegurar su propia

proliferación. Aunque algunos eran plásmidos colicinogénicos (E1, E8, N), la mayoría

presentaban ORFs de función desconocida. Cabe destacar que 5 de estos plásmidos

habían sido previamente descritos en enterobacterias de origen humano y/o animales de

granja. Los plásmidos de mayor tamaño mostraron, en general, bajas coberturas. Tal y

como es habitual en las poblaciones de E. coli, se observó un predominio de la familia

MOBF12/IncF, seguida de MOBP12/IncI1. Sin embargo, la distribución plasmídica de los

determinantes de resistencia fue bastante más homogénea. Describimos el nuevo

complejo de resistencia ∆Tn5393-aph(4)-Ia-aac4-IVa-blaTEM-1a-strA-strB en un

plásmido MOBP12/IncI1, detectamos integrones carentes de region 3’-CS (intI1-dfrA5-

205

Capítulo 5

IS26) y resolvimos la localización y entorno genético de los determinantes de

resistencia presentes en la cepa BLEE C7328. Ésta había sido previamente caracterizada

por técnicas convencionales, lo que permitió identificar el gen blaCTX-M-1, transferible

por conjugación, y el integrón atípico intI1-dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA-aadA1-qacH-

sul3, cuyo fenotipo no se expresaba en la cepa receptora. La reconstrucción de su

genoma confirmó que el gen codificante de la BLEE formaba parte de un transposon

compuesto (IS26-mph(A)-∆mrx-orf477-blaCTX-M-1-∆ISEcp1-IS26) localizado en un

plásmido conjugativo IncN, mientras que el complejo híbrido ∆Tn21/Tn1721, que

albergaba el integrón atípico y el gen tet(A), era portado por un plásmido no

mobilizable IncR-IncFIA. Además, éste ultimo, compartía un 99% de identidad en su

backbone, así como una alta homología en la organización del módulo de resistencia,

con un plásmido descrito recientemente en una cepa de E. coli de origen humano.

Respecto al viruloma, observamos cierta asociación entre la presencia de

determinados factores y el filogrupo bacteriano. El gen lpfA, por ejemplo, se halló en el

genoma de todas las cepas pertenecientes al grupo filogenético B1, mientras que los

genes vat e iroN se asociaron al B2. Estos últimos, frecuentemente relacionados con

perfiles ExPEC y APEC, se localizaron a nivel cromosómico en distintas islas de

patogenicidad insertas en los loci thrW tRNA y serX tRNA. Cabe puntualizar, que iroN

también se detectó en diversas cepas del filogrupo B1 y clado IV, aunque en éstas

aparecía codificado en plásmidos pCol-V MOBF12. Destacó, además, la co-localización

de genes codificantes de bacteriocinas (mchF-microcina H47-, cva-colicina V-) y

sideróforos (iroN) en distintas plataformas, lo que podría favorecer la competitividad y

fitness bacteriano en nichos exigentes como el intestino.

Por ultimo, el árbol filogenético basado en los SNPs del genoma core mostró

una distribución altamente coherente con la obtenida por MLST. Sin embargo, como

cabía esperar, el superior poder de resolución obtenido por WGS permitió identificar

ciertas relaciones discrepantes. Dentro de un mismo clado observamos interrelaciones

entre secuencias genómicas asociadas a distintos hospedadores/nichos, así como a

diversas localizaciones geográficas. El número de SNPs que diferenciaba el genoma

bacteriano de un animal salvaje y un humano era, en ocasiones, extremadamente

reducido.

En definitiva, el análisis por WGS aportó numerosa información difícil de

alcanzar empleando métodos de screening y tipado convencionales. Con respecto al

206

Capítulo 5

plasmidoma, por ejemplo, nos brindó un escenario más completo, que incluyó la

consideración de los plásmidos pequeños difíciles de detectar por S1-PFGE, la

identificación de replicones no tipables por técnicas clásicas como la PBRT e, incluso,

la posibilidad de discernir entre plásmidos y fagos extracromosómicos. Con respecto a

la filogenia, si bien el MLST presenta un buen poder discriminativo, el estudio de los

SNPs de cientos de genes conservados de un determinado grupo bacteriano permite la

obtención de conclusiones más robustas. En definitiva, nuestros datos sugieren la

existencia de un flujo continuo de elementos móviles y líneas bacterianas entre los

ecosistemas humano y natural. En el manuscrito que se muestra continuación, se

recogen más detalles acerca de los resultados obtenidos y el significado de los mismos.

ARTÍCULO 8: Alonso, C.A., de Toro, M.*, de la Cruz, F., Torres, C. Genomic

insights into drug resistance and virulence platforms, CRISPR/Cas systems and

phylogeny of commensal E. coli from wildlife. En preparación.

207

Capítulo 5

ARTÍCULO 8

209

Capítulo 5

Genomic insights into drug resistance and virulence platforms, CRISPR-Cas

systems and phylogeny of commensal E. coli from wildlife

1. Introduction

Escherichia coli is a well-known commensal of the gut of humans and other wide-range

of animals, but it can also reproduce and persist for long periods of time in extra-

intestinal natural environments. Beside these habitats, some strains of E. coli have the

potential to cause severe intestinal and extra-intestinal illness, such as meningitis,

septicemia, pneumonia or urinary tract infections. This diversity in terms of niche

distribution and host-pathogen interactions is due to the high plasticity of E. coli

genome, which allows the bacteria to adapt to the varying selective pressures exerted by

the different environments. All this, plus the easy and fast-growth characteristics of E.

coli, makes this species an excellent model to study the evolution and epidemiology of

antimicrobial resistance or bacterial virulence (Touchon et al. 2009).

The dynamics of bacterial genomes involve both single mutations in the core genome

(microevolution) as well as horizontal gene transfer events (macroevolution) that shape

a species pangenome. Both types of evolutionary phenomena have influenced the

acquisition of new phenotypes and host/niche adaptation. Horizontal gene transfer

(HGT) is largely mediated by mobile genetic elements (MGE) such as insertion

sequences (IS), transposons, integrons, prophages, integrative conjugative elements

(ICE), genomic islands and plasmids. Human activities promote the use of selective

agents (antibiotics, disinfectants, heavy metals) that induce bacterial SOS response and,

thus, increase HGT rates (Gillings and Stokes, 2012). This leads to the assembly of

mosaic genetic elements and the development of antimicrobial and/or virulence

platforms of increasing complexity. Besides the selective pressure exerted by chemicals,

the genetic background of bacteria also seems to play a role in the antimicrobial

resistance phenotype. As an example, the strong correlation observed between E. coli

phylogroup B2 and antimicrobial susceptibility patterns (Johnson et al. 2004).

Clasically, PCR-based genotypic tests and other traditional typing methods (serotyping,

multilocus enzyme electrophoresis, pulsed-field gel electrophoresis, multilocus

sequence typing and phylogrouping multiplex PCR) were used to ascertain the genetic

relatedness and transmission dynamics of bacteria (Teinallon et al. 2010). The advent of

whole genome sequencing technology provides a finer-scale analysis tool that enables

210

Capítulo 5

high resolution detection of antimicrobial resistance and virulence determinants, the

analysis of genome structural variations and genetic linkages or the identification of

potential adaptations of the bacterial genomes to the host conditions, among others.

Since most genome sequencing projects focus on the analysis of multi-drug resistant

clones, clinically relevant pathogens or epidemiological outbreaks, there is a lack of

genomic data on commensal E. coli populations, even more in those non-directly

associated to humans. The study of randomly selected microbial communities, less

exposed to antibiotics and other selective forces associated with the human

environment, could provide new insights into the evolution of E. coli genomes and the

flow of clinically relevant genes among different ecosystems.

In the present work, a collection of 38 E. coli strains from the gut of various wild

animals were sequenced. Analysis of their accessory genome yielded a better

understanding of the role of the mobilome on inter-bacterial dissemination of mosaic

virulence and resistance platforms, the relationship between E. coli CRISPR/Cas

systems, phylogeny and antibiotic susceptibility or the plasmidome of commensal E.

coli from wildlife. Further, we constructed a single nucleotide polymorphisms (SNP)-

based core tree with E. coli strains from different origins (humans, livestock, food and

extraintestinal environment) in order to elucidate whether commensal population of

wild animals is subjected to a parallel independent microevolution or, on the contrary,

an on-going inter-host transmission is more likely occurring.

2. Materials and Methods

2. 1. Bacterial collection, antibiotic susceptibility testing and phylotyping

The genomes of 38 E. coli strains, randomly selected from a broad collection recovered

from wildlife, were sequenced. The strains were isolated from faecal specimens, or

intestine segments with faecal content, collected between 2013 and 2015 in various

geographic locations of Spain (Castilla-La Mancha, Cádiz, Aragón) from healthy wild

animals. Eleven strains were isolated from red deer, 10 from small rodents (wild mice

and rats), 10 from wild boars and 7 from birds of prey (eagles, vultures and osprey). All

isolates were tested for antimicrobial susceptibility with ampicillin,

amoxicillin/clavulanate, ceftazidime, ceftriaxone, cefoxitin, imipenem, nalidixic acid,

ciprofloxacin, gentamicin, amikacin, tobramycin, streptomycin, chloramphenicol,

sulfonamides, trimethoprim/sulfamethoxazole and tetracycline, using CLSI disk-

211

Capítulo 5

diffusion method. Identification of the E. coli phylogroups was analyzed by a multiplex

PCR-based assay (Clermont et al. 2013), followed by in silico validation.

For comparative phylogenomic analysis, other 242 E. coli full-genomes were taken

from the NCBI database. These belonged to bacteria from different sources: humans,

livestock, wild animals and the environment. Information about all these genomes is

included in Table S1.

2. 4. Sequencing and assembly of the E. coli genomes

Genomic DNA from E. coli strains was extracted using the QIAmp DNA Mini Kit

(Qiagen). Subsequently, libraries were prepared with the TruSeq PCR-free DNA

Sample Preparation Kit (Illumina) and 100 bp paired-end reads were sequenced in a

HiSeq 2500 System (Health in Code Facility). Illumina reads were quality checked with

FastQC software (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and

trimmed to optimize their quality with TrimGalore

(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).

2. 5. Genome analysis

Clean reads were uploaded to PLACNETw plasmid reconstruction tool (Vielva et al.

2017). After manual pruning based on scaffold link and coverage analysis as well as

reference sequences comparisons, chromosomal and plasmid sequences were identified,

clustered and downloaded in separated files. Besides genome reconstruction,

PLACNETw enabled classification of the plasmids by identification of relaxases (REL),

plasmid replication initiator proteins (REP) and incompatibility groups (Inc).

E. coli MLST profiles were predicted in silico using the Achtman 7 gene scheme at

EnteroBase (http://enterobase.warwick.ac.uk). The genomes of six strains showing

novel MLST alleles or allele combinations were uploaded to the database for sequence

type (ST) assignment. ResFinder 3.1 and VirulenceFinder 2.0 (90% identity and 60%

minimum length) were used to estimate the antimicrobial resistance and virulence gene

content, respectively (Zankari et al. 2012; Joensen et al. 2014). To determine the

presence of CRISPR/Cas systems and to analyze the number and sequences of spacers,

CRISPRfinder program was employed, with manual validation (Grissa et al. 2007).

Spacer homologues were identified by BLASTn search against the nucleotide collection

212

Capítulo 5

(nr/nt) database (query coverage 100%, identity ≥88%), excluding matches to other

CRISPR sequences.

Whenever necessary, contigs were manually assembled, curated and annotated using

additional bioinformatic tools as: Artemis and SnapGene softwares, BLAST

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), ORFfinder (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf),

ISfinder (www-is.biotoul.fr) and UniProt database (http://www.uniprot.org). To

visualize resistance and virulence gene comparisons EasyFig 2.1 was used (Sullivan et

al. 2011).

Phylogenetic analysis of the cas set of genes or specific virulence determinants were

carried out using MEGA7 software from alignments generated with CLUSTALW.

Concatenated amino acid or nucleotide sequences trees were constructed using the

UPGMA method, with distances calculated by the Poisson correction or Maximum

Composite Likelihood, respectively, on a pairwise-deletion comparison.

For the phylogenomic study, the core genome was defined as the assembly of genes

present in all the genomes analyzed, with more than 80% similarity and 60% coverage.

Genes were clustered with CD-HIT-EST, selecting those that were present at least in

one copy per genome. This subset was concatenated and aligned with Muscle (v3.8.31)

(http://www.drive5.com/muscle). SNPs were extracted and visualized in a SNP-matrix

with HarvestTools (v1.0) (https://harvest.readthedocs.io/en/latest/content/harvest-

tools.html). Finally, RAxML was used to build the core genome phylogenetic tree, by

using 100 replicates for bootstrap determination.

2. 6. Nucleotide sequence accession numbers

Raw sequence reads were deposited at the European Nucleotide Archive (ENA)

(http://www.ebi.ac.uk/ena) under the study accession number “pending”.

3. Results and discussion

Our analysis of the 38 genomes of E. coli isolated from wild animals focused on their

CRISPR/Cas systems (section 3.1), plasmidome and resistoma (section 3.2), virulome

(section 3.3) and phylogenomics (section 3.4). Table 1 summarizes the genetic features

of commensal E. coli isolates from wildlife based on in silico WGS analysis.

213

Capítulo 5

Tab

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214

Capítulo 5

Tab

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215

Capítulo 5

3.1. CRISPR/Cas SYSTEMS

Two monophyletic CRISPR/Cas systems are found in E. coli: I-E and I-F. Subtype I-E

consists of two CRISPR arrays (CRISPR-1, CRISPR-2) and a set of 8 cas genes, while

subtype I-F has 6 cas genes flanked by CRISPR-3 and CRISPR-4 arrays (Makarova et

al. 2015; Aydin et al. 2017). In contrast to the I-E system, which seems to be inactive

due to H-NS regulation under laboratory conditions (Westra et al. 2010), the I-F system

was demonstrated to be constitutively expressed, interfering targeted foreign elements

(Cady et al. 2012; Almendros et al. 2012).

We examined the CRISPR/Cas and spacer repertoire in the 38 E. coli from wildlife.

CRISPR/Cas I-E and I-F systems were detected in 28 (73.4%) and 4 genomes (10.5%),

respectively. As commonly occurs, none carried both I-E and I-F subtypes

simultaneously. There were a total of 404, 331, 48 and 58 spacers in CRISPR-1 to -4,

respectively; 109, 117, 46 and 50 were unique but 108, 63, 1 and 4 appeared in more

than one isolate, regardless of the clonal relatedness of bacteria (Suppl. Fig. S1).

Although strains with equal ST and origin carried identical CRISPR 3/4 arrays, we

found others ascribed to different ST, and even phylogroup (A, B1), sharing spacer

combinations in equivalent positions of the array. Notably, C7031 and C7328 strains,

belonging to different ST and recovered from different host, harbored the same large

CRISPR-3 array. This coincidence in spacer segments between non-clonally related

strains can be explained by recombination between homologous CRISPR arrays

(Almendros et al. 2014), vertical inheritance and differential spacer deletion (Kupczok

et al. 2015) or a combination of both. In agreement with Almendros et al. 2010, we

observed that CRISPR-3/-4 arrays contained a larger proportion of unique spacers than

CRISPR-1/-2 (90.6% vs 30.7 %), which reflects the higher activity of CRISPR/Cas I-F.

Regarding the homology of spacer sequences with known genes (proto-spacers), we

found significant differences among CRISPR arrays. Globally, among the 841 spacers

present in CRISPR 1 to 4, 59 (7.0%) showed high homology (≥88%) to distinct mobile

elements available in public databases. In decreasing order of prevalence, 49 (5.8%), 9

(1.1%) and 1 (0.1%) matched viral, plasmid and IS proto-spacers. However, according

to previous studies, the distribution of these homologues varies among CRISPR/Cas I-E

and I-F (Díez-Villaseñor et al. 2010, Aydin et al. 2017). Supporting Almendros et al.

2010 findings, and contrary to Aydin et al. 2017, a significant number of spacers in

CRISPR-1 and -2 showed homology with different regions of E. coli prophage genomes

216

Capítulo 5

(percentage among the total viral proto-spacers in I-E/reference sequence): E24377A

(46.7%/CP000800.1), P1 (15.5%/AF234172), D6 (2.2%/MF356679) and

uncharacterized bacteriophages (35.6%). In CRISPR/Cas I-F systems, various spacers

with known homology matched at least 97% with conserved regions of plasmids. We

also identified one spacer 100% identical to a specific region of the ISEc66 element

(IS110 family, IS1111 group). The complete nucleotide sequences of these plasmid- or

IS-proto-spacers and their location within CRISPR 3/4 arrays can be shown in Fig. 1.

Recently, a positive correlation has been established between the presence of

CRISPR/Cas I-F systems and antimicrobial susceptible phenotypes in E. coli (Aydin et

al. 2017). Authors concluded that the presence of type I-F spacers matching conserved

regions within IncI1-, IncFII- and IncFIB- plasmids interfered with the acquisition of

resistance plasmids. It is worth noting that despite the different geographical and host

origins of the strains, 2 out of the 5 spacers they reported were also present in our E.

coli collection. Due to the fact that CRISPR/Cas I-F has demonstrated to be active,

these similarities can be explained by the advantageous addition of specific proto-

spacers covering widespread distributed plasmids. However, the existence of common

ancestral CRISPR which evolve retaining certain spacers in response to the

environmental selective pressures cannot be discarded. In this regard, the detection of

two novel plasmid proto-spacers in CRISPR/Cas I-F systems belonging to E. coli from

wildlife may reflect an improvement in the fitness of bacteria lacking resistance

plasmids in environments less exposed to antibiotics.

Figure 1. The structural diversity of the four CRISPR/Cas I-F found in E. coli from wildlife is shown above. The cas-F genes (pink) are located between CRISPR-3 and CRISPR-4 loci. Spacers are represented as vertical bars; those marked in red denote homology with plasmids or IS sequences. The complete spacer sequences matching at least 97% with known plasmids or IS regions are represented in the table. The graphic in the right shows the distribution of CRISPR/Cas I-E and I-F systems among E. coli phylogroups.

217

Capítulo 5

As previously reported (Díez-Villaseñor et al. 2010; Touchon et al. 2011; Aydin et al.

2017), we observed a clear dependence of CRISPR/Cas subtype on phylogeny (Fig. 1).

On the one hand, concerning CRISPR/Cas I-F, we mainly found it in B2 group strains

(3 out of 4 I-F-harboring strains). As mentioned before, the presence of this I-F system

has been associated to low levels of antimicrobial resistance, a frequent pattern

observed in B2 isolates (Johnson et al. 2004). However, some members of B2

phylogroup, such as those belonging to ST131, have contributed in the last decades to

the global dissemination of multi-drug resistance (Nicolas-Chanoine et al. 2014).

Notably, in accordance with Aydin et al. 2017, the two strains of the studied collection

ascribed to ST131 complex did not carry CRISPR/Cas systems, which may favor them

in the uptake of resistance and virulence determinants under selective environmental

conditions. In addition, this suggests a divergent evolution of B2 group members prior

to the acquisition of cas genes. The remaining strain of the collection carrying a

CRISPR/Cas I-F system belonged to Escherichia cryptic clade V (new ST7630). On the

other hand, considering CRISPR/Cas I-E systems, its presence was confirmed in strains

ascribed to phylogroups B1, A, D and, more relevantly, B2. Previous analyses on large

collections reported the absence of CRISPR/Cas I-E in isolates belonging to B2 group

(Díez-Villaseñor et al. 2010, Aydin et al. 2017) or, less frequently, an incomplete I-E

system lacking CRISPR 1 array as a consequence of the deletion/truncation of one or

more cas genes (Touchon et al. 2010).

In connection with this last, we also analyze the genetic module located between the

two CRISPR arrays, comprising the cas set of genes and adjacent ORFs. The different

genetic organizations for I-E and I-F systems are represented in Suppl. Fig. S2. As

other authors described, we found a higher diversity of structures in I-E systems,

probably due to deletions and rearrangements promoted by IS elements (Almendros et

al. 2014). In fact, a truncated IS186, which has been suggested to guide the

CRISPR/Cas evolution owing to its affinity for GC-rich regions (very frequents in

distinct point of the system), was found inserted within the cas3 gene in C7973 and

C7974 strains. Among the remaining cas genes, only cas2 was present. Further, in the

B2 strain carrying the CRISPR/Cas I-E (C7347) a partial deletion of cas7 and cse1

genes and the absence of the complete copy of cse2 was observed. However, CRISPR 1

and 2 arrays were present bearing low number of spacers (4 and 1, respectively), which

probably reflect the non-functionality of the system and the progressive loss of spacers.

218

Capítulo 5

In addition, the evolutionary relationship of cas genes inferred from the phylogenetic

tree of the concatenated amino acid sequences of cas-E and cas-F genes showed, as

previously reported (Almendros et al. 2014), two clearly differentiated clusters in

CRISPR/Cas I-E systems (E1 and E2) and a minor heterogeneity among CRISPR/Cas I-

F (Suppl. Fig. S3). As it was described among ECOR collection (Almendros et al.

2014), most of the E. coli strains from wildlife, belonging to a variety of phylogroups

(A, B1, D, B2), were included in cluster E1 whereas cluster E2 comprised few strains of

the A group. The cas-F set of genes exhibited lower genetic variability and, although

the concatenated amino acid sequence differed by 8.6% between clade V and B2 strains

(C7969 vs C7570/C7975/C7963), they shared a common origin, in contrast to what it is

proposed for E1 and E2 variants. Notably, the genetic sequence of cas-F cluster and

adjacent genes in clade V strain suggests a close relation with Escherichia marmotae, a

recently described species isolated from wild marmots in China (Liu et al. 2015).

3. 2. PLASMIDOME AND RESISTOME

PLACNETw reconstructions revealed the presence of plasmids in 29/38 E. coli

genomes (76.3%), showing ample diversity in size, replicon families and

number/isolate, which ranged from 1 to up to 5.

As discussed by Smillie et al. 2010, plasmid size distribution follows a bimodal curve,

with average sizes of 5 kb for small plasmids and 200 kb for larger ones. Table 2

summarizes the genetic features of the small plasmids that were present in 28.9% of the

isolates. In most cases, they only contained genes involved in plasmid replication and/or

mobility. However, they showed a high phylogenetic diversity, encoding Rep and

relaxase proteins belonging to 4 different families. Among mobilizable small plasmids,

we observed associations between MOBP51 relaxase subfamily and RNAI-encoding loci,

which characterized ColE1 plasmids (e.g. C7382-1), but MOBP51 was also present in

plasmids with a non-typeable replicon sequence. The same was shown for small MOBQ

plasmids, often but not always carrying a Rep similar to that involved in pColE2

replication [col(156)]. The relation of MOBP5 and MOBQ plasmids with diverse

replication systems has been already pointed (de Toro et al. 2014). Further, due to its

scarcity among Enterobacteriaceae, it is worth noting the detection of a 3.3 kp plasmid

(C7382-2) showing the conserved domains of MOBV2 and a RepL-like protein. Besides

small mobilizable plamids, we found several mini-plasmids carrying barely the

information for self-perpetuation (C6466-2, C7369-1, C7347). They show the smallest

219

Capítulo 5

length of the entire collection (1.5-2.2 kb) and are homologous to the pKST21 family

[col (MG828)], a mosaic group of plasmids only transferable by vertical inheritance that

need two rep genes (repA-repB) for autonomous replication (Spaková et al. 2013).

Regarding adaptive and cargo genes most appeared to be cryptic, since their detectable

ORFs (1 to 3) encoded unknown hypothetical proteins. They could represent adaptive

genes to the less studied natural environment. Only 3 of the small plasmids were

involved in the production of colicins, carrying the colE1, colN and colE8 operons.

Interestingly, comparing our set of small plasmid with those deposited in public

databases, 5 of them were identical or highly similar (≥99%) to others previously

reported among Enterobacteriacea of human and livestock origin (Table 2). Hence,

according to previous observations, these small replicons, a priori imposing a metabolic

cost but scarce benefit to the cell, are common and circulate among E. coli from both

clinical and environmental settings (Brolund et al. 2013). The question about whether

these structures are simply selfish genetic elements or play a role as moldable vectors in

the acquisition of adaptive genes, remains unclear. However, latest evidences point

towards the second scenario (Attéré et al. 2017).

Table 2. Diversity and genetic features of small plasmids found among studied collection. Plasmids have been named according to the strain they occupy (if ≥1 per isolate, they appear enumerated).

