efeitos miocÁrdicos da angiotensina 1-7 e seu … · faculdade de medicina da universidade do...

2009/2010

Mariana Marques Santos Pintalhão

EFEITOS MIOCÁRDICOS DA

ANGIOTENSINA 1-7 E SEU PAPEL

NA FUNÇÃO CONTRÁCTIL APÓS

HIPÓXIA-REOXIGENAÇÃO

Abril, 2010

Mestrado Integrado em Medicina

Área: Fisiologia

Trabalho efectuado sobre a Orientação de:

Prof. Doutor Paulo Manuel Barreiros de Castro Chaves

Prof. Doutor Joaquim Adelino Leite Moreira

Mariana Marques Santos Pintalhão

EFEITOS MIOCÁRDICOS DA

ANGIOTENSINA 1-7 E SEU PAPEL

NA FUNÇÃO CONTRÁCTIL APÓS

HIPÓXIA-REOXIGENAÇÃO

Abril, 2010

Trabalho estruturado de acordo com as Normas para Publicação da revista

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Projecto de Opção do 6º ano - DECLARAÇÃO DE REPRODUÇÃO

Nome: __Mariana Marques Santos Pintalhão______________________________________________

Endereço electrónico: [email protected]____________

Título da Dissertação/Monografia/Relatório de Estágio: ____Efeitos miocárdicos da_________

angiotensina 1-7 e seu papel na função contráctil após hipóxia-reoxigenação_____________________

Nome completo do Orientador:

____Paulo Manuel Barreiros de Castro Chaves _____________________________________________

Nome completo do Co-Orientador:

____Joaquim Adelino Correia Ferreira Leite Moreira _________________________________________

Ano de conclusão: _2010____

Designação da área do projecto de opção:

____Fisiologia_______________________________________________________________________

É autorizada a reprodução integral desta Dissertação apenas para efeitos de investigação, mediante

declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 20 / 04 /2010

Assinatura: ________________________________________________

Projecto de Opção do 6º ano - DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE

Eu, __Mariana Marques Santos Pintalhão_________________, abaixo assinado, nº

mecanográfico_040801143__, aluno do 6º ano do Mestrado Integrado em Medicina, na Faculdade de

Medicina da Universidade do Porto, declaro ter actuado com absoluta integridade na elaboração deste

projecto de opção.

Neste sentido, confirmo que NÃO incorri em plágio (acto pelo qual um indivíduo, mesmo por omissão,

assume a autoria de um determinado trabalho intelectual, ou partes dele). Mais declaro que todas as

frases que retirei de trabalhos anteriores pertencentes a outros autores, foram referenciadas, ou

redigidas com novas palavras, tendo colocado, neste caso, a citação da fonte bibliográfica.

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 20 / 04 / 2010

Assinatura: ________________________________________________

Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7

1

Efeitos miocárdicos da angiotensina 1-7 e seu papel na função contráctil após

hipóxia-reoxigenação

Angiotensin 1-7 myocardial effects and its role on contractile function after hypoxia-

reoxygenation

Título abreviado: Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7

Mariana Pintalhao, Rui Cerqueira, Paulo Castro-Chaves, Ricardo Fontes-Carvalho,

Adelino Leite-Moreira

Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal

Endereço para correspondência:

Prof. Dr. Adelino Leite-Moreira

Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Alameda Prof. Hernâni Monteiro, 4200-319 Porto, PORTUGAL

Tel. +351-22.551.36.44; Fax. +351-22.551.36.46;

E-mail: [email protected]

Palavras-Chave: sistema renina-angiotensina, contracção miocárdica, relaxamento,

isquemia miocárdica, endotélio

Key-words: renin-angiotensin system, myocardial contraction, relaxation, myocardial

ischemia, endothelium


2

RESUMO

FUNDAMENTO: A angiotensina 1-7 (Ang1-7) é um heptapeptídeo do sistema renina-

angiotensina (SRA) com acções cardiovasculares contra-reguladoras da angiotensinaII.

OBJECTIVOS: Neste trabalho pretendemos descrever os efeitos da Ang1-7 sobre a

função miocárdica aguda e num modelo de hipóxia-reoxigenação.

MÉTODOS: Os efeitos da Ang1-7 foram avaliados em músculos papilares isolados de

coelho. Inicialmente, avaliaram-se os efeitos de concentrações crescentes de Ang1-7

(10-9

-10-5

M) em condições basais; na presença de antagonistas dos receptores Mas

(A779), AT1 (ZD-7155) ou AT2 (PD-123,319) ou do inibidor da NO síntase L-NA; e

após a remoção selectiva do endotélio endocárdico (EE). Numa segunda fase, após o

pré-tratamento com Ang1-7 ou veículo (controlo), procedeu-se a 30min de isquemia e

40min de reperfusão, seguidos da adição de concentrações crescentes de isoprenalina.

