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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Encapsulação de compostos bioativos de Syzygium aromaticum em

carreadores lipídicos sólidos

Tese de doutorado apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do

título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Medicamentos e Cosméticos

Orientado: Diego Francisco Cortés Rojas

Orientador: Prof. Dr. Wanderley P. Oliveira

Co-orientadora: Dra. Cláudia R. F. Souza

Versão corrigida da Tese de Doutorado apresentada ao programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas em 04/09/2015. A versão original encontra-se disponível na

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP

RIBEIRÃO PRETO

2015

Trabalho realizado no Departamento de

Ciências Farmacêuticas da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, no Laboratório de

P&D em Processos Farmacêuticos, sob a

supervisão do Prof. Dr. Wanderley Pereira de

Oliveira e Dra Cláudia R. Fernandes Souza.

Apoio Financeiro:

FAPESP

FICHA CATALOGRÁFICA

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Cortés-Rojas, Diego Francisco

Encapsulação de compostos bioativos de Syzygium aromaticum

em carreadores lipídicos sólidos. Ribeirão Preto, 2015.

160 p. : il. ; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: Medicamentos e

Cosméticos. Orientador: Oliveira, Wanderley Pereira.

Co-orientadora: Souza,Claudia R. Fernandes.

1. Microencapsulação. 2. Formulações lipídicas. 3. Cravo da Índia.

4. Eugenol. 5. Spray drying 6. Compostos bioativos

FOLHA DE APROVAÇÃO

Diego Francisco Cortés Rojas

Encapsulação de compostos bioativos de Syzygium aromaticum em carreadores lipídicos

sólidos.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção

do Título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Medicamentos e Cosméticos

Orientador: Prof. Dr. Wanderley Pereira Oliveira

Co-orientadora: Dra. Claudia R. Fernandes Souza

Aprovado em: ____/____/______

Banca Examinadora

Prof. (a) Dr.(a)_______________________________________________________

Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________

Prof. (a) Dr.(a)_______________________________________________________


Prof. (a) Dr.(a)_______________________________________________________


Prof. (a) Dr.(a)_______________________________________________________


Prof. (a) Dr.(a)_______________________________________________________


Dedico este trabajo a mi amado padre Teófilo

por el ejemplo que fue para mi vida. A mi

mamá Gloria y mis hermanos Maria Elena y

José David por haberme apoyado durante esta

etapa de mi vida, por las dificultades que

enfrentaron cuando yo estaba lejos.

Ao meu grande amor Juliana por estar ao meu

lado, por sua companhia incondicional, por

ser um apoio constante e por tantos momentos

de felicidade que passamos juntos.

Espero ficar sempre ao seu lado!!

Agradecimentos

Agradeço a Deus por ter me permitido viver tantas experiências boas, conhecer

pessoas maravilhosas e aprender muitas coisas novas.

Ao Professor Wanderley por sua paciência e disposição para orientar este trabalho e

por compartilhar seus conhecimentos e experiência comigo.

À Claudia por sua amizade e suas valiosas contribuições teóricas e práticas na

execução do projeto.

Ao Prof. Dr. Guether Hochhaus e o Dr. Chen Mongjen pela colaboração e orientações

durante a execução de experimentos com cultura de células na Universidade da Flórida.

Ao Marcelo pelo apoio técnico e amizade.

Ao grupo do Laboratório LAPROFAR.

Ao Adroaldo do CEPLAC, Valença-BA, pela ajuda na coleta da matéria-prima

vegetal.

Ao Brasil e a Universidade de São Paulo por abrir suas portas aos estudantes

estrangeiros, por todo o suporte oferecido em seus programas acadêmicos e infraestrutura.

Aos meus amigos de faculdade.

À Universidade Nacional da Colômbia e especialmente aos docentes da Faculdade de

Farmácia pela formação ministrada durante a graduação.

A todos que participaram de forma direta e indireta no desenvolvimento deste

trabalho.

À FAPESP pelo apoio financeiro, processo No. 2012/09890-6 (doutorado), e

2014/01898-3 (processo bolsa estágio pesquisa no exterior, BEPE).

Meus sinceros agradecimentos!

Nunca deixe ninguém dizer que você não pode

fazer alguma coisa. Se você tem um sonho, tem

que correr atrás dele.

(À procura da Felicidade)

RESUMO

Cortés-Rojas, D.F. Encapsulação de compostos bioativos de Syzyguim aromaticum em

carreadores lipídicos sólidos. 2015. 157 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.

Compostos de origem vegetal podem apresentar inúmeros efeitos benéficos à saúde, havendo,

entretanto, uma necessidade de desenvolver formulações que permitam viabilizar seu uso

farmacêutico, alimentício, nutracêutico ou cosmecêutico. Syzygium aromaticum, conhecido

popularmente como cravo da Índia, é uma espécie vegetal aromática com marcada atividade

antioxidante, analgésica e antimicrobiana. A baixa solubilidade e estabilidade química, assim

como a volatilidade dos principais compostos associados às atividades biológicas da planta

justificam o desenvolvimento de formulações que melhorem suas propriedades físico-

químicas e características de liberação. Formulações lipídicas têm sido cada vez mais usadas

para o aumento da solubilidade de compostos no trato gastrointestinal e para o aumento da

biodisponibilidade. O principal objetivo deste projeto foi investigar a produção de

formulações lipídicas sólidas contendo compostos bioativos de S. aromaticum e avaliar o

efeito da composição da formulação e das variáveis operacionais nas propriedades físico-

químicas das partículas, estabilidade e permeação intestinal in vitro. O processo de extração

dos compostos a partir da matéria-prima vegetal também foi estudado. A formulação lipídica

foi otimizada com respeito ao tipo e a proporção dos lipídeos, do emulsificante e dos

carreadores de secagem. Os processos de emulsificação e secagem também foram

criteriosamente estudados. Os resultados mostraram que a composição da formulação teve

efeitos significativos nas propriedades físico-químicas do produto e no desempenho da

secagem. A formulação lipídica otimizada mostrou ser mais estável que a formulação não

lipídica em condições de armazenamento de alta umidade. Com relação à permeação

intestinal in vitro, utilizando eugenol como marcador, não foram observadas diferenças

significativas entre estas duas formulações. Este projeto permitiu obter informações relevantes

sobre a secagem por spray drying de formulações lipídicas contendo extratos vegetais. Esta

rota tecnológica representa uma estratégia interessante na obtenção de formulações lipídicas

estáveis que promovam o aumento da biodisponibilidade oral de compostos bioativos.

Palavras chave: antioxidante, atomização, cravo, spray drying, formulações lipídicas

ii

ABSTRACT

Cortés Rojas, D.F. Encapsulation of bioactive compounds from Syzygium aromaticum in

solid lipid carriers. 2015. 157 f. Thesis (Doctoral). School of Pharmaceutical Sciences of

Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.

Plant-derived compounds can provide important benefits to human health. However, these

compounds should be properly formulated in order to facilitate their pharmaceutical,

nutraceutical, food or cosmetic applications. Syzygium aromaticum commonly known as

Indian clove, is an aromatic tree with antioxidant, antimicrobial and analgesic properties. The

poor water solubility and the volatility of the compounds associated to the biological

activities, justify the development of formulations that improve its physicochemical and

release properties. Lipid based formulations have gained special attention for oral delivery

due to the improvement of solubility in the intestinal tract and increase of bioavailability. The

main objective of this project was to investigate the production of solid lipidic formulations

containing bioactive compounds of S. aromaticum and to test the effect of the formulation

composition and the process variables on the physhicochemical properties of the particles,

stability and in vitro intestinal permeation. The extraction methods of the compounds from the

plant were also studied. The lipid formulation was optimized with regard to the type and

proportion of the solid lipid, the surfactant and the drying carrier. The emulsification and the

drying processes were carefully evaluated. Results showed that the formulation composition

had significant effects on the physicochemical properties of the product and on the drying

performance. The optimized lipid formulation was more stable than the formulation without

lipids in high humidity stress storage conditions. With regard to the in vitro intestinal

permeation using eugenol as marker compound, not significant differences were observed

between the samples. This project allowed to obtain relevant information about the spray

drying process of lipid formulations containing plant extracts. This technique could be an

interesting strategy to obtain stable lipid formulations than enhance the oral bioavailability of

bioactive compounds.

Key words: antioxidant, spray drying, clove, lipid formulations

iii

RESUMEN

Cortés-Rojas, D.F. Encapsulación de compostos bioactivos de Syzygium aromaticum em

sistémas lipídicos sólidos. 2015. 157 f. Tesis (Doctorado). Faculdad de Ciencias

Farmaceuticas de Ribeirão Preto – Universidad de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.

Compuestos de origen vegetal pueden presentar diversos efectos benéficos para la salud, sin

embargo, existe la necesidad de desarrollar formulaciones que permitan viabilizar su uso

farmacéutico, alimentício, nutracéutico o cosmético. Syzygium aromaticum, conocida

popularmente como clavo de la India, es una espécie vegetal aromática con elevada actividad

antioxidante, analgésica y antimicrobiana. La poca solubilidad y estabilidad química así como

la alta volatilidad de los principales compuestos de la planta asociados a la actividad biológica

justifican el desarrollo de formulaciones que mejoren sus propiedades fisicoquímicas y

características de liberación. Formulaciones lipidias están siendo cada vez más usadas para

aumentar a solubilidad de los compuestos en el tracto gastrointestinal y para aumentar la

biodisponibilidad. El principal objetivo de este proyecto fue investigar la producción de

formulaciones lipídicas sólidas de compuestos bioactivos de S. aromaticum y evaluar el efecto

de la composición de la formulación y de las variábles operacionales en las propiedades

fisicoquímicas de las partículas, estabilidad y permeación intestinal in vitro. El proceso de

extracción de los compuestos a partir del material vegetal también fue estudiado. La

formulación lipídica fue optimizada con respecto al tipo y proporción de los lípidos,

tensoactivos y adjuvantes de secado. Los procesos de emulsificación y secado también fueron

críticamente estudiados. Los resultados mostraron que la composición de la formulación tuvo

efectos significativos en las propiedades fisicoquímicas del producto y en el desempeño del

proceso de secado. La formulación lipídica optimizada fue mas estable que la formulación sin

lípidos cuando fue almacenada en condiciones de alta humedad. Con respecto a la permeación

intestinal in vitro, utilizando eugenol como marcador, no fueron observadas diferencias

significativas entre estas dos formulaciones. Este proyecto permitió obtener informaciones

relevantes sobre el proceso de secado por spray drying de formulaciones lipídicas

conteniendo extractos vegetales. Esta ruta tecnológica representa una estrategia interesante en

la obtención de formulaciones lipídicas estables que promuevan el aumento de la

biodisponibilidad oral de compuestos bioactivos.

Palabras clave: antioxidante, aspersión, clavo, spray drying, formulaciones lipídicas

iv

Lista de figuras

Figura 1. Estruturas moleculares dos principais compostos isolados de Syzygium aromaticum.

Eugenol (a), acetato de eugenol (b), ácido gálico (c) e β-cariofileno (d). ................................ 6

Figura 2. Potenciais efeitos de lipídeos e excipientes lipídicos na absorção de fármacos

(Porter et al., 2007). Aumento da solubilização do fármaco no trato intestinal pela alteração da

composição e caráter do ambiente coloidal: micelas e vesículas (a). Transporte e metabolismo

mediado por enterocitos (b). Alteração da via de absorção através do sistema linfático

evitando o efeito de primeira passagem pelo fígado (c). ....................................................... 18

Figura 3. Processo de cristalização durante o armazenamento de partículas lipídicas sólidas

(SLN) e carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) (Muller et al., 2002). ....................... 19

Figura 4. Esquema do processo de homogeneização a alta pressão

(http://www.artepeças.com.br) ............................................................................................. 21

Figura 5. Esquema do processador ultrasônico. ................................................................... 23

Figura 6. Representação dos principais mecanismos físico-químicos da instabilidade das

emulsões (McClements, 2007). ............................................................................................ 29

Figura 7. Fluxograma das etapas envolvidas no desenvolvimento deste projeto. .................. 48

Figura 8. Montagem do sistema utilizado para a extração micelar. ...................................... 52

Figura 9. Esquema de sistema Transwell com cultura de células Caco-2 (www.

corning.com).............................................................................................................................66

Figura 10. Distribuição granulométrica do pó obtido dos botões florais moídos de Syzygium

aromaticum obtida por tamisação e expressa como porcentagem acumulada. ...................... 68

Figura 11. Ponto de fusão dos lipídeos utilizados no screening e das misturas com o óleo de

Syzygium aromaticum, nas concentrações de 20, 40 e 60 %. ................................................. 71

Figura 12. Cromatogramas dos padrões eugenol e acetato de eugenol (a), formulação líquida

(b) e formulação sólida (c). .................................................................................................. 72

Figura 13. Curva analítica do eugenol (a) y = 18668,6x - 12730,5; R2=0,9990 e acetato de

eugenol (b) y = 8496,7x + 7752,8; R2=0,9963 ...................................................................... 73

Figura 14. Efeito do EHL do tensoativo na extração micelar de eugenol. Letras iguais nas

colunas indicam que não existe diferença significativa segundo o teste de Tukey (p≤0,05). .. 76

Figura 15. Efeito do tipo e concentração do tensoativo na extração micelar de eugenol. Letras

iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa entre as amostras segundo o

teste de Tukey (p≤0,05). ....................................................................................................... 78

Figura 16. Teor de polifenóis em função do EHL na extração micelar. Letras iguais nas

colunas indicam que não existe diferença significativa entre as amostras segundo o teste de

Tukey (p≤0,05). ................................................................................................................... 80

v

Figura 17. Atividade antioxidante in vitro determinada pelo método de ABTS em função do

EHL na extração micelar, expressa como µmol de Trolox por grama de matéria-prima. Letras


teste de Tukey (p≤0,05). ....................................................................................................... 81

Figura 18. Retenção de eugenol e acetato de eugenol nas formulações sólidas obtidas nos

ensaios preliminares de formulação. Letras iguais nas colunas indicam que não existe

diferença significativa entre as amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05). ....................... 83

Figura 19. Porcentagem de recuperação de massa após spray drying das formulações

preparadas nos ensaios preliminares (Tabela 1). ................................................................... 85

Figura 20. Atividade antioxidante in vitro das formulações sólidas obtidas nos ensaios

preliminares (expressas como µmol equivalentes de Trolox por mg de pó). Letras iguais nas


Tukey (p≤0,05). ................................................................................................................... 86

Figura 21. Dispersibilidade em água dos pós obtidos por spray drying nos ensaios

preliminares. Letras iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa entre as

amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05). ....................................................................... 87

Figura 22. Comparação das técnicas de homogeneização e secagem quanto à concentração de

eugenol (a) e acetato de eugenol (b). Letras iguais nas colunas indicam que não existe

diferença significativa entre as amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05). ....................... 90

Figura 23. Análises morfológicas das formulações lipídicas F1(a), F2 (b), F3 (c), F4 (d), F5

(e) por microscopia eletrônica de varredura. ......................................................................... 93

Figura 24. Morfologia das partículas obtidas por spray drying e liofilização. ...................... 94

Figura 25. Porcentagem de retenção de eugenol (a) e acetato de eugenol (b), após atomização

em spray dryer, em função do EHL da formulação e a temperatura do ar de secagem. Letras

ou números iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa entre as

amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05). *Devido ao alto desvio padrão esta amostra foi

excluída da análise de variância ........................................................................................... 95

Figura 26. Perda por dessecação das formulações sólidas obtidas por spray drying. ............ 97

Figura 27. Tamanho de partícula dos pós obtidos por spray drying a partir das formulações

lipídicas no estudo da influência do EHL do tensoativo. ....................................................... 99

Figura 28. Imagens (MEV-FEG) dos sistemas particulados da formulação EHL 0 à 90 °C (a),

EHL 2 à 90 °C (b), EHL 13 à 90 °C (c), EHL 13 à 140 °C (d), fragmento de parede de

partícula da formulação EHL 13 à 140 °C (e), EHL 29 à 90 °C (f). .................................... 100

Figura 29. Reogramas das formulações preparadas para o estudo do efeito da proporção dos

componentes da formulação. P1(a), P2 (b), P3 (c), P4 (d), P5 (e), P6 (f) e P7 (g)................ 103

vi

Figura 30. Retenção de eugenol após spray drying das formulações selecionadas P2 e P5 no

estudo da influencia da proporção dos componentes da formulação. ................................... 104

Figura 31. Porcentagem de retenção de eugenol e da atividade antioxidante dos pós obtidos

por spray drying das formulações preparadas para o estudo da influência do lipídeo

apresentadas na Tabela 5. ................................................................................................... 107

Figura 32. Difractogramas de raios-X das formulações preparadas para avaliar o efeito dos

componentes da formulação (a). Difractogramas do compritol (b), gelucire 50/13 (c), goma

arábica (d). ......................................................................................................................... 111

Figura 33. Termogramas das formulações preparadas para o estudo da influência dos

componentes (CSD) e dos adjuvantes: Compritol (b), Gelucire 50/13 (b) e goma arábica (c).

.......................................................................................................................................... 112

Figura 34. Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das partículas

sólidas de cada formulação no estudo da influência dos componentes. CSD1 (a), CSD2 (b),

CSD3 (c), CSD4 (d) e CSD5 (e). ........................................................................................ 114

Figura 35. Imagens obtidas por microscopia confocal da formulação lipídica CSD5 com os

corantes vermelho do Nilo e FITC. Formulação líquida (a), Formulação sólida dispersa em

água (b), formulação sólida dispersa em isopropanol (c) e ampliação das partículas da

formulação sólida dispersa em isopropanol (d). .................................................................. 115

Figura 36. Estudo de estabilidade das formulações CSD4 e CSD5 mostrando a retenção de

eugenol em duas temperaturas (25 e 40°C) e duas umidades relativas (32,4 e 63,5%)......... 117

Figura 37. Variação de peso das formulações secas CSD4 e CSD5 durante o estudo de

estabilidade. ....................................................................................................................... 118

Figura 38. Estudos bidirecional de transporte de eugenol, apical-basal (AB) e basal-apical

(BA). Os resultados são expressos como coeficiente de permeação (Papp). Letras iguais nas


Tukey (p≤0,05). ................................................................................................................. 120

Figura 39. Estudo de permeação das formulações lipídicas contendo extrato de cravo e do

extrato liofilizado utilizado como controle. Os resultados são expressos como coeficiente de

permeação (Papp). Letras iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa

segundo o teste de Tukey (p≤0,05). .................................................................................... 121

vii

Lista de tabelas

Tabela 1. Composição das formulações elaboradas nos ensaios preliminares (p/p). ............. 59

Tabela 2. Composição das formulações elaboradas para a avaliação da influência do EHL do

tensoativo (% p/p). ............................................................................................................... 61

Tabela 3. Proporções de fase lipídica, tensoativo e razão maltodextrina DE10:Goma arábica

(MD:GA) nas sete formulações preparadas para o estudo da influência da proporção dos

componentes na formulação. ................................................................................................ 62

Tabela 4. Composição das formulações preparadas para o estudo da influência da proporção

de fase lipídica, tensoativo e razão maltodextrina:goma arábica (% p/p). .............................. 62

Tabela 5. Composição das formulações utilizadas na avaliação da influência do lipídeo e dos

componentes da formulação (% p/p). ................................................................................... 64

Tabela 6. Resultados do screening de lipídeos pelo ensaio da mancha em papel de filtro. .... 70

Tabela 7. Precisão e exatidão do método para quantificação por HPLC de eugenol e acetato

de eugenol nas formulações líquida e sólida. ........................................................................ 74

Tabela 8. Robustez do método analítico para quantificação por HPLC de eugenol e acetato de

eugenol em formulações lipídicas de cravo. ......................................................................... 75

Tabela 9. Tamanho de partícula, índices de fluidez e atividade de água das formulações

sólidas obtidas por spray drying nos ensaios preliminares. ................................................... 88

Tabela 10. Atividade de água das formulações sólidas obtidas por spray drying no estudo da

influência do EHL do tensoativo. ......................................................................................... 98

Tabela 11. Tamanho de partícula médio das formulações líquidas elaboradas para o estudo da

influência da proporção dos componentes da formulação. .................................................. 101

Tabela 12. Caracterização das partículas sólidas obtidas por spray drying das formulações

preparadas para avaliar o efeito da proporção dos componentes da formulação. ................. 105

Tabela 13. Propriedades físico-químicas das formulações elaboradas para o estudo da

influência do lipídeo na formulação. .................................................................................. 107

Tabela 14. Teor de umidade media e parâmetros de ajuste ao modelo de cinética de

degradação de ordem zero. ................................................................................................. 118

viii

Lista de abreviaturas e siglas

ATCC American Type Culture Collection

ABTS 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico

ANVISA Agência Nacional Vigilância Sanitária

A/O Emulsões água em óleo

BHT Butil hidroxi tolueno

CaCo-2 Colon carcinoma cell line (células de cáncer de colon)

CEPLAC Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

DSC Diferential Scanning Calorimetry (calorimetria exploratoria

diferencial)

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium

EHL Equilíbrio hidrofílico lipofílico

HAP Homogeneizador de alta pressão

HBSS Hank´s Balanced salt solution

HPLC-DAD Cromatografia Liquida de Alta Eficiência - Detetor de Arranjo de

Diodos

DE Equivalentes de dextrose

FH Fator Hausner

IC Índice de Carr

NLC Nanostrucutured Lipid Carriers (Carreadores lipídios

nanoestruturados)

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

M.P. Matéria-prima

MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

O/A Emulsões óleo em água

OMS Organização Mundial da Saúde

Papp Coeficiênte de permeação aparente

Patm Pressão de atomização

SLN Solid Lipid Nanoparticles (nanopartículas lipídicas sólidas)

SD Spray Drying

TEAC Trolox Equivalents Antioxidant Capacity

Tge Temperatura gás de entrada

UR Umidade Relativa

UV-vis Ultra violeta-visível

Watm Vazão do ar de atomização

Wg Vazão do ar de secagem

Ws Vazão de alimentação da formulação líquida

ix

Sumário

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1

2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 4

2.1 CRAVO DA ÍNDIA (SYZYGIUM AROMATICUM) ..................................................................... 5

2.1.1. Compostos químicos isolados do cravo ................................................................. 5

2.1.2. Atividade antioxidante .......................................................................................... 7

2.1.3. Atividade antimicrobiana ...................................................................................... 9

2.1.4. Atividade antinociceptiva .................................................................................... 11

2.1.5. Atividade antiviral ............................................................................................... 11

2.1.6. Citotoxicidade do eugenol ................................................................................... 11

2.1.7. Toxicidade e farmacocinética .............................................................................. 12

2.1.8. Aplicações agrícola e larvicida ............................................................................ 13

2.2. MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS DE ORIGEM VEGETAL ................... 13

2.2.1. Extração micelar ................................................................................................. 16

2.3. FORMULAÇÕES LIPÍDICAS COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS .. 17

2.3.1.Técnicas de preparo de partículas lipídicas ........................................................... 20

2.3.2. Caracterização de formulações lipídicas .............................................................. 27

2.3.3. Estabilidade de emulsões ..................................................................................... 28

2.4 SECAGEM EM SPRAY DRYING DE COMPOSIÇÕES CONTENDO COMPOSTOS VOLÁTEIS .......... 30

2.5. ABSORÇÃO INTESTINAL DE COMPOSTOS BIOATIVOS...................................................... 35

3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 39

3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 40

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 40

x

4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 41

4.1 MATERIAL ................................................................................................................... 42

4.1.1. Matéria-prima vegetal ......................................................................................... 42

4.1.2 Adjuvantes tecnológicos ....................................................................................... 42

4.1.3 Reagentes, solventes e padrões analíticos ............................................................. 44

4.2. EQUIPAMENTOS .......................................................................................................... 45

4.3. MÉTODOS ................................................................................................................... 46

4.3.1. Caracterização da matéria-prima vegetal ............................................................. 49

4.3.2. Screening de lipídeos........................................................................................... 49

4.3.3. Validação do método analítico para a quantificação de eugenol e acetato de

eugenol...............................................................................................................................50

4.3.4. Extração dos compostos bioativos do cravo da Índia ........................................... 52

4.3.5. Métodos utilizados para a caracterização físico-química das partículas lipídicas em

fase líquida ou sólida .................................................................................................... 54

4.3.6 Ensaios preliminares de formulação ..................................................................... 58

4.3.7. Influência do EHL do tensoativo e da temperatura de secagem ............................ 60

4.3.8. Influência da proporção dos componentes na formulação .................................... 61

4.3.9. Influencia do lipídeo na formulação..................................................................... 63

4.3.10. Estudo de estabilidade ....................................................................................... 64

4.3.11. Cultura de células e experimentos de permeação utilizando células CaCo-2....... 65

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 67

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA VEGETAL ......................................................... 68

5.1.1. Distribuição granulométrica do material vegetal moído ....................................... 68

5.1.2. Perda por dessecação ........................................................................................... 68

5.1.3. Teor de extrativos ................................................................................................ 69

5.2. SCREENING DE LIPÍDEOS .............................................................................................. 69

xi

5.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ........................................................................... 71

5.4. EXTRAÇÃO MICELAR ................................................................................................... 75

5.4.1. Influência do EHL na extração do eugenol e acetato de eugenol do cravo ............ 76

5.4.2. Polifenóis totais ................................................................................................... 79

5.4.3. Atividade antioxidante ABTS .............................................................................. 80

5.5. ENSAIOS PRELIMINARES DA FORMULAÇÃO E SECAGEM DAS FORMULAÇÕES LIPÍDICAS ... 81

5.5.1. Influência da composição da formulação ............................................................. 82

5.5.1.2. Recuperação do produto ................................................................................... 84

5.5.1.3. Atividade antioxidante ...................................................................................... 86

5.5.1.4. Dispersibilidade em água .................................................................................. 87

5.5.1.5. Tamanho de partícula e propriedades de fluidez................................................ 87

5.5.1.6. Atividade de água e teor de umidade ................................................................ 89

5.5.1.7. Comparação dos métodos de dispersão e secagem na retenção de eugenol e

acetato de eugenol ......................................................................................................... 89

5.5.1.8. Análises morfológicas ...................................................................................... 91

5.6. INFLUÊNCIA DO EHL DO TENSOATIVO NA FORMULAÇÃO E DA TEMPERATURA DE

SECAGEM EM SPRAY DRYING ................................................................................................ 94

5.6.1. Retenção de eugenol e acetato de eugenol ........................................................... 94

5.6.2. Perda por dessecação e atividade de água ............................................................ 96

5.6.3. Tamanho de partícula .......................................................................................... 98

5.6.4. Morfologia das partículas .................................................................................... 99

5.7. INFLUÊNCIA DA PROPORÇÃO DOS COMPONENTES NA FORMULAÇÃO ............................ 101

5.8. COMPARAÇÃO FORMULAÇÃO LIPÍDICA E NÃO LIPÍDICA ............................................... 105

5.8.1. Avaliação das propriedades fisico-químicas ...................................................... 106

5.8.2. Estudo de estabilidade ....................................................................................... 115

5.8.3. Permeação intestinal in vitro usando células CaCo-2 ......................................... 119

xii

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 122

6.1. EXTRAÇÃO MICELAR ................................................................................................. 123

6.2. INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO DA FORMULAÇÃO ......................................................... 123

6.3. INFLUÊNCIA DO EHL E TEMPERATURA DE SECAGEM DA FORMULAÇÃO ....................... 123

6.4. INFLUÊNCIA DA PROPORÇÃO DOS COMPONENTES NA FORMULAÇÃO ............................ 124

6.5. COMPARAÇÃO FORMULAÇÃO LIPÍDICA E NÃO LIPÍDICA ............................................... 124

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 126

1. INTRODUÇÃO

Introdução 2

1. Introdução

Historicamente, a maioria dos fármacos tem surgido de metabólitos secundários de

produtos naturais ou seus derivados (Li & Vederas, 2009). As plantas medicinais e aromáticas

têm representado importantes fontes de compostos de elevado valor terapêutico e nutricional

para o tratamento e prevenção de diversas doenças. Dentre os medicamentos que tiveram

grande impacto na medicina e que foram obtidos a partir de fontes naturais estão a

vimblastina, placitaxel, podofilotoxina, campotecina, avermectina, quinina, artemisinina,

lovastatina, doxorubicina, captopril e taxol entre outros.

O cravo da Índia, em particular, é uma especiaria que tem sido usada por séculos por

suas propriedades antimicrobianas, anestésicas e antioxidantes, comprovadas em diversos

trabalhos científicos e associadas a compostos como o eugenol, β-cariofileno e α-humuleno

(Cortes-Rojas, Souza, & Oliveira, 2014). Entretanto, varias limitações relacionadas à

estabilidade, volatilidade, baixa solubilidade e biodisponibilidade dos seus compostos

bioativos representam um desafio e tornam o cravo uma matéria-prima vegetal de grande

interesse para o desenvolvimento deste projeto.

A encapsulação de princípios ativos vegetais é uma técnica que vem sendo empregada

para solucionar problemas relacionados com a volatilidade, baixa estabilidade, solubilidade e

baixa biodisponibilidade. Esta técnica consiste na inclusão do agente ativo em um invólucro

protetor utilizando diferentes tipos de materiais de parede. Os métodos de encapsulação

podem ser divididos em processos físicos como spray drying, químicos como a polimerização

interfacial ou físico-químicos como a coaservação (Fang & Bhandari, 2010). Os compostos

bioativos encapsulados são protegidos frente a fatores externos (oxidação, luz) e são

conferidas algumas propriedades fisico-químicas desejadas.

Sistemas lipídicos micro e nanoestruturados representam uma nova tendência de

sistemas de liberação por via oral aumentando a biodisponibilidade do fármaco por diversos

mecanismos os quais serão abordados na revisão da literatura. Este tipo de formulações

também têm sido utilizados para a proteção e liberação de compostos de origem vegetal como

a quercetina (Chen-yu et al., 2012), luteína (Liu & Wu, 2010), silibina (Jia et al., 2010),

psoralenos (Fang, Fang, Liu, & Su, 2008), β-caroteno (Hung et al., 2011) entre outros. A

simplicidade de preparo e de ampliação de escala tem contribuído para o aumento do interesse

das indústrias farmacêuticas e de alimentos.

Introdução 3

Fatores como o tipo de lipídeo, emulsificantes, o processo de emulsificação, condições

de secagem/resfriamento influenciam as características das partículas obtidas. Por tanto deve

ser realizado um estudo detalhado de cada etapa do processo visando conhecer os mecanismos

de formação das partículas e alcançar as características desejadas do produto.

Por outro lado, as formas fitofarmacêuticas secas são preferidas devido à maior

estabilidade, facilidade de manuseio e armazenamento. A técnica de spray drying tem sido

utilizada com sucesso na secagem e microencapsulação de extratos vegetais, entretanto, a

secagem de formulações lipídicas contendo extratos vegetais por esta técnica é uma nova

abordagem que ainda carece de informações. Nesse sentido, este projeto de pesquisa teve por

objetivo desenvolver formulações secas de emulsões e sistemas lipídicos visando a melhora

da solubilidade e o aumento da estabilidade dos principais compostos ativos presentes em

extratos de cravo da Índia (Syzygium aromaticum).

O desenvolvimento de sistemas de liberação para extratos vegetais é uma área de

estudo relativamente nova, com poucos grupos consolidados no Brasil, justificando assim o

apoio ao desenvolvimento de pesquisas relacionadas. Nas páginas seguintes, serão abordadas

de maneira sistemática todas as etapas envolvidas na obtenção de partículas lipídicas sólidas,

avaliação das variáveis envolvidas em cada processo e a sua influência nas propriedades

físico-químicas, estabilidade e permeação intestinal in vitro.

2. REVISÃO DA LITERATURA

Revisão da literatura 5

2. Revisão da literatura

Apresenta-se a seguir uma revisão sobre a espécie Syzygium aromaticum (cravo da

Índia), planta aromática objeto de estudo deste projeto; técnicas extrativas, em especial a

extração micelar; desenvolvimento de formulações lipídicas (composição, técnicas de preparo

e caracterização); secagem e microencapsulação de compostos voláteis por spray drying,

estabilidade de sistemas emulsionados e absorção intestinal de compostos bioativos.

2.1 Cravo da índia (Syzygium aromaticum)

Especiarias como cravo, orégano, menta, tomilho e canela, têm sido utilizadas por

séculos como conservantes de alimentos e como plantas medicinais, especialmente devido às

atividades antioxidante e antimicrobiana. Estas atividades têm sido comprovadas

cientificamente e o cravo tem se destacado por suas atividades biológicas em especial como

antioxidante e antimicrobiano, comparado com outras especiarias.

Syzygium aromaticum (sinônimo: Eugenia cariophylata), popularmente conhecido

como cravo da Índia, é uma árvore de porte médio (8 a 12 m) da família Mirtaceae, nativa das

Ilhas Maluku, no Leste da Indonésia. Por séculos, o comércio e a busca desta valiosa

especiaria estimulou o desenvolvimento econômico desta região Asiática (Kamatou,

Vermaak, & Viljoen, 2012).

Esta espécie é normalmente cultivada em áreas próximas ao litoral em altitudes de

aproximadamente 200 m. A produção dos botões florais, que são as partes comercializadas da

árvore, tem início quatro anos após o plantio. Os botões florais são coletados na fase de

amadurecimento antes da floração.

Atualmente, os maiores produtores de cravo são Indonésia, Índia, Malásia, Siri Lanka,

Madagascar e Tanzânia, especialmente a ilha de Zanzibar (Kamatou et al., 2012). No Brasil, o

cravo é cultivado na Região Nordeste, no Estado da Bahia, nas regiões de Valença, Ituberá,

Taperoá, Camamu e Nilo Peçanha, onde aproximadamente 8000 hectares são cultivados,

produzindo cerca de 2500 toneladas por ano (Oliveira, Oliveira, & Sacramento, 2007).

2.1.1. Compostos químicos isolados do cravo

S. aromaticum representa uma das maiores fontes vegetais de compostos fenólicos

como flavonoides, ácidos hidroxibenzóicos, hidroxicinâmicos e hidroxifenil propenos. O


eugenol é o principal composto bioativo, que é encontrado em concentrações de 9381,70 a

14650,00 mg por 100 g da planta fresca (“http://www.phenol-explorer.eu,” 2012). Em relação

aos ácidos fenólicos, o ácido gálico é o principal composto encontrado (83,50 mg/100 g de

planta fresca), porém outros derivados do ácido gálico, como taninos hidrolisáveis, estão

presentes em altas concentrações (≈ 2375,8 mg/100 g) (Shan, Cai, Sun, & Corke, 2005).

Outros ácidos fenólicos encontrados nessa espécie são o ácido caféico, ferúlico, elágico e

salicílico. Flavonoides como canferol, quercetina e seus derivados glicosilados também estão

presentes em menores concentrações. A Figura 1 apresenta as estruturas moleculares dos

principais compostos isolados.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 1. Estruturas moleculares dos principais compostos isolados de Syzygium aromaticum.

Eugenol (a), acetato de eugenol (b), ácido gálico (c) e β-cariofileno (d).

Concentrações de óleo essencial de até 18 % podem ser encontradas nos botões florais,

sendo que aproximadamente 89 % deste é eugenol e 5 a 15 % correspondem ao acetato de

eugenol e ao β-cariofileno (Jirovetz et al., 2006). Outro importante composto encontrado no

óleo essencial em concentrações de até 2,1 % é o α-humuleno que apresenta atividade anti-

inflamatória. Compostos voláteis tais como β-pineno, limoneno, farnesol, benzaldehido, 2-

heptanona e etil hexanoato também são encontrados no óleo essencial, porém em

concentrações menores.

S. aromaticum é uma importante planta medicinal devido à sua ampla gama de ações

farmacológicas, descritas ao longo da história por seu uso na medicina tradicional e nos

trabalhos científicos reportados na literatura. Nos parágrafos seguintes são apresentados os

principais trabalhos científicos que relatam as atividades biológicas mais importantes desta

espécie e seu composto majoritário isolado, o eugenol.


2.1.2. Atividade antioxidante

Recentemente o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, em colaboração

com universidades e empresas privadas, criou uma base de dados do teor de polifenóis e

atividade antioxidante em diferentes tipos de alimentos. Baseado nesta base de dados, Pérez-

Jiménez et al. (2010), classificaram as 100 maiores fontes de polifenóis. Os resultados

mostraram que as especiarias são o tipo de alimento com maior teor de polifenóis, seguido das

frutas, sementes e vegetais. Dentre as especiarias, o cravo mostrou o maior teor de polifenóis

e atividade antioxidante.

Shan et al. (2005), identificaram e quantificaram por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), os principais compostos fenólicos presentes em 26 especiarias, seguido

pela determinação da atividade antioxidante pelo método de ABTS. Os resultados mostraram

uma alta correlação entre o teor de polifenóis e a atividade antioxidante. O cravo foi a

especiaria que apresentou o maior teor de polifenóis (14,38 ± 0,006 g equivalente de ácido

gálico por 100 g de matéria-prima vegetal seca) e a maior atividade antioxidante (168,66 ±

0,024 mmol de Trolox/100 g de matéria-prima vegetal seca). Os principais tipos de

compostos fenólicos encontrados foram ácidos fenólicos (ácido gálico), flavonoides

glicosilados, compostos fenólicos voláteis como eugenol e acetato de eugenol, e taninos. Foi

ressaltado o potencial do cravo como captador de radicais livres e como fonte comercial de

polifenóis.

As atividades antioxidantes do cravo (S. aromaticum) e cominho (Carum carvi L.)

foram avaliadas utilizando vários modelos in vitro como β-caroteno-linoleato, tiocianato

férrico, DPPH e radical hidroxila. Os extratos metanólicos apresentaram atividade

antioxidante na faixa de 82 a 96 %, determinada pelos métodos de β-caroteno e tiocianato

férrico. Concluiu-se que a atividade antioxidante do cravo é comparável com BHT, um

composto sintético comumente utilizado como conservante de alimentos (Bamdad, Kadivar,

& Keramat, 2006).

Gülçin et al. (2012), compararam a atividade antioxidante do óleo de cravo com outros

antioxidantes sintéticos empregando o método de captação do radical DPPH e verificaram que

atividade antioxidante do óleo de cravo foi maior do que a do BHT, α-tocoferol, BHA e

Trolox.


