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So Paulo 2012
EMLIA CRISTINA PERES
Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos isquemia e reperfuso intestinal: mecanismos evolvidos e
papel protetor da sinvastatina
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Humana do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo 2012
EMLIA CRISTINA PERES
Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos isquemia e reperfuso intestinal: mecanismos evolvidos e
papel protetor da sinvastatina
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Humana do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Fisiologia
Orientadora: Prof. Dra. Luciana Venturini Rossoni
Verso original
Aos meus pais, pelos maiores presentes: amor e base slida, que
permitiram e permitiro trilhar meus caminhos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar ao meu lado em todos os pequenos passos por mim dados e em todas
as grandes conquistas por mim alcanadas.
Aos meus pais pelo amor, carinho, dedicao, educao, alm de serem exemplo de
fora e coragem, que terei para vida.
A Professora Doutora Luciana Venturini Rossoni, pela orientao, confiana, amizade e
acolhimento em seu laboratrio.
A minha irm pela cumplicidade e estar presente nos momentos difceis para concluso do
meu mestrado.
As minhas amigas, Gisele e Camilla, por serem iluminadas, e sempre iluminarem minha vida.
No sei o que seria de mim sem vocs!
Ao Claudiomar pelo companheirismo, fora, e principalmente por me amar
incondicionalmente.
Aos meus tios Valdemar (in memorian) e Yara pelo apoio e orientao a mim concedidos em
todos os momentos de minha vida.
Aos meus primos, Marcos, Lo e Raquel, pela amizade e apoio.
Aos meus colegas de laboratrio por sempre me fazerem rir, por compartilharem comigo dos
momentos duros de trabalho, pelas boas conversas regadas a caf e por terem tornado meus
momentos no laboratrio muito agradveis.
A Universidade de So Paulo pelas oportunidades ao longo da minha vida.
Ao Departamento de Fisiologia e Biofsica pela oportunidade de realizao do curso de
Mestrado.
Ao Departamento de Enfermagem do Hospital Universitrio da USP pelo apoio para
realizao do curso de Mestrado.
Aos Professores da banca de qualificao pela contribuio com sua experincia e boas ideias.
Aos Professores da banca de defesa por lerem este trabalho.
A FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro concedido para execuo deste trabalho.
Muito obrigada!
Que tristes os caminhos, se no fora a
presena distante das estrelas!
Mrio Quintana
RESUMO
Peres EC. Estudo da reatividade vascular em ratos submetidos isquemia e reperfuso
intestinal: mecanismos envolvidos e papel protetor da sinvastatina. [dissertao (Mestrado em
Fisiologia Humana)] - Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So
Paulo; 2012.
A isquemia a deficincia no fluxo de sangue para uma determinada rea durante um perodo
de tempo, incompatvel com as necessidades metablicas. Vrias so as complicaes
presentes na isquemia e reperfuso intestinal (iIR), dentre elas destaca-se a leso pulmonar.
Sabe-se, que as estatinas so frmacos que apresentam resultados favorveis nas leses
intestinais ocasionadas pela iIR. Entretanto, desconhecido se os prejuzos ocasionados pela
iIR esto relacionados a modificaes na reatividade vascular e se os efeitos benficos das
estatinas na iIR esto correlacionados esses ajustes vasculares. Objetivou-se neste estudo
caracterizar a reatividade vascular no leito mesentrico e pulmonar e verificar se a
sinvastatina capaz de prevenir essas possveis alteraes. Ratos Wistar, ~2,5 meses, foram
anestesiados e submetidos ocluso da artria mesentrica superior (AMS) por 45 min e
reperfuso por 2 h (IR). No grupo controle foi realizado o mesmo protocolo; porm, sem a
ocluso da AMS (SHAM). Anis de AMS e artria pulmonar (AP) foram dissecados e
montados em um sistema de rgos isolados para medida da tenso isomtrica. Curvas
concentrao-resposta (CCR) acetilcolina (10-10
3x10-5
M), ao nitroprussiato de sdio (NPS,
10-10
-3x10-5
M) e a fenilefrina (10-10
-3x10-5
M) foram realizadas em anis com (E+) e sem (E-)
endotlio. Alguns anis E+ de AP foram pr-incubados com o inibidor da sintase de xido
ntrico (NOS), L-NAME (100 M) ou com inibidor da NOS induzvel (iNOS), 1400W
(1M), antes das CCR acetilcolina e a fenilefrina. Em um sub-grupo: IR e SHAM foi
realizado o pr-tratamento com sinvastatina (20mg/kg, p.o.) ou com veculo 1 h antes da iIR.
Em seguida foram avaliadas as respostas: dependente e independente do endotlio e a
contrtil em anis de AP. A iIR no alterou a vasodilatao ao NPS em ambas as artrias. Nos
anis de AMS a iIR no alterou nem a vasodilatao acetilcolina e nem a contrao
fenilefrina. Entretanto, tanto as respostas acetilcolina como fenilefrina foram reduzidas em
AP dos IR quando comparado ao SHAM. A pr-incubao com L-NAME como a E-, em
ambos os grupos, reduziu a vasodilatao acetilcolina e aumentou a contrio fenilefrina.
Por sua vez, o 1400W melhorou a vasodilatao acetilcolina e a hiporreatividade
fenilefrina observada nos anis de AP dos IR, sem alterar a reatividade dos SHAM. Tanto a
retirada do endotlio como a pr-incubao dos anis de AP com L-NAME ou com 1400W
aboliram as diferenas observadas entre os grupos estudados. O pr-tratamento com
sinvastatina preveniu o prejuzo no relaxamento acetilcolina assim como a hiporreatividade
fenilefrina nos anis de AP dos IR, sem modificar a reatividade vascular dos SHAM.
Concluindo-se que a iIR modificou a reatividade vascular na AP, porm sem alterar a mesma
na AMS. Na AP a iIR causou disfuno endotelial, por meio de uma ativao da iNOS, a
qual, levou a diminuio da resposta vasodilatadora dependente do endotlio e
hiporreatividade contrtil. Uma nica dose de sinvastatina pr-iIR previne essas alteraes,
demonstrando o efeito benfico desse frmaco provavelmente via uma ao anti-inflamatria
e/ ou anti-oxidante.
Palavras-chave: Reatividade vascular. Isquemia e reperfuso intestinal. Endotlio.
Sinvastatina. Artria Pulmonar.
ABSTRACT
Peres EC. Study of vascular reactivity in rats subjected to intestinal ischemia and reperfusion:
mechanisms involved and the protective role of simvastatin. [dissertation (Masters thesis in
Human Physiology)] - Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, So
Paulo; 2012.
Ischemia is a deficiency in blood flow for a given area during a period of time, incompatible
with the metabolic requirements. Several complications are present in intestinal ischemia and
reperfusion (iIR), lung damage being one of the most important. It is known that statins are
drugs that have favorable results in the intestinal lesions caused by iIR. However, it is
unknown whether the damages caused by iIR are related to changes in vascular reactivity and
the beneficial effects of statins on iIR are correlated to these vascular adjustments. The
objective of this study was to characterize the vascular reactivity in mesenteric and pulmonary
bed and verify whether simvastatin is able to prevent these possible changes. Wistar rats, ~2.5
months old, were anesthetized and subjected to occlusion of the superior mesenteric artery
(SMA) for 45 min and reperfusion (IR) for 2 hours. The same protocol was performed in the
control group, but without SMA occlusion (SHAM). SMA and pulmonary artery (PA) rings
were dissected and mounted in an isolated organ system to measure the isometric tension.
Concentration-response curves (CRC) to acetylcholine (10-10
3x10-5
M), to sodium
nitroprusside (SNP, 10-10
-3x10-5
M) and to phenylephrine (10-10
-3x10-5
M) were performed in
rings with (E+) and without (E-) endothelium. Some E+ rings of PA were preincubated with
the inhibitor of nitric oxide synthase (NOS), L-NAME (100 M) or with inhibitor of inducible
NOS (iNOS), 1400W (1M) prior to the CRC to acetylcholine and phenylephrine. In a
subgroup: IR and SHAM pre-treatment with simvastatin (20mg/kg, p.o.) or with vehicle 1
hour before the iIR was performed. After that in PA rings the endothelium-dependent and -
independent, and contractile responses were evaluated. The iIR did not alter vasodilatation to
SNP in either artery. In SMA rings, iIR did not change the vasodilatation to acetylcholine or
the contraction to phenylephrine. However, both responses to acetylcholine and to
phenylephrine were reduced in PA of IR when compared with SHAM. The pre-incubation
with L-NAME and the E-, in both groups, decreased the vasodilatation to acetylcholine and
increased constriction to phenylephrine. In turn, the 1400W improved vasodilatation to
acetylcholine and hyporeactivity to phenylephrine observed in rings of PA of IR, without
changing the reactivity of SHAM. Both the removal of endothelium and the preincubation of
PA rings with L-NAME or with 1400W abolished the differences observed between the
groups. Pre-treatment with simvastatin prevented loss in the relaxation to acetylcholine and
the hyporeactivity to phenylephrine in the rings of PA of IR, without modifying the vascular
reactivity of SHAM. In conclusion, the iIR modified vascular reactivity in the PA; however, it
did not change it in the SMA. In the PA, iIR caused endothelial dysfunction through an
activation of iNOS, which resulted in a decrease of endothelium-dependent vasodilator
response and contractile hyporeactivity. A single dose of simvastatin pre-iIR prevents these
changes, demonstrating the beneficial effect of this drug probably via an anti-inflammatory
and/ or anti-oxidant action.
Keywords: Vascular reactivity. Intestinal ischemia and reperfusion. Endothelium.