RESULTADOS: A Ang1-7 induziu uma diminuição significativa da tensão activa (TA),

dT/dtmax e dL/dtmax de 10,5±3,6%, 5,3±2,6% e 5,7±2,3%, respectivamente. Estes efeitos

não se alteraram significativamente na presença de ZD-7155 ou PD-123,319, mas foram

abolidos após a remoção do EE e na presença de A-779 ou L-NA. Após a

hipóxia-reoxigenação, a resposta muscular à isoprenalina foi significativamente superior

no grupo Ang1-7 vs. controlo (elevação da TA 434,4%±69,0% vs. 238,6%±26,9%,

dT/dtmax 525,9%±51,7% vs. 373,4%±40,3% e dT/dtmin 552,9%±74,9% vs.

333,2%±40,8%).

CONCLUSÃO: Nesta espécie animal, a Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo,

dependente do receptor Mas e modulado pelo EE e pelo NO, e melhora a resposta


3

miocárdica à estimulação beta-adrenérgica na hipóxia-reoxigenação. Estes resultados

sublinham o papel contra-regulador da Ang1-7 no coração e o seu potencial efeito

benéfico na disfunção contráctil pós-isquémica.


4

INTRODUÇÃO

O sistema renina-angiotensina (SRA) é um regulador crucial da homeostasia

cardiovascular. O seu principal efector clássico é a angiotensina II (AngII), que actua

através da ligação aos receptores AT1 e AT21. A inibição farmacológica do SRA com

inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECAs) e antagonistas dos

receptores AT1 (ARAs) é actualmente uma importante abordagem na terapêutica da

hipertensão arterial, do pós-enfarte agudo do miocárdio, da insuficiência cardíaca e da

nefropatia diabética2.

Nos últimos anos, o SRA foi alvo de intensa investigação, tendo sido descritos

vários sistemas locais independentes do sistema circulante e identificadas novas vias,

envolvendo novas enzimas, receptores e peptídeos bioactivos3. Entre estes, o

heptapeptídeo angiotensina 1-7 (Ang1-7) tem recebido uma atenção crescente, sendo

actualmente considerado um produto major do SRA4, com um papel crítico na contra-

regulação das acções cardiovasculares da AngII5.

A síntese de Ang1-7 está dependente da actividade da enzima de conversão da

angiotensina tipo 2 (ECA2) sobre a AngII6. Uma vez sintetizada, a Ang1-7 pode ligar-se

a vários receptores do SRA7, como os receptores AT1 e AT2, embora com baixa

afinidade8,9

. Em 2003, a Ang1-7 foi identificada como o ligando endógeno de um

receptor previamente órfão, o receptor Mas, através do qual este peptídeo parece exercer

as suas acções fisiológicas mais relevantes10

.

O coração foi identificado como um dos principais alvos da Ang1-7,

verificando-se uma elevada expressão cardíaca de ECA2 e do receptor Mas11

. Assim,

este novo eixo parece ter um papel fundamental nas acções cardíacas do SRA, onde


5

pode exercer efeitos anti-arritmogénicos e anti-hipertróficos5,12

e apresentar um

potencial efeito cardioprotector após a isquemia-reperfusão13,14

. A nível vascular, a

Ang1-7 induz um efeito vasodilatador e antiproliferativo15

.

Actualmente, propõe-se uma nova visão do SRA, em que o eixo ECA2/Ang1-

7/Mas se torna um potencial braço alternativo ao eixo clássico ECA/AngII/AT1 (Fig.1).

No entanto, o papel deste novo eixo na modulação aguda da função miocárdica

permanece ainda por esclarecer. Este trabalho tem como objectivos descrever os efeitos

agudos da Ang1-7 sobre a função contráctil miocárdica, bem como avaliar o papel deste

peptídeo na modulação da função miocárdica num modelo de hipóxia-reoxigenação.


6

MÉTODOS

Este trabalho foi realizado de acordo com as Normas de Utilização de Animais

de Laboratório do National Institute of Health (publicação do NIH nº. 85-23, revista em

1996).

