Valencia,julio2020

TrabajodefindegradoenBiotecnología

Empleodeherramientasbiotecnológicasderecableadoyedicióngénicapararedirigirflujos

metabólicosasociadosalaglicolisisenSaccharomycescerevisiae

Autor:JaumeUlzurrundeAsanzaSàez

Tutora:AmparoPascual-AhuirGiner

Curso:

2019-2020

RESUMENDatosdelTFGAutor JaumeUlzurrundeAsanzaSàezTutor Dra.AmparoPascual-AhuirTitulación GradoenBiotecnologíaTítulodeltrabajo “Empleo de herramientas biotecnológicas de recableado y

edicióngénicapara redirigir flujosmetabólicosasociadosa laglicolisisenSaccharomycescerevisiae”

Lugarderealización InstitutodeBiologíaMolecularyCelulardePlantas(IBMCP)Localidadyfecha Valencia,septiembrede2020Palabrasclave:IngenieriaMetabolica,Glicolisis,CRISPR-cas12,SaccharomycescerevisiaeResumenLa manipulación dirigida de flujos metabólicos es de gran interés biotecnológico,sobretodoporelempleoindustrialdemicrorganismoscomofactoríasdeproductosdegranimpactoeconómico;ypermitelaobtencióndevaliososproductosdirigidosala medicina como son vacunas y fármacos, a un coste relativamente reducido. Elmetabolismo en su conjunto es un sistema complejo, donde las diferentes rutasmetabólicassecoordinany regulan finamenteparaasegurar lahomeostasiscelular.Lamodificacióndeestosflujosmetabólicosendireccionesconcretaseselobjetivodemuchos grupos de investigación, pero la manipulación racional del metabolismoresulta ser bastante compleja, y requiere la optimización de nuevas estrategias. Eneste trabajo trataremos de utilizar una tecnología basada en el recableado consistema cohesina-Dockerina en Saccharomyces cerevisiae, que permite lamanipulación de la localización celular de proteínas, en nuestro caso trabajaremosconlosenzimasglicolíticosHxk2yFba1,yestudiaremossiuncambiodelocalizaciónde estos enzimas a la membrana externa mitocondrial influye al equilibrio entrefermentación y respiración. Además realizaremos este proyecto comparando dosmétodos de edición génica, uno tradicional donde la manipulación se realizaaprovechando la alta tasa de recombinación homóloga en levadura, otro másinnovadormediante la tecnología CRISPR-cas12, de gran interés para el empleo decepasindustriales.

Keywords:MetabolicEngineering,Glycolysis,CRISPR-cas12,SaccharomycescerevisiaeAbstract:The directed manipulation of metabolic flows is of great biotechnological interest,mainly due to the industrial use of microorganisms as factories of products ofsignificanteconomicimpact;anditallowsobtainingvaluablemedicineproductssuchasvaccinesanddrugs,ata relatively lowcost.Metabolismasawhole isa complexsystem,wherethedifferentmetabolicpathwaysarefinelycoordinatedandregulatedtoensurecellularhomeostasis.Modifyingthesemetabolicflowsinspecificdirectionsis the goal ofmany research groups. Still, the rationalmanipulation ofmetabolismturnsouttobequitecomplicatedandrequirestheoptimizationofnewstrategies.Inthiswork,wewill try to use a technology based on the rewiringwith the cohesin-Dockerin system inSaccharomycescerevisiae,whichallows themanipulationof thecellular location of proteins. In our case, wewill work with the glycolytic enzymesHxk2andFba1,andwewillstudyifachangeinLocalizationoftheseenzymestothemitochondrial outer membrane influences the balance between fermentation andrespiration.Wewillalsocarryoutthisprojectcomparingtwogene-editingmethods:Thetraditionalapproach,wheremanipulationiscarriedout,takingadvantageofthehigh rate of homologous recombination in yeast. And the more innovative, usingCRISPR-cas12technology,ofgreatinterestfortheuseofindustrialstrains.

AGRADECIMIENTOSEstetrabajomarcaelfinaldemisestudiosenelgradodeBiotecnología,unrecorridoquemehaayudadoa tantoenelámbitoacadémico,aportándome lasherramientasnecesarias para poder progresar en mi futuro profesional; como a nivel personal,mostrándomemiscarenciasyayudándomeasuperarlasparamejorarcomopersona,trabajadorycompañero.Sin embargo, esto no habría sido posible sin la ayuda demultitud de personas a lolargodeestoscuatroaños.Enprimer lugar,queríaagradeceratodoselprofesoradode Biotecnología de la UPV por su esfuerzo y dedicación a la hora de impartir susconocimientos, tanto teóricos como prácticos, estando siempre dispuestos aayudarnos si fuera necesario. En especial,me gustaría agradecer a Amparo Pascual-AhuirGinerporconfiarenmiyaceptarsermitutoraenesteproyecto.Heaprendidomucho gracias a sus explicaciones y su constante atención, y este trabajo nohabríasidoposiblesinsuayuda.Tambiénquería agradecer el apoyodemis compañeros y amigos, que a lo largo deestoscuatro largosañosdeestudiohancompartidoconmigomuchasexperiencias,ycuyoapoyoycompañíamehanayudadoaseguiradelantemásvecesdelasquepuedocontar.Finalmente,queríaagradeceramispadreselincondicionalapoyoquehandadotodoestetiempo.Sinellos,nohabríasidocapazdellegarhastadondeestoyahoramismo,siempredispuestos adejarlo todopara ayudarmeen losmomentosdifíciles, inclusocuando yo había perdido la esperanza. Muchas gracias por estar a mi lado, sinvosotros,nadadeestohabríasidoposible.

ABREVIATURASORFmarcodeabiertodelecturaMFAanálisisdeflujometabólicoGC-MScromatografíadegas-espectrometríademasasLC-MScromatografíalíquida-espectrometríademasasCoFPpredictordefuncióncondicionalHxk2hexokinasa2Fba1fructosa-bifosfatoaldolasaAlsSα-acetolactadosintasaAlsDα-acetolactadodescarboxilasaG6Pglucosa6-fosfatoF6Pfructosa6-fosfatoPFK-1fosfofructoquinasaDHAPdihidroxiacetonafosfatoG3Pgliceraldehído3-fosfatoNADHnicotinamidaadeninadinucleótidoATPadenosíntrisfosfatoADPadenosíndifosfatoPEPfosfoenolpiruvatoCRISPR agrupaciones de repeticiones palindrómicas cortas regularmenteinterespaciadasADNácidodesoxirribonucleicoARNácidoribonucleicocrARNARNnocodificantePAMmotivoadyacentealosprotoespaciadorestracrARNcrARNtrans-activantegARNARNguíaPIdominiodeinteracciónconPAMLBmedioLuriaBertani

ÍNDICEINTRODUCCIÓN.....................................................................................................................1

1. USOSDELEVADURA..........................................................................................................1a. SACCHAROMYCESCEREVISIAE......................................................................................2

2. INGENIERÍAMETABÓLICA.................................................................................................3a. MODIFICACIÓNDELALOCALIZACIÓNDELAPROTEÍNA...............................................5

3. SISTEMACOHESINA-DOCKERINA......................................................................................74. LAGLICOLISIS.....................................................................................................................85. CRISPR.............................................................................................................................10

OBJETIVOS...........................................................................................................................12MATERIALYMÉTODOS........................................................................................................13

MATERIALBIOLÓGICOYCONDICIONESDECRECIMIENTO.....................................................................13Condicionesdecrecimientodelevadura............................................................................13Condicionesdecrecimientodebacteria.............................................................................13Cepas,plásmidosycebadoresempleados.........................................................................13

METODOLOGÍAEMPLEADA...........................................................................................................141.TransformarE.Coliypurificar........................................................................................152.ObtencióndelfragmentoTAP-DOC................................................................................153.ObtencióndelascepashxK2-TAPyFba1-TAPdelacolección.......................................164.TransformacióndelascepasHxK2-TAPyFba1-TAPconfragmentoTAP-DOC.Seleccióncongeneticina:...................................................................................................................175.ObtencióndelplásmidopUG27......................................................................................186.ObtencióndelfragmentoOM45-COH............................................................................197.ObtencióndelascepasHxK2-TAP-DOCyFba1-TAP-DOC...............................................208.TransformacióndecepasTAP-DOCconfragmentoOM45-COH:selecciónconauxotrofíadehistidina.........................................................................................................................20

DISCUSIÓNYCONCLUSIONES..............................................................................................22BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................25

ÍNDICEDEFIGURASINTRODUCCIÓNFigura1.Esquemadelaglicolisis(Zaraetal.,2017)........................................................9MATERIALESYMÉTODOSFigura2.Esquemadetrabajopararealizarlatransformaciónencepasdelevaduraen

transformacionesconsecutivas..............................................................................14Figura3.EsquemaPCRpUG6-DOCconTAP...................................................................16Figura4.EsquemaPCRpUG27confragmentosTAP-DOC.............................................18Figura5.GeldeelectroforesisprocedentedelacomprobacióndelaPCRdepUG27..19Figura6.EsquemaPCRpUG27-COHconOM45.............................................................20Figura7.EsquemaPCRdecomprobación......................................................................21DISCUSIÓNYCONCLUSIONESFigura 8. Esquema de trabajo de la transformaciónmediante CRISPR (Ciurkot et al.,