Simvastatin. Pulmonary Artery.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Curva concentrao-resposta acetilcolina 36
Figura 2 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis com endotlio
preservado (E+) e sem endotlio (E-) 37
Figura 3 - Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio 39
Figura 4 - Curva concentrao-resposta fenilefrina 41
Figura 5 - Curva concentrao-resposta fenilefrina em anis com endotlio
preservado (E+) e sem endotlio (E-) 42
Figura 6 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis de artria pulmonar
pr-incubados com L-NAME ou com 1400W 45
Figura 7 - Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria
pulmonar de ratos SHAM e IR pr-incubados com L-NAME ou com 1400W 48
Figura 8 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta acetilcolina 53
Figura 9 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta ao
nitroprussiato de sdio 54
Figura 10 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta fenilefrina 55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl) nos anis de
artria mesentrica superior (Mesentrica) e nos anis de artria pulmonar (Pulmonar)
na presena de endotlio preservado dos animais SHAM e IR
34
Tabela 2- Valores da porcentagem de pr contrao fenilefrina em relao
contrao ao cloreto de potssio antes das curvas concentrao-resposta acetilcolina
(ACh) ou ao nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria mesentrica superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio preservado dos animais
SHAM e IR
35
Tabela 3- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio
de curvas concentrao-reposta acetilcolina nos anis de artria mesentrica superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio preservado (E+) e sem
(E-) endotlio dos animais SHAM e IR
38
Tabela 4- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de artrias mesentrica
superior e de artria pulmonar com (E+) e sem (E-) endotlio dos animais SHAM e IR
43
Tabela 5- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) nos anis de artria pulmonar
com endotlio (E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M) ou com 1400W
(1400W,1 M) dos animais SHAM e IR
46
Tabela 6- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio
de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de artria pulmonar com
(E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M) ou incubados com 1400W (1400W,1
M) dos animais SHAM e IR
49
Tabela 7- Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl, 75mM) nos anis
de artria pulmonar dos animais SHAM e IR, controle (CT) e nos grupos SHAM e IR,
tratados com sinvastatina (SINV)
52
Tabela 8- Valores da porcentagem de contrao fenilefrina em relao contrao
ao cloreto de potssio antes das curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) ou
ao nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria pulmonar com endotlio dos
animais SHAM e IR, controle (CT) e nos grupos SHAM e IR, tratados com
sinvastatina (SINV)
52
Tabela 9- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio
de curvas concentrao-reposta acetilcolina (ACh), ao nitroprussiato de sdio (NPS)
e fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar dos animais SHAM, SHAM tratado
com 20mg/kg de sinvastatina (SHAM SINV), IR e IR tratado com 20mg/kg de
sinvastatina (IR SINV)
56
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
XO- Xantina Oxidase
XD- Xantina Desidrogenase
SOD- Superxido Dismutase
MODS- Sndrome de disfuno mltipla de rgos
iIR- Isquemia e reperfuso intestinal
TN- Fator de Necrose Tumoral
IL- Interleucina
NO- xido ntrico
cNOS- xido ntrico sintase constitutiva
iNOS- xido ntrico sintase induzvel
eNOS- xido ntrico sintase endotelial
LPS- Lipopolissacardeo
nNOS- xido ntrico sintase neuronal
Gcs- Guanilato ciclase solvel
GMPc- Guanosina monofosfato ciclco
Ca+2
- Clcio
K+- Potssio
L-NAME- Ng-Nitroarginina Metil ster
HMG-CoA- 3-hidroxi-3 metilglutaril-coenzima A
PaO2- Presso parcial de oxignio no sangue
ALT- Alanina aminotrnasferase
AST- Asparagina aminotrnasferase
EDRFs- Fatores relaxantes derivado do endotlio
EDCFs- Fatores contrteis do endotlio
COX- Coclooxigenase
PKA- Protena quinase A
KCl- Cloreto de potssio
1400W- N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine
ANOVA- Anlise de varincia
NPS- Nitroprussiato de sdio
ACh- Acetilcolina
FE- Fenilefrina
SDRA- Sndrome do desconforto respiratrio agudo
ONOO-- Perxido nitrito
O2-- nion superxido
OH-- radical de hidroxila
LOOH- hidroperxido
TBARS- Substncias que reagem com o cido tiobarbitrico
SUMRIO
1 INTRODUO 15
2 OBJETIVOS 26
3 MATERIAIS E MTODOS 27
3.1 Animais experimentais 27
3.2 Obteno dos modelos experimentais 27
3.2.1 Tratamento com sinvastatina 27
3.3 Estudo de reatividade vascular da artria mesentrica e pulmonar 28
3.4 Protocolos experimentais 29
3.4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio (KCl) 29
3.4.2 Avaliao do relaxamento 29
3.4.2.1 Avaliao do relaxamento dependente do endotlio 29
3.4.2.2 Avaliao do relaxamento independente do endotlio 29
3.4.3 Avaliao da resposta contrtil 30
3.4.4 Efeito da retirada do endotlio sobre a resposta vasodilatadora acetilcolina e
sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
30
3.4.5 Efeito do bloqueio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasodilatadora
acetilcolina e sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
30
3.5 Protocolos experimentais aps o tratamento com sinvastatina 31
3.6 Expresso dos dados e anlises estatsticas 32
3.7 Drogas e diluies 32
4 RESULTADOS 34
4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio (KCl) 34
4.2 Respostas vasodilatadora dependente e independente do endotlio 35
4.3 Avaliao da resposta contrtil 40
4.4 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasodilatadora
acetilcolina
44
4.5 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasoconstritora
fenilefrina
47
4.6 Efeito do tratamento com sinvastatina sobre a reatividade vascular 50
5 DISCUSSO 57
6 CONCLUSO 70
REFERENCIAS 71
15
1 INTRODUO
A isquemia a deficincia no fluxo de sangue para uma determinada rea durante um
perodo, que ocasiona a interrupo do suprimento de oxignio e de nutrientes, acarretando
em disfuno celular, morte celular e, finalmente, disfuno de tecido e rgo (Scannel et al.,
1995). A isquemia considerada uma emergncia vascular, com taxas de mortalidade que
podem chegar a 70% dos casos (Virgini-Magalhes; Mayall, 2009; Vollmar; Menger, 2011).
Nos Estados Unidos, a isquemia intestinal, ou a ausncia ou diminuio do fluxo
sanguneo arterial ou venoso nos tecidos intestinais (Debus et al., 2011; Renner et al., 2011;
Ribeiro; Yoshida, 2005), incide em uma de 1.000 admisses hospitalares (Brandt; Boley,
2000). No Brasil, o sistema DATASUS no discrimina a isquemia intestinal de distrbios
circulatrios em outras partes do organismo. Entretanto, possvel que a incidncia da
isquemia intestinal no Brasil seja mais elevada do que aquela documentada nos Estados
Unidos.
Sua etiologia pode ser oclusiva, como embolia e trombose; ou no-oclusiva, como
baixo fluxo sanguneo e vasoespasmo induzido por drogas vasoativas (Debus et al., 2011;
Renner et al., 2010; Ribeiro; Yoshida, 2005). Na embolia arterial, as principais causas da
isquemia oclusiva so trombos murais da cavidade cardaca associados a infarto do miocrdio
e fibrilao atrial (Debus et al., 2011; Renner et al., 2010; Ribeiro; Yoshida, 2005) . A
trombose arterial instala-se em placa aterosclertica, que pode ser de origem degenerativa ou
inflamatria (Ribeiro; Yoshida, 2005). Na isquemia no-oclusiva, a diminuio do fluxo
sanguneo intestinal ocorre em diferentes situaes clnicas, como trauma, choque de qualquer
etiologia, queimaduras, ps-operatrio de cirurgias cardaca e torcica, assim como no
transplante de intestino delgado (Debus et al., 2011; Kannan et al., 2011; Renner et al., 2010;
Ribeiro; Yoshida, 2005;).
O procedimento para correo da isquemia ou de suas consequncias depende da
extenso da isquemia e da causa da obstruo. De maneira geral, procura-se restabelecer fluxo
ao intestino ainda vivel, geralmente com revascularizao da artria mesentrica e resseco
das pores necrticas (Baptista-Silva; Souza-Moraes, 2006). Entretanto, sabe-se que o tempo
entre a confirmao diagnstica e a introduo de mtodos teraputicos para restabelecer o
fluxo sanguneo importante para reduzir as taxas de mortalidade (Debus et al., 2011). Nas
isquemias no oclusivas, a causa deve ser identificada e removida o mais brevemente possvel
(Renner et al., 2010). Porm sabe-se que a restaurao do suprimento sanguneo, ou
16
reperfuso, pode ter efeitos deletrios que se somam aos da isquemia, com consequncias
danosas para o tecido (Ribeiro; Yoshida, 2005; Scannel et al., 1995).
Na isquemia, ocorre acmulo de hipoxantina e xantina oxidase (XO) (Grace, 1994).
Isso porque durante a fase isqumica, a diminuio do aporte de oxignio leva ao acmulo de
clcio no citosol, que, por sua vez, promove a quebra de uma ponte peptdica da xantina
desidrogenase (XD), levando formao da enzima XO (Ribeiro; Yoshida, 2005). A XO,
diferentemente da XD, necessita de oxignio para realizar a converso da hipoxantina em
xantina (Grace, 1994). Com a reintroduo de oxignio por meio da reperfuso, a hipoxantina
oxidada a xantina e esta, metabolizada a cido rico, gerando como subproduto o nion
superxido. Este transforma-se em perxido de hidrognio espontaneamente ou pela ao da
enzima superxido dismutase (SOD), e o perxido de hidrognio, por sua vez, transformado
em gua pela ao da catalase e da glutationa peroxidase (Ribeiro; Yoshida, 2005). Como a
hipoxantina ficou acumulada durante a isquemia, a produo de radicais livres na reperfuso
acaba sobrepujando a capacidade de neutralizao pelos antioxidantes endgenos, de modo
que os radicais livres passam a exercer livremente as suas aes deletrias (Grace, 1994;
Horton; Walker, 1993). Desse modo, a reperfuso agrava as alteraes celulares ocasionadas
pela isquemia, j que os radicais livres acumulados lesam as membranas celulares, atraindo
neutrfilos e estimulando a liberao de mediadores inflamatrios (Ribeiro; Yoshida, 2005;
Scannel et al., 1995).
Alm das alteraes e leses locais, acredita-se que, na vigncia da reperfuso,
produtos txicos possam ter acesso circulao e promovam importantes alteraes no estado
funcional do organismo (Deitch et al., 2001; Paterno; Longo, 2008; Ribeiro; Yoshida, 2005)
mesmo em stios distantes de onde foi desencadeada a isquemia. H relatos de que a
Sndrome de Disfuno Mltipla de rgos (MODS) ocorra em decorrncia de alteraes no
sistema gastrintestinal ocasionadas por processos de isquemia e reperfuso (Carrico et al.,
1986; Clark e Coopersmith, 2007; Deicth et al., 2001; Hassoun et al, 2001; Magnotti; Deicth,
2005).