Preparação experimental

Coelhos brancos neozelandeses machos (Oryctolagus cuniculus; 2.0–3.0kg;

n=39) foram anestesiados com pentobarbital de sódio endovenoso (25 mg.kg-1

). Foi

executada uma toracotomia esquerda, seguida da extracção imediata do coração e sua

imersão numa solução de Krebs-Ringer modificada (composição em mM: 98 NaCl; 4,7

KCl; 2,4 MgSO4·7H2O; 1,2 KH2PO4; 4,5 glicose; 1,8 CaCl2·2H2O; 17 NaHCO3; 15

C3H3NaO3; 5 CH3COONa) a 35ºC com o composto cardioplégico 2,3-butanediona

monoxima (BDM;3%) e 5% de soro de vitelo. As soluções foram estabilizadas com O2

a 95% e CO2 a 5%, mantendo o pH entre 7.38 e 7.42.

Após a dissecção, os músculos papilares do ventrículo direito (n=66;

comprimento em Lmax: 3,1±1,2mm; peso: 2,7±0,2 mg; pré-carga: 3,6±0,2 mN) foram

montados verticalmente em banhos próprios plexiglas de 10 ml contendo a solução

referida. A extremidade inferior dos músculos foi fixada num clip de fosfobronze e a

extremidade superior, tendinosa, foi fixada a um transdutor electromagnético tensão-

comprimento (Universidade de Antuérpia, Bélgica). A pré-carga aplicada inicialmente

variou entre 3 e 4 mN, de acordo com as dimensões musculares. As preparações foram

estimuladas electricamente a uma frequência de 0,6Hz e a uma voltagem 10% acima do

limiar (tipicamente 3 a 6 mV), com pulsos rectangulares com a duração de 5 ms, através


7

de dois eléctrodos de platina orientados paralelamente ao músculo papilar. Vinte

minutos depois, as soluções foram substituídas por outras em tudo semelhantes, mas

sem BDM e, 30 minutos após, por outras sem BDM nem soro. Durante as 2 horas

seguintes, os músculos foram estabilizados.

Finalmente, os músculos foram estirados até ao comprimento fisiológico

máximo (Lmax,mm), que consiste no comprimento muscular para o qual o

desenvolvimento de tensão activa (TA) é máximo. Os protocolos foram iniciados após a

obtenção de duas contracções isotónicas e isométricas controlo sobreponíveis, separadas

por um intervalo de 10 minutos.

No final de cada protocolo experimental, os músculos foram cuidadosamente

removidos do banho e pesados. A área de secção transversal dos músculos foi calculada

através da divisão do peso pelo comprimento muscular. Foi assumido um formato

muscular cilíndrico e uma gravidade específica de 1,016

e a tensão muscular foi expressa

como força normalizada para a área de secção transversal (mN·mm-2

).

Protocolo experimental:

1. Caracterização dos efeitos agudos da Ang1-7 na função miocárdica

Os efeitos de concentrações crescentes de Ang1-7 (10-9

,10-8

,10-7

,10-6

e 10-5

M)

na função cardíaca sistólica e diastólica foram avaliados em preparações de músculos

papilares de coelho com o endotélio endocárdico intacto (n=12) e após a sua remoção

selectiva (n=9). Vários métodos químicos, mecânicos e farmacológicos têm sido

desenvolvidos para a destruição selectiva do endotélio endocárdico in vitro, sem

danificar o miocárdio subjacente. Neste protocolo experimental, a remoção selectiva do


8

endotélio endocárdico foi realizada de acordo com a metodologia clássica descrita e

validada por Brutsaert et al17

, que consiste na imersão dos músculos papilares numa

solução de Triton X-100 (0,5%) durante 1 segundo, seguida de uma lavagem abundante.

As mesmas concentrações de Ang1-7 foram ainda adicionadas a músculos com o

endotélio intacto na presença de um antagonista do receptor Mas (A779, 10-5

M,n=6), de

um antagonista selectivo dos receptores AT1 (ZD-7155, 10-5

M, n=9), de um antagonista

selectivo dos receptores AT2 (PD-123,319, 10-6

M, n=7) ou de um inibidor da síntase do

NO (NG-nitro-L-arginina (L-NA), 10-5

M; n=11).

Estas substâncias foram adicionadas à solução superfusora de Krebs-Ringer e as

contracções musculares foram registadas após a obtenção de uma resposta estável.

2. Efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica após a hipóxia-reoxigenação

Com o objectivo de avaliar os efeitos da Ang1-7 na performance miocárdica

após hipóxia-reoxigenação, realizou-se o protocolo esquematizado na Fig.2. Após a

estabilização das preparações musculares, conforme descrito na secção acima,

procedeu-se à adição de Ang1-7 (grupo Ang1-7, 10-5

M, n=6) ou de um volume

semelhante de veículo (grupo controlo, 200μl H2O, n=6) à solução superfusora. De

seguida, induziu-se em ambos os grupos hipóxia muscular através da substituição da

mistura gasosa inicial (95%O2 / 5%CO2) por uma mistura de N2 a 95% e CO2 a 5%. A

hipóxia foi mantida durante um período de 30 minutos, no fim do qual se procedeu à

reoxigenação, através da reposição da mistura gasosa inicial, durante 40 minutos. A

ausência de recuperação da TA desenvolvida para níveis pré-hipóxicos foi tomada como

evidência de disfunção contráctil pós-hipóxica.


9

Após a reoxigenação, a reserva contráctil miocárdica foi avaliada através da

resposta à adição de concentrações crescentes de isoprenalina (10-8

,10-7

,10-6

M)18

. Estas

concentrações foram adicionadas à solução superfusora de Krebs-Ringer e as

contracções musculares foram registadas quando se atingiu a resposta máxima para cada

concentração, tipicamente 3 a 5 minutos após a adição.

Todos os reagentes foram adquiridos na Sigma Aldrich, com excepção do ZD-

7155, que foi adquirido na Tocris.

Aquisição e análise dos dados

Neste trabalho foram registadas contracções isotónicas e isométricas, permitindo

a análise dos seguintes parâmetros: TA (mN·mm-2

), velocidade máxima de elevação de

tensão (dT/dtmax; mN·mm-2

·s-1

), velocidade máxima de queda de tensão (dT/dtmin;

mN·mm-2

·s-1

), encurtamento muscular (EM, %Lmax), velocidade máxima de

encurtamento (dL/dtmax; Lmax·s-1

), velocidade máxima de reextensão (dL/dtmin; Lmax·s-1

)

e tempo de abalo muscular (tHR; ms).

Análise estatística

Os valores são apresentados como média±erro padrão. Para a análise dos efeitos

de concentrações crescentes de Ang1-7 ou de isoprenalina na função muscular, as

significâncias estatísticas foram determinadas utilizando o teste ANOVA e Student-

Newman-Keuls para comparações múltiplas emparelhadas. No segundo protocolo, para

comparação da resposta à dose máxima de isoprenalina nos dois grupos (controlo e

Ang1-7), as significâncias estatísticas foram determinadas utilizando o teste t para


10

distribuição normal e o teste Mann-Whitney Rank Sum para distribuições não normais.

P<0.05 foi aceite como significativo.


11

RESULTADOS

1. Caracterização dos efeitos agudos da Ang1-7 na função miocárdica

A performance basal dos músculos papilares de coelho foi idêntica em todos os

protocolos experimentais. Nenhum inibidor alterou significativamente a performance

muscular basal.

Em condições basais, com o endotélio endocárdico intacto, a Ang1-7 induziu

uma diminuição da contractilidade muscular dependente da concentração, sem alterar os

parâmetros do relaxamento (Fig.3). Os efeitos estabilizaram cerca de 20 minutos após a

adição de cada dose de Ang1-7, sendo máximos na concentração de 10-5

M. Esta última

concentração de Ang1-7 induziu uma diminuição de 10,5±3,6% TA, 8,0±3,0% dT/dtmax,

5,3±2,6% EM, 5,7±2,3% dL/dtmax e 4,4±1,2% tHR. Não se verificaram alterações

estatisticamente significativas do dT/dtmin e do dL/dtmin.

Na presença de ZD-7155, um antagonista dos receptores AT1, a resposta

muscular à Ang1-7 não se alterou significativamente (Fig.3). De facto, o efeito

inotrópico negativo manteve-se, com uma diminuição de 10,7±4,4% TA para a

concentração de 10-5

M. À semelhança do protocolo anterior, os parâmetros do

relaxamento dT/dtmin e dL/dtmin não variaram significativamente. O efeito inotrópico

negativo também se manteve quando se procedeu à adição de Ang1-7 na presença de

PD-123,319, um antagonista selectivo dos receptores AT2 (Fig.3). Neste protocolo, a

concentração máxima do heptapeptídeo induziu uma diminuição significativa de

15,3±2,7% TA.


12

Os efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica foram abolidos na presença

do antagonista do receptor Mas A-779 (Fig.3), verificando-se, por exemplo, uma

diminuição não significativa de 1,4±2,9%TA na concentração máxima de Ang1-7.