2019)......................................................................................................................22ÍNDICEDETABLASMATERIALESYMÉTODOSTabla1.Cepasyplásmidosutilizadosenelestudio.......................................................13Tabla2.Cebadoresempleadosenelestudio.................................................................14

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INTRODUCCIÓN

1. USOSDELEVADURALas levaduras tienen una amplia gama de usos, principalmente en la industriaalimentaria (incluyendo vinicultura, elaboración de cerveza, obtención de productosdestiladosyhorneado)y laproduccióndebiomasa (como laobtencióndeproteínasunicelulares). En los últimos años se ha expandido su uso a otros campos, como laindustria del biocombustible y la obtención de compuestos heterólogos. El usoprincipal de las levaduras proviene de su capacidad metabólica para realizartransformaciones de azúcares a alcohol etílico y dióxido de carbono en condicionesanaerobias.Además,soncapacesdecrearungrannúmerodecompuestosdesaborsecundarios,locualimplicaatributosorganolépticosespecíficosadistintosproductosalimenticios.Sin embargo, su capacidadmetabólica no se limita a su actividad fermentativa. Losprincipales factores que influyen en el metabolismo de las levaduras son ladisponibilidad de oxígeno y la fuente de carbono utilizada (Żymańczyk-Duda et al.,2017).A pesar del uso intensivo de las levaduras en aplicaciones biotecnológicas yfermentaciónindustrial,aúnsepuedenmejorar,yaqueestosprocesosnosuelenusarlas levaduras más adecuadas. Esto se debe a que las levaduras industriales seseleccionaron debido a razones históricas, generalmente poco optimizadas, en lugarde realizarse una selección cuidadosa para cada aplicación específica. Debido a lademandasdeunamayorproductividad,másrangodeusodesustratos,laproducciónde compuestos no convencionales y el cambio en las preferencias de losconsumidores; ha sido necesario mejorar las cepas industriales empleadas yseleccionarodesarrollarcepasconnuevaspropiedades.Las levaduras representan un grupomuy diverso de organismos, habiendo grandesdivergenciasgenéticasentrecepasdelamismaespecie.Estadiversidadnaturaldelaslevaduras se ha evidenciado gracias a las tecnologías de secuenciación de próximageneración,quepermitenunacaracterizaciónprofundadelavariacióngenética.La recombinación sexual es el proceso más importante para la generación dediversidadgenéticaeneucariotassuperiorescomoanimalesyplantas.Enelcasodelaslevaduras con ciclo de vida sexual, como Saccharomyces cerevisiae, ocurre unfenómeno similar, ya que la reproducción sexual puede remodelar el genoma dedistintas cepas de levadura, alterando sus características. Aunque la recombinaciónsexualesconsideradoelmétodomás“natural”,tambiénsepuedendarapareamientosentrecepasoespeciesencondicionesindustriales,comoeselcasodeS.pastorianus,unhíbridodeS.cerevisiaeyS.eubayanus.Adiferenciadelaseucariotassuperiores,laslevaduras,entreellasSaccharomycesspp,son capaces de reproducirse asexualmente. Esta proliferación asexual vegetativa esmuchomásprevalentequesualternativasexual,dándoseunciclomeióticocada1000divisiones mitóticas. Durante los ciclos de reproducción asexual se pueden darmutaciones espontáneas, como mutaciones puntuales, InDels, inserción detransposonesoeventosderecombinación(Steenselsetal.,2014).

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Aunque lasmutaciones espontáneas son una de las principales fuerzas evolutivas ypermitenque losorganismosseadaptenadistintosnichosecológicos, lamayoríadelas mutaciones son neutrales o incluso deletéreas (Drake, 1991). La mayoría de lasespecies de levadura (incluyendo S. cerevisiae) existen en un estado diploide quepuedeenmascarar los efectosde lasmutacionesdeletéreas. Estopuedeprovocar laacumulacióndemutacionesduranteelcrecimientoasexual, loque llevaacepasconalta carga de mutación. Sin embargo, debido a la complejidad del ciclo sexual, laslevaduras puede filtrar estas mutaciones deletéreas por un proceso denominado“renovacióndegenoma”.Ademásdelarecombinaciónsexualylasmutacionesespontáneas,latransferenciadematerial genético a través de mecanismos asexuales, denominada transferenciahorizontaldegenes,puedecontribuiraladiversidadgenética.Finalmente,tambiénpuedenocurrircambiosenelniveldeploidía,locualpuedetenerefectosfenotípicosprofundos,comoseobservaenS.cerevisiae,quesufrióuneventode duplicación del genoma completo hace 100 millones de años. Este fenómenopermiteelusodelosgenesduplicadosparacompararlosydeterminarelefectodelasmutacionesenlosgenes(Steenselsetal.,2014).La producción anual de S. cerevisiae es superior a la del resto demicroorganismosindustriales, siendo unos dos ordenes de magnitud superior a estos. El valoreconómicodelasbebidasylosalimentosfermentadosporlevadurassonenormes.Laslevaduras sonmuy importantes enmuchos ámbitos, como el científico, alimentario,médicooagrícola.Laslevaduras,sobretodoS.cerevisiae,seusancadavezmáscomohospedadores para al expresión de biocatalizadores de proteínas y rutas de multi-enzimasparalasíntesisdeproductosquímicosycompuestosdebajopesomolecularimportantes para la medicina o nutrición. Dentro de la agricultura, la levadura seemplean como agentes de biocontrol, biorremediación e indicadores de calidadambiental(Türker,2014).

Unodelosusosmásimportantesdelaslevadurasesenlabiologíaparalaproducciónde biofármacos. En este ámbito S. cerevisiae es una de las especies de levadurapredominantes,aunqueexistenotrasquepresentancaracterísticasinteresantes,comocapacidaddesecretarelevadacantidaddeproteína(PichiapastorisyP.angusta),decrecimientoaaltatemperatura(Kluyveromycesmarxianus)odeproducirunaelevadacantidaddelípidos(Yarrowialipolytica)(Walkeretal.,2018).Alrededor de un 20% de la producción total de biofármacos se debe al uso de S.cerevisiae, entre los cuales se encuentra la insulina (Nielsen, 2013), cuyodescubrimiento en 1922 por Banting, Best yMcLeod fue un avance decisivo para lamedicina (Quianzon et al., 2012). Otros biofármacos provenientes de esta levaduraincluyen la albumina del suero humano, la hirudina, la transferrina humana, elglucagónyprecursoresdeantígenosdesuperficiedehepatitis(Houetal.,2012).

a. SACCHAROMYCESCEREVISIAES. cerevisiae es la principal levadura utilizada en biotecnología a nivel mundial,principalmente por su fisiología única y su papel clave en muchos procesos defermentación de alimentos y otros procesos industriales. También es el principalorganismomodeloeucariota,ampliamenteempleadoenestudiosfundamentales.LosSaccharomycetalescomprendenungrupodiversosdelevadurasascomicetas.

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Irónicamente,apesardelagranimportanciadeS.cerevisiae,seconocerelativamentepocode su origen y su estilo de vida natural. Las cepas industriales “domesticadas”suelendiferenciarsedelascepasdelaboratorioydelascepas“salvajes”tantoensuspropiedadesfisiológicascomogenéticas(Johnsonetal.,2011).Además es un organismo muy abundante con un ciclo de vida asexual y genomapequeñoyampliamenteestudiado(Mustacchietal.,2006), loquefacilitasuempleotanto industrial como para la investigación. Existen otros factores, incluyen uncrecimiento rápido en medios minerales suplementados únicamente con vitaminas,muchas fuentes de carbono y nitrógeno para su crecimiento, alta obtención debiomasaapartirde fuentesdecarbono,crecimientoaerobiorápidoenquimiostatoslimitadosenglucosa,crecimientoenmediosconcondicionesanaerobiasestrictas,altaeficiencia de esporulación, viabilidad de esporas y eficiencia reproductiva, altaeficiencia de transformación, estabilidad genética y una buena producción deproteínasheterólogas,tantointracomoextracelularmente(vanDijkenetal.,2000).Cabedestacarqueposeeun genomapequeño, solamenteuna cuantas vecesmayorque el deEscherichia coliy 200 veces menor que el de células de mamífero, estosimplifica de manera importante el análisis genético y molecular del mismo. Unalevadurahaploidecontiene16cromosomasvariandoentamañode200a2200Kb,enlos cuales como resultadodel análisis de la secuenciadel genoma, se localizaronuntotalde6183marcosde lecturaabiertos(ORF,openreadingframe)ysepredijoquedeéstos,5800correspondíanagenesquecodificabanparaproteínas(Gonzalezetal.,2001).Gracias a estas características, y al hecho de ser el primer organismo eucariotasecuenciado (Johnston, 1996), S. cerevisiae ha sido útil para el estudio del resto deeucariotas.Cómoesposiblededucirelfuncionamientodelascélulashumanasapartirdelevaduras,ymuchasdelasmutacionespatológicassedanengenesquepresentanortólogosenlevaduras,esposiblerealizarelestudiodelasenfermedadeshumanasenlevaduras modelo (Bolotin-Fukuhara et al., 2010). Entre estas enfermedades seincluyen los desordenes neurológicos, debidos a la agregación y al plegamientoincorrecto de proteínas y, aunque las levaduras carecen de un sistema nervioso,muchasde lasrutasdeseñalizaciónmolecularyde lasproteínasafectadasporestosdesordenesestánpresentesenlasmismas(Bharadwaj,etal.,2010).S. cerevisiae es empleado específicamente para los estudios mitocondriales sinnecesitar lamuerte celular, debido a su capacidad de perder genomamitocondrial,siempreycuandoseleaporteunsustratofermentativo.Hayquetenerencuentaquelas funcionesmitocondriales sonmuy variadas, al igual que el origen nuclear de laspatologías; por ello, el uso de las levaduras para estudiar estos defectos es muyimportanteparacomprenderlapatologíahumana(Rinaldietal.,2010).