Small plasmid

size (kb) Relaxase Replicon

type Accessory genes (proteins) ≥99% identical plasmids (origin)

C7369-2 3.4 MOBP51 nd orf1 (hypothetical) CP012927 (human) C8124-2 4.6 MOBP51 col(RNAI) orf1 (hypothetical) - C7382-1 6.7 MOBP51 col(RNAI) cea (colicin E1), cei (colicin E1 immunity), cel

(colicin E1 lysis), exc1 (entry exclusion 1), exc2 (entry exclusion 2)

-

C7962 4.2 MOBP51 nd orf1, orf2, orf3 (hypothetical) - C7971 4.2 MOBP51 nd orf1, orf2, orf3 (hypothetical) - C7969 5.4 - col(RNAI) cna (colicin N), cni (colicin N immunity), cnl

(colicin N lysis), exc1 (entry exclusion 1), exc2 (entry exclusion 2)

-

C6466-1 3.6 - col(RNAI) orf1 (hypothetical) KU166868 (human), CP006052 (chicken)

C6466-2 1.5 - col(MG828) orf1 (hypothetical) CP010877 (human) C7369-1 2.2 - col(MG828) orf1, orf2, orf3 (hypothetical) - C7347 1.7 - col(MG828) orf1 (hypothetical) - C6466-3 5.1 MOBQ12 col(156) orf1 (hypothetical) - C7369-3 3.9 MOBQ12 col(156) orf1 (hypothetical) CP012638 (human),

CP019896 (beef) C8124-3 8.1 MOBQu col(156) cea (colicin E8), cei (3 genes) (colicin immunity),

cel (2 genes) (colicin lysis); orf1, orf2, orf3 (hypothetical)

AP010964 (human)

C8124-1 4.1 MOBQu nd - - C7382-2 3.3 MOBV2 nd orf1 (hypothetical) - C7328 3.2 - Col440I orf1, orf2, orf3 (hypothetical) - C7974 2.7 - nd orf1, orf2, orf3 (hypothetical) - C7973 2.7 - nd orf1, orf2, orf3 (hypothetical) -

220

Capítulo 5

Before focusing on larger plasmids, it is necessary to remark the identification of

extrachromosomal prophages or phage-like elements in two strains. A 5386 bp

sequence, assemble in a unique contig, gave a perfect BLASTn match with the genome

of the coliphage phi-X174 (C7347 strain). Further, the reconstruction of C7136 genome

evidenced a large cluster of 13 contigs (⁓90 kb), well-differentiated from the rest of the

genome elements but showing a poor coverage. It contains features and large sequence

segments highly homologues to P1 bacteriophages, known to lysogenize bacteria and

replicate as independent low-copy number plasmid-like elements (Billard-Pomares et

al. 2014). The repA protein of P1 and P7 phages belonged to IncY, the incompatibility

group associated to C7136 strain. These plasmid-like elements have been involved in

the spread of relevant antimicrobial resistance determinants (blaSHV-12, mcr-1…) and are

distributed both in human as well as natural environments (Billard-Pomares et al. 2014;

Zhang et al. 2016).

As detailed in Table 1, among the large conjugative plasmids residing in E. coli from

wildlife, members of the MOBF12 subfamily (IncF complex) were predominant,

followed by MOBP12 (mainly, IncI1). This was not surprising, since these conjugative

replicons are well-known to have higher prevalence in E. coli, in part due to the lower

fitness cost they impose based on their capability for self-transfer repression (Haft et al.

2009). The most remarkable was the heterogeneity of plasmids found among our

antimicrobial resistance (AMR) strains. Although resistance rate was low among this

collection of E. coli from wildlife (21.0%), AMR genes-carrying plasmids belonged to a

variety of MOB/Inc families (MOBF12/IncF, MOBP12/IncI1, MOBF11/IncN;

MOBP3/IncX1; -/IncR). In contrast to what happens in wild natural environments, the

overrepresentation of particular AMR-plasmids or clones seems to be more frequent in

human-influenced settings. The high antimicrobial pressures tend to select well-adapted

replicons (or even clones) with inherent or newly acquired resistance genes to

proliferate and rapidly spread.

Figure 3 summarized the genetic surrounding of the main resistance determinants found

in the present study. Most of them were included in larger resistance complex involving

different hybrid transposons and insertion sequences, but the resolution of the complete

structure was not possible in all cases due to the limitations of short-read sequence data.

We therefore showed those well-characterized gene associations owing to a high

coverage and previous experimental assays.

221

Capítulo 5

Among the five blaTEM-1 genes detected, three different genetic surroundings could be

identified. The variant blaTEM-1b, more prevalent, was located upstream of the Tn2 tnpR

gene, as commonly occur, but was also found flanked by two IS26 elements. The

blaTEM-1a variant, different in 3 nucleotides but encoding the same TEM-1 protein, was

found in a truncated Tn3 transposon. An IS26 element was inserted downstream of the

Tn3 tnpR gene, likely recruiting this IS26-tnpR (Tn3)-blaTEM-1a gene pool and

integrating it in a ∆Tn5393 resistance complex by homologous recombination, since no

direct target site duplications were identified. Thus, the ∆Tn5393-aph(4)-Ia-aac4-IVa-

blaTEM-1a-strA-strB complex, not previously described, emerged from diverse insertion

events within the original Tn5393 backbone (Fig. 3a). Probably, the tnpA transposase

gene was disrupted by the inclusion of the genetic unit ISEc59-aph(4)-Ia-aac4-IS26,

frequently found in many bacterial genomes, and was followed by the insertion of the

IS26-tnpR(Tn3)-blaTEM-1a segment due to a recombinatory event between two directly

oriented IS26.

The IS26-∆repA-repC-sul2-strA-strB-IS26 composite transposon, conferring resistance

towards sulfonamides and streptomycin, was present in the multireplicon IncFIA-FIB-

Q1 carried by C8124 strain. This cluster, composed by part of the IncQ1 prototype

plasmid RSF1010 (M28829), also derived from the Tn5393 transposon. In this case,

Tn5393 harboring strA and strB genes was likely transposed into the resistance gene

region of RSF1010, containing the sul2 gene and a mobile element called CR2 (Yau et

al. 2010). Secondary events removed parts of Tn5393 and CR2 regions leading to the

conserved ∆repA-repC-sul2-strA-strB configuration (Yau et al. 2010), which is widely

spread as an IS26-bounded transposon. This mobile element is present in many bacterial

plasmids and integrated chromosomal structures from human, veterinary and

environmental settings (Yau et al. 2010).

Regarding tetracycline efflux pumps encoding genes, tet(A) and tet(B), they were

located at the well-characterized transposons Tn1721 and Tn10, respectively. In C6468

isolate, a copy of IS26 disrupted the IS10-L transposase gene. Furthermore, three class

1 integrons structures were identified, containing the following gene cassette

arrangements: i) dfrA5; ii) dfrA17-aadA5 and; iii) dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA-aadA1.

The integron carrying the dfrA17-aadA5 array in the showed the classical 3’-conserved

222

Capítulo 5

(a)

(b)

Fig. 3. Genetic environment of antimicrobial resistance determinants identified in E. coli from wildlife. (a) BLAST comparison of the novel complex ∆TN5393-blaTEM-1a-strA-strB with other reference sequences from public databases; (B) BLAST comparison of a hybrid Tn21-1721 transposon carrying an atypical class 1 integron and tet(A) in non-conjugative IncR-IncFIA plasmids. Genes are colored according to their function: purple, resistance to drug/metal; green, recombination/transposition; blue, replication and regulation of gene; grey, known function; white, unknown function.

223

Capítulo 5

segment (3’-CS), composed by a truncated qac∆E1 gene and the sulfonamide resistance

gene sul1. The results of a Norwegian survey suggested a linkage between this integron

and a subpopulation of E. coli adapted to human host (Sunde et al. 2015). We found this

element in two different E. coli from wild birds (C6468, C6473), belonging to different

STs and harboring distinct MOBF12 plasmids. However, although we could not get the

complete assembly of these plasmids, they showed a very similar resistance gene

content. Hence, the spread of dfrA17-aadA5 array seems to be more associated to a

stable plasmid-encoded resistance complex rather than to certain clonal lineages. The

larger dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA-aadA1 array, which will be mentioned latter, was an

atypical sul3-associated class 1 integron. Notably, dfrA5 gene cassette carrying integron

lacked the 3’-CS due to an IS26-mediated deletion. The intI1-dfrA5-IS26 configuration

has been less reported in conventional PCR-based studies targeting integrons, owing to

the absence of the hybridization site of the 3’-CS primer. However, as shown, they are

present in both human and animal E. coli populations (Dawes et al. 2010).

Figure 4 showed the PLACNETw reconstruction of the extended-spectrum β-lactamase

producing C7328 strain. Plasmid 2 showed a MOBF11 relaxase (red node) and an IncN

replicon type (green node), and harbored the blaCTX-M-1 in an IS26 composite

transposon. An incomplete macrolide resistance cluster, with an entire mphA and a

truncated mrx gene, were located downstream of blaCTX-M-1, leading to the gene block

IS26-mph(A)-∆mrx-orf477-blaCTX-M-1-∆ISEcp1-IS26. This module, first reported in

IncN plasmids of human clinical isolates, has also been described in IncI1 and IncB/O

replicons, which suggest the occurrence of IS26-mediated transposition events between

different plasmid backbones (Cullik et al. 2010; Wang et al. 2014). In addition, C7328

strain carried a nontransferable IncR-FIA plasmid of around 70 kb, lacking the relaxase

gene. Its backbone was highly homologous (99% coverage, 100% identity) to the

recently reported pMRSN346638_67.9 plasmid in a clinical E. coli isolate (Snesrud et

al. 2017). Further, both plasmids carried aadA1/aadA2, cmlA1, blaPSE-1, dfrA16, sul3

and tet(A) genes, encoding for resistance against aminoglycosides (streptomycin),

phenicols, β-lactams (penicillin, carbenicillin), trimethoprim, sulfonamides and

tetracycline, respectively. Their resistance regions, almost identical, consisted on a

hybrid ∆Tn21/Tn1721 transposon containing a large class 1 integron (Fig. 3b). C7328

strain sequenced in this work, corresponded to that included in a previous study carried

out using conventional PCR-base approaches (Alonso et al. 2016). There we

224

Capítulo 5

demonstrated the conjugal transferability of CTX-M-1 encoding gene, but we could not

determine neither its complete genetic surrounding nor the genetic basis behind the

impossibility of a parallel transference of the class 1 integron and the tet(A)

determinant. WGS data enabled the genome reconstruction of the strain, which provides

a better understanding of the genetic background and the mechanisms involved in the

antimicrobial resistance spread.

3. 3. VIRULOME

The analysis of the virulome of commensal E. coli from wildlife revealed similar

patterns to those recently reported in healthy swines (Ahmed et al. 2017). It is necessary

to specify that, although a web-based program was used to search for the virulence

traits, the high sequence homology between specific determinants (e.g. iss/bor or

cva/mchF) required manual validation. Unlike acquired antimicrobial resistance,

preferentially plasmid-encoded, virulence determinants were found in a variety of

mobile element, PAIs, prophages and large virulent plasmids. Among the 25 detected

virulence-related genes, the highest frequencies were observed for gad, lpfA and iss.

Notably, at least one of the two isoenzymes of Gad (glutamate descarboxilase A and B),

both in most cases, were found encoded in all genomes, invariably located in previously

defined chromosomal loci (Smith et al. 1992). These stress-related genes, involved in

Figure 4. PLACNETw reconstruction of the E. coli C7328 genome. After a manual pruning of the original network, four components were differentiated: the chromosome, plasmid 1 (small cryptic plasmid), plasmid 2 (IncN replicon) and plasmid 3 (IncR-IncFIA multi-replicon). Contigs are represented as blue nodes of size proportional to their length. Orange nodes indicate reference genomes. Contigs encoding plasmid relaxases and replication proteins are coloured in red and green, respectively.

225

Capítulo 5

the decarboxylation of glutamate for the maintenance of neutral cytoplasmic pH, seem

to be essential in the colonization of the host gut.

As shown in Figure 5, the occurrence of some virulence factors (VF) varied among E.

coli phylogroups. For instance, the fimbrial adhesin LpfA was present in all strains

belonging to phylogenetic group B1, but it was absent in B2 isolates. On the contrary,

vacuolin autotransporter toxin (vat) and, to a lesser extent, enterobactin siderophore

receptor (iroN) were more prevalent among B2 phylogroup. These differences in VF

distribution seem to be in relation with the propensity of certain E. coli phylogroups to

cause particular infections. In this sense, lpfA carriage and B1 phylogroup have been

associated to persistent mastitis in cattle (Dogan et al. 2012), whilst B2 phylogroup is

more related with avian pathogenic (APEC) and human extraintestinal pathogenic

(ExPEC) E. coli strains.

Focusing on these latter ExPEC/APEC associated VFs, vat and iroNBCDE cluster, our

results suggest that their linkage to B2 phylogroup is in relation to their preferential

location in chromosomal PAIs (Fig. 6). As it will be described, iroN was also found in

B1 and clade IV strains, but in these cases encoded in large pColV-like MOBF12

plasmids. Regarding vat, as previously described in human UPEC (CFT073) and avian

APEC (Ec222) strains, it was located on a PAI inserted at the thrW tRNA locus,

between the proA and yagU genes. This site seems to be a hotspot for recombination

and has been found to carry different VFs such as iroN, sfaS and microcins in some E.

coli isolates harboring PAI-III536 (Parham et al. 2005). However, 6 out of the 8 strains

belonging to the B2 phylogroup of our collection only carried vat at this insertion point

(Fig. 6b). Most of them also harbored iroN, but in a different genomic location. In fact,

this siderophore gene was occupying two different PAIs inserted in the serX locus, the

so-called PAI-CFT073-serX and the island V described in IHE3034 strain (Moriel et al.

2010) (Fig. 6a). Apart from the iron locus, PAI-CFT073-serX co-harbored the genetic

system encoding microcin H47 (mcmA, mchF, mchB, mchC) and the foc operon,

encoding F1C fimbriae. The genetically related SfaS adhesin, also known to play a role

in uropathogenesis, was adjacent to iroNBCDE locus in PAI-V-IHE3034. However, as

mentioned before, the plasmid-borne iro cluster was also frequent among E. coli from

wildlife belonging to various phylogroups (B1, B2, clade IV). pColV- plasmids, coding

for the production of colicin V (cva), were found in 18.4% of the strains. All belonged

to MOBF12 family and carried distinct traits such as iroN, iss (increased serum survival),

226

Capítulo 5

Figu

re 5

. D

istri

butio

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viru

lenc

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term

inan

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mon

g E.

col

i phy

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oups

.

227

Capítulo 5

(a)

(b)

Fig. 6. Genetic location and surrounding of iroN (a) and vat (b) virulence genes in some of the E. coli strains from our collection. The reference genomes used for BLASTn comparisons are indicated as “Ref. Genetic location-Strain name-(accession number)”. Genes are colored according to their function: orange, virulence genes; green, recombination/transposition; pink, prophage genes; grey, known function; white, unknown function.

228

Capítulo 5

tsh (temperature-sensitive hemagglutinin), cma (colicin M) and/or cmb (colicin B).

These plasmids have been associated to APEC pathotype and, although they

background and virulence region is variable, the so-called “conserved” portion

(containing among others iroN) shows high homology with certain chromosomal PAIs

(Johnson et al. 2006). Indeed, most of the pColV plasmids identified in E. coli from

wildlife contained iss, iroN and cva (C7369, C8124, C6847, C6950 strains), a set of

genes associated to the conserved virulence region of these plasmids. Taking into

consideration the frequent occurrence of the mentioned ExPEC/APEC related VFs (e.g.

Vat, iroNBCDE) among commensal E. coli population, these traits seem to primarily

contribute to bacterial fitness, competitiveness and gut colonization, rather than being

directly involved in infection.

In this regard, bacteriocins has also been linked to ExPEC due to the positive correlation

observed between bacteriocin-encoding genes and other VFs (Micenková et al. 2014).

The present study on commensal E. coli corroborated this virulence genes association

for bacteriocins such as colicins V, B and M and microcin H47. As detailed in Table 3,

colicins V, B and M were located on large MOBF12 plasmids, while microcin H47 was

mainly found in chromosomal PAIs. Both platforms usually co-harbored iroN and other

aforementioned VF. However, colE1, E8 and N genes occupied small plasmids, lacking

additional traits. The integration of bacteriocins-siderophores helps E. coli to adapt to

competitive environments, like the gut, thereby posing an advantage for commensal

populations. However, in combination with additional VFs, these strains can be more

prone to invade other tissues causing extra-intestinal infections (Martin et al. 2017).

Colicin/Microcin Gene cluster Genetic

Location Plasmid characteristics Strain

(phylogroup) Host

MOB/Inc Size (kp)

N cna, cni, cnl Plasmid -/col(RNAI) 5.4 C7969 (Clade V) Wild boar E1 cea, cei, cel Plasmid MOBP51/col(RNAI) 6.6 C7382 (B1) Bird of prey E8 cea, cei, cel Plasmid MOBQu/col(156) 8.1 C8124 (B1) Wild boar M, B cma-cmi, cba-cbi Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFIC(FIIA) ⁓120 C7369 (B1) Bird of prey M, B cma-cmi, cba-cbi Plasmid MOBF12/IncFII ⁓100 C7962 (B1) Rodent M, B cma-cmi, cba-cbi Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFII ⁓130 C7963 (B2) Wild boar M, B (truncated) cma-cmi, cba-cbi Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFII ⁓120 C7032 (B2) Rodent V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFIC(FIIA) ⁓150 C6473 (B1) Bird of prey V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIA-IncFII ⁓150 C6847 (Clade IV) Rodent V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIA-IncFII ⁓150 C6950 (Clade IV) Rodent V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFII ⁓130 C7963 (B2) Wild boar V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFII-IncQ1 ⁓150 C8124 (B1) Wild boar V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFIC(FIIA) ⁓100 C7382 (B1) Bird of prey V cvaA, cvaB, cvaC Plasmid MOBF12/IncFIB-IncFIC(FIIA) ⁓120 C7369 (B1) Bird of prey H47 mchB, mchC, mchF, mcmA Chromosome Chromosome (PAI-CFT073-serX) - C7975 (B2) Wild boar H47 mchB, mchC, mchF, mcmA Chromosome Chromosome (PAI-CFT073-serX) - C7032 (B2) Rodent H47-like (98.1% ID) mchB, mchC, mchF Chromosome Chromosome - C7349 (B1) Deer

Table 3. Distribution and location of bacteriocins encoding genes among commensal E. coli from wildlife.

229

Capítulo 5

The Iss factor, frequently associated with colibacillosis in poultry and found on

pColV/BM plasmids, was detected in the genome of 55.3% E. coli strains. The high

prevalence of this gene, located on both plasmids and/or prophage-like elements on the

chromosome, has been previously reported (Xu et al. 2018). However, three iss alleles

have been differentiated according to their sequence (Johnson et al. 2008). The tree of

Suppl. Fig. S4 was constructed based on most of the iss sequences from our collection

as well as reference genes from Johnson et al. 2008 and Xu et al. 2018. Johnson et al.

2008 reported a positive correlation between iss type 3 and human ExPEC as well as iss

type 1 and avian APEC. Xu et al. 2018 demonstrated that differences in the iss

nucleotide sequence and mRNA copy affect its virulence and serum resistance. As

shown in Suppl. Fig. S4, the iss sequence associated with higher serum livability

clustered with iss type 1 group, while other representing a lower livability (“type 13”)

clustered with iss type 2 group. Although all iss alleles were represented among E. coli

from wildlife, most of them encoded the chromosomal, and apparently less virulent, iss

type 2.

Considering VF involved, to a greater or lesser extent, in intestinal colonization and

pathogenicity we reported astA, aaiC, air, eilA, pic, hlyA, subA, espI, ireA, iha and

capU. EAST-1 heat-stable toxin encoding gene (astA) was mainly found embedded

within the putative IS1414 transposase, as previously described (McVeigh et al. 2000).

C7145 strain harbored different VFs related to the enteroaggregative E. coli (EAEC)

pathotype. In addition to astA, it also carried aaiC (type VI secretion protein), air

(enteroaggregative immunoglobulin-repeat protein) and eilA (Salmonella Hil-A

homolog) determinants. Although the type VI secretion system (aaiA-aaiY genes) was

first described in a PAI inserted at pheU in the chromosome of the prototype EAEC 042

strain, in C7145 a partial cluster (aacA-P) was identified on a plasmid. This cluster

shared 94% identity with that recently described in the pAA700-09 plasmid, which also

comprised 16 genes (Jønsson et al. 2017). The air and eilA determinants were found

chromosomally co-located at selC locus. Regarding Pic serine protease autotransporter,

implicated in intestinal colonization, it was identified in the chromosome of C7032

strain showing a configuration highly homologous to that reported in CFT073 strain. In

C7349, genes encoding α-hemolysin (hlyCABD) were harbored in a MOBF12 plasmid, as

widely occur in enteropathogenic strains (Burgos et al. 2010). Finally, the

hexosiltransferase homolog CapU, which is frequently plasmid-borne in EAEC strains,

230

Capítulo 5

was located in the chromosome of C7973 and C7974 strains, conserving the

configuration reported at the same locus in the prototype EAEC 042 strain.

3. 4. PHYLOGENOMICS

A phylogenetic tree based on single nucleotide polymorphism (SNPs) in the core

genome was constructed in order to examine the occurrence of potential adaptive

mutations associated with the host. In a first approach, with the aim of defining the

genetic diversity of our E. coli collection, we performed a phylogenetic analysis

considering only the core SNPs of the 38 genomes from wild animals. The resulting tree

was highly concordant with the population structure inferred by MLST. Thus, additional

E. coli strains were selected from Enterobase, based on MLST criteria. Up to 31 E. coli

genomes per sequence type, representing various sources and geographic locations,

were downloaded from NCBI BioProjects database. Information about these genomes is

detailed in Table S1. The final data set for the phylogenomic reconstruction, represented

by the tree in Figure. 7 (annexes), comprised 280 genomes, including those belonging to

our collection (n꞊38). Of the total gene clusters (108,518), only 0.6% (674) were shared

among all genomes, resulting in a core length of 575,173.5 ± 3,802.95 bp. This small

core genome evidenced the high genetic diversity of the studied collection, particularly

highlighted by the remarkable divergence of cryptic Escherichia clades (C6847 and

C6950 strains-Clade IV/ST322; C7969 strain-Clade V/ST7630). Among the five major

clades defined by Walk et al. 2009 (I to V), members of clades II, III, IV and V

appeared overrepresented in samples from soils, rivers and aquatic sediments. Wild

animals seemed to be spillover hosts of these environmentally well-adapted Escherichia

lineages. Luo et al. 2009 analyzed nine genomes belonging to these cryptic clades and,

by comparing them with enteric E. coli strains (including clade I), demonstrated that

both differed in the content of a significant number of genes. Further, they did not find

genetic exchange of core genes between enteric and environmental clades, contrary to

what it was observed within members of each group. Thus, they suggested that

evolution of Escherichia genus appeared to be mainly driven by gene acquisition and/or

deletion, rather than homologous recombination, which supports our observations. The

other obvious reason that could affect the core size is the high number of sequences

taken from public databases. When using sequence data from different research groups,

two questions affecting its quality should be taken into consideration: genome

annotation and sequence quality (Kaas et al. 2012). Although we avoided the bias by

231

Capítulo 5

assembling and predicting CDS from all reference genomes using Velvet (Zerbino

2010) and Prodigal software (Hyatt et al. 2010), the quality of the sequences likely

varies.

As previously observed (Kaas et al. 2012), the core genome tree was highly consistent

with MLST data as well as with the phylogroupal distribution of our bacterial

collection. Only ST767, ST939, ST5869 and ST7632 fit inside other ST clusters. ST767

and ST7632 are single locus variants of ST58 and ST10, respectively, which explain

their close relation. ST224 clade is split by ST939, which shows also a single locus

change, and ST5869. This latter, surprisingly, shared only mdh and purA alleles with

ST224, a fact that remarks the higher resolution of WGS data. Although MLST is

highly discriminatory, discordant relationships might be attributed to recombination

events in MLST loci.

Regarding the distinct clusters of the tree, most of them contained strains recovered

from different sources and distant locations. Further, in many cases, the SNP number

was significantly lower between strains from different hosts than within members of the

same species. We can point out various examples observed among some of the most

populated tree branches (ST10, ST58, ST224 and ST131 clusters). For instance, in

ST58 clade, with an average of 269.6 SNPs between its members, the C7030 strain

belonging to a rodent showed the closest relationship with the human origin strain

ERS1801995 (33 SNPs). A similar observation was reported among members of the

widely distributed ST10 (SNP average: 689.5). The core genome of C6842 isolate

(rodent, Spain) shared more similarities with MOD1-EC6577 (bovine, Canada) than

with other E. coli from wildlife hosts. More remarkable was the extremely low number

of SNPs (≤10) that differentiated C7328 strain (deer, Spain) from others belonging to

humans (HE-MDREc53, USA; MOD1EC5135, USA; Ecol582, USA), poultry

(NC_P10-04, Uganda) or sewage (JSWP021, Japan), even more considering the average

SNP within ST224 (n꞊466.0). That was also the case (≤10 SNP) between C7970 (wild

boar, Spain) and HVH 177 (human, Denmark), two members of the major ST131

cluster (SNP average꞊201.3). Thus, no clear evidence of adaptive mutations associated

to the core genome were found in strains from different hosts. Although further studies

with a more homogeneous dataset are required to generalize this assumption, our results

reflect an on-going inter-host transmission of E. coli strains. Adaptation to host

environment does not seem to leave a genetic mark in the bacterial core genome.