A atividade antioxidante de extratos aquosos de cravo tem sido avaliada por diferentes

métodos in vitro, tais como DPPH, ABTS, ORAC, FRAP, xantina oxidase e 2-

deoxiguanosina. O cravo e plantas como pino, canela e mate apresentaram grande potencial

para serem utilizadas como conservantes de alimentos, comparadas com outras 30 plantas

analisadas (Dudonné, Vitrac, Coutière, Woillez, & Mérillon, 2009; Wu et al., 2004).

Extratos aquosos e etanólicos de cravo e lavanda (Lavandula stoechas L.) em

concentrações de 20, 40 e 60 µg/mL apresentaram inibição de até 95 %, quando avaliados

como quelantes de metais, captura do radical superóxido e DPPH. Os resultados mostram que

a atividade antioxidante dos extratos das duas plantas é comparável à atividade de compostos

como BHA, BHT e α-tocoferol. De acordo com os métodos utilizados, inferiu-se que a

elevada atividade antioxidante dos extratos pode ser atribuída à forte habilidade de doação de

hidrogênio e a capacidade de quelação de metais (Gülçin, 2004).

Gülçin (2011), estudou a atividade antioxidante do eugenol por diversos métodos in

vitro e discutiu a relação estrutura-atividade. O eugenol apresentou maior capacidade

antioxidante do que BHA, BHT, trolox e α-tocoferol avaliado por métodos tais como DPPH,

ABTS, N,N-dimetil-p-fenilendiamino (DMPD), CUPRAC e o ensaio de redução de ferro.

Foi destacado que os polifenóis de plantas são multifuncionais no sentido que podem

atuar como agentes redutores, doadores de hidrogênio e captadores de radicais. O eugenol

permite a doação de um átomo de hidrogênio e subsequente estabilização do radical fenoxil

gerado, formando compostos estáveis que não iniciam ou propagam oxidação. A molécula de

eugenol possui um conjugação interessante do carbono da cadeia alifática com o anel

aromático o qual participa na estabilização do radical fenoxil por ressonância. Este sistema

cromofóro está também presente na molécula de resveratrol que também possui elevada

atividade antioxidante. Tem sido proposta a hipótese que o eugenol reduz dois ou mais

radicais DPPH, apesar da disponibilidade de só um hidrogênio do grupo hidroxila. A

formação de dímeros de eugenol (dehidrodieugenol), com dois grupos fenol-hidroxila

originado dos radicais intermediários eugenil, tem sido proposta como mecanismo de reação

entre o eugenol e os radicais DPPH (Gülçin, 2011).

Antioxidantes são compostos de grande importância para a prevenção de déficits

causados por estresse oxidativo (Halder et al., 2011; Mehta et al., 2010). O pré-tratamento

com óleo essencial de cravo diminuiu o estresse oxidativo em camundongos, comprovado

pelo monitoramento do nível de malonaldeído e glutationa. Neste estudo, concluiu-se que esse


óleo pode reverter déficits de memória e aprendizagem a curto e longo prazos, causados por

escopolamina, como resultado da redução do estresse oxidativo (Chatterjee & Bhattacharjee,

2013). A melhora na memória e aprendizagem em camundongos tratados com óleo de cravo,

foi observada em doses de 0,025; 0,05 e 0,1 mL/kg no teste do labirinto em cruz elevado

(Halder et al., 2011). Estes trabalhos mostram os benefícios de se utilizar o cravo como uma

rica fonte de antioxidantes para o tratamento de problemas de memória ocasionados por

estresse oxidativo.

A elevada atividade antioxidante do cravo também pode ser empregada na

conservação de alimentos durante o processamento e/ou armazenamento. Chatterjee e

Bhattacharjee (2013), reportaram aumento no tempo de prateleira e estabilidade frente à

fritura do óleo de soja com adição de extratos contendo eugenol encapsulado por meio da

técnica de spray drying, utilizando maltodextrina e goma arábica como materiais de parede.

2.1.3. Atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana de S. aromaticum tem sido avaliada contra diferentes cepas

de fungos e bactérias. Sofia et al. (2007), compararam a atividade bactericida de diferentes

especiarias indianas como menta, canela, mostarda, gengibre, alho e cravo. Os resultados

mostraram que só o cravo teve atividade bactericida frente a todos os patógenos utilizados,

tais como Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.

Rana et al. (2011), determinaram a atividade antifúngica do óleo de cravo em

diferentes cepas de microrganismos pelo método de difusão em placa, calculando a

concentração inibitória mínima (MIC). A seguinte escala de sensibilidade foi obtida: Mucor

sp. > Microsporum gypseum > Fusarium monoliforme NCIM 1100 > Trichophytum rubrum >

Aspergillus sp. > Fusarium oxysporum MTCC284. As análises mostraram que o eugenol foi o

principal composto responsável pela atividade antifúngica atuando na lise de esporos e

micelas. A ruptura de membranas e deformação de macromoléculas produzidas pelo eugenol

também foram reportadas por Devi et al. (2010).

A atividade antimicrobiana do óleo de cravo também foi avaliada em diferentes

dermatófitos, como Microsporum canis (Korean Collection for Type Cultures, KCTC 6591),

Trichophyton mentagrophytes (KCTC 6077), Trichophyton rubrum (KCCM 60443),

Epidermophyton floccosum (KCCM 11667) e Microsporum gypseum, os resultados


mostraram uma atividade máxima na concentração de 0,2 mg/mL com efetividade antifúngica

de até 60 % (Park et al., 2007).

O óleo essencial de cravo puro ou misturado com óleo de alecrim (Rosmarinus

officinalis spp.) foi avaliado frente à cepas de Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgari e Pseudomonas aeruginosa,

mostrando concentrações inibitórias mínimas (MIC) entre 0,062 % e 0,500 % (v/v),

consideradas promissoras como anti-infeccioso ou conservantes de alimentos (Fu et al.,

2007).

Comprovando o amplo espectro de atividade do eugenol contra bactérias, um estudo

mostrou que o eugenol e o cinamaldeído, em concentrações de 2 μg/mL, inibem o

crescimento de 31 cepas de Helicobacter pylori, após 9 e 12 h de incubação, respectivamente,

sendo assim mais potente que a amoxicilina, além de não desenvolver resistência. A atividade

e estabilidade desses compostos foram avaliadas em pH baixo uma vez que H. pylori reside

no estômago (Ali et al., 2005).

Diferentes formulações têm sido desenvolvidas, visando otimizar a atividade

antimicrobiana do cravo ou do seu principal composto, o eugenol. Nanopartículas lipídicas

sólidas contendo eugenol foram preparadas utilizando ácido esteárico, triglicerídio caprílico e

poloxamer 188, em diferentes concentrações, pelo método de ultrassom. A atividade

antifúngica das nanopartículas foi avaliada in vivo utilizando um modelo de candidíase oral

(Candida albicans) em ratos imunossuprimidos. Os resultados mostraram que as formulações

desenvolvidas incrementaram a eficiência terapêutica do eugenol e modificaram o perfil de

liberação destes compostos (Garg & Singh, 2011).

Complexos de inclusão com β-ciclodextrina contendo eugenol e extrato de cravo,

foram preparados pelo método de liofilização e avaliados frente a dois patógenos alimentares

comuns, Salmonella entérica sorotipo Typhimurium LT2 e Listeria innocua (Hill, Gomes, &

Taylor, 2013). As formulações mostraram um grande potencial como aditivos de alimentos

por sua efetividade antimicrobiana; além disso, estas formulações têm maior aceitação pelos

consumidores, por serem derivadas de produtos naturais. Somado a isso, a solubilidade e o

perfil de liberação foram melhorados com o processo de encapsulação.

Formulações contendo eugenol e carvacrol encapsulados em tensoativos não iônicos,

foram avaliadas frente à quatro cepas de dois importantes patógenos alimentares, E. coli


O157:H7 e Listeria monocitogenes. A contagem celular de L. monocitogenes diminuiu 3,7 log

após 3 h de exposição ao eugenol nas concentrações de 0,5 e 0,9 %; estes resultados

comprovam o potencial do eugenol para ser utilizado na desinfecção de superfícies em

contato com alimentos (Pérez-Conesa, McLandsborough, & Weiss, 2006).

2.1.4. Atividade antinociceptiva

A utilização do cravo como analgésico tem sido reportada desde o século XIII em

aplicações como tratamento de dor de dente, de articulações e como antiespasmódico. O

mecanismo atribuído a estes efeitos é a ativação dos canais de cálcio e cloro nas células

ganglionares (Gruenwald, Brendler, Jaenicke, & LaGow, 2004). Os efeitos voltagem-

dependentes do eugenol, em canais de sódio e cálcio e em receptores expressos no gânglio

trigenimal, também têm contribuído ao efeito analgésico dessa espécie (Li, Lee, Kim, Jung, &

Oh, 2008). Outros resultados atribuem o efeito analgésico do cravo à ação agonista de

capsaicina (Ohkubo & Shibata, 1997). A atividade antinociceptiva periférica do eugenol foi

reportada por Daniel et al. (2009), mostrando atividade em concentrações de 50, 75 e 100

mg/kg no teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.

2.1.5. Atividade antiviral

A atividade antiviral de eugeniina, um composto isolado de S. aromaticum e de Geum

japonicum, foi avaliado frente às cepas do vírus da herpes, sendo efetivo na concentração de 5

µg/mL. A análise dos resultados evidenciou que um dos principais alvos da eugeniina é a

síntese de DNA viral pela inibição da DNA polimerase (Kurokawa et al., 1998).

Extratos aquosos de S. aromaticum e outras plantas, como Geum japonicum, Rhus

javanica e Terminalia chebula, mostraram atividade contra o vírus do herpes tipo 1 (HSV-1),

quando combinado com aciclovir. A atividade sinérgica foi mais forte no cérebro do que na

pele e foi também provado que essas combinações não são tóxicas para os camundongos

utilizados no estudo (Kurokawa et al., 1995).

2.1.6. Citotoxicidade do eugenol

Após vários anos de pesquisa intensiva, diferentes alvos moleculares para a prevenção

e tratamento do câncer têm sido identificados. O eugenol foi selecionado como uma molécula

potencial, interferindo com diversas rotas de sinalização celular, especificamente o fator

nuclear kappa B (NF-KB). Este fator é ativado por radicais livres e resulta na expressão de


genes que suprimem a apoptose e induzem transformações celulares, proliferação, invasão e

metástase (Aggarwal & Shishodia, 2010).

As atividades citotóxica e genotóxica do eugenol e borneol foram avaliadas em

diferentes linhagens de células: hepatoma (HepG2), células maligna de Cólon (CaCo2) e

fibroblastos não malignos (VH10), frente aos efeitos nocivos de H2O2 no DNA. Os resultados

mostraram que os efeitos citotóxicos do eugenol foram mais pronunciados do que os do

borneol. O eugenol apresentou fortes efeitos genotóxicos em fibroblastos humanos (VH10),

efeitos genotóxicos moderados em células de cólon (CaCo2) e não foram observados efeitos

em células de hepatoma (HepG2) (Slamenová, Horváthová, Wsólová, Sramková, &

Navarová, 2009). O Programa Nacional de Toxicologia, baseado em diferentes estudos de

carcinogenicidade, concluiu que o eugenol não é cancerígeno em ratos (Ghosh et al., 2005).

Baseado em estudos in vitro e in vivo, Ghosh et al. (2005), reportaram que o eugenol

suprimiu o crescimento de melanoma maligno WM1205lU, assim como diminuiu o tamanho

do tumor e da invasão e metástase pela inibição dos fatores de transição da família E2F, estas

são proteínas com uma função importante na regulação da progressão do ciclo celular.

Atsumi et al. (2005) estudaram a ação antioxidante e pró-oxidante do eugenol e

isoeugenol. Dentre os principais resultados obtidos foi encontrado que na ausência de estresse

oxidativo, o eugenol atua como antioxidante em baixas concentrações, mas atua como pró-

oxidante em concentrações elevadas. Na presença de estresse oxidativo, o eugenol em baixas

concentrações (5–10 µM) incrementa os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS), mas

as diminui em altas concentrações (500 µM). Os autores concluíram que a citotoxicidade do

eugenol ocorre de forma ROS-dependente na presença de estresse oxidativo e a sua atividade

antioxidante/prooxidante está relacionada com mecanismos do radical fenoxilo.

2.1.7. Toxicidade e farmacocinética

O óleo essencial de S. aromaticum é reconhecido como seguro (Generally Recognized

As Safe, GRAS), quando consumido em concentrações menores do que 1500 mg/kg. Por

outro lado, a Organização Mundial da Saúde (OMS) preconiza que a quantidade diária

aceitável de cravo é de 2,5 mg/kg de peso humano (Gülçin et al., 2012).


A toxicidade do óleo de cravo foi avaliada nas espécies de peixes de aquário Danio

rerio e Poecilia reticulata, encontrando concentrações letais médias (LD50) de 18,2 ± 5,52

mg/mL em 96 h em D. rerio e 21,7 ± 0,8 mg/mL em P. reticulata (Doleželová, Mácová,

Plhalová, Pištěková, & Svobodová, 2011).

Em um estudo farmacocinético realizado por Guénette et al. (2007), foi mostrado que

o tempo de meia vida do eugenol é longo tanto no plasma como na corrente sanguínea, 14,0 e

18,3 h, respectivamente. Esse resultado sugere um efeito cumulativo após a administração

repetida o qual está relacionado com a hipótese de que o eugenol alivia a dor neuropática.

2.1.8. Aplicações agrícola e larvicida

Além das propriedades medicinais, a espécie S. aromaticum tem sido empregada para

diversas aplicações agrícolas. Park e Shin (2005), reportaram a utilização do óleo de cravo

para o controle da termita japonesa (Reticulitermes speratus Kolbe) a qual está amplamente

distribuída na Coreia, Japão e China e ocasiona graves danos em estruturas de madeira. Da

mesma forma, Eamsobhana et al. (2009), encontraram que o óleo essencial de cravo na

concentração de 5 % possui 100 % de atividade repelente contra o ácaro Leptotrombidium

imphalu, sendo uma alternativa mais segura e barata aos repelentes sintéticos comumente

associados a efeitos secundários nocivos.

Uma formulação tópica contendo óleo essencial de cravo foi efetiva frente às espécies

de mosquitos Aedes aegypti e Anopheles dirus com tempos de proteção de 80,33±10,56 e

60,00 ± 10,00 min, respectivamente (Sritabutra, Soonwera, Waltanachanobon, & Poungjai,

2011). Em outro estudo recente desenvolvido por (Barbosa et al., 2012), foi relatada a relação

estrutura-atividade dos principais compostos do óleo de cravo, assim como derivados

sintéticos do eugenol, contra a larva do mosquito Aedes aegypti (Diptera:culicidae). Os

métodos larvicidas são uns dos métodos mais eficientes para combater a dengue devido à falta

de vacina ou tratamento contra a doença. O eugenol apresentou resultados interessantes e

pode ser um substituto promissor ao uso de inseticidas comuns (Barbosa et al., 2012).

2.2. Métodos de extração de compostos bioativos de origem vegetal

A extração de compostos bioativos de fontes vegetais é uma etapa fundamental para o

desenvolvimento de formulações fitoterápicas e tem por objetivo realizar uma separação

inicial dos compostos de interesse. Os compostos químicos encontrados nas plantas podem


ser classificados como metabólitos primários e secundários. A maioria dos compostos

bioativos de interesse farmacológico são metabólitos secundários os quais são produzidos

pelas plantas para interagir com o entorno como, por exemplo, a produção de aromas para

atrair insetos favorecendo a polinização, a produção de compostos tóxicos como mecanismo

de defesa frente a pragas ou plantas vizinhas que competem pelos nutrientes. Por outro lado,

os metabólitos primários são compostos essenciais para o crescimento da planta, tais como

carboidratos, proteínas ou lipídeos.

Cada planta ou grupo de plantas produz determinados tipos de metabólitos

secundários, que possuem características químicas diferentes e, portanto, a extração deve ser

otimizada para cada planta em particular dependendo dos compostos de interesse. No

processo extrativo estão envolvidas variáveis tais como pH, temperatura, tempo, polaridade

do solvente extrativo, tamanho de partícula da matéria-prima vegetal, método de agitação e a

proporção planta/solvente.

Os métodos de extração podem ser classificados como convencionais e não

convencionais. Os métodos convencionais mais utilizados são a extração por Soxhlet,

maceração e hidrodestilação. O aparelho Soxhlet, permite a extração exaustiva pela realização

de ciclos de evaporação e condensação do solvente extrator, modificando a concentração de

equilíbrio.

A maceração é a técnica mais utilizada devido à sua simplicidade e facilidade de

escalonamento. Existem diferentes tipos de maceração, tais como, a maceração simples na

qual a matéria-prima vegetal moída é colocada em contato com o solvente extrator em

condições estacionarias, e a maceração dinâmica, quando a matéria-prima vegetal é mantida

em movimento à temperatura ambiente. Quando a maceração ocorre a temperaturas

superiores a 40 ou 50 °C, recebe o nome de digestão (List & Schmidt, 1989).

A hidrodestilação consiste na utilização de água ou vapor de água para o arraste dos

compostos bioativos, que é posteriormente condensada. O processo é controlado pela pressão

e temperatura aplicadas (List & Schmidt, 1989). Esta técnica é comumente utilizada para a

extração de óleos essenciais, sendo um processo simples, econômico e seguro. A temperatura

máxima alcançada pela matéria-prima vegetal é a temperatura de ebulição da água e o vapor

gerado tem um efeito protetor frente à oxidação dos óleos essenciais; posteriormente ocorre a

separação espontânea do óleo e da água, no vapor condensado.


Visando reduzir o tempo de extração, otimizar a quantidade de solvente utilizado e

aumentar a seletividade da extração, foram desenvolvidos métodos não convencionais de

extração. Um dos métodos não convencionais mais utilizados é o ultrassom na faixa de 20

kHz a 100 MHz. A alta quantidade de energia cinética proveniente das ondas de ultrassom

produz um fenômeno de cavitação o qual incrementa a permeação das paredes celulares o

facilita a difusão dos compostos bioativos ao solvente extrator (List & Schmidt, 1989). Esta

técnica tem as vantagens de diminuir o tempo de extração e o volume de solvente utilizado.

Outro dos métodos utilizado é a extração assistida por micro-ondas em frequências de

300 MHz a 300 GHz. A energia gerada pelas ondas é convertida em calor pela resistência do

meio à condução, ocasionando o fenômeno de rotação dipolo-dipolo (Azmir et al., 2013).

Neste tipo de extração ocorrem três mecanismos: primeiro a separação de solutos da matéria-

prima vegetal pelo incremento da pressão e temperatura, posteriormente ocorre a difusão do

solvente pela da matriz e por fim a solubilização dos solutos no solvente (Alupului, Călinescu,

& Lavric, 2012). Esta técnica reduz a utilização de solvente orgânico e acelera o aquecimento

do meio extrator.

A extração com fluídos supercríticos é outra técnica não convencional na qual são

utilizados gases, que em determinadas condições de temperatura e pressão, formam uma única

fase supercrítica na qual não existe separação entre as fases líquida e gasosa. Normalmente é

utilizado dióxido de carbono, como fluído extrator, que por suas propriedades físicas,

favorece a extração de substâncias apolares, porém a adição de modificadores químicos em

pequenas proporções permite a extração de compostos de diferentes polaridades. Esta técnica

tem mostrado ser vantajosa devido à ausência de resíduos de solvente no extrato, além disso,

é uma técnica rápida, os fluídos pressurizados apresentam boa penetração nas células

vegetais, e ainda não são utilizadas altas temperaturas, sendo ideal para compostos

termolábeis (Azmir et al., 2013).

A seguir é descrita a técnica de extração micelar a qual tem mostrado ser uma

alternativa que substitui o uso do solvente orgânico por soluções de tensoativos. Foi dada uma

maior ênfase para esta técnica pelo potencial que apresenta na preparação de formulações

lipídicas, onde o uso do tensoativo pode ser útil na etapa de extração e, posteriormente, na

estabilização da emulsão.


2.2.1. Extração micelar

Na extração micelar são utilizados tensoativos como solventes alternativos de

extração. Em soluções aquosas os tensoativos formam micelas com núcleo lipofílico devido à

orientação das cadeias de carbono, os compostos de baixa polaridade tendem a migrar para

centro das micelas favorecendo a sua extração (Paleologos, Giokas, & Karayannis, 2005).

Uma vez nas micelas os compostos podem ser concentrados pela precipitação da fase rica em

tensoativo provocada por ação de temperatura ou aumento da força iônica, este processo é

conhecido por concentração de ponto de névoa (cloud point concentration) (Kiathevest, Goto,

Sasaki, Pavasant, & Shotipruk, 2009). Geralmente são utilizados tensoativos não iônicos que

se precipitam mais facilmente pela ação da temperatura. O uso de ultrassom ou micro-ondas

tem sido utilizado para aumentar a eficiência desta técnica. A extração micelar tem sido

utilizada na extração de princípios ativos de plantas, proteínas ou enzimas de amostras

biológicas ou compostos inorgânicos de diferentes matrizes (Paleologos et al., 2005). A seguir

estão descritas alguns exemplos da extração micelar a partir de amostras vegetais.

A extração de tansinosídeos de Salvia miltiorrhiza bunge, pelo método de ultrassom,

foi otimizada utilizando Genapol X-080 à 10 % como solvente alternativo, obtendo-se

resultados comparáveis à extração com solventes orgânicos comumente utilizados, tais como

metanol e diclorometano:metanol 1:4 (Shi, He, & Chang, 2004).

As condições de extração do composto antimalárico fenil-1,3,5-heptatriine de Bidens

pilosa L. (picão preto) foram otimizadas por meio da utilização dos tensoativos não iônicos,

Triton X-100, Triton X-114 e Genapol X-80, utilizando-se as técnicas de maceração assistida

por ultrassom e micro-ondas. A concentração do composto de interesse obtido no extrato com

Triton X-100 foi comparável ao teor obtido com acetato de etila (Trivedi, Kumar, Negi, &

Shanker, 2011).

Kiathevest et al. (2009) demonstraram que a extração micelar é uma alternativa

promissora para a extração e concentração de antraquinonas das raízes de Morinda citrifolia,

utilizando o tensoativo não ionico Triton X-100 1 % a 80 °C. Da mesma forma, Fang et al.

(2000), relataram que este tipo de extração permite a purificação de ginsenosídeos das raízes

de Panax quinquefolium. Neste caso foram utilizados dois tipos de tensoativos, Triton X-100

e Triton X-114. Um planejamento experimental foi utilizado para otimizar as condições de

extração, tais como a concentração do tensoativo, o tempo e a temperatura de extração. Os

melhores resultados foram obtidos com a solução de Triton X-100 à 10 %.


Tensoativos como sódio dodecil sulfato (SDS) e Triton X-100 foram utilizados na

extração de gliciricina e efedrina nas espécies de plantas Radix glycyrrhizae e Ephedra sinica,

respectivamente, e os resultados foram comparados com a extração com metanol 70 %, pelo

método de ultrassom. No caso da extração de efedrina de E. sinica, o SDS apresentou

eficiência de extração superior à obtida com Triton X-100. Para a extração da gliciricina, não

foram observadas diferenças entre os dois tensoativos avaliados (Eng, Heng, & Ong, 2007).

Hosseinzadeh et al. (2013), estudaram o efeito de tensoativos na extração de polifenóis

em diferentes variedades de maçãs, mostrando as influências do pH, da concentração, do tipo

de tensoativo e da força iônica. Os tensoativos não iônicos apresentaram melhor eficiência de

extração que os tensoativos iônicos. O sistema solvente utilizando o tensoativo Brij-35 na

concentração de 7 mM e pH 3 foi responsável pela obtenção dos melhores resultados para a

extração de polifenóis.

Chatzilazarou et al. (2010), utilizaram Genapol X-80 e PEG 8000 na recuperação de

polifenóis a partir de resíduos da produção de vinho. Nas condições ótimas foram alcançadas

recuperações de 75,8 % e 98,5 % com Genapol X-80 (2 % v/v) e PEG 800 (5 % v/v),

respectivamente.

2.3. Formulações lipídicas como sistemas de liberação de compostos bioativos

A elaboração de produtos farmacêuticos ou alimentícios utilizando compostos

insolúveis, voláteis ou de baixa estabilidade, tem representado um desafio tecnológico. Ao

longo do tempo, diversas estratégias têm sido propostas para solucionar estes inconvenientes

tais como emulsões, partículas poliméricas, lipossomas e na última década as nanopartículas

lipídicas tem recebido destaque.

Em formulações orais, os sistemas lipídicos aumentam a solubilidade do fármaco no

trato intestinal, promovem o transporte linfático intestinal, reduzindo o efeito de primeira

passagem e facilitam o transporte mediado por enterocitos como foi representado por Porter et

al. (2007) (Figura 2).


Figura 2. Potenciais efeitos de lipídeos e excipientes lipídicos na absorção de fármacos

(Porter et al., 2007). Aumento da solubilização do fármaco no trato intestinal pela alteração da

composição e caráter do ambiente coloidal: micelas e vesículas (a). Transporte e metabolismo

mediado por enterocitos (b). Alteração da via de absorção através do sistema linfático

evitando o efeito de primeira passagem pelo fígado (c).

Por via tópica, as nanopartículas lipídicas permitem um maior contato do fármaco com

o estrato córneo associado ao aumento da área superficial, produzem um efeito de hidratação

devido às propriedades oclusivas dos lipídeos e aumentam a estabilidade química de

compostos sensíveis a luz, oxidação e hidrólise (Pardeike, Hommoss, & Müller, 2009).

Na primeira geração de nanopartículas lipídicas, foram utilizados lipídeos sólidos (a

temperatura ambiente) para realizar a encapsulação e, portanto, são chamadas partículas

lipídicas sólidas (SLN). A segunda geração de carreadores lipídicos são os denominados

carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC). Estes sistemas nanoestructurados foram

propostos recentemente de forma a solucionar alguns problemas observados nas partículas

lipídicas sólidas, tais como a expulsão do princípio ativo da matriz lipídica durante o

armazenamento e a limitação na quantidade de princípio ativo incorporado (Muller, Radtke,

& Wissing, 2002).

Micela mista

Micela

Vesícula

Veia

porta

Fígado

Linfa

Circulação

geral e

sistémica

Intestino

Delgado


A combinação de lipídeos sólidos com pequenas quantidades de lipídeos líquidos

(NLC) permite incorporar uma maior quantidade de ativo, com menor probabilidade de

expulsão do material encapsulado durante o armazenamento (Figura 3) (Pardeike et al., 2009).

Estas vantagens, somadas à simplicidade de preparo e de ampliação de escala, têm

contribuído para o aumento de interesse das indústrias farmacêuticas e de alimentos na

utilização dos NLC para a incorporação de princípios ativos e compostos funcionais.

Figura 3. Processo de cristalização durante o armazenamento de partículas lipídicas sólidas

(SLN) e carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) (Muller et al., 2002).

Fatores como o tipo de lipídeo, emulsificantes, o processo de emulsificação, condições

de processamento influenciam as características das partículas obtidas, o que pode justificar a

necessidade de estudos detalhados de cada etapa do processo, visando conhecer os

mecanismos de formação das partículas, e obter as características desejadas para cada

princípio ativo (Müller, 2007).

Os componentes da formulação devem ser selecionados visando atingir a máxima

eficiência de encapsulação, prevenir ou minimizar a degradação do princípio ativo e

maximizar sua absorção. Os principais componentes deste tipo de formulações são lipídeo

sólido, lipídeo líquido, tensoativo ou sistema de tensoativos e a fase aquosa.

O princípio ativo a ser encapsulado geralmente é disperso na fase lipídica com a qual

deve ser compatível. Portanto, é recomendável a realização de um screening para selecionar

os lipídeos mais apropriados. Normalmente são utilizados lipídeos de origem natural por

serem considerados seguros para o consumo humano, os quais são facilmente digeridos e

absorvidos (Rahman, Hussain, Hussain, Mirza, & Iqbal, 2013). Porém, lipídeos quimicamente

modificados, como por exemplo, com a adição de unidades de propilenoglicol (PEG) também

são utilizados. Os lipídeos são compostos por misturas de triglicerídeos de ácidos graxos de

cadeia longa com diferentes graus de insaturação. O ponto de fusão dos lipídeos está

Após dias ou meses

Principio

ativo

SLN NLC


diretamente relacionado com a composição química sendo que, quanto maior a cadeia do

ácido graxo e menor número de insaturações tiver, maior será o ponto de fusão (Rahman et

al., 2013). Dependendo da aplicação do produto final a fase lipídica pode ser sólida ou líquida

a temperatura ambiente. No caso de aplicação tópica, por exemplo, o ponto de fusão da

composição deve estar acima de 45 °C.

Exemplos de lipídeos sólidos comumente utilizados são a cera de carnaúba, cera de

abelhas, gliceril dibehenato, monoestearato de glicerila e ácido esteárico, enquanto que os

lipídeos líquidos normalmente utilizados são óleos, tais como o óleo de palma, de milho, de

buriti e de coco.

Os tensoativos têm a função de facilitar a dispersão das fases lipídica e aquosa pela

redução da tensão superficial e formação de micelas. Os tensoativos mais utilizados são do

tipo hidrofílico com EHL maior que 10, que formam emulsões tipo (O/A), como por exemplo,

polisorbato 80 (Tween® 80), polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer

® 188, Pluronic

®

F68, Lutrol® F68, Kolliphor

® 188), cocoanfoacetato de sódio (Miranol Ultra C32) e óleo de

rícino polietoxilado (Chremophor®) (“Meaning of HLB”, 1980).

2.3.1.Técnicas de preparo de partículas lipídicas

Assim como a seleção dos componentes da formulação é fundamental na elaboração

de sistemas de liberação, o método de preparação é de grande importância. A seguir, são

apresentadas as principais técnicas de preparo das partículas lipídicas, descritas literatura,

juntamente com exemplos de aplicação. Estas são divididas em técnicas de alta energia, como

a ultrassonicação, homogeneização de alta pressão e homogeneização de alta velocidade e

técnicas de baixa energia, como a microemulsificação, inversão de fases, emulsificação

múltipla e o método de difusão de solvente.

2.3.1.1 Técnicas de alta energia

2.3.1.1.1 Homogeneização de alta pressão (HAP)

A técnica de homogeneização de alta pressão (HAP) é a mais utilizada devido à sua

versatilidade e facilidade de escalonamento. Os homogeneizadores forçam a formulação

líquida a passar a alta velocidade por um orifício de tamanho micrométrico, produzindo

cisalhamento e forças de cavitação que diminuem o tamanho das partículas como mostrado no

esquema da Figura 4 (Yadav, Khatak, & Sara, 2013). Existem duas variantes desta técnica: a


homogeneização de alta pressão a frio e a quente. Na homogeneização a frio, o princípio ativo

é incorporado na matriz lipídica fundida, que é posteriormente resfriada, moída e adicionada

na solução aquosa do tensoativo para finalmente passar pelo homogeneizador de alta pressão.

Por outro lado, na homogeneização de alta pressão a quente, o princípio ativo é adicionado

nos lipídeos fundidos e posteriormente na solução de tensoativo aquecida na mesma

temperatura e submetida ao processo de homogeneização de alta pressão, e finalmente

resfriada para a solidificação-cristalização da matriz lipídica. Normalmente são utilizados 2 a

3 ciclos e pressões de 250 a 500 bar, mas as condições devem ser otimizadas para cada

formulação.

Figura 4. Esquema do processo de homogeneização a alta pressão (http://www.artepeças.com.br)

As desvantagens deste processo são o alto consumo energético, o risco de dano na

estrutura molecular, a liberação de partículas metálicas, a ampla distribuição de tamanho de

partícula e, em alguns casos particulares, a dificuldade de escalonamento (Yadav et al., 2013).

Alguns trabalhos científicos, empregando esta técnica, são abordados a seguir.

NLC contendo eugenol como princípio ativo para aplicação periodontal, foram

preparados pelo método de HAP a uma pressão de 500 bar e 5 ciclos (Pokharkar, Shekhawat,

Dhapte & Mandpe, 2011). Foram utilizados ácido esteárico e ácido oleico como lipídeos

sólido e líquido, respectivamente, e como tensoativos foi utilizada uma mistura de Cremophor

RH40, Pluronic F68 e Tween 20 na proporção 5:3:2 respetivamente. Os autores realizaram

um planejamento fatorial 32 para otimizar a porcentagem de lipídeo, estudando concentrações

de 3, 4 e 5 % e a porcentagem de tensoativo na formulação nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5

%. Os resultados mostraram maior eficiência de encapsulação com a maior porcentagem de

fase lipídica e concentração intermediaria de tensoativo. Foi observado que quanto maior a

porcentagem de tensoativo, menor o tamanho de partícula. A formulação otimizada de NLC

foi incorporada em géis de Pluronic F127 e a liberação foi avaliada in vitro utilizando tubos

de diálise, com a quantificação do eugenol realizada por cromatografia em camada delgada de

alta eficiência (HPTLC). A formulação mostrou dois perfis de liberação, com início rápido e

posterior liberação prolongada do eugenol.


Mitri et al. (2011) prepararam NLC de luteína na concentração de 1 % para aplicação

dérmica avaliando os lipídeos cetil palmitato, gliceril tripalmitato, cera de carnaúba e mygliol

(triglicerídeos cápricos e caprílicos). A concentração da fase lipídica foi de 9 % e como

tensoativo foi utilizado o plantacare 810 (decil glucosido) em concentração de 1,5 %. As

nanopartículas lipídicas protegeram a luteína contra a degradação UV e a velocidade de

liberação in vitro foi maior para a nanoemulsão seguida pelas NLC e as SLN. Como esperado,

o princípio ativo permaneceu na pele (sem penetração sistêmica). Quanto ao tamanho de

partícula, maiores tamanhos foram obtidos quando foi utilizada cera de carnaúba comparada

com gliceril palmitato. A adição do lipídeo líquido (mygliol) diminuiu o tamanho de

partícula. Outro efeito observado foi o aumento da termoestabilidade com a cera de carnaúba,

inclusive quando foi utilizada uma temperatura de preparo de 85 °C.

As partículas de NLC têm sido muito utilizadas na formulação de filtros solares,

utilizando o método de HAP. No trabalho publicado por Nikolić et al. (2011), foi realizado

um screening de lipídeos com misturas de 60 e 80 % dos filtros solares. Baseado neste

screening foram excluídos os lipídeos que formaram cristais e os que tiveram uma

temperatura de fusão menor do que 40 °C. Posteriormente, as NLC foram incorporadas em

hidrogéis para avaliar o fator de proteção solar. A proporção de lipídeo não teve influência na

estabilidade, mas sim o tipo de lipídeo, sendo que o Atowax (ésteres cetílicos hidrogenados de

azeite de oliva), a cera de abelhas e a cera de carnaúba foram os mais estáveis. A temperatura

de armazenamento de 4, 25 e 40 °C não apresentou efeito significativo na estabilidade das

formulações e no tamanho de partícula inicial. As NLC contendo cera de carnaúba

apresentaram maior proteção solar do que as NLC, contendo cera de abelhas e mygliol.

Xia et al. (2007) avaliaram formulações contendo filtros solares preparadas pelo

método de HAP, aplicando 3 ciclos de 500 bar. Foram utilizados cera de carnaúba e

compritol® 888 ATO, como lipídeos sólidos, mygliol 812 (triacilglicerol cáprico/caprílico),

como lipídeo líquido e miranol ultra C32 (cocoanfoacetato de sódio), como tensoativo. O

aumento na quantidade de filtro solar diminuiu o tamanho de partícula e aumentou a

estabilidade da formulação. Entretanto, o tamanho de partícula aumentou após 30 dias de

armazenamento. Os resultados mostraram que as NLC a base da cera de carnaúba, possuem

maior cristalinidade do que as NLC com compritol®

888 ATO e foram mais eficientes para

bloquear a radiação UV. Foi mostrado também que a capacidade de carga do sistema de

aproximadamente 70 % de protetor solar permite a produção de cremes e loções de alto fator

de proteção solar.


Partículas de NLC, contendo flurbiprofeno na concentração de 0,25 % foram

preparadas para aplicação tópica, utilizando 3 ciclos de homogeneização a 600 bar de pressão.

Compritol® 888 ATO (6,83 %) e ácido esteárico (6,83 %) foram avaliados como lipídeos

sólidos e como lipídeos líquidos, utilizou-se o mygliol (2,05 %) e o óleo de ricino (0,88 %)

tween 80 na concentração de 3,20 % foi empregado como tensoativo. Observou-se que a

penetração do fármaco na pele está diretamente relacionada com o tamanho de partícula e

com as transições polimórficas determinadas por radiação de raios X. A formulação preparada

com compritol® 888 ATO apresentou menor tamanho de partícula, assim como maiores

transições polimórficas, o que resultou em uma maior penetração do fármaco (González-Mira

et al., 2011).

2.3.1.1.2 Sonicação

De forma similar ao método de HAP, as emulsões formadas pela mistura da fase

lipídica fundida, fase aquosa e tensoativo são submetidas a fontes de alta energia com o

processador ultrassônico. Ondas de frequência maiores a 20 kHz são geradas por um

transdutor magneto-estritivo ou piezelétrico, produzindo gradientes de pressão que deformam

as gotículas, por meio da cavitação produzida pela queda da pressão local abaixo da pressão

de vapor do solvente, gerando fluxo turbulento e cisalhamento (Figura 5) (Liu & Wu, 2010).

Neste processo devem ser otimizadas variáveis como a intensidade e a frequência das ondas;

o incremento da frequência diminui, por exemplo, o tamanho das bolhas cavitacionais. O

tempo de sonicação também é uma variável importante, mas esta técnica tem a vantagem que

o tempo requerido para atingir a diminuição do tamanho de gotícula é reduzido. Uma

desvantagem deste método é a contaminação da formulação devido à liberação de partículas

metálicas da sonda (Yadav et al., 2013).

http://people.umass.edu/mcclemen/FoodEmulsions2008/Presentations(PDF)/(5)Emulsion_Formation.pdf)

Figura 5. Esquema do processador ultrasônico.