2. INGENIERÍAMETABÓLICAEl campo de la ingeniería metabólica se define como la “mejora directa de laformacióndeunproductoode laspropiedadescelularesatravésde lamodificacióndereaccionesbioquímicasespecíficasolaintroduccióndenuevosgenesconelusodela tecnología de DNA recombinante” (Stephanopoulos et al., 1998) La ingenieríametabólicasediferencióde la ingenieríagenéticaporsuenfoqueen la investigación

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de las propiedades de las rutas metabólicas integradas y las redes genéticasreguladoras, en lugar del estudio individual de genes y enzimas. En este sentido, laingenieríametabólicaprecedealabiologíadesistemasalliderarlanecesidaddeunavistasistémicade lasrutasmetabólicasydeaproximacionesparasufuncionamientoóptimo.Laingenieríametabólicatieneunavertienteindustrial,yaquesuobjetivoesconstruirmicrobiosquesepuedanusarcomobiocatalizadoresparaunaproducciónrentabledecombustiblesycompuestosquímicosy farmacéuticos.Por tanto, incluyemuchomásquejuntargenesparaconstruirunarutabásicafuncional,locualesotradiferenciadela ingenieríametabólicarespectoaotroscamposcon losquesesuperpone,como labiologíasintética.Conelobjetivodesuperproducircompuestosespecíficos,laprimerapreguntaateneren cuenta es que rutas se puedenusar para producir el compuesto de interés. Estacuestióneslamismaqueseplanetaenlaquímicaorgánicasintética,exceptoqueenestecaso las reaccionesdebenser favorables termodinámicamentebajocondicionesbiológicas,losmetabolitosintermediosnodebensertóxicos,ylasenzimasrequeridasdeben poder ser expresadas por el organismo hospedador. Muchas veces lainterconectividad de las reacciones metabólicas es tal que el número de rutaspotenciales que ligan substrato a producto es inmenso, por lo que es necesariocompararlasrutassiguiendodistintoscriterios.Una vez se han establecido las posibles rutas, el siguiente paso en el diseño de laproducción de fenotipos es analizar la velocidad a la que estas rutas operan y suarquitecturadecontrol,traslocualseproponenobjetivosparamodificar.Elprincipalmétodoparaanalizarlasrutaseslaplataformadeanálisisdeflujometabólico(MFA),enlaquelosflujossedeterminanbajodistintascondicionesysusdesviacionesdelascondicionesdecontrolseusanparaidentificarpasoscinéticos limitantes(Ostergaardetal.,2000).Como el metabolismo y la fisiología de los organismos se comprenden mejor si setienenbuenasherramienta,losmicroorganismosmodeloscomoE.coliyS.cerevisiaesiguen siendo los organismos más utilizados para la bioproducción de diversosproductos. La ingenieríametabólica consta de dos partes: un cuidadoso análisis delsistema celular (parte de análisis o fisiología) y la construcción de la ceparecombinante(partedesíntesis).Enalgunoscasossepuedealterarelordendeestaspartes,peroencualquiercasoesimportantequeestasvayanmanoamano.EnlaingenieríametabólicadeS.cerevisiae,lapartedesíntesisesrelativamentesimple(siempre que los genes ha expresar estén disponibles), siendo más limitante lafisiología. Esto se debe a la complejidad del metabolismo celular, ya que losmetabolitospodríaninteractuarconlaexpresióndegenesy,portanto,laexpresióndegenes podría determinar los niveles de metabolitos a través de concentracionesenzimáticas.Además,enmuchoscasossonnecesariasmúltiplesmodificaciones,cadaunadelascualespuedepresentarcambiosinesperadosenelmetabolismocelular.Losavances en diferentes tecnologías han permitido realizar un análisis mucho másprofundode la fisiología celular. Entreestas tecnologías seencuentran losarraysdeDNAparaanálisisdel transcriptoma,electroforesisengelbidimensionalparaanálisisdelproteoma,métodosdecromatografíadegas-espectrometríademasas(GC-MS)yde cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para análisis delmetaboloma,experimentosdeetiquetadode13Cparaelanálisisderedesmetabólicas,

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experimentosdefermentaciónavanzadaconmonitoreoon-linedevariablesdecultivoimportantes,ybioinformática(Woolstonetal.,2013).Generalmente,elobjetivode la ingenieríametabólicaesmaximizar laproduccióndeun químico específico; coincidiendo a veces con maximizar el crecimiento delorganismo. Las reconstrucciones de redesmetabólicas combinan datos genómicos ymetabólicosparaunarutaotodounorganismo.Cuandoelgenomadeunorganismoseha secuenciado, las reconstruccionesmetabólicas sepueden construir a partir debasesdedatosdesecuenciasanotadaspreviamente.Sepuedenemplearherramientasde alineamiento local, como BLAST, para alinear secuencias desconocidas a otrasanotadas.Muchade la informaciónempleadaporestas reconstrucciones seobtienede bases de datos comoKREGG, BRENDAo Biocyc.Hay programas disponibles paraautomatizar el proceso de reconstrucciones de redes, como KAAS o GLOBUS, queproporcionanprobabilidadescuantitativasparacadaanotación.Laredreconstruidosevisualizaatravésdeunareddereacciónmetabólicaquemuestralaestequiometríadelasinteraccionesbioquímicas(Choietal.,2019).DentrodeesteámbitoS.cerevisiaeesunodelosorganismosmásempleados,comoeselcasodelaproduccióndelicopeno.Ellicopenoesuncarotenoidequeseencuentraenvegetablesyfrutas,principalmenteeltomate,yesunimportanteantioxidanteconefectosfisiológicospositivos,comoprevencióndecáncer.Debidoaesto,tieneungranvalorcomercialysehaintentadollevaracabosuproducciónendiferentesorganismoscomoBlakesleatrispora,E.coli,aunqueestosnohansidocapacesproducir licopenode forma satisfactoria, ya que requieren inhibir la función ciclasa y provocan laliberación de la endotoxina 14 respectivamente. A diferencia de los organismosanteriores,S.cerevisiaesíescapazdeproducir licopenosinefectosnodeseados(Shietal.2019).Otro campo en el que el empleo de ingeniería metabólica en S. cerevisiae esfundamental es la obtención de biocombustibles como el etanol. El etanol es unbiocombustible de primera generación que se usa por si mismo o mezclado congasolina, y su principal productor esS. cerevisiae. Para evitar la competencia con laalimentación,seintentaemplearrecursosnoalimentarios,comopolímeros,dímerosymonómeros; que de manera natural no son metabolizables por S. cerevisiae. Sinembargo,graciasalaingenieríametabólica,sepuedemodificarlarutacatabólicadelagalactosaparapermitir laobtencióndeestebiocombustibleen la levadura (Hongetal.,2012).

a. MODIFICACIÓNDELALOCALIZACIÓNDELAPROTEÍNALadistribucióndeunaproteínaencompartimentoscelularesdependede(i)lostiposynúmerosdeseñalesdelocalizaciónenlaproteína;(ii)lafuerzarelativadecadaseñal;(iii) la concentración de moléculas difundidas libremente; y (iv) la concentración yactividaddelosreceptoresdelasseñalesdelocalización(Baueretal.,2015).Lalocalizaciónsubcelulardeunaproteínaesdegranimportancia,yaquedeterminaelambienteenelquepuedefuncionar.Esvitalquelasproteínasselocalicenenlugaresdonde puedan interactuar con sustratos metabólicos, ácidos nucleicos u otrasproteínas; permitiendo que actúen los mecanismos subcelulares que apuntalan el