A MODS caracterizada pela deteriorao aguda da funo de dois ou mais rgos
(Mongardon et al., 2009). a maior causa de morbidade e mortalidade em pacientes
criticamente doentes, com taxas de mortalidade superiores a 40% (Deitch, 2010). No contexto
do trauma, a principal causa de morte em pessoas com idade inferior a 40 anos e uma das
principais causas de morte em pacientes vtimas de trauma (Deitch, 2010).
17
Considerando-se a gravidade das consequncias da isquemia intestinal e de seu
tratamento, a compreenso dos mecanismos pelos quais o choque hemorrgico no trauma e
condies pr-inflamatrias, como queimaduras e pancreatite, levam sndrome da angstia
respiratria aguda (no-infecciosa) e MODS de grande relevncia para o tratamento clnico
(Deitch, 2010). Vrios estudos buscam elucidar qual o papel do intestino na origem e na
propagao de doenas crticas, como a sndrome do desconforto respiratrio agudo (SDRA)
e a MODS (Carrico et al., 1986; Clark; Coopersmith, 2007; Deitch, 2010; Deicth et al., 2001;
Hassoun et al., 2001; Magnotti; Deicth, 2005). Em 1986, Carrico e colaboradores
consideraram a hiptese de que a deficincia da funo de barreira do intestino permitia a
translocao de bactrias intestinais para a circulao portal e sistmica, o que acarretaria a
propagao da MODS em situaes em que as defesas do hospedeiro se apresentavam
comprometidas (Carrico et al., 1986).
Outros trabalhos demonstram que a hipoperfuso intestinal induzida pelo choque,
seguida da reperfuso intestinal, origina mediadores inflamatrios que podem causar a
Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica e, assim, contribuir para a instalao da MODS
(Hassoun et al, 2001; Moore et al., 1994). Experimentalmente, evidenciou-se que um perodo
de isquemia seguido por um perodo de reperfuso intestinal causa inflamao pulmonar,
ativao intestinal da fosfolipase A2 e recrutamento intestinal de neutrfilos, o que confirma
que o intestino gerador de mediadores inflamatrios que modulam a injria pulmonar aguda
(Moore et al., 1994).
Em acordo com esses achados, diversos estudos sugerem que a disfuno pulmonar, a
inflamao sistmica e a MODS causadas pelo trauma gastrointestinal decorrem dos efeitos
dos mediadores inflamatrios provindos do intestino e drenados a partir do sistema linftico
mesentrico (Deitch, 2001; Deitch, 2010; Magnotti et al., 1998; Magnotti et al., 2005). Um
importante fundamento para essa hiptese o conceito de que o leito vascular pulmonar seja o
primeiro leito exposto linfa mesentrica, uma vez que esta atinge a circulao sistmica por
meio do ducto torcico e desemboca na veia subclvia, atingindo o pulmo (Magnotti et al.,
2005). Assim, sugere-se que a ligao do ducto linftico mesentrico previna a apoptose
pulmonar, o sequestro de neutrfilos e o aumento da permeabilidade pulmonar provocados
pela isquemia e pela reperfuso intestinal (iIR) em situaes de queimaduras e choque
hemorrgico (Deitch, 2001; Deitch, 2010; Magnotti et al., 1998; Magnotti et al., 2005).
Adicionalmente, Cavriani e colaboradores (2005) tambm demonstraram que o
sistema linftico mesentrico exerce funo primordial nas disfunes intestinal e pulmonar
18
ocasionadas pela iIR (Cavriani et al., 2005). Esse estudo revela que as leses causadas pela
iIR, tanto no pulmo quanto no intestino, so parcialmente dependentes do fator de necrose
tumoral (TNF-), uma citocina pr-inflamatria gerada no tecido intestinal lesado pela iIR e
transportada pelo sistema linftico (Cavriani et al., 2005). Alm do TNF-, sabe-se que o
ducto linftico uma importante via de transporte para outras citocinas inflamatrias, como
IL-1 e IL-10, ambas geradas pelo tecido intestinal durante a iIR (Cavriani et al., 2005;
Deitch, 2001), que poderiam contribuir para a inflamao sistmica e a MODS. Sugere-se que
a IL-1 gerada durante a reperfuso pode estar envolvida na hiporreatividade do msculo liso
bronquial ocasionada pela iIR (Coelho et al., 2007). Alm disso, esse estudo demonstra que a
IL-1 gerada na reperfuso alcana o pulmo atravs da linfa, estimulando a gerao de xido
ntrico (NO) que desencadeia a hiporreatividade bronquial em animais submetidos a iIR
quando comparados aos animais falso-operados (Coelho et al., 2007).
O NO desempenha um papel crucial na regulao homeosttica dos sistemas
cardiovascular, neuronal e imune (Moncada et al., 1991a e b). Nos vasos, o NO protege contra
trombose e aterosclerose, induz relaxamento dos vasos sanguneos, previne agregao
plaquetria, inibe a proliferao de clulas do msculo liso vascular e diminui a expresso de
genes pr-inflamatrios (Forstermann et al., 1993; Forstermann; Munzel, 2006). Nas clulas
endoteliais, sensores e receptores de membrana respondem a estmulos fisiolgicos com
aumento da concentrao intracelular de clcio e/ ou fosforilao dos stios alvo para a
ativao da enzima sintase de xido ntrico (NOS). A posterior formao do complexo clcio-
calmodulina ativa a NOS, responsvel pela clivagem do aminocido L-arginina em L-citrulina
e NO (Fleming, 2010), aumentando portanto a sntese de NO. A NOS dividida em dois
grandes grupos de isoformas: a constitutiva (cNOS), dependente da elevao dos nveis
intracelulares de clcio, e a induzvel (iNOS), independente das elevaes de clcio, mas
dependente da ativao de citocinas ou estmulos patolgicos como LPS (Lipopolissacardeo)
(Forstermann; Sessa, 2012). A cNOS apresenta a isoforma endotelial (eNOS) e a isoforma
neuronal (nNOS) (Davel et al., 2011; Forstermann, 2010; Forstermann; Sessa, 2012).
Uma vez liberado, o NO difunde-se rapidamente da clula geradora para a clula alvo,
onde interage com o grupamento heme da guanilato ciclase solvel (GCs) estimulando sua
atividade cataltica, o que leva formao de guanosina monofosfato cclico (GMPc). O
GMPc, por sua vez, diminui os nveis intracelulares de clcio pela recaptao para o retculo
sarcoplasmtico e pela extruso de clcio para o meio extracelular por meio das Ca+2
-
ATPases (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro, 2009). H diminuio dos nveis de clcio
19
tambm por meio da abertura de canais para K+ e da ativao da Na
+, K
+-ATPase, com
consequente hiperpolarizao de membrana e posterior fechamento dos canais para clcio
dependentes de voltagem (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro, 2009). Alm do mais, h
reduo da sensibilidade das protenas contrteis ao clcio, devido a ativao da protena
quinase G (PKG) (Bian et al., 2008; Napoli; Ignarro, 2009).
Vrios estudos identificam o NO como um potencial mediador na iIR que liga as
alteraes locais s alteraes sistmicas (Cavriani et al., 2004; Coelho et al., 2007; Ward et
al., 2000; Yasmin et al., 1997). O tratamento de ratos com inibidores da NOS minutos antes
da iIR aponta evidncias da modulao nitrrgica. Demonstrou-se que a administrao do L-
NAME, inibidor no seletivo da NOS, causa aumento da magnitude das alteraes induzidas
por iIR, como aumento do TNF- plasmtico, sequestro de neutrfilos no pulmo e aumento
da permeabilidade microvascular pulmonar, podendo causar a morte dos animais. Por outro
lado, o inibidor seletivo da iNOS inibiu o aumento da permeabilidade microvascular
pulmonar, o que sugere que tanto a isoforma constitutva quanto a induzvel da NOS
modulam as alteraes inflamatrias encontradas na iIR (Cavriani et al., 2004). Assim, a
modulao exercida pelas isoformas da NOS ocorre diferentemente, de acordo com a
isoforma.
Ward e colaboradores (2000) propuseram que durante o perodo de reperfuso
intestinal h declnio da atividade da cNOS, como resultado, observa-se o surgimento das
manifestaes clnicas da iIR, como leso da mucosa e aumento da permeabilidade capilar.
Prope-se que no incio da isquemia ocorra a combinao de NO derivado do endotlio com o
nion superxido (proveniente de neutrfilos ativados), formando peroxinitrito, poderoso
oxidante (Ward et al., 2000; Yasmin et al., 1997) e que, durante a reperfuso, ocorra queda da
produo de NO proveniente da cNOS, o que acarreta na resposta inflamatria sistmica
(Ward et al., 2000). Portanto, a perda do balano entre as atividades das sintases de NO
(cNOS e iNOS) pode ser sugerida como uma das causas dos prejuzos ocasionados pela iIR
(Yasmin et al., 1997; Ward et al., 2000; Cavriani et. al, 2004).
Senthil e colaboradores (2007) demonstraram que a linfa retirada de animais
submetidos a trauma e choque hemorrgico e administrada intravenosamente em ratos
controles capaz de gerar leso pulmonar. Essa leso est associada ao aumento plasmtico
das concentraes de nitrato/nitrito, bem como ao aumento da expresso proteica da iNOS em
pulmo, fgado e intestino. Concluiu-se que a linfa de animais submetidos a trauma e choque
20
hemorrgico suficiente para induzir leso pulmonar aguda, por intermdio de uma via
dependente de iNOS.
Adicionalmente, foi demonstrado que a iIR induz alteraes no funcionamento de
diferentes leitos vasculares e que tais alteraes vasculares podem estar relacionadas a
mudanas na modulao nitrrgica (Chen et al., 2006; Koksoy et al., 2000; Savoye et al.,
2005).
Koksoy e colaboradores (2000) demonstraram que existe uma menor participao do
xido ntrico sobre a presso de perfuso mdia no leito vascular pulmonar de ratos
submetidos iIR, quando comparados aos falso-operados, o que indica menor modulao
nitrrgica basal nas artrias pulmonares aps a iIR (Koksoy et al., 2000).
Em artria mesentrica superior, Chen e colaboradores (2006) sugeriram que a iIR
reduz a resposta mxima fenilefrina (agonista seletivo 1-adrenrgico) em ratos, e que a
queda na reatividade vascular estava associada ao aumento da expresso gnica e proteica da
eNOS e da iNOS no intestino delgado. Adicionalmente, Savoye e colaboradores (2005), em
estudos com artria mesentrica de ratos, demonstraram que a ativao da iNOS parece estar
envolvida na hiporreatividade ocasionada pelo choque hemorrgico seguido de reposio
volmica. Os autores afirmam que a hiporreatividade prevenida pelo uso de
mercatopropionil, um sequestrador no-seletivo de radicais livres, defendendo a hiptese de
que NO produzido por meio da ativao da iNOS pode interagir com nion superxido para
formar peroxinitrito, com alto poder oxidativo (Savoye et al., 2005).