Transdutor

Sonda

Emulsão


Das et al. (2012) utilizaram a técnica de sonicação com uma sonda Vibracell™

(Sonics, USA) à intensidade de 700 W e temperatura de 75 ˚C para comparar SLN com NLC

contendo clotrimazol. Foram avaliados comparativamente os lipídeos sólidos: precirol®

ATO5 (glicerol distearato), compritol® 888 ATO (glicerol dibehenato), dynasan 114 (glicerol

trimiristato), dynasan 118 (glicerol triestearato), inwitor 900K (estearato de glicerila) e geleol

suppocire (glicerol monoestearato) em concentrações de 1 a 10 % e os seguintes tensoativos:

cremophor® EL, tween 20, tween 80, pluronic F68 em concentrações de 0,5 a 5 %.

Labrafac™ (triglicerídeos caprílicos/cápricos) foi utilizado como lipídeo líquido.

O tamanho de partícula sofreu uma variação em função do lipídeo sólido, do tipo de

tensoativo e sua concentração. O tempo de sonicação também influiu no tamanho de

partícula, diminuindo com o aumento do tempo até sua estabilização após 10 min. O potencial

zeta das formulações foi influenciado principalmente pelo tipo de lipídeo sólido. O índice de

polidispersão foi utilizado para medir a distribuição de tamanho de partícula, sendo que

quanto mais uniforme a distribuição de tamanho de partícula maior a estabilidade da

formulação, pois existe menor tendência de agregação das partículas. Estudos de liberação in

vitro foram realizados com as melhores formulações (SLN preparadas com compritol® 5 %,

cremophor 3 % e 10 min de sonicação). Quanto às NLC, foram selecionadas as obtidas com

compritol 3 %, labrafac 2 %, cremophor 3 % e 10 min de sonicação. Nos dois casos foram

avaliadas duas proporções de fármaco (4 e 8 %). Os resultados mostraram que a liberação do

fármaco foi maior quando se utilizou uma relação lipídeo-fármaco de 4 %. A estabilidade das

formulações foi avaliada pelas variações no tamanho de partícula, índice de polidispersão,

potencial zeta e eficiência de encapsulação após 1 e 3 meses de armazenamento em

temperaturas entre 2 e 8 °C e a 25 °C. Os resultados desta etapa mostraram que as NLC foram

mais estáveis do que as SLN (Das et al., 2012).

Em um estudo realizado por Fang et al. (2008), foram comparadas três tipos de

formulações: SLN, NLC e microemulsões contendo psoralenos, com tempo de sonicação de

10 min a 35 °C. A SLN foi preparada utilizando precirol ATO 5 (12 %), pluronic F68 (2,4 %)

e myverol 18-04K (0,2 %). Foram preparadas duas formulações de NLC, sendo que a

primeira (NLC1) foi composta por precirol ATO 5 (6 %), escualeno (6 %), pluronic F68 (2,4

%) e myverol 18-04K (0,2 %) e a segunda (NLC2), composta por precirol (6 %), escualeno (6

%), tween 80 (2,4 %) e fosfatidilcolina de soja (0,2 %). O terceiro tipo de formulação

preparada foi a emulsão lipídica, composta por escualeno (12 %) e fosfatidilcolina de soja (6

%). O tamanho de partícula foi maior para a formulação de SLN (296,6 ± 49,5 nm), seguido


da NLC1 (210,2 ± 14,3 nm), NLC2 (172,7 ± 1,2 nm) e por último a emulsão lipídica (137,1 ±

28,5 nm). O potencial zeta das SLN e NLC manteve-se na faixa de -40 a -46 mV e foi

significativamente diferente ao potencial zeta apresentado pela emulsão lipídica, -60,4 mV.

Comparando os sistemas de tensoativos, o sistema mais lipofílico (tween 80 + fosfatidilcolina

de soja), gerou menores tamanhos de partícula. A liberação de psoralenos foi maior para as

NLC, sem diferença significativa entre as duas formulações, seguido das SLN e, finalmente,

emulsão lipídica.

Liu e Wu (2010b) otimizaram as concentrações de tensoativo hidrofílico e lipofílico,

em formulações de NLC para liberação de luteína, preparadas pelo método de sonicação,

utilizando a sonda XL2000 (Misonic, NY, USA) por 3 min. Precirol ATO 5 foi utilizado

como lipídeo sólido, óleo de milho como lipídeo líquido, myverol 18-04K e pluronic F68

como tensoativos. Um planejamento experimental composto por 13 experimentos foi

realizado para a otimização da composição da formulação lipídica, a composição otimizada

foi 5 % de precirol ATO 5, 0,2 % de óleo de milho, 0,05 % de luteína, 0,2 % de myverol 18-

04K e 5 % de pluronic F68. O tamanho das partículas diminuiu de 228 para 130 nm, com o

aumento do tempo de sonicação de 2 a 10 min. As NLC obtidas apresentaram liberação

controlada em fluídos intestinal e gástrico simulados.

A produção de NLC contendo baicaleína, um flavonoide da planta medicinal asiática

Scutellaria baicalensis, foi avaliada por Tsai et al. (2012), pelo método de sonicação,

utilizando a sonda UP50H (Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany), durante 20 min a 50 W.

A formulação foi composta pelos lipídeos tripalmitina, fosfatidilcolina de soja, vitamina E e

poloxamer 188, sendo que ainda foram avaliados dois tipos de lipídeos: Gelucire 49/8 e 62/5

(mono-, di-, e triglicerídeos e mono- e di-ésteres ácidos de polietilenoglicol). Os resultados

mostraram que as NLC melhoraram a liberação e a concentração de baicalina no cérebro e,

por outro lado, não foram observadas diferenças significativas no tamanho das partículas das

diferentes formulações.

2.3.1.2. Métodos de baixa energia

2.3.1.2.1. Injeção de solvente

Este método foi adaptado da produção de micropartículas poliméricas e está baseado

na precipitação do lipídeo da solução na qual se encontra dissolvido. Consiste na dissolução

do lipídeo sólido em solventes orgânicos miscíveis com água, tais como etanol, acetona e


dimetil sulfóxido (DMSO). Estes solventes são posteriormente injetados na fase aquosa, com

ou sem tensoativo, sob agitação, ocasionando a precipitação e formação das partículas

lipídicas as quais são posteriormente filtradas. Este método, além de utilizar solventes

orgânicos, é restrito para lipídeos solúveis nos solventes orgânicos polares, mas tem a

vantagem de não utilizar altas temperaturas nem elevadas taxas de cisalhamento (Schubert &

Müller-Goymann, 2003).

Hu et al. (2002) utilizaram o método de injeção de solvente para a produção de SLN

contendo clobetasol propionato. O fármaco e o lipídeo (monoestearina), foram dissolvidos

em acetona e etanol a 50 oC e a solução orgânica resultante dispersada em solução acidificada

(pH 1,10) contendo álcool polivinílico 1 %. Observou-se uma liberação prolongada do

fármaco durante quatro dias, com uma liberação média de 6 %.

SLN e NLC contendo sinvastatina foram preparados por meio da técnica de injeção de

solvente visando melhorar sua liberação, farmacocinética e biodisponibilidade. Os lipídeos,

gliceril monoestearato e ácido oleico, foram dissolvidos em álcool isopropílico em diferentes

proporções, segundo um planejamento experimental, e injetados em 10 mL da fase aquosa,

contendo o tensoativo poloxamer 407. Posteriormente, o pH foi diminuído na faixa de 1,5 a 2

favorecendo a agregação das NLC e facilitando a separação por centrifugação. A adição do

lipídeo líquido (ácido oleico) diminuiu o tamanho de partícula e o índice de

polidispersibilidade pela redução da viscosidade e tensão superficial. Da mesma forma, o

lipídeo líquido aumentou a eficiência de encapsulação e a concentração sistêmica do fármaco

após administração oral em camundongos (Tiwari & Pathak, 2011).

2.3.1.2.2. Microemulsificação

Este método consiste na dispersão em água fria (0 a 3 °C) de microemulsões

transparentes compostas por quantidades apropriadas de lipídeo fundido, tensoativos, co-

tensoativos e água, de acordo com o diagrama ternário em função da temperatura. A

proporção de cada componente da diluição, assim como o gradiente de temperatura, são

fatores de grande importância para a formação da microemulsão. Gradientes pronunciados de

temperatura facilitam a rápida cristalização dos lipídeos e evitam sua agregação. Uma

desvantagem deste método são as baixas concentrações de partículas lipídicas obtidas após a

preparação (aprox. 1 %) (Souto & Müller, 2007).


Joshi & Patravale, (2008) empregaram essa técnica para o preparo de NLC contendo

celecoxib. Inicialmente, foi realizou-se o screening dos lipídeos gelucire 62/05, 50/13, 53/10,

44/14, apifil, monoestearato de glicerila, gliceril dilaurato e diferentes tipos de tensoativos.

Realizou-se um diagrama pseudoternário de fases para determinar qual composição

favoreceria à formação da microemulsão. Os lipídeos líquidos nos quais o celecoxib teve a

maior solubilidade foram o capryol 90 (propileno glicol monocaprilato contendo 90 % de

monoésteres) e capmul (gliceril monodicaprilato). Entre os tensoativos, o solutol HS 15

(ésteres de polioxietileno) foi o que paresentou melhor resultado. A composição otimizada foi

composta por capmul, gliceril dilaurato (1:1), cremophor e transcutol (1:1,66), com eficiência

de encapsulação de 35 %. Os estudos de liberação in vitro de celecoxib mostraram que as

NLC incorporadas em gel de carbopol tiveram um início rápido, mas prolongado até 24 h.

Jia et al. (2012) estudaram o desenvolvimento de formulações parenterais de NLC

contendo oridonina, um diterpenoide com atividade antineoplásica isolado da erva chinesa

Rabdosia rubescens. A fase lipídica composta por glicerol monostearato e PEG2000-estearato

(3:2) foi dissolvida em 5 mL de etanol e adicionada em 25 mL de fase aquosa, contendo o

tensoativo pluronic F68. Após 4 h de agitação, esta emulsão foi vertida em 20 mL de água

gelada. As NLC obtidas contendo oridonina apresentaram dois padrões de liberação com

início rápido e posterior estabilização (liberação controlada). Concluiu-se que as formulações

desenvolvidas são potencialmente efetivas para a liberação de oridonina por via parenteral.

2.3.2. Caracterização de formulações lipídicas

A caracterização das formulações lipídicas é fundamental na etapa de

desenvolvimento para determinar a influência das variáveis de processo sobre as propriedades

fisico-químicas do produto. Na etapa de produção industrial, a caracterização também é

importante para garantir a qualidade e padronizar as características do produto. As principais

características avaliadas são a eficiência de encapsulação, capacidade de carga de princípio

ativo, distribuição do tamanho de partícula, estabilidade física em função do tempo, potencial

zeta, grau de cristalinidade e características morfológicas (Guimarães & Ré, 2011).

A eficiência de encapsulação é por definição a porcentagem de ingrediente ativo

incorporado nas partículas lipídicas em relação à quantidade total de ingrediente ativo

adicionado. Por outro lado, a capacidade de carga refere-se à quantidade máxima de princípio

ativo incorporado em relação à quantidade de fase lipídica na formulação. A compatibilidade

dos lipídeos com o ingrediente ativo é fundamental na eficiência de encapsulação e na


capacidade de carga; por esse motivo é realizado um screening para selecionar o lipídeo a ser

utilizado na formulação. A quantificação do princípio ativo é realizada utilizando-se técnicas

analíticas como a cromatografia líquida de alta eficiência ou espectroscopia ultravioleta (UV).

O tamanho de partícula é uma propriedade que sofre influência de fatores como, por

exemplo, o tipo de lipídeo e o tensoativo utilizado, bem como as suas concentrações, o

método de preparação e a temperatura utilizada durante o processo. Por outro lado, o tamanho

de partícula tem relação direta com a liberação do composto bioativo no alvo farmacológico

(Tsai et al., 2012). Os métodos mais utilizados para determinar o tamanho de partícula são a

difração de luz (light scattering), a microscopia ótica e a microscopia eletrônica de varredura

(MEV), sendo que esta última técnica é também bastante utilizada para avaliar as

características morfológicas das partículas (Guimarães & Ré, 2011). Normalmente os

tamanhos das partículas são de escala nanométrica.

O potencial zeta é uma propriedade que indica a carga superficial das partículas e está

relacionada com a estabilidade das formulações uma vez que a agregação de partículas é

menos provável de ocorrer em partículas carregadas (alto potencial zeta), devido à repulsão de

cargas. Este parâmetro é calculado a partir da velocidade de migração das partículas

suspensas em um líquido condutor quando é aplicado um campo elétrico que atrai as

partículas ao eletrodo de carga oposta, sendo que a velocidade de migração é proporcional à

carga superficial da partícula (Guimarães & Ré, 2011).

Outra propriedade importante a ser determinada é o estado cristalino o qual fornece

informações sobre a conformação estrutural do material e permite detectar a presença de

formas polimórficas. O aquecimento e resfriamento dos lipídeos durante o processo de

fabricação pode ocasionar estas mudanças na conformação estrutural. Os métodos mais

utilizados para determinar o estado cristalino são a difração de raios-X e a calorimetria

exploratória diferencial (Guimarães & Ré, 2011).

2.3.3. Estabilidade de emulsões

As emulsões são sistemas termodinamicamente instáveis em decorrência que a água e

o óleo não são miscíveis, separando-se em duas fases. Na Figura 6, são apresentados os

principais mecanismos físico-químicos pelos quais as emulsões se desestabilizam, tais como a

separação gravitacional (cremeação-sedimentação), floculação, coalescencia, inversão de

fases e Oswald ripening.


Figura 6. Representação dos principais mecanismos físico-químicos da instabilidade das

emulsões (McClements, 2007).

A separação gravitacional é uma dos mecanismos de instabilidade mais comuns e está

relacionada com a densidade das gotículas da emulsão. Quando a densidade das gotículas é

menor do que a densidade do meio, estas ascendem no processo denominado cremeação

(creaming); quando a densidade da emulsão é maior que a densidade do meio ocorre um

processo denominado de sedimentação. Como a densidade da maioria dos óleos utilizados

para fins alimentícios ou farmacêuticos é menor do que a densidade da água a cremeação

tende a ocorrer normalmente em emulsões do tipo óleo em água (O/A) e a sedimentação em

emulsões do tipo água em óleo (A/O) (McClements, 2007). A velocidade com que ocorre a

separação gravitacional tem sido calculada, utilizando a Lei de Stokes a qual relaciona o raio

das gotículas, a densidade da fase contínua e da fase dispersa e a força da gravidade. Quando

existem diferentes tamanhos de partículas na emulsão, a velocidade de separação é diferente,

sendo que as partículas maiores separam mais rápido do que as menores.

A floculação é o processo pelo qual as gotículas das emulsões tendem a se associar,

porém, mantendo sua integridade, diferente da coalescencia em que duas ou mais gotículas se

unem, formando uma gotícula maior. O processo de floculação está relacionado com as forças

atrativas e repulsivas entre as partículas. As principais interações atrativas são as forças de

van der Waals, depleção e forças hidrofóbicas, enquanto as forças repulsivas são do tipo

eletrostáticas e estéricas (McClements, 2007).

A coalescência ocorre quando duas ou mais gotículas se unem formando gotículas

maiores o que causa à separação de fases. Em emulsões O/A ocorre a formação de uma fase

Emulsão

estável

Inversão de

fases

Cremeação Sedimentação Floculação Coalescencia Oswald

ripening


lipídica na parte superior e em emulsões A/O é formada uma fase aquosa na parte inferior. A

coalescência ocorre como resultado da colisão entre as gotículas da emulsão e posterior

migração da fase interna e a colisão pode ocorrer de forma espontânea ou mais provavelmente

pelo contato prolongado em emulsões concentradas (McClements, 2007). A coalescência

pode ser evitada reduzindo a concentração das gotículas da emulsão na formulação, evitando

submeter a emulsão a altas forças de cisalhamento e alterando as propriedades da membrana

interfacial para melhorar a resistência à ruptura.

Ostwald ripening é um mecanismo de instabilidade de emulsões que ocorre pelo

aumento de tamanho das gotículas maiores como consequência da ruptura das partículas de

menor tamanho. As moléculas da superfície são energeticamente mais instáveis do que as

moléculas do interior e portanto, as gotículas maiores são termodinamicamente mais estáveis

do que as partículas menores as quais têm maior tendência à solubilização (Lieberman, Rieger

& Banker, 1996).

A inversão de fases é o processo pelo qual uma emulsão do tipo O/A muda para o tipo

A/O podendo ser considerado um mecanismo de instabilidade ou, em alguns casos, um

processo realizado intencionalmente. É desencadeado por mudanças na composição da

emulsão, como a alteração na concentração de fase dispersa, a concentração de tensoativo ou

a mudança na temperatura. Neste processo estão envolvidos fenômenos de floculação,

coalescência e disrupção. O método mais utilizado para avaliar a inversão de fases é a medida

da condutividade elétrica da emulsão que é maior para emulsões O/A do que A/O

(McClements, 2007).

2.4 Secagem em spray drying de composições contendo compostos voláteis

As emulsões e formulações lipídicas líquidas têm se mostrado sistemas de liberação

efetivos de compostos bioativos de origem sintética ou natural pouco solúveis em água,

aumentando sua absorção. Porém, as matrizes líquidas são físico-química e

microbiologicamente mais instáveis que as respectivas formas sólidas. Além disso, as

emulsões são sistemas termodinamicamente instáveis. A secagem de emulsões surge como

uma estratégia interessante que permite aumentar sua estabilidade e, consequentemente, o

tempo de armazenamento uma vez que em estado sólido, as emulsões podem ser facilmente

redispersas no momento do uso (Dollo et al., 2003).


A liofilização é um dos processos de secagem que permite obter emulsões secas,

porém os altos custos envolvidos podem inviabilizar sua aplicação industrial. A técnica de

spray drying tem sido mais utilizada na encapsulação e secagem de emulsões e formulações

alimentícias e farmacêuticas por ser mais econômica e versátil (Bourezg, Bourgeois,

Pressenda, Shehada, & Fessi, 2012; Christensen, Pedersen, & Kristensen, 2001; Garcia,

Tonon, & Hubinger, 2012; Nesterenko, Alric, Silvestre, & Durrieu, 2012).

Compostos voláteis têm sido encapsulados com sucesso por spray drying mediante a

elaboração de emulsões e a adição de carreadores de secagem. Neste processo, a fase aquosa é

removida e consequentemente o carreador (sólido) encapsula a fase lipídica dispersa,

resultando em emulsões secas que podem ser redispersas em água, restabelecendo o sistema

original (Christensen et al., 2001).

Durante a secagem por spray drying, preconiza-se a retenção dos compostos voláteis e

a evaporação da água. Este fenômeno tem sido explicado pelo fato que, na primeira fase do

processo, a gota atomizada perde água da parte exterior, formando uma crosta. Quando esta

superfície atinge uma umidade de 7 a 23 %, ela não é mais permeável aos compostos voláteis,

mas permanece permeável às moléculas solúveis em água, atuando como uma membrana

semipermeável, que permite a evaporação da água e a retenção dos voláteis (Reineccius,

2004).

Os principais fatores que influenciam a retenção de voláteis durante a atomização em

spray dryer são a composição da formulação, o teor de sólidos, a temperatura de entrada e

saída do secador e a concentração dos compostos voláteis. Um dos fatores mais importantes

para a retenção de compostos voláteis é o teor de sólidos da formulação. Quanto maior o teor

de sólidos da formulação menor é o tempo de formação da crosta superficial, que atua como

membrana semipermeável, promovendo assim a retenção de voláteis (Jafari, Assadpoor, He,

& Bhandari, 2008; Reineccius, 2004; Rosenberg, Kopelman, & Talmon, 1990).

A viscosidade da composição também é um fator importante, uma vez que tem relação

direta com o diâmetro da gota atomizada. No entanto, viscosidades muito baixas afetam a

formação da membrana semipermeável das partículas durante a secagem. Por isso, o teor de

sólidos da formulação deve ser otimizado em função da viscosidade (Rosenberg et al., 1990).

Soottitantawat et al. (2005b), conseguiram maior retenção de l-mentol com o aumento

progressivo do teor de sólidos da composição de 5, 10, 20 e 30 % (p/p) e utilizando a

proporção de l-mentol para o material de parede (amido de milho modificado, Hi-Cap 100) de


2:8 (20 % p/p). O tipo de material de parede também teve influência na retenção de l-mentol.

Os autores compararam três tipos de materiais de parede: a goma arábica, o Hi-Cap 100

(amido de milho modificado) e o Capsul (amido de milho modificado) utilizando teor de

sólidos de 30 %. Os resultados mostraram que o Hi-Cap apresentou maior retenção de l-

mentol, porém com maior teor de l-mentol na superfície das partículas, enquanto a goma

arábica apresentou menor retenção de l-mentol, mas o teor superficial das partículas foi

menor, indicando uma melhor encapsulação.

Quanto ao carreador de secagem, é ideal que apresente boas propriedades de

emulsificação e formação de película. Assim, a adição de tensoativos na formulação facilita a

obtenção de emulsões estáveis, melhorando, desta forma, a retenção de voláteis durante a

secagem (Jafari et al., 2008). O estado cristalino do carreador também é de grande

importância, pois está relacionado com a difusão dos compostos dentro da matriz formada nos

estágios iniciais da secagem. Materiais amorfos causam um efeito de imobilização que

dificulta a difusão dos compostos na matriz facilitando a sua encapsulação. Por outro lado,

nos materiais cristalinos, a difusão é mais rápida, aumentando as perdas dos ativos (Goubet &

Voilley, 1998).

As características físico-químicas dos compostos a serem encapsulados estão

diretamente relacionadas com sua retenção na encapsulação por spray drying, principalmente

em relação à difusão através da membrana formada durante a secagem. Portanto, compostos

com maior peso molecular, maior tamanho (efeito estérico) e menor volatilidade difundem

mais lentamente, diminuindo as perdas (Goubet & Voilley, 1998). Em um estudo realizado

por Adamiec e Kalemba (2006), foi comparada a retenção de óleo de elemi (Cannarium

commune) e menta (Mentha piperita) pelo processo de spray drying, utilizando maltodextrina

DE16 como carreador. Os resultados mostraram que a retenção do óleo de menta foi maior,

sendo atribuída aos pontos de ebulição maiores dos principais compostos do óleo de menta

(monoterpenos oxigenados) comparados aos compostos do óleo de elemi.

A quantidade de óleo inicial tem influência na retenção dos compostos voláteis. Altas

cargas de compostos voláteis resultam em maiores perdas devido a uma maior quantidade de

moléculas que irão ficar próximas da superfície difundindo-se mais rapidamente ao exterior,

facilitando as perdas. Este comportamento foi observado por Garcia et al. (2012), na

encapsulação de óleo de manjericão por spray drying, utilizando goma arábica como material

de parede. Os autores observaram que a retenção diminuiu com o aumento da concentração


inicial de óleo, resultados similares também obtidos por Adamiec e Kalemba (2006) na

encapsulação de óleo de menta, utilizando maltodextrina como material de parede. Neste

estudo, a eficiência de encapsulação diminuiu de 70,6 % para 57,2 % com o aumento da

concentração inicial de óleo de 10 para 30 %. Quanto maior a proporção de material de

parede em relação ao composto a ser encapsulado, maior a retenção (Soottitantawat,

Takayama, et al., 2005). Normalmente são utilizadas proporções de voláteis em relação ao

material de parede de 1:4 (p/p) (Beristain, Garcia, & Vernon-Carter, 2001; Reineccius, 2004;

Soottitantawat, Bigeard, et al., 2005).

Além da estabilidade da emulsão, o tamanho de gotícula também possui um efeito

pronunciado na retenção de voláteis. Tem sido observado que a retenção de voláteis aumenta

com a redução do tamanho de partícula da emulsão (Garcia et al., 2012; Soottitantawat,

Bigeard, et al., 2005). Emulsões com tamanho de gotícula grande podem ser rompidas com a

força de cisalhamento produzida durante a atomização. Entretanto emulsões com gotículas

muito finas incrementam a área superficial, favorecendo a difusão (Soottitantawat, Yoshii,

Furuta, Ohkawara, & Linko, 2003). O tamanho de gotícula da emulsão está diretamente

relacionado com o método de preparação no qual são utilizados diferentes tempos e

temperaturas (Soottitantawat, Bigeard, et al., 2005).

O efeito da temperatura de secagem deve ser considerado para cada produto em

particular, dependendo da composição da formulação. Altas temperaturas de secagem

favorecem a rápida formação da camada superficial (membrana semipermeável), que permite

a evaporação da água e a retenção dos voláteis (Jafari et al., 2008). Temperaturas elevadas

também diminuem a umidade relativa do ar de secagem, facilitando a transferência de calor e

acelerando o processo de secagem. Por outro lado, temperaturas de secagem elevadas podem

promover a degradação dos componentes termossensíveis presentes na formulação

(Reineccius, 2004).

Uma etapa fundamental na secagem e encapsulação de compostos por spray drying é a

seleção do material de parede (carreador) a qual está baseada na utilização que vai ser dada ao

produto, no tipo do material a ser encapsulado e no custo (Madene, Jacquot, Scher, &

Desobry, 2006). As características necessárias que o material de parede deve ter são a

capacidade de formação de filme, baixa viscosidade em altas concentrações, capacidade

emulsificante, não reatividade com a material a ser encapsulado, alta temperatura de transição

vítrea e baixo custo (Gharsallaoui, Roudaut, Chambin, Voilley, & Saurel, 2007). Os materiais


de parede podem ser classificados segundo sua composição química, sendo que os mais

utilizados são os carboidratos, gomas e proteínas.

Os carboidratos são bastante utilizados na encapsulação de compostos alimentícios

devido ao seu baixo custo, boa solubilidade e excelente grau de proteção. Destacam-se neste

grupo as maltodextrinas, os amidos e a β-ciclodextrina. As maltodextrinas são amidos

hidrolisados, que apresentam diferentes propriedades físico-químicas, dependendo do grau de

hidrolise, descrito por seu equivalente de dextrose (DE). O aumento do grau de DE confere à

maltodextrina propriedades similares à dextrose, enquanto a diminuição aproxima às

propriedades do amido. De modo geral, tem-se que quanto maior o DE, maior a

higroscopicidade, a solubilidade e a doçura e, menor a viscosidade. As maltodextrinas puras

ou em combinação com as gomas são muito utilizadas na encapsulação de compostos voláteis

(Shah, Ikeda, Michael Davidson, & Zhong, 2012).

As ciclodextrinas são outro tipo de carboidratos de estrutura cíclica compostas por 6

(α-ciclodextrina), 7 (β- ciclodextrina) ou 8 (γ- ciclodextrina) monômeros de glicose, e são

produzidas pela degradação enzimática do amido por bactérias específicas. A estrutura

molecular das ciclodextrinas tem uma cavidade hidrofóbica que facilita a formação de

complexos de inclusão com diferentes tipos de moléculas, melhorando sua solubilidade,

estabilidade e biodisponibilidade (Rowe, Sheskey & Owen, 2006).

Os amidos de milho modificados, tais como o capsul, obtido pela reação com

anhidrido n-octenil succinico, e Hi-Cap 100 o qual é misturado com xarope de dextrose até

atingir unidades equivalentes de dextrose de 32 a 37 DE, também têm mostrado bons

resultados na encapsulação de diferentes compostos voláteis.

Com relação às gomas, a goma arábica é a mais utilizada e consiste em um polímero

composto por ácido D-glucurônico, L-ramnosa, D-galactose e L-arabinosa com

aproximadamente 2 % de proteínas as quais têm sido atribuídas as propriedades

emulsificantes (Gharsallaoui et al., 2007). A goma arábica tem apresentado excelentes

resultados na encapsulação de compostos voláteis (Garcia et al., 2012). Dentre as

desvantagens do uso da goma arábica estão seu custo relativamente alto, a disponibilidade

limitada e possíveis variações na sua qualidade, como a presença de impurezas (Jafari et al.,

2008).


Proteínas, tais como a gelatina, caseinatos, proteínas de soja ou do soro do leite,

também são muito utilizadas como material de parede, pois possuem caráter anfifílico,

oferecendo as propriedades físico-químicas e funcionais requeridas para encapsular materiais

hidrofóbicos. Fatores como o pH e a força iônica devem ser levados em consideração com o

uso de proteínas, pois podem alterar suas propriedades (Jafari et al., 2008).

2.5. Absorção intestinal de compostos bioativos

A via de administração oral de fármacos é uma das mais utilizadas devido à

eliminação do desconforto de injeções, manipulação estéril e hospitalização o que resulta em

um aumento da aderência do paciente ao tratamento aumentando assim a eficácia. Porém, a

administração oral apresenta alguns desafios devido ao maior número de barreiras fisiológicas

que devem ser superadas para o fármaco estar biodisponível.

Para ser absorvido, o fármaco deve estar em solução ou ligado aos alimentos, deve ser

estável ao pH intestinal e à degradação enzimática (Aulton, 2005). Os fármacos atravessam a

mucosa intestinal por diferentes mecanismos: transcelular quando o fármaco passa através das

células, paracelular quando entra pelas uniões entre as células, por transocitosis quando é

incorporado pela membrana e transportado por toda a célula e excretado no lugar oposto, ou

por meio de um carreador (Thanki, Gangwal, Sangamwar, & Jain, 2013). Uma vez o fármaco

atravessa o epitélio intestinal, vai ao fígado antes de alcançar a circulação sistêmica. Fatores

como a solubilidade, valor de pKa, coeficiente de partição (Log P e Log D), expulsão por

bombas de efluxo, união a proteínas e metabolismo pre-sistemico devem ser considerados

(Thanki et al., 2013).

O efeito das formulações lipídicas na absorção do fármaco e a sua biodisponibilidade

após administração oral tem sido relacionado com três mecanismos: alteração da composição

e caráter do entorno intestinal, transporte linfático a partir do intestino e transporte mediado

por enterocitos (Porter et al., 2007). A presença de lipídeos no trato intestinal estimula a

secreção de lipases, sais biliares e diminui o tempo de transito do material do estomago. Após

absorção no enterocito, os produtos da digestão lipídica podem formar parte de lipoproteínas,

tais como quilomicrons e lipoproteínas de baixa densidade as quais são transportadas na

circulação sistêmica pelo sistema linfático intestinal.

Células epiteliais são comumente empregadas para estudos de transporte de fármacos.

São experimentos in vitro que permitem obter informações relevantes facilmente


extrapoláveis ao sistema de absorção intestinal em humanos (Aulton, 2005; Tavelin, Grasjo,

Taipalensuu, Ocklind, & Artursson, 2002). Os experimentos de transporte de fármacos

usando células epiteliais tem sido automatizados e são utilizados como uma ferramenta de

screening em projetos de descoberta e avaliação de novos fármacos.

A linhagem de células mais utilizada para a avaliação de permeação intestinal in vitro

de fármacos são as CaCo-2, provenientes de adenocarcinoma coloretal humano. Dentro das

razões para a preferência por estas células estão o alto grau de diferenciação celular o que

permite a formação de monocamadas com uniões intercelulares, expressão de varias enzimas

e isoenzimas encontradas no epitélio intestinal (isoenzimas CYP450, glucuronidase,

glutation-S-trasnferases e sulfotranserases), expressão de sistemas de transporte encontrados

nos enterocitos humanos (transporte de açúcares, aminoácidos, peptídeos e vitaminas) os

quais tem sido muito bem caracterizados (Tavelin et al., 2002). Além disso, o amplo uso

destas células facilita sua aquisição de fontes como a American Type Culture Collection

(ATCC) e European Collection of Cell Culture (ECACC) (Tavelin et al., 2002).

Este modelo celular para estudos de permeação intestinal in vitro tem sido utilizado

em diversos trabalhos para a avaliação de formulações lipídicas e compostos de origem

vegetal. Alguns de estes trabalhos são discutidos a seguir.

O efeito da coadministração de lipídeos digestíveis com compostos de baixa

solubilidade e com problemas de absorção tais como flavonas foi avaliado utilizando células

CaCo-2. O estudo mostrou que uma dispersão coloidal de ácido oleico e sais biliares estimula

a secreção de lipoproteínas como quilomicrons e lipoproteínas de baixa densidade (VLDL)

nas células CaCo-2, isto favoreceu o transporte linfático de uma polimetoxiflavona

comumente encontrada em cítricos com interesse nutracêutico que inibe o crescimento de

cédulas cancerígenas (Yao et al., 2013). Os compostos bioativos incorporados em

quilomicrons são absorvidos preferivelmente via circulação linfática do que pela veia porta

hepática evitando assim o efeito de primeira passagem.

Carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) foram utilizadas como ferramenta para

aumentar a biodisponibilidade oral de saquinavir, uma fármaco tipo IV segundo o sistema de

classificação biofarmacêutica (Beloqui et al., 2013). Células CaCo-2 foram utilizadas na

comparação de três formulações lipídicas contendo Tween 80, Poloxamer 188, Precirol

ATO5, Mygliol 812N/F. Alguns inibidores foram avaliados na elucidação do mecanismo de

endocitose. Os resultados deste estudo mostraram que os NLC aumentaram em 3,5 vezes a


permeação de saquinavir comparado com a suspensão, evitando o efluxo da bomba P-gp e

alterando o mecanismo de transcitose das nanopartículas.

Sistemas de liberação lipídicos contendo curcumina foram desenvolvidos otimizando a

composição da formulação por meio de diagramas ternários. Os resultados mostraram

aumento da solubilidade e transporte através de células CaCo-2 comparado com o fármaco

livre. Um aumento da atividade antimalárica foi observado nas formulações lipídicas

contendo curcumina e doses subterapêuticas de β-arteeter (Memvanga, Coco & Préat, 2013).

Um estudo de transporte in vitro utilizando monocamadas de células CaCo-2 foi

realizado com nanopartículas de PLGA (poli L-ácido láctico-co-ácido glicólico) contendo 9-

nitrocampotecina, um fármaco anticancer análogo do alcaloide campotecina (Derakhshandeh,

Hochhaus, & Dadashzadeh, 2011). Avaliou-se o efeito do tamanho de partícula e o tempo de

incubação na permeação do fármaco. Os resultados mostraram que partículas de menor

tamanho (110 nm) foram transportadas mais eficientemente do que partículas de maior

tamanho com a mesma concentração do fármaco. Da mesma forma foi determinado que o

aumento da concentração do fármaco encapsulado aumentou a sua absorção. Com respeito ao

tempo de incubação, foi observada uma relação diretamente proporcional.

O modelo de monocamada de células CaCo-2 também foi utilizado para demonstrar a

permeação de procianidinas tipo A de mirtilo o que permitiu inferir que estes compostos estão

biodisponíveis após consumo em humanos (Ou, Percival, Zou, Khoo, & Gu, 2012).

Um sistema de liberação bioadesivo composto por nanopartículas lipídicas e gérmen

de trigo foi desenvolvido para a liberação oral de bufalin, um composto bioativo isolado da

planta tradicional chinesa "Chan´su". O estudo de permeação nas células CaCo-2 mostraram

um aumento de permeação no sistema desenvolvido em comparação com o controle (Liu et

al., 2010).

Nesta revisão foram abordados os aspetos relacionados ao cultivo e produção do cravo

da india, suas principais atividades biológicas e outros usos populares da planta justificando a

escolha desta especie para o desenvolvimento deste projeto. Posteriormente foram revisados

os métodos de extração de compostos de materias-primas vegetais por diferentes técnicas

dando ênfase na extração micelar, sendo um método de extração pouco usado mas de grande

potencial de aplicação. Foi destacada a importancia da extração como o primeiro passo na

preparação de formulações lipídicas contendo os compostos bioativos do cravo. Dando


continuidade à revisão da literatura foi abordado o uso de formulações lipídicas como

sistemas de liberação de compostos, sua importância, os principais métodos de fabricação e

exemplos de aplicações. Em seguida foi discutido o uso da técnica de spray drying para a

produção de formulações lipídicas sólidas. Finalmente foi relacionado o uso de formulações

lipídicas com o aumento da absorção intestinal de compostos bioativos. Desta forma foram

abordados os principais topicos relacionados com cada etapa do projeto dando os conceitos

teóricos fundamentais para o desenvolvimento das etapas práticas e para alcançar os objetivos

propostos.

3. OBJETIVOS

Objetivos 40

3. Objetivos

3.1 Objetivo geral

O objetivo principal desse projeto é o desenvolvimento e secagem de sistemas lipídicos

contendo compostos bioativos de Syzygium aromaticum, empregando diferentes rotas

tecnológicas e avaliando a influência de variáveis do processo sobre propriedades do produto.

3.2 Objetivos específicos

As seguintes etapas foram realizadas para alcançar os objetivos propostos:

Avaliar o processo de extração de compostos bioativos da matéria-prima vegetal,

visando obter um extrato com elevado teor de compostos com atividade biológica

(antioxidante), e do marcador químico a ser monitorado;

Investigar a influência da composição da emulsão (sistemas lipídicos e emulsificantes)

e de processos de homogeneização e secagem nas propriedades físico-químicas das

partículas obtidas;

Padronizar métodos para a caracterização físico-química da matéria-prima utilizada e

produtos obtidos;

Avaliar a atividade antioxidante da matéria-prima utilizada e dos produtos obtidos.

Avaliar a estabilidade do produto e possíveis transformações físicas e químicas,

causadas pelas condições de armazenagem.

Determinar o efeito das formulações na permeação intestinal do eugenol avaliado pelo

modelo in vitro usando células CaCo-2.

4. MATERIAL E MÉTODOS

Material e métodos 42

4. Material e métodos

Apresenta-se neste capítulo os materiais e métodos utilizados no desenvolvimento

deste trabalho.

4.1 Material

4.1.1. Matéria-prima vegetal

Cravo

Com a colaboração do CEPLAC (Comissão Executiva do Plano da Lavoura

Cacaueira) da Região de Valença, Bahia foram adquiridos botões florais secos, assim como o

óleo essencial de cravo da Índia (Syzygium aromaticum).

4.1.2 Adjuvantes tecnológicos

4.1.2.1 Lipídeos

Compritol® 888 ATO (Gattefossé, França): Gliceril behenato, é uma mistura de

diacilgliceróis, principalmente dibehenoilglicerol e quantidades variáveis de mono e

triacilgliceróis, sendo que o principal ácido graxo encontrado é o ácido behenico; tem

ponto de fusão de 65 a 77 °C, EHL de 2, é insolúvel em etanol 95 % e água (Rowe et

al., 2006).