232

Capítulo 5

3. 5. CONCLUDING REMARKS

This study contributes to better characterize the commensal gut niche from wildlife,

which is crucial for understanding the adaptive pathways and genome diversification of

E. coli, the role of different elements in bacterial fitness and the flow of genes and gene

modules among interconnected ecosystems. Whole genome sequencing enables a more

consistent characterization of the composition and diversity of the plasmidome,

facilitating the study of small replicons, the differentiation of extra-chromosomal

phages or phage-like elements and the detection of non-typeable plasmids. Further, it

offers a general view of different genomic regions related to immunity, phylogeny,

pathogenesis or resistance, which favors more robust assumptions than those make on

the basis of a few set of genes screened by conventional methods.

Our analyses seem to rule out the occurrence of a parallel evolution of the E. coli

genome in the gut of wild animals. Bacteria from humans or highly human-influenced

settings exhibit similar genetic patterns in CRISPR-Cas systems, plasmids or

virulence/resistance genes-carrying modules. These observations, together with the

absence of significant genetic changes in their core genome, suggest an ongoing flow of

both mobile elements and E. coli lineages between human and natural ecosystems.

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236

Capítulo 5

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237

Capítulo 5

Material suplementario al Artículo 8

239

Capítulo 5

Supp

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Capítulo 5

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241

Capítulo 5

Supp. Fig. S3. Phylogenetic tree constructed according to the concatenated amino acid sequences of the cas genes. Colour circles denote the different phylogenetic groups (dark blue: B1; red: A; green: D; pink: B2; light blue: Clade V). The concatenated cas-E genes of E. coli K-12 MG1655 are also included as reference.

242

Capítulo 5

Supp. Fig. S4. Phylogenetic tree constructed according to the nucleotide sequences of 21 putative iss genes from our E. coli collection. Some reference sequences used by Jonhson et al. 2008 to define the different iss alleles are marked with a red circle. Two reference sequences, distinctly associated with high (AF042279) and low (iss type13) serum livability by Xu et al. 2018, appear indicated with a blue circle.

243

DISCUSIÓN

245

Discusión

CAPÍTULOS 1 y 2

Los primeros capítulos de la presente tesis abordan, principalmente, la

epidemiología molecular de la resistencia en cepas de E. coli aisladas de alrededor de

500 muestras fecales/intestinales de fauna silvestre. En mamíferos, los resultados

globales muestran una baja-moderada tasa (11.1%) de portación de bacterias resistentes

a los antibióticos, observándose una clara predominancia de la resistencia a agentes

clásicos como la tetraciclina, la ampicilina o las sulfonamidas. La significativa

prevalencia de resistencias frente a estos antimicrobianos también se observa en

aislamientos de origen humano o de animales de producción (Guerra et al. 2003;

Navajas-Benito et al. 2007; Chirila et al. 2017), probablemente debido al uso

prolongado y masivo que se ha hecho de los mismos en el ámbito veterinario y/o

médico. La Tabla 9 reune algunas características de los aislamientos de E. coli que

mostraron un fenotipo resistente a al menos un antibiótico del total de las 234 cepas

recuperadas de mamíferos salvajes en esta tesis.

En general, la prevalencia de bacterias resistentes detectada en nuestra colección

de mamíferos silvestres es comparable a la reportada en otros estudios llevados a cabo

en pequeños mamíferos y rumiantes salvajes (Silva et al. 2010; Literak et al. 2010b).

Sin embargo, es inferior a la descrita en animales domésticos (Wieler et al. 2011),

animales de producción (Ben Sallem et al. 2012; Dierikx et al. 2013) o incluso, en base

a algunos trabajos, grandes mamíferos silvestres como jabalíes (Poeta et al. 2009;

Literak et al. 2010b) o zorros (Radhouani et al. 2012). Estas variaciones en la

prevalencia de bacterias resistentes a los antibióticos pueden deberse a diversos factores,

como diferencias geográficas, grado de influencia antrópica o hábitos alimenticios de la

especie hospedadora (Allen et al. 2010).

Por un lado, la exposición directa de los animales de granja y mascotas a los

antimicrobianos, así como el contacto estrecho de los mismos con el entorno humano

explican las altas tasas de colonización por bacterias resistentes que muestran estos

animales. El uso masivo de antibióticos en cerdos y aves de corral ha demostrado

ejercer un efecto directo en la selección de bacterias resistentes en la microbiota

intestinal de estos hospedadores (Agersø y Aarestrup, 2013; Chantziaras et al. 2014).

Los animales silvestres, en cambio, no suelen ser tratados con antimicrobianos, pero

pueden exponerse a ellos, en menor o mayor medida, de forma indirecta. En general, se

246

Discusión

considera que existe una relación entre el grado de comportamiento sinantrópico de la

especie animal y la prevalencia de portación de bacterias resistentes (Allen et al. 2010).

Se ha observado, por ejemplo, que ratones que habitan en las proximidades de granjas

muestran una mayor tasa de colonización por bacterias multirresistentes que aquellos

que residen en entornos naturales (Kozak et al. 2009; Allen et al. 2011). Asimismo, la

dieta parece influir en la composición de la microbiota del hospedador. El aislamiento

de E. coli resistente a antibióticos parece estar más asociado a animales de hábitos

omnívoros o carnívoros, lo que sugiere que la resistencia bacteriana puede seguir un

patrón de acumulación trófica en la cadena alimenticia (Jobbins y Alexander 2015).

En relación con los mecanismos genéticos implicados en la resistencia a

tetraciclina, en concordancia con otros estudios, los genes codificantes de las bombas de

expulsión tet(A) y tet(B) mostraron estar ampliamente distribuidos en cepas de E. coli

procedentes de mamíferos salvajes (Bryan et al. 2004; Costa et al. 2008; Silva et al.

2010). Con respecto a la resistencia a ampicilina, el gen codificante de la β-lactamasa

TEM-1 (variantes blaTEM-1a y blaTEM-1b) fue detectado en la mayoría de los aislados, si

bien en algunos casos no pudo determinarse el mecanismo involucrado en cepas con

fenotipo resistente. La resistencia a sulfonamidas se identificó en aislamientos

portadores de los genes sul2, sul1 (en muchos casos, presentes en combinación) y, en

menor medida, sul3. En general, los determinantes sul1 y sul3 demostraron formar parte

de la región 3’CS de integrones de clase 1. En las cepas de E. coli aisladas de

mamíferos salvajes, la mayoría de los integrones de clase 1 portaban el gen cassette

aadA1 (que confiere resistencia a estreptomicina) sólo o en combinación con el GC de

resistencia a trimetoprim dfrA1. Ambos arreglos genéticos (intI1-aadA1-3’CS; intI1-

aadA1-dfrA1-3’CS) están también ampliamente diseminados en cepas de origen

humano (Vinué et al. 2009), animales de granja (Guerra et al. 2003) y medio ambiente

(Ben Said et al. 2016; Navajas-Benito et al. 2016). La resistencia a quinolonas en cepas

procedentes de mamíferos estuvo mediada en todos los casos por mutaciones

cromosómicas en los genes codificantes de las topoisomerasas gyrA y parC. No se

detectaron determinantes genéticos de naturaleza plasmídica (genes PMQR). La

presencia de cepas de E. coli PMQR-positivas sólo ha sido reportada de forma

esporádica en mamíferos salvajes terrestres (gorilas -gen qepA-, jabalíes –gen qnrS1/S3-

y conejos –gen oqxAB-) y acuáticos (delfines –gen aac(6’)-Ib-cr) (Dotto et al. 2014;

Janatova et al. 2014; Jones-Dias et al. 2016a; Wasyl et al. 2018).

Discusión

247

Tab

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dos.

248

Discusión

Sin embargo, en concordancia con nuestros resultados y como se mencionará

posteriormente, la presencia de cepas de E. coli portadoras de genes PMQR es más

frecuente en aves salvajes (Wang et al. 2017).

La Tabla 10 muestra las 21 cepas de E. coli aisladas tanto de aves como de

mamíferos silvestres que mostraron resistencia a cefalosporinas de tercera generación.

De acuerdo con nuestros resultados, el 1.4% (5/358) de los mamíferos y el 16%

(16/100) de las aves fueron portadoras de E. coli resistente a cefalosporinas de 3ª

generación (Figura 32). Considerando exclusivamente los mecanismos genéticos

adquiridos (BLEE y AmpC plasmídico), los porcentajes se reducen ligeramente al 1.1%

y 15% de mamíferos y aves, respectivamente. Las primeras cepas productoras de BLEE

en fauna silvestre se identificaron por primera vez en el año 2006 (Costa et al. 2006), y

desde entonces su detección ha sido reportada de forma creciente (Poeta et al. 2008;

Dolejska et al. 2009; Literak et al. 2009; Poeta et al. 2009; Bonnedahl et al.2010;

Guenther et al. 2010a; Literal et al. 2010a; Literak et al. 2010b; Pinto et al.2010;

Radhouani et al. 2010; Simões et al. 2010; Wallensten et al .2010; Garmyn et al 2011;

Guenther et al. 2011; Ho et al. 2011; Silva et al. 2011; Gonçalvez et al. 2012; Guenther

et al. 2012; Hasan et al. 2012; Poirel et al. 2012; Stephan y Hächler, 2012; Tausaova et

al.2012; Hernández et al. 2013; Loncaric et al. 2013; Radhouani et al. 2013; Veldman

et al. 2013; Bonnedhal et al. 2014; Hasan et al. 2014; Báez et al. 2015; Bonnedhal et al.

2015; Ho et al. 2015; Jamboroba et al. 2015; Atterby et al. 2016; Liakopoulous et al.

2016; Loncaric et al. 2016; Parker et al. 2016; Schaufler et al. 2016; Bachiri et al.

2017a). Las Tablas 11 y 12 resumen los principales resultados (prevalencia, variantes

enzimáticas y secuencias tipo) de las publicaciones en las que se han detectado cepas de

E. coli productor de BLEE/pAmpC en aves y mamíferos silvestres, respectivamente.

Como se aprecia, en ambos grupos de animales la prevalencia de E. coli BLEE/pAmpC

varía significativamente de un estudio a otro, oscilando en aves entre un 0.5% y un 54%

(=14.0%) y en mamíferos terrestres entre un 0.5% y un 33% (=6.5%). Estas

variaciones pueden deberse a diferencias en la metodología aplicada durante el

muestreo o en el aislamiento de las cepas BLEE/pAmpC (p. ej.. uso de medios

selectivos), así como a factores ya descritos anteriomente (área geográfica en estudio,

comportamiento sinantrópico de la especie, dieta…) (Allen et al. 2010). Nuestros datos

de prevalencia en aves superan ligeramente la media global, mientras que la tasa de E.

coli BLEE/pAmpC en la colección de mamíferos analizada en esta tesis es inferior a la

Discusión

249

Tab

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.

250

Discusión

registrada para este grupo de animales. Aunque cabe reseñar que, hasta la fecha, los

estudios en aves son mucho más abundantes que los llevados a cabo en mamíferos

silvestres, nuestros resultados avalan la consideración actual de las aves salvajes como

importantes reservorios y vehículos de cepas E. coli BLEE/pAmpC.

En este sentido, merece especial mención la detección de E. coli BLEE/AmpC

en el 44.4% de las cigüeñas (4/9), el 57.1% de los milanos (4/7) y el 21.4% de los

buitres (3/14). Las cigüeñas comparten hábitat con los humanos a la hora de anidar o

alimentarse, aprovechando zonas de cultivos, pastizales o incluso vertederos

periurbanos. La limitada disponibilidad de recursos tróficos también ha promovido que

muchas rapaces diurnas, como los buitres y milanos, consuman restos orgánicos

provenientes de vertederos. Así, la detección de cepas multirresistentes en estas aves

resulta especialmente preocupante por el importante rol que podrían ejercer como

vectores de estas bacterias entre el entorno urbano, ganadero y natural.

Las aves de presa han sido identificadas por otros autores como importantes

reservorios de bacterias E. coli BLEE tanto en países densamente poblados de Europa

(Costa et al. 2006; Pinto et al. 2010; Guenther et al. 2012), como en áreas semi-

desérticas y remotas (Guenther et al. 2012). Un estudio comparativo llevado a cabo en

Alemania y el desierto de Gobi (Mongolia) encontró tasas similares de E. coli BLEE en

rapaces procedentes de ambas regiones geográficas, lo que sugiere que la migración de

las aves también puede contribuir de forma significativa a la diseminación de bacterias

resistentes a áreas menos influenciadas por el ser humano (Guenther et al. 2012).

Figura 32. Número y animales (aves y mamíferos) portadores de E. coli BLEE/AmpC, así como distribución y tipo de variantes implicadas.

Discusión

251

Además, la dieta de las aves de presa las sitúa en la cima de la cadena alimenticia lo

que, como ya se ha mencionado, añade el factor de acumulación trófica de las

resistencias.

Como refleja la Tabla 11, las gaviotas han sido otro de los grupos de aves más

estudiadas y relacionadas con la portación de cepas BLEE y pAmpC (Poeta et al. 2008;

Dolejska et al. 2009; Bonnedalh et al. 2009; Bonnedalh et al. 2010; Hernández et al.

2010; Literak et al. 2010; Simões et al. 2010; Wallensten et al. 2011; Poirel et al. 2011;

Hernández et al. 2013; Bonnedahl et al. 2014; Hasan et al. 2014; Báez et al. 2015;

Bonnedahl et al. 2015; Atterby et al. 2016; Liakopoulous et al. 2016). En nuestra

colección de aves solamente se incluyó un animal perteneciente a este grupo, del que

además se aisló una cepa de E. coli productora de β-lactamasa plásmidica de tipo

AmpC. Este resultado avala lo observado en otro estudio llevado a cabo en EEUU que

señala a las gaviotas no sólo como importantes reservorios de cepas BLEE, sino

también de E. coli pAmpC (Poirel et al. 2012). La adquisición de bacterias, por parte de

estas aves, a partir de basureros y plantas de tratamiento de aguas residuales ya ha sido

demostrada por algunos autores (Nelson et al. 2008). La elevada concentración de

residuos biológicos y sanitarios originados por el ser humano que se acumulan en estas

instalaciones podría explicar, en parte, la alta prevalencia de bacterias resistentes a

antibióticos de importancia clínica detectada en gaviotas.

En cuanto a la diversidad enzimática, entre las 17 cepas BLEE aisladas tanto de

aves como de mamíferos se detectaron 10 pertenecientes a la familia SHV (58.8%) y 7 a

la familia CTX-M (41.2%). Estos resultados difieren de los observados en la mayoría de

los estudios llevados a cabo en fauna salvaje, así como en el ámbito humano y

veterinario, donde en la mayoría de los casos prevalecen las enzimas de tipo CTX-M,

concretamente las del grupo 1 (CTX-M-15 y CTX-M-1) (Guenther et al. 2011; Wang et

al. 2017). En nuestra colección, las variantes más frecuentes dentro de la familia CTX-

M fueron la CTX-M-1 seguida de la CTX-M-14, aunque la producción de BLEE se

asoció en la mayoría de los casos a la enzima SHV-12 (Figura 32). Estos resultados

parecen reflejar variaciones geográficas ya que, si bien en la actualidad la enzima CTX-

M-15 es la predominante a nivel mundial en humanos, la detección de cepas E. coli

productoras de SHV-12 y CTX-M-14 ha sido muy significativa en nuestro país tanto a

nivel comunitario y hospitalario (Vinué et al. 2009; Díaz et al. 2010; Blanco et al. 2013;

252

Discusión

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Discusión

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Discusión

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Discusión

255

Fernández-Reyes et al. 2014; Merino et al. 2016), como en aves de granja y alimentos

derivados (Briñas et al. 2003; Briñas et al. 2005; Egea et al. 2012; Ojer-Usoz et al.

2013). Si comparamos los tipos de BLEE obtenidos en nuestra colección de fauna

silvestre con los descritos en un estudio anterior en cepas de origen humano, veterinario

y carne mayormente avícola recolectadas en La Rioja entre los años 2008-2011,

observamos muchas menos diferencias que en la comparativa mundial de aislamientos

de origen silvestre (Somalo, 2013). Asimismo, resultados comparables a los nuestros se

han reportado en otro trabajo llevado a cabo en Galicia en cepas procedentes de aves y

mamíferos salvajes, si bien en este último estudio se observó una mayor diversidad

enzimática probablemente en relación con la alta prevalencia de BLEEs detectada

(Viso, 2017) (Figura 33). En definitiva, los datos obtenidos en animales salvajes

parecen reflejar las tendencias previamente descritas en el ámbito humano y veterinario

de una determinada área geográfica. Esto sugiere que futuros estudios epidemiológicos

llevados a cabo en fauna silvestre en nuestro país podrían mostrar un aumento en la

prevalencia de CTX-M-15, como consecuencia de la expansión de clones productores

de esta enzima actualmente pandémicos en humanos (p. ej. ST131, ST405…).

En cuanto a las cepas de aves y mamíferos que mostraron un fenotipo AmpC (5,

23.8%), en tres de los casos éste estuvo mediado por mutaciones en el promotor del gen

cromosómico ampC y en dos casos por la expresión de β-lactamasas plasmídicas. En las

tres cepas hiper-productoras de AmpC cromosómico se detectaron mutaciones en las

posiciones -42, -18, -1 y +58 de la región promotora del gen ampC. Destaca la

Figura 33. Distribución de enzimas BLEE en nuestra colección de E. coli aisladas de fauna salvaje, en otra colección de Galicia (Viso, 2017) y en cepas de distintos orígenes aisladas en La Rioja (Somalo, 2013).

256

Discusión

transición C→T en posición -42, que da lugar a un promotor alternativo desplazado y

contribuye de forma sustancial al incremento de la expresión del gen ampC (Trac et al.

2007). Con respecto a las dos cepas pAmpC, aisladas de un erizo y de un milano, ambas

expresaron la beta-lactamasa plasmídica CMY-2, considerada la más diseminada a nivel

mundial en enterobacterias de origen ambiental, ganadero y humano (Wang et al. 2017).

Merece la pena señalar que no se detectaron cepas de E. coli resistentes a

carbapenemas en nuestra colección de fauna silvestre. Las cepas resistentes a estos

antibióticos de última línea se han detectado de forma creciente a nivel internacional en

enterobacterias de origen humano y animales domésticos (Guerra et al. 2014). En fauna

salvaje la primera descripción data de 2013, en una cepa de Salmonella enterica

productora de NDM-1 aislada de un milano negro (Fischer et al. 2013). Posteriormente,

se han reportado cepas de E. coli portadoras de blaVIM y blaIMP en numerosas gaviotas

en Francia y Australia, respectivamente (Vittecoq et al. 2016; Dolejska et al. 2016).

Recientemente, también se ha publicado el aislamiento de E. coli y Klebsiella

pneumoniae OXA-48 a partir de muestras fecales de jabalíes en Algeria (Bachiri et al.

2018). En nuestro país, la diseminación de enterobacterias productoras de

carbapenemasas en el entorno natural también parece estar emergiendo, pues ya se ha

reportado la coexistencia de los genes blaKPC-2 y blaVIM-1 en dos cepas de E. coli no

relacionadas clonalmente, aisladas de gaviotas patiamarillas en Cataluña (Vergara et al.

2017). En la mayoría de los casos, se ha sugerido un probable origen antropogénico,

muchas veces asociado a la contaminación de aguas superficiales y sedimentos. De

hecho, se ha detectado la presencia de enterobacterias productoras, e incluso

coproductoras, de distintas carbapenemasas en el ecosistema fluvial del área

metropolitana de Barcelona (Pedra-Carrasco et al. 2017).

Precisamente la creciente incidencia de infecciones por bacterias resistentes a

carbapenemas ha promovido, como último recurso, regímenes terapéuticos basados en

el uso de colistina. Así pues, el descubrimiento en 2015 del gen plasmídico mcr-1, que

confiere resistencia a colistina, encendió todas las alarmas (Liu et al. 2016). Su

diseminación se ha asociado al empleo intensivo de polimixinas en la crianza de

animales de consumo, lo que parece lógico a la vista de la significativa prevalencia de

este gen en cerdos y aves de corral (Li et al. 2018; Maamar et al. 2018). Dada la

relevancia actual del gen mcr-1, llevamos a cabo un screening molecular para su posible

detección en nuestra colección completa de E. coli de fauna salvaje. Todas las cepas

Discusión

257

fueron negativas para dicho gen, si bien es necesario puntualizar que posteriormente se

han descrito nuevas variantes (mcr-2, mcr-3,…) que no han sido testadas en esta tesis

(Xavier et al. 2016; Yin et al. 2017). En la literatura, aunque muy escasos todavía,

existen algunos reportes de cepas productoras de MCR-1 en gaviotas (Argentina), en

macacos (Algeria) y en un zorro (España) (Liakopoulos et al. 2016a; Bachiri et al.

2017b; Viso, 2017). Todo ello sugiere que, de no establecerse medidas de control, la

presencia de genes de resistencia a colistina, al igual que carbapenemas, en fauna

salvaje será cuestión de poco tiempo. Además, la presencia de genes mcr se ha descrito

mayormente en cepas co-productoras de BLEEs, por lo que su expansión en el entorno

natural conllevaría a una situación ciertamente preocupante.

Los fenómenos de coselección debidos a la administración de antimicrobianos

distintos a los β-lactámicos en medicina humana y veterinaria parecen contribuir de

forma significativa a la diseminación de cepas BLEE en el entorno natural. El 82.3% de

las cepas de E. coli BLEE detectadas en este estudio mostraron un fenotipo MDR

(multidrogo resistente), con un alto porcentaje de cepas (>70%) resistentes a quinolonas

y tetraciclina y una moderada tasa (20-50%) resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol,

cloranfenicol y aminoglucósidos de importancia médica (gentamicina y tobramicina).

La co-resistencia de cefalosporinas de amplio espectro y quinolonas y/o

aminoglucósidos es especialmente preocupante en el ámbito clínico.

Sin ir más lejos, la terapia combinada aminoglucósido/β-lactámico está indicada

en ciertos pacientes de alto riesgo y en infecciones graves. Sin embargo, algunos

trabajos evidencian altas tasas de resistencia a gentamicina y tobramicina en cepas de E.

coli productoras de BLEE (Balkhed et al. 2013; Haldorsen et al. 2014),

fundamentalmente CTX-M-15 y, en menor medida, SHV-12 (Haldorsen et al. 2014;

Robin et al. 2017). La acetiltransferasa AAC(3)-II ha sido identificada en muchos

estudios europeos como la enzima modificante de aminoglucósidos más prevalente en

aislamientos clínicos de E. coli (Balkhed et al. 2013; Miró et al. 2013; Haldorsen et al.

2014) y la principal responsable de la co-resistencia frente a gentamicina y tobramicina.

Asimismo, aac(3)-II fue también el gen de resistencia a aminoglucósidos predominante

en nuestra colección de cepas E. coli-BLEE procedentes de animales silvestres, seguido

muy de lejos por aac(6’)-Ib (también denominado aacA4). Este último codifica una

enzima capaz de acetilar la amikacina, si bien se ha observado que en muchos casos las

cepas portadoras de aac(6’)-Ib no expresan fenotípicamente resistencia frente a este

258

Discusión

antibiótico (Lindemann et al. 2011; Balkhed et al. 2013; Haldorsen et al.2014). Este

mismo fenómeno observamos en una cepa aislada de cigüeña productora de SHV-12 y

portadora de un integrón de clase 1 en cuya región variable se localizó aac(6’)-Ib. La no

expresión de resistencia a amikacina en este caso podría explicarse tanto por una

reducida actividad de la acetilasa como por mutaciones que inactiven el promotor del

integrón portador del gen cassette aac(6’)-Ib. Esta última hipótesis parece plausible si

consideramos que la cepa tampoco mostró resistencia al cloranfenicol, a pesar de la

presencia del gen cassette catB3 en la segunda posición de la región variable del

integrón. Por otro lado, a diferencia del gen aac(6’)-Ib, frecuentemente asociado a

plásmidos transferibles portadores de genes blaCTX-M-15 (Carattoli et al. 2009), el

determinante aac(3)-II raramente coexiste en el mismo plásmido con genes BLEE

(Miró et al. 2013; Haldorsen et al. 2014). Los ensayos de conjugación y

electrotransformación in vitro llevados a cabo en esta tesis en las 3 cepas de E. coli

portadoras de blaSHV-12 y aac(3)-II mostraron que estos genes no eran co-transferibles lo

que indica que no se localizan en el mismo elemento genético movilizable.