Quando a adição da Ang1-7 foi realizada após a remoção selectiva do endotélio

endocárdico, os efeitos deste peptídeo na contractilidade miocárdica também foram

abolidos (Fig.4). Verificou-se mesmo um aumento da TA de 8,9±4,8%, apesar de não

significativo. Na presença de L-NA, um inibidor da síntase do NO, o efeito inotrópico

negativo basal da Ang1-7 também foi antagonizado (Fig.4), observando-se uma

diminuição não significativa de 2,3±2,7% TA (10-5

M Ang1-7).

2. Efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica após a hipóxia-reoxigenação

Relativamente aos efeitos da hipóxia-reoxigenação na função muscular, não se

observaram diferenças estatisticamente significativas entre o grupo Ang1-7 e o grupo

controlo no final dos períodos de hipóxia e reoxigenação. Verificou-se uma tendência

para uma melhor recuperação da contractilidade durante a reoxigenação no grupo

Ang1-7, evidenciada por uma maior percentagem de aumento da TA relativamente ao

seu valor no final do período de hipóxia (634%±197% Ang1-7 versus 398%±133,7%

controlo). No entanto, a comparação dos valores dos parâmetros contrácteis no final da

reoxigenação com os seus valores pré-hipóxia não mostrou diferenças significativas

entre os dois grupos (diminuição da TA de 68,6%±5,0% Ang1-7 versus 52,5%±7,0%

controlo, relativamente aos seus valores pré-hipóxicos).

Após a lesão de hipóxia-reoxigenação, a reserva contráctil miocárdica foi

avaliada através da determinação da curva dose-efeito da isoprenalina18

. Neste

protocolo, a resposta inotrópica e lusitrópica à estimulação beta-adrenérgica foi


13

significativamente superior no grupo Ang1-7, quando comparada com a resposta no

grupo controlo (Fig.5). Apesar de se observar um efeito inotrópico e lusitrópico positivo

significativo em ambos os grupos após a adição de concentrações crescentes de

isoprenalina, o pré-tratamento com Ang1-7 permitiu uma melhor resposta a esta

estimulação. Enquanto que no grupo controlo, para a concentração máxima de

isoprenalina (10-6

M), se verificou um aumento significativo de cerca de 238,6%±26,9%

TA e de 373,4%±40,3% dT/dtmax, a resposta contráctil no grupo Ang1-7 foi

significativamente superior, com um aumento de cerca de 434,4%±69,0% TA e de

525,9%±51,7% dT/dtmax.

No que diz respeito à função cardíaca diastólica, o grupo Ang1-7 apresentou

também uma aceleração do relaxamento relativamente ao grupo controlo após

estimulação com isoprenalina, verificando-se um aumento do dT/dtmin de

552,9%±74,9% Ang1-7 versus 333,2%±40,8% controlo (10-6

M isoprenalina). Não se

verificaram alterações significativas no tHR.


14

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

O presente trabalho reforça o papel da Ang1-7 na modulação aguda da função

miocárdica. Por um lado, descrevemos pela primeira vez que, nesta espécie animal, a

Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo dependente da activação do receptor Mas e

modulado pelo endotélio endocárdico e pelo NO, o que realça o seu papel contra-

regulador do SRA. Por outro lado, num modelo experimental de hipóxia-reoxigenação

em músculos papilares isolados de coelho, a Ang1-7 mostrou ter um potencial efeito

benéfico na disfunção contráctil associada à hipóxia, melhorando a resposta à

estimulação beta-adrenérgica.

A Ang1-7 tem um papel biológico conhecido desde 1988, altura em que foi

associada à libertação de vasopressina19

. Actualmente, parece ter acções

contrarreguladoras da AngII, opondo-se aos efeitos do eixo AngII/AT1 em vários

tecidos-alvo, através da inibição da proliferação e migração celulares, deposição de

matriz extracelular, inflamação e trombose4,5

(Fig.1 e 6).

A síntese da Ang1-7 é mediada pela acção da ECA2, uma enzima descoberta em

200011,20

, sobre a AngII6; uma vez formada, a Ang1-7 é rapidamente inactivada pela

ECA ou por aminopeptidases21

. Curiosamente, a degradação da AngII em Ang1-7 pela

ECA2 tem uma eficiência catalítica superior à degradação da angiotensina I em AngII

pela ECA (Kcat/Km 2,2x106M

-1·s

-1 versus Kcat/Km 1,8x10

5M

-1·s

-1)22

. Estes dados

sugerem que a síntese da Ang1-7 é assim uma via central no SRA e depende

fundamentalmente da degradação da AngII, pelo que a sua relevância fisiopatológica

pode ser mais marcada em condições associadas a uma hiperactivação do SRA com

aumento dos níveis de AngII. Este heptapeptídeo contrapõe-se aos efeitos deletérios da


15

AngII por duas vias: 1) através da diminuição dos níveis de AngII, uma vez que é um

produto da degradação deste octapeptídeo; e 2) através dos seus efeitos compensatórios

e contrários aos da AngII, mediados pela sua ligação ao receptor Mas.