Óleo de buriti: extraído da palmeira Mauritia flexuosa (Família Arecaceae) foi

adquirido da empresa Amazon oil (Ananindeua, Pará, Brasil). Este óleo é rico em β-

caroteno, ácido oleico, palmítico e linoleico. Seu ponto de fusão é de 25 °C.

Apifil CG (Gattefossé, França): é uma cera obtida a partir da cera de abelhas,

adicionando polietilenoglicol (PEG-8); esta cera possui propriedades emulsificantes,

EHL de 9 e ponto de fusão de 59 a 70 °C e é utilizada como emulsificante A/O em

emulsões com alto teor de lipídeos.

Cera de carnaúba (Foncepi, Brasil): esta cera é extraída das folhas da palmeira

brasileira Copernicia cerifera e consiste em flocos amarelos ou laranjas.

Quimicamente é composta por uma complexa mistura de ésteres de ácidos graxos e

álcoois, sendo os C26 e C32 os mais comuns. Seu ponto de fusão está entre 78 e 88 °C,

é solúvel em etanol 95 % quente e insolúvel em água (Rowe et al., 2006). Existem

diferentes tipos de cera de carnaúba, dependendo do grau de pureza, o qual reflete na


cor e no índice de acidez. As ceras de carnaúba tipo 1 e 3 são as mais utilizadas na

indústria farmacêutica.

Cera de abelhas (Viafarma, Brasil): consiste em uma mistura de 70 a 75 % de ésteres

de álcoois de cadeia reta de 24 a 36 átomos de carbono, sendo o miricil palmitato o

principal éster; tem ponto de fusão de 61 a 65 °C e é ligeiramente solúvel em etanol 95

%, mas insolúvel em água (Rowe et al., 2006).

Monoestearato de glicerila (Viafarma, Brasil): consiste em flocos de cor creme com

ponto de fusão de 55 a 60 °C; é solúvel em etanol 95 % quente (Rowe et al., 2006).

Ácido esteárico (Viafarma, Brasil): consiste em uma mistura de ácido palmítico (C16)

e esteárico (C18) com não menos de 40 % deste último, tendo EHL de 15; o ponto de

fusão é igual ou maior a 54 °C, sendo solúvel em etanol 95 % insolúvel em etanol 70

% e água (Rowe et al., 2006).

4.1.2.2 Tensoativos

Poloxamer 188 (Kolliphor P, BASF, Brasil): é um copolímero formado por uma

cadeia central hidrofóbica de polioxipropileno e duas cadeias hidrofílicas de

polioxietileno. Existem diferentes tipos de poloxamer, dependendo do tamanho das

cadeias. Estes apresentam diversas aplicações como agente dispersante, emulsificante,

coemulsificante, solubilizante, lubrificante na fabricação de comprimidos e como

agente umectante; seu EHL é de 29 e o ponto de fusão de 52 a 57 °C, com

solubilidade em água e etanol 95 % (Rowe et al., 2006).

Polisorbato 80 (Tween 80, LabSynth, Brasil): tensoativo não iônico com EHL de 15,

formando emulsões O/A; é um líquido viscoso ligeiramente amarelado, utilizado em

diversos produtos farmacêuticos e cosméticos como agente emulsificante, umectante e

solubilizante (Rowe et al., 2006).

Sorbitan monoleato (Span 80, Sigma): tensoativo não iônico com valor EHL de 4,3

utilizado na elaboração de produtos farmacêuticos, cosméticos e alimentícios como

emulsificante lipofílico, formando emulsões A/O (Rowe et al., 2006).

Gelucire 50/13 (esteroil polioxil-32 glicerideos), Gelucire 44/14 (Lauroil

polioxilglicerideos) e Gelucire 50/2 (Gattefossé, França): são misturas de glicerídeos e

polietilenoglicóis responsáveis pelas suas propriedades hidrofóbicas e hidrofílicas,

respectivamente. Os Gelucires são caracterizados por dois números, sendo o primeiro

referente ao ponto de fusão e o segundo referente ao EHL. Em geral, são utilizados

como tensoativos, agentes solubilizantes e umectantes.


4.1.2.3 Materiais de parede - carreadores de secagem

Maltodextrina DE 10, MOR-REX 1910® - (Corn Products do Brasil

®): obtidas a partir

de hidrólise ácida ou enzimática do amido. São classificadas de acordo aos

equivalentes de dextrose (DE), sendo que um DE baixo indica um comportamento

mais parecido ao amido e valores altos de DE um comportamento mais parecido à

glicose. A temperatura de transição vítrea está inversamente relacionada com o grau

de DE (Rowe et al., 2006).

Goma Arábica (Colloides Naturels Brasil): heteropolissacarídeo complexo, obtido a

partir do exsudado da espécie arbórea Acacia senegal Linné ou outras espécies de

Acácia. Como suas principais vantagens, destacam-se sua habilidade emulsificante e a

boa retenção de voláteis nos produtos secos por spray drying. A goma arábica é

utilizada na preparação de cosméticos e alimentos como agente emulsificante e

suspensor (Rowe et al., 2006).

Lactose 200 (Natural pharma): pó branco tipicamente composto por 70 a 80 % de β-

lactose e 20 a 30 % de α-lactose com ponto de fusão de 232 °C. Além de ser utilizada

como material de parede na encapsulação por spray drying, também é empregada na

compressão direta de comprimidos, agente ligante e agente crioprotetor (Rowe et al.,

2006).

4.1.3 Reagentes, solventes e padrões analíticos

Álcool etílico absoluto (Labsynth), metanol HPLC (Sigma-Aldrich Chemical Co),

ácido fosfomolíbdico (Vetec química fina), tungstato de sódio (Vetec química fina), carbonato

de sódio anidro (Labsynth). Trolox: 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico

(Sigma–Aldrich Chemical Co), ABTS (2,2 AZINO BIS (3-etilbenzo tiazolin 6 ácido

sulfônico) diamonio sal (Sigma–Aldrich Chemical Co).

Substâncias padrão: eugenol e acetato de eugenol (Sigma-Aldrich Chemical Co).

Para a cultura de células foram utilizados os seguintes materiais: Dulbecco's modified

Eagle's medium (DMEM) suplementado com 1 g/L glucose, L-glutamina e piruvato de sodio

(Corning cellgro REF 10-014-CV), soro fetal bovino inativado termicamente (Corning REF

35-011-CV) e 1% de solução de penicilina estreptomicina 100X, solução balanceada de

Hanks (HBSS), tampões MES (Sigma SLB8374) e HEPES 1M (Corning REF 25-060-Cl),

Tripsina 0,05% - EDTA 0,53 mM 1X (Corning 25-052-Cl), brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-

2-il)-2,5-difeniltetrazolio] (MTT).


4.2. Equipamentos

Os seguintes equipamentos foram utilizados no desenvolvimento desse trabalho.

Spray dryer

Utilizou-se um spray dryer modelo SD-05, fabricado pela Lab-Plant, Reino Unido,

composto por uma câmara de secagem de diâmetro de 215 mm e altura de 500 mm. O sistema

de alimentação de suspensão é composto por uma bomba peristáltica e um atomizador de

duplo fluido a ar comprimido; o sistema de alimentação do ar de secagem é constituído por

um compressor e um filtro de ar; sistema de controle de temperatura do gás de secagem;

sistema coletor (ciclone).

Liofilizador

Utilizou-se um liofilizador modelo SNL108B, da Thermo Fisher Scientific contendo

uma unidade liofilizadora Micromodulyo 1,5 L (305x330x432 mm), um condensador em aço

inoxidável um compressor de 1/4 hp e potência de 0,30 kw, uma bomba de ultra-vácuo

LyoPump VLP195FD, frascos para liofilização e válvulas independentes.

Outros equipamentos utilizados

Agitadores mecânicos e magnéticos (Nova ética 119);

Analisador de tamanho de partícula por difração de luz (Light scattering)

Beckman Coulter LS 13 320;

Balança de umidade Sartorius MA35;

Balanças analíticas: Mettler Toledo AG204 e Shimadzu (AUY220) e semi-

analítica (Marte AL500);

Bombas de vácuo modelo 131, (Prismatec);

Câmaras climática para estudo de estabilidade Nova ética B.O.D. 411D e Nova

ética 420E (Vargem Grande Paulista, Brasil).

Centrífuga (Fanem Mod. 206, Brasil);

Determinador de densidade compactada Caleva® TDT;

Espectrofotômetro UV-Vis HP 8453 (Agilent Technologies);

Estufa de secagem com circulação de ar;

Evaporador rotativo;

Homogeneizador de alta pressão Panda Plus (GEA Niro Soavi);


Homogeneizador de alta rotação ultra-turrax IKA mod. T18 basic (6000 a

24000 rpm/min);

Medidor de atividade de água AquaLab 4TEV Decagon devices;

pH-metro Micronal mod. B474;

Processador ultrassônico SONICS Vibracell mod CV334;

Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) LC-20A

Prominence Shimadzu com injetor automático, bomba LC-6A (Shimadzu

Corporation, Kyoto, Japan) e detector de arranjo de diodos (SPD-M20A);

Tanque extrator.

4.3. Métodos

Visando facilitar o entendimento do projeto foi elaborado um fluxograma que mostra

as principais etapas realizadas (Figura 7). Inicialmente foi realizada uma revisão bibliográfica

sobre o cravo da India (Cortes-Rojas et al., 2014). O trabalho experimental iniciou-se com a

análise e caracterização da matéria-prima vegetal adquirida. Posteriormente validou-se o

método analítico para a quantificação de eugenol e acetato de eugenol nas formulações.

Dando continuidade ao projeto e seguindo os objetivos propostos foi avaliado o processo de

extração dos compostos bioativos do cravo por dois métodos: extração micelar, utilizando

tensoativos e extração hidroalcoolica. Os resultados advindos da etapa da extração de eugenol

utilizando tensoativos foi publicada no Journal of Separation and Purification Science

(Cortés-Rojas, Souza, & Oliveira, 2015).

A avaliação das variáveis envolvidas na elaboração das formulações lipídicas foi

abordada da seguinte forma: inicialmente foi realizado um screening com os lipídeos

comumente utilizados visando selecionar o mais compatível com os compostos bioativos do

cravo. Uma vez selecionados os lipídeos, realizou-se um estudo preliminar avaliando o tipo de

tensoativo e carreador de secagem. Neste estudo também foi avaliada a forma de preparo das

nano e micropartículas a través de técnicas como a homogeneização por alta pressão e o

ultrassom e os métodos de secagem por spray drying e liofilização. Os sistemas particulados

foram caracterizados fisico-quimicamente quanto ao teor de eugenol, atividade antioxidante,

tamanho e morfologia de partícula, estado cristalino e fluidez entre outros. Os resultados

obtidos nesta etapa do trabalho encontram-se publicados no Journal of Food Engineering

(Cortés-Rojas, Souza, & Oliveira, 2014).


Baseado nos resultados do estudo preliminar, foi avaliado o efeito do equilíbrio

hidrofílico lipofílico do tensoativo (EHL) e da temperatura de secagem nas propriedades

físico-químicas das partículas. Posteriormente foi otimizada a proporção dos componentes da

formulação e uma vez otimizada a formulação lipídica e o processo de preparo foi realizada

uma comparação com uma formulação sem a adição de lipídeos quanto às propriedades

físico-químicas, estabilidade e estudo de permeação intestinal in vitro.


Figura 7. Fluxograma das etapas envolvidas no desenvolvimento deste projeto.

Caracterização do pó obtido dos

botões florais secos e moídos

Ensaios preliminares de

formulações lipídicas

Extração micelarExtrato hidroetanólico

concentrado

Screening

lipídeos

Seleção de lipídeos

promissores

Influência da composição

da formulação

Método de

homogeneização

Método de

secagem

LiofilizaçãoSpray drying

Caracterização dos

sistemas particulados

contendo extrato de cravo

Formulação com

extrato micelar

Validação método analítico

para quantificar eugenol

Estudo da influência da proporção dos

componentes na formulação

Estudo influencia EHL do tensoativo e da

temperatura de secagem

Influência do lipideo na formulação

Propriedades

físico-químicas

Estudo de

estabilidade

Permeação

intestinal in vitro

Cravo da India Artigo revisão

Método de

Extração

Artigo

Artigo

Spray drying

Caracterização dos

sistemas particulados

contendo extrato de cravo

Fim


4.3.1. Caracterização da matéria-prima vegetal

4.3.1.1. Tamanho de partícula da matéria-prima vegetal moída

A distribuição granulométrica da planta moída foi determinada pela técnica da

tamisação (Brasil, 2010). O material vegetal foi moído em moinho de facas MARCONI

modelo MA 680 (Piracicaba, SP), utilizando malha 20 (833 µm). Após a moagem e

homogeneização, uma amostra representativa do material vegetal foi retirada e submetida à

determinação da distribuição granulométrica, utilizando um jogo de tamises Bertel® com

aberturas de 355, 425, 500, 600, 710 e 850 µm e um agitador de peneiras Bertel®, durante 15

min com intensidade de vibração de 8.

4.3.1.2. Determinação do teor de extrativos

Amostras de 1 g de material vegetal em base seca foram aquecidas até a fervura com

100 mL de etanol 70 % (v/v) durante 10 min. As soluções obtidas foram filtradas em papel de

filtro, descartando os 20 mL iniciais. Alíquotas de 20 g do filtrado, exatamente pesadas, foram

colocadas em placas de Petri previamente taradas e acondicionadas em estufa a 105 °C até

massa constante (durante 24 horas) (Teixeira, 1996). O teor de extrativos foi calculado pela

média de três determinações, segundo a seguinte relação:

100

ap

dmTE (Equação 1)

Onde TE: teor de extrativos (% m/m), m: massa do resíduo seco (g), d: diluição da planta (g),

a: massa da alíquota colocada na placa de Petri, p: massa da droga (g).

4.3.1.3. Determinação da perda por dessecação

A perda por dessecação do material vegetal foi determinada pelo método gravimétrico.

Amostras de aproximadamente 2 g de material vegetal foram colocadas na balança de

umidade Sartorius MA35 (Goettingen, Alemanha) e aquecidas a 105 °C, até obtenção de

massa constante. Os resultados foram expressos em porcentagem, através da média de três

determinações.

4.3.2. Screening de lipídeos

Com o objetivo de selecionar o lipídeo mais apropriado para a preparação das

formulações, foi realizado um screening de lipídeos, segundo a metodologia descrita por

Nikolić et al. (2011), avaliando-se a compatibilidade de quantidades crescentes de óleo de


cravo com diferentes lipídeos (Xia et al., 2007). O ensaio foi realizado com óleo de cravo

devidos a os componentes majoritários do extrato do cravo (eugenol, acetato de eugenol)

estarem presentes em quantidades significativas no óleo essencial do cravo.

Foram avaliados a cera de abelhas, monoestearato de glicerila, ácido esteárico, cera de

carnaúba, apifil, compritol®

888 ATO, álcool estearílico e Gelucire 50/13. Os lipídeos foram

pesados e adicionados em tubo de ensaio com tampa. Em seguida, os tubos foram aquecidos

em banho Maria (Marconi MA-184, Piracicaba, Brasil) a 10 °C acima do ponto de fusão e

foram adicionadas concentrações de óleo de cravo de 20, 40 e 60 % em relação ao lipídeo,

agitados manualmente e resfriados a temperatura ambiente (25 °C) até solidificação. Uma vez

solidificados (após 1 h), foram observadas a homogeneidade, a formação de cristais e a

separação de fases. Uma pequena quantidade de amostra foi pressionada em papel de filtro (J.

Prolab, S. José dos Pinhais, PR, Brasil), observando a presença de manchas oleosas no papel

que indicassem a solubilização parcial dos componentes. A prova do papel de filtro foi

repetida após 30 dias do preparo das amostras, visando avaliar a estabilidade das misturas. O

ponto de fusão de cada mistura foi determinada utilizando o fusiômetro Q34OS15 (Quimis,

Brasil).

4.3.3. Validação do método analítico para a quantificação de eugenol e acetato de

eugenol

Visando a quantificação do eugenol e acetato de eugenol nos extratos e nas

formulações lipídicas, foi empregada a cromatografia líquida de alta eficiência em fase

reversa acoplada a um detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD), segundo o método

reportado por Yun et al. (2010).

Foi utilizado o cromatógrafo LC-20A Prominence Shimadzu com injetor automático,

bomba LC-6A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) e detector de arranjo de diodos (SPD-

M20A), coluna C18 (Shimadzu Shim-Pack CLC(M) 4,6mm x 25 cm, 5 µm), temperatura do

forno de 30 °C, vazão de 1 mL/min, volume de injeção de 20 µL e fase móvel isocrática

composta por metanol:água 60:40 (v/v).

Os padrões analíticos eugenol e acetato de eugenol foram adquiridos da Sigma-

Aldrich Brasil com pureza superior a 99,0 % e 98,0 %, respectivamente. A formulação 5

descrita na tabela 1 foi utilizada para realizar a validação. Os padrões e as amostras foram

exatamente pessadas em balança analítica Mettler Toledo AG204 dissolvidas na fase móvel,

metanol:água 60:40 (v/v) e filtradas utilizando membrana filtrante HV Millex em PVDF de

0,45 µm.


O método foi validado, segundo a guia para validação dos métodos analíticos e bioanalíticos

da resolução 899 de 29 de maio de 2003 (ANVISA, 2003). Os seguintes parâmetros foram

avaliados:

Seletividade: a seletividade avalia a presença de componentes que possam interferir

com a quantificação do composto de interesse. Uma forma de avaliar a seletividade é por

meio da pureza do pico utilizando o detetor de arranjo de diodos.

Linearidade: determinada pela construção de curvas analíticas em triplicata para cada

uma das concentrações e realizando a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados.

No caso do eugenol, foram analisadas concentrações de 20 a 280 µg/mL, e para o acetato de

eugenol concentrações de 10 a 200 µg/mL.

Precisão: foi determinada em formulações líquidas antes do processo de spray drying e

em amostras sólidas obtidas após a secagem em spray dryer. A repetibilidade de resultados

obtidos, por um mesmo analista em um curto período, foi avaliada pela determinação em 3

concentrações do padrão analítico: baixas, médias e altas do intervalo linear. Para o eugenol

foram avaliadas as concentrações de 80 µg/mL, 130 µg/mL e 200 µg/mL, e para o acetato de

eugenol de 2,5 µg/mL, 5,0 µg/mL e 10 µg/mL. A precisão intermediária foi avaliada

comparando a concordância de resultados com dois analistas diferentes em dias diferentes.

Exatidão: por definição a exatidão de um método analítico é a proximidade dos

resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. A recuperação de

amostras foi determinada pelo preparo de amostras fortificadas com quantidades conhecidas

de padrão analítico (eugenol e acetato de eugenol) em concentrações baixa, média e alta, tanto

nas amostras líquidas (antes de submeter ao spray drying) como nas amostras secas (após

secagem em spray drying). A exatidão foi calculada utilizando a Equação 2:

teoricaconc

teoricaconcobtidaconcExatidão

.

.. (Equação 2)

Robustez: este parâmetro avalia a capacidade do método de resistir a pequenas

variações das condições analíticas. Foram realizadas mudanças no preparo das amostras

quanto ao tempo de agitação de 15 e 60 min e a temperatura de preparo de 30 e 45 °C, tanto

para as amostras líquidas como para as amostras secas.


4.3.4. Extração dos compostos bioativos do cravo da Índia

4.3.4.1. Extração micelar

A extração micelar dos botões florais de Syzygium aromaticum foi realizada por

maceração dinâmica, utilizando agitação magnética em balões de fundo redondo imersos em

banho termostatizado (Marconi MA-184) a 50 °C, com o acoplamento do condensador para

evitar a perda de voláteis, como mostrado na Figura 8. Esta montagem foi utilizada para

evitar perdas de eugenol e acetato de eugenol por volatilização e também para poder controlar

a temperatura e velocidade de agitação. O tempo de extração foi de 40 min e a proporção

massa de planta/volume de solvente foi fixada em 1:20 (p/v). O solvente extrator foi

composto por mistura de tensoativos hidrofílicos e lipofílicos visando alcançar o EHL

desejado. A solução extrativa obtida foi filtrada, utilizando papel filtro de 80 g/m2, 14 µm de

tamanho de poro (J. Prolab, S. José dos Pinhais, PR, Brasil), com o auxílio de um funil de

Buchner conectado à bomba de vácuo (Prismatec, modelo 131, São Paulo, Brasil) a 500

mmHg. Os extratos filtrados foram colocados em balões volumétricos, completando o volume

(50 mL) com o mesmo solvente.

Figura 8. Montagem do sistema utilizado para a extração micelar.

Para o estudo da influência do EHL na extração do eugenol e acetato de eugenol, foi

utilizada uma concentração de tensoativo de 5 % (p/p). Para obter o EHL desejado foram

misturados o tensoativo hidrofílico (Tween 80 EHL 15) e o lipofílico (Span 80, EHL 4,3),

utilizando as Equações 3 e 4:

EHLreq= (EHLA)*(% A) + (EHLB) % B (Equação 3)

100% = % A + % B (Equação 4)


Estruturas químicas diferentes podem levar a resultados diferentes, mesmo que usando

o mesmo EHL. Visando avaliar a influência de outros tipos de tensoativos, foram analisados

outros tensoativos como o Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Triton X-100, Poloxamer 188 e

polisorbato 80. Também foram avaliadas concentrações de tensoativo de 2; 5 e 10 % (p/p).

O pH é outra variável de grande importância na extração, pois está relacionado com o

grau de ionização dos compostos presentes no extrato. O tween 80 foi selecionado para

estudar a influência do pH, pois mostrou ser mais eficiente na extração do eugenol e acetato

de eugenol do que os outros tensoativos avaliados. Foi realizada uma extração com tween 80

à 5 % (p/p) em pH 2 (acidificado com uma solução de HCl 0,1 N) e outra com Tween 80 à 5

% (p/p) em pH 12 (basificado com solução de NaOH 0,1 N). Ambas as extrações foram

comparadas com o extrato de Tween 80 à 5 % (p/p) em pH 4,7.

Os extratos foram caracterizados quanto ao teor de eugenol e acetato de eugenol,

atividade antioxidante, determinada pelo método de ABTS e teor de polifenóis totais.

O extrato obtido com poloxamer 188 foi submetido ao processo de spray drying

utilizando goma arábica como material de parede. As condições de secagem utilizadas foram:

temperaturas de ar de entrada (Tge) de 90 °C, vazão do ar de secagem (Wg) de 60 m3/h, vazão

de alimentação (Ws) de 4 g/min, pressão de atomização de 2 kgf/cm2, vazão do ar de

atomização (Watm) de 15 L/min e diâmetro do bico atomizador de 1 mm. As amostras foram

caracterizadas quanto à retenção de eugenol e atividade antioxidante.

4.3.4.2. Extração hidroetanolica

O extrato de cravo foi preparado por maceração dinâmica, utilizando botões florais de

S. aromaticum secos e moídos. Foram utilizados extratores de vidro acoplados a um banho

termostatizado (Marconi MA-184, Piracicaba, Brasil) com temperatura fixada em 50 °C.

Utilizou-se como solvente extrator etanol 70 % (v/v) e uma relação massa de planta: volume

de solvente de 1:10 (p/v). A extração foi realizada durante 30 min e posteriormente o extrato

foi filtrado através de papel de filtro de 80 g/m2 e 14 µm de tamanho de poro (Prolab, S. José

dos Pinhais, PR, Brasil), utilizando um funil de Buchner conectado a uma bomba de vácuo

(Prismatec, modelo 131, São Paulo, Brasil) a uma pressão de 500 mmHg. A solução extrativa

foi concentrada em evaporador rotativo a uma pressão de 600 mmHg e temperatura de 55 °C.

O extrato concentrado apresentou um teor de sólidos de 7,75 ± 0,46 % determinado pelo

método gravimétrico em uma balança de umidade (Sartorius MA35 Goettingen, Germany).


4.3.5. Métodos utilizados para a caracterização físico-química das partículas lipídicas

em fase líquida ou sólida

4.3.5.1. Determinação da perda por dessecação

A perda por dessecação dos sistemas particulados material vegetal foi determinada

pelo método gravimétrico. Amostras de 2 g foram colocadas na balança de umidade Sartorius

MA35 (Goettingen, Alemanha) e aquecidas a 105 °C, até obtenção de massa constante. Os

resultados foram expressos em porcentagem, através da média de três determinações.

4.3.5.2. Atividade de água

Este parâmetro está relacionada com a umidade relativa de equilíbrio da amostra e

permite determinar a quantidade de água livre disponível para o crescimento microbiano e

outras reações de degradação. A atividade de água foi determinada em triplicata em medidor

de atividade de água Água Lab 4Tev® (Decagon devices, Pullman, WA, USA) utilizando o

sensor de capacitância.

4.3.5.3. Tamanho de partícula

Microscopia óptica acoplada à análise de imagens foi empregada na determinação da

distribuição de tamanhos das composições líquidas e secas. Uma quantidade suficiente de

formulação líquida ou de pó foi dispersa em uma lâmina de vidro e observada no microscópio

óptico (Olympus BX60MIV). Imagens de diferentes regiões da lâmina foram capturadas com

aumento de 50 vezes e determinado o diâmetro médio das partículas com a ajuda do software

de análise de imagens Image Pro-plus® 7.0 (2009). O procedimento foi repetido até ter uma

contágem de no mínimo 1000 partículas, que garante a reprodutibilidade do método. Os

resultados foram processados para calcular a distribuição granulométrica do pó e o tamanho

médio de partícula.

O tamanho de partícula dos pós obtidos a partir dos ensaios preliminares de

formulação foi determinado pelo método de difração da luz (Light scattering), utilizando o

equipamento Beckman Coulter LS 13 320 (Brea, CA, EUA) acoplado ao modulo líquido

universal com capacidade para analisar partículas na faixa de 0,017 a 2000 µm. As amostras

foram preparadas, dissolvendo aproximadamente 40 mg de pó em etanol absoluto filtrado por

membrana de 0,45 µm. O valor Span utilizado como indicativo da distribuição granulométrica

foi calculado segundo a Equação (5).


50

1090

d

ddspan

(Equação 5)

4.3.5.4. Morfologia das partículas

A morfologia dos sistemas particulados foi analisada pela técnica de microscopia

eletrônica de varredura por emissão de campo (MEV-FEG). Uma pequena quantidade de pó

foi colocada em suportes metálicos cobertos com fita adesiva de carbono de dupla face. As

amostras foram cobertas com um fino filme de ouro e analisada no microscópio eletrônico de

varredura Inspect F-50 (FEI, Nederland) a 5 kV.

4.3.5.5. Microscopía confocal de varredura a laser

Esta técnica foi utilizada para a visualização da distribuição da fase lipídica e a fase

aquosa na formulação lipídica otimizada na sua forma líquida, sólida e redispersa. As

condições e os corantes foram selecionados baseado em estudos previamente reportados na

literatura (Salvia-Trujillo, Qian, Martín-Belloso, & McClements, 2013; Wooster et al., 2014) .

As observações foram realizadas no microscópio confocal Leica TCS SP5 (Leica

Microsystems Inc., Heidelberg, Germany), pinhole 67,9 µm. O corante vermelho do nilo foi

utilizado para a marcação da fase lipídica em comprimento de onda de exitação de 488nm e

de emisão na faixa de 500 a 545 nm. O corante isotiocianto de fluoresceína (FITC) foi

utilizado como marcador da fase hidrofílica com comprimento de onda de exitação de 514 e

faixa de emisão de 620 a 700 nm.

Soluções de cada corante foram prepradas na concentração de 1 mg/mL em propileno

glicol no caso do vermelho do nilo e em DMSO para o FITC. A solução de FITC foi

adicionada na goma arábica hidratada e com pH ajustado em 11,0 em concentração de 42 µg

de FITC por cada grama de goma arábica, a mistura foi agitada magnéticamente por 1h a 40

°C segundo o procedimento descrito por Lamprecht, Schäfer e Lehr, (2000). Por outro lado, a

solução do corante lipofílico foi adicionada na fase lipídica fundida em concentração de 500

µg/g, e se deu continuidade à preparação da formulação segundo o procedimento descrito no

item 4.3.9 utilizando a goma arábica previamente corada com a solução de FITC.

Posteriormente a formulação foi seca em spray dryer.

Amostras da formulação líquida e seca foram colocadas em lâminas, cobertas com

lamínulas e fixadas com esmalte no contorno. No caso do produto sólido as partículas foram

dispersas em água ou alcóol isopropílico.


4.3.5.6. Propriedades de fluidez dos sistemas particulados

O fator Hausner (FH) e índice de compressibilidade, também denominado índice de

Carr (IC), foram utilizados como propriedades de fluidez. Esses parâmetros são determinados

com base em medidas de densidade aparente e compactada dos pós, segundo as equações 6 e

7, respectivamente. A densidade aparente e compactada foi determinada, utilizando o

equipamento Caleva® (Tapped Density Tester, TDT - Frankfurt, Alemanha), de acordo com o

método descrito na farmacopeia americana (USP 29-NF 24, 2007).

0

1250

d

dFH

(Equação 6)

1001250

01250 xd

ddIC

(Equação 7)

onde, d0 é a densidade aparente, calculada a partir do volume ocupado por um grama

de pó em uma proveta de 10 mL. d1250 é a densidade compactada resultado da divisão da

massa adicionada (1 g) pelo volume da massa ocupada na proveta depois de 1250 quedas da

proveta de uma distância de 14,00 mm.

4.3.5.7. Dispersibilidade do produto seco em água

Foi determinada segundo o método reportado por Cano-Chauca et al. (2005), com

algumas modificações. Inicialmente, 100 mg do pó foram pesados e transferidos para um

béquer, onde foram adicionados 10 mL de água e a mistura mantida sob agitação magnética a

900 rpm por 10 minutos (Mag-multi, Marte, Brasil) à temperatura de 25 °C. As amostras

foram centrifugadas (Fanem Mod. 206, São Paulo, Brasil) a 1301 x g por 5 min e o

sobrenadante foi colocado em placas de Petri, previamente taradas, utilizando uma estufa a

105 °C por 5 h (ensaios realizados em triplicata) para a determinação do resíduo sólido. Este

procedimento permite saber a quantidade de material que foi solubilizado, sendo os resultados

expressos em porcentagem (m/m).

4.3.5.8. Potencial zeta

O potencial zeta utilizado para medir a carga superficial das partículas foi determinado

no equipamento Malvern Nano ZS, diluindo 60 µL da amostra em 1 mL de água.


4.3.5.9. Difração de raios-X

Com o objetivo de determinar o estado cristalino ou amorfo do produto obtido foi

realizado análise de difração de raios-X. As amostras pulverulentas foram colocadas no

suporte específico do equipamento e a superfície fechada por uma lâmina de vidro. As

medidas foram obtidas em difractômetro de raios-X marca Rigaku Rotaflex, modelo RU-

200B, com câmara de difração multi-propósito em radiação de CuKa com comprimento de

onda de 1,542 Å, voltagem de 50 kV e corrente de 100 mA. As amostras foram examinadas

em ângulos de 10 a 40° em 2, com incremento de 0,02° (1,2°/min)

4.3.5.10. Calorimetria exploratório diferencial (DSC)

Para a obtenção dos termogramas, 3 mg de amostras foram colocadas em cadinhos de

alumínio hermeticamente fechados e aquecidos a uma taxa de 10 °C/min até 200 °C sob

atmosfera de nitrogênio. Foi utilizado o equipamento Perkin-Elmer 4000 calibrado com Indio.

Um cadinho vazio foi utilizado como referencia.

4.3.5.11. Quantificação do eugenol por HPLC

A técnica de HPLC-DAD em fase reversa foi utilizada para a quantificação de eugenol

nas amostras líquidas, sólidas e as amostras do estudo de permeação intestinal in vitro. As

condições cromatográficas utilizadas foram selecionadas baseado em um método previamente

validado no laboratório. As análises foram realizadas no cromatógrafo Prominence Shimadzu

serie LC-20A, temperatura do forno de 30 °C, vazão de 1 mL/min, volume de injeção de 20

µL e fase móvel isocrática composta por metanol:água 60:40 (v/v). A quantificação foi

realizado no comprimento de onda de 280 nm. As amostras foram diluídas em metanol 60%

(v/v) agitadas magneticamente por 15 min a 45 °C e posteriormente centrifugadas a 3500 rpm

por 5 min. O sobrenadante foi filtrado em membrana de 0,45 µm e 20 µL foram injetados no

cromatógrafo. Curvas analíticas de eugenol foram elaboradas pela diluição de concentrações

conhecidas do padrão em fase móvel.

4.3.5.12. Quantificação de polifenóis totais

A metodologia para a dosagem dos polifenóis totais baseia-se no método de Folin-

Denis (Folin & Denis, 1912), que consiste na redução do ácido fosfomolíbdico-fosfotúngico

pelos compostos fenólicos, em meio básico, produzindo uma coloração azul intensa que é

medida por espectrofotometria em comprimento de onda de 750 nm, com um tempo de reação

de 2 minutos (Souza, Ramos, Cortes-Rojas, & Oliveira, 2013). Cada ensaio foi realizado em


triplicata e os resultados foram expressos como equivalentes de ácido gálico por grama de

extrato, utilizando a curva analítica.

4.3.5.13. Atividade antioxidante pelo método ABTS

A atividade antioxidante foi determinada pelo método do ABTS, descrito por Re et al.

(1999). O cátion radical ABTS foi gerado pela reação de 5 mL de uma solução 7 Mm (192

mg/50 mL) de ABTS e 88 µL de uma solução 140 mM (378,4 mg/10 mL) de persulfato de

potássio, a temperatura ambiente, durante 16 horas em ambiente escuro. A solução de ABTS

foi diluída com etanol absoluto até uma absorbância de 0,700 ± 0,020, medida a 734 nm. As

soluções extrativas foram diluídas em concentrações pre-definidas com etanol absoluto e

transferidas para tubos de ensaio com 3,0 mL da solução de ABTS•+ (Rufino et al., 2010). No

caso dos sistemas particulados as amostras foram dissolvidas em metanol 60% (v/v). A

absorvância da reação foi determinada a 734 nm após 6 min, usando o espectrofotômetro UV-

Vis HP 8453 com auxilio do software HP Chem-Station (três diluições diferentes das

amostras, analisadas em triplicata). Construiu-se uma curva analítica com Trolox a partir de

soluções, com concentrações de 0 a 2000 µM. Como branco, utilizou-se o etanol absoluto. A

porcentagem de inibição da absorbância a 734 nm foi calculada e ajustada em função da

concentração de Trolox por regressão linear. A absorbância da solução oxidada resultante foi

comparada com as soluções do padrão. Os resultados foram expressos em termos de

equivalentes de trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity).

4.3.6 Ensaios preliminares de formulação

4.3.6.1. Influência do tipo de tensoativo, lipídeo e carreador de secagem nas

propriedades físico-químicas das partículas

Com o objetivo de avaliar a influência da composição da formulação lipídica contendo

o extrato concentrado de cravo, selecionaram-se dois lipídeos sólidos (ácido esteárico e

compritol 888ATO), dois tensoativos (poloxamer 188 e polisorbato 80) e três carreadores de

secagem (goma arábica, maltodextrina DE10 e lactose). Avaliou-se a retenção dos marcadores

eugenol e acetato de eugenol nos sistemas microparticulados obtidos por spray drying.

As formulações foram preparadas pelo método de sonicação, segundo as composições

descritas na Tabela 1. O lipídeo sólido foi pesado em um béquer, aquecido em banho Maria

10 °C acima do ponto de fusão e posteriormente foi adicionado o lipídeo líquido (óleo de

buriti). O tensoativo foi dissolvido em água e misturado com o extrato de cravo

(concentrado), formando assim a fase aquosa a qual foi aquecida na mesma temperatura que a


fase oleosa. Em seguida a fase aquosa foi dispersa sobre a fase oleosa com a ajuda de um

homogeneizador de alta velocidade (UltraTurrax T18, IKA-Wilmington, NC, USA) a 18000

rpm/min, obtendo-se a pré-emulsão, que foi submetida ao processador ultrassônico Vibracell

VC750 (SONICS, Newtown, USA) com sonda de 13 mm a 20 kHz e intensidade de 70 %

durante 3 min. O carreador de secagem foi adicionado após o preparo da emulsão, sendo que

o teor de sólidos das composições foi padronizado em 33 % (p/p). Estas formulações foram

submetidas à secagem por spray dryer (LabPlant SD05) em Tge de 90 °C, Wg de 60 m3/h, Ws

de 4 g/min, pressão de atomização de 2 kgf/cm2, Watm de 15 L/min e diâmetro do bico

atomizador de 1 mm.

Tabela 1. Composição das formulações elaboradas nos ensaios preliminares (p/p).

Componente Função Formulação

F1 F2 F3 F4 F5

Extrato cravo Fonte de antioxidante 63 63 63 63 63

Gliceril dibehenato* Lipídeo sólido 8,1 8,1 8,1 - 8,1

Acido esteárico Lipídeo sólido - - - 8,1 -

Óleo buriti Lipídeo líquido 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Polisorbato 80 Tensoativo 0,9 0,9 0,9 0,9 -

Poloxamer 188** Tensoativo - - - - 0,9

Lactose Carreador de secagem - 18 - - -

Maltodextrina Carreador de secagem 18 - 9 18 18

Goma arábica Carreador de secagem - - 9 - -

Água Diluente 9 9 9 9 9

* Compritol 888ATO, ** Kolliphor P 188 micro (BASF, Brasil)

4.3.6.2. Influência do método de homogeneização na retenção de eugenol nas

formulações sólidas

O efeito do método de homogeneização na retenção do eugenol nas formulações

sólidas foi investigado em duas etapas. Na primeira etapa, selecionou-se a formulação com

maior retenção de eugenol dos ensaios preliminares de formulação (F5). Esta formulação foi

homogeneizada por três diferentes processos:

Método 1: homogeneização em UltraTurrax (T18, IKA-Wilmington, NC, USA)

18000 rpm/min por 5 min;


Método 2: homogeneização em UltraTurrax (T18, IKA-Wilmington, NC, USA)

18000 rpm/min, seguida de homogeneização com processador ultrassônico VC750

Vibracell com sonda de 13mm a 20kHz, 70 % de intensidade por um tempo de 3 min;

Método 3: homogeneização em UltraTurrax (T18 IKA-Wilmington, NC, USA) 18000

rpm/min durante 5 min, seguida de homogeneização de alta pressão realizada no

Panda Plus (GEA Niro Soavi, Parma, Itália), aplicando três ciclos de 500 bar de

pressão.