En cuanto a la resistencia a quinolonas, los datos obtenidos muestran que en

animales salvajes el fenotipo de resistencia a ácido nalidíxico sólo o en combinación

con ciprofloxacino, se relaciona fundamentalmente con la presencia de mutaciones

cromosómicas en los genes de las topoisomerasas. Cabe destacar que el 66.7% de las

cepas resistentes a cefalosporinas de amplio espectro mostraron alteraciones

aminoacídicas tanto en GyrA (S83L y/o D87N) como en ParC (mayormente, S80I y con

menor frecuencia, S80R o S80I + E84V). En general, la presencia de alteraciones de

segundo escalón en ParC se asoció, como cabía esperar, a resistencia de alto nivel a

fluoroquinolonas (ciprofloxacino). El genotipo claramente predominanate entre las

cepas E. coli BLEE procedentes de animales salvajes fue, tal y como se observa en el

entorno clínico, GyrA S83L/D87N + ParC S80I. Un trabajo publicado recientemente ha

demostrado, combinando modelos matemáticos con datos experimentales, que en

presencia de un amplio rango de concentraciones de ciprofloxacino esta triple

sustitución aminoacídica supone una ventaja adaptativa para la bacteria en comparación

con otros genotipos (Huseby et al. 2017). La adquisición de estas mutaciones, que es

preferencialmente aditiva y alternativa siguiendo el orden GyrA S83L →ParC S80I

→GyrA D83N, se da como consecuencia de un balance positivo entre eficacia biológica

o fitness y resistencia (Huseby et al. 2017). Así, el estudio describe una evidente

Discusión

259

tendencia hacia la selección de esta triple mutación en la evolución de la resistencia a

ciprofloxacino, lo que explicaría el éxito y la persistencia de este genotipo incluso en

ausencia de presión antibiótica. A su vez, los ensayos in vitro indican que las

alteraciones genéticas posteriores que permiten incrementar la CMI del ciprofloxacino

hasta en 30 diluciones por encima del punto de corte establecido en las guías clínicas

(≥4 μg/mL según CLSI; ˃0.5μg/mL según EUCAST) son más variables, pudiendo

afectar tanto a bombas de eflujo como a posiciones adicionales en parC/parE (Huseby

et al. 2017). Sin embargo, algunos autores sugieren, en base a los datos clínicos, que la

cuarta sustitución aminoacídica (ParC E84V) que caracteriza a las cepas ciprofloxacino-

resistentes pertenecientes al clon epidémico ST131-H30 debe actuar como mutación

compensatoria que favorezca el fitness de la bacteria (Fuzi et al. 2017). Precisamente, la

única cepa de E. coli de nuestra colección (C7399), aislada de un milano, que mostró

doble mutación en ambas topoisomerasas (GyrA: S83L+D87N; ParC: S80I+E84V)

pertenecía a dicho clon, lo que concuerda con estudios previos en humanos y animales

de compañía y sostiene la asociación de este patrón de sustituciones aminoacídicas con

la línea genética ST131-H30 (Platell et al. 2011; Mavroidi et al. 2012).

Aunque se ha descrito una correlación entre el número de cambios en las

proteínas GyrA y ParC y el nivel de resistencia a quinolonas en E. coli, la implicación

de otros mecanismos genéticos también puede modular la expresión fenotípica de

resistencia y el fitness bacteriano (cambios en la permeabilidad, bombas de expulsión,

presencia de genes PMQR…) (Sáenz et al. 2003). En este sentido, cabe destacar la

presencia del gen plasmídico qnrS1 en una cepa aislada de una lechuza (C7581) que

también presentó doble mutación en gyrA (S83L+D87N). Este genotipo con doble

sustitución en GyrA y ausencia de cambios en ParC desobedece el clásico patrón de

mutaciones alternativas gyrA/parC, aunque se ha descrito ocasionalmente en

aislamientos de humanos (Namboori et al. 2011). Según ensayos in vitro con cepas

isogénicas la segunda mutación D87N en gyrA muestra también un balance positivo en

el fitness bacteriano pero, en ausencia de mecanismos adicionales, no confiere un

fenotipo clínico de resistencia a ciprofloxacino (Machuca et al. 2014). Sin embargo, la

co-expresión del gen qnrS1, por sí mismo relacionado con una leve reducción de

sensibilidad, podría amplificar el efecto de la doble mutación en gyrA y explicar el

fenotipo intermedio/resistente (CMI=2 μg/mL) (categorización variable dependiendo de

los puntos de corte del CLSI o EUCAST, respectivamente) que muestra la cepa C7581.

260

Discusión

Desde su primera descripción en 1998 (Martínez-Martínez et al. 1998), la prevalencia

de E. coli portadora de genes qnr, especialmente qnrS1, ha aumentado

significativamente tanto en el ámbito clínico como en el veterinario (Liu et al. 2012;

Jones-Diaset al. 2013; Rodríguez-Martínez et al. 2016). Asimismo, el gen qnrS1 se ha

detectado frecuentemente en aves silvestres fundamentalmente acuáticas, como

gaviotas, ánades o cormoranes (Literak et al. 2010; Tausova et al. 2012; Veldman et al.

2013; Oh et al. 2016), aunque también en grajos (Jamboroba et al. 2015) y, en nuestro

caso, una lechuza. La detección de este gen en cepas de aves acuáticas se ha relacionado

con su origen, que se atribuye a determinantes cromosómicos presentes en especies

bacterianas ambientales como Vibrio splendidus (Cattoir et al.2007). Sin embargo, la

selección y diseminación de este determinante PMQR en cepas de E. coli tanto del

entorno humano como ambiental, puede haberse visto favorecida por diversos factores.

En primer lugar, se ha demostrado que, a diferencia de otros genes qnr, la presencia de

qnrS1 sólo o en combinación con mutaciones cromosómicas en las topoisomerasas no

sólo no conlleva un coste biológico, sino que mejora el fitness bacteriano (Machuca et

al.2014). Además, dada su naturaleza plasmídica, los genes qnr pueden transferirse

horizontalmente, confiriendo generalmente a la cepa receptora un fenotipo reducido de

sensibilidad a ciprofloxacino. Sin embargo, la expresión fenotípica de la resistencia

puede verse incrementada por el número de copias del plásmido en el que se localiza el

gen o por diferentes mecanismos que controlen la expresión génica (Garoff et al. 2018).

Por otro lado, la frecuente asociación de genes qnr con otros determinantes de

resistencia a antibióticos (p. ej. genes bla) facilita la co-selección de estas cepas

incrementendo su probabilidad de diseminación (Carattoli et al. 2009). Se ha observado

incluso que diferentes condiciones fisiológicas (anaerobiosis, pH urinario) pueden

favorecer la selección y supervivencia de cepas portadoras de genes qnrS1 en presencia

de altas concentraciones de ciprofloxacino (Martínez-Gutierrez et al. 2017).

Por otra parte, el fenómeno de la MDR se asocia a menudo con la presencia de

integrones, fundamentalmente de clase 1 y, en menor medida, de clase 2 (Leverstein-

van Hall et al. 2003). Los integrones pueden proporcionar por sí mismos una ventaja

adaptativa a la bacteria huésped mediante la expresión de genes cassettes que le

confieran capacidades extra y favorezcan su supervivencia en un determinado

ecosistema. Sin embargo, también pueden ser co-seleccionados por la presencia de otros

genes de resistencia a antibióticos, metales o determinantes de otra naturaleza

Discusión

261

localizados en plásmidos o transposones a los que habitualmente se hallan asociados los

integrones, constituyendo complejas plataformas genéticas que facilitan su estabilidad,

selección y dispersión entre distintas bacterias (Stalder et al. 2012). Esto explicaría, en

parte, la mayor diversidad de arreglos genéticos detectados en los integrones de clase 1

presentes en las cepas E. coli BLEE/pAmpC positivas de nuestra colección, en

comparación con las BLEE/pAmpC negativas. En estas últimas, como ya mencionamos,

sólo detectamos arreglos con un máximo de 2 genes cassettes, concretamente aadA1

(resistencia a estreptomicina y espectinomicina) sólo o en combinación con dfrA1

(resistencia a trimetroprim). Estos integrones de clase 1, ampliamente distribuidos en el

ecosistema humano, animal y natural, contenían la región 3’-CS clásica que confiere

además resistencia a compuestos de amonio cuaternario (qacE∆1) y sulfonamidas (sul1)

(Guerra et al. 2003; Vinué et al. 2009; Ben Said et al. 2016).

Por el contrario, se observó una considerable diversidad en cuanto a arreglos y

número de genes cassettes en los integrones presentes en cepas productoras de

BLEE/pAmpC aisladas de aves y mamíferos en esta tesis. Concretamente, se

identificaron genes cassettes de resistencia frente a las siguientes familias de

antibióticos: β-lactámicos (blaPSE-1), aminoglucósidos (aadA1, aadA2, sat2, acc(6’)-Ib),

trimetoprim (dfrA1, dfrA16) y cloranfenicol (cmlA, catB3). Otros, como estX o psp, son

considerados GCs putativos de proteínas esterasas y fosfatasas, respectivamente, cuya

capacidad para inactivar compuestos antimicrobianos no ha sido establecida hasta la

fecha (Partridge y Hall, 2005). En total, los cassettes identificados constituyeron 5

combinaciones de arreglos genéticos en la estructura variable de los integrones de clase

1 y un único arreglo en los integrones de clase 2 (Tabla 10). Entre los integrones de

clase 1 clásicos, asociados a sul1, además del ya mencionado arreglo dfrA1-aadA1,

ampliamente distribuido tanto en cepas BLEE positivas como BLEE negativas, se

detectó una estructura que no pudimos identificar por cartografía genética y otra

compuesta por los genes cassettes aac(6’)-Ib-catB3-dfrA1. Este último arreglo, poco

frecuente, ha sido reportado únicamente en cepas de E. coli en China, aisladas de

muestras clínicas humanas (Sun et al. 2013) y ganado bovino (Wang et al. 2008), así

como de aguas superficiales de río (Su et al. 2012). Sin embargo, entre las cepas

productoras de BLEE de nuestra colección de animales salvajes predominaron los

integrones de clase 1 inusuales, asociados a sul3. El más prevalente fue intI1-estX-psp-

aadA2-cmlA1-aadA1-qacI-IS440-sul3. Este integrón ha sido frecuentemente descrito en

262

Discusión

cepas MDR pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, asociado a transposones de

la familia Tn21 portadores de un operón de resistencia a mercurio (Curiao et al. 2011;

Alonso et al. 2017; Reid et al. 2017). Otro arreglo genético ligado a la región 3’CS

atípica, identificado en una cepa productora de CTX-M-1 aislada de un ciervo, fue

dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA1-aadA1-qacI. Esta estructura, descrita recientemenete en

China en una cepa de Acinetobacter spp. de origen acuático (río Jiulong) (Lin et al.

2015), se identificó posteriormente en una cepa de E. coli portadora de los genes blaCTX-

M-15 y mcr-1 aislada de una muestra perirectal de un paciente estadounidense (Snesrud et

al. 2017). Como se observa en los integrones de clase 1 inusuales descritos en este y

otros trabajos, la presencia de plataformas genéticas idénticas asociadas a sul3 (IS440-

sul3), muchas veces compartiendo incluso parte de la disposición de genes cassettes en

la región variable del integrón (aadA2-cmlA1-aadA1-qacI), sugiere la implicación de

eventos de recombinación homóloga entre integrones coexistentes en un mismo

microoganismo. Sin embargo, la adquisición de los genes cassettes dfrA16, blaPSE-1,

estX y psp también ha podido ocurrir por episodios independientes de escisión e

inserción en los sitios attC o attI (recombinación sitio-específica). Lo que parece

evidente, y discutiremos más en detalle en el próximo capítulo, es que la presencia de

estos integrones localizados generalmente en plásmidos en asociación con otros genes

de resistencia a antibióticos (genes bla, tet…), biocidas (genes qac), metales pesados

(operón merRTPCAD) u otros determinates metabólicos o de virulencia favorecen la

selección de bacterias MDR y su expansión en diversos ecosistemas.

En realidad, para comprender el flujo de E. coli BLEE/AmpC en la interfaz

humano-animal-medio ambiente siempre debemos de considerar las 2 principales vías

implicadas en la diseminación de la resistencia:

(a) La emergencia de clones exitosos.

(b) La transferencia horizontal de plásmidos portadores de los genes bla.

Con respecto al primer punto, las 21 cepas con fenotipo BLEE/AmpC de nuestra

colección de fauna silvestre mostraron una gran diversidad genética (18 STs distintos).

Solamente se identificaron en más de un hospedador las líneas genéticas ST155 (en un

milano real y un milano negro) y ST453 (en una cigüeña, un estornino y un cuco). Las 3

cepas de E. coli ST453 presentaron el mismo perfil de macrorrestricción-PFGE, lo que

sugiere su pertenencia a un mismo clon que podría persistir en una fuente o reservorio

Discusión

263

ambiental de la región geográfica en estudio (Aragón). El ST155 y otros asociados al

complejo clonal CC155, han sido frecuentemente identificados en cepas procedentes de

fauna silvestre. Jamborova et al. (2015), en un estudio en el que se caracterizaron 82 E.

coli BLEE aisladas de córvidos procedentes de 8 países europeos, describieron que el

69.5% de las mismas se englobaban en sólo 3 complejos clonales: CC10, CC155 y

CC131. En nuestra colección de BLEE/AmpC, además del ST155 (CC155), también se

detectaron cepas ST10 (CC10) y ST131 (CC131), si bien se observó una mayor

variabilidad genética, sin dominancia significativa de uno o varios complejos clonales

en particular. Cabe resaltar el aislamiento de una cepa de E. coli BLEE perteneciente al

subclon pandémico ST131-H30R en un milano. Este linaje es actualmente considerado

el más prevalente entre las cepas clínicas E. coli ExPEC, y además de resistencia a

cefalosporinas de amplio espectro también muestra resistencia a fluoroquinolonas. Su

detección, cada vez más frecuente, en cepas humanas de origen comunitario (den Reijer

et al. 2016; Cortés-Cortés et al. 2017), así como en aves silvestres (Wang et al. 2017) y

muestras de suelo y aguas (Ben Said et al. 2015; Ben Said et al.2016) resulta

preocupante y contribuye a la diseminación internacional de los genes blaCTX-M-15 y

blaCTX-M-14.

Atendiendo a la bibliografía, la mayoría de los STs identificados en la colección

de animales silvestres de esta tesis se han descrito también en muestras de humanos,

animales domésticos (de producción y compañía) y medio ambiente a nivel mundial y,

muchos de ellos, parecen relacionarse con la expansión de genotipos BLEE/pAmpC

entre diversos ecosistemas (ST131, ST10, ST155, ST224, ST38, ST156, ST23, ST744,

ST57) (d’Andrea et al. 2013; Dayet al. 2016; Dorado-García et al. 2017). El esquema

Full goeEBURST de la Figura 34 refleja esta teoría. En él se comparan los STs de las

cepas E. coli BLEE/pAmpC de fauna silvestre identificados en esta tesis con los STs de

cepas BLEE/pAmpC aisladas de humanos, perros y productos cárnicos en una tesis

anterior llevada a cabo en nuestro grupo de investigación (Somalo et al. 2013). Se

observa que 6 de los STs identificados en aislamientos de fauna salvaje (concretamente

ST131, ST10, ST155, ST224, ST38 y ST57) están también presentes en una o varias de

las colecciones de humanos, perros o alimentos. A la vista de los resultados, nuestro

estudio avala la existencia de linajes exitosos asociados a la diseminación y emergencia

de genes BLEE/pAmpC (Ewers et al. 2012; d’Andrea et al. 2013; Day et al.2016). Si no

fuera así, los plásmidos donde habitualmente se localizan los genes bla se distribuirían

264

Discusión

Figura 34. Esquema Full goeEBURST (software Phyloviz) que relaciona los STs obtenidos con el origen de las cepas de E. coli BLEE/pAmpC (fauna salvaje, humanos, perros, alimentos). Cada nodo representa un ST y su tamaño es proporcional al número de cepas pertenecientes al mismo. Aparecen unidos los nodos que presentan hasta 6 alelos distintos, siendo independientes aquellos que muestran los 7 locidiferentes.

de forma homogénea entre la población de E. coli, sin observarse un predominio de

determinados STs. Además, la detección de estos clones BLEE/pAmpC existosos en el

ecosistema natural sugiere que, probablemente, factores genéticos asociados al genoma

core contribuyen positivamente al metabolismo bacteriano y/o a la adquisición de

mecanismos compensatorios que favorezcan el mantenimiento de los plásmidos

portadores de genes bla. El estudio por WGS de los linajes BLEE/pAmpC dominantes

en entornos sometidos tanto a alta como a baja presión antibiótica podría aportar más

datos sobre la influencia del genoma core en la adquisición de plásmidos u otros

elementos genéticos movilizables asociados a resistencia.

Sin embargo, nuestros resultados también sugieren la posible emergencia de

ciertos linajes asociados a genotipos BLEE/AmpC en el entorno natural. Concretamente

3 de las cepas resistentes a cefalosporinas (BLEE, pAmpC e hiperproductora de AmpC)

aisladas de distintos mamíferos silvestres (un ciervo y dos erizos) mostraron nuevos STs

(ST4564, ST4996). A una de las cepas, a pesar de presentar una mutación en el alelo icd

Alimentos cárnicos Perros

Fauna salvaje

Humanos

Discusión

265

Figura 35. Distribución de genes bla en función del ST en cepas de E. coli procedentes de fauna silvestre (Tablas 11 y 12).

confirmada por secuenciación Sanger, no pudo asignársele número ST por cuestiones

metodológicas (la base de datos de MLST cambió a mediados de 2017 y los nuevos

registros exigían secuencias WGS). La descripción de estos nuevos clones en animales

silvestres podría reflejar una evolución adaptativa del genoma core (microevolución) en

relación con su nicho ecológico.

Aunque se ha intentado establecer una asociación ST/plásmidos/genes BLEE y

se ha demostrado la alta prevalencia de ciertas tendencias (p. ej. ST131/plásmidos

IncF/CTX-M-15) (Day et al. 2016), lo cierto es que los miembros de un mismo linaje

pueden portar diferentes plásmidos que codifiquen diferentes genes bla (Woodford et al.

2011). Los clones ampliamente distribuidos, son propensos a adquirir los plásmidos de

resistencia más prevalentes a nivel local. Así, el gráfico de la Figura 35, muestra la

diversidad de genes bla asociados a algunos STs descritos tanto en nuestro estudio

como en otros llevados a cabo a nivel mundial en fauna silvestre (datos extraídos de

Tablas 11 y 12).

Con respecto a la transmisión horizontal de los genes BLEE/pAmpC, ésta pudo

ser demostrada en todos los trabajos en los que realizamos ensayos de transferencia de

plásmidos (artículos 1, 4 y 5). Los genes bla fueron transferibles por conjugación y/o

transformación a una cepa de E. coli receptora en todos los casos. Además, pudimos

establecer las siguientes asociaciones plásmido/genes bla: IncN/blaCTX-M-1 (ciervo),

IncI1/blaCMY-2 (erizo), IncI1/blaSHV-12 (diversas especies de aves). En algunos

266

Discusión

transconjugantes con fenotipo BLEE se detectaron varios replicones, lo que impidió

identificar el plásmido que mediaba la transferencia de los genes implicados en dicho

perfil de resistencia.

La localización del gen codificante de la enzima CTX-M-1, en enterobacterias

de origen humano y ganadero, se ha vinculado mayoritariamente a los replicones IncI1 e

IncN (Carattoli, 2009; Jakobsen et al. 2015). En fauna salvaje, la información sobre

plásmidos portadores de genes BLEE/pAmpC es aún escasa, ya que en la mayoría de

los trabajos publicados no se han llevado a cabo estudios de caracterización y tipado de

replicones (Wang et al. 2017). Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados,

algunos estudios europeos han reportado la asociación IncN/blaCTX-M-1 en cepas

comensales de E. coli de ánades y cuervos (Literak et al. 2010a; Loncaric et al. 2013),

lo que indica que los plásmidos conjugativos IncN pueden ejercer un rol significativo en

la diseminación de blaCTX-M-1 entre el ecosistema humano y natural.

En cuanto a la localización plasmídica de blaCMY-2 en enterobacterias de origen

humano y animales domésticos, IncA/C e IncI1 se encuentran entre los principales

grupos de incompatibilidad descritos (Hopkins et al. 2006; Bortolaia et al. 2014;

Sidjabat et al. 2014). En aves salvajes, el gen blaCMY-2 se ha asociado mayoritariamente

a plásmidos conjugativos IncI1 y, en menor medida, a otros como IncF, IncB/O e IncK

(Poirel et al. 2012; Veldman et al. 2013). Hasta donde sabemos, el primer mamífero

silvestre portador de una cepa de E. coli productora de CMY-2 identificado a nivel

mundial es el erizo reportado en la presente tesis. Los ensayos de transferencia y tipado

nos permitieron asociar la producción de esta enzima pAmpC a la presencia de un

plásmido conjugativo IncI1 de 95 kb, lo que contribuye a ensalzar el papel de este tipo

de replicones en la diseminación de blaCMY-2 en el entorno natural. La asociación de este

gen a plásmidos IncA/C, tan frecuente en el entorno humano, no ha sido todavía

descrita en fauna salvaje. Este hecho podría sugerir una variación en el fitness del

replicón IncA/C en función del origen y características genéticas de la cepa

hospedadora, tal y como se ha sugerido para los plásmidos IncP1 (Humphrey et al.

2012) o ser un reflejo, simplemente, del menor número de estudios epidemiológicos

llevados a cabo en fauna silvestre.

Aunque de la diseminación de SHV-12 hablaremos más detalladamente después,

destacaremos aquí que la transferencia del gen codificante de la misma estuvo mediada

por plásmidos IncI1 en un estornino, un cuco y dos cigüeñas. Literak et al. (2010) y

Discusión

267

Veldman et al. (2013) reportaron igualmente la detección del gen blaSHV-12 localizado en

plásmidos IncI1 en cepas de E. coli procedentes de aves acuáticas. Más puntualmente,

en una barnacla cariblanca y en una gaviota reidora, esta enzima BLEE se ha

relacionado con replicones IncN e IncF, respectivamente (Veldman et al.2013).

Para explorar la dinámica bacteriana entre distintos ecosistemas, es también

importante conocer la estructura poblacional de la especie microbiana en estudio en

relación con su hospedador. Aunque en un primer momento E. coli se clasificó en

cuatro grupos filogenéticos (A, B1, B2 y D) (Clermont et al. 2003), los espectaculares

avances en el conocimiento de su genética acontecidos en las últimas décadas

permitieron reorganizar su estructura poblacional en 7 filogrupos (A, B1, B2, C, D, E y

F) de E. coli sensu stricto y 5 clados crípticos de Escherichia (clados I, II, III, IV y V)

(Clermont et al. 2013). Según este último esquema actualizado, el grupo filogenético A

se reclasifica en A y C, el grupo filogenético B2 en B2 y E, mientras que el D se

resuelve en D, B2, E y F. Los artículos 1, 2 y 4 de la presente tesis, fueron de los

primeros en aportar datos sobre la población comensal de E. coli en mamíferos salvajes

atendiendo al esquema ampliado de Clermont et al. 2013. Numerosos trabajos han

relacionado la abundacia relativa de los distintos filogrupos de E. coli con el área

geográfica en estudio, las condiciones climáticas y determinadas características de la

especie hospedadora, como son la dieta, la masa corporal o la morfología y flora

intestinal (Gordon y Cowling 2003; Tenaillon et al. 2010; O’Brien y Gordon, 2011), si

bien un reciente meta-análisis sobre la distribución filogenética de las cepas comensales

de humanos ha puesto en entredicho la existencia de correlación con algunos de estos

factores (Stoppe et al. 2017).

En general, exceptuando en jabalíes (artículo 2), el grupo filogenético

predominante entre las cepas comensales de E. coli de mamíferos silvestres de esta tesis

fue el B1. Este filogrupo ha sido descrito por algunos autores como el mejor adaptado al

entorno natural (Walk et al. 2007), y de acuerdo con nuestros resultados, como el más

prevalente en mamíferos herbívoros (Baldy-Chudzik et al. 2008; Carlos et al. 2010;

Mercat et al. 2016). En humanos, se observan variaciones en la distribución filogenética

de las cepas comensales, prevaleciendo actualmente el filogrupo B2 en los países

industrializados (Bailey et al. 2010; Tenaillon et al. 2010; Massot et al. 2016) y los

filogrupos A y B1 en países en vías de desarrollo (Unno et al. 2009; Li et al. 2010;

Lescat et al. 2013).