Relativamente aos efeitos cardíacos da Ang1-7, este heptapeptídeo, actuando nos

cardiomiócitos e nos fibroblastos, modula a remodelagem cardíaca através dos seus

efeitos anti-proliferativos e anti-hipertróficos23,24

. Num modelo knockout para a eca2 em

ratinho, Crackower et al observaram uma diminuição marcada da contractilidade

cardíaca, sem qualquer efeito na hipertrofia, dilatação, fibrose ou deposição de

colagénio cardíacas e sem aumento da tensão arterial25

. Outros autores, utilizando uma

estirpe diferente de ratinhos knockout para a eca2, não verificaram alterações estruturais

ou funcionais cardíacas, mas sim um aumento ligeiro da tensão arterial em condições

basais e, sobretudo, uma resposta hipertrófica aumentada à AngII23

. Por outro lado, a

sobre-expressão da ECA2 tem sido associada a episódios de taquicardia e fibrilhação

ventriculares, mas os seus efeitos na performance miocárdica são ainda

desconhecidos26

.

O papel da Ang1-7 na modulação aguda da função miocárdica permanecia ainda

por esclarecer. Pela primeira vez, com este trabalho, observámos que, neste modelo de

músculo papilar isolado do ventrículo direito de coelho, a adição de concentrações

crescentes de Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo ligeiro, mas significativo,

sem alteração dos parâmetros do relaxamento.

A Ang1-7 pode ligar-se a vários receptores com diferentes afinidades. Liga-se

aos receptores AT1, mas com uma baixa afinidade e de modo não específico,

aparentemente sem consequências fisiológicas8,27

. Pode também ligar-se aos receptores

AT2, com baixa afinidade, sendo algumas das suas acções abolidas com antagonismo


16

destes receptores27

. No entanto, liga-se com alta afinidade e especificidade a um

receptor recentemente descrito, o receptor Mas, sendo a maior parte dos seus efeitos

abolidos na presença de A-779, um antagonista deste receptor. O receptor Mas parece

assim ser o receptor específico da Ang1-7, sendo responsável pelas acções fisiológicas

deste peptídeo10

. De facto, no presente trabalho não observámos alterações

significativas nos efeitos miocárdicos agudos da Ang1-7 após o antagonismo dos

receptores AT1 ou AT2 com ZD-7155 ou PD-123,319, respectivamente. No entanto, o

seu efeito inotrópico negativo foi inibido na presença de um antagonista do receptor

Mas, o A-779, pelo que, em consonância com trabalhos prévios, também este efeito da

Ang1-7 parece ser dependente da activação do receptor Mas.

Por outro lado, no que diz respeito ao papel do endotélio nas acções fisiológicas

da Ang1-7, o efeito vasodilatador regional e sistémico da Ang1-728

está dependente da

libertação de vários factores endoteliais, como a bradicinina, o factor hiperpolarizante

derivado do endotélio e o NO7,28,29

. Assim, o endotélio vascular parece não só estar

envolvido na síntese da Ang1-7, mas é também um alvo funcional muito importante

deste peptídeo. Neste trabalho, procurámos clarificar os mecanismos subjacentes ao

efeito inotrópico negativo observado e verificámos que, à semelhança dos estudos

anteriores referentes às estruturas vasculares, os efeitos miocárdicos deste heptapeptídeo

estão dependentes da integridade do endotélio endocárdico, uma vez que foram abolidos

após a destruição desta camada. Estes efeitos foram também atenuados na presença de

um antagonista da síntase do NO, pelo que o NO pode estar envolvido na modulação

endotelial do efeito inotrópico negativo descrito. Estes resultados estão de acordo com

estudos prévios que demonstram que a Ang1-7, através da sua ligação ao receptor Mas,

pode estimular a síntase do NO endotelial, por vias dependentes do Akt30

. Tendo em

conta que os efeitos descritos são influenciados pelo endotélio endocárdico, poderão


17

estar perturbados em situações associadas a disfunção endotelial, como a insuficiência

cardíaca ou a isquemia miocárdica.