As formulações foram secas por dois métodos: spray drying e liofilização.

Na secagem em spray drying, as condições utilizadas foram Tge de 90 °C, Wg de 60

m3/h, Ws de 4 g/min, pressão de atomização de 2 kgf/cm

2, Watm de 15 L/min e diâmetro do

bico atomizador de 1 mm.

A liofilização foi realizada no liofilizador Thermo Fisher Scientific modelo SNL108B.

As amostras foram acondicionadas em tubos Falcon, congeladas a -20 °C por 12 h, tomando-

se o cuidado de formar uma fina camada ao redor do tubo, e posteriormente levadas ao freezer

-80 °C por 4 h. O processo de desidratação das amostras teve duração de 24 a 48 horas.

As partículas sólidas foram caracterizadas quanto ao teor de eugenol e acetato de

eugenol antes e depois do processo de secagem, atividade antioxidante, tamanho e morfologia

das partículas, teor de umidade e atividade de água.

4.3.7. Influência do EHL do tensoativo e da temperatura de secagem

Com o objetivo de avaliar a influência do EHL do tensoativo na retenção dos

princípios ativos e nas propriedades físico-químicas das partículas sólidas, foram preparadas

formulações, contendo compritol® 888ATO, óleo de buriti, maltodextrina DE10 e extrato

concentrado de cravo. Como tensoativos foram utilizados Gelucire 50/2 (EHL de 2), Gelucire

50/13 (EHL de 13) e poloxamer 188 (EHL de 29), puros e em misturas, gerando sete

composições (EHL na faixa 2 a 29), segundo a Tabela 2. O lipídeo sólido (gliceril dibehenato)

foi pesado em um béquer e fundido a 10 °C acima do ponto de fusão, utilizando banho Maria,

e posteriormente foram adicionados o lipídeo líquido (óleo de buriti) e os tensoativos. A fase

aquosa é constituída pela maltodextrina DE10 dissolvida em água e o extrato concentrado de

cravo, que foram aquecidos em banho Maria na mesma temperatura que a fase oleosa. A fase

aquosa foi então dispersa sobre a fase oleosa com ajuda de um homogeneizador de alta

velocidade (UltraTurrax T18, IKA-Wilmington, NC, USA) a 18000 rpm/min durante 5 min,

obtendo-se a emulsão primária que foi submetida ao processador ultrassônico Vibracell


modelo VC750 a 20 kHz com sonda de 13 mm a uma intensidade de 70 % durante 3 min

(SONICS Vibracell, Newtown, USA).

Tabela 2. Composição das formulações elaboradas para a avaliação da influência do EHL do

tensoativo (% p/p).

EHL

0*

EHL

2

EHL

7,5

EHL

13

EHL

18

EHL

23

EHL

29

Ext. Conc. de cravo 53,8 53,3 53,3 53,4 53,4 53,4 53,4

Compritol®

888ATO 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9

Óleo de Buriti 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

Poloxamer 188 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,5 0,8

Gelucire 50/13 0,0 0,0 0,4 0,8 0,5 0,3 0,0

Gelucire 50/2 0,0 0,8 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0

Maltodextrina DE 10 15,4 15,3 15,3 15,2 15,3 15,3 15,3

Água 23,2 22,9 22,9 22,9 22,9 22,9 22,9

* EHL 0 faz referencia à formulação preparada sem tensoativo

Estas formulações foram submetidas à secagem em spray dryer (LabPlant SD05) com

Tge de 90 e 140 °C, Wg de 60 m3/h, Ws de 4 g/min, pressão de atomização de 2 kgf/cm

2, Watm

de 15 L/min e diâmetro do bico atomizador de 1 mm. Essas condições foram selecionadas a

partir de estudos anteriores realizados por (Cortés-Rojas & Oliveira, 2012).

As partículas foram caracterizadas quanto ao teor de eugenol e acetato de eugenol,

perda por dessecação e atividade de água, tamanho e morfologia de partícula.

4.3.8. Influência da proporção dos componentes na formulação

Para esta etapa do projeto selecionou-se uma formulação baseado nos resultados

obtidos previamente. Investigou-se a influência da quantidade relativa de fase lipídica relativa

à quantidade de tensoativo e a proporção goma arábica:maltodextrina DE10 (Tabela 3).

Foram preparadas sete formulações conforme apresentado na Tabela 4. As formulações

líquidas obtidas foram caracterizadas quanto à estabilidade física por centrifugação, tamanho

de partícula por microscopia ótica e comportamento reológico. Posteriormente foram

selecionadas as formulações mais estáveis (duas) que foram submetidas a spray drying

avaliando-se a retenção eugenol por HPLC.


Tabela 3. Proporções de fase lipídica, tensoativo e razão maltodextrina DE10:Goma arábica

(MD:GA) nas sete formulações preparadas para o estudo da influência da proporção dos

componentes na formulação.

Formulação Fase

lipídica Tensoativo (MD:GA)*

P1 3,5 4,0 0:1

P2 4,0 3,5 0:1

P3 5,5 5,5 1:3

P4 3,5 5,5 1:3

P5 7,5 3,5 1:3

P6 7,0 7,5 1:1

P7 7,5 7,0 1:1

* com respeito ao total do carreador de secagem

Tabela 4. Composição das formulações preparadas para o estudo da influência da proporção

de fase lipídica, tensoativo e razão maltodextrina:goma arábica (% p/p).

Form Compritol Oleo

buriti

Gelucire

50/13

Ext. conc.

inferior

Ext. conc.

superior

Maltodex.

DE10

Goma

Arabica

P1 3,0 0,5 4,0 14,0 40,0 0 14

P2 3,5 0,5 3,5 14,0 40,0 0 14

P3 4,8 0,7 5,5 14,0 40,0 3,5 10,5

P4 3,0 0,5 5,5 14,0 40,0 3,5 10,5

P5 6,5 1,0 3,5 14,0 40,0 3,5 10,5

P6 6,1 0,9 7,5 14,0 40,0 7,0 7,0

P7 6,5 1,0 7,0 14,0 40,0 7,0 7,0

4.3.8.1.Teste de centrifugação

O teste de centrifugação foi realizado colocando 2 g de formulação em tubo eppendorf

de 2 mL e centrigufando a 3000 x g por 15 min (centrífuga Eppendorff 5430R, Alemanha).

Após este processo as formulações foram avaliadas visualmente quanto a separação de fases

ou outros sinais de instabilidade.


4.3.8.2. Determinação de tamanho de partícula por microscopía ótica

Uma quantidade de 50 µL da formulação líquida foi dispersa em uma lâmina de vidro,

coberta com a lamínula e observada no microscópio ótico (Olympus BX60MIV). Imagens de

diferentes regiões da lâmina foram capturadas com aumento de 100 vezes e determinado o

diâmetro médio das partículas com a ajuda do software de análise de imagens Image Pro-

plus® 7.0 (2009). O procedimento foi repetido até ter uma contágem de no mínimo 1000

partículas, que garante a reprodutibilidade do método.

4.3.8.3. Estudo da reologia das formulações

O estudo de reologia foi determinado em reômetro AR-2000EX (TA Instruments,

Delaware, USA) com geometria de placas paralelas de 40 mm de diâmetro, utilizando um

espaço entre placas de 400 µm. A temperatura das amostras foi controlada utilizando um

Peltier na placa e um sistema para evitar a evaporação de solvente fornecido pelo fabricante

do equipamento. As amostras foram analisadas em duplicata utilizando uma nova amostra

para cada leitura. A medida da tensão de cisalhamento foi realizada utilizando a sequencia de

taxa de cisalhamento: ascendente-descendente-ascendente (Steffe, 1996).

4.3.8.4. Secagem por spray dryer

As duas formulações mais estáveis foram submetidas à secagem em spray dryer

(LabPlant SD05) utilizando Tge de 90 °C, Wg de 60 m3/h, Ws de 4 g/min, pressão de

atomização de 2 kgf/cm2, Watm de 15 L/min e diâmetro do bico atomizador de 1 mm.

4.3.9. Influencia do lipídeo na formulação

Baseado nos resultados da etapa anterior foi selecionada uma formulação e foi

analisado a influência de cada um dos componentes nas propriedades físico-químicas,

estabilidade e permeação in vitro.

As formulações foram preparadas pelo método de sonicação, segundo as composições

descritas na Tabela 5. O lipídeo sólido foi pesado em um béquer e fundido a 70 °C, utilizando

um banho Maria. Posteriormente foi adicionado o lipídeo líquido (óleo de buriti) e a fase

insolúvel em água do extrato de cravo. O tensoativo foi dissolvido em água e misturado com a

fase solúvel em água do extrato de cravo (concentrado), formando assim a fase aquosa a qual

foi aquecida na mesma temperatura que a fase oleosa. Em seguida, a fase aquosa foi vertida

sobre a fase lipídica e homogeneizada com auxílio de um homogeneizador de alta velocidade

(UltraTurrax T18, IKA-Wilmington, NC, USA) a 18000 rpm/min por 5 min, obtendo-se uma


pré-emulsão, que foi submetida ao processador ultrassônico Vibracell VC750 (SONICS,

Newtown, USA) com sonda de 13 mm a 20 kHz, intensidade de 70 % durante 3 min. O

carreador de secagem dissolvido em água foi adicionado após o preparo da emulsão.

4.3.9.1. Secagem em spray dryer

As duas formulações selecionadas foram submetidas à secagem por spray dryer

(LabPlant SD05) em Tge de 90 °C, Wg de 60 m3/h, Ws de 4 g/min, pressão de atomização de 2

kgf/cm2, Watm de 15 L/min e diâmetro do bico atomizador de 1 mm.

Tabela 5. Composição das formulações utilizadas na avaliação da influência do lipídeo e dos

componentes da formulação (% p/p).

Componentes CSD1 CSD2 CSD3 CSD4 CSD5

Compritol 888 ATO 3,5 0,0 3,5 3,5 0,0

Óleo de buriti (Mauritia flexousa) 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0

Gelucire 50/13 3,5 3,5 0,0 3,5 0,0

Extrato de cravo Fase superior 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0

Fase inferior 14,0 14,0 14,0 14,0 14,0

Goma arábica 14,0 14,0 14,0 14,0 14,0

*água: q.s.p. 100 g

4.3.10. Estudo de estabilidade

A partir dos resultados das propriedades físico-químicas, duas formulações foram

selecionadas para o estudo de estabilidade e para o estudo de permeação intestinal in vitro. A

formulação lipídica do extrato (CSD4) e a formulação sem adição de lipídeos (CSD5). O

ensaio foi realizado em quatro condições de armazenamento a temperaturas de 25 e 40 °C e

umidades relativas de 32,4 e 63,5 %. Para o controle da temperatura foram utilizadas as

câmaras climáticas Nova ética B.O.D. 411D e Nova ética 420E 420E (Vargem Grande

Paulista, Brasil). A umidade relativa desejada foi atingida colocando-se as amostras em

dessecadores fechados contendo solução saturada de MgCl2ˑ6H2O para se obter a umidade

relativa de 32,4 e NaNO2 para a umidade relativa de 63,5 %. Amostras de 500 mg do produto

seco foram exatamente pesadas e colocadas em frascos de vidro (2 cm de diâmetro por 4 cm

de altura) e colocadas nos desecadores. As amostras foram removidas a cada sete dias durante

um período de 49 dias. Em cada tempo de amostragem se determinou o peso do frasco com a

amostra (Balança Mettler Toledo AG204, Suíça), o teor de eugenol determinado por HPLC e

o teor de umidade determinado por Karl Fischer (870 Titrino Plus Methrom, Herisau, Suíça)


utilizando 100 mg de amostra sólida. Os resultados da variação de eugenol com respeito ao

tempo foram ajustados a um modelo de ordem zero segundo a equação 8.

KtCC 0 (equação 8)

Onde C0 é a concentração inicial de eugenol, C é a concentração ao tempo t e k é a constante

de reação do ordem zero.

4.3.11. Cultura de células e experimentos de permeação utilizando células CaCo-2

Esta etapa do projeto foi realizada na Universidade da Florida sob a orientação do Pr.

Dr. Guenther Hochhaus (Projeto FAPESP BEPE 2014/01898-3).

O experimento foi realizado segundo o procedimento descrito por de Angelis e Turco

(2011). As células CaCo-2 ATCC, cat. no. HTB-37 foram cultivadas a 37 °C em atmosfera de

CO2 5% utilizando DMEM contendo 1 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio, 10%

(v/v) de soro fetal bovino inativado termicamente, 1% de solução de penicilina-estreptomicina

1%.

O ensaio do MTT foi utilizado para determinar a faixa de concentração não toxica para

as células tratadas com diferentes concentrações de eugenol. Algumas modificações foram

realizadas ao método seguindo o procedimento proposto por Bruggisser et al. (2002), de

forma à evitar interferências de fatores extracelulares como o poder redutor intrínseco de

compostos naturais. As células CaCo-2 mantidas em DMEM foram semeadas em placas de 24

poços com densidade de 1 x 105 células/poço. Após 24 horas de incubação, 500 µL de meio

foram removidos e substituídos por 500 µL de soluções com diferentes concentrações de

eugenol. Após 3h de incubação a 37 ˚C e atmosfera de CO2 à 5 % o sobrenadante (DMEM e

amostra) foi removido e as células foram lavadas com HBSS duas vezes.

Para determinar a permeação do eugenol através das células foi realizado o

experimento de transporte utilizando sistemas TranswellTM

(Figura 9) de 12 poços com

membrana de poliester, tamanho de poro de 0,4 µm. As células foram semeadas com

densidade de 1 x 105 células/poço no compartimento apical e cultivadas por 21 dias. O meio

foi trocado a cada dois dias. No dia do experimento a qualidade das monocamadas de células

foi determinada medindo a resistência elétrica transepitelial (TEER) a 37 °C usando o

Voltmeter EVOM (World Precision Instruments, INC., Sarasota, FL). Somente monocamadas

de células apresentando valores de TEER maiores do que 350 Ω foram utilizadas.


Figura 9. Esquema de sistema Transwell com cultura de células Caco-2 (www. corning.com)

Antes de adicionar as formulações para ensaio, as células foram lavadas com HBSS.

Posteriormente, 0,5 mL de meio de transporte 7,4 (HBSS contendo 0,01 M de HEPES) foram

adicionados no compartimento apical e 1,2 mL de meio de transporte pH 6,0 (HBSS contendo

0,01 M de MES) foram adicionados no compartimento baso-lateral. As células foram

incubadas por 30 min a 37 °C e atmosfera de CO2 a 5 %. No final do período de incubação a

TEER foi medida novamente. O tampão no compartimento apical foi removido

cuidadosamente e substituído por a solução da amostra dissolvida em tampão 7,4. Alíquotas

de 100 μL foram removidas do compartimento baso-lateral após 30, 60, 90 e 120 min. A

concentração de eugenol nestas amostras foi determinada por HPLC-DAD. O coeficiente de

permeabilidade (Papp) foi calculado segundo a equação 9 (Tavelin et al., 2002).

CoA

xdt

dQPapp

1 (equação 9)

Onde dQ/dt (taxa de transporte) é a taxa de eugenol (μg) por unidade de tempo (s)

permeada e detectada no compartimento receptor, Co é a concentração inicial no

compartimento doador (μg/ml) e A é a área superficial da membrana do sistema Transwell

(A=1,12 cm2). Cada amostra foi analisada em triplicata.

Compartimento

basolateral

Membrana

semipermeável

Microvilosidades

Fármaco ou composto

de interesse

Monocamada

de células

Caco-2

Compartimento

apical

Junções

intercelulares

Membrana semipermeável

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados e discussão 68

5. Resultados e discussão

Neste item são apresentadas e discutidas todos os resultados experimentais obtidos

durante o desenvolvimento do trabalho.

5.1 Caracterização da matéria-prima vegetal

O material vegetal empregado para o desenvolvimento deste trabalho (botões florais de

cravo da Índia) foi caracterizado quanto à distribuição granulomética, a perda por dessecação

e o teor de extrativos. Os resultados obtidos serão apresentados a seguir.

5.1.1. Distribuição granulométrica do material vegetal moído

Após a moagem dos botões florais secos de Syzygium aromaticum, o material

pulverizado foi submetido a separação por tamisação. A partir das frações retidas em cada

peneira, determinou-se a distribuição granulométrica do material vegetal (Figura 10). A

operação de moagem é importante, pois aumenta a área superficial e facilita a extração dos

compostos presentes na matéria-prima vegetal, porém, pós muito finos podem apresentar

problemas de molhabilidade. ). O tamanho médio de partícula obtido foi de 645,52 ± 0,35 µm.

Segundo a (Farmacopeia Brasileira, 2010), o pó obtido é classificado como moderadamente

grosso.

Figura 10. Distribuição granulométrica do pó obtido dos botões florais moídos de Syzygium

aromaticum obtida por tamisação e expressa como porcentagem acumulada.

5.1.2. Perda por dessecação

A perda por dessecação é um indicativo do teor de umidade e de compostos voláteis

presentes no material vegetal. Este parâmetro é de grande importância por estar relacionado


com a estabilidade do produto. Teores elevados de água propiciam o crescimento microbiano,

hidrólise e consequente deterioração de constituintes do material vegetal (Farmacopeia

Brasileira, 2010). Elevados teores de perda por dessecação foram obtidos (27,98 ± 0,28 %) o

que está relacionado ao altor teor de compostos voláteis presentes em esta planta. O teor de

óleo essencial em botões florais de S. aromaticum varia de 15 a 19 % (base seca) (Jirovetz et

al., 2006; Prado, Prado, & Meireles, 2011).

5.1.3. Teor de extrativos

O teor de extrativos é um indicativo da eficiência da extração em função do solvente

extrator utilizado. O etanol 70 % (v/v) é um dos solventes mais utilizados por penetrar

facilmente nas células, promovendo, assim, a extração dos princípios ativos de interesse. Os

resultados obtidos quanto ao teor de extrativos em etanol 70 % (v/v) foi 34,96 ± 1,42 %.

5.2. Screening de lipídeos

A eficiência de encapsulação está diretamente relacionada com a compatibilidade do

princípio ativo com o lipídeo selecionado para compor a formulação (Nikolić et al., 2011). O

screening de lipídeos foi realizado com o óleo essencial de Syzygium aromaticum, que possui

caráter apolar o qual é necessário para realizar as respectivas misturas com os lipídeos a serem

avaliados. Nesse óleo são encontradas concentrações de eugenol de 89 % (Jirovetz et al.,

2006), sendo que este é o principal composto ativo encontrado no extrato de cravo e que será

monitorado no processo de encapsulação. Desta forma, é importante selecionar lipídeos que

apresentem solubilidade ou miscibilidade adequada com o eugenol e demais compostos

bioativos dessa espécie.

Os resultados do ensaio do papel de filtro estão apresentados na Tabela 6. A ausência

de manchas oleosas no papel de filtro evidencia uma maior miscibilidade do lipídeo sólido

com o óleo essencial. Seguindo este critério, a cera de carnaúba tipo 1 foi o lipídeo que

apresentou maior compatibilidade com o óleo de cravo. O Gelucire 50/13 e o álcool estearílico

apresentaram pouca miscibilidade com o óleo, mesmo não tendo sido observada separação de

fases.


Tabela 6. Resultados do screening de lipídeos pelo ensaio da mancha em papel de filtro.

Lipídeo

Óleo de cravo

Branco 20 % 40 % 60 %

t0 t30 t0 t30 t0 t30

Álcool estearílico - - + + + + +

Ácido esteárico - - - - + + +

Apifil - - - - + + +

Cera de abelhas - - - + + + +

Cera carnaúba Tipo 1 - - - - - - -

Cera carnaúba Tipo 3 - - - - - + +

Compritol® 888ATO - - - + + + +

Gelucire 50/13 - + + + + + +

Monoestearato de glicerila - - - + + + +

(+) mancha oleosa no papel, (-) sem mancha no papel. t0: tempo zero, t30: 30 dias

Além da compatibilidade do lipídeo com o principio ativo a ser encapsulado, outros

fatores devem ser considerados na seleção do lipídeo apropriado, como a sua aplicação

posterior, via de administração e as temperaturas nas quais a formulação deve ser estável.

Formulações que serão submetidas ao processo de secagem por spray dryer, preferivelmente

devem ser compostas por lipídeos que apresentem alto ponto de fusão, permitindo a utilização

de temperaturas de secagem maiores, para reduzir problemas de aderência nas paredes do

equipamento, os quais são relacionados com sua temperatura amolecimento e de transição

vítrea. A adição do óleo de cravo ao lipídeo sólido diminui seu ponto de fusão, como pode ser

observado na Figura 11, sendo que quanto maior a quantidade de óleo adicionado, menor o

ponto de fusão da mistura. A pesar da cera de carnaúba ter apresentado bons resultados neste

screening esta foi descartada devido a que em formulações preparadas em ensaios

preliminares causou entopimento do bico atomizador do spray dryier.


Figura 11. Ponto de fusão dos lipídeos utilizados no screening e das misturas com o óleo de

Syzygium aromaticum, nas concentrações de 20, 40 e 60 %.

5.3. Validação do método analítico

A validação do método analítico é necessária de forma de garantir a confiabilidade dos

resultados de quantificação dos princípios ativos monitorados, demonstrando ser apropriado

para esta aplicação. Com as condições cromatográficas validadas foram obtidos os

cromatogramas dos padrões eugenol e acetato de eugenol, apresentados na Figura 12a, com

seus respectivos perfis UV, sendo observada uma boa separação dos compostos. Os

cromatogramas das formulações líquida e secas (F5) são apresentados na Figuras 12b e 12c,

respectivamente, observando-se uma boa seletividade do método utilizado. A seletividade do

método foi garantida pelo indice de pureza dos picos de eugenol e acetato de eugenol das

amostras e dos padrões que foi de 1,0 determinada com o detector de arranjo de diodos

Shimadzu (SPD-M20A).


Figura 12. Cromatogramas dos padrões eugenol e acetato de eugenol (a), formulação líquida

(b) e formulação sólida (c).

Eugenol Acetato de eugenol

a

b

c


A linearidade do método, calculada a partir da curva analítica do eugenol e do acetato

de eugenol por regressão linear é apresentada na Figura 13a e 13b. O método foi linear nas

faixas de concentração estudadas com valor de R2 próximo a 1, o que indica que na faixa de

valores estudados, a área é proporcional à concentração do analito na amostra.

Figura 13. Curva analítica do eugenol (a) y = 18668,6x - 12730,5; R2=0,9990 e acetato de

eugenol (b) y = 8496,7x + 7752,8; R2=0,9963

Precisão e exatidão

Uma vez determinada a faixa de concentração linear, foram realizados os testes de

precisão e exatidão, visando determinar a proximidade dos resultados experimentais em

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 50 100 150 200 250 300 350

Áre

a (

-)

Concentração (µg/mL)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 20 40 60 80 100

Áre

a (

-)

Concentração (µg/mL)

a

b


relação a um resultado teórico e a proximidade dos resultados obtidos em uma série de

medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra (ANVISA, 2003).

Na Tabela 7 são apresentados os resultados de precisão e exatidão para a formulação

líquida e a formulação após secagem em spray dryer. A exatidão foi calculada pelo método de

adição de padrão (fortificação) o qual é utilizado quando for difícil ou impossível preparar um

branco da matriz sem a substância de interesse (Ribani, Bottoli, Collins, & Jardim, 2004),

como é o caso da quantificação de eugenol e acetato de eugenol nas formulações contendo o

extrato de cravo. Segundo a normativa vigente (ANVISA, 2003), para a precisão não são

admitidos valores de coeficiente de variação (CV ou desvio padrão relativo, RSD) superiores

a 5 % para métodos analíticos e de 15 % para métodos bioanalíticos. No caso da exatidão, o

desvio de acordo com o valor de referência não pode exceder 15 %. Nos resultados

apresentados na Tabela 7, observa-se que o CV é sempre inferior a 5 %, sendo que os CV

foram maiores para o acetato de eugenol do que para o eugenol.

Tabela 7. Precisão e exatidão do método para quantificação por HPLC de eugenol e acetato

de eugenol nas formulações líquida e sólida.

Parâmetro

Eugenol Acetato de eugenol

Formulação

líquida

Formulação

seca

Formulação

líquida

Formulação

seca

Repetibilidade

(CV %)

Baixa 1,1 0,8 3,3 4,6

Media 0,6 1,2 1,8 1,0

Alta 1,0 2,1 2,0 2,3

Precisão intermediária

Analista 1 x Analista 2

(CV %)

2,42 0,2 4,2 3,6

Exatidão

(Recuperação %)

Baixa 95,6 ± 3,7 100,3 ± 3,1 91,8 ± 1,8 106,0 ± 1,6

Media 104,1 ± 5,9 103,1 ± 5,9 95,8 ± 3,4 102,4 ± 3,3

Alta 106,7 ± 4,7 105,1 ± 3,5 98,4 ± 4,1 102,3 ± 4,3

Robustez

A robustez do método analítico mede a sensibilidade que este apresenta frente a

pequenas variações (Ribani et al., 2004), sendo que essas variações podem ser devido ao


preparo das amostras ou às condições cromatográficas. Os parâmetros utilizados para avaliar a

robustez do método foram o tempo (15 e 60 minutos) e a temperatura (30 e 45 °C) de preparo

das amostras. Os resultados são apresentados na Tabela 8, que mostra que o acetato de

eugenol foi muito mais sensível às mudanças do que o eugenol que se mostrou mais robusto

às variações analisadas.

Tabela 8. Robustez do método analítico para quantificação por HPLC de eugenol e acetato de

eugenol em formulações lipídicas de cravo.

Tipo de formulação Método de

preparação

CV* (%)

Eugenol Acetato de

eugenol

Líquida

15 min, 30 °C 1,1 3,8

15 min, 45 °C 2,6 7,1

60 min, 30 °C 2,0 4,1

60 min, 45 °C 1,0 4,0

Sólida

15 min, 30 °C 0,1 4,1

15 min, 45 °C 0,6 4,8

60 min, 30 °C 0,3 5,6

60 min, 45 °C 0,2 5,7

*em relação à média

5.4. Extração micelar

Uma etapa de grande importância quando se trabalha com matrízes complexas, como é

o caso de produtos naturais, é a extração de compostos bioativos. O método de escolha deve

ser capaz extrair o máximo dos compostos de interesse ou até mesmo ser capaz de fazer uma

extração seletiva.

A extração micelar surge como uma estratégia interessante na otimização do preparo

das formulações lipídicas solidas. A etapa da evaporação do solvente orgânico (etanol 70 %) é

substituída pela precipitação das micelas, contendo os princípios ativos extraídos. O

tensoativo, além de ser utilizado como solvente extrator, também forma parte da formulação

lipídica. Este método de preparação também pode aumentar a retenção do eugenol, após a

secagem no spray dryer. A primeira fase deste estudo consistiu em determinar o efeito do tipo


e a concentração do tensoativo na extração do eugenol de S. aromaticum. A segunda fase

consistiu na preparação da formulação lipídica com o extrato micelar, sendo inicialmente

realizados ensaios preliminares, utilizando poloxamer 188 como tensoativo.

5.4.1. Influência do EHL na extração do eugenol e acetato de eugenol do cravo

A variação do teor de eugenol extraído em função do EHL é apresentado na Figura 14.

É claramente observado que quanto maior o EHL, maior a concentração de eugenol. O extrato

obtido com Tween 80 a 5 % (EHL 15) apresentou o maior teor de eugenol. Por outro lado,

utilizando Span 80 % (EHL 4,3), a extração de eugenol foi reduzida. Também verificou-se

que acima do EHL 6, a extração de eugenol com tensoativos foi superior à extração aquosa.

Figura 14. Efeito do EHL do tensoativo na extração micelar de eugenol. Letras iguais nas

colunas indicam que não existe diferença significativa segundo o teste de Tukey (p≤0,05).

Comparando os extratos etanólicos, observa-se que na concentração de 70 % (v/v), a

extração de eugenol foi superior à obtida com o etanol 96 %, mesmo a solubilidade do

eugenol ser maior em etanol 96 % (v/v). Este resultado pode ser explicado levando em

consideração a penetração celular do etanol 70 %, ser superior à do etanol 96 %, razão pela

qual esta concentração de etanol é utilizada como antisséptico. O etanol 96 % causa

coagulação de proteínas dentro da parede celular o que reduz a penetração do solvente na

celula. Na literatura, são encontrados vários trabalhos, utilizando concentrações de etanol de

60 a 80 %, para a extração de compostos bioativos de plantas (Cortés-Rojas, Souza, &

Oliveira, 2011; Juntachote, Berghofer, Bauer, & Siebenhandl, 2006; Pompeu, Silva, & Rogez,

2009; Souza, Bott, & Oliveira, 2007).


Atualmente, a utilização de solventes orgânicos na elaboração de produtos

farmacêuticos é evitada, uma vez que a maioria são tóxicos e os mesmos devem ser removidos

no final do processo, garantindo o menor teor aceitável. Os tensoativos utilizados neste

trabalho são comumente utilizados pelas indústrias alimentícia e farmacêutica (Rowe et al.,

2006), representando assim uma alternativa viável para a formulação de emulsões, contendo

compostos bioativos de plantas. Os tensoativos fenólicos, como o Triton X-100 e Genapol X-

80, têm sido bastante utilizados para a extração, purificação e concentração de compostos de

origem vegetal para fins analíticos, porém este tipo de tensoativos não são aceitáveis em

formulações orais ou de uso tópico.

Na literatura são reportadas concentrações de eugenol nos extratos de S. aromaticum

na faixa de 93,8 mg/g a 126 mg/g de peso fresco, quando é realizada a extração com solventes

orgânicos, como o metanol (“http://www.phenol-explorer.eu,” 2012; Pathak, Niranjan, Padh,

& Rajani, 2004; Shan et al., 2005). Os resultados experimentais obtidos neste trabalho (Figura

15) mostram que a extração com tensoativos é comparável ou inclusive superior à extração,

utilizando solventes orgânicos (etanol 70 %).

A extração de eugenol com outros tensoativos foi realizada, visando estudar a

influência do tipo de tensoativo. A Figura 15 mostra que os melhores resultados foram obtidos

com tensoativos de EHL de 13 a 29, como Tween 80 (EHL: 15), Gelucire 44/14 (EHL:14),

Gelucire 50/13 (EHL: 13), Triton X-100 (EHL: 13,5) e Poloxamer 188 (EHL 29). Quanto à

concentração, foram observadas diferenças significativas entre as concentrações de 2 e 5 %,

mas não entre 5 e 10 %. Menores concentrações de tensoativos são desejadas para diminuir a

toxicidade. Estes resultados também foram observados em outros estudos onde foi

demonstrado que concentrações de tensoativos não iônicos como Triton X-100, Triton X-114

e Genapol X-80 de 5 a 10% (p/p) apresentaram resultados satisfatórios de extração e que

concentrações maiores do que 10% não melhoraram a extração (Chen, Yuchun, & Huizhou,

2007; Trivedi et al., 2011; Wenjuan & Ligang, 2013; Zhou, Sun, & Wang, 2008).


Figura 15. Efeito do tipo e concentração do tensoativo na extração micelar de eugenol. Letras


teste de Tukey (p≤0,05).

O pH do solvente extrativo é outra variável de grande importância, pois está

relacionado com a solubilidade e o grau de dissociação de moléculas tais como compostos

fenólicos e aminas. Uma maior eficiência de extração é alcançada em valores de pH onde o

analito está na sua forma não ionizada (Paleologos et al., 2005). Os resultados das análises

realizadas utilizando Tween 80 em pH ácido e básico (Figura 16) mostraram que a extração de

eugenol foi maior em pH 12 (154,1 ± 5,4 mg eugenol/g of M.P.) comparado com a extração a

pH 5 ou pH 2, os quais apresentaram valores de 130,7 ± 5,6 e 128,5 ± 7,3 mg eugenol/g M.P.

respectivamente. Levando em consideração que o pKa do eugenol é 10,19 a 25 °C, é de se

esperar que valores de pH próximos a este valor melhoram o processo de extração. Outros

autores tem estudado o efeito do pH na extração micelar. Memon et al., (2010), mostraram

que aumentos no pH diminuem a extração de ácido clorogenico das folhas de Morus laevigata

e este efeito foi associado com a atração eletrostática entre o ácido clorogenico protonado e o

tensoativo, dodecil sulfato de sódio, negativamente carregado. Resultados similares foram

obtidos por Hosseinzadeh et al. (2013) na extração de compostos fenólicos de maçãs onde,

menores valores de pH favoreceram a extração devido à neutralização dos compostos

fenólicos facilitando sua migração na micela. Os tensoativos não iônicos mostram maior

eficiência de extração do que os tensoativos iônicos. Brij-35 7mM em pH 3 foi considerada a

melhor condição para a extração de polifenois. Wenjuan e Ligang, (2013), demonstraram que

o rendimento da extração de bergenina de Ardisia japonica aumenta aumentando o valor de

pH de 2 a 7 e diminui quando o pH fica na faixa de 7 a 10. Estes resultados confirmam a


existência de uma forte relação entre as propriedades químicas do composto de interes como o

efeito do pH na extração.

A extração de ginsenosidos das raízes de Panax quinquefolium (Ginseng americano)

foi otimizada por planejamento estatístico sendo os melhores resultados obtidos com Triton

X-100 10% (Fang et al., 2000). As condições de extração de tanshinosidos de Salvia

miltiorrhiza Bunge foram otimizadas utilizando Genapol X-80 como uma alternativa eficiente

comparada com solventes orgânicos como metanol e diclorometano (Shi et al., 2004). Em

outro estudo, tanshinosido I e criptotanshinoside foram extraídos de Salvia miltiorrhiza Bunge

utilizando Triton X-100 na concentração de 0,8 mol/L como tensoativo específico (Bi, Tian,

& Row, 2011). Os resultados obtidos para os tensoativos tween 20 e SDS (dodecil sulfato de

sódio) foram comparáveis à extração utilizando solventes orgânicos como acetato de etila,

etanol, metanol e diclorometano. Os curcuminoides de Curcuma longa, uma importante

especiaria com usos medicinais e alimentícios, foram extraídos com Gelucire 44/13 e

Gelucire 50/14, concluindo-se que glicerídeos poliglicolizados de grau alimentício podem ser

utilizados na extração de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos do rizoma da planta. Os

resultados evidenciaram que o Gelucire 44/14 forneceu melhores resultados, inclusive quando

comparado com o solvente orgânico (Gilda, Kanitkar, Bhonde, & Paradkar, 2010). Todos

estes estudos tem mostrado a importância de variáveis tais como o tipo de tensoativo,

concentração, pH e temperatura para otimizar a extração dos compostos bioativos de interesse.

A viscosidade da solução de tensoativo utilizada está relacionada com a concentração

de tensoativo e tem influência com a eficiência de extração. Isto pode estar relacionado com o

fato que menores valores de viscosidade facilitam o processo de mistura, a transferência de

massa e a penetração nas células do material vegetal (Paleologos et al., 2005; Trivedi et al.,

2011).

5.4.2. Polifenóis totais

Os resultados apresentados na Figura 16 mostram que a extração de polifenóis também

aumenta com o incremento do EHL, do mesmo modo que o teor de eugenol. Os flavonoides e

ácidos fenólicos presentes nos botões florais do cravo da Índia possuem diferentes graus de

polaridade e os tensoativos facilitam a extração dos dois tipos de moléculas. Os resultados

apresentados mostram que a água foi o melhor solvente para a extração de polifenóis, devido à


sua alta solubilidade neste solvente. Entretanto a extração com água não é a melhor opção,

para a extração de eugenol como foi apresentado anteriormente na Figura 14.

Figura 16. Teor de polifenóis em função do EHL na extração micelar. Letras iguais nas


Tukey (p≤0,05).

5.4.3. Atividade antioxidante ABTS

Os resultados apresentados na Figura 17 mostram que a atividade antioxidante tem

relação direta com a concentração de eugenol e polifenóis totais. O extrato obtido com o

tensoativo de EHL 15 não apresentou diferenças estatisticamente significativas com o extrato

obtido com etanol 70 % (v/v). O extrato com maior atividade antioxidante foi o obtido com o

tensoativo de EHL 15 e pH 12 o qual teve também o maior teor de eugenol. A relação

estrutura-atividade do eugenol foi discutida por Gülçin (2011), o autor reportou que a

presença do grupo fenólico e a dupla ligação na cadeia alifática é importante para a captação

de radicais livres. Este tipo de conformação é similar à encontrada na molécula de resveratrol

a qual tem sido associada à atividade antioxidante do vinho tinto.


Figura 17. Atividade antioxidante in vitro determinada pelo método de ABTS em função do

EHL na extração micelar, expressa como µmol de Trolox por grama de matéria-prima. Letras


teste de Tukey (p≤0,05).

O extrato micelar preparado com poloxamer 188 5 % foi selecionado para realizar um

ensaio de secagem por spray drying utilizando goma arábica na proporção de 14 % (p/p) como

carreador. Foi observada uma alta aderência das partículas à câmara de secagem e uma baixa

retenção de eugenol (14,4 %). Com relação à baixa retenção de eugenol, uma hipótese é que a

diminuição da tensão superficial por parte do tensoativo diminui as propriedades de

viscoelasticidade do material de parede e isto interfere com a velocidade de formação da

crosta da partícula promovendo a perda dos compostos voláteis (Jafari, He, & Bhandari,

2007).

Baseado em estes resultados e visando a obtenção de sistemas particulados decidiu-se

realizar a extração utilizando etanol 70 % (v/v) e desenvolver as formulações lipídicas a partir

deste extrato.

5.5. Ensaios preliminares da formulação e secagem das formulações lipídicas

Esta etapa do desenvolvimento do projeto teve por objetivo avaliar a influência da

composição da formulação nas propriedades físico-químicas das composições lipídicas secas,

especialmente na retenção do eugenol e do acetato de eugenol. Nesta etapa, foram realizados

ensaios preliminares de formulação utilizando o extrato hidroetanólico de cravo sendo


avaliados dois tipos de lipídeos (Compritol 888 ATO e ácido esteárico), dois tensoativos

(polisorbato 80 e poloxamer 188) e três carreadores de secagem (maltodextrina, goma arábica

e lactose). A formulação que apresentou maior retenção de eugenol foi selecionada para se

avaliar os efeitos do método de homogeneização e secagem.