268

Discusión

Aunque descrito hace unos años, todavía son escasos los estudios basados en el

esquema ampliado de Clermont et al. (2013), por lo que no se dispone de mucha

información acerca de las características y distribución de los filogrupos menores (C, E

y F) y los clados crípticos de Escherichia en los distintos ecosistemas. De acuerdo con

las publicaciones existentes y los resultados derivados de esta tesis, las cepas de E. coli

pertenecientes al grupo filogenético E son más prevalentes en el tracto gastrointestinal

de mamíferos silvestres (11.7-29.0%) que en humanos (2.4-3.2%) (Clermont et al.

2013; Massot et al. 2016; Mercat et al. 2016). Por el contrario, el filogrupo F, que ha

despertado interés tanto por su asociación con cepas ExPEC en humanos (Vangchhia et

al. 2016; Johnson et al. 2017) y animales domésticos (Ewers et al. 2014; Guo et al.

2015), como por su relación con genotipos resistentes a fluoroquinolonas,

cefalosporinas y carbapenemas (cepas ST354, CC648) (Vangchhia et al. 2016; Johnson

et al. 2017), sólo se detectó en 2 cepas de jabalíes (ambas sensibles a los antibióticos;

una de ellas STEC). En base a nuestros resultados, y de acuerdo con la bibliografía

existente, el filogrupo F parece ser más frecuente en humanos (7.0-10%) que en

mamíferos salvajes (0– 3.1%) (Clermont et al. 2013; Massot et al. 2016; Vangchhia et

al. 2016).

La existencia de clados crípticos de Escherichia se planteó gracias a un estudio

sobre la estructura poblacional de E. coli en playas de agua dulce (Walk et al. 2007).

Los autores, tras analizar secuencias MLST de cepas fenotípicamente indistinguibles de

E. coli, observaron que 2 de ellas no se agrupaban en el mismo cluster que el resto de

los aislamientos pertenecientes a esta u otras especies conocidas de Escherichia. Un

trabajo posterior, con una colección más amplia de cepas atípicas de E. coli, demostró la

existencia de 5 clados (I, II, IIII, IV, V) que englobaban cepas fenotípicamente idénticas

a E. coli, pero genotípicamente distantes (Walk et al. 2009). Los clados II, III, IV y V se

consideran linajes de Escherichia especialmente adaptados al entorno natural

(extraintestinal), como aguas, suelos o sedimentos (Luo et al. 2011). Sin embargo, se

han hallado también en aves (7.8-28.2%) y mamíferos silvestres (3.2-8.2%), debido

probablemente a la estrecha interacción que éstos mantienen con el entorno natural

(Clermont et al. 2011; Walk et al. 2015). Los datos expuestos en el artículo 4, que

examina distintos mamíferos silvestres, respaldan las observaciones anteriormente

mencionadas y muestran una prevalencia del 7.7% de cepas pertenecientes a clados

crípticos de Escherichia (clado IV en 4 ratones y clado V en un visón). La

Discusión

269

reconstrucción del árbol filogenético basado en las secuencias nucleotídicas

concatenadas de los 7 loci del MLST muestra la evidente divergencia genética de estas

cepas (fundamentalmente del clado V) con respecto a aquellas correspondientes a la

especie E. coli.

Los escasos trabajos en los que se analizan estos clados crípticos hablan de una

baja virulencia y resistencia asociada a estas cepas, a excepción del clado I, el más

estrechamente relacionado con E. coli y ocasionalmente causante de infecciones

intestinales y extraintestinales (Ingle et al. 2011; Iranpour et al. 2015; Leonard et al.

2016). Sin embargo, la cepa de Escherichia perteneciente al clado V que aislamos en

heces de visón portaba varios determinantes de virulencia (fimA, malX, aer, ompT) y el

gen de resistencia blaCTX-M-14. Hasta donde sabemos, éste constituye el primer reporte de

una cepa críptica de Escherichia con genotipo BLEE. Estudios recientes han

determinado que el repertorio genético y la capacidad de adherencia de las cepas

pertenecientes al clado V es similar al que muestran algunas cepas patógenas

intestinales de E. coli (Vignaroli et al. 2015), lo que subraya la necesidad de seguir

investigando acerca de las características geno y fenotípicas, el potencial patogénico y

el nicho ecológico preferencial de estos clados crípticos de Escherichia.

Atendiendo a la literatura, en muchos casos basada en el estudio de los 4

principales grupos filogenéticos (A, B1, B2, D), puede establecerse un vínculo entre

virulencia y filogenia en las cepas de E. coli (Escobar-Páramo et al. 2004b; Carlos et al.

2010). Generalmente, las cepas causantes de infecciones extraintestinales se asocian

significativamente a los filogrupos B2 y, en menor medida, D (Picard et al. 1999;

Johnson y Stell, 2000; Martínez et al., 2006; Bukh et al. 2009; Massot et al. 2016). La

alta tasa de cepas comensales pertenecientes al grupo filogenético B2 observadas en

jabalíes (47.5%) nos condujo a un análisis más exhaustivo de las mismas. Observamos

que la predominancia de este filogrupo no se debía a la expansión de uno o pocos clones

exitosos entre la población de jabalíes, sino que las cepas mostraban una amplia

diversidad genética. Este hecho sugiere que la capacidad de colonización de las cepas

del filogrupo B2 podría verse favorecida por presiones selectivas del ambiente en el que

se desarrollan.

En concordancia con nuestros resultados, un estudio comparativo sobre la

estructura poblacional de E. coli en el tracto gastrointestinal de cerdos y jabalíes mostró

una mayor prevalencia del filogrupo B2 en porcinos salvajes (Römer et al. 2012). Los

270

Discusión

autores sugirieron que estas diferencias podrían estar en relación con la dieta de cada

especie hospedadora; los cerdos suelen consumir piensos suplementados con hierro

mientras que la alimentación básica de los jabalíes (vegetales y pequeños mamíferos)

aporta una menor cantidad de este compuesto, cofactor esencial en diversas rutas

metabólicas bacterianas. Por lo tanto, la selección de cepas de E. coli B2 en el intestino

de porcinos silvestres podría verse favorecida por su capacidad para expresar la proteína

ChuA, implicada en la captación de hierro a partir del grupo hemo. Por otro lado, la alta

prevalencia del filogrupo B2 en jabalíes, en comparación con cerdos, también podría

estar asociada a la menor presión antibiótica a la que están sometidos los primeros.

Ninguna de las 38 cepas de E. coli B2 presentó resistencia a los antibióticos. En

concordancia con nuestros resultados, el filogrupo B2 parece estar menos

frecuentemente asociado con genotipos resistentes a los antibióticos que el resto

(Johnson et al. 2003; Skurnik et al. 2005; Bukh et al. 2009). Así, la mayor exposición

de los cerdos a los antimicrobianos podría favorecer la colonización intestinal de los

mismos por cepas distintas del filogrupo B2, relacionadas más frecuentemente con la

presencia de determinantes de resistencia.

Aunque no siempre existe esta correlación (p. ej. clon ST131), en muchos casos

el nivel de resistencia parece estar inversamente relacionado con la virulencia. Está

ampliamente aceptado que la adquisición horizontal de mecanismos de resistencia

conlleva una pérdida del fitness bacteriano, asociado a menudo a una disminución de la

virulencia (Cohen et al. 2003; Andersson y Hughes, 2010). Además, como discutiremos

más adelante, parece existir una correlación entre la presencia de sistemas CRISPR-Cas

de tipo I-F y el fenotipo sensible a antibióticos que muestran muchas cepas de E. coli

filogrupo B2. Considerando todas las pertenecientes a este grupo filogenético

recuperadas de animales silvestres en esta tesis, sólo una mostró un fenotipo resistente a

los antibióticos (Figuras 36 y 37). Ésta, aislada como ya mencionamos de un milano,

pertenecía al clon pandémico ST131/H30. Las razones de su exitosa expansión no están

claras, pero se cree que su particular combinación de factores de resistencia y virulencia

(distintos de otras ExPEC) favorecen la colonización intestinal por parte de este clon

(Mathers et al. 2015b).

Entre las cepas comensales pertenecientes al filogrupo B2 aisladas de jabalíes,

detectamos secuencias tipo previamente asociadas a patología extraintestinal en

humanos, fundamentalmente infecciones del tracto urinario. Este es el caso de clones

Discusión

271

como ST131/B2 (Merino et al. 2016), ST28/B2 (Coque et al. 2008), ST1170/B2 (Porse

et al. 2016; Pietsch et al. 2017), ST681/B2 (Banerjee et al. 2013; Hertz et al.2016) y

ST625/B2 (Banerjee et al. 2013). De hecho, en muchos de los aislamientos asociados a

estos linajes, excepto aquellos asignados al ST131/B2 y ST28/B2, identificamos uno o

más deteminantes de resistencia habituales de ExPEC: papC, papGIII, cnf1 y/o hlyA. Se

ha descrito que los genes codificantes del factor citotóxico necrotizante (cnf1) y la α-

hemolisina (hlyA) se localizan en la misma isla de patogenicidad (Blum et al. 1995), lo

que explicaría la detección de ambos factores de virulencia en la cepa C7995 de nuestra

colección. En cuanto a la cepa E. coli ST131, en este caso perteneciente al sublinaje

H22 (serogrupo O25), no se detectaron los factores de virulencia extraintestinal clásicos

sino otros como la proteína específica uropatógena (usp), el receptor de aerobactina

(iutA), la proteasa de membrana externa (ompT) y el marcador de una isla de

patogenicidad (malX). Como mencionamos anteriormente, probablemente este

particular perfil de virulencia contribuye no sólo a la patogenicidad sino también al

incremento de la capacidad de adaptación, competencia y colonización de estas cepas,

contribuyendo a la exitosa diseminación del clon ST131 a nivel mundial. Merece la

pena destacar, que en contraste con los fenotipos altamente sensibles a los antibióticos

observados en las cepas comensales ST131, ST28 y ST1170 en jabalíes, en humanos los

aislamientos pertenecientes a estos linajes son frecuentemente más resistentes e incluso

portadores de determinantes BLEE (Coque et al. 2008; Merino et al. 2016; Porse et al.

2016; Pietsch et al. 2017). Esto sugiere, como han observado otros autores, que los

animales podrían actuar como reservorios de cepas con alta capacidad de adquirir

plásmidos de resistencia en entornos en los que el empleo de antibióticos genera una

presión selectiva que favorece la aparición de resistencias (Skurnik et al. 2015).

Figura 36. Distribución filogenética de las cepas de E. coli aisladas de mamíferos salvajes en relación con su fenotipo de resistencia. El análisis filogenético en mamíferos (artículos 1, 2 y 4) se llevó a cabo según el esquema ampliado de Clermont et al. 2013 (filogrupos A, B1, B2, C, D, E, F y clados crípticos).

272

Discusión

El grupo filogenético claramente dominante entre las cepas de E. coli

BLEE/AmpC aisladas de fauna salvaje en esta tesis fue el B1 (61.9%) (Figuras 36 y

37). Este filogrupo, vinculado a cepas comensales, ha sido reportado también como el

más prevalente por otros autores (Simões et al. 2010; Ho et al. 2015; Cristóvão et al.

2017), lo que sugiere que estas cepas BLEE/AmpC se encuentran asentadas en la

microbiota intestinal de animales silvestres sanos.

CAPÍTULO 3

Con el objetivo de estudiar desde un enfoque One Health la dinámica de la

resistencia a antibióticos, en este capítulo analizamos molecularmente cepas de distintos

ecosistemas y orígenes geográficos que presentaban la característica común de portar el

mismo gen o elemento genético de resistencia. Por un lado, analizamos una colección

de 23 cepas productoras de SHV-12, una BLEE clásica pero poco estudiada, muy

prevalente en nuestro país tanto en humanos y aves de corral como, a la vista de lo

expuesto en capítulos anteriores, en fauna silvestre. Por otro lado, estudiamos la

localización, estructura, entorno genético y capacidad conjugativa de los integrones de

clase 2 presentes en una colección de 35 cepas de E. coli.

Las 23 cepas portadoras del gen blaSHV-12 se aislaron de muestras procedentes de

distintas fuentes (humanos, perros, aves de corral, alimentos, aves silvestres) y orígenes

geográficos (España, Alemania), recolectadas a lo largo de un amplio periodo de tiempo

(2003-2014). No existía una relación epidemiológica directa entre las mismas, lo que

explica la alta diversidad de clones y plásmidos reportados. La repetida detección de

determinadas líneas genéticas (p. ej. ST23/A, ST57/D, ST117/D) en muestras de

Figura 37. Distribución filogenética de las cepas de E. coli con genotipo BLEE y/o AmpC aisladas de aves salvajes. El análisis de los grupos filogenéticos, en el artículo 3, se realizó siguiendo el esquema clásico de Clermont et al. 2003 (filogrupos A, B1, B2, D).

Discusión

273

distintas fuentes y/o años de aislamiento sugiere la existencia de posibles clones

epidémicos, relativamente estables en el tiempo, y portadores de plásmidos altamente

similares. Identificamos una cepa de E. coli perteneciente al clon pandémico ST131/B2,

típicamente relacionado con la producción de CTX-M, en una muestra de carne de

pollo. Esta cepa en particular era portadora de dos genes BLEE, concretamente, blaSHV-

12 y blaCTX-M-1. Aunque la producción de SHV-12 ha sido previamente descrita en el

linaje ST131/B2, fundamentalmente en aislamientos clínicos en España (Coelho et al.

2011; Oteo et al. 2012), esta asociación es aún poco común. Teniendo en cuenta la alta

prevalencia de E. coli blaSHV-12 positivo en clones no-ST131 en nuestro país, se ha

sugerido el acontecimiento de eventos de transferencia horizontal entre cepas locales

no-ST131 y el clon pandémico ST131 (Oteo et al. 2012). Nuestros resultados avalan

esta teoría pues evidenciamos el mismo patrón de restricción EcoRI, HindIII y BamHI

en los plásmidos IncK portadores de blaSHV-12 presentes en la cepa ST131 y en otras

cepas de distintos ST, lo que refuerza la hipótesis de la transferencia plasmídica en la

adquisición de este gen por parte del clon ST131.

En base a los resultados globales del estudio, el gen blaSHV-12 se localizó

mayoritariamente en plásmidos pertenecientes al grupo de incompatibilidad IncI1

(73.9%). Estos plásmidos se asocian a una elevada eficiencia conjugativa, lo que puede

explicar su alta prevalencia en cepas de distintos ecosistemas (García-Fernández et al.

2008; Accogli et al. 2013). La transferencia horizontal del gen codificante de la enzima

SHV-12 también estuvo mediada, en menor medida, por plásmidos IncK e IncF. En dos

cepas la caracterización plasmídica por el método PBRT no arrojó resultados, lo que

concuerda con las observaciones de Mercadé et al. (2009) en relación con la mayor

proporción de replicones no tipables asociados a SHV-12 en comparación con TEM y

CTX-M. Uno de estos plásmidos no tipables por PBRT, pudo identificarse como

perteneciente al subgrupo IncX3 mediante el análisis bioinformático de su secuencia

parcial a través del servidor PlasmidFinder. Se ha sugerido que la prevalencia a nivel

global de los plásmidos de la familia IncX, asociados a un estrecho rango de

hospedadores (algunos géneros de enterobacterias), podría estar subestimada debido

precisamente a limitaciones como las que nos encontramos en este trabajo a la hora de

su tipificación mediante metodologías clásicas (Johnson et al. 2012). El plásmido IncX3

de la colección analizada fue transferible por conjugación, presentaba un tamaño de ~45

kb y portaba los genes blaSHV-12 y qnrS1. La co-localización de estos dos genes de alta

274

Discusión

importancia clínica en plásmidos IncX3 de similares características se ha descrito

recientemente en muestras de distintos orígenes en Europa (Dobiasova y Dolejska,

2016; Liakopoulos et al. 2016b). Anteriormente, ya había sido reportada la detección de

plásmidos del mismo subgrupo (IncX3) co-portadores tanto de blaSHV-12 como de

distintos genes codificantes de carbapenemasas, fundamentalmente blaNDM-1 en China

(Ho et al. 2012; Du et al. 2013; Feng et al. 2015) y blaKPC-2 en Europa (Kassis-Chikhani

et al. 2012). Estos últimos se hallan generalmente incluídos en transposones compuestos

presumiblemente implicados en su movilización (Ho et al. 2012). La alta capacidad de

adquisición de genes que confieren resistencia frente a antibióticos de relevancia crítica

en medicina humana (fluoroquinolonas, cefalosporinas, carbapenemas) por parte de los

plásmidos IncX3, junto con su habilidad conjugativa y su amplia diseminación en

enterobacterias de diversos ambientes, podría repercutir en mayor medida de lo

estimado en el control de las infecciones causadas por bacterias MDR.

Los plásmidos IncK portadores del gen blaSHV-12 se detectaron en cepas

pertenecientes a distintos clones (ST131, ST57) y aisladas de diversas fuentes

(alimentos, mascotas), pero mostraron patrones de restricción indistinguibles. Sin

embargo, el análisis por pMLST demostró una mayor diversidad entre los plásmidos

IncI1, aunque se observó una dominancia de los subtipos IncI1/pST3 e IncI1/pST26. De

acuerdo con trabajos previos (García-Fernández et al. 2008; Accogli et al. 2013), todos

los plásmidos IncI1/pST3 en los que se localizó el gen blaSHV-12 se detectaron en cepas

recuperadas de muestras fecales y de carne de aves de granja, lo que sugiere una posible

asociación origen-variante plasmídica. Sin embargo, nuestros resultados reflejan que los

plásmidos IncI1/pST26 y otros subtipos relacionados al CC26 (como pST29 o pST215,

descrito por primera vez en este estudio) abarcan un amplio rango de hospedadores

contribuyendo a la diseminación del gen codificante de SHV-12 entre diferentes

ecosistemas (humano, veterinario y ambiental) y regiones geográficas.

Es importante resaltar que, a diferencia del fenotipo sensible a los antibióticos

no-β-lactámicos que mostraban las cepas transformantes portadoras de plásmidos IncK-

blaSHV-12, el 82.3% de los transformantes que adquirieron el gen blaSHV-12 a través de

plásmidos IncI1 exhibieron un fenotipo multirresistente. Éste involucró resistencia a β-

lactámicos, cloranfenicol y estreptomicina en todos los casos y, en muchos de ellos, a

tetraciclina. Este fenotipo MDR que exhibieron 14 cepas transformantes portadoras de

plásmidos IncI1-blaSHV-12 se asoció a la co-localización de un integrón de clase 1 atípico

Discusión

275

(IS440-sul3) conteniendo el arreglo genético estX-psp-aadA2-cmlA1-aadA1-qacI en su

región variable y, frecuentemente, el gen tet(A). El análisis de la secuencia completa del

plásmido conjugativo IncI1 pCAZ590 (117.387 pb, LT669764) mostró que su módulo

de adaptación contenía un complejo de resistencia derivado de Tn21, originado a partir

de diferentes eventos de transferencia horizontal. Se conservaban las regiones

terminales IR y los genes de transposición (tnpA, tnpR, tnpM) de Tn21, así como el gen

intI1, las terminaciones imperfectas IRi y un fragmento del tniA del integrón clásico In2

descrito originalmente en este grupo de transposones (Liebert et al., 1999). Sin

embargo, el resto de la estructura de In2 estaba ausente, y en su lugar observamos la

inserción del arreglo de GC estX-psp-aadA2-cmlA1-aadA1-qacI seguido de la

plataforma IS440-sul3-yqkA-yusZ-∆mef(B)-IS26. El gen mef(B), codificante de una

bomba de eflujo de macrólidos, aparecía interrumpido por una IS26. De acuerdo con lo

sugerido por otros autores (Kiiru et al. 2013; Curiao et al. 2015), la alta prevalencia del

citado integrón atípico en cepas productoras de SHV-12 parece estar en relación con el

nexo que establece con el elemento IS26, el cual constituye a su vez la región

conservada aguas arriba del gen blaSHV-12. Aguas abajo del segmento IS26-blaSHV-12-

deoR se localizaba un transposón Tn1721 truncado (∆Tn1721), portador del gen de

resistencia a la tetraciclina tet(A). Del operón de resistencia a mercurio típico de Tn21

(merRTPCAD), sólo se detectó un fragmento de merR (120 pb) aguas abajo de

∆Tn1721. La presencia de este complejo genético de resistencia (Tn21-blaSHV-12-

∆Tn1721) en el módulo de adaptación de plásmidos conjugativos del grupo de

incompatibilidad IncI1, parece desempeñar un papel importante en la persistencia y

diseminación de la enzima SHV-12, incluso en ausencia de la presión selectiva ejercida

por el uso de β-lactámicos.

Merece especial mención la detección de un integrón de clase 1 clásico

conteniendo un arreglo poco común, constituído por dos copias idénticas de qacG

(responsable de la resistencia a compuestos de amonio cuaternario) flanqueando el

cassette aadA6. Éste se hallaba situado en un plásmido IncI1 que presentó una alta

frecuencia de conjugación y era, a su vez, portador del gen blaSHV-12. La cepa de E. coli

en la que se detectó este plásmido se aisló de una muestra fecal de pollo. Existen varios

estudios que demuestran la frecuente presencia de genes qac en bacterias de origen

cárnico y sugieren que la presión selectiva ejercida por biocidas tales como compuestos

de amonio cuaternario, empleados habitualmente en la industria alimentaria, favorece su

276

Discusión

selección (Sidhu et al. 2002; Zou et al. 2014). A su vez, tal y como muestran también

nuestros resultados, los autores señalan la existencia de una fuerte correlación entre la

portación bacteriana de genes qac (qacI, qacE∆1, qacG…) y de genes de resistencia a

antibióticos debido a la co-localización de estos determinantes en los mismos elementos

genéticos (generalmente, integrones de clase 1). Probablemente, el uso extendido de

antibióticos en granjas avícolas favorezca la selección de cepas de E. coli MDR en el

intestino de las aves e, indirectamente, la co-selección de genes qac. A su vez, los

compuestos de amonio cuaternario empleados durante el procesamiento de los

alimentos en la industria cárnica podrían actuar como agentes selectivos que faciliten la

persistencia de cepas MDR en los alimentos, llegando a suponer un riesgo para la salud

del consumidor.

Con respecto al entorno genético de blaSHV-12, de acuerdo con trabajo previos,

éste se hallaba altamente conservado (Diestra et al. 2009). De los 23 aislamientos

analizados, 22 mostraron idénticas secuencias nucleotídicas flanqueando el gen en

estudio. El elemento IS26 se localizaba aguas arriba de blaSHV-12 y, aguas abajo, el gen

putativo deoR. Se ha descrito que la secuencia de inserción IS26 promueve la expresión

de este gen BLEE gracias a la generación de un promotor híbrido entre la región -35 de

IS26 y la región -10 del promotor de blaSHV-12 (Kim et al. 2002). Una de las cepas de

nuestra colección (101689) presentó una variación aguas abajo del gen blaSHV-12. En

este caso, el gen putativo deoR aparecía truncado debido a la inserción de un fragmento

de 445 pb que contenía dos ORFs, los cuáles precedían a un elemento IS26. Tras la

comparación de esta estructura genética con las secuencias disponibles en GenBank,

observamos que la misma interrumpía otros genes localizados en diferentes regiones de

varios plásmidos, como pYD626E (KJ933392) o pSRC119-A/C (KM670336). Esto

refleja la capacidad de IS26 de movilizar genes adyacentes como consecuencia de la

identificación errónea de secuencias cortas alternativas a sus IR. Considerando ambos

extremos del gen de blaSHV-12 en la cepa 101689, el nuevo entorno genético descrito en

esta tesis (IS26-blaSHV-12-∆deoR-orf1-orf2-IS26) forma un transposón compuesto que

podría facilitarla movilización en bloque de este gen BLEE.

El segundo artículo recogido en este capítulo se centra en el análisis de los

integrones de clase 2 que, tras los de clase 1, constituyen importantes plataformas

genéticas involucradas en la movilización y expresión de cassettes genéticos de

resistencia a antibióticos. El estudio se planteó igualmente desde una perspectiva global

Discusión

277

de manera de incluyó una población de 35 cepas de E. coli heterogénea desde el punto

de vista temporal (periodo de aislamiento: 1998-2014), espacial (España, Mexico,

Túnez) y de hospedador (humanos, animales salvajes, animales de producción,

mascotas, y alimentos).