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funcionamientocorrectodelascélulas.Enmuchoscasoslalocalizaciónsubcelulardelas proteínas es altamente dinámica, habiendo proteínas que se desplazancontinuamente, mientras que otras se localizan en compartimentos subcelularesespecíficos.Además,haymuchasproteínasque sedesplazanen respuestaa señalesexternaseinternas.Sonmuchoslosfactoresquecontrolandondeselocalizanlasproteínasysesabepocodelosmismos.Enalgunoscasoslasseñalescodificadasenlasecuenciaprimariadelaproteína controlan su destino final. Esto se puede basar en característicaspsiquicoquímicas, como las etiquetas de secuencias C-terminales HDEL o KDEL. Enotros casos, las proteínas se trasladan a un nicho subcelular basándose eninteracciones entre compañeros proteicos, como la proteína quinasa PRAK, quecontiene una secuencia de localización nuclear determinada por que isoforma de lakinasap38aguasarribaseune.Eldestinodeunaproteínatambiénestáinfluidoporlasmodificacionespost-transcripcionales,comoelsplicingalternativo.Múltiples estudios informan del uso de etiquetas de proximidad para estudiar lalocalizaciónsubcelulardelasproteínasenS.cerevisiae.Lapremisadeestosmétodosesqueunaenzimacapazdebiotinilar, generalmentebiotin ligasa (BirA)oascorbatoperoxidasa(APEX),seusacomoetiquetaenORFsespecíficosdeinterésexpresadosinvivo.Lalocalizaciónproteicasepuedeestudiarcaracterizandolapresenciaoausencia,oladiferencia relativa en abundancia, de proteínas de preparados de uno o múltiplesorgánulos.Hayquetenerencuentaquelasproteínasquepuedenencontrarseenmásdeunalocalizaciónsubcelularnosedistinguenmedianteestemétodo.Múltiplesestudioshanutilizadoaproximacionescuantitativasbasadasencorrelaciónde perfiles para mapear el proteoma espacial a escala de célula completa. Estosmétodossebasanenlaobservacióndequecuandoloslisadoscelularessefraccionan,lasproteínasquese localizanenelmismolugarsubcelularsecomportarándeformasimilar.Eletiquetadofluorescentedeproteínashaemergidocomounaherramientapoderosapara visualizar la localización de proteínas individuales por microscopía a escala decélula completa en S. cerevisiae. Las variantes de este método se han usadoextensivamenteparaelmapeoespacialdelproteomaenvariascondicionesdeestrés:produciendounavariantedelmapadereferencia(encondicionesdenoperturbación)(Nightingaleetal.,2019).Para predecir la localización dependiente de condición y la función bajo distintosestreses,sehadesarrolladounframeworkdepredicciónbasadounareddeproteínasqueusamúltiplescaracterísticastantodeproteínas individualescomode losvecinosconlosqueinteractúa;esteframeworksedenominapredictordefuncióncondicional(CoFP).CoFPsebasaenasumirquelasproteínasqueinteractúanentreellasysecoexpresantienenlugaresyfuncionessimilares.Paracomprobarestoseexaminaronlosacuerdosfuncionales entreparesdeproteínasdividasen varios grupos: (i) todos losparesdeproteínas que interactúan, (ii) todos los pares de proteínas con correlación positiva

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(coeficientedecorrelaciónpearsonγ≥0,3)osincorrelación(-0,3<γ<0,3)entrelospatrones de expresión; y (iii) pares de proteínas que interactúan con correlaciónpositiva, negativa o sin correlación entre los patrones. Muchas proteínas queinteractúanentresícompartenelmismoproceso(>62%),función(>35%)olocalización(>58%)encontrasteconloqueseesperasifuesealazar.Posteriormente se analizaron los perfiles de expresión obtenidos bajo 17 estresesdiferentes para calcular la puntuación de coherencia funcional entre los pares deproteínasqueinteractúanencadacondición.Trasesto,sepredijeronlaslocalizacionesy funciones de las proteínas en cada condición. En la mayoría de los casos, lalocalización y función de la proteína en condición de estrés era consistente con suestadonatural.Las proteínas cuya localización cambiaba más frecuentemente sufrían undesplazamientodelamitocondriaalnúcleo,odelretículoendoplasmáticoalaparatodeGolgi(Leeetal.,2014).Enesteestudiosevaatrabajarcondosproteínas, lahexokinasa2(codificadaporelgenHXK2)ylafructosa-bifosfatoaldolasa(codificadaporelgenFBA1).La hexokinasa 2 se encuentra tanto en el citosol, el núcleo, la mitocondria y lamembranamitocondrial(UNITPROT,2020b).La fructosa-bifosfato aldolasa se encuentra en la pared celular, la membranaplasmática,elcitosolylamitocondria(UNITPROT,2020a).

3. SISTEMACOHESINA-DOCKERINALa segregacióndecromátidashermanasenpolosopuestosdeunacéluladurantesumitosis es un evento muy importante en la célula. La cohesión de las cromátidashermanasesesencialparapreparar lasconexionesentre loscinetocoroshermanosyhusocromático.Estacohesiónesposiblegraciasauncomplejoproteicodenominadocohesina. Éste presenta un núcleo con dos proteínas Smc, Smc1 y Smc3, y dosproteínas no Smc, Scc1 y Scc3 (Nasmyth et al., 2009).Unode los posibles ligandosenzimáticosdeestecomplejoesladockerina(Jobstetal.,2015).El sistema cohesina-dockerina representa una interacción proteína-proteína de altaafinidad (Kd 10-9-10-10 M), que tiende a ser inespecífica dentro de una especie yespecíficaentreespeciesdistintas.Portanto,unacohesinadeunaespecietendríaquesercapadereconoceryunirseatodaslasdockerinasdelamismaespecie,peronoconlasdeotrasespeciedistinta.Estesistemapresentadostiposdeinteraccionesdistintas,denominadasdetipoIydetipoIII.Sehaobservadoqueen las interaccionesde tipo Inoesnecesariaunasimetríacasiperfectaenlasecuenciayenlaestructuradeloselementosrepetidosdeladockerinapara llevaracabo launióna lacohesina.Además,unadockerinasepuedeunirasucohesinayaseamediantesuprimerosegundomotivorepetido.En el caso de las interacciones de tipo III se ha comprobado que los residuosespecíficos de especie putativos son pequeños e hidrofóbicos. Por otra parte, esposible que la dockerina de tipo III se una a la cohesina de forma no simétrica,actuandoambossegmentosdeformaequitativa(WEIZMANNINSTITUTEOFSCIENCE,2020).

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Este sistema multi-enzimático, denominado celulosoma, se caracteriza por laproximidadespacial de las celulasas ligadas a suestructura, lo cual proporcionaunagraneficienciadegradandosustratoscelulósicos.Sinembargo,estenoeselúnicousoal que se limita el sistema, sino que también es importante para la purificación deproteínas,elusocomobiosensorolaconstruccióndecomplejosenzimáticosestáticos(Kimetal.,2014).El estudio de la organización espacial de las enzimas metabólicas ha dado lugar alefecto de canalización de sustratos, el cual tiene muchas posibles ventajas, comoprevenir la perdida de intermediaros en rutas con las que se compite, reducir laacumulacióndeintermediariostóxicos,protegerintermediariosinestablesyaumentarlastasasdeconversión(Kimetal.,2016).Hanhabidomúltiplesestudiossobreelusodelcelulosomaparaalterarlaorganizaciónespacial de las enzimas. El primer caso fue el de la conversión de piruvato a 2,3-butanodiol mediante el uso de las proteínas α-acetolactado sintasa (AlsS) y α-acetolactadodescarboxilasa(AlsD)unidasadockerinayposteriormenteensambladasa un andamio con múltiples dominios de cohesina. La canalización de sustrato fueexitosa,consiguiendocanalizarα-acetolactatoen2,3-butanodiol,aunquenodeformatan eficiente como la ruta de producción del etanol nativo (Kim et al., 2014). Otroestudio ha tratado de emplear la canalización de sustratos en el flujo defraccionamientodepiruvato.Paraello se sobreexpresaronenzimasconvertidorasdepiruvatocondockerinafusionada,consiguiendoaumentarelflujodepiruvatotantoenlaproduccióndelactatocomoenlade2,3-butanodiol(Kimetal.,2016).

4. LAGLICOLISISLaglicolisisesunarutametabólicayfuenteanaerobiadeenergíaquehaevolucionadoen casi todos los organismos. El proceso consiste en la oxidación de moléculas deglucosa, consumiéndose una molécula de glucosa y 2 moléculas de ATP paraproducirse4moléculasdeATP,2deNADHy2piruvatos.La glicolisis ocurre en el citosol de la célula, siendo capaz de crear ATP con o sinpresencia de oxígeno. En el caso de las células que emplean la respiración aerobiacomoprincipalfuentedeenergía,elpiruvatoseempleaenelciclodelácidocítricoysufreunafosforilaciónoxidativaparaoxidarseendióxidodecarbonoyagua.Entejidoaltamenteoxidativolaproduccióndepiruvatoesimportanteparalasíntesisdeacetil-CoAydeL-malato, sirviendocomoprecursordemuchasmoléculas,comoel lactato,alaninauoxaloacetato.Laglicolisistienedosfasesdistintas:lafasedegastoenergéticoylafasedebeneficioenergético.Durante la fase de gasto energético se consume la energía en formadeATP,mientrasquedurante la fasedebeneficioenergéticosecrean lasmoléculasdeNADHyATP.Enlafasedegastoenergéticoseañaden2fosfatosalaglucosa.Laglicolisisempiezacon lahexokinasa fosforilando laglucosaenglucosa6-fosfato (G6P), consumiéndoseasíelprimerATPdeformairreversible.Lafosforilaciónatrapalamoléculadeglucosaenlacélulaalnopoderatravesarlamembranacelular.Apartirdeaquílafosfoglucosaisomerasa isomerizaG6Pen fructosa6-fosfato (F6P). Entonces, seañadeel segundofosfatopor la fosfofructoquinasa (PFK-1),queconsumeel segundoATPy fosforila la

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F6P en fructosa 1,6-bifosfato de forma irreversible. Posteriormente, la fructosa 1,6-bifosfato se lisa en 2 mediante la fructosa bifosfato aldolasa, obteniéndosedihidroxiacetonafosfato(DHAP)ygliceraldehído3-fosfato(G3P).LaDHAPseconvierteenG3Pmediante triosefosfato isomerasa.DHAPyG3Pestánenequilibrio,de formaquesetransformanentreellascontinuamente.