5.5.1. Influência da composição da formulação

5.5.1.1.Teor de eugenol e acetato de eugenol nas formulações lipídicas sólidas secas

As concentrações de eugenol e acetato de eugenol nos sistemas particulados obtidos

após a secagem por spray drying das formulações lipídicas foram quantificadas por HPLC,

sendo os resultados apresentados na Figura 18. Observou-se que a formulação 5 (F5)

apresentou as maiores concentrações de eugenol e acetato de eugenol, enquanto que as

formulações 2 e 4, as menores concentrações. A diferença da formulação 5 em relação a

formulação 4 é o tipo de tensoativo, (poloxamer e tween 80, respectivamente) e o tipo de

lipídeo sólido: compritol 888ATO (Gliceril dibehenato) na formulação 5 e ácido esteárico na

formulação 4. A formulação 2 difere da formulação 4 no tipo de lipídeo e no tipo de material

de parede, compritol 888 ATO (Gliceril dibehenato) e lactose, respectivamente.

A afinidade do lipídeo sólido com o eugenol e acetato de eugenol tem uma influência

direta com a retenção após a secagem em spray dryer. Por este motivo, é importante

selecionar o lipídeo que proporcione uma melhor encapsulação dos compostos bioativos. Garg

e Singh (2011), utilizaram ácido esteárico e triglicerídeo caprílico na preparação de SLN de

eugenol, encontrando uma eficiência de encapsulação de até 98,52 %. Os autores observaram

também que o aumento da concentração da fase lipídica de 2 a 4 % resultou no aumento da

eficiência de encapsulação e no tamanho de partícula. Da mesma forma, Pokharkar et al.

(2011), utilizaram ácido esteárico e ácido oleico na preparação de NLC, contendo eugenol

para liberação peridontal, encontrando eficiências de encapsulação na faixa de 71,53 a 97,43

% quando utilizaram uma concentração de fase lipídica de 2,5 e 5 % dos tensoativos

cremophor RH40, pluronic F68 e tween 20 nas proporção 5:3:2. A literatura apresenta vários

trabalhos utilizando o compritol®

(Gliceril dibehenato) na preparação de NLC, contendo

diferentes princípios ativos (Das et al., 2012; González-Mira et al., 2011; Puglia et al., 2008;

Xia et al., 2007). Baseado nestes estudos, foram selecionados o ácido esteárico e o compritol®

888 ATO para o desenvolvimento desta etapa do projeto. Entretanto, salienta-se que a cera de

carnaúba, compritol® 888 ATO, ácido esteárico, monoestearato de glicerila e cera de abelhas


também são lipídeos muito utilizados na preparação de partículas lipídicas (Das et al., 2012;

González-Mira et al., 2011; Nikolić et al., 2011; Xia et al., 2007). Fatores como a proporção

de lipídeo sólido e a porcentagem da fase lipídica também influenciam a eficiência de

encapsulação, pois estão relacionados com a estabilidade da emulsão e a capacidade de carga

de cada lipídeo.

Figura 18. Retenção de eugenol e acetato de eugenol nas formulações sólidas obtidas nos

ensaios preliminares de formulação. Letras iguais nas colunas indicam que não existe

diferença significativa entre as amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05).

A influência do carreador de secagem pode ser determinada quando se comparam as

formulações 1, 2 e 3. Foi observado que quando se utilizou lactose como carreador de

secagem (F2), as concentrações de eugenol e acetato de eugenol foram inferiores às obtidas

com maltodextrina (F1) ou quando se utilizou a combinação de maltodextrina com goma

arábica (F3). A seleção do material de parede é crucial no desenvolvimento de formulações

microencapsuladas por spray drying devido a sua relação direta com a difusividade do

composto a ser encapsulado na membrana semipermeável formada durante as primeiras etapas

de secagem (Goubet e Voilley, 1998). Desta forma, devem ser analisadas propriedades, tais

como, a capacidade de formação de filme, capacidade de emulsificação e temperatura de

transição vítrea, visto que a interação do material de parede com o núcleo tem uma forte

influência no grau de proteção conferido e também na aderência do material às paredes da

câmara de secagem (Gharsallaoui et al., 2007). As maltodextrinas, por exemplo, são materiais

de parede muito utilizados na encapsulação de alimentos e formulações fitoterápicas por spray

drying, especialmente com equivalentes de dextrose entre 10 e 20, por apresentarem uma boa

solubilidade com altos teores de sólidos e boas propriedades de encapsulação (Gharsallaoui et


al., 2007; Raja, Sankarikutty, Sreekumar, Jayalekshmy, & Narayanan, 1989; Rowe et al.,

2006; Tonon, Brabet, & Hubinger, 2008).

O tipo e a concentração do tensoativo têm uma correlação direta com o tamanho de

partícula, eficiência de encapsulação e estabilidade de NLC (Tan, Billa, Roberts, & Burley,

2010). Ensaios preliminares devem ser realizados, visando selecionar o tensoativo adequado

para um sistema em particular. Os resultados apresentados na Figura 18 mostram que a

formulação contendo poloxamer 188 apresentou maior retenção de eugenol e acetato de

eugenol, quando comparado com a formulação 1 e 5. Estes resultados podem estar

relacionados com o EHL do tensoativo, visto que o polisorbato 80 tem um EHL de 15 e o

poloxamer 188 de 29 (Rowe et al., 2006). Este parâmetro pode influenciar a encapsulação,

mesmo que os dois são tensoativos não iônicos do tipo O/A. No trabalho publicado por Das et

al. (2012), quatro diferentes tipos de tensoativos foram avaliados para a preparação de SLN e

NLC de clotrimazol: cremophor® EL, tween

® 20, tween

® 80 e pluronic

® F68, determinando

também a concentração ótima. Os resultados mostraram que aumentos na concentração de

tensoativo incrementaram a eficiência de encapsulação. O tamanho de partícula diminuiu pelo

efeito da diminuição da tensão superficial das gotículas lipídicas. No entanto, uma maior

tendência de agregação foi observada com baixas concentrações do tensoativo, ocasionado por

uma menor repulsão entre as partículas. Foi observado que a concentração do tensoativo

apresenta um ponto ótimo, uma vez que incrementos posteriores não alteraram o tamanho de

partícula nem melhoraram a estabilidade (Das et al., 2012), sendo que o planejamento fatorial

pode ser de grande utilidade para otimizar a concentração dos tensoativos na formulação.

NLC contendo luteína foram preparados, utilizando a metodologia de superfície de

resposta, com a otimização das concentrações de pluronic F68 e myverol, tendo como

respostas o perfil de liberação, o grau de cristalinidade e a eficiência de encapsulação. A

concentração otimizada foi 0,2 % de Myverol 18-04K e 5 % de Pluronic F68 enquanto que a

concentração da fase lipídica foi de 5,2 % (Liu & Wu, 2010).

5.5.1.2. Recuperação do produto

As formulações lipídicas preparadas foram submetidas à secagem no spray dryer,

avaliando a quantidade de pó coletado pelo do ciclone. As perdas por aderência na câmara de

secagem são comuns na secagem por spray drying em escala laboratorial e estão relacionadas

com a composição da formulação, em especial com a temperatura de transição vítrea.


O carreador de secagem e o tipo de tensoativo tiveram impacto direto na recuperação

do produto. Como observado na Figura 19, a formulação contendo compritol®

888ATO e

poloxamer 188 (F5) apresentou maior recuperação (57,6 %); enquanto que a formulação

contendo ácido esteárico (F4) apresentou a menor recuperação (21,0 %). Este resultado pode

estar relacionado com o fato que o compritol® 888 ATO possui um ponto de fusão de 58 °C

enquanto que o do ácido esteárico é de 50 °C, o que aumenta o ponto de fusão da mistura

lipídica e, consequentemente sua temperatura de transição vítrea. Dollo et al. (2003)

obtiveram valores de recuperação na faixa de 44 a 74 % na atomização de emulsões,

utilizando mygliol 812 e maltodextrina, respectivamente como lipídeo e carreador, sendo que

quanto maior a proporção de óleo na formulação, menor a recuperação.

Figura 19. Porcentagem de recuperação de massa após spray drying das formulações

preparadas nos ensaios preliminares (Tabela 1).

Com relação ao efeito do tensoativo na recuperação do produto, foi obtida maior

recuperação com o poloxamer 188 do que com o polisorbato 80, comparando as formulações

1 e 5 (Figura 19). Este fato pode estar relacionado com o ponto de fusão destes dois

componentes, sendo o ponto de fusão do poloxamer 188 maior do que o do polisorbato 80,

que é um líquido viscoso a temperatura ambiente. Quanto aos carreadores de secagem

utilizados, as formulações contendo maltodextrina DE10 mostram maior recuperação a qual

pode ser atribuída a uma maior temperatura de transição vítrea, comparada com goma arábica

e lactose (Islam, Sherrell, & Langrish, 2010; Mosquera, Moraga, & Martínez-Navarrete,

2012).

A aderência dos pós nas paredes do spray dryer é uma das maiores causas de perda de

produto, especialmente com formulações lipídicas (Bourezg et al., 2012). A composição da


formulação e as condições de secagem devem ser otimizadas para prevenir esta aderência e

incrementar a recuperação do produto.

5.5.1.3. Atividade antioxidante

Os resultados da atividade antioxidante in vitro das formulações secas por spray dryer

são apresentados na Figura 20. Não foram encontradas diferenças estatisticamente

significativas (one-way ANOVA) entre as amostras. Entretanto, as formulações 2 e 4 mostram

resultados interessantes, apesar dos baixos teores de eugenol e acetato de eugenol,

apresentaram atividade antioxidante comparável com as outras amostras com maior teor de

eugenol. Isto indica que outros compostos antioxidantes não monitorados devem estar

contribuindo a atividade antioxidante.

A atividade antioxidante de S.aromaticum tem sido considerada uma das mais elevadas

(Pérez-Jiménez et al., 2010) das fontes vegetais. Em um estudo realizado por Wojdyło,

Oszmiański e Czemerys (2007) o valor de TEAC (µmol trolox/100 g de material vegetal) foi o

mais alto entre 32 especiarias.

Figura 20. Atividade antioxidante in vitro das formulações sólidas obtidas nos ensaios

preliminares (expressas como µmol equivalentes de Trolox por mg de pó). Letras iguais nas


Tukey (p≤0,05).


5.5.1.4. Dispersibilidade em água

A dispersibilidade em água dos pós é apresentada na Figura 21, sendo que a

formulação contendo ácido esteárico (F4) é mais solúvel em água que as formulações

contendo compritol® 888 ATO (F1, F2, F3, F5). Em relação ao tipo de tensoativo, não foram

observadas diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre o polisorbato 80 e o

poloxamer 188, nas formulações contendo compritol®

888ATO. Comparando a influência do

material de parede (carreador), observa-se que a solubilidade em água do produto contendo

maltodextrina DE10 (F1) foi maior do que as formulações contendo lactose (F2) e a mistura

de maltodextrina e goma arábica (F3). As maltodextrinas são carboidratos derivados da

hidrólise do amido, apresentam boa solubilidade e são amplamente utilizadas na indústria de

alimentos, como materiais de parede na encapsulação por spray drying (Cano-Chauca et al.,

2005). Por outro lado, a goma arábica apresenta boas propriedades emulsificantes e esperar-

se-ia maior solubilidade. Porém a interação com os lipídeos da formulação pode influenciado

esta propriedade.

Figura 21. Dispersibilidade em água dos pós obtidos por spray drying nos ensaios

preliminares. Letras iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa entre as

amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05).

5.5.1.5. Tamanho de partícula e propriedades de fluidez

Os resultados da distribuição de tamanho de partícula, obtidos pelo método de difração

de luz em modo líquido, utilizando etanol 96 % como meio dispersante dos sistemas

particulados, são apresentados na Tabela 9. Observou-se que o valor de span da formulação 2

foi maior (3,79) do que das outras formulações, o que indica uma ampla distribuição de


tamanho de partícula. Por outro lado, a formulação 5 apresenta distribuição de tamanho de

partícula mais estreita, o que pode estar relacionado com o tipo de tensoativo. Este efeito pode

ser determinado, comparando a formulação 1 com a formulação 5, nas quais foram utilizados

tween 80 e poloxamer 188, respectivamente. A influência do tipo e da concentração de

tensoativo no tamanho de partícula de formulações lipídicas tem sido estudada por vários

autores (Hentschel, Gramdorf, Müller, & Kurz, 2008; Pardeike et al., 2011; Pokharkar et al.,

2011). Das et al. (2012) observaram que o tamanho de partícula e o índice de

polidispersibilidade de formulações, contendo Poloxamer 188 (Pluronic F68), foram maiores,

quando comparado com o tamanho de partícula de formulações contendo tween 80 e

chremophor EL, sugerindo que este comportamento pode estar relacionado ao alto valor de

EHL do poloxamer 188 (> 29), em relação ao dos outros tensoativos, cremophor EL (EHL 14)

e tween 80 (EHL 15). Outro fator importante que influi no tamanho de partícula é o carreador

de secagem utilizado. Na formulação contendo lactose (F2), o tamanho de partícula no

percentil 90 (43,91 µm) foi maior do que nas formulações contendo maltodextrina (F1: 33,0

µm) e a combinação de maltodextrina com goma arábica (F3: 30,54 µm).

Tabela 9. Tamanho de partícula, índices de fluidez e atividade de água das formulações

sólidas obtidas por spray drying nos ensaios preliminares.

Form Tamanho de partícula (µm)

Fator

Hausner

Índice de

Carr

Atividade de

água

d10 d50 d90 Span (-) (-) (-)

F1 3,3 13,6 33,0 2,18 1,6 36,0 0,329 ± 0,004

F2 2,3 11,0 43,91 3,8 1,4 30,0 0,388 ± 0,005

F3 2,8 10,6 30,54 2,6 1,5 34,6 0,318 ± 0,012

F4 3,3 12,9 32,72 2,3 1,6 37,0 0,356 ± 0,008

F5 5,0 22,5 48,17 1,9 1,5 32,1 0,327 ± 0,006

Quanto às propriedades de fluidez, as densidades aparente e compactada dos pós foram

utilizadas para se determinar o fator de Hausner e o Índice de Carr, que classificam o fluxo

dos pós baseado na acomodação das partículas, que é influenciada pelo tamanho e pelas

características superficiais destas. Valores menores de 16 para o Índice de Carr e menores de

1,2 para o Fator de Hausner são considerados de fluxo bom (Aulton, 2005). Os resultados

apresentados na Tabela 9 indicam que a maioria dos pós apresentam baixa fluidez. Isto pode


estar associado ao tamanho das partículas dos pós obtidos por spray drying os quais

geralmente apresentam diâmetro médio inferior à 20 µm, incrementando a coesividade

(Cortés-Rojas & Oliveira, 2012; Couto et al., 2012). Sabe-se que quanto maior o tamanho de

partícula, melhor a fluidez, o qual é confirmado pelos resultados obtidos com a formulação 2

(d90: 43,9 µm) e 5 (d90: 48,2 µm), as quais possuem um maior tamanho de partícula e

apresentaram melhor fluidez. Outros fatores, como a higroscopicidade dos materiais e a

aderência dos componentes nas paredes do equipamento, podem influenciar a fluidez de um

material durante o processo de fabricação, quando o transporte interno ocorre, utilizando a

força da gravidade. Materiais como a sílica são comumente utilizados como melhoradores de

fluxo, causando incremento na densidade de pós finamente compactados (Aulton, 2005; Bott,

Labuza, & Oliveira, 2010; Onwulata, Konstance, & Holsinger, 1996).

5.5.1.6. Atividade de água e teor de umidade

A atividade de água é uma propriedade importante dos materiais secos, pois está

estreitamente ligada com a estabilidade físico-química e microbiológica. Produtos

desidratados são mais estáveis que as preparações líquidas. A atividade de água é um

parâmetro comumente relacionado com a estabilidade microbiológica do produto sendo

recomendado un valor inferior a 0,5 (Keey, 1992). O teor de umidade e a atividade de água

estão principalmente relacionados às condições de secagem, tais como a temperatura de

entrada e saída do gás de secagem e a vazão de atomização. A secagem também pode

promover mudanças na ligação e dissociação da água as quais podem afetar o valor da

atividade de água do produto. Como todas as formulações foram atomizadas na mesma

temperatura de entrada (90 °C), as variações no valor de atividade de água foram mínimas

(Tabela 9).

5.5.1.7. Comparação dos métodos de dispersão e secagem na retenção de eugenol e

acetato de eugenol

Os resultados da influência dos dois métodos de secagem (liofilização e spray drying)

e dos três métodos de homogeneização de alta energia (ultraturrax, ultrassom e HAP), no teor

de eugenol e acetato de eugenol estão apresentados na Figura 22. Observou-se que quando as

amostras foram liofilizadas, as concentrações de eugenol e acetato de eugenol foram

superiores às obtidas por spray drying.


A principal vantagem da liofilização em relação à secagem por spray drying é que a

degradação de compostos voláteis ou termossensíveis é menor, porém apresenta tempo de

processamento mais longo e possui custo elevado. No trabalho publicado por Bourezg et al.

(2012), foram comparados três métodos para a produção de partículas lipídicas redispersáveis,

contendo espironolactona, a saber: spray drying, leito fluidizado e liofilização. Os resultados

mostraram que a técnica de spray drying foi ideal para a produção de pós com boas

propriedades de dissolução, porém o rendimento do produto pode ser um problema no

escalonamento da técnica, devido à aderência às paredes do equipamento.

Figura 22. Comparação das técnicas de homogeneização e secagem quanto à concentração de

eugenol (a) e acetato de eugenol (b). Letras iguais nas colunas indicam que não existe

diferença significativa entre as amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05).

A correta seleção dos materiais de parede e condições de secagem tornam possível a

encapsulação de compostos voláteis, pela técnica de spray drying, reduzindo perdas e

degradação do produto durante o processo. A temperatura do ar de entrada e de saída são

variáveis comumente otimizadas na encapsulação de compostos voláteis por spray drying

(Bringas-Lantigua, Expósito-Molina, Reineccius, López-Hernández, & Pino, 2011; Bringas-

Lantigua, Valdés, & Pino, 2012). A microencapsulação de óleo de lima, por spray drying, foi

otimizada quando se utilizou temperatura do ar de entrada e de saída de 220 °C e 85 °C

respectivamente. Nestas condições a retenção de óleo foi de 95,5 % e a eficiência de

encapsulação de 99,9 % (Bringas-Lantigua et al., 2012).

Huynh et al. (2008) otimizaram a retenção de óleo de limão (Backhousia citriodora)

quanto ao teor de sólidos (20, 30 e 40 %), concentração de óleo (10, 15 e 20 %) e temperatura

a b


do ar de saída (60, 65 e 70 °C), utilizando como material de parede o amido modificado Hi-

Cap 100 e a proteína do leite. As condições otimizadas foram teor de sólidos de 40 %,

concentração de óleo de 18 % e temperatura de saída de 65 °C; em relação ao material de

parede, foi obtida maior retenção utilizando Hi-cap (64,49 a 90,07 %), em comparação com a

proteína do leite (54,50 a 77,45 %).

Quanto à influência método de homogeneização na retenção de eugenol e acetato de

eugenol, o método de homogeneização de alta pressão mostrou uma tendência a aumentar a

retenção. Porém, as diferenças não foram estatisticamente significativas na maioria das

amostras comparando o mesmo processo de secagem. O método de homogeneização possui

um impacto direto no tamanho da gotícula da emulsão e na estabilidade, o qual está

relacionado com a retenção de compostos voláteis em pós obtidos por spray drying. O grande

gradiente de velocidade e a turbulência no atomizador podem romper as gotículas maiores

causando a evaporação dos compostos voláteis (Soottitantawat et al., 2003). Os resultados

obtidos em neste trabalho mostraram que os métodos de dispersão não tem efeito significativo

quanto à retenção de eugenol e acetato de eugenol nos dois processos de secagem estudados.

Como mencionado por Jafari et al, (2007), existe uma controvérsia em relação ao efeito do

tamanho de partícula na encapsulação por spray drying, alguns autores tem reportado melhor

eficiência de encapsulação com maiores tamanhos de partículas e outros tem reportado o

comportamento oposto.

Os métodos de homogeneização de alta energia podem reduzir a concentração de

tensoativo necessário para obter emulsões estáveis devido ao menor tamanho de gotícula que

pode ser obtido (Pinnamaneni et al., 2003). Os resultados experimentais obtidos mostraram

que as variáveis com maior influência na retenção de compostos bioativos de cravo foram a

composição da formulação e o método de secagem. Neste sentido, fatores como o consumo de

energia, o custo de operação e a facilidade de escalonamento devem ser considerados. O

método de homogeneização de alta pressão é amplamente utilizando em industrias

farmacêuticas e de alimentos devido ao curto tempo de processamento e a facilidade de

escalonamento (Pardeike et al., 2009). O método de ultrassom é também efetivo em baixa

escala, porém, o aumento de escala representa um desafio tecnológico.

5.5.1.8. Análises morfológicas

A morfologia das partículas atomizadas no spray dryer é afetada por fatores como a

velocidade com que ocorre a evaporação da água (cinética de secagem) e a composição da


formulação. No primeiro estágio da atomização na câmara do spray dryer, ocorre a secagem

da superfície da gotícula formando uma película ou crosta que atua como uma matriz

semipermeável. A água em forma de vapor difunde através desta matriz até atingir a superfície

da gotícula enquanto os compostos mais apolares ficam retidos (El-sayed, Wallack, & King,

1990). As bolhas de água podem evaporar violentamente, causando ruptura na superfície das

partículas, formando partículas rugosas (Walton & Mumford, 1999).

Como as condições de secagem e o teor de sólidos de todas as formulações foram

idénticos, as diferenças na morfologia das partículas podem ser associadas às características

de cada composição. Fatores como a capacidade de formação de filme do carreador de

secagem, o ponto de fusão do lipídeo e a interação do lipídeo com o extrato de cravo podem

afetar a morfologia das partículas (Rosenberg et al., 1990).

Nas imagens de microscopia eletrônica de varredura apresentadas na Figura 23,

observa-se que as partículas das formulações contendo maltodextrina DE10 (F1, F4, F5) são

mais esféricas que as partículas das outras formulações (F2, F3). As partículas da formulação

2 apresentam maior tendência à aglomeração e sua forma não é totalmente definida, o que

pode estar relacionado à utilização de lactose como carreador de secagem. A superfície

externa da maioria das partículas atomizadas no spray dryer apresenta aspecto enrugado,

como tem sido descrito por vários autores, na encapsulação de compostos voláteis por esta

técnica (Jafari et al., 2007; Paramita, Iida, Yoshii, & Furuta, 2010; Shah, Davidson, & Zhong,

2012; Shah, Ikeda, et al., 2012; Soottitantawat, Bigeard, et al., 2005; Soottitantawat,

Takayama, et al., 2005). A retenção de compostos voláteis, utilizando a técnica de spray

drying, é altamente influenciada pela concentração de sólidos da formulação e pela

temperatura de secagem, fatores diretamente relacionados com a velocidade de formação da

crosta semi-permeável e com a difusão dos compostos encapsulados (El-sayed et al., 1990).


Figura 23. Análises morfológicas das formulações lipídicas F1(a), F2 (b), F3 (c), F4 (d), F5

(e) por microscopia eletrônica de varredura.

b a

d c

e f


A morfologia das partículas obtidas por spray drying é muito diferente da morfologia

das partículas obtidas por liofilização as quais são planas, em forma de lâmina e com alta

porosidade, como observado na Figura 24. Estes resultados são esperados, pois as formas

arredondadas são obtidas quando as formulações são atomizadas, etapa não presente no

processo de liofilização.

Figura 24. Morfologia das partículas obtidas por spray drying e liofilização.

5.6. Influência do EHL do tensoativo na formulação e da temperatura de secagem

em spray drying

5.6.1. Retenção de eugenol e acetato de eugenol

De forma a avaliar a influência do EHL do tensoativo na retenção dos princípios ativos

do extrato de cravo nas formulações após secagem em spray dryer, foram preparadas 7

formulações com tensoativos ou mistura de tensoativos de diferentes valores de EHL.

A Figura 25 mostra a retenção de eugenol e acetato de eugenol, comparando o teor na

formulação líquida em relação ao teor presente na composição seca em spray dryer. As

variáveis estudadas foram o valor de EHL do tensoativo na formulação (EHL 2,0; 7,5; 13,0;

18,0; 23,0 e 29,0) e a temperatura do ar de entrada (90 e 140 °C). Observou-se claramente que

quando foi utilizada uma maior temperatura do ar de entrada (140 °C), as perdas de eugenol

(na faixa de 73,2 a 80,6 %) e acetato de eugenol (79,0 a 90,5 %) foram significativamente

maiores do que quando a atomização foi realizada com temperatura do ar de entrada de 90 °C

(eugenol na faixa de 44,0 a 60,5 % e acetato de eugenol de 39,5 a 55,1 %).

a b


Em alguns casos, altas temperaturas de secagem favorecem a retenção dos compostos

voláteis devido à rápida formação da camada superficial (crosta) semipermeável que permite a

evaporação da água e propicia a retenção dos voláteis. Este fenômeno depende, em grande

parte, da composição da formulação. No caso de formulações lipídicas, maiores temperaturas

de secagem podem fundi-las, causando a aderência das partículas à câmara de secagem e,

consequentemente, o aumento das perdas dos compostos a serem encapsulados. Desse modo,

cada formulação deve ser estudada, em particular, como mencionado por Reineccius (2004),

pois dependendo das propriedades físico-químicas dos componentes específicos, melhores

resultados podem ser obtidos, utilizando temperaturas de secagem menores.

Figura 25. Porcentagem de retenção de eugenol (a) e acetato de eugenol (b), após atomização

em spray dryer, em função do EHL da formulação e a temperatura do ar de secagem. Letras

ou números iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa entre as

amostras segundo o teste de Tukey (p≤0,05). *Devido ao alto desvio padrão esta amostra foi

excluída da análise de variância

b

a


Também foi observado que a recuperação do acetato de eugenol foi ligeiramente

menor em relação às perdas do eugenol (a 90 °C na faixa 39,5 a 55,1 % para o eugenol e 44,0

a 60,5 % para o acetato de eugenol; para 140 °C foi de 73,2 a 80,6 % para o eugenol e de 79,0

a 90,5 % para o acetato de eugenol). Esses resultados podem estar relacionados com a

estrutura molecular do acetato de eugenol que, possui maior peso molecular que o eugenol, e

provavelmente irá apresentar menor volatilidade e difusão na membrana semipermeável

formada.

Em relação ao EHL, foi observado que as perdas foram menores no EHL de 13 quando

foi utilizado Gelucire 50/13 como tensoativo. Valores de EHL superiores (18, 23 e 29) ou

inferiores (0; 2 e 7,5) resultaram em maiores perdas, tanto para o eugenol como para o acetato

de eugenol, nas duas temperaturas de secagem avaliadas (90 e 140 °C). O caráter lipofílico ou

hidrofílico do tensoativo, determinado por seu EHL, tem relação direta com a estabilidade da

emulsão. O tensoativo reduz a tensão superficial entre a fase oleosa e a aquosa, tornando a

formulação termodinamicamente mais estável. O EHL requerido para uma formulação lipídica

deve ser determinado para cada caso, pois está relacionado com a composição das fases, em

especial quando são utilizadas matrizes complexas, como é o caso dos extratos vegetais. Com

os resultados obtidos, comprova-se que o EHL do tensoativo também está relacionado com a

retenção de compostos bioativos durante a secagem por spray drying de sistemas lipídicos

incorporando ativos vegetais.

5.6.2. Perda por dessecação e atividade de água

Os resultados de perda por dessecação são apresentados na Figura 25 e são importantes

como indicativo do teor de umidade e de compostos voláteis, presentes nas amostras. Em

primeiro lugar, notou-se que na maior temperatura de secagem (140 °C), a perda por

dessecação foi menor (5,74 a 11,14 %) do que a 90 °C (9,30 a 13,10 %). A possível causa

para este comportamento pode estar relacionada à maior perda de compostos voláteis durante

o processo. A pesar da formulação com EHL 13 apresentar uma alta retenção de eugenol e

acetato de eugenol, a perda por dessecação foi inferior às outras formulações. Uma possível

explicação para este comportamento é que a eficiência de encapsulação foi melhor nesta

formulação e as partículas conseguem reter os compostos voláteis mais eficientemente,

reduzindo assim o valor da perda por dessecação.


Os valores de perda por dessecação apresentados na Figura 26 são elevados em relação

aos resultados de umidade para pós obtidos por spray drying, que geralmente são da ordem de

1 a 6 % (Reineccius, 2004). Porém se deve levar em consideração que essa medida também

inclui o teor de compostos voláteis presentes nas amostras analisadas.

A Tabela 10 apresenta os resultados de atividade de água para as composições secas

sendo observados valores abaixo de 0,5 que é o limite considerado seguro

microbiologicamente (Keey, 1992; Labuza & Altunakar, 2007). Para formulações lipídicas,

valores muito baixos de atividade de água não são recomendadas devido a elevar o risco de

oxidação lipídica durante o armazenamento. Assim os resultados experimentais deste estudo,

estiveram na faixa de 0,257 a 0,483 podem ser considerados como adequados para diminuir o

risco de degradação química, física e microbiológica do produto.

Figura 26. Perda por dessecação das formulações sólidas obtidas por spray drying.


Tabela 10. Atividade de água das formulações sólidas obtidas por spray drying no estudo da

influência do EHL do tensoativo.

Formulação Temperatura do ar de entrada

90 °C 140 °C

EHL 0 0,290 ± 0,007 0,382 ± 0,014

EHL 2 0,316 ± 0,008 0,319 ± 0,005

EHL 7,5 0,315 ± 0,006 0,483 ± 0,005

EHL 13 0,298 ± 0,008 0,312 ±0,003

EHL 18 0,292 ± 0,002 0,438 ± 0,005

EHL 23 0,297 ± 0,005 0,371 ± 0,012

EHL 29 0,257 ± 0,005 0,373 ± 0,003

5.6.3. Tamanho de partícula

O tamanho de partícula dos pós obtidos a partir das formulações lipídicas preparadas

com tensoativos de diferentes EHL, determinado pelo método de difração da luz (light

scattering) no modo líquido, é apresentado na Figura 27. Observou-se que o tamanho médio

de partícula expresso como d50 foi um pouco maior quando a temperatura de secagem foi de

140 °C (faixa de 13,88 a 19,48 µm) em relação a 90 °C (faixa de 10,42 a 15,18 µm), para

todas as formulações.

Comparando o EHL, não foi observado um padrão de comportamento, sendo que os

resultados foram muito similares com tamanhos na faixa de 10 a 20 µm, representando valores

típicos de partículas obtidas por spray drying (Cortés-Rojas & Oliveira, 2012; Obón,

Castellar, Alacid, & Fernández-López, 2009; Oliveira, Bott, & Souza, 2006; Sansone et al.,

2011). Outro fator que pode ter influência nesta resposta é o fato que as formulações secas na

temperatura de 140 °C foram coletadas do ciclone onde ficaram aderidas enquanto que as

formulações secas a 90 °C foram recuperadas do frasco coletor.


Figura 27. Tamanho de partícula dos pós obtidos por spray drying a partir das formulações

lipídicas no estudo da influência do EHL do tensoativo.

5.6.4. Morfologia das partículas

A morfologia das partículas sofreu influência do EHL, como pode ser observado na

Figura 28. Quando não foi utilizado tensoativo (EHL 0) e a temperatura de secagem foi de 90

°C, as partículas apresentaram uma forma arredondada, mas pouco definida e com bastante

variação no tamanho (Figura 28). Na formulação com tensoativo de EHL 2 (Gelucire 50/2) e

utilizando temperatura de secagem de 90 °C, as partículas apresentaram uma forma

arredondada e enrugada (Figura 28b). Na formulação de EHL 13 (Gelucire 50/13) são

apresentadas imagens das micropartículas obtidas à 90 °C (Figura 28c) e à 140 °C (Figura

28d). É possível observar que a morfologia das partículas foi afetada pela mudança na

temperatura de secagem. Quando se utilizou a menor temperatura, as partículas apresentaram

aspecto enrugado similar às partículas obtidas na formulação de EHL 2. Na temperatura de

secagem maior (140 °C), as partículas apresentaram forma esférica e aspecto superficial liso,

sendo possível observar um fragmento de parede de uma partícula com espessura de 798,3 nm

(Figura 28e).

A morfologia das partículas obtidas por spray drying tem influência da cinética de

secagem durante a formação da partícula. Nos estágios iniciais da secagem, a capa superficial

da gotícula atomizada começa a formar uma crosta e posteriormente as bolhas do líquido em

evaporação atingem a superfície da partícula (El-sayed et al., 1990). Elevadas temperaturas

de secagem maiores aceleram a formação da crosta que tem relação com a superfície de

partícula mais lisa observado para o produto obtido a 140 °C.


Figura 28. Imagens (MEV-FEG) dos sistemas particulados da formulação EHL 0 à 90 °C (a),

EHL 2 à 90 °C (b), EHL 13 à 90 °C (c), EHL 13 à 140 °C (d), fragmento de parede de

partícula da formulação EHL 13 à 140 °C (e), EHL 29 à 90 °C (f).

a b

d c

f e


5.7. Influência da proporção dos componentes na formulação

Baseado nas etapas iniciais do projeto, nas quais foram selecionados os principais

componentes da formulação, esta fase do projeto avaliou a influência da quantidade relativa

desses componentes selecionados: fase lipídica, tensoativo e a proporção goma

arábica:maltodextrina DE10. A composição das sete formulações preparadas estão

apresentadas na Tabela 3. O tamanho de partícula das sete formulações em estado líquido é

apresentado na Tabela 11. Observa-se que o tamanho de partícula das formulações P6 e P7 é

maior do que as demais formulações. O tamanho de partícula da formulação P5 é ligeiramente

superior do que as formulações P1, P2, P3 e P4 porém as diferenças não são significativas.

Este comportamento pode estar relacionado com o incremento da proporção de fase lipídica e

tensoativo. Resultados similares foram obtidos por Das et al. (2012), durante a preparação de

formulações lipídicas contendo clotrimazol, o aumento do tamanho de partícula como

consequência do aumento da fase lipídica foi atribuído à diminuição da eficiência da

distribuição da energia de sonicação em dispersões mais concentradas.

Tabela 11. Tamanho de partícula médio das formulações líquidas elaboradas para o estudo da

influência da proporção dos componentes da formulação.

Formulações Media D.P.

P1 5,086 3,806

P2 4,988 3,925

P3 5,244 3,822

P4 4,991 4,199

P5 5,781 6,396

P6 6,239 4,514

P7 6,532 5,799

O estudo da reologia tem grande importância do ponto de vista farmacêutico pois

excerce influência na estabilidade física, propriedades organolépticas, absorção e com o

processo de fabricação (Lieberman et al., 1996). No processo de spray drying a viscosidade

das formulações também é de grande importância pelo fato de estar diretamente relacionado

com as características das gotículas atomizadas, que vão entrar em contato com a corrente de


ar aquecido (Reineccius, 2004). Assim, procedeu-se à caracterização reológica das

formulações. A Figura 29 apresenta os resultados dessa caracterização. Foram observadas

grandes diferenças na viscosidade dependendo da composição da formulação. As formulações

P1, P2, P3 e P4 apresentaram baixa viscosidade, sobreposição das curvas ascendentes e

descendente e comportamento reológico pseudo-plástico, ou seja, o material começa a fluir

quando uma tensão de cisalhamento é aplicada. As formulações P5, P6 e P7 apresentaram

viscosidade significativamente maior o qual pode estar relacionado com o aumento da

proporção da fase lipídica e no caso das formulações P6 e P7 aumento também da proporção

do tensoativo. É importante resaltar que as formulações P5 e P7 apresentaram tixotropia, onde

ocorre uma diminuição da viscosidade em função do tempo de deformação. A proporção de

mistura de goma arábica com maltodextrina também pode estar relacionado com a alta

viscosidade apresentada pelas formulações P6 e P7. A goma arábica possui uma estrutura

ramificada e cadeias longas, esta estrutura favorece o aumento da viscosidade e por tal motivo

este material é utilizado como agente espesante. Carneiro et al. (2013) prepararam diferentes

emulsões utilizando como carreador diferentes misturas de maltodextrina com goma arábica,

proteína de soro de leite e amidos modificados (Hi-cap, Capsul), os resultados mostraram que

a combinação de maltodextrina com goma arábica apresentou a maior viscosidade. Outros

estudos também observaram esse comportamento (Bule, Singhal, & Kennedy, 2010;

Fernandes et al., 2008; Soottitantawat et al., 2003).


Figura 29. Reogramas das formulações preparadas para o estudo do efeito da proporção dos

componentes da formulação. P1(a), P2 (b), P3 (c), P4 (d), P5 (e), P6 (f) e P7 (g).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)

Taxa de cisalhamento (1/s)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150 200 250 300

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 50 100 150 200 250 300 350

Ten

são

de c

isa

lha

men

to (

Pa

)


1ra Rampa (Ascendente) 2nda rampa (Descendente) 3ra rampa (Ascendente 2)

a b

c d

e f

g


Avaliou-se também a estabilidade física das formulações líquidas pelo método de

centrifugação, e foram selecionadas as formulações P2 e P5 as quais apresentaram menor

separação de fases. Estas duas formulações foram secas por spray drying utilizando condições

previamente selecionadas. O resultado da retenção de eugenol após o processo de spray

drying é apresentado na Figura 30. Observa-se que a formulação P2 apresentou maior

retenção do que a formulação P5, o que pode estar relacionado com a viscosidade.

Formulações muito viscosas retardam o processo de formação da gotícula no atomizador o

qual promove uma maior perda de compostos voláteis durante a secagem (Reineccius, 2004).

Da mesma forma, viscosidades muito baixas podem dificultar a formação da membrana

semipermeável. Assim, de forma de melhorar a retenção dos compostos voláteis é

recomendável um alto teor de sólidos e uma viscosidade alta, porém estes valores devem ser

otimizados para cada caso em particular. Como foi mostrado previamente, a formulação P5 é

muito mais viscosa do que a P2 o que pode explicar a maior perda de eugenol durante a

secagem. Em um estudo realizado por Christensen et al. (2001) foram preparadas emulsões

o/w e submetidas ao processo de spray drying, utilizando hidroxipropil metil celulose

(HPMC) em diferentes concentrações como carreador de secagem. Observou-se aumento da

viscosidade com o aumento da concentração de HPMC o que ocasionou entupimento do bico

atomizador, concluindo-se que baixas concentrações de HPMC foram mais eficientes na

secagem e posterior reconstituição das emulsões.