Observamos que la estructura genética y la localización de los integrones de

clase 2 se mantenia conservada en cepas de diversos orígenes y áreas geográficas. En

contraste con la amplia variedad de GC descritos en la región variable de los integrones

de clase 1, e incluso tal y como reportan algunos autores en integrones de clase 2 de

aguas residuales (Xia et al. 2013), en nuestra colección sólo encontramos tres arreglos

de GC: dfrA1-sat2-aadA1, estX-sat2-aadA1 y sat2-aadA1. Esta limitada diversidad es

probablemente debida al codon stop prematuro en el aminoácido 179 del gen intI2

detectado en todas las cepas estudiadas, lo que daría lugar a una integrasa no funcional

incapaz de capturar y/o escindir GC.

Los arreglos estX-sat2-aadA1 y sat2-aadA1, ambos detectados en muestras de

carne de pollo, han sido reportados previamente en Australia, Japón, Alemania y China

(Ahmed et al. 2005; Barlow et al. 2006; Kadlec y Schwarz, 2008; Xia et al. 2013) y

comparten la característica común de conservar los GC sat2 y aadA1. La distribución

internacional de estas estructuras, la ausencia en ambas de dfrA1 y la reconocida

preferente integración de los GC en la primera posición (attI x attC) sostienen la

hipótesis evolutiva planteada por algunos autores. Ésta sugiere que el gen de resistencia

a trimetoprim pudo ser adquirido más tardíamente en la evolución de Tn7, posiblemente

gracias a la actividad de una integrasa de clase 1 co-localizada en la misma cepa que el

integrón de clase 2 (Hansson et al. 2002; Ahmed et al. 2005). Probablemente, la

existencia de presión selectiva y la menor eficacia de las integrasas de integrón a la hora

de escindir el primer GC (attI x attC) contribuyeron a mantenerlo, favoreciendo la

persistencia del actualmente considerado arreglo clásico del integrón de clase 2 (intI2-

dfrA1-sat2-aadA1-orfX-ybfA-ybfB-ybgA-tnsE-tnsD-tnsC-tnsB-tnsA).

Si bien no observamos una alta diversidad de GC, muchos de los integrones de

clase 2 analizados (30%) portaban secuencias de inserción en distintas localizaciones de

las regiones variable y 5’-CS. A diferencia del grupo de elementos IS1111-attC, el cual

reconoce específicamente los sitios de recombinación attC y generalmente aparece

degenerado (Tetu y Holmes, 2008), las ISs detectadas en nuestra colección de

integrones de clase 2 pertenecieron a diversas familias (IS3, IS4, IS5, IS21), no

278

Discusión

mostraron especificidad por los sitios attC y todas presentaron su estructura intacta,

incluyendo sus respectivas repeticiones invertidas (IRR, IRL).

Uno de los integrones de clase 2 detectados por primera vez en este trabajo en

dos cepas de México, contenía un elemento ISSen4 (familia IS3, subgrupo IS407)

inserto 55 pb aguas abajo del pseudo-GC orfX. Si bien ambas cepas portadoras de este

integrón fueron aisladas de distintas fuentes (carne de cerdo, perro) y en distintos años

(2010, 2012), ambas pertenecieron a la secuencia tipo ST57 y mostraron un patrón de

bandas indistinguible por OD-PCR. Estos datos, junto con la localización cromosómica

del integrón (sitio attTn7), avalan una probable diseminación clonal. Es poco factible

que la inserción del elemento ISSen4 haya estado mediada por dos eventos

independientes ya que no se ha descrito una diana específica para el mismo, por lo que

su integración se considera aleatoria.

Atendiendo a la literatura, se han descrito pocas ISs integradas en la región

variable de los integrones de clase 2. En Shigella sonnei se detectó una copia completa

de IS911 truncando el cassette sat1 (Sow et al. 2008) y en Acinetobacter baumannii una

IS26 interrumpiendo orfX (Ramírez et al. 2010). También se han reportado elementos

IS1 e IS630 entre el gen intI2 y el sitio de recombinación attC en un aislamiento de E.

coli y S. flexneri, respectivamente (Briski y Mazel, 2003; Dubois et al. 2007). La

integración de estas ISs podría truncar la expresión de los GC o dotar a los mismos de

movilidad adicional (Siguier et al. 2014). De hecho, algunos de estos elementos (p. ej.

IS26, IS1 o ISEcl1) se han asociado frecuentemente con la movilización de genes

adyacentes (Smet et al. 2010; Beyrouthy et al. 2014; Zhang et al. 2017). Además, las

ISs también pueden promover la expresión de genes o GC localizados en la estructura

del integrón. En este sentido, merece especial mención el integrón portador de una IS10

identificado en nuestra colección. Este elemento queda inserto en el sitio attI2, entre los

promoteres Pc2B y Pc2C, lo que probablemente afectaría a la expresión de los GC

localizados en la región variable. La secuencia del sitio de recombinación attI2 continua

justo después de la duplicación del sitio diana 5’-CGGTAAGCA-3’. Este fragmento de

9 pb es casi idéntico a la secuencia consenso descrita originalmente para IS10 (5’-

NGCTNAGCN-3’), lo que sugiere que la integración de este elemento podría haber

tenido lugar por un evento de transposición sitio-específica. De hecho, un grupo

portugués reportó un integrón de clase 2 que portaba una IS10 en idéntica posición

(Jones-Dias et al. 2016b). Estudios previos han descrito la existencia de promotores en

Discusión

279

ambos extremos de este elemento (Simons et al. 1983; Martínez-García et al. 2003) y se

ha demostrado que la inserción de IS10 activa la transcripción de los genes de

resistencia adyacentes (Olliver et al. 2005; González-Prieto et al. 2015). Además de en

integrones de clase 2, también se ha reportado la inserción de IS10 en diferentes

integrones de clase 1 registrados en la base de datos INTEGRALL (números de acceso:

AY600086, FJ587511) (Szczepanowski et al. 2004; Vinué et al. 2010). En uno de ellos,

el elemento transponible se localizó aguas arriba del GC blaOXA-2 y se observó que la

presencia de este integrón confería a la bacteria una mayor resistencia a ampicilina en

comparación con su homólogo carente de IS10 (CMI: 250 μg/mL vs 150 μg/mL). La

diferencia en el nivel de resistencia a ampicilina se asoció al efecto posicional de IS10,

el cual probablemente promovería la transcripción del gen codificante de la β-lactamasa

(Szczepanowski et al. 2004). Todas estas observaciones abren la vía a futuros ensayos

funcionales que aclaren el efecto regulador de IS10 en la expresión de los GC presentes

en integrones de clase 1 y 2.

Por otro lado, los análisis de cartografía genética nos permitieron determinar que

los integrones de clase 2 se hallaban embebidos en estructuras en mosaico del módulo

de transposición de Tn7 (tnsABCDE). Aunque la mayoría de los integrones presentaron

todos los genes tns (89%), observamos algunas construcciones que carecían de uno o

varios de ellos. En uno de los integrones de clase 2 no sólo faltaba el módulo de

transposición completo, sino también el pseudo-GC orfX y la región ybfA-ybfB-ybgA.

Descartamos que se tratase de un integrón híbrido (extremo 3’ de clase 2/extremo 5’ de

clase 1), raramente descrito (Ploy et al. 2000; Xia et al. 2013). Pudimos confirmar que

la región 3’ de este integrón quedaba ligada al transposón Tn7 y que toda la estructura

era transferible por conjugación, lo que sugería su localización en un elemento

conjugativo/movilizable (plásmido o ICE). Precisamente la ausencia del módulo de

transposición podría estar favoreciendo la estabilidad de este integrón en el elemento

genético movilizable, facilitando su diseminación horizontal a otras bacterias. En otros

casos, si bien el integrón presentaba todos los genes de transposición, alguno de ellos

(tnsD o tnsE) aparecía truncado por una IS. Considerando el rol esencial de estos genes

en la capacidad de transposición y la selección del sitio diana por parte de los integrones

de clase 2 (attTn7 cromosómico vs plásmidos/fagos), la disrupción de los mismos por

ISs podría modular su capacidad de diseminación o especifidad de huésped.

280

Discusión

En cuanto a su localización genética, el 80% de las cepas presentaba al menos

una copia del integrón de clase 2 inserta a nivel cromosómico en el sitio attTn7,

adyacente al gen esencial glmS (codificante de la enzima glucosamina-6-fosfato

sintetasa). Los ensayos de conjugación demostraron que 9 de los 31 integrones

portadores del GC dfrA1 eran transferibles a una cepa receptora, lo que sugiere que

también se localizan, aparentemente en menor medida, en elementos conjugativos o

plásmidos movilizables. Este bajo porcentaje de integrones de clase 2 transferibles por

conjugación (29%), en comparación con lo observado en los de clase 1, concuerda con

los resultados reportados en estudios previos (Kadlec y Schwarz, 2008; Xia et al. 2013).

Se obtuvieron frecuencias de conjugación mayores (~10-5) en las cepas que contenían el

integrón en un sitio distinto al attTn7 cromosómico en comparación con aquellas que

portaban al menos una copia a este nivel (10-6-10-8). En este último caso, la

transferencia conjugativa podría explicarse por un evento de transposición mediada por

TnsE durante el proceso de replicación conjugativa o, como se ha reportado

ocasionalmente, por la presencia de una segunda copia del integrón a nivel plasmídico

en la bacteria (Rodríguez et al. 2006).

Cabe mencionar, que si bien la mayoría de las cepas originales (donadoras)

mostraron un fenotipo MDR, siendo muchas de ellas portadoras de genes BLEE y

múltiples plásmidos (2-4), el ensayo S1-PFGE reveló que los transconjugantes

adquirían generalmente un solo plásmido de entre 30-100 kb (IncI1, n=3; IncF; n=1; no-

tipable; n=3) carente de genes bla. De hecho, el 67% de los transconjugantes

presentaron únicamente resistencia a trimetoprim y estreptomicina, en relación con la

adquisición del integrón de clase 2. El 33% restante, adicionalmente, mostraron

resistencia a sulfonamidas (sul2; n=2; sul1; n=1), tetraciclina [tet(A); n=2] y/o

cloranfenical (cmlA, n=1; floR; n=1). En ninguno de los casos tuvo lugar la co-

transferencia del integrón de clase 2 y del gen responsable del fenotipo BLEE, lo que

sugiere que estos integrones contribuyen en menor medida que los de clase 1 a la

persistencia y diseminación horizontal de genes bla.

CAPÍTULO 4

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno zoonótico

emergente que puede llegar a ocasionar cuadros muy severos en humanos, como colitis

hemorrágica y SUH. Los rumiantes domésticos, especialmente el ganado bovino,

Discusión

281

constituyen el reservorio natural de este microorganismo, siendo la carne picada, los

vegetables frescos o ligeramente cocinados, los zumos no pasteurizados, el agua

contaminada, la leche recién ordeñada y los productos derivados, los principales

vehículos de transmisión. Aunque el serotipo O157:H7 es, a nivel internacional, el más

frecuentemente asociado a grandes brotes y casos esporádicos de colitis hemorrágica y

SUH, otros muchos presentan un potencial patogénico similar en humanos. De hecho,

en las últimas décadas, se han reportado diversos brotes epidémicos asociados a

serogrupos no-O157 (p. ej. O26, O111, O145, O103, O121…) y continúan emergiendo

nuevos serotipos capaces de ocasionar enfermedad (Brooks et al., 2005; Espie et al.

2008; Buvens et al. 2011; Severi et al. 2016). Merece especial mención la cepa híbrida

O104:H4 (patotipos STEC y EAEC) que causó un brote en Alemania y Francia en 2011

y afectó a 3.134 personas, incluyendo 778 casos de SUH y 47 muertes (EFSA, 2011).

Diversos estudios sugieren que, además de los rumiantes domésticos, algunos

animales silvestres también pueden actuar como reservorios de cepas STEC ejerciendo

un rol significativo en la diseminación de este patógeno (Sánchez et al. 2009; Mora et

al. 2012; Díaz-Sánchez et al. 2013). Se han descrito brotes y casos aislados de STEC en

personas que habían consumido carne de caza (Rabatsky-Ehr et al. 2002; Rounds et al.

2012), fresas contaminadas con heces de ciervo (Laidler et al. 2013) e, incluso, niños

que habían tenido un estrecho contacto con animales en zoológicos interactivos

(DebRoy y Roberts, 2006). El incremento de la densidad poblacional de algunos

mamíferos salvajes (p. ej. jabalíes, zorros, lobos), frecuentes incluso en áreas

periurbanas y basureros, la transformación de hábitats naturales en zonas de cultivo y

asentamientos humanos, actividades como la caza, la ganadería extensiva o semi-

extensiva, la transhumancia, así como las propias características de las cepas STEC (alta

resistencia en el medio, baja dosis infectiva), podrían facilitar el contacto interespecífico

y la transmisión de este patógeno entre animales domésticos, silvestres y humanos. Con

el objetivo de profundizar en el rol de la fauna salvaje como reservorio de cepas STEC

potencialmente patógenas o genes que, en un momento dado, podrían contribuir a la

emergencia de nuevas cepas patógenas, en este cuarto capítulo analizamos 326

aislamientos de E. coli procedentes de aves y mamíferos silvestres. Es importante

indicar que varios de los animales muestreados compartían hábitat con ganado

doméstico y, algunos (diversos ciervos y jabalíes), habían sido abatidos en actividades

cinegéticas destinadas al consumo humano.

282

Discusión

Entre la amplia colección estudiada, detectamos STEC no-O157:H7 en el 100%

de los muflones (3/3), el 7.6% de los ciervos (6/79), el 3.3% de los jabalíes (3/90) y el

1.3% de las aves examinadas (1/79). Estos animales han sido previamente identificados

como reservorios y/o vectores de STEC en estudios epidemiológicos llevados a cabo en

distintas regiones geográficas (Asakura et al., 1998; Sánchez et al., 2009; Borges et al.

2017). De acuedo con nuestros resultados, aunque se han aislado cepas STEC de

diversas especies de aves silvestres, la prevalencia ha sido generalmente muy baja

(Makino et al. 2000; Nielsen et al. 2004; Foster et al., 2006; Borges et al. 2017). Así, a

diferencia de los rumiantes silvestres (muflones, cérvidos) y jabalíes, las aves no se

consideran un verdadero reservorio de cepas STEC, sino vectores que propician su

proliferación. Sólo las palomas parecen actuar como reservorios de cepas productoras

de un subtipo específico de toxina Shiga (Stx2f) (Schmidt et al. 2000).

La comparación de nuestros resultados con los obtenidos en estudios previos

reflejó cierta asociación entre algunos serotipos STEC y el tipo de hospedador. Como

ejemplo, la alta incidencia del serotipo O27:H30 en cepas STEC aisladas de heces de

ciervo ha sido también reportada por otros autores (Díaz-Sánchez et al. 2013). Si bien

en ambos casos los animales muestreados procedían de la misma región geográfica

(centro-sur de España), el serotipo O27:H30 también ha sido detectado en carne de

ciervo de origen centroeuropeo (Martin y Beutin, 2011). Por otro lado, de acuerdo con

nuestros datos, cepas STEC pertenecientes a los serotipos O146:H21 y O146:H28 han

sido aisladas de forma recurrente en heces de jabalíes, ciervos y muflones, así como en

carne de caza (Sánchez et al. 2009; Martin y Beutin, 2011; Mora et al. 2012). Este

hecho indica que ambos serotipos son frecuentes en cepas comensales de grandes

mamíferos silvestres. Asimismo, diversos estudios han demostrado la presencia de

cepas STEC O128:H2 en el intestino de ovejas y cabras (Martin y Beutin, 2011;

Sánchez et al. 2012). En este trabajo, 2 de las 3 cepas aisladas de muflones

pertenecieron al mismo serotipo, lo que sugiere que tanto ovinos domésticos como

salvajes actúan como importantes reservorios de STEC O128:H2.

En base a su incidencia y asociación con manifestaciones clínicas severas en

humanos (p. ej. SUH), así como a su capacidad de causar brotes, las cepas STEC se han

clasificado en cinco seropatotipos (A-E) (Karmali et al. 2003; Farrokh et al. 2013). Por

lo tanto, la determinación del serotipo STEC nos permite conocer el riesgo patogénico

potencial de la cepa. En este sentido, cabe mencionar que 9 de las 13 STEC aisladas de

Discusión

283

fauna silvestre en esta tesis se asociaron a serotipos relacionados con enfermedad en el

hombre (Karmali et al. 2003; Girardeau et al. 2005; Coombes et al. 2008).

Concretamente, detectamos una STEC O145:H28 perteneciente al seropatotipo B, que

incluye cepas de serotipos causantes de brotes ocasionales y de frecuentes casos

aislados de SUH y colitis hemorrágica. Adicionalmente, identificamos 3 cepas con

serotipos asociados a casos esporádicos severos que cursan con SUH (O22:H8,

O128:H2; seropatotipo C) y 5 relacionadas con diarrea y colitis hemorrágica

(O11O:H28, O146:H21, O146:H28, ONT:H8; seropatotipo D).

Aunque el perfil de virulencia del patotipo STEC varía de unas cepas a otras,

todas poseen los genes que codifican uno o los dos tipos de toxina Shiga (Stx1 y/o

Stx2), integrados en el genoma de bacteriófagos atemperados (Farrokh et al. 2013). De

acuerdo con estudios previos en cepas STEC de fauna silvestre (Asakura et al. 1998;

Mora et al. 2012), en nuestra colección predominó el gen stx2, sólo o en combinación

con stx1. La toxina Shiga tipo 2 (Stx2) se ha asociado a una mayor citotoxicidad que la

de tipo 1 (Stx1), si bien en ambos casos se describen variantes atendiendo a sus

diferencias genéticas y actividad biológica (3 subtipos de Stx1 [Stx1a, Stx1c, Stx1d], 7

subtipos de Stx2 [Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2g]) (Friedrich et

al. 2002; Persson et al. 2007; Scheutz et al. 2012).

Las patologías severas en seres humanos (colitis hemorrágica, SUH) se

relacionan principalmente con los subtipos Stx1a, Stx2a, Stx2c y Stx2d (Bielaszewska

et al. 2002; Persson et al. 2003). De las 13 cepas STEC aisladas de fauna salvaje, 5

presentaron genes codificantes de alguna de estas variantes (stx1a, stx2a y/o stx2c).

Merece la pena destacar la detección de una cepa STEC O145:H28 (seropatotipo B),

productora del subtipo de toxina Shiga altamente virulento Stx2a y de dos factores de

riesgo adicionales, una intimina-γ1 y la enterohemolisina EhxA. La intimina, codificada

por el gen eae de la isla de patogenicidad cromosómica LEE, media la adhesión de la

bacteria al epitelio intestinal. El gen ehxA, codificante de la enterohemolisina, se

localiza en un plásmido denominado pO157. La presencia concomitante de eae y ehxA

se considera un distintivo de las clásicas cepas STEC, causantes de alrededor del 80%

de los casos de SUH y colitis hemorrágica en Europa y Estados Unidos (Beutin y

Martin, 2012).

En base a nuestros resultados, las STEC de fauna silvestre portaban de forma

predominante el subtipo stx2b (sólo o en combinación con stx1a/ stx1c) y carecían del gen

284

Discusión

eae, y la mayoría producía adicionalmente una subtilasa (SubAB). SubAB es una

citotoxina producida generalmente por cepas STEC carentes de la isla de patogenicidad

LEE (eae negativas), que ha demostrado ser letal en ratones y células Vero (Paton et al.

2004). Aunque existen diversas variantes de SubAB, las más prevalentes son la

plasmídica subAB1 y la cromosómica subAB2 (Paton et al. 2004; Michelacci et al. 2013).

Nuestros datos concuerdan con los reportados por otros autores en rumiantes salvajes,

jabalíes y carne de caza, y confirman la significativa asociación entre la producción del

subtipo de toxina Shiga Stx2b y la subtilasa SubAB (Sánchez et al. 2013). La expresión

del gen subAB podría incrementar la patogenicidad de estas STEC eae-negativas en

humanos (Orden et al. 2011). De hecho, se han descrito casos de colitis hemorrágica

causados por cepas STEC eae-negativas y Stx2b/EhxA/SubAB-positivas, pertenecientes

a los serotipos O128:H2 y O76:H19 (Sánchez et al. 2012; Sánchez et al. 2014). El

subtipado de la subtilasa nos permitió determinar que la variante cromosómica subAB2,

asociada al gen tia, fue la predominante en nuestra colección de STEC de fauna salvaje.

El gen tia, detectado primeramente en el patotipo ETEC (E. coli enterotoxigénico),

codifica una proteína de membrana implicada en la invasión del epitelio intestinal

(Fleckenstein et al. 1996). La presencia concomitante de subAB2 y tia observada en este

trabajo refleja, tal y como han descrito otros autores, la localización de ambos

determinantes en la misma isla de patogenicidad (SE-PAI, Subtilase-Encoding PAI)

(Tozzoli et al.2010). Se ha sugerido que las islas de patogenicidad SE-PAI y LEE

podrían compartir y, por tanto, competir por el mismo sitio de integración en el genoma

bacteriano, lo que explicaría la presencia de subAB2 en cepas eae-negativas y viceversa

(Michelacci et al. 2013). La variante plasmídica subAB1 también fue identificada en 2

cepas STEC aisladas de un jabalí y un ciervo. Una de ellas fue también positiva para el

gen saa, el cual codifica una adhesina autoaglutinante y se halla habitualmente

localizado en el mismo plásmido que la subtilasa subAB1 (Paton et al. 2004).

Otro de los objetivos de este capítulo fue analizar las características genéticas de

las cepas de E. coli enteropatógena identificadas en la colección de aislamientos de

fauna silvestre. El patotipo EPEC se define como un virotipo diarreogénico de E. coli

causante de lesiones A/E mediadas, entre otros factores, por la intimina (eae), pero que

carece de genes stx. Las EPEC fueron los primeros patotipos de E. coli en ser descritos

y se asociaron a casos esporádicos de diarrea estival infantil y brotes epidémicos de

gastroenteritis en guarderías (Levine et al. 1978). El cuadro clínico cursa con diarrea

Discusión

285

acuosa de diverso grado, muchas veces acompañada de vómitos y fiebre. Afecta

principalmente a niños menores de 2 años y, en países en vías de desarrollo, se relaciona

con una elevada tasa de morbimortalidad (Nataro y Kaper, 1998). En base a la

capacidad que presentan las cepas EPEC para expresar o no la fimbria BFP (bundle-

forming pilus), éstas se dividen en tEPEC (EPEC típicas) o aEPEC (EPEC atípicas),

respectivamente.

Las tEPEC, a diferencia de las aEPEC, no suelen aislarse de huéspedes animales,

por lo que el hombre es considerado su único reservorio (Blanco et al. 2005; Chandran

y Mazumder, 2013). Tan sólo excepcionalmene se han reportado cepas tEPEC (bfpA-

positivas) en perros, coyotes y un ciervo (Ishii et al. 2007; Chandran y Mazumder,

2013). Por ello, merece especial mención la detección de este microorganimo en una

muestra intestinal de jabalí, lo que sugiere su probable adquisición a partir del estrecho

contacto establecido entre esta especie animal y el entorno humano. Además, tanto el

serotipo (O49:H10) como la variante de intimina (eae-к) que presentaba esta cepa

tEPEC de jabalí, coincidieron con el genotipo descrito de forma recurrente en

aislamientos de pacientes con diarrea del Hospital Lucus Augusti (Lugo, Galicia)

(periodo 2003-2014; datos no publicados).

Entre las 10 cepas EPEC detectadas en nuestra colección, identificamos 7

subtipos de intimina, siendo los más prevalentes β2, ζ1 y ε1. El subtipo eae-ε1 ha sido

frecuentemente descrito tanto en cepas EPEC como STEC pertenecientes al serotipo

O103:H2, asociándose este último a casos de SUH y colitis hemorrágica (Blanco et al.

2005; Karmali et al. 2003). Este dato es importante, ya que los genes stx se localizan en

fagos lamboides atemperados que se hallan integrados de forma estable en el genoma

bacteriano, pero al menos en algunas STEC, no están exentos de escindirse

espontáneamente, revirtiendo entonces la cepa al patotipo EPEC. De hecho, parece

evidente que la mayoría de STEC patógenas tienen su origen en poblaciones EPEC que

fueron lisogenizadas por uno o varios fagos portadores de los genes stx1 y/o stx2. Sin

embargo, según han demostrado algunos autores, los eventos de escisión/integración

fágica y, por tanto, la conversión bidireccional EPEC-STEC son infrecuentes en la

naturaleza (Söderlund et al. 2016). El análisis de SNPs de una colección de cepas

aEPEC/STEC O103:H2 de ganado bovino demostró que, aunque algunos subgrupos de

aEPEC y STEC presentaban un repertorio de genes de virulencia casi idéntico,

pertenecían a diferentes líneas genéticas (Söderlund et al. 2016). Por otra parte, cabe

286

Discusión

destacar la detección de la variante de intimina γ1, mayormente asociada aEPEC y

STEC de origen humano, en una aEPEC O55:H7 aislada de heces de ciervo. Este

serotipo es uno de los más frecuentes entre las cepas clínicas aEPEC y los modelos

evolutivos lo han postulado como el precursor del clásico STEC O157:H7 (Feng et al.