Figura1.Esquemadelaglicolisis(Zaraetal.,2017)En la fase de beneficio energético es importante recordar que hay 2 azúcares de 3carbonos por cada glucosa. La enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidroganasametabolizaelG3Pen1,3-difosfogliceratoalreducirNAD+enNADH.Posteriormente,el1,3-difosfogliceratopierdeungrupofosfatoporlafosfogliceratokinasa,obteniéndose3-fosfogliceratoy1ATPmediantefosforilaciónaniveldesustrato.Enestemomentose han creado 2 ATPs, uno de cada molécula de 3 carbonos. El 3-fosfoglicerato seconvierteen2-fosfogliceratopor la fosfogliceratomutasa,yunaenolasaconvierteel2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato (PEP). Finalmente, la piruvato kinasa conviertePEPenpiruvatoyfosforilaADPenATP,obteniéndose2ATPsdeformairreversible.En el caso de las células es fundamental que el NADH se recicle en NAD+ paramantener la glicolisis. En el caso de las células aerobias esto se hace mediante lafosforilación oxidativa, mientras que en células anaerobias se consigue porfermentación,yasealácticaoalcohólica(Chaudryetal.,2019).

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Respecto al papel regulatorio de la glucosa, la hexokinasa actúa comoun sensor deglucosaconservadaenvariosorganismos,comoS.cerevisiae,enelquelahexokinasa2(Hxk2p)estantounaenzimaglicolíticacomounreguladordelatranscripcióndegenesenelnúcleograciasasulocalizacióntantoenelcitoplasmacomoenlamitocondriayelnúcleo(Zhengetal.,2020).

5. CRISPRCRISPR es una familia de secuencias de ADN repetitivas cuyo nombre significa“agrupaciones de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas”(Jansenetal.,2002).LossistemasCRISPR-Cassonsistemas inmunesadaptativosquese encuentran en aproximadamente la mitad de las especies bacteriales y en lamayoría de las arqueas. Estos sistemas han evolucionado a lo largo de miles demillonesdeañosparadefenderalosmicrobiosdeácidosnucleicosforáneos,comoelgenoma de bacteriófagos. La maquinaria molecular involucrada en la inmunidadCRISPR-cas está codificada por el locus CRISPR en dos conjuntos de componentesgenéticosquesuelenestaradyacentesen losgenomasmicrobiales; (i)unoperóndemúltiples genes cas y (ii) un conjunto de CRISPRARNs no codificantes (crARNs) queincluyen los codificados por una matriz repetitiva CRISPR con espaciadores entrerepeticionescortasCRISPR.Los sistemas CRISPR-Cas median la inmunidad adaptativa en tres fases distintas:adaptación, procesado de crRNA e interferencia. Durante la fase de adaptación, unsubconjuntodeproteínasCasdenominadas“módulodeadaptación”obtieneeinsertafragmentos de un virus invasor u otro material genético foráneo en una secuenciaespaciador al principio de lamatriz CRISPR, junto con una nueva repetición CRISPRduplicada.Lasecuenciadelvirusoplásmidoquecoincideconelespaciadoradquiridosedenominaprotoespaciador.En segundo lugar, lamatrizdeCRISPR se transcribeyprocesaencrARNsindividualesquecontienenunfragmentodeARNcorrespondienteal encontrado previamente en el virus o plásmido, junto con una porción de larepeticiónCRISPR.Entercerlugar,durantelafasedeinterferencia,loscrARNsguíanel“módulode interferencia” codificado ya seapor el complejode subunidadesdeCasefectoroporunaúnicaproteínaefectora,destruyendoelinvasor(Zang,2019).Sin embargo, la importancia de este sistema radica en suuso comoherramientadeedición genética. Anteriormente la complejidad de desarrollar proteínas modularesque unan ADN a dianas específicas requería amplios conocimiento de ingeniería deproteínas;peroestoyanoesnecesariograciasaque laespecificidaddeCRISPR-Casdependedelosparesdebasesdelosácidosnucleicosenlugardereconocimientodeproteínas(Pickar-Oliveretal.,2019).Parallegaraestepuntohansidofundamentalesunaseriedehallazgos.Elprimerodeelloslugarfueobservarlasimilitudentrelassecuenciasespaciadoresadquiridasylosmotivosadyacentesa losprotoespaciadores(PAMs). Independientementedeestosedescubrió que de las muchas proteínas Cas, únicamente Cas9 tenía actividad enStreptococcus thermophilus; además de ser necesario dos ARN cortos para sufuncionamiento.FinalmenteseconsiguiótransferirelsistemaCRISPRdesdeunacepadebacteriaaotra, incluyendoE.coli (Zang,2019). EstudiosposterioresdemostraronquelasenzimasCas9puedenreprogramarseparaactuarsobreunasecuenciadeADN

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específicaenbacterias,ademásdesimplificarelsistemaCRISPRalemplearARNsimplecortoformadoporlafusióndecrARNycrARNtrans-activante(tracrARN),denominadoARNguía(gRNA),enlugardeusarambosporseparado.HayvariostiposdesistemasCRISPR/Cas,entrelosqueseencuentranelsistematipoII,caracterizadoporlaaccióndeunaproteínaCasespecíficadenominadaCas9(Jineketal., 2012). Otro sistema CRISPR/Cas empleado es el tipo V, caracterizado por lapresenciadelaproteínaCas12aenlugardelaCas9.EnelsistematipoII,Cas9identificaelADNobjetivousandosudominiodeinteracciónconPAM (PI)mediante el reconocimientode la secuencia PAM (específicamente5’-NGG-3’) semejante localizada aguas abajo del protoespaciador. Cas9 reconoce losnucleótidosconservadosPAMdG-2ydG-3graciasa interaccionesentredosresiduosdearginina.EstaactividadesreguladaporelARN.UnavezesreconocidoelPAMysepre-organizalasecuenciaenunaconformaciónhelicoidalA,Cas9activalaseparaciónde las cadenas de ADN y la formación del bucle-R. El dúplex de ADN objetivoadyacentealPAMsedesestabilizaatravésdeunmecanismodebloqueodebucledefosfato.LoscambiosdeconfiguraciónestabilizanladistorsiónestructuralenlacadenadeADNdeseadayjuegaunpapelimportanteenelemparejamientodebasesentreelARN guía y el ADN. Seguidamente, interactuando con la región pre-ordenada, unheterodúplexdeARN-ADN,desplazandolacadenanodeseada.Elheterodúplexformaunaestructuradebucle-Rjuntoconlasecuencianodeseada.Elbucle-Ractivaelcorteen un lugar específica a 3 pares de bases del PAM, generando principalmenteextremosromos.EnelsistemadetipoV,adiferenciadeCas9,Cas12anonecesitatracrARNysebastaconcrARNparaelcorte.Estaproteínacas reconoceelPAM(5’-TNN-3’)aguasarribadel protoespaciador, De forma similar a Cas9, Cas12a también sufre grandesreordenamientos estructurales, formando una hendidura para acomodar alheterodúplex ARN-ADN. Cas12a emplea un dominio catalítico RuvC para generarextremoscohesivos5nucleótidosdespuésdelPAM(Yaoetal.,2018).

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OBJETIVOSEl metabolismo es un sistema de gran interés, ya que su manipulación permiteobtenermuchosproductosimportantesdesdeunpuntodevistaeconómico,yaseapor su valor intrínseco o por reducir los costes de producción de compuestosimportantes para la población, como los fármacos. El objetivo de este trabajo esponer a punto una herramienta biotecnológica para la edición genética enSaccharomycescerevisiaemedianteelusodelsistemacohesina-dockerinasobre losenzimas glicolíticos Hxk2 y Fba1, viendo si el cambio de localización de estasproteínas a lamembranamitocondrial afecta al equilibrio entre la fermentación yrespiración. Para llevar a cabo este objetivo, se van a emplear dos métodos deedicióngenéticadistintos:

1. Inicialmente se realizará una técnica tradicional de manipulación queaprovechelaaltatasaderecombinaciónhomólogaenlevadura.