No que diz respeito ao papel da Ang1-7 na isquemia-reperfusão, esta parece

proteger a função miocárdica neste contexto e atenuar o desenvolvimento da

insuficiência cardíaca pós-enfarte do miocárdio, sobretudo devido aos seus efeitos

contra-reguladores do eixo AngII/AT1. O grupo de Almeida et al verificou que, num

modelo de isquemia-reperfusão em coração isolado de rato, uma concentração baixa de

Ang1-7 diminui a incidência e a duração de arritmias associadas à isquemia-

reperfusão31

. Além disso, o enfarte do miocárdio resulta no aumento da expressão de

ECA2 cardíaca no rato e no ser humano13

e estudos em modelos animais têm

demonstrado um aumento da expressão de ECA2 e do seu produto major, a Ang1-7, nos

cardiomiócitos ventriculares à volta da área de enfarte13,32

. Isto sugere que o eixo

ECA2/Ang1-7 poderá actuar como um mecanismo contra-regulador dos efeitos

adversos do eixo ECA/AngII, modulando a resposta à agressão e a remodelagem

cardíaca pós-enfarte13

. Por outro lado, a infusão crónica de Ang1-7 no período pós-

enfarte do miocárdio parece atenuar o posterior desenvolvimento de insuficiência

cardíaca, melhorando a função endotelial, a perfusão coronária e a função cardíaca no

rato14

.

Os resultados descritos no presente trabalho vêm assim reforçar o papel

cardioprotector da Ang1-7 em situações de isquemia-reperfusão. Apesar de não termos

observado uma diferença significativa na performance basal pós-reoxigenação dos

músculos papilares expostos à Ang1-7, o pré-tratamento com este peptídeo permitiu

uma melhor resposta inotrópica e lusitrópica à isoprenalina, ressaltando o potencial

efeito benéfico deste heptapeptídeo na disfunção contráctil associada à isquemia. A


18

resposta à estimulação beta-adrenérgica tem sido extensamente utilizada na literatura

como marcador da reserva contráctil miocárdica. Está diminuída em vários contextos

patológicos, como a hipertrofia e a insuficiência cardíaca18,33,34

, sendo um dos

marcadores mais precoces de disfunção contráctil nestas patologias18,34

. Nos estadios

iniciais, compensados, da hipertrofia cardíaca, a função sistólica basal pode estar normal

ou mesmo superior ao normal, mas verifica-se uma redução da tolerância ao exercício35

.

A dessensibilização da resposta beta-adrenérgica indica assim uma diminuição da

reserva contráctil com incapacidade de resposta ao stress, apesar da função em repouso

poder estar preservada18,35

. Deste modo, o aumento da resposta à estimulação com

isoprenalina induzida pela Ang1-7 neste trabalho sublinha o papel da Ang1-7 na

modulação da função miocárdica, através da melhoria da reserva contráctil muscular

pós-isquémica.

A inibição farmacológica do SRA com IECAs ou ARAs é actualmente uma

abordagem terapêutica chave nas doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial,

a insuficiência cardíaca e a remodelagem cardíaca pós-enfarte do miocárdio2. Os seus

mecanismos de acção são complexos mas, tendo em conta as vias de síntese e

degradação da Ang1-7, parte dos seus efeitos poderão ser mediados por este

heptapeptídeo36

. Os níveis plasmáticos de Ang1-7 estão aumentados durante o

tratamento crónico com IECAs e ARAs, devido à inibição da sua degradação ou ao

aumento da disponibilidade de AngII para conversão em Ang1-7, respectivamente36,37

.

Além disso, parte dos efeitos dos ARAs e dos IECAs pode ser inibida com a utilização

de A-779, um antagonista do receptor Mas38,39

. Tendo em conta que o antagonismo do

SRA aumenta os níveis de Ang1-7 e parece potenciar os seus efeitos, a melhoria da

reserva contráctil pós-isquémica induzida pela Ang1-7 poderá constituir um mecanismo


19

de acção dos IECAs e dos ARAs, fármacos associados a uma redução muito

significativa da morbimortalidade no pós-enfarte do miocárdio.

Em conclusão, este trabalho reforça o papel do SRA na modulação aguda da

função miocárdica, sublinhando o efeito contra-regulador do eixo Ang1-7/Mas a nível

cardíaco. Uma vez que o efeito inotrópico negativo descrito é influenciado pelo

endotélio endocárdico, poderá estar perturbado em situações associadas a disfunção

endotelial, como a insuficiência cardíaca e a isquemia do miocárdio. Por outro lado, em

condições de hipóxia-reoxigenação, o pré-tratamento com Ang1-7 permite uma melhor

resposta inotrópica e lusitrópica à isoprenalina, corroborando o potencial efeito benéfico

deste heptapeptídeo na disfunção contráctil associada à isquemia. A descoberta e

subsequente estudo do eixo ECA2/Ang1-7/Mas tem aberto novas opções que poderão

constituir armas terapêuticas futuras na abordagem das patologias cardiovasculares.