2007).

Al comparar los perfiles de macrorrestricción de las 23 cepas STEC y EPEC de

nuestra colección, observamos una alta diversidad genética, en concordancia con la

amplia variedad de perfiles de virulencia y serotipos detectados. Con respecto a la

distribución filogenética, nuestros resultados coinciden con estudios previos al mostrar

una clara predominancia del filogrupo B1, tanto en la población STEC como EPEC

(Girardeau et al. 2005; Mora et al. 2012).

Cabe resaltar la baja prevalencia de cepas resistentes a los antimicrobianos

detectada entre los patotipos EPEC y STEC en este estudio. Sólo observamos un

fenotipo MDR (ampicilina-tetraciclina-trimetoprim/sulfametoxazol) en dos cepas STEC

genéticamente relacionadas aisladas de muflones (identidad >85%). Como

mencionamos en capítulos anteriores, estos antimicrobianos (u otros con estructura

química similar de la misma familia) han sido ampliamente empleados en la industria

ganadera, desde donde probablemente han emergido las bacterias resistentes,

diseminándose al entorno natural (Chirila et al. 2017). De hecho, un reciente estudio

llevado a cabo en cepas STEC no-O157 aisladas de granjas y mataderos ha reportado

una tasa de multirresistencia del 87% (Kennedy et al. 2017). Además, la detección de

un 57% de cepas MDR en EPEC y STEC de aves salvajes alerta sobre la posible

temprana emergencia de patógenos resistentes a los antibióticos en la naturaleza

(Borges et al. 2017). En las infecciones humanas por STEC el tratamiento antibiótico

está generalmente desaconsejado, pues se ha demostrado que muchos agentes inducen la

respuesta SOS provocando un aumento en la expresión de los genes fágicos (entre ellos

los codificantes de la toxina Shiga), llegando a ocasionar deterioro clínico y evolución a

SUH (Kimmitt et al. 2000). Sin embargo, los estudios de vigilancia de la resistencia

antimicrobiana en los patotipos de E. coli diarreogénica son necesarios, pues la

portación de genes de resistencia puede conferir una ventaja selectiva a estas bacterias

sobre otros miembros de la microbiota intestinal y contribuir a su diseminación.

A la vista de los resultados, podríamos afirmar que tanto rumiantes silvestres

(muflones y ciervos) como jabalíes desempeñan un importante papel epidemiológico en

Discusión

287

el mantenimiento y diseminación de cepas de E. coli con patotipos STEC y EPEC

potencialmente patógenas. Además, con independencia del potencial virulento, los datos

obtenidos son un reflejo de los genes que circulan en el entorno natural y que podrían

contribuir, dada su localización en elementos genéticos movilizables, a la emergencia de

nuevos serotipos patógenos e, incluso patotipos híbridos.

CAPÍTULO 5

En los capítulos anteriores hemos analizado diferentes aspectos relacionados con

la epidemiología molecular de la resistencia y la virulencia en E. coli partiendo

mayormente de metodologías de screening y tipado clásicas. Sin embargo, el incesante

avance de las tecnologías de secuenciación completa de genomas acontecido en los

últimos años, además de suponer un reto para los investigadores, a abierto las puertas a

estudios más globales basados en el análisis de múltiples datos. Precisamente de la

necesidad de gestionar y estudiar toda esta información nació el campo de la

bioinformática, facilitando el desarrollo de estudios in silico en el ámbito de la

epidemiología molecular. Hasta la fecha, la mayoría de estos trabajos se han centrado en

el análisis de cepas portadoras de deteminantes de resistencia o virulencia de interés

clínico, así como brotes epidémicos o análisis evolutivos. Sin embargo, los estudios de

poblaciones bacterianas comensales son aún escasos. En esta tesis tuvimos la

oportunidad de secuenciar el genoma completo de 38 cepas de E. coli pertenecientes a

nuestra colección de aislamientos de fauna silvestre, lo que permitió caracterizar los

sistemas CRISPR/Cas y los módulos de resistencia y virulencia de esta población, nos

proporcionó una visión más completa del plasmidoma, y sumó evidencias que sostienen

la existencia de un flujo continuo de elementos genéticos móviles y líneas bacterianas

entre el ecosistema humano y ambiental.

Con respecto a los sistemas CRISPR/Cas, de acuerdo con estudios previos,

observamos una clara correlación entre el subtipo y la filogenia (Díez-Villaseñor et al.

2010; Aydin et al. 2017). A diferencia del sistema CRISPR/Cas I-E, presente en todos

los grupos filogenéticos identificados en nuestra colección (A, B1, B2, D), el sistema

CRISPR/Cas I-F se asoció exclusivamente a algunos miembros del filogrupo B2 y a la

cepa perteneciente al clado V. Además, la organización y localización de los

espaciadores en los sistemas I-E (CRISPR-1 y -2) compartía ciertos patrones en cepas

asociadas a distintos ST e, incluso, filogrupos. Así, si bien en Salmonella se ha

288

Discusión

propuesto el estudio de los CRISPRs como método de tipado en base a su alto

polimorfismo, correlativo tanto con el serotipo como con el ST (Fabre et al. 2012), en

E. coli su utilidad se ve más limitada. La presencia de idénticos clusters de espaciadores

en los filogrupos A y B1, localizados además en posiciones conservadas del CRISPR,

podría ser consecuencia de eventos de recombinación homóloga (Almendros et al.

2014) o de la existencia de un ancestro común cuya evolución condujo a la pérdida de

espaciadores (Kupczok et al. 2015).

En cuanto a la homología de los espaciadores con secuencias conocidas,

nuestros resultados concuerdan con trabajos previos (Almendros et al. 2010) que

asocian el sistema CRISPR/Cas I-E a proto-espaciadores fágicos. Aunque algunos

autores han reportado la existencia de correlación positiva entre el número de

espaciadores en los CRISPRs -1 y -2 y la portación de determinantes de virulencia

(García-Gutierrez et al. 2015), diversos estudios ponen en duda la dinámica y

funcionalidad de los sistemas I-E (Touchon et al. 2011; Westra et al. 2010). Sin

embargo, ensayos de expresión e interferencia del CRISPR/Cas I-F, han demostrado

que éste es activo en condiciones óptimas de laboratorio (Almendros et al. 2012; Aydin

et al. 2017). Debido a que, como observamos en esta tesis, los proto-espaciadores de

origen plasmídico e ISs se asocian preferentemente con este sistema, un trabajo reciente

ha sugerido que su presencia se correlaciona con fenotipos sensibles a los

antimicrobianos (Aydin et al. 2017). Concretamente, los autores señalan que en la

colección de cepas clínicas que analizaron, sólo las pertenecientes al filogrupo B2

portaban sistemas CRISPR-Cas de tipo I-F y éstos presentaban secuencias espaciadoras

altamente homólogas (≥97%) a regiones conservadas de plásmidos IncI1, IncFII e

IncFIB, frecuentemente asociados con la diseminación de determinantes de resistencia.

Al demostrar que sus genes cas se expresaban de forma activa, dedujeron que estos

sistemas podrían estar interfiriendo en la adquisición/estabilidad de plásmidos de

resistencia por parte de la bacteria. Nuestros resultados parecen respaldar esta tesis, pues

ninguna de las cepas que portaba CRISPR/Cas I-F, incluyendo la perteneciente al clado

V, mostró un fenotipo resistente y en todas se observó al menos un espaciador con alta

homología a secuencias halladas en plásmidos y otros elementos genéticos móviles

(ISEc66). Curiosamente, al igual que reportó Aydin et al. 2017, las cepas pertenecientes

al complejo clonal ST131, generalmente asociadas a perfiles multirresistentes

relacionados con el filogrupo B2, carecían de sistemas CRISPR/Cas I-F. Tal y como

Discusión

289

refleja el árbol filogenómico construído en base a los SNPs del core, el complejo ST131

forma una rama diferenciada de aquella que agrupa los ST135, ST567 y ST625

(portadores de los sistemas I-F), lo que podría indicar que la adquisición de los

CRISPR/Cas fue posterior a la divergencia evolutiva del filogrupo B2. Esto, a su vez,

sustentaría en parte la mayor habilidad que muestran las cepas pertenecientes al linaje

ST131 para captar y conservar de forma estable plásmidos de resistencia.

Por otro lado, resulta llamativo que, de los 4 espaciadores homólogos a

secuencias plasmídicas identificados en nuestra colección de fauna salvaje, 2 fueran

idénticos a los descritos en cepas clínicas humanas distantes a nivel geográfico (Aydin

et al. 2017). Considerando la funcionalidad del sistema CRISPR/Cas I-F, este hecho

podría deberse a la preferente adquisición de estos proto-espaciadores, asociados a

plásmidos ampliamente distribuidos, que aportarían una ventaja a la bacteria. Sin

embargo, no descartaría la existencia de un sistema ancestral común que evoluciona

reteniendo sólo aquellos espaciadores ventajosos en respuesta a las presiones

ambientales, siendo la adquisición de nuevos espaciadores un evento muy poco

frecuente en la naturaleza.

El análisis filogenético del set de genes cas-E y cas-F, reveló la existencia de 2

subtipos en ambos sistemas. La existencia de las variantes E-1 y E-2 y la presencia de la

primera en una mayor diversidad de cepas había sido previamente reportada

(Almendros et al. 2014). Sin embargo, y aun siendo alto el grado de homología de

secuencias, la cepa perteneciente al clado V mostraba variaciones en cas-F y un bloque

adicional de genes en la región inter-CRISPR con respecto a las cepas del filogrupo B2.

En base a estas diferencias, Escherichia clado V podría relacionarse filogenéticamente

con otras especies del género Escherichia, como E. albertii y, fundamentalmente E.

marmotae.

Con respecto al plasmidoma, los datos obtenidos por secuenciación masiva y la

reconstrucción genómica mediante PLACNETw brindaron, sin lugar a dudas, un

escenario más global que el alcanzable por técnicas convencionales. Por un lado, como

ya hemos dicho, permitió el estudio de la población de plásmidos pequeños (≤8.1 kb),

frecuentemente difíciles de detectar por S1-PFGE y no tipables por PBRT. Aunque

observamos diversas combinaciones relaxasa-sistema de replicación, destacaron las

asociaciones MOBP51-RNAI, característica de los plásmidos pColE1, y MOBQ-col(156).

Sin embargo, los plásmidos de menor tamaño (2.5 kb) carecían de relaxasas y solo

290

Discusión

contenían los genes necesarios para asegurar su propia replicación, presentando alta

homología con el plásmido prototipo pKST21 descrito en ganado bovino (Spaková et

al. 2013). Con respecto al módulo accesorio, 3 de los pequeños plásmidos contenían

genes codificantes de colicinas (colE1, colN y colE8), aunque la mayoría eran

plásmidos crípticos. Cabe destacar, que 5 de ellos compartían una homología de

secuencia de al menos 99% con plásmidos previamente descritos en enterobacterias de

origen humano y ganadero. Así, probablemente, estos replicones mínimos que circulan

entre bacterias de diversos ecosistemas cumplan una función ventajosa para la bacteria,

posiblemente contribuyendo a incrementar la plasticidad de su genoma (Attéré et al.

2017).

En cuanto a la población de plásmidos de mayor tamaño, predominó

significativamente la familia MOBF12/IncF, seguida de MOBP12/IncI1. Sin embargo, los

determinantes de resistencia se repartieron entre una amplia variedad de familias que

incluía plásmidos conjugativos (MOBF12/IncF, MOBP12/IncI1, MOBF11/IncN;

MOBP3/IncX1) y no mobilizables (IncR). Esta distribución heterogenénea tanto de los

plásmidos como de las líneas genéticas asociadas a resistencia es más propia de los

ecosistemas naturales, donde habitualmente existe una baja o nula presión selectiva que

evita la selección y proliferación de determinados plásmidos/clones exitosos. Sin

embargo, en general, los módulos genéticos que albergaban estos genes de resistencia

fueron idénticos a los descritos en poblaciones bacterianas propias del entorno humano.

Cabe destacar, el importante rol que juega la secuencia de inserción IS26 en la

creación de complejas plataformas de resistencia y en su movilización intramolecular.

En el capítulo 3 (artículo 5) pudimos comprobar su implicación en la formación del

ampliamente distribuido módulo Tn21-blaSHV12-Tn1721 y del transposon compuesto

IS26-blaSHV-12-∆deoR-IS26. En este capítulo, el elemento IS26 se hallaba flanqueando

por ambos extremos el determinante blaTEM-1b, y los bloques de genes ∆repA-repC-sul2-

strA-strB y mph(A)-∆mrx-orf477-blaCTX-M-1-∆ISEcp1. Se ha comprobado

experimentalmente, que Tnp26 cataliza la formación de una unidad transponible

compuesta por una IS26 y uno o varios genes de resistencia y su inserción preferencial

en lugares adyacentes a una IS26 preexistente en la célula, favoreciendo la formación de

estas estructuras a modo de transposon compuesto (Harmer et al. 2016). Una vez

constituídos, estos módulos genéticos pueden movilizarse en bloque entre plásmidos

Discusión

291

pertenecientes a distintos grupos de incompatibilidad y/o regiones cromosómicas, lo que

explica su alta frecuencia en el genoma de bacterias del ecosistema humano y natural.

Precisamente esta IS26 también se localizó en el extremo 3’ de un integrón de

clase 1 que contenía el gen cassette dfrA5. La deleción del extremo 3’-CS (clásico o

atípico) característico de los integrones de clase 1 dificultó su identificación previa por

PCR convencional, ya que el cebador reverso empleado en la amplificación de la región

variable carecía de diana en este caso. Por este motivo, conviene tener en cuenta que su

prevalencia ha podido ser subestimada en estudios epidemiológicos basados en

metodologías tradicionales.

Los datos obtenidos por WGS también nos permitieron comprender la

organización y localización genética de los determinantes presentes en la cepa BLEE

C7328. Ésta fue caracterizada por técnicas convencionales en el artículo 1, pero

diversos aspectos no pudieron ser resueltos. Por un lado, el análisis de entornos por

técnicas de cartografía genética requiere preveer los elementos que pudieran estar

flanqueando un determinado gen, para el diseño específico de cebadores. La

movilización y aumento de expresión de blaCTX-M-1 se ha asociado mayormente a la

presencia de un elemento ISEcp1 situado aguas arriba del gen BLEE (Poirel et al.

2003). Sin embargo, en la cepa C7328 éste aparecía truncado y el gen codificante de

CTX-M-1 se hallaba inserto, junto con un segmento del operon de resistencia a

macrólidos (mphA-∆mrx), en el ya mencionado transposón compuesto flanqueado por 2

copias directas de IS26. Como se observó en el ciervo, esta estructura fue inicialmente

descrita en plásmidos IncN de cepas de E. coli de origen humano (Cullik et al. 2010).

Por otro lado, la reconstrucción del genoma bacteriano nos permitió entender porqué el

integrón atípico intI1-dfrA16-blaPSE-1-aadA2-cmlA-aadA1-qacH-IS440-sul3 no se

expresaba en la cepa receptora tras los ensayos de conjugación. Éste se hallaba inserto

en un complejo híbrido ∆Tn21-Tn1721, que también contenía el gen tet(A), localizado

en un integrón no conjugativo e inmóvil del grupo de incompatibilidad IncR.

Concretamente se trataba de un multirreplicón de aproximadamente 70 kb que

compartía una alta homología de secuencia con el hallado recientemente en una cepa de

E. coli de origen humano (pMRSN346638_67.9; Snesrud et al. 2017).

El análisis del viruloma mostró que la distribución de algunos factores variaba

en función del grupo filogenético. Así, la adhesina LpfA mostró una clara correlación

con el filogrupo B1, tal y como sugería un estudio previo realizado en una colección de

292

Discusión

cepas causantes de mastitis en bovinos (Dogan et al. 2012). Otros determinantes

frecuentemente asociados a patotipos ExPEC y APEC, como la toxina Vat o el receptor

sideróforo IroN, estaban también presentes en cepas comensales de animals salvajes,

única o preferentemente asociados al filogrupo B2. De hecho, esta asociación estaba en

relación con la localización de los mismos en islas de patogenicidad cromosómicas

previamente descritas en cepas extraintestinales humanas, insertas en los loci thrW

tRNA (vat) y serX tRNA (iroN) (Parham et al. 2005; Moriel et al. 2010). El gen iroN,

junto con otros determinanates de virulencia como iss, cva, tsh, cmb y/o cmb también se

localizó en plasmidos pColV (familia MOBF12), habitualmente asociados a patotipos

APEC. Éstos se hallaron distribuidos en cepas de varios filogrupos y muchos co-

portaban los genes iss, iroN y cva, que contituyen la llamada region conservada de estos

plásmidos y presenta cierta homología con algunas PAI cromosómicas (Johnson et al.

2006).

Además, observamos una correlación entre la presencia de bacteriocinas y el gen

iroN. Las colicinas V, B, y M compartían plataforma con el cluster iroNBCDE en los

plásmido pColV; mientras que la microcina H47 y los genes codificantes del receptor

sideróforo se colocalizaban en la isla de patogenicidad PAI-CFT073-serX. Nuestras

observaciones sustentan las hipótesis de algunos autores que consideran que la

integración de bacteriocinas y receptores de sideróforos suponen una ventaja para la

población commensal, pues facilitan la adaptación de E. coli a nichos competitivos

como el intestino. Sin embargo, en combinación con otros determinantes de virulencia

estas bacterias estarían también más capacitadas para invadir tejidos extraintestinales

causando infección (Martin et al. 2017).

La comparación del genoma core de bacterias de diversos orígenes en base a los

SNPs hallados en 674 regiones codificantes compartidas por las 280 cepas analizadas,

arrojó evidencias considerables. Por un lado la distribución de las cepas fue bastante

coherente con la obtenida en base al MLST, aunque con algunas discrepancias fruto de

la mayor resolución de las técnicas de WGS (7 genes vs todos los genes compartidos

por la colección en estudio). Sin embargo, lo más significativo fue observar como

dentro de una misma rama las cepas pertenecientes a humanos, animals de granja,

animals salvajes y muestras ambientales quedaban intercaladas. Es más, encontramos un

número de SNPs extremandamente bajo (≤10) entre ciertas cepas procedentes de

nuestra colección de animales salvajes y otras de humanos o ganado distantes

Discusión

293

geográficamente. No observamos líneas adaptativas en base al hospedador ni al área

geografica que nos permitan hablar de una diversificación del core. Éste parece estar

más bien distribuido universalmente. Nuestro resultados sugieren la existencia de un

flujo continuo de bacterias entre los distintos ecosistemas, más que una microevolución

paralela asociada al nicho u hospedador.

294

295

CONCLUSIONES

Conclusiones

297

I. Se observa una baja-moderada frecuencia de detección de E. coli resistentes

a los antibióticos en muestras fecales/intestinales de mamíferos salvajes

(11.1%), con una predominancia de la resistencia a agentes clásicos como las

tetraciclinas, penicilinas y sulfonamidas.

II. La resistencia a cefalosporinas de amplio espectro fue más prevalente en

aves salvajes (16%) que en mamíferos (1.4%), destacando las primeras

(especialmente, cigüeñas y rapaces) como importantes reservorios y

vehículos de E. coli BLEE/AmpC.

III. Las principales variantes BLEE/pAmpC detectadas en E. coli de fauna

silvestre fueron SHV-12 (52.6%), CTX-M-1 (21.1%), CTX-M-14 (15.8%) y

CMY-2 (10.5%), lo que se correlaciona con las descritas en años previos en

el ámbito humano y veterinario del área geográfica en estudio.

IV. El 82% de las cepas de E. coli BLEE mostraron un fenotipo multirresistente,

en muchos casos en relación con la portación de integrones de clase 1

conteniendo complejos arreglos de genes cassettes.

V. La resistencia a quinolonas en fauna silvestre se relacionó fundamentalmente

a la presencia de mutaciones cromosómicas en las topoisomeras GyrA y

ParC. Sólo detectamos un gen PMQR (qnrS1) en una cepa aislada de

lechuza, que también mostró doble mutación en gyrA.

VI. Nuestros resultados avalan la existencia de linajes exitosos (ST131, ST10,

ST155, ST224, ST38 y ST57) asociados a la diseminación de genes

BLEE/pAmpC entre el entorno humano, ganadero y natural.

VII. En fauna salvaje, las cepas de E. coli con genotipo resistente pertenecieron

principalmente al grupo filogenético B1. El filogrupo B2, se asoció a

virulencia extraintestinal y baja resistencia antibiótica, probablemente en

relación con la presencia de sistemas CRISPR/Cas I-F. Los clados crípticos

de Escherichia, distantes filogenéticamente de E. coli, son relativamente

comunes en el tracto gastrointestinal de mamíferos silvestres.

VIII. La diseminación horizontal del gen blaSHV-12 está mediada principalmente

por plásmidos conjugativos del grupo de incompatibilidad IncI1 (74%). El

subtipo IncI1/pST3 predomina en aves de granja, mientras que los plásmidos

pertenecientes al CC26 se hallan distribuidos en cepas de muy diversos

orígenes (humanos, perros, aves de granja, aves salvajes).

IX. La secuenciación completa de uno de los plásmidos IncI1 demostró la

298

Conclusiones

existencia del complejo de resistencia Tn21-blaSHV-12-ΔTn1721 en el módulo

de adaptación del plásmido, el cual parece desempeñar un papel importante

en la persistencia y diseminación del gen blaSHV-12 en distintos ecosistemas.

X. Los ensayos de restricción evidencian la transferencia lateral de plásmidos

IncK portadores de blaSHV-12 entre cepas locales no-ST131 y el clon

pandémico ST131.

XI. Identificamos un plásmido IncX3, no tipable por PBRT, coportador de los

genes blaSHV-12 y qnrS1. La reciente descripción de plásmidos con idénticas

características en cepas de E. coli de origen humano y animal en Europa

sugiere que la prevalencia y la relevancia epidemiológica del subgrupo

IncX3 podría estar subestimada.

XII. La localización y diversidad de genes cassettes de los integrones de clase 2

está altamente conservada en cepas de E. coli de distintos ecosistemas y

áreas geográficas. Las nuevas estructuras descritas se deben principalmente a

la integración de una amplia variedad de ISs en distintas localizaciones del

integrón de clase 2, lo que podría modular la expresión y movilización de

genes adyacentes o influir en su localización genómica y capacidad de

diseminación.

XIII. Los integrones de clase 2 se hallan mayoritariamente localizados a nivel

cromosómico en el sitio attTn7, adyacente al gen esencial glmS. Su

implicación en la co-transferencia de genes BLEE, a diferencia de lo

observado en integrones de clase 1, es practicamente nula.

XIV. Ciervos, muflones y jabalíes desempeñan un papel epidemiológico

importante en el mantenimiento y diseminación de cepas STEC y EPEC

potencialmente patógenas. Cabe destacar la detección de E. coli O145:H28

stx2a/eae-γ, asociada a SUH y colitis hemorrágica en humanos, en una

muestra fecal de ciervo, y de una cepa tEPEC O49:H10 eae-к aislada de

jabalí, cuyo perfil de virulencia y serotipo se ha descrito frecuentemente en

aislamientos de pacientes con diarrea.

XV. El análisis del genoma core y accesorio de cepas comensales de E. coli

descarta la existencia de fenómenos de microevolución paralela en el

intestino de hospedades silvestres. Las evidencias obtenidas sugieren la

existencia de un flujo continuo de bacterias y elementos genéticos móviles

entre los ecosistemas humano y natural.

299

CONCLUSIONS

Conclusions

301

I. A low to moderate frequency of antibiotic resistance was observed among

faecal/intestinal E. coli from wild mammals (11.1%), predominantly against

old antimicrobial agents such as tetracyclines, penicillins and sulfonamides.

II. Broad-spectrum cephalosporin resistance was more prevalent in wild birds

than in mammals (16% vs 1.4%), highlighting the first group (especially

storks and birds of prey) as important reservoirs and vehicles of

ESBL/AmpC-producing E. coli.

III. SHV-12 (52.6%), CTX-M-1 (21.1%), CTX-M-14 (15.8%) and CMY-2

(10.5%) were the main ESBL/pAmpC variants found in E. coli from

wildlife, which correlates with those previously described in both human and

veterinary settings in our country.