2. PosteriormenteseemplearálatecnologíaCRISPR-Cas12debidoasuinterésalusarcepasindustriales.

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MATERIALYMÉTODOSMaterialbiológicoycondicionesdecrecimientoCondicionesdecrecimientodelevaduraLascélulasdelevadurasecultivaronsiguiendométodosestándar(Holzetal.,2003),creciendoenunmedioricoYPDomediomínimoSDa28°Cenagitacióna200rpm.El medio YPD presenta glucosa (2%, m/v), peptona bacteriológica (2%, m/v) yextractodelevadura(1%,m/v).ElSDcontieneglucosa(2%,m/v),basenitrogenadadelevadura(YNB,0,7%,m/v)yácidosuccínico(50mM)apH5,5ajustadomedianteTris.El medio SD también se usó para seleccionar cepas mediante auxotrofías,suplementando los aminoácidos necesarios: histidina (100 µg/mL ), leucina (100µg/mL),metionina(100µg/mL)yuracilo(30µg/mL).Durantelaseleccióndecepaselmediosecomplementóconampicilina.CondicionesdecrecimientodebacteriaLascélulasbacterianascrecieronenunmedioLuriaBertani(LB)a37°Cenagitacióna200 rpm. Los componentes de este medio son: extracto de levadura (0,5%, m/v),triptona(1%,mv)yclorurosódico(1%,m/v).Deformasimilaralaslevaduras,enlaseleccióndeplásmidossesuplementaelmedioconampicilina(50µg/mL).Cepas,plásmidosycebadoresempleadosTabla1.Cepasyplásmidosutilizadosenelestudio.Nombre Característicasrelevantes ProcedenciaCepadeEscherichiacoli

DH5α Células quimiocompetenteseficientesparasubclonaje

ThermofisherScientific

Cepadelevadura

HXK2-TAP BY4741HXK2-TAP-His3 Ghaemmaghamietal.,2003

HXK2-Doc BY4741HXK2-TAP-Doc-Kan Enestelaboratorio

FBA1-TAP BY4741FBA1-TAP-His3 Ghaemmaghamietal.,2003

FBA1-Doc BY4741FBA1-TAP-Doc-Kan EnestelaboratorioOM45-Coh BY4741OM45-Coh-His3 Enestelaboratorio

HXK2-Doc-OM45-Coh BY4741 HXK2-TAP-Doc-Kan,OM45-Coh Enesteestudio

FBA1-Doc-OM45-Coh BY4741 FBA1-TAP-Doc-Kan,OM45-Coh Enesteestudio

Plásmidos pUG6-Doc Doc-[loxP-Kan+-loxP] EnestelaboratoriopUG27-Cohx2-Myc Cohx2-Myc-[loxP-His5+-loxP] Kimetal.,2016

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Tabla2.Cebadoresempleadosenelestudio.Cebadores Secuencia(5’-3’) ProcedenciaTAPDOCforward

CTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAAGTAGACGCGAATCATCAGTCTACTAAATTATACGGCGACGTC

ThermofisherScientific

TAPDOCreverse

TCGATGAATTCGAGCTCGTTAAACTGGATGGCGGCGTTAGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

ThermofisherScientific

KanB CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT ThermofisherScientific

ChkTAPDOC ATTCCAACTACTGCTAGCGAG ThermofisherScientific

OM45forward GATAAGGGTGATGGTAAATTCTGGAGCTCGAAAAAGGACCCTGTAACAACACCACCTGC

En estelaboratorio

OM45reverse TAGATATATAACGGTATTTTATGTATGCAGCTATACCCCGCATAGGCCACTAGTGGATC

En estelaboratorio

OM45ChkTAP ATGGGGTGAAACAGCCGCTC ThermofisherScientific

MetodologíaempleadaElproyectotratadeelaborarunaherramientaparalatransformacióndeS.cerevisiaebasándoseentransformacionesconsecutivas.Paraello,seelaboróenunesquemadetrabajoqueindicatodoslospasosnecesariospararealizarlatransformacióndecepas,loscualessedesarrollaronalolargodelproyecto.

Figura 2. Esquema de trabajo para realizar la transformación en cepas de levadura entransformacionesconsecutivas

1 TransformarE.ColiypurificarObtencióndelplásmidopUG6-DOC

ObtencióndelfragmentoTAP-DOC

2.1

2.2

2

2.3

2.2

PCRpUG6-DOC(conprimersTAPDOCforwardyTAPDOCreverse)ComprobaciónmedianteelectroforesisPurificaciónCuantificaciónconnanodrop

3.1

3

3.2

3.3

ObtencióndelascepasHxK2-TAPyFba1-TAPdelacolección

Despertarcepasde-80ComprobargenotipoMantenerenmediolíquidoysólido

4.1

4.2

4.3

TransformacióndelascepasHxk2-TAPyFba1-TAP,confragmentoTAP-DOC.SelecciónconGeneticina

Comprobargenómico

PCRconprimersChKTAPDOCykanBComprobarconelectroforesis

5 ObtencióndelplásmidopUG27TransformarE.Coliypurificar

4

ObtencióndelfragmentoOM45-COH

6.1

6.2

6

6.3

6.4

PCRpUG27-COH(conprimersOM45forwardyOM45reverse)ComprobaciónmedianteelectroforesisPurificaciónCuantificaciónconnanodrop

7 ObtencióndelascepasHxK2-TAP-DOCyFba1-TAP-DOC

Comprobargenotipoymantenerenmediolíquidoysólido

8.1

8.2

TransformacióndecepasTAP-DOCconfragmentoOM45-COH.Selecciónconauxotrofíadehistidina

Comprobardelgenómico

PCRdecomprobaciónconprimersOM45CHKTAPykanBComprobarconelectroforesis

8

8.3

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1.TransformarE.Coliypurificar1.ObtencióndelplásmidopUG6-DOC.

1. Se deshiela la cantidad adecuada de células competentes y se pre-enfrían lostubosdemicrocentrífugade1,5mLqueserequieran.2.SepipeteanµLalícuotasdecélulasenlostubospre-enfriados.3.Seañaden5ngdeplásmidoacadatubo.4.Semezclasuavemente.5.Seincubanlostubosenhielodurante30minutos.6. Se provoca un choque térmico a las células durante 45 segundos a 42 °C o 2minutosa37°C.7.Colocarlostubosenhieloalmenos2minutos.8.Seañaden800µLdemedioSOCacadatuboyseincubadurante1horaa37°C.9.Setransfierenloscultivosatubosdemicrocentrífugade1,5mLyrealizarunspinde1minutoa6000rpm.10.Seeliminan800µLdesobrenadanteyseresuspendeelpelet.11.SeintroducelasuspensiónenunaplacadeagarLBconampicilina.12.Seincubanlasplacastodalanochea37°C.

2.Purificaciónconminiprep:1.Seobtienen2alícuotasde750µLdecultivoenuntubodemicrocentrifugade1,5mL,yserecogenlasbacteriascentrifugandoa12000rpmdurante1minuto;traslocualseeliminaelsobrenadante.2. Se resuspende completamente el pelet bacteriano vorteando en 100 µL detampóndesuspensión.3. Se añaden 100 µL de tampón de lisis y se mezcla por inversión 5-6 veces atemperaturaambiente.4.Seañaden120µLdetampóndeneutralización(acetatopotásico5M,pH5,5)ysemezcla suavemente por inversión 5-6 veces. Tras esto se incuba la solución atemperaturaambientedurante3minutos.6. Se eliminan los restos bacterianos y de proteínas mediante centrifugación a12000 rpm durante 2 minutos y se transfiere el sobrenadante a un tubo demicrocentrífuganuevo.7.Seañaden200µLdeisopropanolparaprecipitarelADNalsobrenadante,seguidodeunamezclapor inversión10vecesounvorteadobreve.Trasesto,se incubaatemperaturaambientedurante1minuto.8. Se recoge el ADN por centrifugación a 15000 rpm durante 1 minuto.Inmediatamentedespuésseeliminaelisopropanol.9. Se añaden 500 µL de etanol al 70% al tubo, mezclando por inversión, y secentrifugaelADNa14000rpmdurante1minuto.10.Seeliminaeletanolysecentrifugaeltubodurante1minuto.11.SeresuspendeelADNen20-35µLdeagua.

3.Cuantificaciónennanodrop.2.ObtencióndelfragmentoTAP-DOC1.PCRpUG6-DOC(concebadoresTAPDOCforwardyTAPDOCreverse):

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1.SepreparaelmixdePCRcon4µLdeMg+,5µLdetampón,0,5µLdeprimer3’,0,5µLdeprimer5’,5µLdedNTPs,2µLdeTaqpolimerasa,2µLdeDNAgenómicoextraídoyagua.2.SeutilizanlascondicionesdePCRsiguientes:1cicloa(i)95°Cde3minutos;25ciclosde lasfases(ii)a(iv),consistentesen:(ii)95°Cdurante1minuto,(iii)55°Cdurante 1 minuto y (iv) 72 °C durante 2 minutos; finalmente, 1 ciclo a (v) 4 °Cdurante59minutosparamantenerelproductodePCReltiempoqueseanecesario.