Como ressaltado anteriormente, a iIR conhecida por ser uma doena que causa
prejuzo no funcionamento normal do intestino e tambm por causar leses em rgos
distantes, especialmente o pulmo, um dos primeiros rgos atingidos. Reconhece-se o efeito
do sistema linftico mesentrico na propagao de mediadores inflamatrios gerados na iIR,
bem como no surgimento de resposta inflamatria sistmica. Pelos dados encontrados na
literatura, conclui-se que o NO parece estar envolvido na propagao da resposta sistmica e
nas leses causadas no intestino e no pulmo. As alteraes vasculares na iIR parecem ser
dependentes do leito vascular estudado e da metodologia empregada para o estudo; entretanto,
devido ao nmero reduzido de trabalhos e a falta de padronizao quanto ao tempo de
isquemia e reperfuso, no possvel afirmar o quanto os ajustes vasculares podem contribuir
para a gravidade da iIR.
21
Por outro lado, tm-se buscado possveis tratamentos que diminuam as implicaes
locais e sistmicas associadas s altas taxas de mortalidade na iIR e alguns estudos buscam
definir os efeitos das estatinas na isquemia e na reperfuso de rgos.
As estatinas so inibidores seletivos e competitivos da 3-hidroxi-3 metilglutaril-
coenzima A (HMG-CoA) redutase, e so largamente usadas no tratamento e no controle da
hipercolesterolemia, das dislipidemias e da doena arterial coronariana (Maron et al., 2000).
Alm disso, propriedades pleiotrpicas das estatinas, como a anti-inflamatria e a
antioxidante, esto sendo reveladas. H relatos de que as estatinas so capazes de melhorar a
funo endotelial, aumentar a biodisponibilidade de xido ntrico, apresentar aes
imunomodulatrias, estabilizar placas aterosclerticas, participar no remodelamento vascular,
reduzir a apoptose e modular a funo plaquetria, entre outros efeitos (Alvarez De
Sotomayor et al., 2000; Briones et al., 2009; Gelosa et al., 2007).
As aes pleiotrpicas das estatinas tm sido exploradas tambm em pacientes
expostos reperfuso cardaca por procedimentos percutneos ou cirrgicos (Biccard et al.,
2005; Paraskevas et al., 2007; Paraskevas et al., 2008). A terapia com estatina no pr-
operatrio de cirurgia de revascularizao do miocrdio melhora a perfuso miocrdica da
rea enxertada no ps-operatrio, bem como reduz a liberao de citocinas (IL-6 e IL-8) e a
adeso de neutrfilos no endotlio venoso, sendo o NO o possvel mediador para esses
mecanismos (Paraskevas et al., 2007). Alm disso, o tratamento pr-operatrio com estatina
tambm parece estar associado com menores taxas de mortalidade ps-cirurgia cardaca
(Paraskevas et al., 2007). Com esses dados, pode-se inferir que as estatinas podem ser
benficas para amenizar os prejuzos causados pela isquemia e pela reperfuso de diferentes
rgos.
Alm dos estudos com humanos, em modelos animais de isquemia e reperfuso de
rgos, as estatinas tambm apresentam resultados favorveis. Em corao de ratos Wistar, o
tratamento com 15 mg/kg/dia de lovastatina, por 12 dias, diminuiu a rea de infarto por
ocluso da artria coronria esquerda (Kocsis et al., 2008). Assim como o tratamento crnico,
o tratamento agudo com estatinas tambm capaz de reduzir a rea de infarto, como
verificado pela reduo do tecido necrtico em ratos submetidos administrao de uma dose
intravenosa de sinvastatina (1 mg/kg) uma hora antes da ocluso da artria coronria
descendente anterior (25 minutos de isquemia seguida de 2 horas de reperfuso) (Wayman et
al., 2003). Adicionalmente, o pr-tratamento com 5 mg/kg de sinvastatina, intravenoso, em
coelhos submetidos a 30 minutos de ocluso da artria coronria esquerda seguidos de 48
22
horas de reperfuso diminuiu a rea infartada, efeito correlacionado produo aumentada de
NO (Bao et al., 2009), que foi apontado como o provvel mediador dos efeitos da
sinvastatina. Alm do mais, Lefer e colaboradores (1999) demonstraram que a melhora do
fluxo coronariano associado a administrao de 25 g de sinvastatina intraperitoneal, 18 horas
antes do processo de isquemia e reperfuso miocrdica em ratos, parece estar relacionada a
um aumento da produo de NO.
Corroborando os dados acima citados, outros estudos apontam que a reperfuso com
sinvastatina melhora a funo cardaca em corao isolado submetido ao processo de
isquemia e reperfuso (Szrszoi et al., 2008; Zheng et al., 2006). A funo ventricular
esquerda em animais submetidos a ocluso da artria coronria descendente anterior foi
melhorada pelo tratamento por quatro semanas com sinvastatina (40 mg/kg/por dia/por
gavagem), efeito este relacionado a uma queda dos nveis de citocinas inflamatrias e a um
aumento dos nveis citocinas anti-inflamatrias nos micitos cardacos (Zhang et al., 2005).
Tambm foi observada reduo na deposio de colgeno na rea remanescente ao infarto e,
portanto, sugeriu-se que a reduo da deposio de colgeno e a melhora a funo ventricular
se devem modulao da funo inflamatria ocasionada pelo tratamento com sinvastatina
(Zhang et al., 2005). Adicionalmente, foi sugerido que os efeitos benficos das estatinas no
infarto agudo do miocrdio so independentes da reduo dos nveis plasmticos de colesterol
(Lefer et al.,1999; Wayman et al., 2003; Zhang et al., 2005).
Em outros rgos submetidos ao processo de isquemia e reperfuso, as estatinas
tambm tm se mostrado eficazes na reduo das injrias. Em pulmo de ratos, o tratamento
com 0,5 mg/kg de sinvastatina, administrado por via oral por 5 dias antes do experimento,
preveniu o aumento da permeabilidade vascular pulmonar e o sequestro de neutrfilos
causados pelo processo de isquemia e reperfuso, tanto no tecido pulmonar quanto no lavado
broncoalveolar (Naidu et al., 2003). Alm disso, verificou-se que os efeitos benficos da
sinvastatina sobre a permeabilidade vascular foram inibidos com o uso de L-NAME e que a
reduo da expresso proteica da eNOS nos pulmes foi prevenida pelo tratamento com
sinvastatina (Naidu et al., 2003). Exemplificando, ainda, os efeitos benficos da sinvastatina
na iIR, demonstrou-se que o pr-tratamento com sinvastatina (10 mg/kg/dia) durante 3 dias,
com administrao da ltima dose uma hora antes da iIR, reduziu a gravidade da leso aguda
pulmonar induzida pela iIR em ratos; tendo sido registradas melhoras na presso parcial de
oxignio no sangue arterial (PaO2) e na saturao de oxignio e diminuio da infiltrao de
neutrfilos no pulmo (Pirat et al., 2006).
23
No fgado de ratos, o processo de isquemia e reperfuso aumentou os nveis da alanina
e da asparagina aminotransferase (ALT, AST, respectivamente), indicadores de dano heptico
(Dibazar et al., 2008; Lai et al., 2008). Entretanto, tanto o tratamento por via oral com
10mg/kg/dia de sinvastatina, administrada durante 3 dias antes da isquemia e da reperfuso
heptica, como o pr-tratamento com administrao intraperitoneal de 5 mg/kg de
sinvastatina, 24 horas antes da isquemia e reperfuso heptica, preveniram o dano heptico
(Dibazar et al., 2008; Lai et al., 2008).
Em rins de ratos, o pr-tratamento com uma nica dose de sinvastatina (1 mg/kg/i.v.)
melhorou a disfuno renal causada por 45 minutos de isquemia e 4 horas de reperfuso,
reduzindo a frao de excreo de sdio e os nveis plasmticos de ureia e creatinina,
aumentados em decorrncia da isquemia e reperfuso (Todorovic et al., 2008).
Similarmente ao que ocorre em pulmo, fgado e rim, no intestino de ratos foi
demonstrado que o pr-tratamento com sinvastatina (10 mg/kg/dia), administrada oralmente
durante quatro dias antes da iIR, foi eficaz em reduzir os danos. Esse efeito foi associado
diminuio do nvel srico do TNF- e do nvel tecidual de malondialdedo, produto final da
peroxidao de lipdios utilizado na avaliao do estresse oxidativo, e elevao dos nveis de
glutationa peroxidase e superxido dismutase intestinal, enzimas que fazem parte do sistema
de defesa antioxidante (Hajipour et al., 2009). Agudamente, as estatinas tambm demonstram
ser benficas na iIR intestinal: o tratamento com sinvastatina imediatamente antes da
isquemia e aps 24 horas previne a destruio da mucosa intestinal e diminui o ndice de
apoptose no jejuno e leo (Slijper et al., 2010). Adicionalmente, em ratos submetidos a
isquemia e reperfuso da artria mesentrica, o tratamento agudo com rouvastatina (10
mg/kg), uma hora antes da isquemia, bloqueia a gerao de mediadores inflamatrios, como
TNF- e citocina induzida por neutrfilo quimioatraente-1 (CINC-1), e preserva a expresso
proteica da eNOS, suprimindo, assim, a inflamao intestinal (Naito et al., 2006).
Recentemente, numerosos estudos tm demonstrado que as estatinas parecem estar
envolvidas tambm no restabelecimento ou na melhoria da funo endotelial nas doenas
cardiovasculares (Briones et al., 2009; Gelosa et al., 2007; Omori et al., 2002; Tawfik et al.,
2006). Um estudo demonstrou que uma nica dose de pravastatina (40 mg/dia) foi capaz de
melhorar a funo coronariana em pacientes portadores de disfuno arterial coronariana, sem
que houvesse reduo significativa nos nveis de colesterol (Wassmann et al., 2003).