IV. Eighty-two percent of the ESBL-producing E. coli showed a multidrug-

resistant phenotype, which in most cases was associated with the carriage of

class 1 integrons containing long arrays of gene cassettes.

V. Mutations in the topoisomerases GyrA and ParC were found to be the major

cause of quinolone resistance. Only a PMQR determinant (qnrS1) was

detected in an isolate recovered from a barn owl.

VI. Our results support the existence of successful lineages (ST131, ST10,

ST155, ST224, ST38, ST57) associated with the spread of ESBL/AmpC

genotypes between human populations, domestic animals and natural

ecosystems.

VII. Most of the resistant E. coli isolates from wildlife belonged to the

phylogenetic group B1. B2 phylogroup was associated with ExPEC clones

and low antimicrobial resistance, probably in relation to the carriage of

CRISPR/Cas I-F systems. Cryptic Escherichia clades, phylogenetically

distant from E. coli, were quite common in wild mammal’s gut.

VIII. The horizontal dissemination of blaSHV-12 gene was mainly driven by IncI1

plasmids (74%). IncI1/pST3-like plasmids predominated in poultry, while

those belonging to CC26 were associated with a wide host range

contributing to the spread of SHV-12-encoding gene among different

ecosystems.

IX. Complete sequencing of an IncI1 plasmid revealed a Tn21-blaSHV-12-

∆Tn1721 resistance complex in the accessory module, which plays a major

role in the persistence and dissemination of SHV-12 enzyme.

302

Conclusions

X. Restriction assays reinforced the horizontal transfer of blaSHV-12-carrying

IncK plasmids from local non-ST131 isolates to the pandemic ST131 clone.

XI. We identified an IncX3 plasmid, not typeable by PBRT, co-harbouring

blaSHV-12 and qnrS1 genes. The recent description of similar plasmids in

humans and animals from different European regions, suggest that the

prevalence and epidemiological relevance of IncX3 subgroup could be

underestimated.

XII. The genetic organization and location of class 2 integrons was highly

conserved among E. coli from different ecosystems and geographic areas.

Novel structures were mainly due to the integration of a variety of ISs in

different sites of the class 2 integron, which might modulate the expression

and movilization of adjacent genes or define its genomic location and

dissemination capability.

XIII. Most class 2 integrons were chromosomally inserted at the attTn7 site,

adjacent to the housekeeping glmS gene. Its role in the co-transference of

ESBL genes is not significant.

XIV. Deer, mouflon and wild boars play an important epidemiological role in the

maintenance and dissemination of potentially pathogenic STEC and EPEC.

It is remarkable the detection of an E. coli O145:H28 stx2a/eae-γ, associated

with HUS and hemorrhagic colitis, in deer faeces, and a tEPEC O49:H10

eae-к isolated from a wild boar, frequently described in patients with

diarrhea.

XV. WGS analyses seem to rule out the occurrence of a parallel microevolution

of the E. coli genome in the gut of wild animals. Evidences suggest the

existance of an ongoing flow of both mobile elements and E. coli lineages

between human and natural ecosystems.

303

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ANEXOS

347

ANEXO 1

ST adk fumC gyrB icd mdh purA recA Origen ReferenciaST4564 10 11 4 478* 8 8 2 Erizo Capítulo 2ST4954 290 403 55 495* 35 358* 38 Ciervo Capítulo 1ST4996 6 607* 32 26 9 8 2 Erizo Capítulo 2ST7624 6 29 14 18 11 26 7 Ciervo Capítulo 5ST7629 6 4 4 16 660* 18 6 Roedor Capítulo 5ST7630 734* 1048* 456 287 235 42 37 Jabalí Capítulo 5ST7631 6 19 15 246 11 8 5 Roedor Capítulo 5ST7632 10 1049* 4 8 8 8 2 Jabalí Capítulo 5NR 51 48 467 NR* 235 42 37 Visón americano Capítulo 1

pST repI ardA trbA sogS pilL Origen ReferenciapST214 2 37* 4 1 2 Cigüeña Capítulo 3pST215 1 6 13 2 1 Humano Capítulo 3

Tabla S1. Nuevos ST descritos en esta tesis y registrados en las bases de datos públicas.

Tabla S2. Nuevos pST (plasmid ST) descritos en esta tesis y registrados en las bases de datos públicas.

* Alelos nuevos. pST215 deriva de una nueva combinación alélica.

* Alelos nuevos. NR: Número alélico o ST nuevo, pero no registrado en la base de datos.

348

ANEXO 2

Cebador Diana Secuencia (5'-3') ReferenciaDEOR-ge1 entorno del gen deor en IncX3 AGGGTACCGCTTTCCCAATC Capítulo 3pCAZ590_1 región shufflon plásmido pCAZ590 GGCTGTCTCAAGGGCAAGAT Capítulo 3pCAZ590_2 región shufflon plásmido pCAZ590 TCCGATGGATCATGGGTTCG Capítulo 3pCAZ590_3 región shufflon plásmido pCAZ590 TGGGCACAGGAGGATTTGTC Capítulo 3OrfX-F orfX pseudo-gen cassette GCTTGCCCTGACAGATAACG Capítulo 3ISSen4-R elemento ISSen4 CAACTGCCAAATACGACGG Capítulo 3ybfA-F gen ybfA GATGCCGAATGGATGGAT Capítulo 3IS100kyp-R elemento IS100 GGTTTTCCCCACACCTGATG Capítulo 3ybgA-out-R entorno del gen ybgA TCCGTAGGGAACACCTTGAG Capítulo 3EAE-R11 eae TCTTCGGAGGGTTTTTTATT Capítulo 4*EAE-FBN eae CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAAAC Capítulo 4*EAE-R12 eae CCAGACGAATATATACATATTC Capítulo 4*EAE-FBN eae CAGGTCGTCGTGTCTGCTAAAAC Capítulo 4*

Tabla S3. Listado de cebadores diseñados en esta tesis para la amplificación de secuencias específicas.

* Diseñados en el Laboratorio de referencia de E. coli.

349

ANEXO 3

Nº Acceso EMBL/GenBank Cepa Estructura genética Tamaño (pb) ReferenciaKU317749 C526 Integrón de clase 1 (5'CS-qacG -aadA6 -qacG -3'CS) 2.017 Capítulo 3LT621755 101689 Nuevo entorno genético bla SHV-12 3.143 Capítulo 3LT669764 111918 Plásmido IncI1 portador de bla SHV-12 117.387 Capítulo 3LT898484 C3309 Integrón de clase 2 (inserción ISSen4 ) 15.434 Capítulo 3LT898485 C7210 Integrón de clase 2 (inserción ISEcl1 ) 14.028 Capítulo 3LT898486 C7577 Integrón de clase 2 (inserción IS5 ) 13.871 Capítulo 3LT898487 pn424 Integrón de clase 2 (inserción IS21 ) 14.634 Capítulo 3

Tabla S4. Números de acceso y características de las secuencias nucleotídicas incluídas en el EMBL o GenBank.

350

ANEXO 4

Tabla S5. Información sobre las secuencias genómicas descargadas de la base de datos del NCBI para la construcción del arból filogenético basado en los SNP del core.

Strain name Source Country Biosample Bioproject ST155 ME160633 Human Ireland SAMEA104083455 PRJEB19435

MOD1-EC6779 Human Zambia SAMN04992127 PRJNA230969

IHD45_5 Human Cambodia SAMN03325983 PRJNA274331

KCJ9492 Chicken USA SAMN04510562 PRJNA298331

MOD1-EC5522 Chicken USA SAMN05440399 PRJNA230969

MOD1-EC6885 Mink USA SAMN04992251 PRJNA230969

MOD1-EC5722 Chicken USA SAMN05440438 PRJNA230969 AZ-TG73331 Chicken meat USA SAMN02628587 PRJNA230968

AZ-TG71327 Chicken meat USA SAMN02463254 PRJNA230968

KCh007 Chicken Japan SAMD00029119 PRJDB3552

MOD1-EC6811 Bovine USA SAMN04992175 PRJNA230969

AZ-TG73651 Chicken meat USA SAMN02628666 PRJNA230968

NC_STEC228 Soil USA SAMN06645904 PRJNA293225

20151201 Human Vietnam SAMEA104188693 PRJEB21997

AZ-TG60412 Chicken meat USA SAMN02442818 PRJNA230968

DTU2017-812-PR Chicken meat Denmark SAMEA104205902 PRJEB22091

MOD1-EC6936 Bovine USA SAMN04992302 PRJNA230969

2-316-03_S3_C3 Human Tanzania SAMN02680240 PRJNA233839

IHD717_3 Human Cambodia SAMN03326060 PRJNA274331

ST58 HICF112 Human UK SAMN04357562 PRJNA306133

KFu021 River Japan SAMD00053129 PRJDB4884

AZ-TG-713-2 Water USA SAMN04450992 PRJNA230968

MOD1-EC6870 Bovine USA SAMN04992236 PRJNA230969

ERS1341034 Human Netherlands SAMEA4429585 PRJEB15226

GN03624 Human USA SAMN04388560 PRJNA290784

MOD1-EC6943 Dog USA SAMN04992309 PRJNA230969

AZ-TG71543 Turkey meat USA SAMN02463308 PRJNA230968

AZ-TG73483 Chicken meat USA SAMN02628625 PRJNA230968

upec-203 Human USA SAMN02802024 PRJNA248737

ERS1812824 Human Congo SAMEA104153806 PRJEB21637

2013C-4350 Human USA SAMN03019947 PRJNA218110

MOD1-EC1634 Human Canada SAMN05607404 PRJNA230969

MOD1-EC6368 Parrot USA SAMN04992984 PRJNA230969

ERS1801995 Bovine Spain SAMEA104142977 PRJEB21546

CFSAN046659 Spinach USA SAMN05414504 PRJNA312475

MOD1-EC1626 Human Germany SAMN05607409 PRJNA230969

2011-70-34-3 Swine Denmark SAMEA3268813 PRJEB8647

ESC0198 Dog USA SAMN02368195 PRJNA203445

MOD1-ECOR34 Dog USA SAMN04913880 PRJNA230969 ST767 KPPUTH06 Human Thailand SAMN07450700 PRJNA389557

FSIS1703155 Swine USA SAMN07450955 PRJNA292667

ST162 MOD1-EC3564 Bovine USA SAMN05596239 PRJNA230969

MS7925 Human Australia SAMN07173914 PRJNA383436

181089 Human UK SAMN05171060 PRJNA315192

351

MOD1-EC6385 Human Argentina SAMN04993002 PRJNA230969

KCJ3858 Bovine USA SAMN04396087 PRJNA298331

AZ-TG71191 meat (bovine) USA SAMN02463220 PRJNA230968

AMA940 Human Denmark SAMEA3712541 PRJEB12145

VRES0107 Bovine UK SAMEA3753383 PRJEB8776

HICF191 Human UK SAMN04357615 PRJNA306133

upec-3 Human USA SAMN02802119 PRJNA248737

ME160327 Human Ireland SAMEA90399418 PRJEB19435

MT66C.C1 Chicken Vietman SAMEA104188708 PRJEB21997

287552 Human UK SAMN06006011 PRJNA315192

AZ-TG71423 Turkey meat USA SAMN02463278 PRJNA230968 AZ-TG73319 Chicken meat USA SAMN02628584 PRJNA230968

MOD1-EC6938 Okapi USA SAMN04992304 PRJNA230969

ST224 Ecol_583 Human USA SAMN05511172 PRJNA316786

MOD1-EC5135 Human USA SAMN04279473 PRJNA230969

JSWP021 Sewage Japan SAMD00076218 PRJDB5602

ERS1340998 Human Netherlands SAMEA4429549 PRJEB15226

1508493 1STR1-Eco 141 Bovine Belgium SAMEA104142822 PRJEB21546

HICF32 Human UK SAMN04357516 PRJNA306133

NC_P10-04 Poultry Uganda SAMN06677723 PRJNA293225

NC_P19-11 Poultry Uganda SAMN06848984 PRJNA293225

HE-MDREc53 Human USA SAMD00052673 PRJDB4868

upec-205 Human USA SAMN02802026 PRJNA248737

KCJK1866 Bovine USA SAMN05757714 PRJNA298331

KCJK1916 Bovine USA SAMN05757745 PRJNA298331

HICF32 Human UK SAMN04357516 PRJNA306133

AZ-TG-WCHI-8 Wastewater USA SAMN04450979 PRJNA230968

AZ-TG73343 Chicken meat USA SAMN02628590 PRJNA230968

MOD1-EC5070 Rhinoceros USA SAMN04279407 PRJNA230969

ST939 IHD717_9 Human Cambodia SAMN03326066 PRJNA274331

NC_STEC242 Manure USA SAMN07469552 PRJNA293225

ERS1724554 Human Denmark SAMEA104060661 PRJEB20792

MOD1-EC3793 Bovine USA SAMN05440254 PRJNA230969

CFSAN044415 meat (bovine) USA SAMN04902864 PRJNA230969

IHD717_16 Human Cambodia SAMN03326073 PRJNA274331

ST5869 SCK02-43 Human Netherlands SAMEA4427901 PRJEB15226

ST1642 E123 Chicken Denmark SAMN05981813 PRJNA352460

SCP21-24 Human Netherlands SAMEA4428509 PRJEB15226

MOD1-EC6847 Human USA SAMN04992213 PRJNA230969

ST1423 195745 Human UK SAMN05170676 PRJNA315192 MOD1-EC6953 Klipspringer USA SAMN04992319 PRJNA230969 MOD1-EC3584 Bovine USA SAMN05596345 PRJNA230969 MOD1-EC5737 Bovine USA SAMN05439294 PRJNA230969 ST906 AZ-TG98487 Elk USA SAMN07549825 PRJNA230968

AZ_TG78596 White-tailed deer USA SAMN04125194 PRJNA230968

352

MOD1-EC6835 Bovine USA SAMN04992201 PRJNA230969

UMB08_01.1uog Human USA SAMN04606426 PRJNA269984

KCJK2721 Bovine USA SAMN05163873 PRJNA298331

MOD1-EC5440 Soil USA SAMN05452839 PRJNA230969

NC_STEC173 Cucumber SAMN06645880 PRJNA293225

upec-33 Human USA SAMN02802123 PRJNA248737

VREC0426 Bovine UK SAMEA3472083 PRJEB8774 KCJ1232 Bovine USA SAMN04191558 PRJNA298331

CFSAN041116 Lettuce USA SAMN04273142 PRJNA230969

CFSAN045100 Leafy Greens USA SAMN04422341 PRJNA230969

149438 Human UK SAMN05966787 PRJNA315192

MOD1-EC5122 Dog USA SAMN04279460 PRJNA230969

ST26 272422 Human UK SAMN06040333 PRJNA315192

182138 Human UK SAMN06029396 PRJNA315192

93272 Human UK SAMN06017286 PRJNA315192

ST1308 AZ-TG71555 Turkey meat USA SAMN02463311 PRJNA230968

DTU2011_26 Swine Denmark SAMEA3268837 PRJEB8647

1657 Human Indonesia SAMEA1031202 PRJEB2581

VREC0418 Bovine UK SAMEA3472069 PRJEB8774

KMi019 River Japan SAMD00053157 PRJDB4884

ST388 SCP29-34 Human Netherlands SAMEA4428949 PRJEB15226

VREC0506 Bovine UK SAMEA3752553 PRJEB8774

MOD1-EC5153 Bovine USA SAMN04279491 PRJNA230969

VREC0504 Bovine UK SAMEA3751071 PRJEB8774

MOD1-EC3330 Bovine USA SAMN05595849 PRJNA230969

MOD1-EC6332 Meet (beef) USA SAMN05440432 PRJNA230969

140183 Human UK SAMN06015110 PRJNA315192

MOD1-EC5167 Swine USA SAMN04279506 PRJNA230969

AZ-TG71195 Meat (beef) USA SAMN02463221 PRJNA230968

ST295 MOD1-EC5105 White-tailed deer USA SAMN04444411 PRJNA230969 H124600634 Human UK SAMN03492212 PRJNA259645 MOD1-EC5111 Bovine USA SAMN04279447 PRJNA230969 1599 Human Argentina SAMEA1317753 PRJEB2796 703 Human Guatemala SAMEA1317744 PRJEB2796 UMEA 3201-1 Human Sweden SAMN01885926 PRJNA186316 509sc Human Mexico SAMEA1531067 PRJEB2827 5051 Human India SAMEA1031195 PRJEB2581 998 Human Egypt SAMEA1317826 PRJEB2796 246164 Human UK SAMN05163814 PRJNA315192 ST1718 MOD1-EC6716 Parrot USA SAMN04992546 PRJNA230969

ST10

MOD1-EC6966 Slender-horned gazel USA SAMN04992332 PRJNA230969

MOD1-EC6978 Dog) USA SAMN04992344 PRJNA230969

MOD1-EC6802 Bovine USA SAMN04992166 PRJNA230969

IEH-NGS-ECO-00205 Vegetables USA SAMN04429914 PRJNA230969

2012C-3377 Human US SAMN02991194 PRJNA218110 CDPHFDLB-F1602032-004B Bovine USA SAMN05275919 PRJNA277984

353

C260_92 Human Italy SAMN02435961 PRJNA79239

MOD1-ECOR25 Dog USA SAMN04158362 PRJNA230969

7-233-03_S3_ Human Tanzania SAMN02687488 PRJNA233845

MOD1-EC5706 Poultry USA SAMN05452915 PRJNA230969

2011-70-41-2 Swine Denmark SAMEA3268833 PRJEB8647 IHD813_16 Human Cambodia SAMN03326089 PRJNA274331

IHD813_9 Human Cambodia SAMN03326082 PRJNA274331

MOD1-EC6897 Mink USA SAMN04992263 PRJNA230969

MOD1-EC1638 Swine Italy SAMN05607400 PRJNA230969

MOD1-EC6577 Bovine Canada SAMN04992402 PRJNA230969

blood-10-1009 Human USA SAMN02801879 PRJNA248737 KFu023 River Japan SAMD00053131 PRJDB4884

H134240608 Human UK SAMN03492675 PRJNA248042

KMi024 River Japan SAMD00053162 PRJDB4884

MOD1-EC7010 Water USA SAMN04992376 PRJNA230969

ESC0167 Dog USA SAMN02368174 PRJNA203445

FSIS 210115784 Bovine USA SAMN04293387 PRJNA292667

RR1 Human SAMN03384316 PRJNA272568 MOD1-EC5700 Pronghorn USA SAMN05452920 PRJNA230969

MGH108 Human SAMN03280204 PRJNA271899

MOD1-EC3605 Bovine USA SAMN05596397 PRJNA230969 KCJK4181 Soil USA SAMN05363780 PRJNA298331 KCJK4201 Soil USA SAMN05408390 PRJNA298331

JEONG-9567 Bovine USA SAMN04160767 PRJNA298331

2011-70-219-2 Swine Denmark SAMEA3268855 PRJEB8647

ST69 283_ECOL Human USA SAMN03197477 PRJNA267549

966_ECOL Human USA SAMN03198186 PRJNA267549

blood-09-1294 Human USA SAMN02801858 PRJNA248737

PA20B Human Australia SAMEA2392724 PRJEB5742

18.1-R1 Human SAMN05567362 PRJNA335932 AZ-TG-WCHI-3 Wastewater USA SAMN04448145 PRJNA230968

JSWP001 Sewage Japan SAMD00076198 PRJDB5602

775_SBOY Human USA SAMN03197985 PRJNA267549

EC-F86E-R-141010 Human Singapore SAMEA3920428 PRJEB13304

SEQ895 Human USA SAMN00623094 PRJNA66227

HICF2 Human UK SAMN04357497 PRJNA306133

CFSAN061770 Cheese Egypt SAMN06928086 PRJNA230969

1351 Human Germany SAMEA3180512 PRJEB8084

Kmi017 River Japan SAMD00053155 PRJDB4884

NA Human Pakistan SAMN03074765 PRJNA261540

ESC0211 Sheep Papua New Guinea SAMN02368206 PRJNA203445

2-316-03_S1_C2 Human Tanzania SAMN02689038 PRJNA233728

E2026_9 Water Australia SAMN06109006 PRJNA356186

MOD1-EC6831 Bovine USA SAMN04992197 PRJNA230969

KMi011 River Japan SAMD00053149 PRJDB4884

MOD1-EC6900 Mink USA SAMN04992266 PRJNA230969

AZ-TG71539 Turkey meat USA SAMN02463307 PRJNA230968

OH-17-6342 Bovine USA SAMN07229622 PRJNA338676

E. coli_R1 Swine Denmark SAMEA4464657 PRJEB15511

ST131 KO178B Raven Czech Republic SAMN04273115 PRJNA295914

354

KO198B Raven Serbia SAMN04273116 PRJNA295914 F283 Raven USA SAMN04273110 PRJNA295914 JSWP014 Sewage Japan SAMD00076211 PRJDB5602 cam_1531_1 Human Cambodia SAMN04159619 PRJNA297860 10B06797 Human Thailand SAMN04159585 PRJNA297860 MS2481 Human Australia SAMEA1486653 PRJEB2968 184_ECOL Human USA SAMN03197375 PRJNA267549

la_1424 Human Laos SAMN04159627 PRJNA297860 AZ684313 Human France SAMN04159647 PRJNA297860 AM_LREC-98 Human Spain SAMEA92127418 PRJEB19190 2010031282 Human Spain SAMEA1486614 PRJEB2968 HS115 Raven Serbia SAMN04273112 PRJNA295914 2-460-02_S1_C2 Human Tanzania SAMN02689041 PRJNA233730 J21 Human China SAMN04273114 PRJNA295914 HVH 177 (4-2876612) Human Denmark SAMN01885818 PRJNA186205 AM_LREC-61 Sewage Spain SAMEA92116918 PRJEB19190 AM_LREC-109 Swine Spain SAMEA92141668 PRJEB19190 AZ-TG60445 Turkey meat USA SAMN02442854 PRJNA230968 MOD1-EC54 Water USA SAMN05440287 PRJNA230969 AM_LREC-128 Chicken meat Spain SAMEA92140918 PRJEB19190 AZ-TG73171 Chicken meat USA SAMN02628547 PRJNA230968 412049521 Chicken meat Denmark SAMEA3952454 PRJEB13885 AM_LREC-63 River Spain SAMEA92138668 PRJEB19190 DTU2017-821-PRJ1111 Chicken meat Germany SAMEA104205911 PRJEB22091 AM_LREC-15 Chicken meat Spain SAMEA92136418 PRJEB19190 KFu031 River Japan SAMD00053139 PRJDB4884 KTa003 River Japan SAMD00053193 PRJDB4884 ST1170 AZ-TG73315 Chicken meat USA SAMN02628583 PRJNA230968 VREC0559 Turkey UK SAMEA3753304 PRJEB8774 SCK53-23 Human Netherlands SAMEA4429607 PRJEB15226 ST135 AZ_TG76998 Chicken meat USA SAMN03295432 PRJNA230968 ERS1340929 Human Netherlands SAMEA4429480 PRJEB15226

AZ-TG73251 Chicken meat USA SAMN02628567 PRJNA230968

MOD1-EC5432 Soil USA SAMN06240039 PRJNA230969

MOD1-EC6529 Chicken India SAMN04993151 PRJNA230969

MOD1-EC6891 Mink USA SAMN04992257 PRJNA230969

12_ECOL Human USA SAMN03197161 PRJNA267549

upec-128 Human USA SAMN02801940 PRJNA248737

ME160685 Human Ireland SAMEA104091836 PRJEB19435

UMB12_01.1uot Human SAMN04606432 PRJNA269984

ST104 KTE141 Human Denmark SAMN00854673 PRJNA164985 KTE187 Human SAMN00974042 PRJNA163387 EDZFRVQ5 Human Denmark SAMEA104060891 PRJEB20792 29618 Human UK SAMN05965842 PRJNA315192 GN02531 Human USA SAMN03922992 PRJNA290784 ST567 KTE126 Human Denmark SAMN00854665 PRJNA164969

MOD1-EC3102 Swine USA SAMN05597370 PRJNA230969

SCP24-18 Human Netherlands SAMEA4429670 PRJEB15226

ST625

355

MOD1-EC6825 Mink USA SAMN04992191 PRJNA230969

MOD1-EC6946 Dog USA SAMN04992312 PRJNA230969

MOD1-EC6868 Turttle USA SAMN04992234 PRJNA230969

MOD1-EC707 Human USA SAMN05591522 PRJNA230969

MOD1-EC5194 Dog USA SAMN04279533 PRJNA230969

MOD1-EC5196 Cat USA SAMN04448470 PRJNA230969

C-0863N0015 Dog UK SAMEA3681630 PRJEB11950

356

ANEXO 5: Artículo de revisión