2.Comprobaciónmedianteelectroforesis:1.Sepreparaelgel.Paraello,semezclan0,35gdeagarosacon50mLdeTBE1x,traslocualseintroduce1µLdebromurodeetilioysedepositaenelmoldedelgel,dondesedejasolidificar.2. Una vez ha solidificado el gel, se introduce en un equipo de electroforesis,sumergidoenTBE1x.Enelprimerpocillodelgelseintroducen5µLdeunpatrón(Mass RulerMix),mientras que en el resto se introducen 10 µL de lamezcla delproductodePCRcon10µLdeLB.Unavezsehanintroducidotodaslasmuestras,sedejacorrerelgelaunos110V.

Figura 3. A la izquierda se observa la amplificación con los cebadores TAPDOC Forward yTAPDOC Reverse del fragmento DOC-IoxP-Kan-IoxP del plásmido pUG6. A la derecha seobservalainserciónporrecombinaciónhomólogadeTAPenelfragmentoanterior3.Purificación:

1. Se emplea el kit de purificación de PCR QIAquick de Qiagen, con algunasmodificaciones. En primer lugar se añaden 5 volúmenes de tampón PE a unvolumendereaccióndePCRysemezclan.LamezclaseintroduceenunacolumnaQIAquick, que a su vez está dentro de un tubo colector de 2mL, y se centrifugadurante 30-60 segundos. Se descarta el sobrenadante, se añaden 750 µL deltampónPE y se vuelve a centrifugar, descartándoseotra vez el sobrenadante. Sevuelveacentrifugardurante1minutoparaeliminareltampónresidual.Lacolumnase transfiere a un tubo de microcentrifuga, y se añaden 15 µL de agua en lamembrana de la columna, dejándolo reposar durante 5 minutos. Tras esto, secentrifugalacolumnayserepiteelproceso.

4.Cuantificaciónconnanodrop.3.ObtencióndelascepashxK2-TAPyFba1-TAPdelacolección

PUG6

DOC

KAN

IoxP

IoxP

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1.Despertarcepasde-80°C.LascepaspertenecenalacolecciónTAP(Ghaemmaghamietal.,2003).

1.SeintroduceunapequeñaporcióndelglicerolcongeladoquecontienelascepasenunmedioSD.2.Seincubalaplacaa30°Chastaquelascoloniasdelevadurasalcanzanunos2mmdediámetro(enunos3-5días).

2.Comprobargenotipo.3. Mantener en medio SD suplementado con leucina, metionina y uracilo, ya sealíquidoosólido.4. Transformación de las cepas HxK2-TAP y Fba1-TAP con fragmento TAP-DOC.Seleccióncongeneticina:1.TransformarlascepassiguiendoelprotocolopublicadoenNature(Gietz&Schiestl,2007):

1.Traselcultivocelularserealizalacentrifugacióndelascélulasa3000gdurante5minutos,resuspendiéndoseelpelletobtenidoen1mLdeaguaestéril.2.De la suspensión celular se transfieren100µL a unnuevoeppendorf, que soncentrifugados a 13000 g durante 30 segundos, tras lo cual se elimina elsobrenadante.3.Seresuspendeenlamezcladetransformacióndescritaanteriormenteyseincubaenunbañodeaguaa42°Cdurante40minutos.4. Tras la incubación se centrifuga a 13000 g durante 30 segundos, se elimina elsobrenadanteyseresuspendeelsedimentocon200µLdeaguaestéril.5. Se pipetea el volumen a placas con medio SD empleando geneticina comométododeselección,extendiéndosepor laplacaconunavarilladevidrio,queseesterilizausandoelmecheroBunsenymojándoseenalcohol.6.Lasplacasseincubandurante3-4díasa30°C.

2.Extraccióndegenómico:1.Sedejancrecer2-5mLdecultivosYPDdurantelanoche.2. Se centrifuganyeliminael sobrenadante, resuspendiendoelpellet restanteen200µLdetampóndeprotoplastoysedejaincubara37°Cdurante1hora.3.Seañaden200µLdetampóndelisisyseincubaa65°Cdurante20minutos.4.Seañaden200µLdeacetatopotásico5Mysecentrifugadurante3minutos.5. Se añaden 600 µL de isopropanol, se centrifuga y se elimina el sobrenadante,limpiandoelpelletcon1mLdeetanolal70%,traslocualsesecayresuspendeen50µLdeagua.

3.PCRconcebadoresChkTAPDOCykanB:1.SepreparaelmixdePCRcon4µLdeMg+,5µLdetampón,1µLdeprimer3’,1µL de primer 5’, 5 µL de dNTPs, 2 µL de Taqpolimerasa, 2 µL deDNA genómicoextraídoyagua.2.SeutilizanlascondicionesdePCRsiguientes:1cicloa(i)95°Cde3minutos;20ciclosde lasfases(ii)a(iv),consistentesen:(ii)95°Cdurante1minuto,(iii)55°Cdurante 1 minuto y (iv) 72 °C durante 2 minutos; finalmente, 1 ciclo a (v) 4 °Cdurante59minutosparamantenerelproductodePCReltiempoqueseanecesario.

4.Comprobaciónmedianteelectroforesis:

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Figura4.AlaizquierdaseobservalaamplificaciónconloscebadoresKanByChkTAPDOCdelfragmentoTAP-DOC-IoxP-Kan-IoxPdelplásmidopUG6.AladerechaseobservalainserciónporrecombinaciónhomólogadeHxk2yFba1enelfragmentoanterior.5.ObtencióndelplásmidopUG271.TransformarE.colisiguiendoelsiguienteprotocolo:

1.Descongelalascélulascompetentesenhielo.2.Añade50µLdecélulascompetentesalADNymézclalosconcuidado50µL(sinvortear).3.Colocalamezclaenhielodurante30minutos,nolomezcles.4.Choquetérmicoa42°Cdurante30segundos,nolomezcles.5.Añade950µLdemedioatemperaturaambientealtubo.6. Deja el tubo a 37°C durante 60 minutes. Agítalo vigorosamente (250 rpm) orótalo.7.Calientalasplacasdeseleccióna37°C.8.Esparce50-100µLdelascélulasylamezcladeligaciónenlasplacas.9.Incubadurantelanochea37°C.

2.Purificar.3.Extraccióndelplásmido:

1.Centrifugaelcultivobacterianoenuntubodemicrocentrífugadurante2minutosa10000rpm.2.Decantaelsobrenadanteyañade200µLdetampónderesuspensión.3.Añade250µLdetampóndelisisymézclaloporinversión.4. Añade 350 µL de tampón de lisis y mézclalo por inversión hasta formarse unprecipitado5.Centrifugaeltubodurante10minutosa10000rpmytransfiereelsobrenadanteauntubodemicrocentrífuga.6.Añade0,7volúmenesdeisopropanolalsobrenadanteeincúbaloa-20°Cdurante15minutos.

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7.Transfierelasoluciónaunacolumnadespin.8.Centrifugalacolumnadespindurante1minutoa7000rpmydescartaellíquidofiltrado.9.Añade400µLdetampónde lavadoycentrifugadurante1minutoa7000rpm.Descartaellíquidofiltradoyrepiteelpaso.10.Centrifugadurante2minutosa10000rpmparaeliminarel tampónde lavadoresidual.11.Transfierelacolumnaauntubode1,5mL,añade500µLdetampóndeeluciónycentrifugadurante1minutoa10000rpm.

6.ObtencióndelfragmentoOM45-COH1.PCRpUG27-COH(concebadoresOM45forwardyOM45reverse):

1.SepreparaelmixdePCRcon4µLdeMg+,5µLdetampón,2µLdeprimer3’,2µLdeprimer5’,5µLdedNTPs,1µLdeTaqpolimerasa,0,5µLdeDNAgenómicoextraídoyagua.2.SeutilizanlascondicionesdePCRsiguientes:1cicloa(i)95°Cde3minutos;25ciclosde lasfases(ii)a(iv),consistentesen:(ii)95°Cdurante1minuto,(iii)53°Cdurante 1 minuto y (iv) 72 °C durante 2 minutos; finalmente, 1 ciclo a (v) 4 °Cdurante59minutosparamantenerelproductodePCReltiempoqueseanecesario.

2.Comprobaciónmedianteelectroforesis.

Figura5.GeldeelectroforesisprocedentedelacomprobacióndelaPCRdepUG27.Sepuededeterminarque laPCRfueexitosadebidoa labandacorrespondienteal fragmentode2kpbcaracterísticadelacohesinaqueseobservaenelgel.