A disfuno endotelial, presente em diversas doenas cardiovasculares, uma
condio patolgica caracterizada pelo desbalano entre a liberao de fatores relaxantes
24
derivados do endotlio (EDRFs) o xido ntrico, a prostaciclina e o fator hiperpolarizante
derivado do endotlio e de fatores contrteis derivados do endotlio (EDCFs) endotelina,
as prostaglandinas, a angiotensina II e as espcies reativas do oxignio (Davel et al., 2011).
Em humanos, Omori e colaboradores (2002) demonstraram que a administrao de
cerivastatina, em uma nica dose, capaz de aumentar a responsividade endotelial em
humanos saudveis, sugerindo um efeito direto nos vasos independentemente de diminuir os
lipdios. Adicionalmente, em culturas de clulas endoteliais, a incubao com cerivastatina
por 24 horas aumenta a biodisponibilidade de xido ntrico (Berkels et al., 2003).
Em ratos portadores de diabetes induzida por estreptozotocina, a disfuno endotelial
presente no leito mesentrico foi atenuada aps a exposio aguda com lovastatina (10 M,
por 20 minutos). Esse efeito foi mediado pelo xido ntrico, uma vez que foi bloqueado pela
administrao de inibidor no-seletivo da sintase de xido ntrico (Fatehi-Hassanabad et al.,
2006). Alm disso, a administrao aguda de estatinas ao banho de rgos produziu
relaxamento vascular em artrias de condutncia e de resistncia provenientes de ratos Wistar
e SHR, tanto por sua ao no msculo liso vascular como no endotlio (Alvarez De
Sotomayor et al., 2000; Bravo et al., 1998; Perez-Guerrero et al., 2000). Os estudos
demonstraram que o relaxamento dependente do endotlio induzido pela sinvastatina envolve
um aumento da biodisponibilidade de xido ntrico por mecanismo sensvel a superxido
dismutase e relacionado sntese de produtos vasodilatadores derivados da ciclooxigenase
(COX) (Alvarez De Sotomayor et al., 2000).
Ainda no que se refere aos efeitos da sinvastatina, Rossoni e colaboradores (2011)
demonstraram que sua administrao aguda (1 M, durante 2 horas) em artrias mesentricas
de resistncia de ratos diminui a vasoconstrio induzida por U46619, anlogo do
tromboxano A2. A sinvastatina, nessa condio, aumentou a sntese de NO, via aumento da
fosforilao da eNOS por meio da ativao da protena quinase ativada por AMP (AMPK).
Alm da ativao da AMPK, outros estudos demonstram que o tratamento agudo com estatina
em clulas endoteliais tambm capaz de ativar a fosforilao da eNOS por meio de protena
quinase A (PKA) e Akt (Harris et al., 2004; Sun et al., 2006).
Portanto, considerando a literatura, pode-se dizer que as estatinas agem no sistema
vascular, melhorando a disfuno endotelial nas doenas cardiovasculares, alm de terem
aes benficas em modelos de isquemia e reperfuso de rgos. Entretanto, pouco se sabe
sobre as alteraes vasculares na iIR, e no se conhece em que extenso os benefcios das
estatinas na iIR so devidos a ajustes vasculares.
25
Assim, visto que as alteraes vasculares podem contribuir para a gravidade da iIR,
condio com altas taxas de mortalidade, o presente estudo buscou elucidar as alteraes
vasculares presentes nessa patologia e avaliar os efeitos da administrao aguda de
sinvastatina nas alteraes vasculares presentes na iIR e, dessa forma esclarecer se os
benefcios da sinvastatina, descritos na iIR, so devidos a melhoras nos ajustes vasculares.
Portanto, a hiptese deste estudo de que existam alteraes vasculares na iIR e que estas
possam ser revertidas pela administrao aguda de sinvastatina, de forma a melhorar o
prognstico da doena.
26
2 OBJETIVOS
Tendo em vista a escassez de informaes sobre o papel da reatividade vascular nas
alteraes locais desencadeadas pela isquemia e reperfuso intestinal (iIR), bem como dos
mecanismos pelos quais a iIR induz modificaes patolgicas srias em rgos distantes do
stio da isquemia, especialmente o pulmo, este estudo teve por objetivo caracterizar a
reatividade vascular nos leitos mesentrico e pulmonar aps a iIR. Adicionalmente, tendo sido
considerados os efeitos benficos da sinvastatina em doenas cardiovasculares, este estudo
buscou avaliar o efeito da sinvastatina sobre os ajustes da reatividade vascular aps a iIR.
27
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (280-340 g), com aproximadamente dois
meses e meio de idade, provenientes do biotrio de criao Dra Lor Cury do Departamento de
Fisiologia e Biofsica do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo. Os
animais foram mantidos em gaiolas ventiladas sob condies controle de temperatura e ciclo
claro-escuro de 12 horas, tendo livre acesso gua e alimentao no biotrio de
experimentao animal do Departamento de Fisiologia e Biofsica, ICB/USP, at que
atingissem a idade necessria para realizao dos experimentos.
Os presentes protocolos foram aprovados pela Comisso de tica do Instituto de
Cincias Biomdicas da USP (Protocolo registrado sob n 018 fls. 83 do livro 02).
3.2 Obteno dos modelos experimentais
Em um primeiro momento, para caracterizao da reatividade vascular na isquemia, os
animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: animais submetidos ao
procedimento isquemia e reperfuso intestinal (IR) e animais falso operado (SHAM).
Para obteno dos modelos experimentais os animais foram anestesiados com uma
mistura contendo ketamina, xilazina e acetopromazina (64,9; 3,20 e 0,78 mg/kg,
respectivamente, i.p.). Aps a confirmao do plano anestsico, o abdmen foi submetido a
uma laparotomia na linha Alba e a artria mesentrica superior foi exposta e ocluda com o
auxlio de um clampe para microcirurgia. Depois de 45 minutos de ocluso (perodo de
isquemia), o clampe foi removido, a parede abdominal foi suturada e a perfuso intestinal foi
restabelecida por um perodo de 2 horas (perodo de reperfuso), conforme utilizado por
Cavriani e colaboradores (2004).
Cabe ressaltar que os animais SHAM foram submetidos aos mesmos procedimentos
experimentais, exceto pela ocluso da artria mesentrica superior.
3.2.1 Tratamento com sinvastatina
Em um sub-grupo de animais foi realizado gavagem, 1 hora antes da induo anestsica
para realizao do procedimento cirrgico de isquemia e reperfuso intestinal.
28
A sinvastatina foi administrada na dose de 20 mg/kg, via oral. A escolha dessa dose, foi
realizada baseada no trabalho de Zhang e colaboradores (2010), que analisam a
farmacocintica da sinvastatina (20 mg/kg, v.o.), em ratos, e observaram que a concentrao
plasmtica mxima da sinvastatina atingida com aproximadamente 48 minutos ps-
administrao.
O tratamento com sinvastatina foi realizado em um grupo de ratos aleatoriamente
escolhidos. Os animais foram separados em quatro grupos: os que eram submetidos ao
procedimento de isquemia e reperfuso (conforme descrito acima) e recebiam
carboxemetilcelulose (IR/ CT); os que eram submetidos IR e recebiam sinvastatina (IR/
SINV); os que foram submetidos aos mesmos procedimentos experimentais, exceto pela
ocluso da artria mesentrica superior e recebiam carboxemetilcelulose (SHAM/ CT); e um
SHAM que recebia a sinvastatina (SHAM/ SINV).
3.3 Estudo de reatividade vascular da artria mesentrica e pulmonar
Aps as duas horas de reperfuso, os ratos foram novamente anestesiados, como
descrito acima, mortos e exsanguinados. A artria mesentrica superior e o pulmo foram
cuidadosamente removidos e imersos em uma placa de Petri contendo soluo de Krebs-
Henseleit (composio (em mM): NaCl 118,4; KCl 4,7; NaHCO3 25; CaCl 2,5; glicose 11;
MgSO4 H2O 1,2; KH2PO4 2H2O 1,2 e EDTA 0,01); gaseificado com mistura carbognica
(95% de O2 e 5% de CO2), mantendo pH estvel de 7,4. Em seguida, as artrias mesentrica
superior e pulmonar foram dissecadas e limpas de tecido conectivo.
Para os experimentos de reatividade vascular, as artrias foram divididas em segmentos
de 2-3 mm de comprimento denominados anis vasculares. Em alguns anis, a camada
endotelial foi removida mecanicamente atravs do uso de fios metlicos.
Para obteno do registro de tenso isomtrica, cada anel vascular foi montado em um
sistema para rgos isolados. As cubas continham 5 mL de soluo de Krebs-Henseleit
aquecida a 37 C, continuamente gaseificada com mistura carbognica, mantendo o pH
estvel em 7,4. Dois fios metlicos foram passados atravs do lmen das artrias. Um fio
metlico foi fixado parede do banho e o outro conectado verticalmente a um transdutor de
tenso isomtrica (Letica TRI 210, Barcelona, Espanha). A tenso isomtrica foi registrada
por meio de um transdutor de fora, o qual estava conectado a um pr-amplificador e a um
sistema de aquisio de dados (Biopac Systems, Santa Barbara, California) e esse, a um
29
computador. Os anis foram submetidos a uma tenso de repouso de 0,5 g e essa tenso
reajustada a cada 15 minutos, durante os 45 minutos de estabilizao.
3.4 Protocolos experimentais
3.4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio (KCl)
Aps 45 minutos de estabilizao, foi administrado KCl (75 mM) para comprovar a
viabilidade funcional de todas as artrias estudadas. Assim, os anis que contraram menos
que 0,5 g, foram descartados. Aps 30 minutos de estabilizao, novamente foi administrado
KCl (75 mM) e foram aguardados aproximadamente 30 minutos at que fosse atingido a
estabilizao da resposta contrtil. A resposta mxima induzida pelo KCl foi considerada
100% da resposta contrtil do anel vascular.
3.4.2 Avaliao do relaxamento
3.4.2.1 Avaliao do relaxamento dependente do endotlio
Depois da avaliao da resposta contrtil ao KCl 75 mM, os anis foram lavados com
soluo de Krebs-Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30 minutos foi aguardada.
Aps essa, os anis de artria pulmonar e mesentrica foram pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao fenilefrina, foram
realizadas curvas concentrao-resposta, cumulativas ao agonista muscarnico acetilcolina
(10-10
3x10-5
M), para avaliar o relaxamento dependente do endotlio.
3.4.2.2 Avaliao do relaxamento independente do endotlio
Em alguns anis, escolhidos aleatoriamente foi realizado teste da viabilidade endotelial.