Figura 30. Retenção de eugenol após spray drying das formulações selecionadas P2 e P5 no

estudo da influencia da proporção dos componentes da formulação.

Na Tabela 12 são apresentados os resultados da recuperação de massa após o processo

de spray drying, onde é possível observar que a formulação P2 teve melhor recuperação do

que a P5. Este fato pode estar relacionado a fatores como a maior proporção de fase lipídica

na formulação P5 que por sua vez afeta a viscosidade e por tanto o processo de formação da

gotícula atomizada como foi descutido anteriormente. A diferença na proporção de


maltodextrina:goma arábica também pode contribuir com este efeito. Os resultados de perda

por dessecação estão correlacionados com os valores de retenção de eugenol, sendo que a

formulação P2 teve maior retenção de eugenol e maior valor de perda por dessecação. Com

relação à atividade de água foi observado que as duas formulações apresentaram valores

apropriados que favorecem a estabilidade do produto seco.

Tabela 12. Caracterização das partículas sólidas obtidas por spray drying das formulações

preparadas para avaliar o efeito da proporção dos componentes da formulação.

Análises P2 P5

Recuperação de massa após spray drying ( % ) 45,0 ± 2,1 11,82 ± 3,8

Perda por dessecação ( % ) 14,8 ± 0,9 7,90 ± 1,3

Atividade de água ( - ) 0,26 ± 0,014 0,299 ± 0,014

5.8. Comparação formulação lipídica e não lipídica

Nas etapas anteriores do projeto foi possível estudar o efeito de diferentes

componentes da formulação: fase lipídica, tensoativos e carreadores de secagem assim como a

influência da proporção de cada um destes componentes. Da mesma maneira, foram avaliadas

variáveis do processo tais como o efeito dos métodos de homogeneização e secagem. O qual

permitiu obter uma formulação lipídica otimizada.

Esta etapa do projeto teve por objetivo comparar a formulação lipídica com uma

formulação sem lipídeos avaliando-se o efeito dos diferentes componentes da formulação nas

propriedades físico-químicas do produto seco. Foi determinada retenção de eugenol após

secagem, tamanho de partícula, dispersibilidade em água, atividade de água, avaliação do

estado cristalino (Raios-X), comportamento térmico (DSC), microscopía confocal e

microscopía eletrônica de varredura. Posteriormente as formulações lipídica e sem lipídeos

foram avaliadas quanto à estabilidade acelerada em temepraturas de 25 e 40 °C e umidades de

32,4 e 63,5 %. A permeação intestinal in vitro foi avaliada utilizando células Caco-2.

Foram preparadas cinco formulações. A formulação CSD1 foi preparada sem o lipídeo

líquido (óleo de buriti), a formulação CSD2 não contem o lipídeo sólido (Compritol), a

formulação CSD3 foi preparada sem o tensoativo (Gelucire 50/13), a formulação CSD4 é a

formulação lipídica completa contendo lipídeo sólido e líquido, tensoativo e carreador de


secagem. A formulação CSD5 é o extrato seco de cravo utilizando como carreador de

secagem a goma arábica.

5.8.1. Avaliação das propriedades fisico-químicas

Na produção de formulações sólidas contendo plantas medicinais, é muito importante

monitorar o teor dos compostos bioativos durante as etapas envolvidas. O processo de spray

drying implica um aumento da temperatura para a evaporação do solvente e representa uma

etapa crítica para a degradação ou evaporação dos compostos. A composição da formulação é

fundamental para a retenção da atividade biológica associada aos princípios ativos presentes

no material vegetal. O cravo da Índia é classificado como uma das plantas com maior

atividade antioxidante, que tem sido associada com a presença de eugenol, um composto

volátil. O mecanismo antioxidante atribuído ao eugenol está relacionado com sua estrutura

molecular característica, a qual possuí um anel aromático conjugado com uma cadeia alifática

com dupla ligação. Este tipo de estrutura é similar à apresentada pelo resveratrol que é o

composto associado com as propriedades benéficas do vinho tinto (Gülçin, 2011).

Na Figura 31 são apresentados os resultados da influencia da composição da

formulação na retenção de eugenol e na atividade antioxidante. É observado que o

comportamento foi similar para estas duas respostas, isto indica que a atividade antioxidante

está diretamente relacionada com o teor de eugenol. Um dos motivos para a diminuição da

retenção dos compostos bioativos após a atomização no spray dryer é a quebra da gotícula da

formulação no momento da atomização. Diferentes variáveis estão relacionadas com este

fenômeno como por exemplo baixo teor de sólidos, pouca proporção de carreador de secagem

com respeito ao núcleo (material a ser encapsulado), fragilidade da parede formada ou baixa

temperatura de transição vítrea dos carreadores de secagem entre outros.


Tabela 13. Propriedades físico-químicas das formulações elaboradas para o estudo da

influência do lipídeo na formulação.

Form.

Recuperação

de massa após

spray drying

(%)

Tamanho de

partícula

(µm)

Perda por

dessecação

(%)

Dispersibilidade

(%)

Atividade de

água (-) Liquida Sólida

CSD1 34,5 11,7 7,2 15,0 ± 0,4 76,4 ± 7,4 0,289 ± 0,003

CSD2 10,4 8,6 5,8 9,97 ± 1,3 82,2 ± 7,7 0,284 ± 0,014

CSD3 46,7 7,9 5,2 14,2 ± 0,1 74,2 ± 0,7 0,256 ± 0,005

CSD4 38,7 14,4 5,3 11,5 ± 1,2 76,0 ± 2,4 0,313 ± 0,002

CSD5 56,2 6,3 5,2 13,9 ± 1,0 78,4 ± 0,4 0,307 ± 0,010

Figura 31. Porcentagem de retenção de eugenol e da atividade antioxidante dos pós obtidos

por spray drying das formulações preparadas para o estudo da influência do lipídeo

apresentadas na Tabela 5.

As formulações que apresentaram maior retenção de eugenol foram CSD3, CSD5 e em

menor proporção CSD4, como as condições de preparo e secagem das formulações foram

iguais, variáveis operacionais podem ser descartadas e as diferenças na retenção podem ser

associadas à capacidade de encapsulação dos componentes da formulação. A composição da

formulação está diretamente relacionada a fatores como a estabilidade da emulsão, a

facilidade com que a gotícula quebra durante a atomização e a capacidade de formar a camada

externa da partícula durante a secagem, entre outros.


Quando a formulação é atomizada no spray dryer as gotículas geradas entram em

contato com a corrente de ar quente evaporando o solvente e formando a crosta externa das

partículas (El-sayed et al., 1990). A adição de lipídeos na formulação pode interferir neste

processo, na medida em que altera as propriedades da crosta externa das partículas e diminui a

temperatura de transição vítrea. Este efeito também está relacionado com a adesão das

partículas à câmara de secagem o que resulta em uma menor recuperação de produto após o

processo de spray drying. Dollo et al. (2003) estudaram o efeito da proporção de fase lipídica

em relação ao teor de sólidos composto pelo material de parede, maltodextrina DE12,6 e o

tensoativo, caseinato de sódio no processo de spray drying utilizando Tge de 110 °C e Tgs 65-

75 °C. Os resultados mostraram que a proporção de sólidos (maltodextrina e caseinato de

sódio) deve ser 1,35 vezes maior do que a fase lipídica para poder o pó pelo processo de spray

drying.

Munoz-Ibanez et al. (2015) estudaram os principais fatores que influenciam o processo

de spray drying de emulsões. Foram levadas em consideração as intensas forças de

cisalhamento e elongação sofridas pela emulsão durante a etapa de atomização. Estas forças

de estresse durante a formação da gotícula podem ocasionar deformação e ruptura da estrutura

da emulsão dependendo das suas propriedades físico-químicas e de fatores operacionais

relacionados com a atomização. Dentre as propriedades da emulsão a viscosidade e o tamanho

de partícula mostraram ter efeito significativo. Foi considerado que a relação da força interna,

correspondente à tensão superficial da emulsão, e a força externa, provocada pelo meio

externo onde se encontra a emulsão, determinam a ruptura da gotícula. Os resultados do

estudo mostraram que altas viscosidades e tamanhos de partícula maiores promovem a ruptura

da emulsão quando as forças de cisalhamento e tensão do processo de atomização estão

envolvidas. Com relação às condições operacionais a influência das variáveis depende do tipo

de atomizador, com o atomizador de duplo fluído a vazão de ar teve efeito significativo e no

caso do atomizador rotacional foi a velocidade de rotação.

Os resultados de recuperação de produto estão apresentados na Tabela 13 e mostram

que a formulação CSD2 teve a menor recuperação. Também é observado que as formulações

CSD3 e CSD5 apresentaram os maiores valores de eficiência de produção do pó. Estes

resultados estão diretamente relacionados com os resultados de retenção de eugenol e

atividade antioxidante (Figura 31). A presença de compritol e gelucire 50/13 tem um efeito

direto na aderência das partículas à câmara de secagem e por tanto no resultado de

recuperação de produto. O ponto de fusão do Gelucire é de 50 °C é do compritol na faixa de


65 a 77 °C (Rowe et al., 2006). A temperatura atingida pelas formulações durante a secagem

(temperatura do ar de saída) foi de 65 ± 0,7 °C, isto explica a tendência das formulações

contendo gelucire a aderir-se em maior grau ao equipamento. Comparando a formulação

CSD1 com a formulação CSD4 é observado que a adição de óleo de buriti diminuiu a

recuperação, da mesma forma, comparando a formulação CSD1 com a CSD3 é observado que

a adição de Gelucire diminuiu a recuperação de produto. A formulação CSD2 a qual contém

gelucire, (sem o Compritol) apresentou menor recuperação de produto. Dependendo da

condição de secagem, em especial da temperatura utilizada, a adição de compostos com baixo

ponto de fusão dificulta o processo de secagem. Foi observado que a adição de lipídeos

aumenta a adesão das partículas ao equipamento. Problemas de aderência foram encontrados

na secagem de emulsões redispersíveis de espironolactona por spray drying e leito fluidizado

utilizando Gelucire 50/13 e uma combinação de manitol e maltodextrina como carreadores de

secagem (Bourezg et al., 2012). Além das propriedades inerentes à formulação outros

parâmetros relacionados com o equipamento podem influenciar a aderência das partículas, tais

como a geometria da câmara de secagem, o padrão de fluxo do ar de secagem dentro da

câmara e o material da câmara de secagem entre outros (Keshani, Daud, Nourouzi, Namvar, &

Ghasemi, 2015).

Os resultados da perda por dessecação (Tabela 13) mostram que a formulação CSD2

apresentou o menor valor. Por outro lado, as formulações CSD3 e CSD5 mostraram resultados

similares. É importante resaltar que a perda por dessecação mede tanto o teor de umidade

como a quantidade de compostos voláteis presentes nas amostras. O cravo da Índia possui

diferentes tipos de compostos voláteis tais como eugenol, α-humuleno e β-cariofileno entre

outros. Por tanto, em amostras com teor de umidade similar, quanto maior o teor de

compostos voláteis maior o resultado da perda por dessecação. Desta forma, os resultados da

retenção de eugenol são correlacionados com os resultados da perda por dessecação e com os

resultados de recuperação de produto.

Os ensaios da dispersibilidade dos pós em água (Tabela 13) mostram que a presença de

gelucire e compritol na formulação tem efeito direto nesta propriedade. Gelucire é um

tensoativo solúvel em água, enquanto o compritol é um lipídeo insolúvel em água. Como

apresentado na Tabela 13, a dispersibilidade em água da formulação CSD2 foi superior a

maior. As formulações contendo Compritol (CSD1, CSD3 e CSD4) apresentaram resultados

muito similares entre elas. A formulação CSD5 apresentou uma dispersibilidade ligeiramente

maior do que as formulações contendo Compritol, porém como foi citado anteriormente, a


adição de Gelucire aumenta a dispersibilidade do pó o qual pode ser observado comparando a

formulação CSD5 com CSD2.

A técnica de difração de raios-x na área farmacêutica é utilizada para o estudo de

propriedades estruturais de fármacos puros, relação estrutura atividade e na avaliação de

sistemas de liberação de fármacos. O uso desta técnica tem aumentado não só pela

importância da caracterização dos materiais como também pelo aumento da disponibilidade de

equipamentos que permitem obter cada vez mais informações (Dong & Boyd, 2011). Em

formulações lipídicas o estudo a estrutura das matrizes formadas utilizando a técnica de raios-

x tem sido correlacionada com a eficiência de encapsulação e com a estabilidade (Müller,

Radtke, & Wissing, 2002). Os resultados de difração de raios-X das formulações avaliadas

estão apresentados na Figura 32. É possível observar variações no estado cristalino

dependendo da composição da formulação. No caso das formulações CSD2 e CSD5, observa-

se o predomínio do estado amorfo o qual pode ser explicado pela ausência do compritol o qual

é um lipídeo que apresenta estado cristalino. A goma arábica é um material amorfo e confere

esta característica às formulações. A intensidade do difractograma da formulação CSD2 é a

maior provavelmente pela presença de gelucire. Apesar deste material apresentar-se em estado

cristalino, sua baixa proporção na formulação produz pequenas mudanças no comportamento

cristalino da formulação CSD2, o que pode ser observado ao comparar-se as formulações

CSD2 com a CSD5. Por outro lado, as formulações contendo compritol (CSD1, CSD3 e

CSD4) apresentaram maior grau de cristalinidade além do comportamento conferido pela

goma arábica. As formulações contendo compritol e gelucire (CSD1 e CSD4) apresentaram

picos mais intensos do que a formulação contendo só compritol (CSD3). O grau de

cristalinidade das amostras está relacionado com a estabilidade da formulação, materiais

predominantemente cristalinos podem ocasionar a expulsão do fármaco da matriz com maior

facilidade (Bott et al., 2010; Müller, Mäder, & Gohla, 2000). Materiais com menor grau de

organização como no caso de materiais amorfos geram imperfeições estruturais permitindo

uma maior e melhor acomodação do fármaco na matriz, diminuindo a probabilidade de

expulsão (Müller, 2007; Pardeike et al., 2009).


Figura 32. Difractogramas de raios-X das formulações preparadas para avaliar o efeito dos

componentes da formulação (a). Difractogramas do compritol (b), gelucire 50/13 (c), goma

arábica (d).

Dando continuidade ao estudo das propriedades físicas do produto optido foi realizada

a análise de calorimetria exploratoria diferencial (DSC). Esta técnica é utilizada no estudo do

estado cristalino dos materiais e na detecção de estruturas polimórficas de fármacos ou

excipientes. Os termogramas das formulações apresentados na Figura 33 complementam os

resultados obtidos por difração de raios-x e mostram que o estado amorfo predomina em todas

as formulações. As formulações contendo compritol (CSD1, CSD3 e CSD4) apresentaram um

comportamento levemente diferente com picos entre 60 e 70 °C. Os termogramas dos

adjuvantes puros: compritol, gelucire 50/13 e da goma arábica são apresentados na Figura

33b, 33c e 33d respectivamente, e foram similares aos obtidos por outros autores (Ahmad,

Mazumdar, & Kumar, 2013; Brubach et al., 2007; El-badry, Fetih, & Fathy, 2009; Hamdani,

Moës, & Amighi, 2003). Brubach et al. (2007) realizaram uma caracterização detalhada do

compritol utilizando difração de raios-x, DSC e espectroscopia infravermelho mostrando que

o elevado grau de polimorfismo deste composto que depende da velocidade de cristalização.

As diferentes conformações que os ácidos graxos unidos ao glicerol podem adotar em função

b c d

a


da temperatura dão origem ao complexo comportamento polimórfico o qual tem relação direta

com a liberação dos fármacos desta matriz. Por outro lado, o comportamento térmico da goma

arábica e complexos iodados deste material foram estudados por Ahmad et al. (2013).

Segundo os autores o largo pico endotérmico apresentado em torno de 78 °C pode estar

relacionado à fusão e parcial decomposição térmica do complexo polissacarídeo que possui

diferentes açúcares ramificados. A acetilação da goma arábica ocasionou aumento da

temperatura de transição vítrea, por outro lado a iodinização diminuiu o valor.

Figura 33. Termogramas das formulações preparadas para o estudo da influência dos

componentes (CSD) e dos adjuvantes: Compritol (b), Gelucire 50/13 (b) e goma arábica (c).

A morfologia das partículas foi realizada utilizando microscopia eletrônica de

varredura (MEV). As imagens obtidas estão apresentadas na Figura 34. Observou-se que a

morfologia e tamanho das partículas foi muito similar, porém, a formulação CSD2 apresenta

maior presença de aglomerados. A aglomeração pode estar relacionada com a adição do

gelucire 50/13 que devido ao seu baixo ponto de fusão (50 °C) tende a fundir mais facilmente

promovendo a aglutinação das partículas. Observa-se que as partículas da formulação CSD3

que qual contém compritol e não contém gelucire apresentam menor aglomeração. A

a

b c d


superfície externa da maioria das partículas apresenta aspecto enrugado, como tem sido

descrito por vários autores, na encapsulação de compostos voláteis por esta técnica (Jafari et

al., 2007; Lacatusu, Badea, Ovidiu, Bojin, & Meghea, 2012; Paramita et al., 2010; Shah,

Ikeda, et al., 2012; Soottitantawat, Bigeard, et al., 2005; Soottitantawat, Takayama, et al.,

2005). A morfologia das partículas está relacionada com a velocidade de formação da crosta,

que por sua vez está relacionada com concentração de sólidos da formulação e pela

temperatura de secagem (El-sayed et al., 1990).

As imagens da microscopia confocal da formulação lipídica são apresentadas na Figura

35. Esta técnica tem sido utilizada para a visualização da distribuição das fases lipídica e

aquosa em emulsões (Aditya et al., 2015; Drusch & Berg, 2008; Schuster et al., 2012).

Também pode ser utilizada para avaliar qualitativamente o processo de encapsulação e de

homogeneização (Lamprecht et al., 2000). Outra vantagem da microscopia confocal é a

possibilidade de visualizar o interior da partícula através de cortes ópticos.

Observa-se que na formulação líquida (Figura 35a) as gotículas de lipídeo (vermelhas)

encontram-se distribuídas uniformemente no meio aquoso mostrado na cor verde. A imagem

das partículas redispersas em água (Figura 35b) também mostram uma distribuição

homogênea da fase lipídica, indicando que o lipídeo encapsulado pode ser liberado após a

camada externa da partícula é dissolvida em água. Por outro lado, quando a partícula é

colocada em um solvente que não solubiliza a camada externa, como é o caso do isopropanol,

observa-se (Figura 35c) a partícula com o corante marcador da fase aquosa na parte externa

(verde) e a fase lipídica dentro das partículas (Figura 35d).


Figura 34. Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das partículas

sólidas de cada formulação no estudo da influência dos componentes. CSD1 (a), CSD2 (b),

CSD3 (c), CSD4 (d) e CSD5 (e).

a b

c d

e


Figura 35. Imagens obtidas por microscopia confocal da formulação lipídica CSD5 com os

corantes vermelho do Nilo e FITC. Formulação líquida (a), Formulação sólida dispersa em

água (b), formulação sólida dispersa em isopropanol (c) e ampliação das partículas da

formulação sólida dispersa em isopropanol (d).

5.8.2. Estudo de estabilidade

Com o objetivo de determinar a influencia das propriedades físico-químicas das

formulações obtidas sobre sua estabilidade, foram selecionadas duas formulações. A

formulação CSD4 corresponde à formulação lipídica (com todos os componentes) e a

formulação CSD5 composta pelo extrato de cravo da Índia e o carreador de secagem (goma

arábica). Os resultados da retenção de eugenol em diferentes condições de armazenamento são

apresentados na Figura 36. Observa-se que a amostra com a menor retenção de eugenol foi a

formulação CSD5 nas condições de armazenagem mais agressivas (40 °C e 63,5 % U.R.),

entretanto, a mesma amostra nas condições de armazenagem a 25 °C e 32,4 % U.R.

a b

c d


apresentou a maior retenção de eugenol. Também se observa que a retenção de eugenol na

formulação lipídica (CSD4) foi maior a 25 °C do que a 40 °C, em cada uma destas

temperaturas o comportamento foi similar para as duas U.R. avaliadas 32,4 e 63,5%. Isto

mostra que a temperatura é o fator que apresenta maior influência na estabilidade desta

formulação. No caso da formulação sem lipídios (CSD5), observa-se que a umidade tem

maior impacto sobre a estabilidade. Na umidade relativa de 32,4 % as amostras armazenadas

tanto a 25 como a 40 °C apresentaram alta retenção de eugenol. Por outro lado, na U.R. de

63,5 % a amostra armazenada a 40 °C apresentou degradação de eugenol consideravelmente

maior do que a amostra armazenada a 25 °C. Comparando as duas formulações é observado

que nas condições de elevada U.R., a formulação lipídica (CSD4) é mais estável do que a

formulação não lipídica (CSD5). Além disso, nas condições de armazenagem mais extremas

(40 °C e 63,5% U.R) a formulação CSD4 é significativamente mais estável do que a

formulação não lipídica (CSD5). Estes resultados podem ser explicados pelo fato que os

lipídeos formam uma barreira hidrofóbica em condições de alta umidade. Este efeito não é

proporcionado pela formulação não lipídica e por tanto a água pode penetrar facilmente no

produto seco causando hidrolise e outras reações de degradação que afetam a estabilidade dos

compostos encapsulados. Os resultados da degradação de eugenol foram ajustados a um

modelo de cinética de ordem zero, indicando que a degradação é independente da

concentração. A maioria dos produtos farmacêuticos seguem a cinética de ordem zero em

armazenamento de longo prazo, sendo o ajuste dos dados realizado por regressão linear

(Oriqui & Mori, 2013).

A pesar do eugenol ser o composto majoritário da planta, que foi monitorado, o cravo

da Índia é uma planta aromática com diversos compostos voláteis os quais não foram

monitorados neste estudo mas que estão presentes nas amostras. A variação de peso das

amostras durante o estudo de estabilidade é apresentado na Figura 37. Estes resultados

complementam os resultados da retenção de eugenol apresentados na Figura 31. É claramente

observado que a formulação lipídica teve menor variação de peso do que a formulação não

lipídica em todas as condições de armazenamento avaliadas. Em ambos os casos (CSD4 e

CSD5) as maiores perdas de peso foram a 40 °C e 32,4 % U.R. e as menores perdas a 25 °C e

63,5 % U.R. Após 14 dias a variação de peso da maioria das amostras atingiu o equilíbrio. É

esperado que amostras contendo teores elevados de óleos voláteis quando armazenadas a

maiores temperaturas apresentam significativa perda de voláteis. Se a redução de peso é

correlacionada com a perda de compostos voláteis, as formulações lipídicas melhoram a


retenção destes compostos, provavelmente devido a que os lipídeos promovem o fechamento

dos poros ou canais reduzindo a difusão dos compostos do interior para a superfície das

partículas (Prata, Garcia, Tonon, & Hubinger, 2013).

Figura 36. Estudo de estabilidade das formulações CSD4 e CSD5 mostrando a retenção de

eugenol em duas temperaturas (25 e 40°C) e duas umidades relativas (32,4 e 63,5%).

O teor de umidade das amostras determinado por Karl Fischer mostrou que após sete

dias é atingido estado de equilíbrio. A média do teor de umidade depois de atingir o estado de

equilíbrio é apresentado na Tabela 14. Observa-se que a umidade é maior na amostra não

lipídica (CSD5) do que na formulação lipídica (CSD4) podendo estar relacionado à formação

de uma barreira hidrofóbica pelos lipídeos. Também foi observado que um maior teor de

umidade relativa e uma menor temperatura aumenta a umidade da amostra nas duas

formulações avaliadas.


Tabela 14. Teor de umidade media e parâmetros de ajuste ao modelo de cinética de

degradação de ordem zero.

Formulação e condição

de armazenamento

Teor de

umidade media

(%)

Modelo

Ordem-zero

k (% dia-1

) R2

CSD4 25°C 32,4% U.R. 6,2 ± 0,4 0,6163 0,972

63,5% U.R. 9,8 ± 2,4 0,6989 0,969

CSD4 40°C 32,4% U.R. 5,3 ± 0,4 1,4746 0,949

63,5% U.R. 7,9 ± 1,4 1,6205 0,991

CSD5 25°C 32.4% U.R. 7,3 ± 1,0 0,0703 0,744

63,5% U.R. 11,3 ± 3,2 1,1417 0,987

CSD5 40°C 32,4% U.R. 6,4 ± 0,5 0,1687 0,864

63,5% U.R. 9,5 ± 2,2 1,8566 0,919

Figura 37. Variação de peso das formulações secas CSD4 e CSD5 durante o estudo de

estabilidade.


5.8.3. Permeação intestinal in vitro usando células CaCo-2

O modelo de células CaCo-2 tem sido utilizado por muitos anos para a predição da

absorção oral de fármacos em humanos, medindo a habilidade de um composto para

atravessar uma barreira intestinal simulada por uma monocamada de celular. Devido à boa

correlação in vitro - in vivo e à possibilidade de estudar o mecanismo de transporte o uso de

este método como uma ferramenta de screening tem aumentado. Neste caso, este modelo foi

utilizado para determinar o efeito da presença de lipídeos na formulação.

O primeiro passo para realizar este estudo é definir a faixa de toxicidade do composto

de maneira a garantir e preservar a integridade da monocamada de células. Métodos Redox

como MTT tem sido amplamente utilizados. Os resultados das análises realizadas com

eugenol pelo método de MTT mostraram que as concentrações de 100 e 150 µg/mL não são

toxicas para as células e por tanto foram selecionadas para a realização do experimento de

permeação intestinal in vitro com eugenol e para estudar o mecanismo envolvido.

Para determinar se o eugenol é substrato de alguma das bombas de efluxo expressas

pelas células CaCo-2 (no compartimento apical) e para estudar o efeito da concentração na

permeação foi realizado o experimento de permeação em duas direções, apical - basal e basal -

apical. Os resultados estão apresentados na Figura 38 e mostram que não há diferença

significativa entre os experimentos realizados em duas direções nem variando a concentração.

Devido a que o efeito das bombas de efluxo ser é observado unicamente no compartimento

apical da monocamada de células, diferenças significativas (proporção de 1 para 3) indicariam

um efeito de transporte ativo. Quando a permeabilidade de um composto é significativamente

maior na direção basal - apical do que apical - basal, o composto pode ser substrato de uma

bomba de efluxo, para confirmar este comportamento são utilizados inibidores das bombas de

efluxo. Compostos como azitromicina, prazosin, eritromicina e quinidine apresentam este

comportamento (Yee, 1997). Compostos absorvidos paracelularmente apresentam um

coeficiente de permeação similar nas duas direções, por outro lado, compostos absorvidos por

mecanismos ativos apresentam maior permeação na direção apical - basal.

Baseado em estudos de correlação in vitro - in vivo, o coeficiente de permeação (Papp)

tem sido padronizado como o valor para comparar a absorção intestinal de diferentes

fármacos. Este parâmetro leva em consideração a taxa do composto atravessando a

monocamada de células e a área da monocamada. Compostos com Papp < 1 X 10-6

cm/s são

considerados de baixa absorção, compostos com Papp entre 1-10 X 10-6

cm/s são


moderadamente absorvidos e compostos com Papp > 10 X 10-6

cm/s são considerados de boa

absorção (Yee, 1997). O Papp do eugenol é considerado alto comparado com outros

compostos, isto indica uma boa absorção intestinal. Um estudo prévio mostrou que o eugenol

e outros terpenos como D-limoneno e mentona podem aumentar a absorção percutânea de

tamoxifeno associada a mudanças nas propriedades do estrato córneo (Zhao & Singh, 1998),

um mecanismo similar a este pode estar relacionado com a permeação intestinal deste

composto.

A Figura 39 mostra os resultados do experimento de transporte realizado com as

mesmas duas formulações selecionadas para o ensaio de estabilidade, CSD4 e CSD5. Não

foram observadas diferenças significativas no Papp comparado com o extrato liofilizado usado

como referência. Compostos como gelucire são inibidores da bomba de efluxo Pgp (Srivalli &

Lakshmi, 2012), e a presença deste composto na formulação teria influência na permeação do

eugenol, porém, os resultados obtidos mostraram que o eugenol não é substrato desta bomba

de efluxo e por tanto os inibidores da P-gp não tem influência na permeação.

Figura 38. Estudos bidirecional de transporte de eugenol, apical-basal (AB) e basal-apical

(BA). Os resultados são expressos como coeficiente de permeação (Papp). Letras iguais nas


Tukey (p≤0,05).


Figura 39. Estudo de permeação das formulações lipídicas contendo extrato de cravo e do

extrato liofilizado utilizado como controle. Os resultados são expressos como coeficiente de

permeação (Papp). Letras iguais nas colunas indicam que não existe diferença significativa

segundo o teste de Tukey (p≤0,05).

6. CONCLUSÕES

6. CONCLUSÕES

Conclusões 123

A partir dos resultados obtidos nas condições experimentais analisadas, foram geradas

informações relevantes sobre a influência dos componentes da formulação etapas de

processamento e condições de secagem por spray drying na obtenção de sistemas particulados

de base lipídica incorporando compostos bioativos de S. aromaticum. A seguir são

apresentadas as conclusões obtidas em de cada etapa do desenvolvimento deste trabalho.

6.1. Extração micelar

Os resultados obtidos em esta etapa demonstraram que a extração de eugenol e de

compostos antioxidantes dos botões florais de S.aromáticum utilizando tensoativos representa

uma alternativa interessante ao uso de solventes orgânicos. Foi demonstrado que a eficiência

da extração depende do EHL dos tensoativos e sua concentração, obtendo-se melhores

resultados quando foram utilizados valores de EHL maiores que 10. Da mesma forma, foi

observado que a extração em meio básico foi mais eficiente e que a atividade antioxidante,

assim como o teor de polifenóis totais, estão diretamente correlacionados com o teor de

eugenol extraído. Deste modo, é possível dizer que a extração usando solventes reconhecidos

como seguros (GRAS), pode facilitar o desenvolvimento de formulações fitofarmacêuticas ou

de grau alimentício sem a necessidade de um processo posterior de eliminação do solvente.

Entretanto, foi obtida baixa retenção de eugenol quando as composições foram submetidas a

secagem em spray drying.

6.2. Influência da composição da formulação

Esta etapa do projeto permitiu fazer uma comparação inicial do efeito do tipo de

lipídeo, do tensoativo e do carreador na produção das formulações lipídicas submetidas a

secagem por spray drying. Em função da retenção de eugenol e acetato de eugenol e da

recuperação de produto, foram selecionados o compritol como lipídeo sólido, poloxamer 188

como tensoativo e maltodextrina DE10 como carreador de secagem. Foi determinado que a

concentração de eugenol e acetato de eugenol foi maior nos pós obtidos por liofilização do

que nos pós obtidos por spray drying. Por outro lado, não foram observadas diferenças

significativas entre os métodos de homogeneização de alta energia (ultraturrax, HAP,

sonicação) quanto à retenção de eugenol após a secagem em spray dryer.

6.3. Influência do EHL e temperatura de secagem da formulação

Esta etapa do projeto mostrou que o sistema de tensoativos (caracterizado pelo valor

de HLB) e a temperatura de secagem, influenciam na retenção de eugenol e acetato de

eugenol após secagem. As perdas de eugenol e acetato de eugenol foram em torno de 25 a 30

Conclusões 124

% maiores, quando as formulações foram atomizadas utilizando temperatura de secagem de

140 °C. Por outro lado nas formulações preparadas com o tensoativo de EHL 13 as perdas de

eugenol e acetato de eugenol foram menores.

6.4. Influência da proporção dos componentes na formulação

Esta etapa do projeto mostrou que mudanças nas proporções dos componentes têm

grande influência na viscosidade das formulações o que por sua vez, tem relação com a

estabilidade e retenção dos compostos ativos. Dentre as duas formulações selecionadas para

secagem por spray drying, a formulação com menor viscosidade, contendo goma arábica

como carreador de secagem e com menor proporção de fase lipídica teve maior retenção de

eugenol.

6.5. Comparação formulação lipídica e não lipídica

A partir da comparação da formulação lipídica com a formulação sem a adição de

lipídeos foi possível determinar que a adição de lipídeos à formulação aumenta a adesão das

partículas às paredes do secador, ocasionando um menor rendimento de produção de pó. Além

disso a formulação sem lipídeos (CSD5) apresentou maior retenção de eugenol e da atividade

antioxidante do que a formulação lipídica (CSD4).

Em relação ao estudo de estabilidade, a formulação lipídica mostrou ser mais estável

do que a formulação não lipídica em condições de alta umidade relativa. Da mesma forma, a

formulação lipídica teve menor variação de peso e menor ganho de umidade média do que a

formulação sem lipídeo em todas as condições de armazenamento avaliadas.

O estudo de permeação in vitro usando células CaCo-2 permitiu determinar que o

coeficiente de permeação do eugenol é alto o que indica uma boa absorção intestinal.

Consequentemente, não foram observados efeitos de bomba de efluxo na permeação de

eugenol. Em relação às formulações avaliadas, não foram observadas diferenças significativas

no coeficiente de permeação do eugenol quando comparado com o extrato liofilizado.

Neste projeto foi demonstrada a possibilidade da secagem de sistemas lipídicos

utilizando a técnica de spray drying. Foram estudados os efeitos das variáveis do processo nas

Conclusões 125

diferentes etapas de produção desde a obtenção do extrato até o processo de secagem. Estes

tipos de formulações são uma alternativa interessante para melhorar a estabilidade de sistemas

heterodispersos e segundo a literatura podem aumentar a biodisponibilidade de compostos de

origem natural o sintético.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas 127

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adamiec, J., & Kalemba, D. (2006). Analysis of microencapsulation ability of essential oils

during spray drying. Drying Technology, 24(9), 1127–1132.

Aditya, N. P., Aditya, S., Yang, H.-J., Kim, H. W., Park, S. O., Lee, J., & Ko, S. (2015).

Curcumin and catechin co-loaded water-in-oil-in-water emulsion and its beverage

application. Journal of Functional Foods, 15, 35–43.

Aggarwal, B. B., & Shishodia, S. (2010). Molecular targets of dietary agents for prevention

and treatment of cancer. Biochemical Pharmacology, 71(10), 1397–1421.

Ahmad, S. I., Mazumdar, N., & Kumar, S. (2013). Functionalization of natural gum: An

effective method to prepare iodine complex. Carbohydrate Polymers, 92(1), 497–502.

Ali, S. M., Khan, A. A., Ahmed, I., Musaddiq, M., Ahmed, K. S., Polasa, H., … Ahmed, N.

(2005). Antimicrobial activities of Eugenol and Cinnamaldehyde against the human

gastric pathogen Helicobacter pylori. Annals of Clinical Microbiology and

Antimicrobials, 4(20), 1–7.

Alupului, A., Călinescu, I., & Lavric, V. (2012). Microwave extraction of active principles

from medicinal plants. U.P.B. Science Bulletin, Series B, 74(2), 129–142.

ANVISA. Resolução 899 (2003). Brasil: Agencia Nacional de Vigilância Sanitaria.

Atsumi, T., Fujisawa, S., & Tonosaki, K. (2005). A comparative study of the

antioxidant/prooxidant activities of eugenol and isoeugenol with various concentrations

and oxidation conditions. Toxicology in Vitro, 19(8), 1025–1033.

Aulton, M. E. (2005). Delineamento de formas farmacêuticas (2nd ed.). Porto Alegre:

Churchill Livignston.

Azmir, J., Zaidul, I. S. M., Rahman, M. M., Sharif, K. M., Mohamed, A., Sahena, F., …

Omar, A. K. M. (2013). Techniques for extraction of bioactive compounds from plant

materials: A review. Journal of Food Engineering, 117(4), 426–436.

Bamdad, F., Kadivar, M., & Keramat, J. (2006). Evaluation of phenolic content and

antioxidant activity of Iranian caraway in comparison with clove and BHT using model

systems and vegetable oil. International Journal of Food Science and Technology,

41(s1), 20–27.

Barbosa, J. D. F., Silva, V. B., Alves, P. B., Gumina, G., Santos, R. L. C., Sousa, D. P., &

Cavalcanti, S. C. H. (2012). Structure-activity relationships of eugenol derivatives

against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Pest Management Science, 68(11),

1478–1483.

Beloqui, A., Solinís, M. Á., Gascón, A. R., del Pozo-Rodríguez, A., des Rieux, A., & Préat,

V. (2013). Mechanism of transport of saquinavir-loaded nanostructured lipid carriers

across the intestinal barrier. Journal of Controlled Release, 166(2), 115–123.


Beristain, C. I., Garcia, H. S., & Vernon-Carter, E. J. (2001). Spray-dried encapsulation of

cardamom (Elettaria cardamomum) essential oil with mesquite (Prosopis juliflora) gum.

LWT - Food Science and Technology, 34(6), 398–401.

Bi, W., Tian, M., & Row, K. H. (2011). Extraction and concentration of tanshinones in Salvia

miltiorrhiza Bunge by task-specific non-ionic surfactant assistance. Food Chemistry,

126(4), 1985–1990.

Bott, R. F., Labuza, T. P., & Oliveira, W. P. (2010). Stability testing of spray- and spouted

bed–dried extracts of Passiflora alata. Drying Technology, 28(11), 1255–1265.

Bourezg, Z., Bourgeois, S., Pressenda, S., Shehada, T., & Fessi, H. (2012). Redispersible lipid

nanoparticles of spironolactone obtained by three drying methods. Colloids and Surfaces

A: Physicochemical and Engineering Aspects, 413, 191–199.

Brasil. (2010). Farmacopeia brasileira (5th ed.). Brasilia: Ministerio da saúde.

Bringas-Lantigua, M., Expósito-Molina, I., Reineccius, G. A., López-Hernández, O., & Pino,

J. A. (2011). Influence of spray-dryer air temperatures on encapsulated mandarin oil.

Drying Technology, 29(5), 520–526.

Bringas-Lantigua, M., Valdés, D., & Pino, J. A. (2012). Influence of spray-dryer air

temperatures on encapsulated lime essential oil. International Journal of Food Science &

Technology, 47(7), 1511–1517.