20

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25

FIGURAS

Figura1. Nova visão do sistema renina-angiotensina: balanço entre o eixo

ECA/AngII/Receptor AT1 e o eixo ECA2/Ang1-7/Receptor Mas. NEP: endopeptidase

neutra; PEP: prolilendopeptidase.

Figura 2. Desenho experimental do protocolo de isquemia-reperfusão.

Figura 3. Efeitos de concentrações crescentes de angiotensina 1-7 (Ang1-7) na tensão

activa, dT/dtmax e dT/dtmin em condições basais, na presença de um antagonista dos

receptores AT1 (ZD-7155), de um antagonista dos receptores AT2 (PD-123,319) ou de

um antagonista do receptor Mas (A-779). Os dados são apresentados como média ± erro

padrão. P<0,05: α vs basal, β vs 10-9

M Ang1-7, γ vs 10-8

M Ang1-7, δ vs 10-7

M Ang1-7,

τ vs 10-6

M Ang1-7.

Figura 4. Efeitos de concentrações crescentes de angiotensina 1-7 (Ang1-7) na tensão

activa, dT/dtmax e dT/dtmin em condições basais, após remoção selectiva do endotélio

endocárdico (sem EE) e na presença de um inibidor da síntase do NO (L-NA). Os dados

são apresentados como média±erro padrão. P<0,05: α vs basal, β vs 10-9

M Ang1-7, γ vs

10-8

M Ang1-7, δ vs 10-7

M Ang1-7, τ vs 10-6

M Ang1-7.

Figura 5. Efeito da adição de concentrações crescentes de isoprenalina na tensão activa,

dT/dtmax e dT/dtmin após a lesão de isquemia-reperfusão no grupo controlo e no grupo

angiotensina 1-7 (Ang1-7). Os dados são apresentados como média±erro padrão.


26

P<0,05: α vs basal, β vs 10-8

M isoprenalina, γ vs 10-7

M isoprenalina, * vs grupo

controlo.

Figura 6. Efeitos fisiológicos da angiotensina 1-7. A figura foi desenhada utilizando o

Servier Medical Art.


27

Figura 1.


28

Figura 2.


29

Figura 3.

Tensão Activa

[Ang 1-7], log M

Basal -9 -8 -7 -6 -5

%

basal

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15 Ang 1-7

Ang 1-7 com ZD-7155

Ang 1-7 com A-779

Ang 1-7 com PD-123,319

dT/dtmax

[Ang 1-7], log M

Basal -9 -8 -7 -6 -5

%

basal

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15 Ang 1-7

Ang 1-7 com ZD-7155

Ang 1-7 com A-779

Ang 1-7 com PD-123,319


30

dT/dtmin

[Ang 1-7], log M

Basal -9 -8 -7 -6 -5

%

basal

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15 Ang 1-7

Ang 1-7 com ZD-7155

Ang 1-7 com A-779

Ang 1-7 com PD-123,319


31

Figura 4.

Basal -9 -8 -7 -6 -5

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15Ang 1-7

Ang 1-7 sem EE

Ang 1-7 com L-NA

[Ang 1-7], log M

%

basal

Tensão Activa

Basal -9 -8 -7 -6 -5

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

Ang 1-7

Ang 1-7 sem EE

Ang 1-7 com L-NA

dT/dt max

[Ang 1-7], log M

%

ba

sa

l


32

Basal -9 -8 -7 -6 -5

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20Ang 1-7

Ang 1-7 sem EE

Ang 1-7 com L-NA

dT/dtmin

%

Ba

sa

l

[Ang 1-7], log M


33

Figura 5.

Tensão Activa

Isoprenalina, log MBasal -8 -7 -6

b

asal

0

200

400

600

Ang 1-7

Controlo

dT/dtmax

Isoprenalina, log M

Basal -8 -7 -6

b

as

al

0

200

400

600 Ang 1-7

Controlo


34

dT/dt

min

Isoprenalina, log MBasal -8 -7 -6

b

asal

0

200

400

600

Ang 1-7

Controlo


35

Figura 6.

efeitos miocÁrdicos da angiotensina 1-7 e seu … · faculdade de medicina da universidade do...

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