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Figura6.AlaizquierdaseobservalaamplificaciónconloscebadoresOM45ForwardyOM45Reverse del fragmento COH-IoxP-HIS5-IoxP del plásmido pUG27. A la derecha se observa lainserciónporrecombinaciónhomólogadeOM45enelfragmentoanterior.3.PurificaciónmedianteelkitdepurificaciónQIAquick:

1. Se añaden 5 volúmenes de tampón PE a un volumende reacción de PCR y semezclan.2.LamezclaseintroduceenunacolumnaQIAquick,queasuvezestádentrodeuntubocolectorde2mL,ysecentrifugadurante30-60segundos.3. Se descarta el sobrenadante, se añaden 750 µL del tampón PE y se vuelve acentrifugar,descartándoseotravezelsobrenadante.4.Sevuelveacentrifugardurante1minutoparaeliminareltampónresidual.5.Lacolumnasetransfiereauntubodemicrocentrifuga,yseañaden15µLdeaguaenlamembranadelacolumna,dejándoloreposardurante5minutos.6.Secentrifugalacolumnayserepiteelproceso.

4.Cuantificaciónconnanodrop.7.ObtencióndelascepasHxK2-TAP-DOCyFba1-TAP-DOC1.Comprobargenotipoymantenerenmediolíquidoysólido.8. Transformación de cepas TAP-DOC con fragmento OM45-COH: selección conauxotrofíadehistidina1.TransformarlascepassiguiendoelprotocolopublicadoenNature(Gietz&Schiestl,2007):

1.Traselcultivocelularserealizalacentrifugacióndelascélulasa3000gdurante5minutos,resuspendiéndoseelpelletobtenidoen1mLdeaguaestéril.2.De la suspensión celular se transfieren100µL a unnuevoeppendorf, que soncentrifugados a 13000 g durante 30 segundos, tras lo cual se elimina elsobrenadante.3.Seresuspendeenlamezcladetransformacióndescritaanteriormenteyseincubaenunbañodeaguaa42°Cdurante40minutos.4. Tras la incubación se centrifuga a 13000 g durante 30 segundos, se elimina elsobrenadanteyseresuspendeelsedimentocon200µLdeaguaestéril.

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5.SepipeteaelvolumenaplacasconmedioSDempleandoauxotrofíadehistidinacomométodo de selección, extendiéndose por la placa con una varilla de vidrio,queseesterilizausandoelmecheroBunsenymojándoseenalcohol.6.Lasplacasseincubandurante3-4díasa30°C.

2.PCRdecomprobaciónconcebadoresOM45CHKTAPykanB.1.SepreparaelmixdePCRcon4µLdeMg+,5µLdetampón,0,5µLdeprimer3’,0,5µLdeprimer5’,5µLdedNTPs,2µLdeTaqpolimerasa,2µLdeDNAgenómicoextraídoyagua.2.SeutilizanlascondicionesdePCRsiguientes:1cicloa(i)95°Cde3minutos;20ciclosde lasfases(ii)a(iv),consistentesen:(ii)95°Cdurante1minuto,(iii)55°Cdurante 1 minuto y (iv) 72 °C durante 2 minutos; finalmente, 1 ciclo a (v) 4 °Cdurante59minutosparamantenerelproductodePCReltiempoqueseanecesario.

3.Comprobarelectroforesis.

Figura 7. A PCR comprobatoria mediante los cebadores OM45 ChkTAP y KanB del genomaobtenidoanteriormente.

OM45ChkTAP

KanB

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DISCUSIÓNYCONCLUSIONESDebido a las medidas de cuarentena que se impusieron durante el desarrollo delestudio,nosepudieronobtenerresultadosdeningúntipo,yaquelainvestigaciónsevioparalizadatrasrealizarlascepasdeHxk2-TAP-DOCyFba1-TAP-DOC.Sin embargo, es posible comparar la eficacia de los dos métodos que se iban aemplear, el de transformación tradicional explicado anteriormente y el métodoCRISPR.El método de transformaciones consecutivas se basaba en el esquema de trabajodiseñadoenellaboratoriopresenteenmaterialesymétodos,mientrasqueelmétodoque se iba a emplear para la transformación por CRISPR se basaba en el protocolodescritoenJove(Ciurkotetal.,2019).

Figura8.EsquemadetrabajodelatransformaciónmedianteCRISPR(Ciurkotetal.,2019)Empezandoconelmétodo tradicional,un factor importantea teneren cuentaeseltiemponecesarioparallevarloacabo.Cadatransformaciónintermedianecesariaparaelprocesoconllevaunperíododecrecimiento, transformacióny comprobación;queen conjunto representanmás de una semana de trabajo para cada transformación,considerandoqueelensayoensíseaexitoso.Porotraparte,debidoalagrancantidaddeexperimentosnecesarios,esprobablequealgunosdeellosseanerróneos,yaseadebidoaerroresdurante lamanipulaciónporparte del investigador, o simplemente por factores externos que no se puedencontrolar,comomaterialdefectuoso.

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Sinembargo,aquílamodularidaddelprocesoesunaventajaclaveenesteaspecto,yaqueaunqueunensayonofuncione,simplementeserepiteelexperimentoencuestióno,enelpeordeloscasos,setieneretrocedeligeramenteenlainvestigación,yaqueunproblema a la hora de transformar un plásmido no tiene ningún efecto sobre lastransformacionesdelevadurasquesehanrealizadopreviamente.Además, los costes de realizar estos ensayos son reducidos, ya que los materialesempleadosenlosmismossoneconómicosyreutilizables,siemprequenoseproduzcaunacontaminaciónde losmismos;mientrasque los instrumentos requeridossondeusohabitualenunlaboratorio,comotermocicladoresoNanodrop.Finalmente, debido a todos los factores anteriores, la técnica de transformaciónbasadaentransformacionesconsecutivasrequiereunamplioconocimientogenéticode las proteínas con las que se trabaja para poder diseñar cebadores y emplear losplásmidosadecuadosparaelobjetivoenmente.RespectoalusodeCRISPR,destacasureducidocoste,yaquelosmaterialesrequeridossonsimilaresalosempleadosenotrosmétodosdetransformaciónunavezseponeapuntoestesistema.Elproblemaradicaenelprocedimientoprevioa losensayos.Antesdepoderrealizarcualquiertransformación,esnecesarioprepararunprotocoloqueoptimiceelusodeCRISPR,porloquehayqueobteneruncasetedeARNguíaeintroducirloenunvectorquecontengaelgenCas12a,queposteriormentese introduciráenlascélulasquesequierentransformar.Estoimplicaunlargopreparativoantesdepoderrealizarningúnensayo,aunqueunavez sehaya conseguidooptimizar, yanoesnecesario repetirelprocesocuandosequiererealizarotratransformación.Además, el procedimiento propiamente dicho es mucho más rápido que lasalternativas tradicionales, ya que todas las transformaciones se producen a la vez.Aunquehayquetenerencuentaquelarapidezconlaqueserealizalatransformaciónseveparcialmentecontrarrestadaporlabajaeficienciadetransformacióncomparadocon las técnicas tradicionales, por lo que la parte de las cepas que se intententransformannosufriránelefectodeseado.Centrándonosenlospasosteóricosensimismos,ambosprotocolostienenelmismoobjetivo,perohayunaclaradiferenciaenlosprocedimientosnecesarios.Enelcasodelatransformacióntradicional,todoslospasosdelprocesoformanpartelosrequisitospararealizarlatransformaciónensimisma,conlaexcepcióndeloctavoyúltimopaso,queesunacomprobacióndeléxitodelatransformación.Esteprotocoloconllevaunagrancantidaddetransformacionespreviasantesdealcanzarelobjetivo,requiriendotodasunacantidaddetiempoymaterialsimilar.Por otra parte, en el caso de la transformación mediante CRISPR, vemos que elprotocolo presenta cuatro partes completamente diferenciadas, tres de ellascorrespondientesalatransformaciónensimisma.Estaspartesson:elprocesopreviodepreparaciónparapoderrealizarlatransformación,elprocesodetransformaciónensimismo,ylacomprobacióndelatransformación.A diferencia del método tradicional y como se ha mencionado previamente, latransformación mediante CRISPR tiene un requisito fundamental: una extensapreparaciónprevia.Estoestáreflejadoenelprimerapartadodelesquemadetrabajo,que incluye lamayoríade losensayos realizados,cuyoobjetivoesobtenerunacepa

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que pre-expresa Cas12a y un plásmido que contenga ADN donante, regionesflanqueantesyunamatrizdecrARNdecadenasimple.Respectoalpasodelacomprobacióndelatransformación,noesdeextrañarqueseasimilarenambosprotocolos,yaquenoseveafectadoporelprocedimientoempleadopararealizarlatransformaciónensi.Por tanto, se puede concluir que el empleo de un método tradicional basado entransformacionesconsecutivasoelbasadoenCRISPRsereduceprincipalmentealusoque se le vaya a dar a la cepa en cuestión. Si no se va a realizar múltiplestransformacionesdeunamismacepa,elmétodotradicionalesmásadecuado,yaquenorequiereningúntipodeinversiónprevia;sinembargo,sielestudioconllevarealizardiferentes transformaciones deunamisma cepa, es conveniente emplear el sistemabasado en CRISPR, ya que la inversión de tiempo inicial en preparar los elementosfundamentales de la CRISPR es inferior al tiempo necesario para realizar múltiplestransformacionestradicionales.

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