Para realizao desse teste, os anis de artria pulmonar e mesentrica foram pr-contrados
com uma concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta
mxima de contrao ao KCl 75mM). Aps a obteno de um plat de contrao fenilefrina,
a resposta vasodilatadora acetilcolina (10-5
M) foi avaliada para confirmao da presena de
30
endotlio. Se confirmada a presena do endotlio a partir de uma resposta vasodilatadora
acetilcolina superior a 60%, os anis eram novamente lavados com soluo de Krebs-
Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30 minutos era aguardada. Em seguida, os
anis de artria pulmonar e mesentrica foram, novamente, pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao curva concentrao-
resposta ao nitroprussiato de sdio (10-10
-3x10-5
M), doador de xido ntrico, foi realizada
para avaliar o relaxamento independente do endotlio.
3.4.3 Avaliao da resposta contrtil
Aps 30 minutos da confirmao da viabilidade funcional do endotlio (conforme
descrito acima, item 3.4.2.2), alguns anis de artria pulmonar e mesentrica com endotlio
integro, foram separados para a realizao de curvas concentrao-resposta ao agonista
seletivo 1-adrenrgico fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), de maneira cumulativa.
3.4.4 Efeito da retirada do endotlio sobre a resposta vasodilatadora acetilcolina e sobre a
resposta vasoconstritora fenilefrina
Com a finalidade de avaliar a habilidade do endotlio em modular a resposta
vasodilatadora acetilcolina e constritora fenilefrina, em alguns experimentos o endotlio
foi removido mecanicamente por meio do uso de fios metlicos. A ausncia do endotlio foi
confirmada a partir de uma resposta vasodilatadora acetilcolina (10-5
M) inferior a 20 % da
resposta fenilefrina, a partir dessa confirmao, foi construda as curvas concentrao
resposta cumulativas acetilcolina (10-10
3x10-5
M) ou fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), tanto
em anis de artria pulmonar, quanto em anis de artria mesentrica.
3.4.5 Efeito do bloqueio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasodilatadora
acetilcolina e sobre a resposta vasoconstritora fenilefrina
Diante dos resultados obtidos com as curvas concentrao-resposta acetilcolina e
fenilefrina, com e sem endotlio, optou-se por realizar os protocolos seguintes somente nos
anis de artria pulmonar.
31
Assim, para avaliar a funo do xido ntrico na modulao da resposta vasodilatadora
acetilcolina (10-10
3x10-5
M) e constritora fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), curva concentrao-
resposta a estes agonistas foram realizadas em anis pr-incubados durante 30 minutos com
Ng-Nitroarginina Metil ster (L-NAME 100 M), inibidor no seletivo da NOS.
Para avaliar a funo do xido ntrico sintetizado pela sintase de xido ntrico induzvel
(iNOS) na modulao da resposta vasodilatadora acetilcolina (10-10
3x10-5
M) e constritora
fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), curva concentrao-resposta a estes agonistas foram realizadas
em anis pr-incubados durante 40 minutos com N-(3-Aminomethyl)benzylacetamidine
(1400W, 1 M) (Chiao et al., 2008).
3.5 Protocolos experimentais aps o tratamento com sinvastatina
Assim, a avaliao dos efeitos da sinvastatina foi realizada atravs da avaliao da
resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio, KCl (75 mM), o qual foi administrado 45
minutos aps estabilizao para comprovar a viabilidade funcional de todos os anis de artria
pulmonar. Dessa forma, os anis que contraram menos que 0,5 g, foram descartados. Aps 30
minutos de estabilizao, novamente foi administrado KCl (75 mM) e foram aguardados
aproximadamente 30 minutos at que fosse atingido a estabilizao da resposta contrtil. A
resposta mxima induzida pelo KCl foi considerada 100% da resposta contrtil do anel
vascular.
Depois da avaliao da resposta contrtil ao KCl 75 mM, os anis foram lavados com
soluo de Krebs-Heinseleit e, em seguida, uma estabilizao de 30 minutos foi aguardada.
Aps essa, os anis de artria pulmonar foram pr-contrados com uma concentrao
submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de contrao ao
KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao fenilefrina, foram realizadas curvas
concentrao-resposta, cumulativas ao agonista muscarnico acetilcolina (10-10
3x10-5
M),
para avaliar o relaxamento dependente do endotlio.
Em alguns anis, escolhidos aleatoriamente foi realizado teste da viabilidade endotelial.
Para realizao desse teste, os anis de artria pulmonar foram pr-contrados com uma
concentrao submxima de fenilefrina (aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de
contrao ao KCl 75 mM). Aps a obteno de um plat de contrao fenilefrina, a resposta
vasodilatadora acetilcolina (10-5
M) foi avaliada para confirmao da presena de endotlio.
Se confirmada a presena do endotlio a partir de uma resposta vasodilatadora acetilcolina
32
superior a 60%, os anis eram novamente lavados com soluo de Krebs-Heinseleit e, em
seguida, uma estabilizao de 30 minutos era aguardada. Em seguida, os anis de artria
pulmonar foram, novamente, pr-contrados com uma concentrao submxima de fenilefrina
(aproximadamente 40-60 % da resposta mxima de contrao ao KCl 75 mM). Aps a
obteno de um plat de contrao curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio
(10-10
-3x10-5
M), doador de xido ntrico, foi realizada para avaliar o relaxamento
independente do endotlio.
A reposta contrtil foi avaliada em alguns anis, escolhidos aleatoriamente, aps 30
minutos da confirmao da viabilidade funcional do endotlio (conforme descrito acima),
anis de artria pulmonar com endotlio integro, foram separados para a realizao de curvas
concentrao-resposta ao agonista seletivo 1-adrenrgico fenilefrina (10-10
-3x10-5
M), de
maneira cumulativa.
3.6 Expresso dos dados e anlises estatsticas
Para cada curva concentrao-resposta foram calculados os valores de pD2 (-log. EC50)
e resposta mxima (Rmax) utilizando o GraphPad Prism Software (San Diego, CA, U.S.A).
A anlise estatstica dos resultados foi realizada por Teste-t ou anlise de varincia
(ANOVA), uma via ou duas vias, medidas repetidas ou completamente randomizadas, de
acordo com o desenho experimental de cada protocolo. Quando a ANOVA apresentou
significncia estatstica, o teste post-hoc de Bonferroni foi aplicado (GraphPad Prism
Software, San Diego, CA, E.U.A). Os resultados foram considerados estatisticamente
significantes para valores de p
33
Para o tratamento com sinvastatina, a medicao foi comprada na forma comercial, do
laboratrio Sandoz. A medicao foi macerada e suspensa em carboximetilcelulose.
34
4 RESULTADOS
Na primeira parte da sesso resultados (itens de 4.1 a 4.3) sero descritas as
caractersticas encontradas na reatividade vascular dos anis de artria mesentrica superior e
pulmonar, aps a isquemia e reperfuso intestinal.
4.1 Avaliao da resposta vasoconstritora ao cloreto de potssio (KCl)
A resposta contrtil induzida pelo cloreto de potssio (75mM) no diferiu entre os
grupos SHAM e IR nem nos anis de artria mesentrica superior nem de artria pulmonar
(Tabela 1).
Tabela 1 - Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl) nos anis de artria
mesentrica superior (Mesentrica) e nos anis de artria pulmonar (Pulmonar) na
presena de endotlio preservado dos animais SHAM e IR.
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada Teste-t.
Mesentrica
Pulmonar
SHAM IR SHAM IR
KCl 1,47 0,15 g (12) 1,42 0,12 g (14) 0,70 0,02 g (31) 0,70 0,03 g (36)
35
4.2 Respostas vasodilatadora dependente e independente do endotlio
Os valores do plat de pr-contrao fenilefrina antes das curvas concentrao-
resposta acetilcolina e ao nitroprussiato de sdio nos anis de artria mesentrica superior e
artria pulmonar com endotlio preservado, provenientes de animais dos grupos SHAM e IR,
esto representados na Tabela 2.
Tanto nos anis de artria mesentrica superior quanto nos de artria pulmonar dos
animais SHAM e IR no foram observadas diferenas significativas entre os grupos, na pr-
contrao fenilefrina antes da curva-concentrao resposta acetilcolina ou ao
nitroprussiato de sdio, (Tabela 2).
Tabela 2 - Valores da porcentagem de pr-contrao fenilefrina em relao contrao ao
cloreto de potssio antes das curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) ou ao
nitroprussiato de sdio (NPS) nos anis de artria mesentrica superior (Mesentrica)
e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio preservado dos animais SHAM e IR.
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 1-via.
Mesentrica
Pulmonar
Pr-contrao Pr-contrao
NPS ACh NPS ACh
SHAM 55,1 3,32% (07) 40,4 4,70 % (05) 50,9 7,69% (05) 52,8 3,10 % (13)
IR 47,7 4,44% (08) 55,0 7,77 % (06)
54,3 9,12% (07) 52,0 3,32 % (18)
36
Na figura 1 est representada as curvas-concentrao resposta acetilcolina nos anis
de artria mesentrica superior e artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM e IR. Em
ambas as artrias estudadas, de ambos os grupos a acetilcolina induziu relaxamento na
dependncia da concentrao utilizada (Figura 1A e B).
No foram observadas diferenas significativas entre as curvas concentrao-resposta
acetilcolina realizadas nas artrias mesentrica superior dos grupos SHAM e IR (Figura
1A). J as artrias pulmonares do grupo IR apresentaram uma reduo na resposta
vasodilatadora induzida pela acetilcolina quando comparada ao grupo SHAM (Figura 1B e
Tabela 3).
Figura 1 - Curva concentrao-resposta acetilcolina
A) Mesentrica B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis com endotlio preservado de artria
mesentrica superior (A) e de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e falso operados
(SHAM). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como
mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias:* P
37
A remoo mecnica do endotlio nos anis de artrias mesentrica superior e pulmonar,
de ambos os grupos estudados, reduziu a resposta de relaxamento induzida pela acetilcolina
(Figura 2A e B). Alm disso, a remoo do endotlio nos anis de artria pulmonar aboliu a
diferena na resposta mxima acetilcolina observada entre os grupos SHAM e IR (Figura
2B e Tabela 3).