Brubach, J. B., Jannin, V., Mahler, B., Bourgaux, C., Lessieur, P., Roy, P., & Ollivon, M.

(2007). Structural and thermal characterization of glyceryl behenate by X-ray diffraction

coupled to differential calorimetry and infrared spectroscopy, 336, 248–256.

Bruggisser, R., Von Daeniken, K., Jundt, G., Schaffner, W., & Tullberg-Reinert, H. (2002).

Interference of plant extracts, phytoestrogens and antioxidants with the MTT tetrazolium

assay. Planta Medica, 68, 445–448.

Bule, M. V., Singhal, R. S., & Kennedy, J. F. (2010). Microencapsulation of ubiquinone-10 in

carbohydrate matrices for improved stability. Carbohydrate Polymers, 82(4), 1290–

1296.

Cano-Chauca, M., Stringheta, P. C., Ramos, A. M., & Cal-Vidal, J. (2005). Effect of the

carriers on the microstructure of mango powder obtained by spray drying and its

functional characterization. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 6(4),

420–428.

Carneiro, H. C. F., Tonon, R. V, Grosso, C. R. F., & Hubinger, M. D. (2013). Encapsulation

efficiency and oxidative stability of flaxseed oil microencapsulated by spray drying using

different combinations of wall materials. Journal of Food Engineering, 115(4), 443–451.

Chatterjee, D., & Bhattacharjee, P. (2013). Comparative evaluation of the antioxidant efficacy

of encapsulated and un-encapsulated eugenol-rich clove extracts in soybean oil: Shelf-

life and frying stability of soybean oil. Journal of Food Engineering, 117(4), 545–550.


Chatzilazarou, A., Katsoyannos, E., Gortzi, O., Lalas, S., Paraskevopoulos, Y., Dourtoglou,

E., & Tsaknis, J. (2010). Removal of polyphenols from wine sludge using cloud point

extraction. Journal of the Air & Waste Management Association, 60(4), 454–459.

Chen, S., Yuchun, X., & Huizhou, L. (2007). Microwave-assisted micellar extraction and

determination of glycyrrhizic acid and liquiritin in licorice root by HPLC. Chinese

Journal of Chemical Engineerig, 15(4), 474–477.

Chen-yu, G., Chun-fen, Y., Qi-lu, L., Qi, T., Yan-wei, X., Wei-na, L., & Guang-xi, Z. (2012).

Development of a quercetin-loaded nanostructured lipid carrier formulation for topical

delivery. International Journal of Pharmaceutics, 430(1-2), 292–298.

Christensen, K. L., Pedersen, G. P., & Kristensen, H. G. (2001). Preparation of redispersible

dry emulsions by spray drying. International Journal of Pharmaceutics, 212(2), 187–

194.

Cortés-Rojas, D.F., & Oliveira, W.P. (2012). Physicochemical properties of

phytopharmaceutical preparations as affected by drying methods and carriers. Drying

Technology, 30(9), 921–934.

Cortes-Rojas, D. F., Souza, C. R. F., & Oliveira, W. P. (2014). Clove (Syzygium

aromaticum): a precious spice. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(2), 90–

96.

Cortés-Rojas, D. F., Souza, C. R. F., & Oliveira, W. P. (2011). Optimisation of the extraction

of phenolic compounds and antioxidant activity from aerial parts of Bidens pilosa L.

using response surface methodology. International Journal of Food Science &

Technology, 46(11), 2420–2427.

Cortés-Rojas, D. F., Souza, C. R. F., & Oliveira, W. P. (2014). Encapsulation of eugenol rich

clove extract in solid lipid carriers. Journal of Food Engineering, 127, 34–42.

Cortés-Rojas, D. F., Souza, C. R. F., & Oliveira, W. P. (2015). Surfactant Mediated

Extraction of Antioxidants from Syzygium Aromaticum. Separation Science and

Technology, 50(2), 207–213.

Couto, R. O., Conceição, E. C., Chaul, L. T., Oliveira, E. M. S., Martins, F. S., Bara, M. T. F.,

… Paula, J. R. (2012). Spray-dried rosemary extracts: physicochemical and antioxidant

properties. Food Chemistry, 131(1), 99–105.

Daniel, A. N., Sartoretto, S. M., Schmidt, G., Caparroz-Assef, S. M., Bersani-Amado, C. A.,

& Cuman, R. K. N. (2009). Anti-inflammatory and antinociceptive activities of eugenol

essential oil in experimental animal models. Revista Brasileira de Farmacognosia,

19(1B), 212–217.

Das, S., Ng, W. K., & Tan, R. B. H. (2012). Are nanostructured lipid carriers (NLCs) better

than solid lipid nanoparticles (SLNs): development, characterizations and comparative

evaluations of clotrimazole-loaded SLNs and NLCs? European Journal of

Pharmaceutical Sciences, 47(1), 139–151.

De Angelis, I., & Turco, L. (2011). Caco-2 cells as a model for intestinal absorption. Current

Protocols in Toxicology, 20.6(February), 1–15.


Derakhshandeh, K., Hochhaus, G., & Dadashzadeh, S. (2011). In-vitro Cellular Uptake and

Transport Study of 9-Nitrocamptothecin PLGA Nanoparticles Across Caco-2 Cell

Monolayer Model. Iranian Journal of Pharmaceutical Research : IJPR, 10(3), 425–34.

Devi, K. P., Nisha, S. A., Sakthivel, R., & Pandian, S. K. (2010). Eugenol (an essential oil of

clove) acts as an antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular

membrane. Journal of Ethnopharmacology, 130(1), 107–115.

Doleželová, P., Mácová, S., Plhalová, L., Pištěková, V., & Svobodová, Z. (2011). The acute

toxicity of clove oil to fish Danio rerio and Poecilia reticulata. Acta Veterinaria Brno,

80(3), 305–308.

Dollo, G., Le Corre, P., Guérin, A., Chevanne, F., Burgot, J. L., & Leverge, R. (2003). Spray-

dried redispersible oil-in-water emulsion to improve oral bioavailability of poorly

soluble drugs. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 19(4), 273–280.

Dong, Y.-D., & Boyd, B. J. (2011). Applications of X-ray scattering in pharmaceutical

science. International Journal of Pharmaceutics, 417(1-2), 101–11.

Drusch, S., & Berg, S. (2008). Extractable oil in microcapsules prepared by spray-drying:

Localisation, determination and impact on oxidative stability. Food Chemistry, 109(1),

17–24.

Dudonné, S., Vitrac, X., Coutière, P., Woillez, M., & Mérillon, J.-M. (2009). Comparative

study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of

industrial interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC assays. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 57(5), 1768–1774.

Eamsobhana, P., Yoolek, A., Kongkaew, W., Lerdthusnee, K., Khlaimanee, N., Parsartvit, A.,

… Yong, H.-S. (2009). Laboratory evaluation of aromatic essential oils from thirteen

plant species as candidate repellents against Leptotrombidium chiggers (Acari:

Trombiculidae), the vector of scrub typhus. Experimental & Applied Acarology, 47(3),

257–262.

El-badry, M., Fetih, G., & Fathy, M. (2009). Improvement of solubility and dissolution rate of

indomethacin by solid dispersions in Gelucire 50/13 and PEG4000. Saudi

Pharmaceutical Journal, 17(3), 217–225.

El-sayed, T. M., Wallack, D. A., & King, C. J. (1990). Changes in particle morphology during

drying of drops of carbohydrate solutions and food liquids. 1 . Effects of composition

and drying conditions. Industrial and Engineering Chemical Research, 29(12), 2346–

2354.

Eng, A. T. W., Heng, M. Y., & Ong, E. S. (2007). Evaluation of surfactant assisted

pressurized liquid extraction for the determination of glycyrrhizin and ephedrine in

medicinal plants. Analytica Chimica Acta, 583(2), 289–295.

Fang, J.-Y., Fang, C.-L., Liu, C.-H., & Su, Y.-H. (2008). Lipid nanoparticles as vehicles for

topical psoralen delivery: solid lipid nanoparticles (SLN) versus nanostructured lipid

carriers (NLC). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 70(2), 633–

640.


Fang, Q., Yeung, H. W., Leung, H. W., & Huie, C. W. (2000). Micelle-mediated extraction

and preconcentration of ginsenosides from Chinese herbal medicine. Journal of

Chromatography A, 904, 47–55.

Fang, Z., & Bhandari, B. (2010). Encapsulation of polyphenols – a review. Trends in Food

Science & Technology, 21(10), 510–523.

Farmacopeia Brasileira. (2010) (5th ed.). Brasilia: Fiocruz.

Fernandes, L. P., Turatti, I. C. C., Lopes, N. P., Ferreira, J. C., Candido, R. C., & Oliveira, W.

P. (2008). Volatile retention and antifungal properties of spray-dried microparticles of

Lippia sidoides essential oil. Drying Technology, 26(April 2015), 1534–1542.

Folin, O., & Denis, W. (1912). On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color

reagents. Journal of Biological Chemistry, 12, 239–243.

Fu, Y., Zu, Y., Chen, L., Shi, X., Wang, Z., Sun, S., & Efferth, T. (2007). Antimicrobial

activity of clove and rosemary essential oils alone and in combination. Phtytotherapy

Research, 994(March), 989–994.

Garcia, L. C., Tonon, R. V., & Hubinger, M. D. (2012). Effect of homogenization pressure

and oil load on the emulsion properties and the oil retention of microencapsulated basil

essential oil (Ocimum Basilicum L.). Drying Technology, 30(13), 1413–1421.

Garg, A., & Singh, S. (2011). Enhancement in antifungal activity of eugenol in

immunosuppressed rats through lipid nanocarriers. Colloids and Surfaces. B,

Biointerfaces, 87(2), 280–288.

Gharsallaoui, A., Roudaut, G., Chambin, O., Voilley, A., & Saurel, R. (2007). Applications of

spray-drying in microencapsulation of food ingredients: An overview. Food Research

International, 40(9), 1107–1121.

Ghosh, R., Nadiminty, N., Fitzpatrick, J. E., Alworth, W. L., Slaga, T. J., & Kumar, A. P.

(2005). Eugenol causes melanoma growth suppression through inhibition of E2F1

transcriptional activity. The Journal of Biological Chemistry, 280(7), 5812–5819.

Gilda, S., Kanitkar, M., Bhonde, R., & Paradkar, A. (2010). Activity of water-soluble

turmeric extract using hydrophilic excipients. LWT - Food Science and Technology,

43(1), 59–66.

González-Mira, E., Nikolic, S., García, M. L., Egea, M. A., Souto, E. B., & Calpena, A. C.

(2011). Potential use of nanostructured lipid carriers for topical delivery of flurbiprofen.

Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(1), 242–251.

Goubet, I., & Voilley, A. J. (1998). Retention of aroma compounds by carbohydrates:

influence of their physicochemical characteristics and of their physical state. Journal of


Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., & LaGow, B. (2004). PDR for Herbal Medicines

(3rd ed.). Montvale: Thomson PDR.


Guénette, S. A., Ross, A., Marier, J.-F., Beaudry, F., & Vachon, P. (2007). Pharmacokinetics

of eugenol and its effects on thermal hypersensitivity in rats. European Journal of

Pharmacology, 562(1-2), 60–67.

Guimarães, K. L., & Ré, M. I. (2011). Lipid nanoparticles as carriers for cosmetic ingredients:

the first (SLN) and the second generation (NLC). In Nanocosmetics and Nanomedicines

(pp. 101–122). Berlin Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg.

Gülçin, İ. (2011). Antioxidant activity of eugenol: a structure-activity relationship study.

Journal of Medicinal Food, 14(9), 975–985.

Gülçin, İ., Elmastaş, M., & Aboul-Enein, H. Y. (2012). Antioxidant activity of clove oil – A

powerful antioxidant source. Arabian Journal of Chemistry, 5(4), 489–499.

Gülcin, W. (2004). Comparison of antioxidant activity of clove (Eugenia caryophylata Thunb)

buds and lavender (Lavandula stoechas L.). Food Chemistry, 87(3), 393–400.

Halder, S., Mehta, A. K., Kar, R., Mustafa, M., Mediratta, P. K., & Sharma, K. K. (2011).

Clove oil reverses learning and memory deficits in scopolamine-treated mice. Planta

Medica, 77(8), 830–834.

Hamdani, J., Moës, A. J., & Amighi, K. (2003). Physical and thermal characterisation of

Precirol ® and Compritol ® as lipophilic glycerides used for the preparation of

controlled-release matrix pellets. International Journal of Pharmaceutics, 260, 47–57.

Hentschel, A., Gramdorf, S., Müller, R. H., & Kurz, T. (2008). Beta-carotene-loaded

nanostructured lipid carriers. Journal of Food Science, 73(2), N1–N6.

Hill, L. E., Gomes, C., & Taylor, T. M. (2013). Characterization of beta-cyclodextrin

inclusion complexes containing essential oils (trans-cinnamaldehyde, eugenol, cinnamon

bark, and clove bud extracts) for antimicrobial delivery applications. LWT - Food

Science and Technology, 51(1), 86–93.

Hosseinzadeh, R., Khorsandi, K., & Hemmaty, S. (2013). Study of the effect of surfactants on

extraction and determination of polyphenolic compounds and antioxidant capacity of

fruits extracts. PloS One, 8(3), e57353.

http://www.phenol-explorer.eu. (2012).

Hu, F. Q., Yuan, H., Zhang, H. H., & Fang, M. (2002). Preparation of solid lipid nanoparticles

with clobetasol propionate by a novel solvent diffusion method in aqueous system and

physicochemical characterization. International Journal of Pharmaceutics, 239(1-2),

121–128.

Hung, L. C., Basri, M., Tejo, B. A., Ismail, R., Nang, H. L. L., Hassan, A. H., & May, C. Y.

(2011). An improved method for the preparations of nanostructured lipid carriers

containing heat-sensitive bioactives. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces, 87(1), 180–

186.

Huynh, T. V., Caffin, N., Dykes, G. A., & Bhandari, B. (2008). Optimization of the

microencapsulation of lemon myrtle oil using response surface methodology. Drying

Technology, 26(3), 357–368.


Islam, M. I. U., Sherrell, R., & Langrish, T. A. G. (2010). An investigation of the relationship

between glass transition temperatures and the crystallinity of spray-dried powders.

Drying Technology, 28(3), 361–368.

Jafari, S. M., Assadpoor, E., He, Y., & Bhandari, B. (2008). Encapsulation efficiency of food

flavours and oils during spray drying. Drying Technology, 26(7), 816–835.

Jafari, S. M., He, Y., & Bhandari, B. (2007). Encapsulation of nanoparticles of d-limonene by

spray drying: role of emulsifiers and emulsifying techniques. Drying Technology, 25(6),

1069–1079.

Jia, L., Shen, J., Zhang, D., Duan, C., Liu, G., Zheng, D., … Zhang, Q. (2012). In vitro and in

vivo evaluation of oridonin-loaded long circulating nanostructured lipid carriers.

International Journal of Biological Macromolecules, 50(3), 523–529.

Jia, L., Zhang, D., Li, Z., Duan, C., Wang, Y., Feng, F., … Zhang, Q. (2010). Nanostructured

lipid carriers for parenteral delivery of silybin: Biodistribution and pharmacokinetic

studies. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces, 80(2), 213–8.

Jirovetz, L., Buchbauer, G., Stoilova, I., Stoyanova, A., Krastanov, A., & Schmidt, E. (2006).

Chemical composition and antioxidant properties of clove leaf essential oil. Journal of


Joshi, M., & Patravale, V. (2008). Nanostructured lipid carrier (NLC) based gel of celecoxib.

International Journal of Pharmaceutics, 346(1-2), 124–132.

Juntachote, T., Berghofer, E., Bauer, F., & Siebenhandl, S. (2006). The application of

response surface methodology to the production of phenolic extracts of lemon grass,

galangal, holy basil and rosemary. International Journal of Food Science and

Technology, 41(2), 121–133.

Kamatou, G. P., Vermaak, I., & Viljoen, A. M. (2012). Eugenol- From the remote Maluku

Islands to the international market place: A review of a remarkable and versatile

molecule. Molecules, 17(6), 6953–6981.

Keey, R. B. (1992). Drying of loose and particulate solids materials. New York: Hemisphere

Publishing Co.

Keshani, S., Daud, W. R. W., Nourouzi, M. M., Namvar, F., & Ghasemi, M. (2015). Spray

drying: An overview on wall deposition, process and modeling. Journal of Food

Engineering, 146, 152–162.

Kiathevest, K., Goto, M., Sasaki, M., Pavasant, P., & Shotipruk, A. (2009). Extraction and

concentration of anthraquinones from roots of Morinda citrifolia by non-ionic surfactant

solution. Separation and Purification Technology, 66(1), 111–117.

Kurokawa, M., Hozumi, T., Basnet, P., Nakano, M., Kadota, S., Namba, T., … Shiraki, K.

(1998). Purification and characterization of eugeniin as an anti-herpesvirus compound

from Geum japonicum and Syzygium aromaticum. The Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics, 284(2), 728–735.


Kurokawa, M., Nagasaka, K., Hirabayashi, T., Uyama, S., Sato, H., Kageyama, T., …

Shiraki, K. (1995). Efficacy of traditional herbal medicines in combination with

acyclovir against herpes simplex virus type 1 infection in vitro and in vivo. Antiviral

Research, 27, 19–37.

Labuza, T. P., & Altunakar, L. (2007). Water activity in foods: fundamentals and

applications. (S. J. S. and T. P. L. G. V. Barbosa-Cánovas, A. J. Fontana, Ed.). Oxford,

UK.: Blackwell Publishing Ltd.

Lacatusu, I., Badea, N., Ovidiu, O., Bojin, D., & Meghea, A. (2012). Highly antioxidant

carotene-lipid nanocarriers: synthesis and antibacterial activity. Journal of Nanoparticle

Research, 14(6).

Lamprecht, a, Schäfer, U. F., & Lehr, C. (2000). Characterization of microcapsules by

confocal laser scanning microscopy: structure, capsule wall composition and

encapsulation rate. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 49(1), 1–

9.

Li, H. Y., Lee, B. K., Kim, J. S., Jung, S. J., & Oh, S. B. (2008). Eugenol inhibits ATP-

induced P2X currents in trigeminal ganglion neurons. The Korean Journal of Physiology

& Pharmacology, 12(6), 315–321.

Li, J. W.-H., & Vederas, J. (2009). Drug discovery and natural products: end of an era or an

endless frontier? Science, 325(5937), 161–165.

Lieberman, H. A., Rieger, M. M., & Banker, G. S. (1996). Pharmaceutical dosage forms:

disperse systems (2nd ed.). New York: Marcel Dekker, Inc.

List, P. H., & Schmidt, P. C. (1989). Phytopharmaceutical Technology. London: Heyden &

Son Limited.

Liu, C.-H., & Wu, C.-T. (2010). Optimization of nanostructured lipid carriers for lutein

delivery. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 353(2-3),

149–156.

Liu, Y., Wang, P., Sun, C., Feng, N., Zhou, W., Yang, Y., … Zhao, J. (2010). Wheat germ

agglutinin-grafted lipid nanoparticles: preparation and in vitro evaluation of the

association with Caco-2 monolayers. International Journal of Pharmaceutics, 397(1-2),

155–63.

Madene, A., Jacquot, M., Scher, J., & Desobry, S. (2006). Flavour encapsulation and

controlled release a review. International Journal of Food Science & Technology, 41(1),

1–21.

McClements, D. J. (2007). Critical review of techniques and methodologies for

characterization of emulsion stability. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,

47(7), 611–649.

Meaning of HLB Advantages and Limitations. (1980). In The HLB SYSTEM a time-saving

guide to emulsifier selection. Wilmington, Delaware: ICI Americas Inc.


Mehta, K. D., Garg, G. R., Mehta, A. K., Arora, T., Sharma, A. K., Khanna, N., … Sharma,

K. K. (2010). Reversal of propoxur-induced impairment of memory and oxidative stress

by 4’-chlorodiazepam in rats. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology,

381(1), 1–10.

Memon, A. A., Memon, N., & Bhanger, M. I. (2010). Micelle-mediated extraction of

chlorogenic acid from Morus laevigata W . leaves. Separation and Purification

Technology, 76(2), 179–183.

Memvanga, P. B., Coco, R., & Préat, V. (2013). An oral malaria therapy: curcumin-loaded

lipid-based drug delivery systems combined with β-arteether. Journal of Controlled

Release, 172(3), 904–913.

Mitri, K., Shegokar, R., Gohla, S., Anselmi, C., & Müller, R. H. (2011). Lipid nanocarriers

for dermal delivery of lutein: preparation, characterization, stability and performance.


Mosquera, L. H., Moraga, G., & Martínez-Navarrete, N. (2012). Critical water activity and

critical water content of freeze-dried strawberry powder as affected by maltodextrin and

arabic gum. Food Research International, 47(2), 201–206.

Müller, R. H. (2007). Lipid Nanoparticles for Improved Formulation of Cosmetic and

Pharmaceutical Actives, (1), 1–69.

Müller, R. H., Mäder, K., & Gohla, S. (2000). Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled

drug delivery - a review of the state of the art. European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, 50(1), 161–77.

Muller, R. H., Radtke, M., & Wissing, S. (2002). Nanostructured lipid matrices for improved

microencapsulation of drugs. International Journal of Pharmaceutics, 242(1-2), 121–

128.

Müller, R. H., Radtke, M., & Wissing, S. A. (2002). Solid lipid nanoparticles (SLN) and

nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological preparations.

Advanced Drug Delivery Reviews, 54 Suppl 1, S131–55.

Munoz-Ibanez, M., Azagoh, C., Dubey, B. N., Dumoulin, E., & Turchiuli, C. (2015). Changes

in oil-in-water emulsion size distribution during the atomization step in spray-drying

encapsulation. Journal of Food Engineering, In press.

Nesterenko, A., Alric, I., Silvestre, F., & Durrieu, V. (2012). Influence of soy protein’s

structural modifications on their microencapsulation properties: α-Tocopherol

microparticle preparation. Food Research International, 48(2), 387–396.

Nikolić, S., Keck, C. M., Anselmi, C., & Müller, R. H. (2011). Skin photoprotection

improvement: synergistic interaction between lipid nanoparticles and organic UV filters.


Obón, J. M., Castellar, M. R., Alacid, M., & Fernández-López, J. A. (2009). Production of a

red–purple food colorant from Opuntia stricta fruits by spray drying and its application

in food model systems. Journal of Food Engineering, 90(4), 471–479.


Ohkubo, T., & Shibata, M. (1997). The selective capsaicin antagonist capsazepine abolished

the antinociceptive action of eugenol and guaiacol. Journal of Dental Research, 76, 848–

851.

Oliveira, R. A., Oliveira, F. F., & Sacramento, C. K. (2007). Óleos essenciais : perspectivas

para o agronegócio de especiarias na Bahia. Bahia Agricultura, 8(1), 46–48.

Oliveira, W. P., Bott, R. F., & Souza, C. R. F. (2006). Manufacture of standardized dried

extracts from medicinal Brazilian plants. Drying Technology, 24(4), 523–533.

Onwulata, C. I., Konstance, R. P., & Holsinger, V. H. (1996). Flow properties of encapsulated

milkfat powders as affected by flow agent. Journal of Food Science, 61(6), 1211–1215.

Oriqui, L. R., & Mori, M. (2013). Guia para determinação da estabilidade de produtos

químicos. Química Nova, 36(2), 340–347.

Ou, K., Percival, S. S., Zou, T., Khoo, C., & Gu, L. (2012). Transport of cranberry A-type

procyanidin dimers, trimers, and tetramers across monolayers of human intestinal

epithelial Caco-2 cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(6), 1390–1396.

Paleologos, E. K., Giokas, D. L., & Karayannis, M. I. (2005). Micelle-mediated separation

and cloud-point extraction. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 24(5), 426–436.

Paramita, V., Iida, K., Yoshii, H., & Furuta, T. (2010). Effect of feed liquid temperature on

the structural morphologies of d-limonene microencapsulated powder and its

preservation. Journal of Food Science, 75(1), E39–45.

Pardeike, J., Hommoss, A., & Müller, R. H. (2009). Lipid nanoparticles (SLN, NLC) in

cosmetic and pharmaceutical dermal products. International Journal of Pharmaceutics,

366(1-2), 170–184.

Pardeike, J., Weber, S., Haber, T., Wagner, J., Zarfl, H. P., Plank, H., & Zimmer, A. (2011).

Development of an itraconazole-loaded nanostructured lipid carrier (NLC) formulation

for pulmonary application. International Journal of Pharmaceutics, 419(1-2), 329–338.

Park, I.-K., & Shin, S.-C. (2005). Fumigant activity of plant essential oils and components

from garlic (Allium sativum) and clove bud (Eugenia caryophyllata) oils against the

Japanese termite (Reticulitermes speratus Kolbe). Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 53(11), 4388–4392.

Park, M.-J., Gwak, K.-S., Yang, I., Choi, W.-S., Jo, H.-J., Chang, J.-W., … Choi, I.-G.

(2007). Antifungal activities of the essential oils in Syzygium aromaticum (L.) Merr. Et

Perry and Leptospermum petersonii Bailey and their constituents against various

dermatophytes. Journal of Microbiology, 45(5), 460–465.

Pathak, S. B., Niranjan, K., Padh, H., & Rajani, M. (2004). TLC densitometric method for the

quantification of eugenol and gallic acid in clove. Chromatographia, 60(3-4), 241–244.

Pérez-Conesa, D., McLandsborough, L., & Weiss, J. (2006). Inhibition and inactivation of

Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 colony biofilms by micellar-

encapsulated eugenol and carvacrol. Journal of Food Protection, 69(12), 2947–2954.


Pérez-Jiménez, J., Neveu, V., Vos, F., & Scalbert, A. (2010). Identification of the 100 richest

dietary sources of polyphenols: an application of the Phenol-Explorer database.

European Journal of Clinical Nutrition, 64(3), S112–120.

Pokharkar, V. B., Shekhawat, P. B., Dhapte, V. V, & Mandpe, L. P. (2011). Development and

optimization of eugenol loaded nanostructured lipid carriers for peridontal delivery.

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(4), 138–143.

Pompeu, D. R., Silva, E. M., & Rogez, H. (2009). Optimisation of the solvent extraction of

phenolic antioxidants from fruits of Euterpe oleracea using response surface

methodology. Bioresource Technology, 100(23), 6076–6082.

Porter, C. J. H., Trevaskis, N. L., & Charman, W. N. (2007). Lipids and lipid-based

formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nature Reviews. Drug

Discovery, 6(March), 231–248.

Prado, J. M., Prado, G. H. C., & Meireles, A. A. (2011). Scale-up study of supercritical fluid

extraction process for clove and sugarcane residue. The Journal of Supercritical Fluids,

56(3), 231–237.

Prata, A., Garcia, L., Tonon, R., & Hubinger, M. (2013). Wall Material Selection for

Encapsulation by Spray Drying. Journal of Colloid Science and Biotechnology, 2(2), 86–

92.

Puglia, C., Blasi, P., Rizza, L., Schoubben, A., Bonina, F., Rossi, C., & Ricci, M. (2008).

Lipid nanoparticles for prolonged topical delivery: an in vitro and in vivo investigation.


Rahman, M. A., Hussain, A., Hussain, M. S., Mirza, M. A., & Iqbal, Z. (2013). Role of

excipients in successful development of self-emulsifying/microemulsifying drug delivery

system (SEDDS/SMEDDS). Drug Development and Industrial Pharmacy, 39(1), 1–19.

Raja, K. C. M., Sankarikutty, B., Sreekumar, M., Jayalekshmy, A., & Narayanan, C. S.

(1989). Material characterization studies of maltodextrin samples for the use of wall

material. Starch - Stärke, 41(8), 298–303.

Rana, I. S., Rana, A. S., & Rajak, R. C. (2011). Evaluation of antifungal activity in essential

oil of the Syzygium aromaticum (L.) By extraction, purification and analysis of its main

component eugenol. Brazilian Journal of Microbiology, 42, 1269–1277.

Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-evans, C. (1999).

Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.

Free Radical Biology and Medicine, 26(9/10), 1231–1237.

Reineccius, G. (2004). The spray drying of food flavors. Drying Technology, 22(6), 1289–

1324.

Ribani, M., Bottoli, C. B. G., Collins, C. H., & Jardim, I. C. S. F. (2004). Validação em

métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, 27(5), 771–780.


Rosenberg, M., Kopelman, I. J., & Talmon, Y. J. (1990). Factors affecting retention in spray-

drying microencapsulation of volatile materials. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 38(5), 1288–1294.

Rowe, R. C., Sheskey, P. J., & Owen, S. C. (2006). Handbook of pharmaceutical excipients.

(P. P. and A. P. Association, Ed.) (5th ed.). London: Association Pharmaceutical Press

and American Pharmacists.

Rufino, S. M., Alves, R. E., Brito, E. S. De, Pérez-jiménez, J., Saura-calixto, F., & Mancini-

filho, J. (2010). Bioactive compounds and antioxidant capacities of 18 non-traditional

tropical fruits from Brazil. Food Chemistry, 121(4), 996–1002.

Salvia-Trujillo, L., Qian, C., Martín-Belloso, O., & McClements, D. J. (2013). Influence of

particle size on lipid digestion and β-carotene bioaccessibility in emulsions and

nanoemulsions. Food Chemistry, 141(2), 1472–80.

Sansone, F., Picerno, P., Mencherini, T., Villecco, F., D’Ursi, A. M., Aquino, R. P., & Lauro,

M. R. (2011). Flavonoid microparticles by spray-drying: Influence of enhancers of the

dissolution rate on properties and stability. Journal of Food Engineering, 103(2), 188–

196.

Schubert, M. A., & Müller-Goymann, C. C. (2003). Solvent injection as a new approach for

manufacturing lipid nanoparticles – evaluation of the method and process parameters.

European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 55(1), 125–131.

Schuster, S., Bernewitz, R., Guthausen, G., Zapp, J., Greiner, A. M., Köhler, K., &

Schuchmann, H. P. (2012). Analysis of W1/O/W2 double emulsions with CLSM:

Statistical image processing for droplet size distribution. Chemical Engineering Science,

81, 84–90.

Shah, B., Davidson, P. M., & Zhong, Q. (2012). Encapsulation of eugenol using Maillard-

type conjugates to form transparent and heat stable nanoscale dispersions. LWT - Food

Science and Technology, 49(1), 139–148.

Shah, B., Ikeda, S., Michael Davidson, P., & Zhong, Q. (2012). Nanodispersing thymol in

whey protein isolate-maltodextrin conjugate capsules produced using the emulsion–

evaporation technique. Journal of Food Engineering, 113(1), 79–86.

Shan, B., Cai, Y. Z., Sun, M., & Corke, H. (2005). Antioxidant capacity of 26 spice extracts

and characterization of their phenolic constituents. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 53(20), 7749–7759.

Shi, Z., He, J., & Chang, W. (2004). Micelle-mediated extraction of tanshinones from Salvia

miltiorrhiza bunge with analysis by high-performance liquid chromatography. Talanta,

64(2), 401–407.

Slamenová, D., Horváthová, E., Wsólová, L., Sramková, M., & Navarová, J. (2009).

Investigation of anti-oxidative, cytotoxic, DNA-damaging and DNA-protective effects of

plant volatiles eugenol and borneol in human-derived HepG2, Caco-2 and VH10 cell

lines. Mutation Research, 677(1-2), 46–52.


Sofia, P. K., Prasad, R., Vijay, V. K., & Srivastava, A. K. (2007). Evaluation of antibacterial

activity of Indian spices against common foodborne pathogens. International Journal of

Food Science & Technology, 42(8), 910–915.

Soottitantawat, A., Bigeard, F., Yoshii, H., Furuta, T., Ohkawara, M., & Linko, P. (2005).

Influence of emulsion and powder size on the stability of encapsulated d-limonene by

spray drying. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 6(1), 107–114.

Soottitantawat, A., Takayama, K., Okamura, K., Muranaka, D., Yoshii, H., Furuta, T., …

Linko, P. (2005). Microencapsulation of l-menthol by spray drying and its release

characteristics. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 6(2), 163–170.

Soottitantawat, A., Yoshii, H., Furuta, T., Ohkawara, M., & Linko, P. (2003).

Microencapsulation by spray drying: influence of emulsion size on the retention of

volatile compounds. Food Engineering and Physical Properties, 68(7), 2256–2262.

Souto, E. B., & Müller, R. H. (2007). Lipid Nanoparticles (Solid Lipid Nanoparticles and

Nanostructured Lipid Carriers) for cosmetic, dermal and transdermal applications. In

Nanoparticulate Drug Delivery Systems (pp. 213–233).

Souza, C. R. F., Bott, R. F., & Oliveira, W. P. (2007). Optimization of the extraction of

flavonoids compounds from herbal material using experimental design and multi-

response analysis. Latin American Journal of Pharmacy, 26(5), 682–690.

Souza, C. R. F., Ramos, D. N., Cortes-Rojas, D. F., & Oliveira, W. P. (2013). Stability testing

and shelf live prediction of a spouted bed dried phytopharmaceutical preparation from

Maytenus ilicifolia. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 91(July), 1847–

1855.

Sritabutra, D., Soonwera, M., Waltanachanobon, S., & Poungjai, S. (2011). Evaluation of

herbal essential oil as repellents against Aedes aegypti (L.) and Anopheles dirus Peyton

& Harrion. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 1(1), S124–S128.

Srivalli, K. M. R., & Lakshmi, P. K. (2012). Overview of P-glycoprotein inhibitors: A

rational outlook. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 48(3), 353–367.

Tan, S. W., Billa, N., Roberts, C. R., & Burley, J. C. (2010). Surfactant effects on the physical

characteristics of Amphotericin B-containing nanostructured lipid carriers. Colloids and

Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 372(1-3), 73–79.

Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., & Artursson, P. (2002). Application of

epithelial cell culture in studies of drug transport. In Epithelial cell culture protocols (pp.

233–272).

Teixeira, H. F. (1996). Avaliação da influência de adjuvantes farmacêuticos sobre as

características fisicas, químicas, tecnológicas e farmacológicas de extratos secos

nebulizados de Achyrocline satureioides (Lam.) DC. - Marcela. Universidade Federal do

Rio Grande do Sul.

Thanki, K., Gangwal, R. P., Sangamwar, A. T., & Jain, S. (2013). Oral delivery of anticancer

drugs: Challenges and opportunities. Journal of Controlled Release, 170(1), 15–40.


Tiwari, R., & Pathak, K. (2011). Nanostructured lipid carrier versus solid lipid nanoparticles

of simvastatin: comparative analysis of characteristics, pharmacokinetics and tissue

uptake. International Journal of Pharmaceutics, 415(1-2), 232–243.

Tonon, R., Brabet, C., & Hubinger, M. (2008). Influence of process conditions on the

physicochemical properties of açai (Euterpe oleraceae Mart.) powder produced by spray

drying. Journal of Food Engineering, 88(3), 411–418.

Trivedi, P., Kumar, J. K., Negi, A. S., & Shanker, K. (2011). HPLC method development and

validation of cytotoxic agent phenyl-heptatriyne in Bidens pilosa with ultrasonic-assisted

cloud point extraction and preconcentration. Biomedical Chromatography : BMC, 25(6),

697–706.

Tsai, M.-J., Wu, P.-C., Huang, Y.-B., Chang, J.-S., Lin, C.-L., Tsai, Y.-H., & Fang, J.-Y.

(2012). Baicalein loaded in tocol nanostructured lipid carriers (tocol NLCs) for enhanced

stability and brain targeting. International Journal of Pharmaceutics, 423(2), 461–470.

USP 29-NF 24. (2007). Bulk density and tapped density of powders <616>. In United States

Pharmacopeia and National Formulary (USP 29-NF 24) (p. 2704). Rockville, MD:

United States Pharmacopeia Convention.

Walton, D. E., & Mumford, C. J. (1999). The morphology of spray-dried particles. Trans

IChemE, 77(A), 442–460.

Wenjuan, X., & Ligang, C. (2013). Micelle-mediated extraction and cloud point

preconcentration of bergenin from Ardisia japonica. Separation and Purification

Technology, 110, 57–62.

Wojdyło, A., Oszmiański, J., & Czemerys, R. (2007). Antioxidant activity and phenolic

compounds in 32 selected herbs. Food Chemistry, 105(3), 940–949.

Wooster, T. J., Day, L., Xu, M., Golding, M., Oiseth, S., Keogh, J., & Clifton, P. (2014).

Impact of different biopolymer networks on the digestion of gastric structured emulsions.

Food Hydrocolloids, 36, 102–114.

Wu, X., Beecher, G. R., Holden, J. M., Haytowitz, D. B., Gebhardt, S. E., & Prior, R. L.

(2004). Lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities of common foods in the United

States. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(12), 4026–4037.

Xia, Q., Saupe, A., Müller, R. H., & Souto, E. B. (2007). Nanostructured lipid carriers as

novel carrier for sunscreen formulations. International Journal of Cosmetic Science,

29(6), 473–482.

Yadav, N., Khatak, S., & Sara, S. V. U. (2013). Solid lipid nanoparticles - A review.

International Journal of Applied Pharmaceutics, 5(2), 8–18.

Yao, M., Chen, J., Zheng, J., Song, M., McClements, D. J., & Xiao, H. (2013). Enhanced

lymphatic transport of bioactive lipids: cell culture study of polymethoxyflavone

incorporation into chylomicrons. Food & Function, 4(11), 1662–1667.

Yee, S. (1997). In vitro permeability acrros CaCo-2 cells (Colonic) can predict in vivo (small

intestinal) absorption in man-fact or myth. Pharmaceutical Research, 14(6), 763–766.


Yun, S.-M., Lee, M.-H., Lee, K.-J., Ku, H.-O., Son, S.-W., & Joo, Y.-S. (2010). Quantitative

analysis of eugenol in clove extract by a validated HPLC method. Journal of AOAC

International, 93(6), 1806–1810.

Zhao, K., & Singh, J. (1998). Mechanisms of percutaneous absorption of tamoxifen by

terpenes: Eugenol, D-limonene and menthone. Journal of Controlled Release, 55(2-3),

253–260.

Zhou, J., Sun, X. L., & Wang, S. W. (2008). Micelle-mediated extraction and cloud-point

preconcentration of osthole and imperatorin from Cnidium monnieri with analysis by

high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. A, 1200(2), 93–

99.

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