Figura 2 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis com endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-)
A) Mesentrica B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis com endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-) de artria mesentrica superior (A) e de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e
falso operados (SHAM). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos
como mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias:* P
38
Tabela 3 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio de curvas
concentrao-reposta acetilcolina nos anis de artria mesentrica superior
(Mesentrica) e de artria pulmonar (Pulmonar) com endotlio preservado (E+) e sem
(E-) endotlio dos animais SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
Mesentrica
E+
7,41 0,10
98,0 2,2 % (05)
7,26 0,15
91,1 3,6 % (06)
E- - 15,9 3,0 % (05) # - 13,8 3,1 % (05)
#
Pulmonar
E+
7,11 0,12
88,1 1,4 % (13)
6,94 0,11
77,7 2,4 % (18)*
E- - 9,1 4,9 % (04) # - 2,2 6,7 % (04)
#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 1- via: * P
39
Similar ao observado no relaxamento acetilcolina, o nitroprussiato de sdio (NPS)
promoveu um relaxamento de modo dependente da concentrao utilizada, tanto nos anis de
artria mesentrica superior, quanto nos anis de artria pulmonar de ambos os grupos
estudados (Figura 3A e 3B). Em ambas as artrias estudadas, no foram observadas diferenas
significativas no relaxamento induzido pelo nitroprussiato de sdio entre os grupos SHAM e
IR (Artria pulmonar: SHAM: Rmax.: 95,7 2,26, pD2: 7,92 0,16 ; IR: Rmax.: 95,8 4,7,
pD2: 8,00 0,21 / Artria mesentrica: SHAM: Rmax.: 100,4 0,8, pD2: 7,93 0,09 ; IR:
Rmax.: 103,8 2,4, pD2: 8,21 0,07 ) (Figura 3).
Figura 3 - Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio
Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio (NPS) em anis de artria mesentrica
superior (A) e de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e falso operados (SHAM). O
n representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como mdiaEPM.
Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias.
A) Mesentrica B) Pulmonar
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-80
-60
-40
-20
0
IR (N=08)
SHAM (N=07)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-80
-60
-40
-20
0
SHAM (n=05)
IR (n=07)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
40
4.3 Avaliao da resposta contrtil
Na figura 4 est representado a curva-concentrao resposta fenilefrina nos anis de
artria mesentrica superior e nos anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM e
IR. A fenilefrina aumentou o tnus na dependncia da concentrao utilizada tanto na artria
mesentrica superior quanto na artria pulmonar de ratos SHAM e com IR da artria
mesentrica (Figura 4A e B).
Nos anis de artria mesentrica superior no foram observadas diferenas significativas
na resposta de contrao mediada pela fenilefrina entre os grupos SHAM e IR (Figura 4A e
Tabela 4). Porm, nos anis de artria pulmonar provenientes de animais IR a resposta
contrtil fenilefrina foi de menor magnitude quando comparada aos anis de artria
pulmonar dos animais SHAM (Figura 4B e Tabela 4).
Em ambos os grupos, remoo do endotlio tanto dos anis de artria mesentrica superior
como os de artria pulmonar deslocou a curva concentrao resposta fenilefrina para a
esquerda (Figura 5). Esse deslocamento da curva concentrao resposta fenilefrina nos anis
de artria mesentrica superior proveniente dos animais SHAM e IR foi de magnitude similar,
no induzindo alteraes significativas entre os grupos (Figura 5A e Tabela 4). Por sua vez, a
remoo do endotlio aboliu a reduo da resposta contrtil fenilefrina observada nos anis
de artria pulmonar dos animais submetidos a iIR quando comparado aos SHAM (Figura 5B e
Tabela 5). Assim, a remoo do endotlio nos anis de artria pulmonar bloqueou a diferena
que existia entre os grupos.
41
Figura 4 - Curva concentrao-resposta fenilefrina
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis com endotlio de artria mesentrica
superior (A) e de anis de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e falso operados
(SHAM). Os resultados representam a % de contrao em resposta ao KCl. O n representa o
nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como mdia EPM. Anlise
estatstica utilizada ANOVA 2 vias: * P
42
Figura 5 - Curva concentrao-resposta fenilefrina em anis com endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-)
A) Mesentrica
B) Pulmonar
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis com endotlio preservado (E+) e sem
endotlio (E-) de artria mesentrica (A) e de artria pulmonar (B) de ratos submetidos a iIR e falso
operados (SHAM). Os resultados representam a % de contrao em resposta ao KCl. O n
representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como mdia EPM.
Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias: * P
43
Tabela 4 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio de curvas
concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de artrias mesentrica superior
e de artria pulmonar com (E+) e sem (E-) endotlio dos animais SHAM e IR.
SHAM
IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
Mesentrica
E+
5,92 0,25
105,6 5,7 % (05)
5,65 0,39
104,2 4,4 % (05)
E- 6,52 0,18 146,9 7,4 % (05)# 6,40 0,14 150,8 10,8 % (04)
#
Pulmonar
E+
7,44 0,07
73,9 3,4 % (21)
7,22 0,05
55,8 3,3 % (22)*
E- 7,72 0,13 103,0 3,0 % (07)# 7,74 0,06
# 105,7 9,7 % (06)
#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 1-via: * P
44
4.4 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasodilatadora
acetilcolina
Como j referido anteriormente, a partir deste momento focou-se o estudo somente na
artria pulmonar, pois os resultados observados nas artrias pulmonares foram mais
expressivos que os observados nos anis de artria mesentrica superior. Alm disso,
conhecido que o pulmo o principal orgo de choque na iIR (Cavriani 2004; Koksoy et al.,
2001; Kuzu et al., 2002; Mitsuoka et al., 1999).
Para avaliar o papel do xido ntrico sobre a resposta de relaxamento em artrias
pulmonares dos ratos SHAM e IR, os anis de artrias com endotlio preservado foram
previamente incubados com L-NAME (100 M). Nas figuras 6A e B esto representadas as
curvas concentrao-resposta acetilcolina, na presena de L-NAME, nos anis de artria
pulmonar dos animais dos grupos SHAM e IR; respectivamente. Nos anis de artria
pulmonar de ambos os grupos experimentais, a incubao com L-NAME inibiu o relaxamento
mediado pela acetilcolina, alm de abolir a diferena observada entre os grupos estudados
(Figura 6A e B e Tabela 5).
Para avaliar a modulao da iNOS sobre a resposta acetilcolina, os anis de artria
pulmonar com endotlio preservado foram incubados com 1400W (1 M) durante 40
minutos. Nas figuras 6C e D esto representadas a curvas concentrao-resposta
acetilcolina, na presena de 1400W, nos anis de artria pulmonar dos animais dos grupos
SHAM e IR, respectivamente. A incubao com 1400W no alterou a resposta vasodilatadora
acetilcolina nos anis de artria pulmonar do grupo SHAM (Figura 6 C e Tabela 5). Porm,
nos anis de artria pulmonar do grupo IR a incubao com 1400W aumentou a resposta
mxima acetilcolina sem modificar a pD2 a esse agonista (Figura 6D e Tabela 5).
importante ressaltar que na presena de 1400W, no se observou diferena na resposta
vasodilatadora dependente do endotlio entre os anis de artria pulmonar provenientes dos
animais SHAM e IR (Tabela 5).
45
Figura 6 - Curva concentrao-resposta acetilcolina em anis de artria pulmonar pr-
incubados com L-NAME ou com 1400W
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis de artria pulmonar de ratos
submetidos a iIR (IR, direita) e falsos operados (SHAM, esquerda). Curva realizada em anis
de artria pulmonar com endotlio preservado (E+), pr-incubados com inibidor da sintase de
xido ntrico L-NAME (LN, 100 M) (A e B) ou com inibidor da sintase de xido ntrico
induzvel (1400W, 1 M) (C e D). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados
foram expressos como mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias: # P
46
Tabela 5 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por
meio de curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) nos
anis de artria pulmonar com endotlio (E+), incubados com L-
NAME (LN, 100 M) ou com 1400W (1400W,1 M) dos animais
SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
E+
7,11 0,12 88,1 1,4 % (13) 6,94 0,11 77,7 2,4 % (18)*
LN - 1,9 2,2 % (09)# - 3,7 3,2 % (09)
#
1400W 7,26 0,08 82,0 2,30 % (05) 7,13 0,11 89,8 2,07 % (06)#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre
parnteses. Os valores esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica
utilizada ANOVA 1-via: * P
47
4.5 Efeito da inibio da sntese de xido ntrico sobre a resposta vasoconstritora
fenilefrina
Para avaliar o papel do xido ntrico sobre a resposta de contrtil induzida pela fenilefrina
em artrias pulmonares dos ratos SHAM e IR, os anis de artrias com endotlio preservado
foram previamente incubados com L-NAME (100 M). Nas figuras 7A e B esto
representadas as curvas concentrao-resposta fenilefrina, na presena de L-NAME, nos
anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM e IR, respectivamente. A incubao
dos anis de artria pulmonar com L-NAME desviou a curva concentrao-resposta
fenilefrina para a esquerda (Figura 7A e B). No grupo SHAM, a pr-incubao com L-
NAME, aumentou somente a resposta mxima a fenilefrina, sem apresentar diferena
significativa na pD2 (Figura 7A e Tabela 6). Porm, no grupo IR a incubao com L-NAME
aumentou tanto a pD2 quanto a resposta mxima fenilefrina (Figura 7B e Tabela 6). Alm
disso, como observado na resposta de relaxamento acetilcolina, a incubao dos anis de
artria pulmonar com L-NAME aboliu a diferena na resposta contrtil fenilefrina entre os
grupos SHAM e IR (Figura 7A e B e Tabela 6).
Para avaliar a modulao da iNOS sobre a resposta contrtil fenilefrina, os anis de
artria pulmonar com endotlio intacto foram incubados com 1400W (1400W,1 M) durante
40 minutos. Nas figuras 7C e D esto representadas as curvas concentrao-resposta
fenilefrina, na presena de 1400W, nos anis de artria pulmonar dos animais dos grupos
SHAM e IR, respectivamente. A incubao com 1400W no alterou a resposta contrtil
fenilefrina nos anis de artria pulmonar do grupo SHAM (Figura 7C e Tabela 6). J nos anis
de artria pulmonar do grupo IR, a incubao com 1400W desviou a curva concentrao-
resposta fenilefrina para esquerda, aumentando somente a resposta mxima a esse agonista
contrtil (Figura 7D e Tabela 6). importante ressaltar que assim como na resposta
acetilcolina, na presena de 1400W no se observou diferena entre as artrias proveniente
dos animais SHAM e IR (Figura 7C e D e Tabela 6).
48
Figura 7 - Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar de ratos SHAM e
IR pr-incubados com L-NAME ou com 1400W
SHAM
IR
A) B)
C) D)
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar de ratos submetidos
a iIR (IR, direita) e falsos operados (SHAM, esquerda). Curva realizada em anis de artria
pulmonar com endotlio (E+), pr-incubados com inibidor da sintase de xido ntrico L-NAME
(LN, 100 M) (A e B) ou com inibidor da sintase de xido ntrico induzvel (1400W, 1 M) (C e
D). O n representa o nmero de animais utilizados. Resultados foram expressos como
mdiaEPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2 vias: # P
49
Tabela 6 - Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por
meio de curvas concentrao-resposta fenilefrina (FE) nos anis de
artria pulmonar com (E+), incubados com L-NAME (LN, 100 M)
ou incubados com 1400W (1400W,1 M) dos animais SHAM e IR.
SHAM IR
pD2 Rmax pD2 Rmax
E+ 7,44 0,07 73,9 3,41 % (21) 7,22 0,05 55,8 3,29 % (22)*
LN 7,73 0,09 103,5 2,8 % (11)# 7,67 0,12
# 109,5 3,89 % (09)
#
1400W 7,46 0,07 76,0 3,35 % (09) 7,47 0,05 71,5 4,96 % (09)#
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses.
Os valores esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA
1-via: * P
50
4.6 Efeito do tratamento com sinvastatina sobre a reatividade vascular
Os valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (75mM) dos anis de artria
pulmonar, provenientes de animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/ CT e IR/
SINV esto representados na tabela 7. Nos quatro grupos estudados no houve diferenas
significativas na resposta contrtil mxima induzida pelo cloreto de potssio, ou seja o
tratamento com sinvastatina no alterou a resposta contrtil induzida pelo cloreto de potssio
(Tabela 7).
Os valores de plat da pr-contrao fenilefrina antes das curvas concentrao-
resposta acetilcolina ou ao nitroprussiato de sdio, nos anis de artria pulmonar,
provenientes de animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/ CT e IR/ SINV esto
representados na tabela 8. Assim como a resposta ao KCl 75mM, no foram observadas
diferenas significativas nos quatro grupos estudados entre a pr-contrao fenilefrina antes
das curvas concentrao-resposta acetilcolina e nem ao nitroprussiato de sdio (Tabela).
Na figura 8 esto representados as curvas concentrao-resposta acetilcolina nos
anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/ CT e IR/
SINV. Em todos os grupos avaliados, a acetilcolina induziu relaxamento na dependncia da
concentrao utilizada. Como demonstrado anteriormente, a iIR reduziu o relaxamento
acetilcolina quando comparado ao grupo SHAM (Tabela 9). O tratamento com sinvastatina
no alterou resposta acetilcolina no grupo SHAM, sendo que no foram observadas
diferenas significativas entre as curvas concentrao-resposta acetilcolina realizadas na
artria pulmonar do grupo SHAM/ CT e SHAM/ SINV (Figura 8A e Tabela 9). J nas artrias
pulmonares do grupo IR a sinvastatina preveniu a reduo na resposta vasodilatadora induzida
pela acetilcolina (Figura 8B e Tabela 9). Sendo que a artria pulmonar do grupo IR/ SINV
teve uma maior resposta mxima induzida pela acetilcolina quando comparadas ao grupo
IR/ CT e igual aos grupos SHAM/ CT e SHAM/ SINV (Tabela 9).
Na figura 9 esto representadas as curvas concentrao-resposta ao nitroprussiato de
sdio nos anis de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/
CT e IR/ SINV. Similar ao observado no relaxamento acetilcolina, o nitroprussiato de sdio
(NPS) promoveu um relaxamento de modo dependente da concentrao utilizada em todos os
51
grupos estudados (Figura 9A e B). Porm, no foram observadas diferenas significativas no
relaxamento induzido pelo NPS entre os grupos avaliados (Figura 9A e B e Tabela 9).
Na figura 10 esto representadas as curvas concentrao-resposta fenilefrina nos anis
de artria pulmonar dos animais dos grupos SHAM/ CT, SHAM/ SINV, IR/ CT e IR/ SINV.
A fenilefrina aumentou o tnus arterial na dependncia da concentrao utilizada em todos os
grupos estudados (Figura 10A e B). Como demonstrado anteriormente, a iIR reduziu
resposta de contrao induzida pela fenilefrina nos anis de artria pulmonar quando
comparada cirurgia fictcia (SHAM) (Tabela 9). O tratamento com sinvastatina no alterou a
resposta contrtil induzida pela fenilefrina nos anis de artria pulmonar do grupo SHAM
(Figura 10). Porm, o mesmo aumentou a resposta contrtil induzida pela fenilefrina nos anis
de artria pulmonar do grupo IR (Figura 10B e Tabela 9). Aps o tratamento com sinvastatina
no observa-se mais a reduo da contrao induzida pela fenilefrina entre os grupos SHAM/
SINV e IR/ SINV (Tabela 9).
52
Tabela 7 - Valores da contrao mxima ao cloreto de potssio (KCl, 75mM) nos anis de
artria pulmonar dos animais SHAM e IR, controle (CT) e nos grupos SHAM e
IR, tratados com sinvastatina (SINV).
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores
esto expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 1-via.
Tabela 8 - Valores da porcentagem de contrao fenilefrina em relao contrao ao cloreto de
potssio antes das curvas concentrao-resposta acetilcolina (ACh) ou ao nitroprussiato
de sdio (NPS) nos anis de artria pulmonar com endotlio dos animais SHAM e IR,
controle (CT) e nos grupos SHAM e IR, tratados com sinvastatina (SINV).
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os valores esto
expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 1-via.
SHAM
IR
CT SINV CT SINV
KCl 0,76 0,05 g (09) 0,65 0,04 g (11) 0,63 0,02 g (07) 0,70 0,05 g (08)
Pr-contrao ACh NPS
CT SINV CT SINV
SHAM 47,3 3,09 % (07) 47,6 4,02 % (07) 56,7 3,17 % (05) 42,7 4,51 % (05)
IR 46,3 3,46 % (08) 44,5 2,74 % (09) 41,6 6,54 % (05) 44,3 4,20 % (07)
53
Figura 8 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta acetilcolina
Curva concentrao-resposta acetilcolina (ACh) em anis de artria pulmonar provenientes
de animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou com sinvastatina (SHAM/ SINV)
(A) e animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou com sinvastatina (IR/ SINV) (B). O
nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os
resultados so expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2-vias.
A) SHAM B) IR
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
SHAM/ SINV (N=07)
SHAM/ CT (N=07)
ACh (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
IR/ CT (N=08)
IR/ SINV (N=09)
ACh (Log M)
% R
ela
xam
en
to
54
Figura 9 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio
A) SHAM B) IR
Curva concentrao-resposta ao nitroprussiato de sdio (NPS) em anis de artria pulmonar
provenientes de animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou com sinvastatina
(SHAM/ SINV) (A) e animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou com sinvastatina (IR/
SINV) (B). O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre
parnteses. Os resultados so expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada
ANOVA 2-vias.
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
SHAM/ CT (N=05)
SHAM/ SINV (N=05)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-100
-75
-50
-25
0
IR/ SINV (N= 07)
IR/ CT (N=05)
NPS (Log M)
% R
ela
xam
en
to
55
Figura 10 - Efeito da sinvastatina sobre a curva concentrao-resposta fenilefrina
SHAM IR
Curva concentrao-resposta fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar provenientes de
animais SHAM tratados com veculo (SHAM/ CT) ou com sinvastatina (SHAM/ SINV) (A) e
animais IR tratados com veculo (IR/ CT) ou com sinvastatina (IR/ SINV) (B). O nmero de
animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os resultados so
expressos como mdia EPM. Anlise estatstica utilizada ANOVA 2-vias: # P
56
Tabela 9- Valores de sensibilidade (pD2) e resposta mxima (Rmax) obtidos por meio de curvas concentrao-reposta acetilcolina (ACh), ao
nitroprussiato de sdio (NPS) e fenilefrina (FE) em anis de artria pulmonar dos animais SHAM, SHAM tratado com 20mg/kg de
sinvastatina (SHAM SINV), IR e IR tratado com 20mg/kg de sinvastatina (IR SINV)
O nmero de animais analisados em cada grupo experimental est entre parnteses. Os resultados so expressos como mdia EPM. ANOVA
1-via: *P
57
5 DISCUSSO
Apesar de continuamente e progressivamente a medicina apresentar melhora de
recursos diagnsticos e tratamentos inovadores, a isquemia intestinal ainda uma
doena com alta taxa de mortalidade. Alm disso, pode ter como consequncia a SDRA
e a MODS, sendo que a MODS a principal causa de morte em pacientes crticos.
Esses fatos justificam a importncia da busca pela compreenso dos mecanismos que
atuam na isquemia intestinal, bem como de sua teraputica eficaz. Como detalhado na
introduo, o sistema linftico uma das vias por meio das quais a iIR promove
alteraes em rgos-alvo, como o pulmo (Cavriani et al., 2005; Deitch, 2010; Deitch,
2001; Magnotti et al., 1998; Magnotti et al., 2005). Porm, o conhecimento das
alteraes do sistema vascular e de sua contribuio para o comprometimento de rgos
e desfechos indesejveis da iIR permanece insuficiente.
No presente estudo, a primeira resposta obtida foi a constatao de que os
ajustes de reatividade vascular observados na iIR ocorrem na dependncia do leito
vascular estudado. Surpreendentemente, na artria mesentrica superior a iIR no
alterou a reatividade vascular dependente e independente do endotlio nem a agentes
vasodilatadores, nem ao agonista seletivo 1-adrenrgico, fenilefrina. J na artria
pulmonar, a iIR causou disfuno endotelial e hiporreatividade fenilefrina. O xido
ntrico produzido por meio da ativao da iNOS parece ter papel crucial nos ajustes na
artria pulmonar, os quais esto portanto associados com alteraes na modulao
nitrrgica. Adicionalmente, confirmando a hiptese da presente dissertao, o pr-
tratamento agudo com sinvastatina foi capaz de prevenir as alteraes de reatividade
vascular provocadas pela iIR.
Sabe-se que o endotlio vascular constitui a monocamada celular interna dos
vasos sangun